JPH0221794B2

JPH0221794B2 -

Info

Publication number: JPH0221794B2
Application number: JP56122815A
Authority: JP
Inventors: Juichi Yamamura; Chuzo Kishimoto
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-08-04
Filing date: 1981-08-04
Publication date: 1990-05-16
Also published as: JPS5823785A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なヒトＴ細胞ライン、更に詳しく
はヒトＴ細胞交雑（融合）細胞ライン殊にＴ細胞
増殖因子を分泌するヒトＴ細胞交雑細胞ラインを
得るためのヒトＴ細胞融合特性を有する親細胞ラ
イン及び該細胞ラインの確立方法に関する。ヒトの免疫系に含まれるリンパ球は、Ｔ細胞即
ち胸腺由来細胞と、Ｂ細胞即ち骨髄由来細胞とに
大別される。上記Ｂ細胞は、抗体を分泌すること
が知られており、従来細胞融合技術を利用して上
記Ｂ細胞の交雑細胞即ち抗体産生Ｂ細胞と新細胞
としての骨髄腫瘍細胞（ミエローマ）との交雑細
胞（ハイブリドーマ）を作製し、該ハイブリドー
マより単一クローン由来の抗体（モノクロナル抗
体）を生産する技術が確立されている〔「臨床科
学」第16巻第９号第1108−1114（1980年）参照〕。一方Ｔ細胞は免疫応答の調節における中心的役
割を果すものであり、その特性については尚不明
な点が多いが、抗体産性を抑制する因子、異種細
胞の分裂を引起す因子（インターロイキンス）等
の数多くの液性免疫因子（リンホカイン類）を分
泌するものである。しかしながら之等Ｔ細胞の細
胞融合技術の応用による交雑細胞の作成は、現在
わずかマウスＴ細胞につき報告されているにすぎ
ず、ヒトＴ細胞融合技術は非常に遅れており、未
だ成功した例がない。本発明者らはかかるヒトＴ細胞融合技術を確立
することを目的として種々研究を重ねた結果、ま
ずヒトＴ細胞との融合特性を有し且つ融合細胞を
選択するための培地に感受性を有し、しかも永代
培養可能な親細胞株を確立し、該親細胞株を利用
してヒトＴ細胞交雑細胞の作成に成功し、ここに
本発明を完成するに至つた。即ち本発明はヒポキサンチン−グアニン−ホス
ホリボシルトランスフエラーゼ（HGPRT）欠
損ヒト白血病性Ｔ細胞ライン（ATCC CRL−
8081）及び該等細胞ラインを確立する方法に係る
ものである。本発明は従来全く知られていない新規な、ヒト
Ｔ細胞融合を可能とする親細胞株、該親細胞株と
ヒトＴ細胞との新規な交雑細胞株および之等の生
産方法を提供するものである。本発明の親細胞株
および交雑細胞株は、いずれも継代培養できるも
のであり、之等細胞株の確立殊に交雑細胞株の確
立によれば、ヒトＴ細胞が放出する数多くの液性
免疫因子即ち細胞間相互作用をメデイエートする
可溶性因子の生体外での大量生産が可能となり、
従来尚充分には解明されていない之等可溶性因子
の化学的及び生物学的特性の解析が可能となり、
之等の臨床面への応用、該臨床面での効果の究明
進歩に大きく寄与する。また上記ヒトＴ細胞交雑
細胞ラインの確立は、ヒトＴ細胞における細胞膜
表面抗原やＴ細胞抗原レセプターの解析、Ｔ細胞
サブセツトの検索、Ｔ細胞自体の分化、増殖、活
性化等の細胞学的及び免疫学的研究にも極めて有
力な手段を提供するものである。本発明に係る親規な親細胞株は、ヒト白血病性
Ｔ細胞株より誘導されるものであり、HGPRTを
欠損している点において特徴付けられる。その細
胞学的及びその他の諸性質を示せば次の通りであ
る。 (1) 形態学的特徴：径は正常ヒト末梢血Ｔ細胞の約２〜３倍であ
り、ほぼ球形をなす。細胞内における核の占め
る割合は大で、原形質が僅かに認められる。原
形質内には僅かの顆粒が認められる。時として
偽足様の突起を出す場合がある。 (2) 染色体数： 0.1μｇ／ml濃度のコルヒチン存在下に細胞を
37℃下３時間培養し、遠沈後0.075M−KClで
処理し、メタノール：エタノール＝３：１の固
定液を用いスライドガラス上に固定後の核染色
体数を、1000倍の油浸レンズを用いた顕微鏡観
察により計数した結果、100個の細胞の分裂中
期において各細胞の核染色体数は、下記第１表
の通り69〜87の間にあり、平均78である。

【表】 (3) Ｔ細胞特異抗原発現性：各細胞を５×10⁵個濃度に調整し、100μの
適当な濃度のモノクロナル抗体（0.1mg／0.5ml
の抗−Leu1、抗−Leu2A及び抗−Leu3A抗体
の原液を、夫々100倍、10倍及び10倍に希釈し
て100μとして用いた）と、４℃下30分間イ
ンキユベート後、細胞を５％胎児牛血清
（FCS）を含むMEM培地〔財団法人阪大微研〕
で洗浄し、FITC（fluorescein isothiocyanate）
−結合−ウザギ抗マウス免疫グロブリン
〔Miles−Yeda LTD.、Israel〕と反応させ、
Ｔ細胞特異抗原発現性を関接免疫螢光抗体法に
より測定した。尚各モノクロナル抗体はベクト
ンデイキンソン社〔Becton Dickinson Co.、
Sunnyvale、Ca〕より得た〔J.Exp.Med.、
153、310−323（1981）〕。200個の細胞について
調べた結果抗−Leu1及び抗−Leu3A抗体に対
し95％以上が陽性であり、抗−Leu2A抗体に
対し１％以下が陽性であつた。 (4) ロゼツト形成：抗体補体感作ヒツジ赤血球（EAC）におけ
るロゼツト形成を、200個の細胞につき、400倍
の顕微鏡下で測定した結果１％以下が陽性であ
る。 (5) Ｂ細胞マーカー発現性： FITC−結合マウス抗ヒト−免疫グロブリン
（Behring werke AG、Marburg）を用いた直
接免疫螢光抗体法により解析した表面免疫グロ
ブリン（Ig）は、１％以下陽性である。モノクロナル−抗−DR抗体（Becton−
Dickinson Co.）を用いた間接免疫螢光抗体法
により解析したヒトHLA−DR抗原（DR）は、
１％以下陽性である。またビールス（Epstein−Barr virus）でト
ランスフオームしたヒトＢ細胞株（CESS、ス
ローン・ケタリング癌研究所のピーターラルフ
博士より入手）により免疫されたマウス脾細胞
とミエローマP3U₁、（Elbert Einstein College
of Medicinより入手）との細胞融合株から得
た〔G.Kohler and C.Milstein、Nature、256、
495、1975参照〕モノクロナル抗ヒトＢ細胞抗
体を用い、間接免疫螢光抗体法により解析し
た、ヒトＢ細胞特異抗原（Ｂ抗原）の表現性
は、１％以下が陽性である。尚上記抗体はＢ細
胞乃至そのラインとは反応するが、Ｔ細胞乃至
そのラインとは反応しない。 (6) HLA表現型細胞を抗HLA血清（東京医科大学、笹月教
授より入手）と30分間37℃で培養後、本発明の
親細胞で吸収した家兎補体（ベリタス）と、60
分間インキユベートして細胞の生存率を調べた
結果、HLA表現型はA2、A11、B8、B37、
Bw22を示す。 (7) 増殖性：８−アザグアニン（８−AG、100μM）、10
％胎児牛血清（FCS）、５×10^-5M2−メルカプ
トエタノール及び1mMグルタミンを含む
RPMI1640培地（Flow Laboratories）におい
て良好に増殖する。 (8) 増殖条件：一般に36〜38℃の温度条件下及びPH7.2〜7.3
の条件下で良好に増殖する。また５％炭酸ガス
及び95％空気のインキユベーター内での培養が
好適である。 (9) 継代培養：限界なく継代培養が可能である。 (10) 凍結保存：液体窒素中で容易に長期間保存できる。 (11) ８−アザグアニン耐性：８−アザグアニン（100μM）に耐性があり、
ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む培地（HAT培地）死滅する。このこと
から本細胞はHGPRT欠損株であることが判
る。 (12) マイトジエン反応性：コンカナバリン（Con Ａ）10〜100μｇ／ml
の添加及び植物性赤血球凝集素、フイトヘモア
グルケニン（PHA）の１〜10％添加により、
分裂増殖は部分的に抑制される。ポツクウイー
ドマイトジエン（PWM）及びプロテインＡ
（Pro Ａ）は、いかなる濃度においても本細胞
株の分裂増殖に影響を与えない。之等のことを添付の第１図乃至第４図に示す。
各図は夫々２×10⁴個の本細胞株を、種々の濃度
のマイトジエン（第１図はCon Ａ、第２図は
PHA、第３図はPWM及び第４図はPro Ａを
夫々用いたものである）と共にRPMI1640＋10％
FCS内で60時間培養し、培養の最後の12時間に
0.2μCiの3H−チミジン（3H−TdR）を加え、培
養細胞をグラスフアイバーストリツプ（ラボサ
イエンス社）に集め、3H−TdRのデオキシリボ
核酸分画への取り込みを液体シンチレーシヨンカ
ウンターでカウントした結果を、各３度繰返した
平均値（S.D.は10％以下）でプロツトしたもので
あり、図中横軸は各マイトジエンの濃度及び縦軸
は取り込まれた3H−TdRのカウント数（C.P.M.
×10^-5）を示す。また各図における（●――●）
は本細胞株を、また（Γ――Γ）は、後述するク
ローン24A（本発明ヒトＴ細胞融合細胞株のひと
つのクローン）における結果を示す。上記諸性質を有する本発明のHGPRT欠損ヒト
白血病性Ｔ細胞株は、ヒト白血病性Ｔ細胞
（CCRF−CEM）〔J.KAPLAN、T.C.SHOPE
and W.D.PETERSON、Jr.、J.Exp.Med.139、
1070−1076、1974参照〕を起源とし、これを10％
FCS含有RPMI1640培地に８−アザグアニン（８
−AG）を添加した培地で培養し、８−AG添加
量を順次増加させていくことにより収得できる。
より具体的には例えばまず2μMの８−AGを添加
した培地で１週間培養し、生存細胞を次に16μM
の８−AGを含む培地で１週間培養し、その後同
様に８−AG濃度を２倍づつ増加させた培地で順
次培養し、最終的に８−AG濃度を100μMとした
培地に生存する８−AG耐性細胞株を得る。かく
して得られる細胞株は、その後100μMの８−AG
含有培地で強い増殖性を示し、この培地で継代培
養できる。また本発明のHGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞
株は、上記に代え６−チオグアニン（最終濃度
67μM）又は６−メルカプトプリンリボシツド
（最終濃度1μM）を用い、上記と同様に培養する
ことによつても収得できる。かくして本発明のHGPRT欠損細胞ラインを得
る。これは上記した諸性質を有し、文献未載の新
しいＴ細胞ラインであり、永代培養でき、またほ
ぼ永久的に凍結保存できる。上記本発明HGPRT欠損細胞ラインの培養は、
各種の栄養培地で行ない得る。利用できる栄養培
地は、本質的には合成培地であるが、血清のよう
な天然から得られる成分を含んでいてもよく、該
培地としては例えばRPMI1640培地（Flow
Laboratories社）を、FCS、ウマ血清等の血清補
液を用いて改質した培地、又は血清を含まないイ
スコブ（Iscove）改質培地を用いて改質したドル
ベツコ（Dulbecco）改質培地等が有利に用い得
る。上記培地で増殖される本発明細胞はまた例え
ばFCS含有イーグル最低必須培地（MEM）培地
等の当該分野で細胞培養に一般に用いられている
各種の培地で短期間の適応で容易に増殖する。上
記各種培地には、特に８−AGの添加を必要とし
ないが、通常好ましくは８−AGを添加しておく
のがよい。また上記各種培地での培養条件は、通
常の細胞培養に利用される条件でよい。一般には
約36〜38℃下に３〜５日毎に液交換を行なうこと
により細胞を良好に増殖させることができる。上記細胞株は、工業技術院微生物工業技術研究
所への寄託が受付けられなかつたが、本発明者ら
により、常に分譲可能な状態にて保存されてお
り、また上記細胞株は、1981年７月30日にアメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（ATCC）に寄託されている。本発明の上記HGPRT欠損Ｔ細胞株は、ヒトＴ
細胞の細胞融合用親細服株として利用できる。本
発明は上記親細胞株を用いたＴ細胞融合方法及び
それにより得られる交雑Ｔ細胞株をも提供するも
のである。上記Ｔ細胞融合において利用できるヒトＴ細胞
は特に制限はなく、例えば未梢血、骨髄、リンパ
節、脾臓、扁桃腺、胸腺等に由来する各種Ｔ細胞
をいずれも例示できる。之等Ｔ細胞は、通常知ら
れている各種の分離手段例えば物理的方法、化学
的方法及び表面膜法により単離精製され、本発明
の細胞融合に供し得る。また之等Ｔ細胞は、細胞
融合に先立ち融合効率を高めるために、公知の
種々のマイトジエンで刺激することができる。マ
イトジエンとしては、Ｔ細胞に感受性を持つ各種
のものが利用でき、この例としては、例えばコン
カナバリンＡ（Con Ａ、シグマ社）、精製ツベル
クリン（PPD、阪大癌研究所、高津博士）、プロ
テインＡ（Pro Ａ、フアルマシア社）、フイトヘ
モアグルチニン（PHA、デイフコ社）、ポツクウ
イードマイトジエン（PWM、ギブコ社）等挙
げることができる。更に之等Ｔ細胞は、リンパ球
混合培養法（Mixed Lymphocyte Culture）を
用いて活性化することもできる。上記ヒトＴ細胞
及びマイトジエン刺激Ｔ細胞の製造の詳細は後述
する実施例に示す通りである。本発明のHGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞と上
記ヒトＴ細胞との融合反応は、基本的には公知の
細胞融合方法と同様であり、融合促進剤の存在下
に適当な培地内で行なわれる。融合促進剤として
は例えばセンダイウイルス（HVJ）等のウイル
スを用いてもよいが、近年開発されたポリエチレ
ングリコール（PEG）を用いるのが好ましい。
該PEGとしては平均分子量1000〜6000程度のも
のが好ましく、これは培地に約30〜60W／Ｖ％の
濃度で存在させるのが適当である。また培地とし
ては、上記した親細胞株の増殖に用いられるよう
なMEM培地、そのドルベツコ改質培地、
RPMI1640培地、その他のこの種の細胞培養に利
用される通常の各種培地を利用できる。また上記
細胞融合用培地には所望により融合効率を高める
ための補助剤として例えばジメチルスルホキキシ
ド等を添加してもよい。上記細胞融合に当り用いる本発明親細胞と、ヒ
トＴ細胞との使用量比は、特に制限はないが一般
には親細胞数に対しヒトＴ細胞数を約１〜10倍用
いることができる。好ましい細胞融合は例えば次
の如くして行なわれる。即ち親細胞株とヒトＴ細
胞との所定量を適当な培地内でよく混ぜ、遠沈後
上清を除去し、予め37℃に加温したPEG溶液の
適当量を加えてまぜ合せる。これにより細胞融合
反応が開始される。以後適当な培地を逐次添加
し、遠沈させ、上清をすてる操作を繰返すことに
より所望の融合細胞の出現が認められる。所望融合細胞の分離は、上記細胞融合後の細胞
を、通常の雑種選別用培地で培養することにより
行なわれる。この選別用培地は、親細胞は増殖し
得ず、目的とする交雑細胞のみが増殖し得る培地
（ヒトＴ細胞は本来増殖し得ない）であり、その
代表例としては例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む培地（HAT培地）を
例示できる。該HAT培地としては、例えば10％
FCS含有MEM培地に、アミノプテリン４×
10^-7M、ヒポキサンチン１×10^-4M、チミジン
1.6×10^-5M及びグリシン３×10^-6Mを添加した
培地が例示できる。該HAT培地での細胞の培養
は、通常の限界希釈法に従い目的とする交雑細胞
以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するに充分な
時間通常約数日〜数週間程行なわれる。これによ
り目的とするヒトＴ細胞融合細胞のみが選択的に
増殖する。かくして得られる融合細胞は、核形（核染色体
数）細胞表面の表現型、マイトジエン反応性、リ
ンホカイン産生能等において、親細胞株、ヒトＴ
細胞とは明らかに異なる新しい特性を具備してい
る。この融合細胞は、前記と同様の適当な培地中
で増殖維持することができるがHAT培地による
選別後、ヒポキサンチン及びチミジンを含むHT
培地で１〜２週間培養した後、通常の培地に移す
方が好ましい。その特性を後述する実施例により
得られた融合細胞を例にとり、親細胞株
（HGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞、以下CEM−
AGRとする）との対比において示せば、下記第
２表の通りである。

【表】尚第２表中頻度は次式により示されるものであ
る。確立された交雑細胞を含むウ
エル数／細胞融合直後の細胞２×10⁵個を接種したウエ
ル数また、染色体数、Ｔ細胞特異抗原発現性、ロゼ
ツト形成及びＢ細胞マーカー発現性は、夫々親細
胞につき前述した方法により測定されたものであ
り、各項における記号は夫々次のことを示す。＋＋……95％以上の細胞が陽性を示す。 −……１％以下の細胞が陽性を示す。 ND……未測定上記第２表を参考として、本発明の親細胞ライ
ンから誘導されるヒトＴ細胞交雑細胞ラインの各
種特性を、親細胞株につき上記した各項目(1)〜(12)
と共にその他の特性をまとめれば次の通りであ
る。 (1) 形態学的特徴；各融合細胞のクローン毎に若干相違するが、
本質的には親細胞株を類似しており、その大き
さは親細胞株よりやや大きく（1.2〜1.5倍）、
細胞表面上にヒゲ様の突起を多数出しているも
のが多い。 (2) 核形（核染色体数）；各クローン毎に異なるが平均染色体数は、86
〜94の範囲にある。これは親細胞のそれが78で
あるのに対し明らかに多い。 (3)〜(5)；大部分のクローンにおいて親細胞と同一であ
る。 (6) HLA表現型；すべてのクローンにおいて親細胞のそれは発
現されており、各クローンは他に該親細胞以外
のヒトＴ細胞のHLA表現型の１以上を発現し
ている。 (7)〜(10)；すべてのクローンにおいて親細胞のそれと
略々同一である。 (11) ８−アザグアニン耐性；すべてのクローンは８−AG耐性を示さな
い。 (12) マイトジエン反応性； Con ＡとPHAに関しては、親細胞株と同様
の又はそれ以上の反応性を示す。親細胞株は
PWMに全く反応しないがPWMに反応するク
ローンがかなり見い出される。 (13) Ｔ細胞増殖因子活性；クローンNo.24−Ａは、後述する実施例に示す
方法において、Ｔ細胞増殖因子（TCGF）活性
を示す。上記した諸特性より、本発明の親細胞ラインか
らは新規なヒトＴ細胞交雑細胞ラインが確立され
ることが明らかである。殊にこの交雑細胞ライン
の確立は、得られる各クローンが親細胞株と対比
して、いずれも８−AG耐性を示さないこと、核
染色体数が増加していること、HLA表現型にお
いて親細胞株以外の表現型が発現されること等に
おいて確証される。また上記した如きヒトＴ細胞交雑細胞株は、こ
れを常法に従い通常の培地で増殖させることによ
り、クローン化することができ、これにより夫々
単一の融合細胞株に分離することができる。かく
して得られる各融合細胞株は、いずれもヒトＴ細
胞の少なくとも１つの核染色体を保有するもので
あり、また継代培養による増殖が可能でしかも凍
結保存できる所から、これを増殖させることによ
りヒトＴ細胞のより詳細な研究解明が行ない得
る。また之等クローンには、従来ヒトＴ細胞より
分泌され免疫応答の調節における重要な役割を演
じることの知られている数多くのリンホカイン類
の産生能を有するものが存在しており、従つて該
クローンの確立により生体外で容易迅速にしかも
多量のリンホカイン類を収得することが可能であ
る。これは各種の免疫系疾患の診断や治療に新し
い方法を提供し得るものである。本発明に従い確立単離されたひとつのヒトＴ細
胞融合細胞株（クローンNo.24−Ａ）につき更に詳
述すれば次の通りである。即ちこの細胞融合株ク
ローンは、後述する実施例に示す通り親細胞株
と、ヒト末梢血リンパ球のＴ細胞との細胞融合に
より得られたひとつの交雑細胞株であり、これは
上記した交雑細胞株に共通する各種性質を有す
る。殊にその核染色体数は79−97（平均89）であ
る。HLA表現型は、A2、AW24、A11、B5、
B8、B37及びBW22であり、親細胞株のそれ
（A2、A11、B8、B37、BW22）の他にヒトＴ細
胞のそれ（A2、AW24、B5、B40）のうちのB40
を除くすべてを発現している。またこのクローン
細胞株は、第１図乃至第４図に示す各マイトジエ
ンに対する反応性を示し、即ち１％のPHA濃度
で分裂増殖をほぼ完全に抑制され、0.5〜１％の
PWM濃度で分裂増殖が抑制される。更にこのクローン細胞株は、強力なTCGF活性
を示す点において特徴付けられる。之等の特性は
実施例及び添付の第５図及び第６図に示す通りで
ある。このように上記ひとつのクローン細胞株は、こ
れを前記した適当な培地中で培養させることによ
り、その培養上澄からＴ細胞増殖因子（TCGF）
を回収することができる。従つて本発明はこの
TCGFを製造する新しい方法をも提供するもので
ある。この方法の詳細は後記実施例を示す。本発明者らは、この新しいTCGF産生能を有す
る融合細胞株についても、前記親細胞株と同様微
工研への寄託が受付けられなかつたため、自ら分
譲可能な状態に保持すると共に、ATCCに寄託
し、「HB8082」として受託されている。以下本発明を更に詳しく説明するため、親細胞
株の製造例、ヒトＴ細胞の単離調製例、之等の各
細胞の融合例及び得られた融合株についての試験
例を実施例として詳述する。実施例１ HGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞の製造ヒト白血病Ｔ細胞株CCRF−CEMは、Dr
Minowada RPMI、Buffaloより入手し、これを
10％FCS（Centaurus、Biological、Co.、社、ロ
ツトNo.527）を含むRPMI1640培地（Flow
Laboratories社）に培養維持した。上記CCRF−CEM細胞を、まず2μMの８−AG
を含むRPMI1640＋10％FCS培地に１×10⁶個／
mlの細胞濃度で浮遊させ、培養ボトル（コーニン
グ社）にその10mlを取り、ボトルを横にした状態
で、５％炭酸ガス及び95％空気の通気条件下、37
℃でインキユベーター内で１週間培養した。その
後生存細胞を取り出し、上記の２倍濃度即ち
4μMの８−AGを含む同一培地に１×10⁶個／ml
濃度となる様に浮遊させ、同様にして１週間培養
した。上記のように１週間毎に培地に添加させる
８−AG濃度を約２倍づつ（２→４→８→16→32
→50→75→100μMとした）増加させ、夫々の倍
地で生存する細胞を順次培養して、最終的に８−
AG100μMを存在させた培地で生存する細胞を得
た。かくして約８週間を経て所望の８−AG耐性
株を得た。これを「CEM−AG^Rとする。この株
はその後同濃度（100μM）の８−AGを含む
RPMI1640＋10％FCS培地にて強い増殖を示し、
この培地で継代培養により維持されている。また
その細胞学的及びその他の特性は前述した通りで
あつた。実施例２ヒト細胞の単離調製 (1) 末梢血Ｔ細胞健康な成人よりヘパリン採血して得た血液50
mlを「フイコール−バツク」（フアルマシア・
ジヤパン株式会社）で遠心分離して、末梢血リ
ンパ球５×10⁷を単離した。該リンパ球からの
Ｔ細胞の単離は、ノイラミニダーゼ処理羊赤血
球（SRBC）でロゼツト化することにより行な
つた〔T.HIRANO、T.KURIANI、T.
KISHIMOTO and T.YAMAMURA、J.
Immunol.、119、1235〜1241（1977）〕。かくし
て得られた末梢血Ｔ細胞を「非刺激PBL−Ｔ」
とする。また上記非刺激PBL−Ｔの１×10⁶個／mlに
対して、10μｇ／mlのCon Ａ、25μｇ／mlの
PPD及び10μｇ／mlのPro Ａで夫々48時間刺激
させて、刺激Ｔ細胞を調整する。之等を夫々
「Con Ａ刺激PBL−Ｔ」、「PPD刺激PBL−Ｔ」
及び「Pro Ａ刺激PBL−Ｔ」とする。 (2) 口蓋扁桃Ｔ細胞慢性扁桃炎患者の扁桃切除術で得たヒト口蓋
扁桃より採取した扁桃腺を、ヘパリン10単位／
ml及びアンホテリシンＢ（三共株式会社）4μ
ｇ／mlを含むMEM培地にて細切し、扁桃細胞
を取り出した。この細胞を「フイコール−バツ
ク」を用い遠心分離し、５×10⁸個の扁桃リン
パ球を単離した。以後上記(1)と同様にノイラミ
ニダーゼ処理羊赤血球にてロゼツト化して扁桃
Ｔ細胞２×10⁸を単離した。この細胞１×10⁶
個／mlMEMを次いで10μｇ／mlのCon Ａで48
時間刺激し、刺激扁桃Ｔ細胞を得た。これを
「Con Ａ刺激Tonsil−Ｔ」とする。 (3) 胸腺滲出液Ｔ細胞肺結核の患者より胸腺滲出液のリンパ様細胞
を分離した。即ち肺結核患者の胸腺滲出液（胸
水）を穿刺法により100ml採取し、これを
1500rpm、５分の遠沈後ヘパリン10単位／mlを
含有するMEMにて２回洗浄し、「フイコール
−ハイパツク」（フアルマシア・ジヤパン株式
会社）で遠心分離し、胸水リンパ球３×10⁸個
を単離した。以後上記(1)と同様にして、胸水Ｔ
細胞を得、その１×10⁶個／mlを25μｇ／mlの
PPDで48時間刺激した。かくして得られた細
胞を「PPD刺激PF−Ｔ」とする。実施例３親細胞−ヒトＴ細胞融合親細胞CEM−AG^Rは、融合の３日前より毎日
培地（RPMI1640＋10％FCS＋100μM8−AG）を
交換して、増殖が活発な状態に保持しておいた。上記CEM−AG^Rの１×10⁷個と、上記実施例２
で得た各ヒトＴ細胞の夫々２×10⁷個とを細胞融
合に利用した。即ち上記各細胞を、予め37℃加温
保持したFCSを含まないMEM培地で３回洗浄
し、次いで50mlのコニカルチユーブに移しよく混
合し、1000rpmで10分遠沈した。上清を除去して
得られた細胞ペレツトを軽く振とうし、その上に
37℃に加温した45％PEG−6000（コツホライト
社）の0.3mlを注いだ。30秒間よく振とうした後、
５％炭酸ガス及び95％空気の炭酸ガスインキユベ
ーター内で、37℃下に６分間静置した。これに
FCSを含まないMEM（予め37℃に加温）を１分
間に２mlの速度で総計12ml加えた。更にMEM25
mlをすばやく加えた後800rpm、10分間遠沈し、
上清を除去した。これに20％FCS含有RPMI1640
培地（予め37℃に加温）の50mlを静かに加えて
CEM−AG^R濃度を２×10⁵個／mlとし、これをマ
イクロカルチヤープレート（リンブロ社）の直
径２cmの各ウエル50個に夫々１mlづつ分注した。
24時間後上清の半分をすてHAT培地（ヒポキサ
ンチン（シグマ社）１×10^-4M、アミノプテリン
（シグマ社）４×10^-7M及びチミジン（シグマ社）
1.6×10^-5Mを含むRPMI1640＋20％FCS培地）１
mlを各ウエルに加えた。２日毎に同様の操作を繰
返し、２〜４週間５％炭酸ガスインキユベーター
内で37℃下に培養した。増殖する細胞株を次いで
アミノプテリン(A)を含まないHT培地（HAT培
地よりＡを除いたもの）に移し、更に１週間培養
後、HATを含まないRPMI1640＋10％FCS培地
（正常培地）に移し、以後常法に従いクローニン
グ化した。即ち交雑細胞を正常培地中で５個／ml
となるように希釈しこれをフアルコンマイクロプ
レートに0.2ml／ウエルづつ分注し、２〜３日お
きに上清を半分すて、予め37℃に加温した培地を
加え、上記細胞の増殖をつづけた。かくして交雑
細胞株の単一クローンを得た。得られたクローン
中の代表的ヒトＴ細胞交雑細胞株は、前述した第
２表に示す特性を有していた。実施例４ヒトＴ細胞交雑細胞上清の製造 (1) 無刺激で得た上清上記実施例３で得た交雑細胞クローンNo.24−
Ａの細胞を、RPMI1640＋10％FCS培地を用い
て１×10⁵個／ml濃度に調整し、これをマイク
ロカルチヤプレート（リンブロ社）の直径２cm
のウエルにて２日間、37℃下、５％炭酸ガスイ
ンキユベーター内で培養した。3000rpm10分遠
沈して培養上清を採取し、これを0.45μミリポ
ア・フイルターにて滅菌過し、この上清中の
リンホカイン活性の有無を検討した。 (2) Con Ａ刺激で得た上清上記において用いた培地にCon A1μｇ／ml
を添加する以外は、上記(1)と同様にして、上清
を得、これをリンホカイン活性測定に供した。実施例５ヒトＴ細胞交雑細胞上清のリンホカイン産生能上記実施例４で得た各上清のリンホカイン産生
能を次の通り試験した。＜TCGF活性試験１＞生後５〜６週間のBALB／Ｃマウス（静岡実
験動物）から胸腺細胞を取出し、細切して胸腺細
胞を得、これをMEMにて２回洗浄し、10％FCS
を含むRPMI1640培地にて１×10⁶個／ml濃度の
細胞液を調整した。この胸腺細胞浮遊液0.1ml
（１×10⁵個細胞）に、上記実施例４で得た交雑細
胞の上清を加え0.2ml容平板マイクロプレート
（フアルコン社）内で2μｇ／mlのCon Ａの刺激
下、 ³H−チミジン（ ³H−TdR）0.5μCi／ウエ
ルを６時間を要して与え培養を行なつた。培養３
日後の分裂増殖を ³H−TdRの取り込みにより調
べた。同一試験を親細胞株であるCEM−AG^Rの
培養上清についても行なつた。結果を第５図に示
す。第５図中縦軸は取り込まれた ³H−TdRカウ
ント数（C.P.M.×10^-3）を示す。また横軸の(A)
は、何らの培養上清をも添加しない場合、(B)は、
実施例４の(1)及びこれと同様にして得たCEM−
AG^Rの各上清を添加した場合（斜線を入れないも
のが実施例４(1)で得た上清及び斜線で示すものが
CEM−AG^Rの上清である。以下同じ）、(C)は実施
例４の(2)及びこれと同様にして得たCEM−AG^R
上清の場合及び(D)は培養上清の替わりに1μｇ／
mlのCon Ａのみを用いた場合を夫々示す。各(A)
〜(D)共結果は３度同一試験を繰返した平均±S.D.
で示す。上記第５図より、クローンNo.24−Ａの培
養上清（図中斜線を付していない(B)及び(C)群）
は、Con Ａで刺激されたマウス胸腺細胞の有意
な分裂増殖を誘発し、殊にこの作用はクローンNo.
24−ＡをCon Ａで刺激して得た上清(C)群で著し
く強いことが判る。これに対しCEM−AG^Rは、
非刺激上澄及びCon Ａ刺激上清のいずれにおい
ても分裂増殖誘発因子を産生しないことが判る。＜TCGF活性試験２＞実施例４の(1)で得た上清50mlを濃縮後セフアデ
ツクスＧ−100カラム（フアルマシア社）に通し、
分子量約13000〜20000の分画を得、これを「アミ
コンYM−５」メンブランス（Amicon
Corporation、Lexington、Mass）で５mlに濃縮
して半精製上澄を得た。同様にして親細胞株
CEM−AG^Rの半精製上澄を得た。一方正常ヒト末梢血Ｔ細胞とマイトマイシン処
理CESS（EB−ウイルスでトランスフオームした
ヒトＢ細胞、スローン・ケタリング癌研究所のピ
ーターラルフ博士より入手）とをリンパ球混合培
養（MLC）し、TCGF（ヒト扁桃リンパ球１×
10⁶個／mlを0.1％PHAの存在下で２日間培養し、
培養上清を粗製TCGFとして用いた）によつて16
週間培養、増殖させたTCGF依存性ヒト細胞障害
性Ｔ細胞株を用意した。上記TCGF依存性ヒト細胞障害性Ｔ細胞株の３
×10³個を、上記で得た半精製上澄の存在下に、
24時間培養し（37℃、CO₂インキユベーター内、
RPMI1640＋10％FCS培地）し、0.5μCiの ³H−
TdRを５〜８時間をかけて与え、上記半精製上
澄の連続希釈によつて、該 ³H−TdRの取り込み
量をカウントし、TCGF活性を調べた。結果を第
６図に示す。第６図において横軸は希釈上清原液
を１とし、その希釈濃度（希釈倍率）を示し、０
はコントロールとして上澄を加えない場合を、ま
た斜線を入れた値は、上記で得た半精製上清を、
斜線を入れない値ははCEM−AG^Rの半精製上清
を示す。また縦軸は取り込まれた ³H−TdRのカ
ウント数（C.P.M.×10^-3）を示す。すべての結
果は、同一試験を３度繰返した平均±SDで示す
ものである。第６図よりクローンNo.24−Ａの培養上清中の分
子量13000〜20000の半精製分画は、TCGF依存性
ヒト障害性Ｔ細胞株の増殖を維持することがで
き、その活性は、液性因子の濃度に依存すること
が判る。一方親細胞株CEM−AG^Rから得られる
同様の分子量を持つ分画は、どの濃度においても
上記増殖活性を示さないことが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図は、本発明親細胞株CEM−
AG^R及び該親細胞株から誘導されたＴ細胞融合株
クローンNo.24−Ａの夫々のマイトジエン反応性を
示すグラフ並びに第５図及び第６図は上記Ｔ細胞
融合株クローンNo.24−ＡのTCGF活性を示すグラ
フを夫々示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル
トランスフエラーゼ（HGPRT）欠損ヒト白血病
性Ｔ細胞ラインであり、ATCC CRL−8081であ
るヒトＴ細胞ライン。２ヒト白血病性Ｔ細胞を、８−アザグアニン、
６−チオグアニンおよび６−メルカプトプリンリ
ボシツドから選ばれた少なくとも１種を含有する
培地で培養してHGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞
ATCC CRL−8081を得ることを特徴とするヒト
Ｔ細胞ラインの生産方法。