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Die Erfindung betrifft neuartige monoklonale Antikörper
sowie, unter anderem, ein iininunologisches Verfahren, bei
dem diese Antikörper verwendet werden. Die Erfindung
betrifft insbesondere von einem Human-Human-Hybridom
abgeleitete Antikörper, die befähigt sind, ein
Differenzierungs-Antigen menschlicher Lymphocyten zu erkennen und/oder
immunsuppressive Wirksamkeit gegenüber menschlichen
Lymphocyten auszuüben, und die von nachteiligen Nebenwirkungen
frei sind, wenn sie dem menschlichen Organismus verabreicht
werden, immunsuppressive Mittel, welche diese Antikörper
als Wirkstoffe enthalten, sowie diagnostische Verfahren,
bei denen diese Antikörper eingesetzt werden.
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Mit dem raschen Fortschritt auf dem Gebiet der
Biotechnologie in den letzten Jahren genießen monoklonale Antikörper
besonderes Interesse und sind Gegenstand zahlreicher
eingehender und umfangreicher Untersuchungen auf zahlreichen
Gebieten.
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Wie wohlbekannt ist, ist jeder lebende tierische und
menschliche Organismus mit einer Selbstabwehrfunktion
ausgestattet, die als Immunität bezeichnet wird und die sich
gegen Fremdorganismen, wie Bakterien, die als Antigene
bezeichnet werden, richtet, die in den menschlichen Körper
eindringen, woraufhin die Lymphocyten im Körper einen
Antikörper erzeugen, der so wirkt, daß die Fremdorganismen aus
dem Körper eliminiert oder im lebenden Körper auf einem
niedrigen Niveau gehalten werden. Unter diesem
Gesichtspunkt erzeugen Lymphocyten eines einzelnen Klons
charakteristischerweise
eine einzige Art von Antikörpern, die als
monoklonale Antikörper bezeichnet werden.
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Derzeit werden intensive Untersuchungen im Hinblick auf die
Anwendung monoklonaler Antikörper auf zahlreichen Gebieten
durchgeführt, wozu die biochemische Analyse, wie etwa die
Affinitätschromatographie, die klinische Diagnose und
Therapie in der Medizin, etc., gehören. Die Anwendung
monoklonaler Antikörper in der klinischen Therapie kann durch
folgende Beispiele erläutert werden:
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(1) Das sogenannte 'Missile'-Verfahren zur Krebstherapie,
bei dem ein monoklonaler Antikörper, dessen Antigen das in
der Oberflächenschicht der Krebszellen enthaltene
spezifische Glykoprotein ist, hergestellt und einem Krebspatienten
in Kombination mit einem Antikrebsmittel oder einem
Antikrebstoxin verabreicht wird, das befähigt ist, die
Krebszellen abzutöten, wobei sich der monoklonale Antikörper
durch Antigen-Antikörper-Reaktion selektiv allein an die
Oberfläche der Krebszellen anheftet, worauf die Krebszellen
durch das an den Antikörper gebundene Antikrebsmittel oder
Toxin zerstört werden;
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(2) die Verwendung monoklonaler Antikörper anstelle
herkömmlicher immunsuppressiver Mittel, die
Organtransplantationspatienten mit dem Ziel verabreicht werden, das
Problem der Abstoßung des transplantierten Organs
abzumildern, wenn die Haupt-Histokoinpatibilitäts-Antigene nicht
miteinander konsistent sind, während herkömmliche
immunsuppressive Mittel in manchen Fällen aufgrund der
gravierenden Nebenwirkungen oder von Infektionskrankheiten zum
Tod des Patienten führen,
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und
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(3) die Verwendung monoklonaler Antikörper unter Ausnützung
der Eigenschaften der hohen Spezifität, Qualitätsstabilität
und der niederen Herstellungskosten anstelle herkömmlicher
Antiseren beim sog. Gammaglobulin-Verfahren, bei dem aus
menschlichem Blut hergestellte, Antiserum genannte
Antikörper Patienten verabreicht werden, die unter
verschiedenen Arten von Immunschwächesyndromen oder gravierenden
Infektionskrankheiten leiden.
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Im Stand der Technik sind bereits mehrere Methoden zur
Herstellung monoklonaler Antikörper bekannt und in die Praxis
eingeführt; hierzu gehört ein Verfahren, bei dem eine einen
Antikörper produzierende Zelle und eine Myelomzelle einer
Zellfusion unterzogen werden und das so erhaltene Hybridom
kultiviert wird, ein Verfahren, bei dem Lymphocyten einer
Transformation mit einem Virus unterzogen werden und die so
erhaltene, Antikörper produzierende Zellinie kultiviert
wird, etc.
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Es bedarf keiner Hervorhebung, daß es bei der Herstellung
von monoklonalen Antikörpern vom Humantyp wesentlich ist,
über Zellen zu verfügen, die menschliche Antikörper
herstellen und mit einem bestimmten Antigen sensibilisiert
sind und gegenüber diesem Antigen spezifisch sind, da eine
In-vivo-Stimulation des menschlichen Körpers mit einem
Antigen, mit Ausnahme einiger weniger Fälle, generell nicht
erlaubt ist. Diese Situation ist der Grund dafür, daß die
Technologie für die oben erwähnte mögliche Anwendung
monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Arten von
Antigenen im allgemeinen nicht in die Praxis eingeführt
wurde. Es wurde auch versucht, monoklonale Antikörper mit
permanenten menschlichen Zellen herzustellen, die durch
Immortalisierung menschlicher, Antikörper produzierender
Zellen erhalten wurden, beispielsweise durch Transformation
mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) oder durch Zellfusion mit
einer menschlichen Myelomzelle unter Erhalt eines Human-
Hybridoms. Im Unterschied zu von Mäusen abgeleiteten
Systemen wurden jedoch ungünstigerweise bisher noch keine
transformierten Zellen hergestellt, die sich als
Elternzellinien eignen, und ebenso wurden noch keine Hybridome im
Human-System hergestellt, die eine stabile Wirksamkeit bei
der Antikörperproduktion besitzen. Demzufolge sind die
derzeit verfügbaren monoklonalen Antikörper auf solche
Antikörper beschränkt, die von der Maus abgeleitet sind.
Derartige von der Maus abgeleitete monoklonale Antikörper
eignen sich natürlich für bestimmte Anwendungen,
beispielsweise bei der biochemischen Analyse, z.B. bei der
Affinitätschromatographie, und in der klinischen Diagnose. Wenn
aber derartige monoklonale Antikörper bei der
therapeutischen Behandlung von Patienten mit bestimmten Krankheiten
angewandt werden sollen, werden die monoklonalen Antikörper
von dem menschlichen Organismus, dem sie verabreicht
wurden, als Fremdprotein erkannt, was allergische Reaktionen
auslösen kann, so daß die Verwendung derartiger
monoklonaler Antikörper bei der therapeutischen Behandlung von
Patienten notwendigerweise Beschränkungen unterliegt. Es
besteht daher ein außerordentliches Interesse an der
Entwicklung einer Technologie, die Mittel für eine günstige
Herstellung humaner monoklonaler Antikörper zur Verfügung
stellt, die sich für therapeutische Zwecke einsetzen
lassen.
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Obgleich einige von der Maus abgeleitete Antikörper bekannt
sind, wurde bisher noch kein von einem Human-Hybridom
abgeleiteter Antikörper angegeben, der befähigt ist, ein
differenziertes Antigen menschlicher Lymphocyten zu erkennen,
und der bei therapeutischen Behandlungen verwendbar ist.
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Auf der anderen Seite sind als monoklonale Antikörper, die
als immunsuppressive Mittel verwendet werden, sog. OKT3
bekannt, die hauptsächlich in den Vereinigten Staaten dafür
praktisch eingesetzt werden, Abstoßungsreaktionen gegen
transplantierte Gewebe zu verhindern (vgl. z.B. JP-A-55-
145617). Diese Antikörper weisen aber erhebliche Mängel
auf, da sie von der Maus abgeleitet sind und im
menschlichen Körper als Fremdprotein wirken, was gravierende
Nebenwirkungen hervorruft, wenn diese Antikörper einem Patienten
mehr als einmal verabreicht werden (vgl. Nikkei Biotech,
Ausgabe 14. Juli 1986, und Ausgabe 23. Februar 1987). Wie
berichtet wurde, litten Patienten, denen diese Antikörper
in klinischen Fällen verabreicht wurden, 30 min nach der
Verabreichung unter Kältegefühl, Schüttelfrost und Pyrexie,
wobei die Hälfte der Patienten Dyspnoe erlitt. Ungünstig
war der Befund, daß in 12 von 16 Fällen die
Abstoßungsreaktion wieder auftrat, wie aus dem Bericht in Rinsho Men-eki
(Clinical Immunology), Vol. 17, No. 10 (1985) S. 895,
hervorgeht.
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Der vorliegenden Erfindung liegt entsprechend im Hinblick
auf die oben erläuterte Situation bei monoklonalen
Antikörpern die Aufgabe zugrunde, neuartige monoklonale Antikörper
anzugeben, die von einem Human-Human-Hybridom abgeleitet
sind und befähigt sind, ein Differenzierungs-Antigen
menschlicher Lymphocyten zu erkennen oder eine
immunsuppressive Wirksamkeit gegenüber menschlichen Lymphocyten
auszuüben und die sich als nebenwirkungsfreie Arzeimittel
zur Therapie von Erkrankungen in der Humanmedizin eignen.
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Die Erfindung stellt ferner ein neues Verfahren zur
Immunsuppression zur Verfügung, bei dem ein von einem
Human-Human-Hybridom abgeleiteter monoklonaler Antikörper
verwendet
wird, der ohne Gefahr von Nebenwirkungen Menschen
verabreicht werden kann.
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Der Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, ein neues
diagnostisches Verfahren anzugeben, bei dem ein von einem
Human-Human-Hybridom abgeleiteter monoklonaler Antikörper
verwendet wird, der befähigt ist, ein Differenzierungs-
Antigen menschlicher Lymphocyten zu erkennen.
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Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind von
einem Human-Human-Hybridom abgeleitet, das unter der
Hinterlegungsnummer FERM BP-2384 hinterlegt ist; sie sind
befähigt, ein Differenzierungs-Antigen menschlicher
Lymphocyten zu erkennen oder eine immunsuppressive Wirkung
gegenüber menschlichen Lymphocyten auszuüben.
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Nach einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung ein Verfahren
zur Erfassung oder zur Bestimmung von
Dlfferenzierungs-Antigenen in biologischen Proben an, bei dem die biologische
Probe mit einem monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht
wird, der von einem Human-Human-Hybridom abgeleitet ist,
das unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2384 hinterlegt
ist, und der befähigt ist, das Differenzierungs-Antigen
menschlicher Lymphocyten zu erkennen, so daß ein Komplex
des monoklonalen Antikörpers mit Lymphocyten in der
biologischen Probe gebildet wird, die dieses
Differenzierungs-Antigen aufweisen, wonach der Komplex erfaßt oder bestimmt
wird.
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Das oben erwähnte Human-Human-Hybridom kann durch die
Vermehrung inhibierende Behandlung einer transformierten
menschlichen Zelle und anschließende Zellfusion der so
behandelten transformierten menschlichen Zelle mit einer
menschlichen, Antikörper produzierenden Zelle hergestellt
werden.
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Das oben erwähnte Diagnoseverfahren wird so durchgeführt,
daß die zu untersuchende biologische Probe mit den oben
definierten monoklonalen Antikörpern in Kontakt gebracht
wird, so daß sich Komplexe zwischen den monoklonalen
Antikörpern und den Lymphocyten in der Probe bilden, die ein
Differenzierungs-Antigen aufweisen, worauf der so gebildete
Komplex erfaßt oder bestimmt wird.
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Im Rahmen der Erfindung wurden ausgedehnte Untersuchungen
zur Herstellung eines Human-Human-Hybridoms, das eine
stabile Aktivität bei der Erzeugung eines humanen monoklonalen
Antikörpers aufweist, nach einem Verfahren durchgeführt,
das bereits früher in JP-63-17688 angegeben worden war, und
nach dem ein Human-Human-Hybridom dadurch hergestellt
werden kann, daß eine transformierte menschliche Zelle einer
Behandlung unterzogen wird, um die Zellvermehrung zu
inhibieren, und die so behandelte transformierte menschliche
Zelle einer Zellfusion mit einer menschlichen, Antikörper
produzierenden Zelle unterzogen wird.
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Weitere Untersuchungen führten zu der neuen Feststellung,
daß das oben erwähnte Human-Human-Hybridom einen humanen
monoklonalen Antikörper erzeugt, der befähigt ist, ein
Differenzierungs-Antigen menschlicher Lymphocyten zu erkennen
oder eine immunsuppressive Wirksamkeit gegenüber
menschlichen Lymphocyten auszuüben; ferner wurde festgestellt, daß
der so erhaltene humane monoklonale Antikörper ohne die
Gefahr irgendwelcher Nebenwirkungen als immunsuppressives
Mittel verwendet werden kann und sich auch zur Erfassung
oder Bestimmung menschlicher Lymphocyten eignet, die ein
Differenzierungs-Antigen aufweisen, indem ein Komplex
zwischen
dem monoklonalen Antikörper und dem Lymphocyten
gebildet wird.
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Der erste Schritte bei der Herstellung eines Human-Human-
Hybridoms mit einer stabilen Aktivität hinsichtlich der
Antikörperproduktion besteht in der Behandlung einer
transformierten menschlichen Zelle zur Inhibierung der
Zellvermehrung. Verwendbare transformierte Humanzellen, die sich
hierfür als Elternzellen eignen, sind beispielsweise
menschliche B-Zellen, menschliche Hepatocyten, menschliche
Splenocyten, Tonsillarzellen, menschliche Lymphknotenzellen
u.dgl., wobei transformierte menschliche B-Zellen besonders
bevorzugt sind. Die Transformation kann nach einem
herkömmlichen Verfahren wie etwa durch Infektion der Zelle mit
einem Virus und ein genetisches Rekombinationsverfahren
durchgeführt werden.
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Zu den Verfahren zur Inhibierung der Vermehrung dieser
transformierten menschlichen Zellen gehören die chemische
Behandlung, die Bestrahlung mit hochenergetischer Strahlung
u.dgl. . Die Behandlung zur Inhibierung der Vermehrung
transformierter menschlicher Zellen wird vorzugsweise durch
eine chemische Behandlung mit einem Reagens vorgenommen,
das befähigt ist, die Proteinsynthese oder die RNA-Synthese
zu inhibieren, beispielsweise Emetin, Actinomycin D u.dgl.,
wobei diese Verbindungen entweder allein oder in Form von
Kombinationen von zwei oder mehreren verwendet werden
können. Die anzuwendende Menge des chemischen Reagens sollte
in geeigneter Weise je nach Art der der Zellfusion zu
unterziehenden Zellen ausgewählt werden. Im Sinne einer
pauschalen Angabe sollte die Menge des Reagens ausreichend
sein, um die transformierten menschlichen Zellen innerhalb
von 7 bis 10 Tagen vollständig abzutöten. Die
transformierten menschlichen Zellen nach der Behandlung zur Inhibierung
der Zellvermehrung können heterozygot oder homozygot sein,
wobei jedoch homozygote Zellen im Hinblick auf die
Effizienz beim nachfolgenden Screening-Schritt bevorzugt sind.
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Der nächste Schritt besteht in der Zellfusion der
transformierten menschlichen Zellen nach der Behandlung zur
Inhibierung der Zellvermehrung in der oben beschriebenen
Weise mit Antikörper produzierenden menschlichen Zellen zur
Herstellung eines Human-Human-Hybridoms. Beispiele für die
oben erwähnten Antikörper produzierenden Zellen sind etwa
menschliche B-Zellen, menschliche Plasmazellen, menschliche
Hepatocyten, menschliche embryonale Hepatocyten,
menschliche Splenocyten, menschliche Lymphknotenzellen, kultivierte
menschliche B-Zellen u.dgl., wobei menschliche B-Zellen und
kultivierte menschliche B-Zellen bevorzugt sind. Die
Antikörper produzierenden menschlichen Zellen können in der
Form verwendet werden, in der sie von einem Gewebe oder aus
Blut aus dem menschlichen Körper isoliert werden; sie
können jedoch wahlweise auch nach einer
Transformationsbehandlung verwendet werden. Es ist in diesem Zusammenhang
allgemein wünschenswert, daß sich an die Zellfusion eine
Behandlung mit einem Anti-HLA-Antikörper anschließt, um
nichtfusionierte Antikörper produzierende menschliche Zellen
auszuschließen. Die Zellfusion wird nach einem bekannten
Verfahren durchgeführt, beispielsweise nach einem Verfahren,
bei dem Polyethylenglycol, ein Virus u.dgl. verwendet
werden, oder nach einem elektrischen Zellfusionsverfahren. Die
Zellfusion wird vorzugsweise so durchgeführt, daß die
menschlichen Zellen, deren Vermehrung inhibiert ist, in
einer Anzahl eingesetzt werden, die der 1- bis 30-fachen
Anzahl der Antikörper produzierenden menschlichen Zellen
entspricht. Verschiedene Arten von Kulturmedien können für
die Zellfusion herangezogen werden, beispielsweise RPMI
1640-Kulturmedium, MEM-Kulturmedium und modifiziertes
Dulbecco-Kulturmedium oder davon abgeleitete Kulturmedien
mit und ohne Serumzusatz.
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Das auf diese Weise erhaltene Human-Human-Hybridom wird
anschließend darauf geprüft, ob es die gewünschte Aktivität
der Antikörperproduktion aufweist, und kloniert.
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Die Aktivität der Antikörperproduktion kann durch
Bestimmung des von dem Human-Human-Hybridom erzeugten Antikörpers
geprüft werden. Dieser Antikörpertest wird so durchgeführt,
daß seine Reaktivität gegenüber einem sensibilisierten
Antigen nach einem der verschiedenen bekannten Verfahren zur
Erfassung von Antikörpern geprüft wird, wozu allgemein das
ELISA-Verfahren, das in Meth. of Enzymol., Vol. 70 (1980)
S. 419-439, beschrieben ist, das Plaque-Verfahren, das
Spot-Verfahren, das Agglutinationsreaktionsverfahren, das
Ouchterlony-Verfahren, das Enzym-Immunoassay (EIA), das
Radioimmunoassay (RIA), der Cytotoxizitätstest u.dgl.
gehören (vgl. Hybridoma Method and Monoclonal Antibody, Hrsg.
R & D Planning Co., 1982, S. 30-53, sowie andere
entsprechende Literatur). Die Klonierung kann leicht so
vorgenommen werden, daß der bekannte Schritt der Subkultivierung
wiederholt durchgeführt wird, oder so, daß ein
herkömmliches Verfahren der begrenzten Verdünnung angewandt wird.
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Das auf diese Weise hergestellte Human-Human-Hybridom wird
üblicherweise in einem geeigneten Kulturmedium, wie RPMI
1640-Kulturmedium, MEM-Kulturmedium und modifiziertem
Dulbecco-Kulturmedium oder davon abgeleiteten Kulturmedien
mit und ohne Serumzusatz, bei einer Temperatur von 36,5 bis
37,5 ºC bei einem pH-Wert des Mediums, der im Bereich von
6,7 bis 7,5 und vorzugsweise 7,0 bis 7,3 kontrolliert wird,
und einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 0,5 bis
6 ppm und vorzugsweise 3 bis 5 ppm kultiviert. Wenn der pH-
Wert des Kulturmediums außerhalb des oben angegebenen
Bereichs liegt, wird bezüglich der Vervielfältigungsrate
der Hybridome ein Verzögerungseffekt hervorgerufen,
insbesondere in der Anfangsphase. Wenn die Konzentration an
gelöstem Sauerstoff außerhalb des oben angegebenen Bereichs
liegt, wird die Produktivität des Hybridoms bezüglich des
angestrebten Antikörpers beeinträchtigt. Das zur
Kultivierung verwendete Gefäß unterliegt keiner besonderen
Einschränkung; zu den geeigneten Gefäßen gehören Mikroplatten,
Petrischalen, Glaskolben, Kultivierungstanks u.dgl., je
nach dem gewünschten Maßstab der Kultivierung.
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Das in dieser Weise kultivierte Human-Hybridom erzeugt den
menschlichen monoklonalen Antikörper und sezerniert ihn in
den Überstand des Kulturmediums. Der menschliche
monoklonale Antikörper kann nach einem herkömmlichen Verfahren oder
einer Kombination herkömmlicher Verfahren aus dem
Kulturmedium isoliert und gereinigt werden; hierzu gehören die
Abtrennung durch Zentrifugieren, die Ultrafiltration, die
Gelfiltration, die Ionenaustauschchromatographie, die
Affinitätschromatographie u.dgl. . Eine hohe Effizienz bei der
Isolierung und Reinigung der Antikörper wird durch
Affinitätschromatographie erzielt, bei der eine mit Protein A
beladene Säule verwendet wird.
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Da der auf diese Weise erhaltene monoklonale Antikörper von
einem Human-Human-Hybridom abgeleitet ist, kann er als
immunuppressives Mittel ohne Auftreten irgendwelcher
Nebenwirkungen beim Menschen verwendet werden.
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Wenn das Human-Human-Hybridom durch geeignete Selektion der
transformierten menschlichen Zelle und der menschliche
Antikörper produzierenden Zelle, die bei der Zellfusion
eingesetzt werden, erzeugt wird, kann das Human-Human-
Hybridom einen menschlichen monoklonalen Antikörper
sezernieren, der befähigt ist, ein Differenzierungs-Antigen
menschlicher Lymphocyten zu erkennen oder eine
immunsuppressive Wirksamkeit gegenüber menschlichen Lymphocyten
auszuüben. Das Human-Human-Hybridom, das den
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erzeugt, ist der Stamm
223.10.33, der unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2384
beim Fermentation Research Institute, Japan, hinterlegt ist
und durch Zellfusion zwischen dem SA-1-Stamm, also
transformierten menschlichen B-Blastzellen als transformierten
menschlichen Zellen, und dem EBV-SU-Stamm, also
transformierten, menschliche Antikörper produzierenden B-Zellen
als menschliche Antikörper produzierende Zellen,
hergestellt wurde. Der hier erhaltene menschliche monoklonale
Antikörper ist im Hinblick auf die Befähigung zur Erkennung
eines Differenzierungs-Antigens menschlicher Lymphocyten
oder die immunsuppressive Wirksamkeit gegenüber
menschlichen Lymphocyten neuartig und eignet sich für
therapeutische und diagnostische Zwecke, insbesondere als
immunsuppressives Mittel, bei dem keine Störungen durch
irgendwelche Nebenwirkungen bei der Anwendung beim Menschen
vorliegen.
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Die Arzneimittelform, in der die erfindungsgemäßen
menschlichen monoklonalen Antikörper als immunsuppressives Mittel
verwendet werden, unterliegt keiner besonderen
Beschränkung; hierzu gehören pillen, Tabletten, Granulate, Pulver,
Kapseln, Sirupe, Salben, Einreibemittel, Injektionen
u.dgl. . Dem Fachmann ist geläufig, daß jede dieser
Arzneimittelformen durch Compoundieren des monoklonalen
Antikörpers als Wirkstoff mit pharmakologisch geeigneten,
üblicherweise bei galenischen Formulierungen verwendeten
Additiven zu einer Zusammensetzung verarbeitet wird.
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Was die zu verabreichende Dosis des Arzneimittels anlangt,
kann eine ausreichende Wirkung wie angestrebt üblicherweise
mit 1 mg bis 5 g des verabreichten Medikaments erzielt
werden, berechnet als monoklonale Antikörper pro Tag und
erwachsene Person.
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Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper weisen keine
Reaktivität mit normalen T- und B-Zellen des menschlichen
peripheren Blutkreislaufs auf, sind aber gegenüber
Lymphocyten reaktiv, die mit verschiedenen Arten von Mitogenen
und Interleukin-2 (IL-2) stimuliert wurden. Aus diesem
Grund können die monoklonalen Antikörper als Mittel zur
Erkennung des Auftretens eines Differenzierungs-Antigens
durch Aktivierung von Lymphocyten verwendet werden und
eignen sich entsprechend für diagnostische Zwecke bei
bestimmten Erkrankungen. Dies bedeutet, daß ein durch Aktivierung
menschlicher Lymphocyten auftretendes
Differenzierungs-Antigen offenbar fremde Substanzen durch die Wirksamkeit
des Immunsystems erkennt und eliminiert, wenn ein
menschlicher Organismus mit Bakterien oder Viren infiziert wird
oder unter einer eitrigen Erkrankung leidet. Da die
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper befähigt sind,
derartige aktivierte, ein Differenzierungs-Antigen aufweisende
menschliche Lymphocyten zu erkennen, können die
monoklonalen Antikörper in wirkungsvoller Weise für diagnostische
Zwecke in vivo oder in vitro bei Patienten angewandt
werden, die unter Infektionskrankheiten leiden oder solche
Erkrankungen überstanden haben oder eine Operation
durchgemacht haben, wobei die biologische Probe mit dem
monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht wird, worauf sich ein
Komplex mit den Lymphocyten bildet, und die
komplexbildenden Lymphocyten erfaßt oder bestimmt werden.
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Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, sind die
erfindungsgemäßen, zur Erkennung eines Differenzierungs-Antigens
menschlicher Lymphocyten befähigten monoklonalen Antikörper
absolut frei von dem Risiko irgendwelcher Nebenwirkungen,
wenn sie Menschen verabreicht werden, da sie ein Produkt
eines Human-Human-Hybridoms und nicht ein gegen den
menschlichen Körper gerichtetes Fremdprotein darstellen.
Dementsprechend ist die Anwendung der monoklonalen Antikörper
nicht auf Wirkstoffe in immunsuppressiven Mitteln
beschränkt, da die monoklonalen Antikörper auch in wirksamer
Weise auf den Gebieten der Therapie und Diagnostik in
breitem Maße eingesetzt werden können.
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Was die Anwendung als immunsuppressive Mittel anlangt,
können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper als
Hauptbestandteil immunsuppressiver Mittel in
zufriedenstellender Weise als Mittel zur Verhinderung einer
Organabstoßung bei Organtransplantationen oder als Arzneimittel
zur Therapie bestimmter Immunanomalitäten, wie etwa
Autoimmunkrankheiten, verwendet werden, da, im Gegensatz zu
herkömmlichen iTnmunsuppressiven Mitteln wie OKT-3 u.dgl.,
die von der Maus abgeleitet sind, die erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper von einem Human-Human-Hybridom
abgeleitet sind und bei Verabreichung beim Menschen absolut
frei von nachteiligen Nebenwirkungen sind.
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Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können
Antigene mit einem Molekulargewicht im Bereich von 100 bis
105 kDa, 120 bis 130 kDa und 270 bis 280 kDa erkennen, für
deren Erfassung bisher keine Mittel bekannt waren, so daß
die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper die
Möglichkeit eröffnen, Antigene zu erfassen, die nach dem Stand der
Technik nicht erfaßt werden konnten.
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Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung im
einzelnen, wobei die Angaben in keiner Weise einschränkend
sind.
Herstellungsbeispiel: Herstellung eines Human-Human-
Hybridamstums 223.10.33
(I) Herstellung Antikörper produzierender B-Zellen
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Von einer schwangeren Probandin (SU: HLA-A2, -: Bw 46.22:
Cw 7, -: DR 4,8) wurde peripheres Blut abgenommen; die
Lymphocyten wurden daraus nach dem
Conray-Ficoll-Gradientenverfahren gewonnen. Die B-Zellen wurden durch Trennung
der T-Zellen und der B-Zellen nach dem
Rosettenbildungsverfahren erhalten, wobei mit Neuraminidase behandelte SRBC
verwendet wurden.
(II) Sensibilisierung von B-Zellen mit Epstein-Barr-Virus
(EBV)
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Ein EBV-Stamm wurde in einer Kultur von EBV-transformierten
Krallenaffenzellen, Stamm B95-8, durch Kultivierung in
einem RPMI 1640-Kulturmedium unter Zusatz von 10 %
Kälberfetalserum (FCS) hergestellt, wobei der die Viren
enthaltende Überstand zweimal filtriert wurde. Der Virusstamm
wurde zu 100 ul einer Suspension zugegeben, die B-Zellen in
einer Zelldichte von 5 10&sup4; Zellen/100 ul enthielt, worauf
1 h bei 37 ºC inkubiert wurde. Danach wurden 800 ml des
gleichen, mit 10 % FCS-versetzten Kulturmediums RPMI 1640
in frischer Form zugesetzt. Die Inkubierung wurde
fortgesetzt, wobei alle 3 bis 4 Tage das gleiche Volumen an
frischem Kulturmedium zugegeben wurde. Transformierte
B-Zellen, die im folgenden als EBV-SU bezeichnet sind, konnten
etwa 2 Wochen nach der Sensibilisierung festgestellt
werden.
(III) Behandlung der Elternzellen, d.h. EBV-transformierter
B-Lymphoblastenzellen (SA-1), mit Emetin und
Actinomycin D
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Homozygote SA-1-Zellen (HLA-A24, B7, C-, DR 1, Dw 1) wurden
in einem RPMI 1640-Kulturmedium, das mit 10 % FCS versetzt
war, kultiviert. Die in der Wachstumsphase gewonnenen
Zellen wurden durch dreimaliges Zentrifugieren bei 1000 min&supmin;¹
mit RPMI 1640-Medium während jeweils 10 min gewaschen und
in einer Zelldichte von 1 10&sup4; Zellen/ml konditioniert;
anschließend wurde mit einer 5 10&supmin;&sup5;
M-Emetin-hydrochlorid-Lösung, die 0,1 ug/ml Actinomycin D enthielt, 2 h bei 37 ºC
behandelt. Die oben erwähnten Konzentrationen an Emetin und
Actinomycin D waren ausreichend, um die Zellteilung und
Zellvermehrung der SA-1-Zellen vollständig zu unterdrücken.
Freies Emetin und Actinomycin D wurden durch dreimaliges
Waschen mit frischen Anteilen an RPMI 1640-Medium
vollständig entfernt, wodurch SA-1-Zellen mit inhibierter
Zellvermehrung erhalten wurden.
(IV) Zellfusion und Hybridom-Wachstumsbedingungen
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Die gesammelten und dreimal mit RPMI 1640-Medium
gewaschenen EBV-SU-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium
suspendiert und mit den SA-1-Zellen mit inhibierter
Zellvermehrung im Verhältnis 10:1 gemischt.
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Das oben hergestellte Zellgemisch wurde mit 0,25 ml 15 %
DMSO-42,5 % Polyethylenglycol (PEG1000)-Lösung versetzt,
was 1 min unter kontinuierlicher Quellung vorgenommen
wurde; anschließend wurden 9 ml frisches RPMI 1640-Medium
zugegeben,
das auf 37 ºC erwärmt war und in einer
Geschwindigkeit von 1 ml/min zugesetzt wurde.
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Die suspendierten Zellen wurden 10 min bei einer Drehzahl
von 1000 min&supmin;¹ zentrifugiert; der erhaltene Zellkuchen
wurde dann in mit 10 % FCS versetztem RPMI 1640-Medium
suspendiert. Die Suspension wurde auf die Vertiefungen von
Mikrotiterplatten verteilt, wobei die Zelldichte in der
Suspension so eingestellt wurde, daß 5 10&sup4; Zellen auf jede
Vertiefung entfielen. Alle 2 bis 3 Tage wurde eine zusätzliche
Menge von 0,1 ml frischem Kulturmedium in jede Vertiefung
gegeben.
(V) Erfassung des HLA-Antigens und Selektion fusionierter
Zellen
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Das Oberflächen-HLA-DR-Antigen des Hybridoms wurde durch
Mikrolymphocytotoxizitättest ermittelt, um eine Selektion
der fusionierten Zellen mit den 1-, 4- und 8-Antigenen
durchzuführen. Aus 1 Million EBV-SU-Zellen wurden zwei
Hybridome erhalten, welche die HLA-DR 1-, 4- und 8-Antigene
aufwiesen. Anschließend wurde das angestrebte Hybridom
durch das Verfahren der begrenzten Verdünnung erhalten.
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Anschließend wurde dieses Hybridom 223 in einer Zelldichte
von 10 Zellen/Vertiefung kloniert, wobei ein Subklonstamm
223.10.33 erhalten wurde.
Beispiel 1: Herstellung von Immunglobulin M (IgN) durch den
Stamm 223.10.33 in mit Serum versetztem
Kulturmedium
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Die Zellen des im Herstellungsbeispiel erhaltenen Stamms
223.10.33 wurden in einem RPMI 1640-Kulturmedium, das 10 %
FCS enthielt, in einem Kolben bei 37 ºC unter einer
Atmosphäre aus einem gasförmigen Gemisch von 5 %
Kohlendioxid und 95 % Luft subkultiviert. Die so subkultivierten
Zellen wurden in 5 l frischem, gleichem Kulturmedium wie
oben in einer Zelldichte von 2 10&sup5; Zellen/ml dispergiert;
die Kultivierung wurde unter Rühren etwa 6 d in einem
Drehkolben von 5 l Fassungsvermögen bei einer Drehzahl von
20 min&supmin;¹ durchgeführt, wobei die Konzentration des gelösten
Sauerstoffs 4 ppm betrug. Auf diese Weise wurde eine Kultur
erhalten, die etwa 1 10&sup6; Zellen/ml enthielt. Die Zellen
wurden durch 5 min Zentrifugieren bei einer Drehzahl von
4000 min&supmin;¹ aus der Kultur abgetrennt, wobei 5 l Überstand
erhalten wurden, der einer Ultrafiltration unterzogen
wurde, für die eine Membran verwendet wurde, mit der
Teilchen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 300000
abgetrennt werden konnten, um so das Volumen auf 500 ml
einzuengen. Der so aufkonzentrierte Überstand wurde mit
Ammoniumsulfat in einer Konzentration versetzt, die 50 %
der Sättigung entsprach; das Gemisch wurde zur Gewinnung
des Niederschlags zentrifugiert, der ein Immunglobulin
(IgM) enthaltendes Rohprodukt darstellte. Dieses Rohprodukt
wurde in 150 ml einer 10 mM Phosphatpufferlösung von pH 7,4
gelöst, die 0,9 % Natriumchlorid enthielt. Die Lösung wurde
etwa 18 h gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert, wobei
etwa 200 ml dialysierte Lösung anfielen. Danach wurden
100 ml der so erhaltenen dialysierten Lösung auf eine
Chromatographiesäule mit einem Innendurchmesser von 5 cm und
einer Höhe von 90 cm aufgegeben, die mit Sephacryl S-300
gefüllt war; die Elution wurde mit der gleichen
Pufferlösung durchgeführt. Die Bestimmung des IgM in den
Eluatfraktionen geschah durch photometrische Messung bei einer
Wellenlänge von 280 nm sowie nach dem ELISA-Verfahren. Die
IgM enthaltende Fraktion in einem Volumen von etwa 250 ml
wurde dann einer Ultrafiltration unterzogen, wodurch eine
konzentrierte Lösung mit einem Volumen von 6 ml erhalten
wurde, die einen Antikörper gegen den Stamm 223.10.33
enthielt. Diese Antikörperlösung enthielt IgM in einer
Konzentration von 1 mg/ml; ihr Titer war aufgrund des
komplementabhängigen Zellcytotoxizitätstests 256-fach erhöht.
Beispiel 2: Herstellung von Igx durch den Stamm 223.10.33
in GIT-Kulturmedium
-
Das in diesem Beispiel verwendete Kulturmedium war ein im
Handel erhältliches GIT-Kulturmedium, das anstelle von
Kälberfetalserum mit einem Zellwachstumsfaktor in einem
tierischen Serum versetzt war.
-
Die im Herstellungsbeispiel erhaltenen Zellen des Stamms
223.10.33 wurden in dem oben erwähnten Kulturmedium in
einem Kolben bei 37 ºC unter einer Atmosphäre aus einem
gasförmigen Gemisch von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft
subkultiviert. Die so subkultivierten Zellen wurden durch
5 min Zentrifugieren bei einer Drehzahl von 1500 min&supmin;¹
gewonnen und auf 20 Kolben von jeweils 75 cm² Größe verteilt,
die 30 ml frisches GIT-Kulturmedium enthielten; die Zellen
wurden darin in einer Zelldichte von 4,6 10&sup5; Zellen/ml
suspendiert. Die Suspensionen in den 20 Kolben wurden zu einem
Volumen von 600 ml vereinigt und in einen Drehkolben von
2 l Fassungsvermögen gegeben, in den auch 1400 ml frisches,
gleiches Kulturmedium gegeben wurden, wodurch eine
Zelldichte von 2 10&sup5; Zellen/ml erzielt wurde; die dispergierten
Zellen wurden dann unter kontinuierlichem Rühren bei einer
Drehzahl von 32 min&supmin;¹ und einer Konzentration an gelöstem
Sauerstoff von 4 ppm weiter kultiviert.
-
Wenn die Zelldichte nach 6 d Kultivierung 1 10&sup6; Zellen/ml
erreicht hatte, wurden die Zellen durch 5 min
Zentrifugieren
bei einer Drehzahl von 4000 min&supmin;¹ aus der Kultur
abzentrifugiert, wobei 2 l Überstand erhalten wurden. Der
Überstand wurde von oben durch eine Chromatographiesäule
mit einem Innendurchmesser von 0,5 cm und einer Länge von
15 cm, die mit mit Protein A beladener Sepharose CL-6B
gefüllt war, in einem Durchsatz von 1 ml/min
hindurchgeleitet, um das IgM am Säulenfüllmaterial zu adsorbieren;
anschließend wurde mit 0,02 M Phosphatpufferlösung von pH 4
bei einem Durchsatz von 1 ml/min gewaschen, worauf das IgM
mit einer 0,03 M Phosphatpufferlösung von pH 3 bei einem
Durchsatz von 1 ml/min eluiert wurde. Die Ermittlung des
IgM in den Eluatfraktionen erfolgte durch photometrische
Messung bei einer Wellenlänge von 280 nm; die Bestimmung
des IgM wurde nach dem ELISA-Verfahren durchgeführt.
-
200 ml der so erhaltenen, IgM enthaltenden Fraktion wurden
der FPLC-Gelchromatographie durch eine Säule mit Pharmacia
Superose 6 (Produkt der Firma Pharmacia Co.) unterzogen,
wobei eine 0,01 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert
von 6,5 bei einem Durchsatz von 0,5 ml/min als
Elutionsmittel verwendet wurde; die IgM enthaltende Fraktion mit
einem Volumen von 100 ml wurde dann der Ultrafiltration
unterzogen, wobei eine Membran verwendet wurde, mit der
Teilchen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa
300000 abgetrennt werden konnten; dabei wurden 10 ml einer
konzentrierten Lösung erhalten, die einen Antikörper gegen
den Stamm 223.10.33 enthielt, was 10 mg IgM entspricht.
Dieser Antikörper wurde aufgrund der Ergebnisse der SDS-
Elektrophorese als rein identifiziert. Der Titer dieser
Antikörper lösung war aufgrund der Bestimmung durch Test der
komplementabhängigen Cytotoxizität 512-fach höher.
Beispiel 3: Reaktivität des 223.10.33-Antikörpers mit
einkernigen Zellen aus dem peripheren Blut:
Test der komplementabhängigen Cytotoxizität
-
Aus Proben von peripherem Blut von 18 normalen Personen
wurden die einkernigen Zellen nach dem
Conray-Ficoll-Verfahren isoliert; diese wurden dann nach dem
Nylonsäulenverfahren und dem Rosettenbildungsverfahren mit roten
Blutkörperchen vom Schaf in die T-Zellen und die B-Zellen
aufgetrennt. Unter Verwendung dieser T-Zellen und B-Zellen
sowie auch von einkernigen peripheren Blutzellen, die mit
drei Arten von Mitogenen stimuliert worden waren, wozu PHA,
d.h. Phytohämaglutinin, PWM, d.h. Kermesbeeren-Mitogen, und
ConA, d.h. Concanavalin A, sowie IL-2, d.h. Interleukin-2,
gehörten, wurden Versuche durchgeführt. Dementsprechend
wurden PHA, PWM, ConA und IL-2 jeweils zu RPMI
1640-Kulturmedium, das 10 % Humanserum enthielt, in Konzentrationen
von 0,1 %, 1 %, 10 4g/ml bzw. 1 u zugegeben, worauf 5 d zur
Stimulierung kultiviert wurde. 1 41 der in Beispiel 1
hergestellten Antikörperlösung wurde auf eine Terasaki-Platte
gegeben, wonach die oben beschriebenen Targetzellen
portionsweise in jede Vertiefung gegeben wurden, wobei
2000 Zellen/GVB mit Gelatine-Veronal-Puffer erzielt wurden;
anschließend wurde die Reaktion 1 h bei 37 ºC durchgeführt.
Im Anschluß daran wurden 5 ul eines zweifach verdünnten
Kaninchen-Komplements (Produkt der Firma Peritus Co.)
zugegeben, wonach die Reaktion 2 h bei Raumtemperatur
vorgenommen wurde; anschließend wurde mit Eosin gefärbt und mit
Formalin fixiert; schließlich wurde mikroskopisch
untersucht, ob die Zellen lebendig oder tot waren. Die
Ergebnisse der Reaktivitätsuntersuchung, die als Verhältnis der
Anzahl positiver Zellen zur Gesamtzahl der untersuchten
Zellen angegeben sind, waren wie folgt:
-
T-Zellen aus peripherem Blut: 0/18
-
B-Zellen aus peripherem Blut: 0/18
-
PHA-stimulierte einkernige Zellen aus
peripherem Blut: 5/5
-
PWM-stimulierte einkernige Zellen aus
peripherem Blut 5/5
-
ConA-stimulierte einkernige Zellen aus
peripherem Blut 3/5
-
IL-2-stimulierte einkernige Zellen aus
peripherem Blut 5/5.
-
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß der 223.10.33-Antikörper
gegenüber den einkernigen Zellen aus peripherem Blut, die
mit den Mitogenen oder IL-2 stimuliert waren, reaktiv war,
während gegenüber den nichtstimulierten T-Zellen und
B-Zellen des peripheren Bluts keine Reaktivität vorlag.
Beisviel 4: Reaktivität der monoklonalen Antikörper mit
aktivierten menschlichen T-Zellen
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Aus Proben von peripherem Blut von drei normalen Personen
wurden nach dem Conray-Ficoll-Verfahren die einkernigen
Zellen isoliert, von denen die T-Zellen nach dem
Rosettenbildungsverfahren unter Verwendung von roten Blutkörperchen
vom Schaf abgetrennt wurden. Diese Zellen wurden in einem
RPMI 1640-Kulturmedium suspendiert, dem 20 % Humanserum
zugesetzt waren und das 10 u oder 1 u IL-2 enthielt; die
Zelldichte betrug 1 10&sup5; Zellen/ml; die Kultivierung
erfolgte bei 37 ºC unter einer Atmosphäre eines gasförmigen
Gemischs von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft, wobei das
halbe Volumen des Kulturmediums periodisch einmal alle 3
Tage ersetzt wurde. Die so kultivierten Zellen wurden von
jedem Kulturmedium nach 1, 2, 3, 5 und 7 Tagen Kulturdauer
gewonnen; ferner wurden Proben vor dem Beginn der
Kultivierung
entnommen. Nach dem wie in Beispiel 3 durchgeführten
Cytotoxizitätstest wurden die Proben mikroskopisch
untersucht, ob die Zellen lebendig oder abgestorben waren. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1
als Prozentsatz geschädigter T-Zellen, bezogen auf den
Mittelwert für 3 Personen, angegeben. Wie aus der Tabelle
hervorgeht, war die Reaktivität des 223.10.33-Antikörpers ab
dem 5. Tag der Kultivierung deutlich.
Tabelle 1
Stimulans IL-2 Konzentration
Kultivierungsdauer (d)
Beispiel 5: Reaktivität der monoklonalen Antikörper mit
transformierten menschlichen B-Zellen
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Aus Proben von peripherem Blut von drei normalen Personen
wurden nach dem Conray-Ficoll-Verfahren die einkernigen
Zellen isoliert, von denen die B-Zellen nach dem
Rosettenbildungsverfahren unter Verwendung von roten Blutkörperchen
vom Schaf abgetrennt werden. Diese B-Zellen wurden nach dem
in Nature, Band 269 (1977) S. 420-422, beschriebenen
Verfahren mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert, wobei
EBVB-Zellen erhalten wurden. Die Reaktivität der Antikörper
mit diesen Zellen wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 3
geprüft, wobei die Kultivierung bis zu 34 Tagen fortgesetzt
wurde; dabei ergab sich, daß die Antikörper bis zum 9. Tag
der Kultivierung gegenüber den Zellen nicht reaktiv waren,
jedoch Reaktivität nach 12 oder 14 Tagen Kultivierungsdauer
vorlag. Der Prozentsatz der geschädigten Zellen ist in der
nachstehenden Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Kultivierungsdauer (d)
geschädigte Zellen; Mittelwert (%)
Beispiel 6: Einfluß auf die Antikörperproduktion
einkerniger Zellen
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Aus normalem menschlichem peripherem Blut wurden nach dem
Conray-Ficoll-Verfahren einkernige Zellen isoliert. Die
Zellen wurden in einem RPMI 1640-Kulturmedium suspendiert,
das 1 % PWM enthielt und mit 10 % Humanserum versetzt war;
die Zelldichte betrug 5 10&sup5;-Zellen/ml. Die Kultivierung
wurde bei 37 ºC vorgenommen, wobei eine U-förmige
Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verwendet wurde und die
Kultivierung unter einer Atmosphäre eines gasförmigen
Gemischs von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft durchgeführt
wurde. 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 und 120 h nach Beginn
der Kultivierung wurden jeweils 20 ul einer
Antikörperlösung in RPMI 1640-Kulturmedium in jede Vertiefung
gegeben. Die Antikörperlösung war eine Lösung von 223.10.33-
Antikörper in einer Konzentration von 5 mg/ml oder eine
Lösung von Standard-Human-IgM (bezogen von Kappel Co.) in
einer Konzentration von 5 mg/ml. Nach 1 Woche fortgesetzter
Kultivierung wurden die Zellen aus der Kultur durch
Zentrifugieren gewonnen, worauf die IgG-reaktiven und
IgM-reaktiven plaquebildenden Zellen (PFC) ermittelt wurden; dabei
wurde das Reversplaque-Verfahren angewandt, das in "Manual
of Immunological Experiments", C, S. 2003-2004, beschrieben
ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt,
in der die Anzahl der IgG-reaktiven und IgM-reaktiven PFCs
(IgG-PFC und IgM-PFC) pro insgesamt 10 4-Zellen angegeben
sind. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß der 223.10.33-
Antikörper während der gesamten Zeitdauer, beginnend
unmittelbar nach der Stimulierung mit PWM bis zum Stadium der
Differenzierung und Zellvermehrung, Aktivität zur
Inhibierung der Bildung von IgG und IgM besaß, während das im
Handel erhältliche Human-IgM diese Aktivität nicht besaß.
Tabelle 3
IgG-PFC/10&sup4;
IgM-PFC/10&sup4;
PWM
Kultivierung dauer bis zur Zugabe des Antikorpers (h)
Zugesetzter 223.10.33-Antikörper
Zugesetztes Human-IgM
Beispiel 7: Test des Nolekulargewichts erkannter Antigene
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Zum Test des Molekulargewichts der erkannten Antigene wurde
das Western-Blotting-Verfahren angewandt. Zu diesem Zweck
wurden B-85-Zellen, d.h. eine B-lymphoblastenartige
Zelllinie, die mit EBV transformiert war, und BT-1-Zellen, d.h.
Burkitt-Lymphom-Zellen, die eine besonders hohe Reaktivität
gegenüber dem Antikörper 223.10.33 aufwiesen, mit 0,5 % NP-
40 in Lösung gebracht; die Zellkerne wurden durch
Zentrifugieren abgetrennt, wobei eine Fraktion erhalten wurde,
welche die Zellmembranen enthielt. Diese Fraktion wurde der
Gelelektrophorese an einem SDS-Polyacrylamidgel unterzogen.
Danach wurde eine Übertragung vom Gel auf ein
Nitrocellulosefilter durchgeführt, worauf mit dem Antikörper 223.10.33
umgesetzt wurde, um die erkannten Antigene festzustellen;
hierbei wurde ein mit Peroxidase (POD) markiertes
Ziegen-IgM verwendet (Produkt der Firma Kappel Co.). Im Ergebnis
wurden drei entwickelte Banden festgestellt, die
Molekulargewichten von 100 bis 105 kDa, 120 bis 130 kD bzw. 270 bis
280 kDa entsprachen.
Beispiel 8: Nit den monoklonalen Antikörpern erfaßbare B-
Zellen-Marker
-
Die Reaktivität des 223.10.33-Antikörpers wurde unter
Verwendung von B-Zellen-Stämmen in verschiedenen
Differenzierungsstadien als Targetzellen untersucht, wobei das
Verfahren der indirekten Antikörperfluoreszenz angewandt wurde,
das in Handbook of Clinical Immunology (1984) S. 1510
beschrieben ist.
-
Die hier verwendeten CD-Antikörper (vgl. Clinical
Immunology, Vol. 18, Summerly Special Issue (1986) S. 149)
waren B 2 (CD 21, Kohlenteerklon), Leu-14 (CD 22, Produkt
der Firma Fujisawa Yakuhin Co.) und H 107 (CD 23, Produkt
der Firma Nitiray Co.). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4
angegeben, die bestätigen, daß der Antikörper 223.10.33 in
einer engen Korrelation mit dem Antikörper CD 23 steht.
Tabelle 4
B-Lymphocyten
Pre-B-Zellen Plasmazellem
unreif/verbleibend reif/aktiviert
Differenzierungsstadien und Zell-Stämme
Monoklonaler Antikörper
Rezeptor
Anmerkung: +: positive, -: negative, : falsch positive