JPH0551277B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
本発明は、ヒトＢリンパ球細胞との融合能を有
し高頻度にヒトハイブリドーマを供し得る親細胞
株に関するものである。 ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の産
生法の特徴は、単一の抗原決定基にのみ反応する
抗体を生体外で大量に且つ繰り返し得ることがで
きることにある。従つて、この方法を用い腫瘍、
ウイルス等の抗原に対するモノクローナル抗体を
産生し、その抗体を免疫療法及び生物・医学研究
に応用することができる。 抗原に対するモノクローナル抗体がEpstein−
Barrウイルスに感染した脾細胞の培養で産生さ
れた。また、Kohlerらは、マウス脾細胞とマウ
ス骨髄腫細胞との細胞融合によりマウスのモノク
ローナル抗体を産生した（Nature，256巻，495
−497頁，1975年）。以来、動物脾細胞と動物骨髄
腫細胞とのハイブリドーマに関し数多くの報告が
なされているが、殆んどがマウスのハイブリドー
マである。しかし、マウスのハイブリドーマによ
り産生された抗体はヒトにとつては異物であるた
め、反復注射した場合シヨツクを起こす危険性が
ある。 このためヒトモノクローナル抗体が必要となつ
た。ヒトモノクローナル抗体を得るには、ヒトＢ
リンパ球細胞のような抗体産生細胞とヒト骨髄腫
細胞のような永続的に増殖可能な細胞とのハイブ
リドーマが必要となる。しかし、ヒト骨髄腫細胞
は、通例、ヒトＢリンパ球細胞とは充分に融合せ
ずハイブリドーマを形成しない。従つて、ヒトＢ
リンパ球細胞との融合能を有するよいヒト親細胞
株が望まれていた。 一方、ハイブリドーマを生体外で大量培養し、
モノクローナル抗体を産生する場合、培地として
牛胎児血清（以下、FCSという）等の血清添加培
地（以下、血清培地という）を使用していた。し
かし、血清は高価であること及びロツト間でばら
つきがあることから、血清培地は大量培養に適さ
ない。更に、血清は数十以上の成分から成り且つ
多量に添加されるため、培地中に分泌された抗体
の精製は非常に困難である。従つて、血清を添加
しない培地（以下、無血清培地という）でもハイ
ブリドーマが増殖し且つモノクローナル抗体が産
生される系が望まれていた。 本発明の目的は、ヒトＢリンパ球細胞との融合
能が優れておりその結果抗体を産生するヒトハイ
ブリドーマを作成し得る親細胞株を供することで
ある。 本発明に係る新規な親細胞株は、ナマルバ
（Namalwa）細胞の突然変異細胞で、ヒポキサ
ンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ（以下、HGPRTという）の欠損株であ
る。この親細胞株をNAT−30と命名した。 本発明に用いたナマルバ細胞はヒトＢリンパ球
細胞系に由来し、バーキツトリンパ腫の患者に由
来した。ナマルバ細胞は広く入手可能な細胞であ
る。 本発明において親細胞株の選択は次に示すとお
りである。 ハイブリドーマは24ウエル又は96ウエルプレー
トを用い非融合細胞から選別するが、１ウエルか
らは１個のハイブリドーマが増殖してくるように
分注する。従つて、ハイブリドーマは、大量の死
滅した非融合細胞の中で増殖できなければならな
い。又多くの場合、通常の親細胞は細胞融合を起
こすことがあつても融合後増殖して来ない。 これらのことから、ヒトＢリンパ球細胞との融
合に用いる親細胞株は、１ウエル中１個の細胞か
ら増殖可能な増殖能力の大きい且つ強い細胞が望
まれる。 このような細胞を得るための手法として、１ウ
エル中１個の細胞から増殖できる細胞を選択する
こと、軟寒天で増殖できる細胞を選択すること、
大量の死細胞の混入した培地でも増殖できる細胞
を選択すること及び無血清培地で増殖してくる細
胞を選択すること等を行なう。これらの選択の
個々の条件及びこれら選択操作の回数、順序等
は、所望の細胞株が得られるように適宜変化す
る。 尚、ヒトＢ細胞との融合に供する親細胞は抗体
非分泌型の細胞が望まれる。この場合には、上記
ナマルバ細胞の突然変異細胞の内から抗体非分泌
型の細胞を選択する。 このナマルバ細胞の突然変異細胞を30μｇ／ml
の濃度の６−チオグアニン（以下、６−TGとい
う）を含む培地でHGPRT欠損に対し更に選択す
る。かくして本発明のHGPRT欠損細胞が得られ
る。 このようにして得られる親細胞株NAT−30は
文献末載の新しい細胞株であり、永代培養でき、
また永久的に凍結保存できる。 本発明の親細胞株NAT−30細胞の培養は、各
種の栄養培地で行ない得る。利用できる栄養培地
は、通常用いる血清培地（10％FCS添加）の他
に、例えば、インシユリン10μｇ／ml、トランス
フエリン35μｇ／ml、エタノールアミン10μM及
びセレニウム2.5×10-8Ｍの４成分を基礎培地に
添加した無血清培地（以下ITES培地という）等
がある（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79巻，1158
−1162頁，1982年）。基礎培地としては、例えば
Dulbecco改質培地、RPMI1640培地等が例示で
きる。上記各種培地に30μｇ／mlの６−TGを添
加しておくのが好ましい。尚、通常のナマルバ細
胞は６−TG添加培地では生育できない。培養条
件は通常の細胞培養に利用される条件でよい。一
般には約37℃の５％炭酸ガスインキユベーター内
で培養を行ない、約３〜５日毎に培地交換を行な
うことにより細胞を良好に増殖させることができ
る。 本発明のNAT−30細胞はヒトＢリンパ球細胞
との細胞融合用親細胞として利用できる。Ｂ細胞
融合において利用できるヒトＢ細胞には特に制限
はなく、例えばリンパ節、脾臓、抹消血等に由来
するＢ細胞を例示できる。これらＢ脂肪は通常用
いられる各種の分離手段により単離精製され、本
発明の親細胞との細胞融合に供し得る。 本発明のNAT−30細胞と上記ヒトＢ細胞との
融合反応は、基本的には公知の細胞融合方法と同
様であり、融合促進剤の存在下に適当な培地中で
行なわれる。融合促進剤としては、例えばポリエ
チレングリコール（以下、PEGという）が有利
に用い得る。PEGとしては平均分子量1000〜
2000程度のものが好ましく、これは培地に30〜50
％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在させるのが適当であ
る。また培地としては上記したNAT−30細胞の
増殖に用いられる基礎培地、Dulbecco改質培地、
RPMI1640培地等通常の各種培地を利用できる。
また、上記細胞融合培地には融合効率を高めるた
めの補助剤として例えばジメチルスルホキシド等
を添加してもよい。細胞融合に当り用いるNAT
−30細胞とヒトＢリンパ球細胞との細胞数比は、
通常、NAT−30細胞に対し約１〜５倍のヒトＢ
細胞を用いる。 細胞融合は例えば次の如く行なう。即ちNAT
−30細胞とヒトＢ細胞とを適当な培地中で混合
し、遠沈し、得られた細胞ペレツトに37℃に加温
したPEG溶液を加えて混ぜ合わせる。この後、
適当な培地を少しずつ添加し、遠沈し、得られた
細胞ペレツトに通常の選別用培地を加え、目的と
する融合細胞の分離を行なう。選別用培地は、親
細胞は死滅し目的とするハイブリドーマのみが増
殖し得る培地であり、通常HAT培地を例示でき
る。該HAT培地としては、例えば、15％FCS含
有Dulbecco改質培地に、ヒポキサンチン１×
10-4Ｍ、アミノプテリン１×-7Ｍ及びチミジン
1.6×10-5Ｍを添加した培地が用いられる。HAT
培地での細胞の培養は、目的とするハイブリドー
マ以外の細胞が死滅するに充分な２〜４週間程度
行なわれる。これにより目的とするヒトＢ細胞の
ハイブリドーマのみが選択的に増殖する。HAT
培地により選別後、ヒポキサンチン及びチミジン
を含む培地で約１週間培養した後、通常の培地で
培養する。 本発明のNAT−30細胞とヒトＢリンパ球との
融合により生成したハイブリドーマは３〜４週間
後に668ウエルのうち62ウエル（１×105のNAT
−30細胞につき１個のハイブリドーマ）で観察さ
れた。このハイブリドーマの出現頻度は、従来の
Coteらのもの（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80巻，
2026−2030頁，1983年）より数倍高い。HAT培
地において生育することは、NAT−30細胞とヒ
トＢ細胞との間の融合化の成功を示す。これらの
細胞をHAT培地で連続的に増殖し、限定希釈を
行なうことによりクローン化した。使用した
NAT−30細胞は抗体非分泌型であるが、クロー
ン化したハイブリドーマの約24％はIgGまたは
IgMを分泌した。またNAT−30細胞の染色体数
は46±２であるのに対し、ハイブリドーマのひと
つのクローンの染色体数は57±７であり、明らか
に増加していた。 本発明のNAT−30細胞は、上記の如く無血清
培地（例えばITES培地）でも血清培地と同様に
増殖する。NAT−30細胞とヒトＢ細胞との間の
ハイブリドーマも、ITES培地などの無血清培地
でも充分に増殖することができ且つ、抗体を産生
する。即ち、ハイブリドーマの大量培養により分
泌された抗体を培地から精製する場合において、
NAT−30細胞を親細胞として使用すれば、従来
のように血清培地から抗体を精製するのに比べ、
無血清培地で非常に容易且つ安価に抗体を精製す
ることも可能となる。 以下、実施例による本発明を更に具体的に説明
する。 実施例１ HGPRT欠損ヒトナマルバ突然変異細
胞株の製造 先ずナマルバ細胞（大日本製薬）を45℃で、
0.25％寒天を含むDulbecco改質培地＋10％FCS添
加血清培地に１×103個／mlの細胞濃度で浮遊さ
せ、５cmシヤーレにその５mlを取り、37℃で５％
炭酸ガス及び95％空気のインキユベーター内にて
３週間培養した。その後生育したクローン90個を
１つずつ96ウエル（１ウエルにつき200mlの培地）
に取り出し、寒天を含まない上記血清培地中で、
同様にして２週間培養した。抗体産生能のない株
を選択する目的から、各ウエルの培養上清をとり
エンザイムイムノアツセイ（カツペル社）により
その上清中の抗体量の測定を行なつた。その結果
抗体の全く検出されなかつた細胞株７株を選び、
96ウエル中で充分に増殖させた。増殖した細胞株
をそれぞれ24ウエル（１ウエルにつき1.5mlの培
地）、５cmシヤーレ（１枚につき５mlの培地）の
順に用いた培養液量を増加していき、約５×106
細胞ずつを得た。それぞれの株について３×104
細胞を残し、他の細胞を、新しく調製した上記血
清培地15mlに浮遊させ、−５℃で凍結後室温で融
解するという凍結・融解操作を２回繰り返し細胞
を死滅させた。この死滅細胞を含む培地５mlを３
枚の５cmシヤーレに移し、死滅させずに残してお
いて細胞をそれぞれ１×104細胞ずつ移植した。
上記と同様に５日間培養すると大部分の細胞は死
滅するが、その中の生き残つた細胞を遠心により
集めそれぞれの株について、96ウエルプレート30
ウエルに移植した。４〜６日毎に培地を交換しつ
つ３週間培養した結果、増殖のみられた株は上記
７株中２株についてであつた。２株について、増
殖速度の速い５個ずつのウエルの細胞を上記の順
に培養液量を増加し、それぞれ約１×106細胞を
得た。それぞれの細胞を別々に遠沈により集め、
１回Dulbecco改質培地にて洗い、無血清培地
（ITES培地）５mlにそれぞれ浮遊させた。上記と
同様に４週間、４〜６日毎に培地を換え培養し
た。この無血清培地での培養で増殖速度の早いも
のから３種類の細胞を選び、充分に増殖させて約
１×107個ずつの細胞を得た。これらをそれぞれ
3μｇ／mlの６−TGを含む上記血清培地10mlに浮
遊させ、４日毎に培地を交換しつつ４週間培養し
た。その後生存細胞を取り出し、30μｇ／mlの６
−TGを含む同一培地に１×105個／ml濃度となる
ように浮遊させ、上記と同様に４週間培養した。
このようにして２株の６−TG耐性株を得た。こ
の２株につき上述の実施例２に記載の方法により
細胞融合を行なつたところ、２株のうち１株が特
に強い融合能を示した。この株をNAT−30と命
名した。この株は30μｇ／mlの６−TGを含む上
記血清培地及び無血清培地にて強い増殖を示し、
それらの培地で継代培養に維持されている。 実施例２ NAT−30細胞とヒトＢリンパ球細胞
との細胞融合 実施例１で得られたNAT−30細胞を用いて細
胞融合を行なつた。親細胞NAT−30は融合前日
10％FCS含有Dulbecco改質培地で培養し、増殖
が活発な状態にした。 ヒトＢリンパ球細胞はガン患者から摘出したリ
ンパ節を上記培地中にて細切りリンパ細胞を取り
出した。これをシヤーレ中で１時間、37℃の５％
炭酸ガスインキユベーターで培養し、シヤーレに
付着したマイクロフアージを除きヒトＢリンパ球
細胞を得た。 上記NAT−30細胞の３×107個と上記ヒトＢリ
ンパ球細胞１×108個とを細胞融合に用いた。各
細胞をDulbecco改質培地で２回洗浄し、50mlの
遠心管中で混合し、1200r.p.m.で７分間遠沈し
た。上清を完全に除去し、得られた細胞ペレツト
に、37℃に加温した42.5％PEG（平均分子量1500）
及び15％ジメチルスルホキシド添加Dulbecco改
質培地の１mlを少しずつ加えた。１分間軽く振盪
した後、37℃に加温したDulbecco改質培地を
徐々に９ml加えた。1500r.p.m.で10分間遠沈し、
上清を除去した。得られた細胞ペレツトに15％
FCSを含むDulbecco改質培地300mlを加えて、
NAT−30細胞の濃度を１×105個／mlとし、96ウ
エルプレート（ヌンク社）に夫々100μずつ分
注した。24時間後２倍濃度のHAT培地（上記15
％FCS培地にヒポキサンチン２×10-4Ｍ、アミノ
プテリン２×10-7Ｍ及びチミジン3.2×10-5Ｍを
添加した培地）100μを各ウエルに加えた。以
後、４日毎に上清の半分を捨て、HAT培地100μ
を各ウエルに加える操作を繰り返し、４週間５
％炭酸ガスインキユベーター内で37℃にて培養し
た。 表１は既存のマウス骨髄腫細胞とNAT−30細
胞とを上記Ｂ細胞と融合させて得たハイブリドー
マの出現頻度を示す。NAT−30細胞を用いた場
合の出現頻度は、約10ウエルに１ウエルの割合で
ハイブリドーマが出現し、NS−１及びP3U1のよ
うなマウス骨髄腫細胞を用いた場合より高頻度に
出現した。このNAT−30細胞を用いた場合の出
現頻度は上述した如く、既に報告されているヒト
ハイブリドーマの出現頻度より優れている。
し高頻度にヒトハイブリドーマを供し得る親細胞
株に関するものである。 ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の産
生法の特徴は、単一の抗原決定基にのみ反応する
抗体を生体外で大量に且つ繰り返し得ることがで
きることにある。従つて、この方法を用い腫瘍、
ウイルス等の抗原に対するモノクローナル抗体を
産生し、その抗体を免疫療法及び生物・医学研究
に応用することができる。 抗原に対するモノクローナル抗体がEpstein−
Barrウイルスに感染した脾細胞の培養で産生さ
れた。また、Kohlerらは、マウス脾細胞とマウ
ス骨髄腫細胞との細胞融合によりマウスのモノク
ローナル抗体を産生した（Nature，256巻，495
−497頁，1975年）。以来、動物脾細胞と動物骨髄
腫細胞とのハイブリドーマに関し数多くの報告が
なされているが、殆んどがマウスのハイブリドー
マである。しかし、マウスのハイブリドーマによ
り産生された抗体はヒトにとつては異物であるた
め、反復注射した場合シヨツクを起こす危険性が
ある。 このためヒトモノクローナル抗体が必要となつ
た。ヒトモノクローナル抗体を得るには、ヒトＢ
リンパ球細胞のような抗体産生細胞とヒト骨髄腫
細胞のような永続的に増殖可能な細胞とのハイブ
リドーマが必要となる。しかし、ヒト骨髄腫細胞
は、通例、ヒトＢリンパ球細胞とは充分に融合せ
ずハイブリドーマを形成しない。従つて、ヒトＢ
リンパ球細胞との融合能を有するよいヒト親細胞
株が望まれていた。 一方、ハイブリドーマを生体外で大量培養し、
モノクローナル抗体を産生する場合、培地として
牛胎児血清（以下、FCSという）等の血清添加培
地（以下、血清培地という）を使用していた。し
かし、血清は高価であること及びロツト間でばら
つきがあることから、血清培地は大量培養に適さ
ない。更に、血清は数十以上の成分から成り且つ
多量に添加されるため、培地中に分泌された抗体
の精製は非常に困難である。従つて、血清を添加
しない培地（以下、無血清培地という）でもハイ
ブリドーマが増殖し且つモノクローナル抗体が産
生される系が望まれていた。 本発明の目的は、ヒトＢリンパ球細胞との融合
能が優れておりその結果抗体を産生するヒトハイ
ブリドーマを作成し得る親細胞株を供することで
ある。 本発明に係る新規な親細胞株は、ナマルバ
（Namalwa）細胞の突然変異細胞で、ヒポキサ
ンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ（以下、HGPRTという）の欠損株であ
る。この親細胞株をNAT−30と命名した。 本発明に用いたナマルバ細胞はヒトＢリンパ球
細胞系に由来し、バーキツトリンパ腫の患者に由
来した。ナマルバ細胞は広く入手可能な細胞であ
る。 本発明において親細胞株の選択は次に示すとお
りである。 ハイブリドーマは24ウエル又は96ウエルプレー
トを用い非融合細胞から選別するが、１ウエルか
らは１個のハイブリドーマが増殖してくるように
分注する。従つて、ハイブリドーマは、大量の死
滅した非融合細胞の中で増殖できなければならな
い。又多くの場合、通常の親細胞は細胞融合を起
こすことがあつても融合後増殖して来ない。 これらのことから、ヒトＢリンパ球細胞との融
合に用いる親細胞株は、１ウエル中１個の細胞か
ら増殖可能な増殖能力の大きい且つ強い細胞が望
まれる。 このような細胞を得るための手法として、１ウ
エル中１個の細胞から増殖できる細胞を選択する
こと、軟寒天で増殖できる細胞を選択すること、
大量の死細胞の混入した培地でも増殖できる細胞
を選択すること及び無血清培地で増殖してくる細
胞を選択すること等を行なう。これらの選択の
個々の条件及びこれら選択操作の回数、順序等
は、所望の細胞株が得られるように適宜変化す
る。 尚、ヒトＢ細胞との融合に供する親細胞は抗体
非分泌型の細胞が望まれる。この場合には、上記
ナマルバ細胞の突然変異細胞の内から抗体非分泌
型の細胞を選択する。 このナマルバ細胞の突然変異細胞を30μｇ／ml
の濃度の６−チオグアニン（以下、６−TGとい
う）を含む培地でHGPRT欠損に対し更に選択す
る。かくして本発明のHGPRT欠損細胞が得られ
る。 このようにして得られる親細胞株NAT−30は
文献末載の新しい細胞株であり、永代培養でき、
また永久的に凍結保存できる。 本発明の親細胞株NAT−30細胞の培養は、各
種の栄養培地で行ない得る。利用できる栄養培地
は、通常用いる血清培地（10％FCS添加）の他
に、例えば、インシユリン10μｇ／ml、トランス
フエリン35μｇ／ml、エタノールアミン10μM及
びセレニウム2.5×10-8Ｍの４成分を基礎培地に
添加した無血清培地（以下ITES培地という）等
がある（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79巻，1158
−1162頁，1982年）。基礎培地としては、例えば
Dulbecco改質培地、RPMI1640培地等が例示で
きる。上記各種培地に30μｇ／mlの６−TGを添
加しておくのが好ましい。尚、通常のナマルバ細
胞は６−TG添加培地では生育できない。培養条
件は通常の細胞培養に利用される条件でよい。一
般には約37℃の５％炭酸ガスインキユベーター内
で培養を行ない、約３〜５日毎に培地交換を行な
うことにより細胞を良好に増殖させることができ
る。 本発明のNAT−30細胞はヒトＢリンパ球細胞
との細胞融合用親細胞として利用できる。Ｂ細胞
融合において利用できるヒトＢ細胞には特に制限
はなく、例えばリンパ節、脾臓、抹消血等に由来
するＢ細胞を例示できる。これらＢ脂肪は通常用
いられる各種の分離手段により単離精製され、本
発明の親細胞との細胞融合に供し得る。 本発明のNAT−30細胞と上記ヒトＢ細胞との
融合反応は、基本的には公知の細胞融合方法と同
様であり、融合促進剤の存在下に適当な培地中で
行なわれる。融合促進剤としては、例えばポリエ
チレングリコール（以下、PEGという）が有利
に用い得る。PEGとしては平均分子量1000〜
2000程度のものが好ましく、これは培地に30〜50
％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在させるのが適当であ
る。また培地としては上記したNAT−30細胞の
増殖に用いられる基礎培地、Dulbecco改質培地、
RPMI1640培地等通常の各種培地を利用できる。
また、上記細胞融合培地には融合効率を高めるた
めの補助剤として例えばジメチルスルホキシド等
を添加してもよい。細胞融合に当り用いるNAT
−30細胞とヒトＢリンパ球細胞との細胞数比は、
通常、NAT−30細胞に対し約１〜５倍のヒトＢ
細胞を用いる。 細胞融合は例えば次の如く行なう。即ちNAT
−30細胞とヒトＢ細胞とを適当な培地中で混合
し、遠沈し、得られた細胞ペレツトに37℃に加温
したPEG溶液を加えて混ぜ合わせる。この後、
適当な培地を少しずつ添加し、遠沈し、得られた
細胞ペレツトに通常の選別用培地を加え、目的と
する融合細胞の分離を行なう。選別用培地は、親
細胞は死滅し目的とするハイブリドーマのみが増
殖し得る培地であり、通常HAT培地を例示でき
る。該HAT培地としては、例えば、15％FCS含
有Dulbecco改質培地に、ヒポキサンチン１×
10-4Ｍ、アミノプテリン１×-7Ｍ及びチミジン
1.6×10-5Ｍを添加した培地が用いられる。HAT
培地での細胞の培養は、目的とするハイブリドー
マ以外の細胞が死滅するに充分な２〜４週間程度
行なわれる。これにより目的とするヒトＢ細胞の
ハイブリドーマのみが選択的に増殖する。HAT
培地により選別後、ヒポキサンチン及びチミジン
を含む培地で約１週間培養した後、通常の培地で
培養する。 本発明のNAT−30細胞とヒトＢリンパ球との
融合により生成したハイブリドーマは３〜４週間
後に668ウエルのうち62ウエル（１×105のNAT
−30細胞につき１個のハイブリドーマ）で観察さ
れた。このハイブリドーマの出現頻度は、従来の
Coteらのもの（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80巻，
2026−2030頁，1983年）より数倍高い。HAT培
地において生育することは、NAT−30細胞とヒ
トＢ細胞との間の融合化の成功を示す。これらの
細胞をHAT培地で連続的に増殖し、限定希釈を
行なうことによりクローン化した。使用した
NAT−30細胞は抗体非分泌型であるが、クロー
ン化したハイブリドーマの約24％はIgGまたは
IgMを分泌した。またNAT−30細胞の染色体数
は46±２であるのに対し、ハイブリドーマのひと
つのクローンの染色体数は57±７であり、明らか
に増加していた。 本発明のNAT−30細胞は、上記の如く無血清
培地（例えばITES培地）でも血清培地と同様に
増殖する。NAT−30細胞とヒトＢ細胞との間の
ハイブリドーマも、ITES培地などの無血清培地
でも充分に増殖することができ且つ、抗体を産生
する。即ち、ハイブリドーマの大量培養により分
泌された抗体を培地から精製する場合において、
NAT−30細胞を親細胞として使用すれば、従来
のように血清培地から抗体を精製するのに比べ、
無血清培地で非常に容易且つ安価に抗体を精製す
ることも可能となる。 以下、実施例による本発明を更に具体的に説明
する。 実施例１ HGPRT欠損ヒトナマルバ突然変異細
胞株の製造 先ずナマルバ細胞（大日本製薬）を45℃で、
0.25％寒天を含むDulbecco改質培地＋10％FCS添
加血清培地に１×103個／mlの細胞濃度で浮遊さ
せ、５cmシヤーレにその５mlを取り、37℃で５％
炭酸ガス及び95％空気のインキユベーター内にて
３週間培養した。その後生育したクローン90個を
１つずつ96ウエル（１ウエルにつき200mlの培地）
に取り出し、寒天を含まない上記血清培地中で、
同様にして２週間培養した。抗体産生能のない株
を選択する目的から、各ウエルの培養上清をとり
エンザイムイムノアツセイ（カツペル社）により
その上清中の抗体量の測定を行なつた。その結果
抗体の全く検出されなかつた細胞株７株を選び、
96ウエル中で充分に増殖させた。増殖した細胞株
をそれぞれ24ウエル（１ウエルにつき1.5mlの培
地）、５cmシヤーレ（１枚につき５mlの培地）の
順に用いた培養液量を増加していき、約５×106
細胞ずつを得た。それぞれの株について３×104
細胞を残し、他の細胞を、新しく調製した上記血
清培地15mlに浮遊させ、−５℃で凍結後室温で融
解するという凍結・融解操作を２回繰り返し細胞
を死滅させた。この死滅細胞を含む培地５mlを３
枚の５cmシヤーレに移し、死滅させずに残してお
いて細胞をそれぞれ１×104細胞ずつ移植した。
上記と同様に５日間培養すると大部分の細胞は死
滅するが、その中の生き残つた細胞を遠心により
集めそれぞれの株について、96ウエルプレート30
ウエルに移植した。４〜６日毎に培地を交換しつ
つ３週間培養した結果、増殖のみられた株は上記
７株中２株についてであつた。２株について、増
殖速度の速い５個ずつのウエルの細胞を上記の順
に培養液量を増加し、それぞれ約１×106細胞を
得た。それぞれの細胞を別々に遠沈により集め、
１回Dulbecco改質培地にて洗い、無血清培地
（ITES培地）５mlにそれぞれ浮遊させた。上記と
同様に４週間、４〜６日毎に培地を換え培養し
た。この無血清培地での培養で増殖速度の早いも
のから３種類の細胞を選び、充分に増殖させて約
１×107個ずつの細胞を得た。これらをそれぞれ
3μｇ／mlの６−TGを含む上記血清培地10mlに浮
遊させ、４日毎に培地を交換しつつ４週間培養し
た。その後生存細胞を取り出し、30μｇ／mlの６
−TGを含む同一培地に１×105個／ml濃度となる
ように浮遊させ、上記と同様に４週間培養した。
このようにして２株の６−TG耐性株を得た。こ
の２株につき上述の実施例２に記載の方法により
細胞融合を行なつたところ、２株のうち１株が特
に強い融合能を示した。この株をNAT−30と命
名した。この株は30μｇ／mlの６−TGを含む上
記血清培地及び無血清培地にて強い増殖を示し、
それらの培地で継代培養に維持されている。 実施例２ NAT−30細胞とヒトＢリンパ球細胞
との細胞融合 実施例１で得られたNAT−30細胞を用いて細
胞融合を行なつた。親細胞NAT−30は融合前日
10％FCS含有Dulbecco改質培地で培養し、増殖
が活発な状態にした。 ヒトＢリンパ球細胞はガン患者から摘出したリ
ンパ節を上記培地中にて細切りリンパ細胞を取り
出した。これをシヤーレ中で１時間、37℃の５％
炭酸ガスインキユベーターで培養し、シヤーレに
付着したマイクロフアージを除きヒトＢリンパ球
細胞を得た。 上記NAT−30細胞の３×107個と上記ヒトＢリ
ンパ球細胞１×108個とを細胞融合に用いた。各
細胞をDulbecco改質培地で２回洗浄し、50mlの
遠心管中で混合し、1200r.p.m.で７分間遠沈し
た。上清を完全に除去し、得られた細胞ペレツト
に、37℃に加温した42.5％PEG（平均分子量1500）
及び15％ジメチルスルホキシド添加Dulbecco改
質培地の１mlを少しずつ加えた。１分間軽く振盪
した後、37℃に加温したDulbecco改質培地を
徐々に９ml加えた。1500r.p.m.で10分間遠沈し、
上清を除去した。得られた細胞ペレツトに15％
FCSを含むDulbecco改質培地300mlを加えて、
NAT−30細胞の濃度を１×105個／mlとし、96ウ
エルプレート（ヌンク社）に夫々100μずつ分
注した。24時間後２倍濃度のHAT培地（上記15
％FCS培地にヒポキサンチン２×10-4Ｍ、アミノ
プテリン２×10-7Ｍ及びチミジン3.2×10-5Ｍを
添加した培地）100μを各ウエルに加えた。以
後、４日毎に上清の半分を捨て、HAT培地100μ
を各ウエルに加える操作を繰り返し、４週間５
％炭酸ガスインキユベーター内で37℃にて培養し
た。 表１は既存のマウス骨髄腫細胞とNAT−30細
胞とを上記Ｂ細胞と融合させて得たハイブリドー
マの出現頻度を示す。NAT−30細胞を用いた場
合の出現頻度は、約10ウエルに１ウエルの割合で
ハイブリドーマが出現し、NS−１及びP3U1のよ
うなマウス骨髄腫細胞を用いた場合より高頻度に
出現した。このNAT−30細胞を用いた場合の出
現頻度は上述した如く、既に報告されているヒト
ハイブリドーマの出現頻度より優れている。
【表】
実施例３ ハイブリドーマの抗体産生
NAT−30細胞及びマウス骨髄腫細胞X63.6.5.3
を親細胞として用い、ヒトＢリンパ球細胞とのハ
イブリドーマを実施例２に記載の方法に従い作成
した。これらのハイブリドーマについて抗体を産
生しているか否か調べた結果を表２に示す。表か
ら明らかなように、NAT−30及びX63.6.5.3のど
ちらを用いたハイブリドーマにおいても、IgG及
びIgM産生型の両種類が認められた。尚、ヒトの
IgG及びIgMの検定は実施例１に記載のエンザイ
ムイムノアツセイにより行なつた。
を親細胞として用い、ヒトＢリンパ球細胞とのハ
イブリドーマを実施例２に記載の方法に従い作成
した。これらのハイブリドーマについて抗体を産
生しているか否か調べた結果を表２に示す。表か
ら明らかなように、NAT−30及びX63.6.5.3のど
ちらを用いたハイブリドーマにおいても、IgG及
びIgM産生型の両種類が認められた。尚、ヒトの
IgG及びIgMの検定は実施例１に記載のエンザイ
ムイムノアツセイにより行なつた。
【表】
−ヒト
ヒト− NAT−30 668 62 5 1
0
ヒト
ヒト− NAT−30 668 62 5 1
0
ヒト
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトバーキツトリンパ腫細胞であるナマルバ
細胞のヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ルトランスフエラーゼ欠損突然変異細胞であるこ
とを特徴とするヒトハイブリドーマ作成用親細胞
株。 ２ 抗体を生産しないことを特徴とする特許請求
の範囲第１項に記載の親細胞株。 ３ 無血清培地で増殖し得ることを特徴とする特
許請求の範囲第１項又は第２項に記載の親細胞
株。 ４ 抗体産生細胞（ヒトＢリンパ球細胞）との融
合能を有することを特徴とする特許請求の範囲第
１項乃至第３項のいずれかに記載の親細胞株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58247772A JPS60141285A (ja) | 1983-12-29 | 1983-12-29 | ヒトハイブリド−マ作成用親細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58247772A JPS60141285A (ja) | 1983-12-29 | 1983-12-29 | ヒトハイブリド−マ作成用親細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60141285A JPS60141285A (ja) | 1985-07-26 |
| JPH0551277B2 true JPH0551277B2 (ja) | 1993-08-02 |
Family
ID=17168419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58247772A Granted JPS60141285A (ja) | 1983-12-29 | 1983-12-29 | ヒトハイブリド−マ作成用親細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60141285A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2599123B2 (ja) * | 1985-12-28 | 1997-04-09 | 萩原 義秀 | 新規なヒトｂセル・リンパ芽球細胞変異株 |
| CA2002067A1 (en) | 1988-11-09 | 1990-05-09 | Tamotsu Fukuda | Parent cell line for producing human hybridomas |
| JPH0763363B2 (ja) * | 1991-12-25 | 1995-07-12 | 萩原 義秀 | 融合細胞の取得方法 |
| JP2721817B2 (ja) * | 1995-05-15 | 1998-03-04 | 萩原 義秀 | ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体 |
-
1983
- 1983-12-29 JP JP58247772A patent/JPS60141285A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60141285A (ja) | 1985-07-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |