JPH03297382A

JPH03297382A - ヒト―ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株及びその取得方法

Info

Publication number: JPH03297382A
Application number: JP2099842A
Authority: JP
Inventors: Hironori Murakami; 浩紀村上; Shuichi Hashizume; 秀一橋爪
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 1990-04-16
Filing date: 1990-04-16
Publication date: 1991-12-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野」本発明は、ヒト型モノクローナル抗体を産生ずるヒト−
ヒトハイブリドーマを高頻度に作製し得る新規親細胞株
及びその取得方法に関する。

「従来の技術」抗体を、予防、治療または診断を目的としてヒトに投与
する場合、ヒト型モノクローナル抗体は、マウスモノク
ローナル抗体に比べ抗原性に関する問題が少く、臨床治
療上利用範囲が非常に大きい。ヒト型モノクローナル抗
体は、ヒト由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞（親細
胞）とを融合させて得られたバイブリドーマによって生
産される。

しかし、ヒト型モノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマにおいては、マウスの場合と比べて、抗体産生細
胞と親細胞との融合効率が悪く、また、抗体産生の安定
性も悪く、抗体を大量に得ることが困難であり、免疫さ
れたリンパ球が自由に得られず、ＩｇＧタイプの抗体を
得ることが難しいなどの不利な点があった。

これらを克服するために、ヒト型の親細胞株を改良する
方法、例えば（ヒト・マウス）へテロミエローマを親細
胞として用いる方法［プロシープインク　才ブ　ナショ
ナル　アカデミ−オブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＩ　８０７３０８、
　ｆ１９８３１等］、又はマウスミエローマを親細胞と
して用いる方法［ジャーナル　才ブ　クリニカル　イン
ベスティゲーション（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、）　７０．１３０６．　　ｆ１９８２１
等１などが考えられている。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで
抗原刺激することにより特異抗体産生ハイブリドーマを
効率よく得る方法［ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　
イミュノロジー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｌ
　１４．２３．　　ｆ１９８４１等］、又は向リンパ性
ウィルスであるエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）
で抗体産生細胞を形質転換する方法［サイエンス（５ｃ
ｉｅｎｃｅｌ　　１９９゜１４３９、　　ｆ１９７８１
等］、更にはＥＢＶ形質転換細胞を親細胞と融合する方
法［プロシーディング　才ブ　ナショナル　アカデミ−
才ブ　サイエンスｆＰｒｏｃ、　Ｎａｔ−Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　７９．６６５１．　　ｆ１９８２
１等］などが試みられている。

「発明が解決しようとする課題」このようにヒト型モノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマを高頻度に作製し得る親細胞株を得る試みが種
々なされているが、現在までのところ、ヒトリンパ球と
の融合効率が高く、また、ＩｇＧタイプのヒト型モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを作製するための親細
胞株、特にヒト由来の親細胞株は得られていない。

また、ヒト由来の親細胞株を用いたヒト−ヒトハイブリ
ドーマの大きな特徴は、マウス−ヒトあるいはマウス−
ヒト−ヒトバイブリドーマと比較し、マウス由来の物質
が混入することがなく、また、ヒト型モノクローナル抗
体産生に必要な遺伝子を細胞外に放出する可能性も少な
く、安定性が高いことなどである。

従って、本発明の目的は、これらの条件を満足するヒト
型モノクローナル抗体産生用ヒト−ヒトハイブリドーマ
を作製するための新規な親細胞株及びその取得方法を提
供することにある。

「課題を解決するための手段」本発明者らは、ヒトプラズマ細胞腫細胞株ＬＩＣＲ−Ｌ
ＯＮ−ＨＭｙ２を、繰り返しクローニングすることによ
り、１個の細胞から増殖し得るようにした後、更に高濃
度の８−アザグアニンで耐性化することによって、ヒト
リンパ球との融合効率が高（、ＩｇＧ抗体を安定に産生
ずる親細胞株が得られることを見出し、本発明を完成す
るに至った。

すなわち、本発明のヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親
細胞株は、ヒトプラズマ細胞腫細胞株ＬＩ（：Ｒ−ＬＯ
Ｎ−ＨＭｙ２　　（以下、ｒＨＭ、ｙ２Ｊとする）を、
繰り返しクローニングすることにより、１個の細胞から
増殖し得るようにした後、更に高濃度の８−アザグアニ
ンで耐性化して得られ、以下の性質を有することを特徴
とする。

ａ　ヒトリンパ球との融合効率が高い。

ｂ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマは
抗体、特にＩｇＧ抗体を安定に産生ずる。

Ｃ，ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマの
抗体産生量が高い。

また、本発明のヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞
株の取得方法は、ヒト由来の腫瘍細胞株を、繰り返しク
ローニングすることにより、１個の細胞から増殖し得る
ようにした後、更に高濃度の８−アザグアニンで耐性化
することを特徴とする。

このように、本発明の一つは、特定のヒトプラズマ細胞
腫細胞株ＨＭｙ２から作製された新規の親細胞株を対象
とするものである。また、本発明のもう一つは、ヒト由
来の腫瘍細胞株から優れた性質を有する親細胞株を取得
する方法を対象とするものである。

以下に本発明について詳細に説明する。

本発明のヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株につ
いて説明すると、親細胞株を得るための元の細胞株とし
ては、ヒトプラズマ細胞腫細胞株ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−Ｈ
Ｍｙ２　　（微工研菌寄第１１４０４号）を用いる。こ
の細胞株は、融合効率が低いこと、作製したハイブリド
ーマが安定した抗体産生をしないこと、バイブリドーマ
の抗体産生量が低いこと、などの多（の問題点がある。

そこで、本発明では、これらの問題を解決するため、ま
ず、１個の細胞からでも増殖可能な、増殖能力の優れた
強い細胞を得る。すなわち、上記細胞株ＨＭｙ２を用い
て限界希釈法によりクローニングを繰り返し行う。クロ
ーニングの方法としては、例えば、９６ウエルマイクロ
プレートに１個／ウェルの割合で細胞を植え込み、増殖
能力の優れた細胞を繰り返し選択する。最初のクローニ
ング効率は４％程度であるが、約４回クローニングを行
なうことにより　１００％になり、増殖能力の優れた強
いクローンを得ることができる。

更に、高濃度の８−アザグアニン含有培地で細胞を処理
することにより、更に強いクローンを得る。この処理は
、好ましくは８−アザグアニンを添加した培地で７日間
程度培養し、８−アザグアニンの添加濃度を更に高めた
培地に移して再び７日間程度培養し、この操作を何回か
繰り返すことによって行なわれる。より好ましくは、８
−アザグアニンの添加濃度を５０〜２００μｇ／ｍｌの
範囲で段階的に高めた培地で、順次培養することによっ
て行なわれる。こうして得られたクローンの中で、ヒト
リンパ球との融合効率が高いものを選択することによっ
て、本発明のヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株
を得ることができる。

本発明者らは、後述する実施例において、上記の方法で
得られたヒト由来の親細胞株をｒＨＫ−１２８−５７Ｊ
（微工研菌寄第１１３９２号）と命名した。このＨＫ−
１２８−Ｓ７は、融合効率が高く、しかもＨＫ−１２８
−３７を用いて作製したヒト−ヒトハイブリドーマはク
ローニング効率がよく、ＩｇＧ抗体産生も安定している
ことが確認された。

また、本発明のヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞
株の取得方法においては、親細胞株を得るための元の細
胞株として、前記ＨＭｙ２に限らず、各種のヒト由来の
腫瘍細胞株を用いることができる。このような細胞株と
しては、例えば従来よりヒト−ヒトハイブリドーマ作製
に用いられてきた各種の親細胞株が挙げられる。

これらの細胞株を用いて、上記と同様な方法でクローニ
ングし、高濃度の８−アザグアニンで耐性化することに
よって、上記ＨＫ−１２８−５７のように、融合効率が
高く、クローニング効率がよ（、ＩｇＧ抗体産生も安定
している親細胞株を得ることができる。

「作用及び効果」本発明のヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株は、
後述する実施例で得られたＨＫ−１２８−５７に示され
るように、ヒト−ヒトバイブリドーマの作製に際して親
細胞株として用いたときに融合効率が高く、得られたハ
イブリドーマは高頻度でＩｇＧクラスのヒト型モノクロ
ーナル抗体を生産する。従って、この親細胞株を用いる
ことにより、ヒトに投与可能な種々の抗原に対するヒト
型モノクローナル抗体産生ヒト−ヒトハイブリドーマの
作製が容易となり、その有用性は非常に高い。

また１本発明のヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞
株の取得方法によれば、元の細胞株として、ヒトプラズ
マ細胞腫細胞株ＨＭｙ２に限らず各種のヒト由来の腫瘍
細胞株を用いて、上記ＨＫ−１２８−３７のように、ヒ
ト−ヒトハイブリドーマ作製時の融合効率が高く、得ら
れたハイブリドーマがＩｇＧ抗体を高頻度で産生ずる親
細胞株を得ることかできる。

「実施例」（１，）ヒト親細胞株ＨＫ−１２８−５７の作製ヒトプ
ラズマ細胞腫細胞株ＨＭ、ｙ２を、１０％の非動化牛胎
児血清（以下ＦＣ３と記す）を含むＲＤＦ培地（ＲＰＭ
Ｉ　１６４０．ダルベツコＭＥＭ及びハムＦ−１２培地
を２：１：１で混合した培地）を用いて繰り返しクロー
ニングした。

まず、１０枚の９６ウエルマイクロプレートに、ＨＭｙ
２細胞を１個／ウェルとなるように植え込んだ、植え込
んだ後２〜３時間経過した細胞を検鏡し、１個の細胞が
入っているウェルをマークした。６〜７日後、マークし
たウェルのうち最も増殖の速やかなウェルの細胞を次の
クローニングに供した。

このようなりローニングを繰り返し、クローニング毎に
クローニング効率を測定したところ、第１図に示すよう
に、最初のクローニングでは４％の効率であったが４回
目のクローニングで１００％に達した。また、５回クロ
ーニングを繰り返した結果、全てのウェルで細胞の旺盛
な増殖が認められ、その増殖能についても、はとんど差
異が認められなくなった。すなわち、１個の細胞からで
も増殖可能な強い細胞株が得られた。

このことは、ヒトリンパ球と融合した場合に、増殖能力
が優れたヒト−ヒトハイブリドーマが得られることを意
味しており、従来の親細胞では増殖能力が低く増殖でき
なかったハイブリドーマも本細胞株を用いることにより
、増殖可能となることを示唆している。

更に、この細胞株を１０％ＦＣ３添加ＲＤＦ培地で３週
間培養し、細胞株を増加させた後、５０．１００及び２
００μｇ／ｍｌに順次高めた８−アザグアニン添加培地
で、それぞれ７日間培養を行い、高濃度の８−アザグア
ニン耐性細胞株を得た。

この細胞株を再度クローニングし、増殖能力が高い１０
クローンを得た。これらについてヒトリンパ球との融合
を行い、最も融合効率の高いクローンをＨＫ−１２８−
５７と命名した。

ＨＫ−１２８−３７を１００μＭヒボキサンチン、０．
０４４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含む
１５％ＦＣ５添加ＲＤＦ培地（以下ＨＡＴと記す）で培
養したところ、約５日間の培養で死滅し、ＨＫ−１２８
−５７のＨＡＴ感受性が確認された。

（２）ヒト−ヒトバイブリドーマの出現効率ヒトリンパ
球としては、リンパ節リンパ球及び末梢血リンパ球を用
いた６　リンパ節リンパ球の分離は、以下の方法により
行った。まず、ヒトリンパ節から余分な脂肪及び結合組
織をハサミで切り離した。その後、リンパ節をメスで３
ｍｍ角程度の大きさのブロックに刻んだ。リンパ節のブ
ロックをスライドグラス２枚で挟みすりつぶすことによ
りリンパ球を得た。得られたリンパ球をＲＤＦ培地で３
回洗浄した後、融合に供した。また、ヒト末梢血リンパ
球は、末梢血をフィコールハイパツクでの比重遠心法に
より分離し、ＲＤＦ培地で３回洗浄後、融合に供した。

ＨＫ−１２８−Ｓ７細胞とリンパ球とをそれぞれｌＸｌ
０’個ずつ混合し、　２００　Ｘ　ｇで５分間遠心した
。遠心上清を除去し、細胞ペレットを充分に分散した後
、５０％ポリエチレングリコール（平均分子量４，００
０　）を、１分間にわたって１ｍｌ添加した。３７℃で
１分間保温した後、ＲＤＦ培地を３０秒間に１ｍｌずつ
添加して最終的に９ｍｌ添加した。２００Ｘｇで５分間
遠心後、１５％ＦＣ５添加ＲＤＦ培地５０ｍ１に再懸濁
して９６ウエル培養プレートに１００μｍずつ分注し、
３７℃、５％ＣＯ□、７％０２．８８％Ｎ２に調整した
インキュベーター中で培養した。翌日、培地をＨＡＴ培
地に交換し、以降３〜４日間隔で培地の交換を行った。

この結果は、第１表に示す如（、ＨＫ−１２８−３７を
用いた場合には、ＨＫ−１２８−５７の元株であるＨＭ
、ｙ−２より約４０倍もの高い融合効率が得られた。ま
た、この融合効率は、マウス−マウス系の融合効率に匹
敵する高い値を示している。

（以下、余白）第１表　種々の親細胞株の融合効率（なお、上記において胃癌のリンパ球は、末梢血由来の
リンパ球である。また、ＨＯ−３２３−ＭＯ７は、微工
研菌寄１１３９３号として寄託しである。）（３）ハイブリドーマの産生ずる抗体のクラス前記と同
様な方法で各種の融合実験を行なった結果、ＨＫ−１２
８−５７を融合して得られたハイブリドーマの９０％は
、ＩｇＧのみを産生ずることがわかった。また、残りの
１０％のハイブリドーマはＩｇＧとＩｇＭとを産生じた
。すなわち、ＨＫ−１２８−５７を親細胞株として用い
ることにより、非常に高い確率でＩｇＧ産生ハイブリド
ーマが得られることがわかる。

こうして得られた各種のＩｇＧ産生ハイブリドーマＨＫ
Ａ１．ＨＫＢＩＯ１ＨＫＣ２、ＨＫＣ８、ＨＫＦ７につ
いて、ＩｇＧの生産量を測定した結果を第２表に示す。

なお、測定は、上記ハイブリドーマを１０’細胞／＋１
で植え込み、３日間培養した後、培地中のＩｇＧ濃度を
、通常の酵素抗体法により測定することにより行なった
。

また、上記のハイブリドーマは、親細胞としてＨＫ−１
２８−５７を用い、抗体産生細胞として次に示す細胞を
用いて、これらを融合して得たものである。

（ハイブリドーマ）　　（抗体産生細胞）ＨＫＡ　１　
　・・・乳癌患者由来リンパ節リンパ球ＨＫＢＩＯ・・
・　　　　　　〃ＨＫＣ２・・−〃ＨＫＣ８・・・胃癌患者由来抹消血リンパ球ＨＫＦ７　
　−・・　　　　　　　　　　　〃第２表（ヒト−ヒト
ハイブリドーマのＩｇＧ生産量）

【図面の簡単な説明】

第１図はクローニング回数とクローニング効率との関係
を示す図表である。４フローニンデ四１処手糸売ネ南正書（自発）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトプラズマ細胞腫細胞株ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−Ｈ
Ｍｙ２を、繰り返しクローニングすることにより、１個
の細胞から増殖し得るようにした後、更に高濃度の８−
アザグアニンで耐性化して得られ、以下の性質を有する
ことを特徴とするヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細
胞株。ａ、ヒトリンパ球との融合効率が高い。ｂ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリリドーマ
は抗体、特にＩｇＧ抗体を安定に産生する。ｃ、ヒトリンパ球と融合して得られたハイブリドーマの
抗体産生量が高い。
（２）ヒト由来の腫瘍細胞株を、繰り返しクローニング
することにより、１個の細胞から増殖し得るようにした
後、更に高濃度の８−アザグアニンで耐性化することを
特徴とするヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株の
取得方法。
（３）５０〜２００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン添加
培地で培養することによって耐性化する請求項２記載の
ヒト−ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株の取得方法。