FR2507620A1 - Lignees cellulaires t humaines et procede de production - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE EN PARTICULIER UNE LIGNEE CELLULAIRE LEUCEMIQUE T HUMAINE DEFICIENTE EN HYPOXANTHINE-GUANINE-PHOSPHORIBOSYL-TRANSFERASE (HGPRT) ET LES LIGNEES CELLULAIRES QUI EN DERIVENT.

Description

La présente invention concerne-de nouvelles lignées cellulaires T humaines

et plus particulièrement des lignées cellulaires T humaines hybrides (fusionnées, et spécialement des lignées cellulaires T hybrides humaines qui sécrètent des lymphokines et une lignée cellulaire parentale qui peut fusionner avec les cellules T humaines pour obtenir de telles cellules hybrides L'invention concerne également un procédé pour établir ces lignées cellulaires, et un procédé pour

obtenir les lymphokines à partir de telles lignées cellulaires.

Les lymphocytes qui interviennent dans le système im-

munitaire chez l'homme sont généralement classés en cellules T, à savoir cellules dérivées du thymus, et encellules B, à savoir cellules dérivées de la moelle osseuse On sait que les cellules B sécrètent des anticorps On a mis au point une technique pour obtenir des anticorps monoclonaux à partir d'hybridomes de cellule B préparés par hybridation cellulaire de cellules B productrices d'anticorps et de cellules de myélome qui servent de cellules parentales (Cf "Rinsho

Kagaku (Clinical Science" Vol 16, N O 9, 1108-1114 ( 1980).

Les cellules T jouent un rôle principal dans la régulation de la réponse immunitaire Bien que beaucoup de leurs caractéristiques restent encore à découvrir, on sait

que les cellules T sécrètent de nombreux facteurs immuno-

régulatoires solubles (lymphokines), comme un facteur qui supprime la production d'anticorps, des facteurs solubles qui induisent la prolifération d'autres cellules T (interleucines), etc Cependant, ces facteurs sont sécrétés en très faibles

quantités même in vivo et en outre il est extrêmement diffi-

cile de les produire, de les isoler ou de les recueillir en grandes quantités in vitro On s'est donc efforcé de préparer des cellules T hybrides par fusion cellulaire afin d'obtenir de tels facteurs in vitro, mais les quelques cas de fusion de cellules T opérée avec succès mentionnés jusqu'ici se limitent aux cellules T murines seulement Rien n'a été signalé jusqu'à présent concernant une hybridation réussie de cellules T humaines On n'a pas développé jusqu'à présent de cellules parentales T humaines pouvant fusionner avec des cellules T humaines De façon plus précise, même si l'on obtient une cellule parentale de ce genre pour l'hybridation avec la cellule T humaine normale, la cellule parentale retourne à son état d'origine avant et/ou pendant le processus d'hybridation, rendant ainsi presque impossible la sélection des hybridomes En outre, même si les hybridomes sont choisis et isolés, on ne peut aucunement prédire que les hybridomes seront fonctionnellement stables ou proliféreront pendant longtemps tout en gardant les gènes que la cellule T normale

leur a transmis.

Comme il est difficile d'obtenir de grandes quantités

de facteurs immunorégulatoires solubles homogènes, on ren-

contre d'extrêmes difficultés à analyser leurs caractéris-

tiques chimiques et biologiques Ainsi, aucune recherc#e n'a été faite pour l'application clinique de ces facteurs et leurs effets cliniques En outre, étant donné que les lignées cellulaires hybrides T humaines n'ont pas été établies jusqu'à présent, on n'a fait que peu ou pas de progrès dans l'analyse des antigènes de surface sur les cellules T humaines et les

récepteurs cellulaires T pour les antigènes, dans les recher-

ches sur le sous-ensemble des cellules T humaines, et dans

les études cellulaires et immunologiques sur la différencia-

tion, la prolifération et l'activation des cellules T

humaines par elles-mêmes.

L'invention a donc pour objet de fournir une lignée cellulaire parentale pouvant fusionner avec les cellules T

humaines.

Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé

pour produire une lignée cellulaire parentale pouvant fusion-

ner avec les cellules T humaines.

Un autre objet de l'invention est de fournir de nouvelles lignées cellulaires hybrides produites à partir

de la lignée cellulaire parentale et de cellules T humaines.

Un autre objet de l'invention est de fournir un

procédé pour produire la lignée cellulaire hybride.

Un objet encore différent de l'invention est de four-

nir un procédé pour produire une grande quantité de facteurs immunorégulatoires solubles rapidement et facilement in vitro

en utilisant la lignée cellulaire hybride.

Ces objets et autres caractères de l'invention apparat-

tront d'après la description qui suit.

L'invention fournit une lignée cellulaire leucémique

T humaine déficiente en hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-

transférase (HGPRT), des lignées cellulaires hybrides qui

en dérivent, et un procédé pour établir ces lignées cellulai-

res Plus particulièrement, l'invention fournit une nouvelle lignée cellulaire T parentale qui n'est connue d'aucune manière et qui rend possible la fusion des cellules T humaines, de nouvelles lignées cellulaires hybrides produites à partir de la lignée cellulaire parentale et des cellules T humaines,

et un procédé pour produire ces lignées.

On a conduit dés recherches poussées pour établir une technique de fusion des cellules T humaines Par conséquent,

on a trouvé qu'une lignée cellulaire spécifique peut fusion-

ner avec les cellules T humaines, possède une sensibilité au milieu de culture pour choisir les cellules fusionnées, peut être entretenue dans une culture de façon permanente, et convient comme lignée cellulaire parentale pour préparer les cellules hybrides T humaines On a également trouvé que la lignée, lorsqu'elle est utilisée comme parent, fusionne avec les cellules T humaines pour donner naissance à des

cellules hybrides humaines et que les cellules hybrides peu-

vent être facilement sélectionnées en utilisant un milieu sélectif En outre, les clones obtenus à partir des cellules hybrides T humaines ainsi préparées comprennent ceux qui ont la capacité de produire les facteurs immuno-régulatoires solubles (lymphokines) qui sont sécrétés à partir des cellules T humaines et dont on sait qu'ils jouent un rôle important dans la régulation des réponses immunitaires L'invention

a été réalisée sur la base de ces nouvelles découvertes.

Les figures 1 à 4 montrent des graphes donnant la réactivité mitogène de la lignée cellulaire parentale CEM-AG et de la lignée cellulaire hybride T (clone

n O 24-A) selon l'invention.

Les figures 5 et 6 présentent des graphes donnant les activités TCGF de la lignée cellulaire hybride T (clone

N O 24-A) selon l'invention.

La lignée cellulaire parentale et les lignées cellu-

laires hybrides de l'invention peuvent être cultivées de

façon continue Avec l'établissement de ces lignées cellulai-

res, en particulier des lignées cellulaires hybrides, il devient possible de produire in vitro de grandes quantités de facteurs immuno-régulatoires solubles qui sont sécrétés à partir des cellules T humaines, c'est-à-dire des facteurs solubles qui jouent un rôle de médiation de la réaction intercellulaire dans la réponse immunitaire, et d'analyser les caractéristiques chimiques et biologiques de ces facteurs solubles quin'ont pas été entièrement éclaircies jusqu'à présent, en contribuant dans une large mesure à la recherche

sur l'application clinique et l'effet de ces facteurs.

En outre, l'établissement de lignées cellulaires hybrides T humaines fournit un moyen très utile pour l'analyse des antigènes de surface sur les cellules T humaines et des

récepteurs cellulaires T pour les antigènes, pour la recher-

che sur le sous-ensemble des cellules T humaines, et pour

les études cellulaires et immunologiques sur la différen-

ciation, la prolifération et l'activation des cellules T

humaines en elles-mêmes.

La nouvelle lignée cellulaire parentale de l'invention dérive d'une lignée cellulaire leucémique T humaine et se

caractérise en ce qu'elle est déficiente en HGPRT Les carac-

téristiques cytologiques et autres de la lignée cellulaire

parentale sont les suivantes.

( 1) Caractéristiques morphologiques: Les cellules parentales ont environ 2 à 3 fois le diamètre des cellules T du sang périphérique humain normal et sont presque sphériques Le noyau occupe une grande proportion de la cellule, et on observe une petite quantité

de protoplasme Le protoplasme comprend quelques granules.

On peut trouver occasionnellement un prolongement du type pseudopode. ( 2) Nombre de chromosomes: On fait incuber les cellules parentales en présence

de colchicine à une concentration de 0,1 mg/ml à 370 C pen-

dant 3 h, on centrifuge, on traite avec K Cl 0,075 M et on fixe sur une lamelle de verre avec un mélange de méthanol et d'éthanol ( 3:1) On compte ensuite le nombre de chromosomes nucléaires au microscope en utilisant une lentille à immersion dans l'huile grossissant 1000 fois Le décompte pour 100 cellules dans les phases méta est compris entre 69 et 87 avec

une moyenne de 78 et est donné au Tableau 1 ci-dessous.

À _

Tableau 1

Nombre de chromosomes 69 70 71 72 73 74 75 76 77 Nombre de cellules 1 3 4 4 4 4 4 11 12 Nombre de chromosomes 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 Nombre de cellules 10 9 4 9 5 10 2 1 2 1 ( 3) Expression de l'antigène spécifique de la cellule T: On fait incuber les cellules parentales, au nombre de x 10, avec 100 pl d'un anticorps monoclonal à une concentration: appropriée ( 0,1 mg/O,5 ml d'anticorps anti-Leul, anti-Leu 2 A et anti-Leu 3 A dilués 100 fois, 10 fois et

10 fois, respectivement, à 100 ml) à 4 C pendant 30 minutes.

Les anticorps monoclonaux sont fournis par Becton-Dickinson

Co., Sunnyvale, Ca, Etats-Unis (J Exp Med, 153, 310-

323 ( 1981)) On lave ensuite les cellules avec un milieu MEM (obtenu auprès du Research Institute for Microbial Diseases, Université d'Osaka, Osaka, Japon) contenant 5 % de

SFV (sérum de foetus de veau), on fait réagir avec de l'immuno-

globuline anti-souris de la pin conjuguée avec du FITC (isothiocyanate de fluorescéine) (Miles-Yeda Ltd, Israël), puis on examine pour détecter l'expression de l'antigène

spécifique de la cellule T par immunofluorescence indirecte.

Lorsqu'on vérifie 200 de ces cellules, au moins 95 % sont positives pour les anticorps anti-Leu 1 et anti-Leu 3 A, et Jusqu'à 1 % sont positives pour l'anticorps anti-Leu 2 A. ( 4) Formation de rosette: On examine 200 cellules parentales au microscope grossissant 400 fois pour détecter la formation d'une rosette avec EAC (érythrocytes de mouton (E) traités avec de l'anticorps anti-érythrocyte (A) et du complément

humain (C)) avec ce résultat que jusqu'à 1 % sont positives.

( 5) Expression d'un marqueur cellulaire B: On analyse une immunoglobuline de surface (Ig) en

employant de l'immuno-globuline ani-humaine de souris FITC-

conjuguée (Behring Werke AG, Marburg) par immunofluorescence

directe Jusqu'à 1 % des cellules sont positives.

On analyse lantigène HLA-DR humain (appelé ci-dessous "DR") en utilisant un anticorps anti-DR monoclonal (fourni

par Becton-Dickinson Co) par immunofluorescence indirecte.

Jusqu'à 1 % des cellules analysées sont positives.

On analyse l'expression des antigènes spécifiques de la cellules B humaine (antigène B) par immunofluoréscence indirecte en utilisant un anticorps cellulaire B antihumain monoclonal obtenu à partir d'une lignée cellulaire hybride préparée à partir de myélome P 3 U 1 (fourni par l'Albert Einstein College of Medicine) et de cellules de rate de souris immunisées avec une lignée cellulaire B humaine (CESS, fournies par le Dr Peter Ralph du Sloan-Kettering

Institute for Cancer Research, New-York, Etats-Unis) transfo-

mé avec un virus (virus d'Epstein-Barr) (voir G Kohler et C Milstein, Nature, 256, 495, 1975) Jusqu'à 1 % des cellules sont positives L'anticorps réagit avec les cellules B ou leurs lignées mais ne réagissent pas avec les cellules T ou

leurs lignées.

( 6) Phénotype HLA: On fait incuber les cellules parentales avec le sérum

anti-HLA (fourni par le Prof Sasazuki de l'Université médica-

le et dentaire de Tokyo au Japon) à 37 C pendant 30 minutes, puis on fait incuber pendant 60 minutes avec du complément de lapin absorbé par la cellule parentale de l'invention au préalable puis on vérifie la survie Le phénotype HLA

est A 2, All, B 8, B 37 et Bw 22.

( 7) Prolifération:

Les cellules parentales prolifèrent de façon satis-

faisante dans le milieu de culture RPMI 1640 (Flow Laboratories, EtatsUnis) contenant de la 8-azaguanine ( 8-AG, 100 i M),

du SFV à 10 %, du 2-mercaptoéthanol 5 x 10-5 M et de la gluta-

mine 1 m M. ( 8) Consitions de prolifération: Les cellules parentales prolifèrent généralement de façon satisfaisante à une température de 36 à 38 C et à un p H de 7,2 à 7,3 Il est commode d'utiliser un incubateur

contenant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'air.

( 9) Culture continue: On peut faire incuber les cellules parentales de

façon continue et indéfiniment.

( 10) Conservation sous forme congelée: On peut conserver les cellules parentales dans l'azote

liquide pendant une durée prolongée.

( 11) Résistance à la 8-azaguanine:

Les cellules parentales sont résistantes à la 8-aza-

guanine ( 100 MM) et meurent dans un milieu (milieu HAT) con-

tenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine.

Ceci indique que les cellules parentales sont déficientes en

HGPRT.

( 12) Réactivité mitogène: Lorsqu'on ajoute au milieu de 10 à 100 pg/ml de concanavaline A (Con A), et de 1 à 10 % de lectine végétale, phytohémagglutinine (PHA), on inhibe dans une certaine mesure

la prolifération de la lignée cellulaire parentale.

Le mitogène pokeweed (PWM) ainsi que la protéine A (Pro A),ne produisent pas d'influence sur la prolifération de la lignée

à quelque concentration que ce soit.

Les figures 1 à 4 montrent ces caractéristiques.

On cultive 2 x 10 cellules de la présente lignée cellulaire parentale en présence de diverses concentrations d'agents mitogènes (Fig 1 pour Con A, fig 2 pour PHA, fig 3 pour PWM et fig 4 pour Pro A) pendant 60 heures dans le milieu RPMI 1640 contenant 10 % de SFV î ajoute au milieu 0,2 M Ci de 3 H-thymidine ( 3 H-Td R) pendant les 12 dernières heures de la culture On recueille les cultures sur des bandes de fibre de verre (Labo- Science Cell Harvester, Tokyo), et on détermine l'absorption de 3 H-Td R dans la

fraction acide désoxyribonucléique par comptage à scintilla-

tion liquide Dans chaque expérience, les cultures sont faites en 3 exemplaires, et on présente les valeurs moyennes

(jusqu'à 10 % dans l'écart-type) Dans chaque graphe, la con-

centration de l'agent mitogène est mise en abcisse, et le dé-

compte de 3 H-Td R (C P M x 10-5) en ordonnée L'une des courbes () représente le résultat obtenu avec la présente lignée cellulaire parentale, et l'autre courbe ( O) représente le résultat avec le clone 24 A (clone de la lignée cellulaire hybride T humaine de l'invention)

qui sera décrit plus loin.

La lignée cellulaire leucémique T humaine déficiente

en HGPRT de l'invention ayant les caractéristiques précé-

dentes dérive, par exemple, des cellules leucémiques T humaines (CCRF-CEM) (J KAPLAN, T C SHOPE et W D PETERSON, Jr., J Exp Med 139, 1070-1076, 1974) et peut être obtenue en cultivant des cellules de ce genre dans un milieu RPMI 1640 contenant du SFV à 10 % et de la 8-azaguanine ( 8-AG)

puis entransférant successivement ces cellules dans des mi-

lieux de ce genre ayant des concentrations accrues en 8-AG.

De façon plus spécifique, on cultive les cellules dans ce type de milieu contenant, par exemple, 2 MM de 8-AG pendant

une semaine pour commencer, puis dans le même milieu conte-

nant 16 p M de 8-AG pendant une semaine puis de même dans des milieux o la concentration de 8-AG est multipliée par 2 à chaque fois Enfin, on obtient une lignée cellulaire 8-AG-résistante vivante dans un milieu contenant 100 VM de 8-AG La lignée cellulaire résultante prolifère rapidement dans le milieu avec 100 MM de 8-AG et peut être cultivée

de façon continue dans le même milieu.

La lignée ainsi obtenue possède les caractéristiques précédentes, est une nouvelle lignée cellulaire T qui n'a pas été mentionnée antérieurement, peut être cultivée de façon permanente, et peut être conservée par congélation

presque indéfiniment.

La lignée cellulaire HGPTR-déficiente de l'invention peut être cultivée dans divers milieux nutritifs qui sont

pratiquement synthétiques mais qui peuvent contenir un ingré-

dient naturel, comme le sérum Comme exemples de milieux nutritifs utiles, on peut citer le milieu RPMI 1640 (Flow Laboratories, Etats-Unis) modifié avec du SFV, du sérum de cheval ou un supplément analogue à du sérum, et le milieu de Dulbecco modifié avec le milieu modifié par Iscove dépourvu de sérum Les cellules de l'invention devant être

cultivées sur de tels milieux peuvent être facilement adap-

tées pour proliférer sur divers milieux qui sont générale-

ment utilisés par les spécialistes, comme le milieu essen-

tiel minimum (MEM) d'Eagle contenant du SFV Pour entrete-

nir les cellules parentales de l'invention, il n'est pas nécessaire que ces milieux contiennent toujours du 8-AG mais il est préférable qu'ils contiennent du 8-AG La cellule peut être cultivée dans ces milieux dans les conditions qui sont

généralement employées pour la culture des cellules habituel-

les Généralement, on peut faire proliférer les cellules parentales de façon satisfaisante à environ 36 à environ

380 C, en remplaçant le composant liquide tous les 3 à 5 jours.

Bien que la lignée cellulaire parentale précédente n'ait pas été acceptée pour dép 8 t au Fermentation Research Institute, Agency Of Industrial Science and Technology, au Japon, elle est toujours conservée par les demandeurs dans un état accessible au public En outre, un échantillon de la lignée cellulaire a été déposé à l'Amer cn Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis le 30 juillet 1981 et a reçu

le N O ATCC CRL 8081.

La lignée cellulaire T HGPRT-déficiente de l'invention peut être utilisée comme lignée cellulaire parentale pour faire fusionner des cellules T humaines L'invention fournit également un procédé pour fusionner les cellules T avec la lignée cellulaire parentale et la lignée cellulaire hybride T

ainsi obtenue.

Les cellules T humaines qui peuvent être utilisées pour

la fusion de cellules T ne sont pas particulièrement limitées.

Comme exemples de cellules T utiles, on peut citer celles qui sont obtenues à partir du sang périphérique, de la moelle osseuse, des ganglions lymphatiques, de la rate, des amygdales, d thymus, etc Ces cellules T peuvent être isolées et purifiées par divers procédés de séparation qui sont connus,

comme les procédés physiques classiques, les procédés chi-

miques et le procédé d'adhérence aux membranes superficielles, et peuvent être utilisées pour la fusion cellulaire selon l'invention Pour obtenir une meilleure efficacité de fusion,

ces cellules T peuvent être stimulées avec divers agents mito-

gènes avant la fusion Comme exemples d'agents mitogènes utiles on peut citer ceux qui ont une sensibilité aux cellules T, comme la concanavaline A (Con A, Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri, Etats-Unis), la tuberculine purifiée

(PPD, fournie par le Dr Takatsu, Instute for Cancer Re-

search, Ecole de médecine de l'Université d'Osaka, Osaka, Japon), la protéine A (Pro A, Pharmacia Co, Suède), la phytohémagglutinine (PHA, Difco, Detroit, Michigan, Etats-Unis), le mitogène de pokeweed (PWM, Laboratoires GIBCO,

Etats-Unis), etc Les cellules T à utiliser peuvent égale-

ment être activées par une culture de lymphocyte mixte.

On trouvera ci-dessous des exemples dans lesquels la produc-

tion de cellules T humaines et de cellules T stimulées par

des agents mitogènes est décrite en détail.

La réaction de fusion entre les cellules leucémiques T humaines déficientes en HGPRT et les cellules T humaines est conduite pratiquement de la même manière que dans le procédé connu de fusion cellulaire en présence d'un promo- teur de fusion dans un milieu approprié Des virus, comme le virus de Sendai (HVJ) sont utilisables comme promoteurs de fusion, mais il est préférable d'utiliser du polyéthylèneglycol

récemment développé (PEG) comme promoteur Il est préféra-

ble d'utiliser un PEG ayant un poids moléculaire moyen d'environ 1000 à environ 6000 Il est convenable que le milieu contienne un tel PEG à une concentration d'environ 30 à environ 60 % p/v Les milieux de culture utiles sont le milieu MEM tel quel ou modifié avec le milieu de Dulbecco,

le milieu RPMI 1640 et d'autres milieux qui sont habituelle-

ment utilisés pour cultiver des cellules Lorsqu'on le désire,

le milieu peut comporter du diméthylsulfoxyde ou un agent au-

xiliaire analogue pour améliorer l'efficacité de la fusion.

Les proportions de cellules parentales de l'invention et de cellules T humaines) utiliséespour la fusion ne sont pas particulièrement limitées Généralement, le nombre de cellules T humaines peut être d'environ 1 à environ 10 fois le nombre de cellules parentales De préférence les

cellules sont fusionnées, par exemple, de la manière suivante.

On mélange avec soin dans le milieu des quantités spécifiées

de cellules parentales et de cellules T humaines, on centri-

fuge le milieu, et on jette le surnageant obtenu On mélange alors à la masse restante une quantité appropriée d'une solution de PEG chauffée à 370 C, ce qui amorce la réaction de fusion cellulaire En'ajoutant un milieu approprié, on centrifuge le mélange, et on jette le surnageant On répète

ce procédé, et on produit les cellules fusionnées désirées.

On peut obtenir de façon sélective les cellules fusionnées désirées en cultivant le mélange obtenu avec un milieu sélectif habituel qui permet la prolifération des cellules hybrides désirées seulement, mais qui inhibe la prolifération des cellules parentales (Par elles-mêmes les cellules T humaines sont incapables de proliférer dans le milieu sélectif) On peut considérer comme typique de tels milieux, par exemple, un milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine (milieu HAT) Dé façon plus spécifique, on Drep re pn exemple utile de milieu HAT en

ajoutant 4 x 10-7 M d'aminoptérine, 1 x 10-4 M d'hypoxan-

thine, 1,6 x 10-5 M de thymidine et, si on le désire,

3 x 10-6 M de glycine à un milieu MEM ou RPMI-1640 conte-

nant de 10 à 20 % de SFV On cultive les cellules dans le milieu HAT par le procédé habituel de dilution limitante pendant une certaine durée, généralement plusieurs jours à plusieurs semaines, suffisante pour permettre la mort des cellules (p ex cellules non fusionnées, etc) autres que les cellules hybrides désirées, grâce à quoi on ne fait proliférer de façon sélective que les cellules fusionnées T

humaines désirées.

Les cellules fusionnées ainsi obtenues ont de nouvel-

les caractéristiques distinctes de celles de la lignées cellulaire parentale et des cellules T humaines, quant à leur caryotype (nombre de chromosomes nucléaires), le phénotype de la surface cellulaire, la réactivité mitogène, l'aptitude à produire une lymphokine, etc Bien qu'on puisse ensuite faire proliférer les cellules fusionnées de façon continue

dans un milieu approprié tel que celui qui a déjà été mention-

né, il est préférable de cultiver les cellules sélectivement préparées dans un milieu HT contenant de l'hypoxanthine et de la thymidine pendant 1 à 2 semaines puis de les transférer dans un milieu habituel Pour plus de précision, on trouvera les caractéristiques des cellules fusionnées obtenues dans les exemples qui suivent au Tableau 2 ci-dessous par comparaison

avec celles de la lignée cellulaire parentale (c'est-à-

dire les cellules leucémiques T humaines déficientes en

HGPRT, appelées ci-dessous "CEM-AG ").

Tableau 2

Cellule Cellule T Fréquence Clone Nombre de hybride humaine n chromosomes n (moyenne) PBL-T non stimulée Amygdale-T stimulée par Con A PBL-T stimulée par Con A PE-T stimulée par PPD PBL-T non stimulée PBL-T stimulée par Pro A PBL-T stimulée par Pro A PBL-T stimulée par Pro A PBL- T stimulée par Pro A 1/12 1/24 1/8 1/8 1/24 1/24 4/12 /24 3/24

24-A 79-97

( 89)

36-B 79-100

( 89) 38-B 79-96 ( 88)

41-III 75-93

( 86)

43-A 88-89

( 93)

47-A 81-98

( 89)

-VI 82-91

( 87)

144-C 89-100

( 94)

47-B 87-100

( 93) Cellule parentale

CEM-AGR

69-87 ( 78) Tableau 2 (suite) Cellule Expression de l'anti Formation Expression du hybride gène spécifique de de rosette marqueur B n O la cellule T

Leu 1 Leu 2 A Leu 3 A E EAC Ig DR Anti-

gène B

1 ++ ++ _ _ _ _ _

2 ++ ++ _ _ _ _ _

3 ++ ++ _ _ _ _

4 ++ ++ _ _ _ _ _

++ ++ _ _ _ _

6 ++ ++ _ _ _ _ _

7 ND ND ND ND ND ND

8 ND ND ND ND ND ND

9 ND ND ND ND ND ND

Cellule parentale ++ ++ La fréquence énumérée au tableau 2 est donnée par A/B o A est le nombre de réservoirs contenant des cellules

hybrides établies, et B est le nombre de réservoirs ensemen-

cés avec 2 x 105 cellules fusionnées immédiatement après fusion. On détermine le nombre de chromosomes, l'expression de l'antigène spécifique de la cellule T, la formation d'une rosette et l'expression du marqueur cellulaire B par les mêmes procédés que ceux qui sont déjà mentionnés pour la lignée cellulaire parentale Les symboles dans le Tableau ci- dessus ont les significations suivantes: ++ au moins 95 % des cellules sont positives ju-squ'à 1 % des cellules sont positives

ND donnée non déterminée.

E érythrocytes de mouton.

On trouvera ci-dessous résumées, avec référence au tableau 2, diverses caractéristiques de la lignée cellulaire hybride T humaine comprenant les mêmes éléments ( 1) à ( 12)

donnés pour les cellules parentales et l'élément ( 13).

( 1) Caractères morphologiques:

Les caractères de la lignée, bien que légèrement dif-

férents d'un clone à l'autre, sont pratiquement semblables à

ceux de la lignée cellulaire parentale La lignée est légè-

rement plus grande que la lignée parentale ( 1,2 à 1,5 fois

plus grande) Nombre de cellules ont de nombreuses projec-

tions en forme de poils à la surface.

( 2) Caryotype (nombre de chromosomes nucléaires): Bien que le nombre de chromosomes varie d'un clone à l'autre, le nombre moyen de chromosomes se situe dans un intervalle de 86 à 94 et est apparemment plus grand que celui

des cellules parentales qui est de 78.

( 3) à ( 5)

Identité avec les cellules parentales dans la majorité

des clones.

( 6) Phénotype HLA Les phénotypes des cellules parentales s'observent dans tous les clones On observe dans chaque clone au moins un phénotype HLA des cellules T humaines autre que ceux des

cellules parentales.

*( 7) à ( 10) A peu près semblables aux cellules parentales dans

tous les clones.

( 11) Résistance à la 8-azaguanine

Aucun clone n'est résistant à la 8-azaguanine.

( 12) Réactivité mitogène: Les lignées cellulaires hybrides sont comparables ou supérieures à la lignée cellulaire parentale en réactivité à Con A et PHA Tandis que la lignée cellulaire parentale

n'a pas de réactivité vis-à-vis de PWM, on trouve qu'un cer-

tain nombre de clones sont réactifs à PWM.

( 13) Productibilité des lymphokines: Certains clones hybrides sont capables de produire des lymphokines, en particulier des facteurs favorisants Par exemple, les clones N O 24-A, nc 38-B, etc, ont une aptitude à produire le facteur de croissance des cellules T (TCGF)

par le-procédé à décrire dans les exemples qui suivent.

En outre, les clones sont fonctionnellement stables, c'est-

à-dire capables de produire du TCGF par une culture continue

pendant une longue durée.

Les caractéristiques énumérées ci-dessus indiquent que de nouvelles lignées cellu-laires hybrides T humaines sont

établies par l'invention Lrétablissement des lignées cellu-

laires hybrides est confirmé par le fait que les clones obtenus ne sont pas résistants à 8-AG, contrairement à la

lignée cellulaire parentale, ont un nombre accru de chromo-

somes nucléaires et présentent des phénotypes HLA autres que

ceux de la lignée cellulaire parentale.

Les lignées cellulaires hybrides T humaines de l'in-

vention ainsi obtenues, lorsqu'on les fait proliférer dans un milieu habituel par un procédé habituel, peuvent être clonées, grâce à quoi les lignées peuvent être séparées en lignées cellulaires hybrides monoclonales individuelles dont chacune présente au moins un chromosome nucléaire de la cellule T humaine On peut faire proliférer la lignée par une culture continue tout en gardant les caractéristiques basées sur les gènes transférés de la cellule T humaine, et

on peut la conserver lorsqu'on la congèle, ce qui permet d'en-

treprendre des recherches plus détaillées sur les cellules T humaines Les clones comprennent ceux qui sont capables de produires diverses lymphokines, en particulier les facteurs favorisant comme le TCGF qui sont sécrétés par les cellules T humaines et dont on sait qu'ils jouent un rôle important dans la régulation de la réponse immunitaire, si bien que grâce à l'établissement de tels clones, il est possible de produire de grandes quantités de lymphokines in vitro facilement et rapidement et ainsi de fournir de nouveaux moyens pour le diagnostic et le traitement des maladies du

système immunitaire.

On donnera une description détaillée de l'une des

lignées cellulaires hybrides T humaines établies et isolées

par l'invention, à savoir le clone N O 24-A Comme il apparat-

tra d'après les exemples qui suivent, ce clone est l'un des hybridomes obtenus par la fusion de la lignée cellulaire parentale et des cellules T humaines obtenues à partir des lymphocytes sanguins périphériques et possèdent diverses propriétés qui sont communes avec les lignées cellulaires hybrides mentionnées ci-dessus En particulier, le nombre de chromosomes nucléaires du clone est de 79 à 97 ( 89 en moyenne), Le clone présente des phénotypes HLA de A 2, AW 24, Ail, B 5,

B 8, B 37 et BW 22 comprenant ceux de la lignée cellulaire pa-

rentale (A 2, Ail, B 8, B 37 et BW 22) et aussi ceux de la cellule T humaine (A 2, AW 24, B 5 et B 40) sauf B 40 La lignée cellulaire clonée présente la réactivité aux agents mitogènes montrés dans les figures 1 à 4 Ainsi sa prolifération est presque complètement inhibée à PHA à 1 % et est également inhibée à

une concentration de 0,5 à 1 % de PWM.

Le clone est en outre caractérisé par une activité TCGF élevée comme il apparattra d'après les exemples et les

figures 5 et 6.

Lorsqu'on cultive le clone-de l'invention décrit ci-

dessus avec le milieu approprié mentionné ci-dessus, on peut recueillir le facteur de croissance cellulaire T humain (TCGF) à partir du surnageant obtenu L'invention fournit donc également un nouveau procédé pour produire le TCGF Le procédé

sera décrit en détail dans l'un des exemples qui suivent.

Comme la nouvelle lignée cellulaire fusionnée ayant l'aptitude à produire le TCGF n'a pas été acceptée pour dépôt au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Scien

and Technology, Japon, les demandeurs maintiennent un échan-

tillon de la lignée dans un état accessible au public.

Z 507620

Un échantillon a été déposé le 30 Juillet 1981 à 1 'ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Etats-Unis,

et a reçu le n ATCC HB 8082.

L'invention sera décrite plus en détail avec référence aux exemples suivants de préparation de la lignée cellulaire parentale, d'isolement de cellules T humaines, de fusion de

telles cellules et de tests des lignées fusionnées obtenues.

Exemple 1

Préparation de cellules leucémiques T humaines déficientes en

HGPRT:

On cultive une lignée cellulaire leucémique T humaine CCRF-CEM fournie par le Dr Minowada, RPMI, Buffalo dans un milieu RPMI 1640 (Flow Laboratories) contenant 10 % de SFV

(Centaurus, Biological Co, Lot n 527).

On met en suspension les cellules CCRF-CEM dans un milieu RPMI 1640 contenant 2 MM de 8-AG et modifié avec % de SFV à une concentration de 1 x 106 cellules/ml On dispose une fraction de 10 ml de la suspension dans une bouteille de culture (Corning Glass Works, Corning, New York,

Etats-Unis) et on la maintient pour incubation dans un incuba-

teur à 37 C pendant une semaine, la bouteille étant placée horizontalement tandis qu'on fait passer à travers elle un

mélange de 5 % de dioxyde de carbone et de 95 % d'air.

On recueille les cellules survivantes, on les met en suspen-

sion dans une concentration de 1 x 10 cellules /ml dans le

même type de milieu contenant du 8-AG à deux fois la con-

centration ci-dessus, c'est-à-dire 4 MM, et on cultive de façon similaire pendant une semaine On cultive chaque semaine les cellules survivant au procédé de culture précédent en utilisant un milieu frais, la concentration de 8-AG doublant approximativement chaque semaine (c'est-àdire 2 -> 4 + 8

16 -Y 32 50 75 -> 100 MM) pour obtenir finale-

ment des cellules survivantes dans le milieu contenant p M de 8-AG On obtient ainsi la lignée cellulaire 8-AG-résistante désirée en 8 semaines environ La lignée est appelée "CEM-AG " La lignée croît ensuite rapidement sur le milieu RPMI 1640 contenant du 8-AG à la même concentration

( 100 p M) et modifié avec du SFV à 10 % et a depuis été main-

tenue dans le même milieu par une culture continue La lignée présente les mêmes caractères cytologiques et autres

que décrit ci-dessus.

Exemple 2

Préparation et isolement des cellules T humaines: ( 1) Cellules T sanguines périphériques: On centrifuge une quantité de 50 ml de sang héparinisé recueilli chez un adulte humain en bonne santé en utilisant un liquide de séparation lymphocytaire avec un gradient de densité ("FicollPaque", produit de Pharmacia Japan Co,

Ltd, Japon) pour isoler 5 x 107 lymphocytes sanguins péri-

phériques On isole les cellules T des lymphocytes en formant une rosette avec des érythrocytes de mouton traités à la neuraminidase (SRBC) (T HIRANO, T KUROTANI, T KISHIMOTO

et T YAMAMURA, J Immunol, 119, 1235-1241 ( 1977)).

Les cellules T sanguines périphériques ainsi préparées sont

appelées "PBL-T non stimulées".

On stimule les PBL-T avec 10 Pg/ml de Con A,

Pg/ml de PPD ou 10 Pg/ml de Pro A pendant 48 h pour obte-

nir des cellules T stimulées, appelées "PBL-T stimulées par con A", "PBLT stimulées par PPD" ou "PBL-T stimulées par

Pro-A", respectivement.

( 2) Cellules T provenant de l'amygdale palatine: On découpe l'amygdale prélevée dans l'amygdale palatine d'un malade atteint d'amygdalite chronique en petits fragments en utilisant un milieu MEM contenant unités/ml d'héparine et 4 Mg/ml d'Amphotéricine-B

(Sankyo, Co, Ltd Japon) pour obtenir des cellules amygda-

liennes On centrifuge les cellules par le procédé de gradient de densité de Ficoll-Paque pour isoler 5 x 108 lymphocytes amygdaliens On isole à partir de cela des cellules T amygdaliennes ( 2 x 10) de la même manière qu'en ( 1) ci-dessus en formant une rosette avec des érythrocytes de mouton traités à la neuraminidase On stimule les cellules ( 1 x 10 cellules/ml de MEM) avec 10 pg/ml de Con A pendant 48 h pour obtenir des cellules T amygdaliennes stimulées,

qui sont appelées "T-amygdaliennes stimulées par Con-A".

( 3) Cellules T provenant d'une effusion pleurale: On sépare des cellules lymphocytaires de l'effusion pleurale d'un malade atteint de tuberculose De façon plus spécifique, on recueille 100 ml d'effusion pleurale chez

le malade par un procédé de thoracocentèse, puis on cen-

trifuge à 1500 tpm pendant 5 minutes, on lave 2 fois avec du MEM contenant 10 unités/ml d'héparine et on centrifuge par le procédé de gradient de densité de Ficool-Paque pour

isoler 3 x 108 lymphocytes à partir de l'effusion pleurale.

On obtient les cellules T de l'effusion pleurale de la même manière qu'en ( 1) ci-dessus On stimule les cellules ( 1 x 106/ml) avec 25 pg/ml de PPD pendant 48 h Les cellules

ainsi obtenues sont appelées "PE-T stimulées par PPD".

Exemple 3

Fusion de cellules parentales et de cellules T humaines, sélection et clonage des cellules fusionnées: On maintient des cellules parentales CEMAGR dans un état de croissance rapide en remplaçant le milieu

(RPMI 1640 + SFV à 10 % + 100 p M de 8-AG) quotidiennement pen-

dant 3 Jours avant la fusion.

On utilise pour la fusion les cellules CEM-AGR ( 1 x 107 cellules) et chacun des types de cellules T humaines ( 2 x 107) obtenues dans l'exemple 2 On lave les cellules 3 fois avec le milieu MEM dépourvu de SFV maintenu à 37 C, puis on mélange à fond dans un tube conique de 50 ml et on centrifuge à 1000 tpm pendant 10 minutes On agite légèrement les boulettes de cellules séparées du surnageant, et on applique aux boulettes 0,3 ml de PEG-6000 à 45 % (Koch-Light Co, Angleterre) chauffé à 370 C On agite alors à fond les boulettes pendant 30 secondes puis on laisse

reposer à 370 C pendant 6 minutes dans un incubateur conte-

nant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'air On dispose du MEM dépourvu de SFV (chauffé à 370 C) dans l'incubateur en

une quantité combinée de 12 ml à un débit de 2 ml/minute.

On ajoute alors rapidement au mélange une quantité de 25 ml de MEM, on centrifuge le mélange obtenu à 800 tpm pendant minutes et on retire le surnageant On ajoute doucement du milieu RPMI 1640 contenant 20 % de SFV et chauffé à 370 C pour ajuster la concentration de CEM-AGR à 2 x 105 cellules/

ml On dispose une quantité de 1 ml du mélange dans 50 réser-

voirs, ayant chacun 2 cm de diamètre, d'une plaque de micro-

culture (Linbro Scientific, Etats Unis) Au bout de 24 h, on jette la moitié du surnageant, et on dispose dans le réservoir 1 ml de milieu HAT (RPMI 1640 + milieu SFV à 20 %, contenant 1 x 10 M d'hypoxanthine (Sigma Chemical Co, Etats-Unis), 4 x 10 " 7 M d'aminoptérine (Sigma Chemical Co, Etats-Unis) et 1,6 x 10-5 M de thymidine (Sigma Chemical Co, Etats-Unis)) On répète le même pr océdé tous les deux jours pour cultiver les cellules dans un incubateur en présence de

5 % de dioxyde de carbone gazeux à 370 C pendant 2 à 4 se-

maines On transfère alors les lignées cellulaires culti-

vées dans un milieu HT ne contenant pas d'aminoptérine (A)

(correspondant au milieu HAT dépourvu de A), on fait incu-

ber pendant encore une semaine, puis on transfère dans un

milieu dépourvu de HAT de RPMI 1640 i SFV à 10 % (milieu clas-

sique) et on clone par le procédé habituel De façon plus spécifique, on dilue la culture à une cellules hybride par

ml dans un milieu classique et on la dispose dans les réser-

voirs d'une microplaque (Flacon, Etats-Unis) en une quantité de 0,2 ml/réservoir On jette la moitié du surnageant de chaque réservoir tous les 2 à 3 jours, et on verse dans le réservoir pour poursuivre l'incubation un milieu de culture classique frais chauffé à 370 C, ce qui donne naissance à des monoclones des lignées cellulaires hybrides Les lignées typiques des clones ainsi obtenus, c'est-à-dire les

lignées cellulaires hybrides T humaines, ont les caracté-

ristiques présentées au Tableau 2 ci-dessus.

Exemple 4

Préparation d'un surnageant de culture à partir de cellules

hybrides T humaines.

( 1) Surnageant obtenu sans stimulation: On ajuste des cellules du clone hybride obtenu dans l'exemple 3, à savoir N O 24-A, à une concentration de 1 x 105 cellules/ml contenues dans un milieu RPMI 1640 + SFV à 10 %, puis on les dispose dans les réservoirs, de 2 cm de diamètre, d'une plaque de culture (Linbro Scientific, Etats-Unis) et on cultive dans un incubateur en présence de % de dioxyde de carbone à 370 C pendant 2 jours On centrifuge la culture à 3000 tpm pendant 10 minutes, et on recueille le surnageant, on filtre avec un filtre Millipore

de 0,45 p aux fins de stérilisation et on contrôle l'acti-

vité de lymphokine.

( 2) Surnageant stimulé par Con-A: On prépare un surnageant de la même manière que selon le procédé-( 1) ci-dessus, sauf qu'on ajoute 1 Pg/ml de Con A au même milieu que celui utilisé en ( 1) ci-dessus On

examine l'activité de lymphokine du surnageant.

( 3) Surnageant stimulé par PHA: On ajuste la concentration des cellules de clone hybride no 38-B obtenues dans l'exemple 3 à 1 x 105 cellules/ ml en utilisant RPKI 1640 + SFV à 10 % + PHA à 0,1 % On obtient

un surnageant de culture de la même manière qu'en ( 1) ci-

dessus. ( 4) Sirageant stimulé par des macrophages: On dispose des lymphocytes de sang périphérique obtenus de la même manière que dans l'exemple 2-( 1) dans une botte de Pétri et on enlève par lavage les cellules qui n'adhèrent pas à la botte On détache les cellules restan- tes qui adhèrent à la botte en les prélevant avec unepipette avec HBSS (solution salée équilibrée de Hank) /EDTA à 0,2 % (produit de Sigma, Etats-Unis), et on les utilise comme

macrophages humains.

On obtient un surnageant de culture stimulé par des macrophages de la même manière qu'en ( 3) ci-dessus sauf qu'on ajoute les macrophages humains au milieu à une concentration

de 0,5 x 105 cellules/ml.

Exemple 5

Analyse de l'activité de lymphokine du surnageant de culture provenant de lignées cellulaires hybrides T humaines: On teste l'activité de lymphokine des surnageants de

culture préparés dans l'exemple 4 par les procédés suivants.

( 1) Test 1 de l'activité TCGF du surnageant de culture provenant du clone n 24-A: On obtient des thymocytes à partir de souris BALB/C âgées de 5 à 6 semaines (Shizuoka Agricultural Cooperative Association for Laboratory Animals, Japon), on déooupe en

petits fragments, on lave 2 fois avec MEM et on met en sus-

pension dans un milieu RPMI-1640 contenant du SFV à 10 % pour obtenir une suspension cellulaire ayant une concentration de 1 x 106 cellules/ml On ajoute le surnageant provenant du

clone n 24-A obtenu dans l'exemple 4-( 1) ou ( 2) à une frac-

tion de 0,1 ml de la suspension ( 1 x 105 cellules), et on dispose le mélange dans une microplaque à fond plat de 0,2 ml (Falcon) On ajoute de la 3 H-thymidine ( 3 H-Td R) à 0,5 Ci/réservoir au mélange pendant les 6 dernières heures, et on fait incuber les thymocutes en présence de 2 mg/ml de Con A aux fins de stimulation Le 3 jour, on vérifie l'absorption de 3 H-Td R par la culture On teste de manière analogue le surnageant de culture provenant de CEM-AGR c'est-à-dire la lignée cellulaire parentale Les résultats sont donnés à la figure 5, o l'on met en ordonnée le décompte de l'absorption de 3 H-Td R (C P M x 103) En A est indiqué le résultat obtenu sans utiliser aucun surnageant de culture, en B le résultat pour le surnageant de l'exemple 4-( 1) et le résultat pour un surnageant provenant de CEM-AGR obtenu de manière analogue (la barre blanche représentant le premier, la barre hachurée le second, comme cidessous), en C le résultat pour un surnageant obtenu de manière analogue à partir de CEM-AGB, et en D le résultat obtenu avec l'emploi de 1 pg/ml de Con A seulement à la place du surnageant de culture Les résultats (A) à (D) sont tous indiqués en termes de valeur moyenne + écart-type obtenues en répétant le même test 3 fois La figure 5 montre que les surnageants de culture provenant du clone N O 24-A (B et C non hachurés) induisent une prolifération significative des thymocytes de

stimulée avec Con A, et que cette activité est particulière-

ment élevée dans le cas de C obtenue avec un surnageant préparé en stimulant le clone N O 24-A avec Con A O voit que dans le cas de CEM-ARR, ni le surnageant préparé sans stimulation, ni le surnageant préparé par stimulation avec Con A ne produit de facteur de croissance cellulaire T. ( 2) Test 2 de l'activité TCGF du surnageant de culture

provenant du clone N O 24-A.

On concentre une fraction de 50 ml du surnageant obte-

nu dans l'exemple 4-( 1) puis on la fait passer à travers une colonne de Sephadex G-100 (Pharmacia, Suède) pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire d'environ 13 000 à environ 20 000, que l'on concentre à 5 ml sur des membranes Amicon YM-5 (Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts) pour préparer un surnageant semi-purifié De même on prépare un surnageant semi-purifié à partir de la lignée cellulaire R

parentale CEM-AGR.

On prépare une lignée cellulaire T cytotoxique humaine TCGF-dépendante par une réaction MLC (culture

lymphocytaire mixte) entre des cellules T sanguines péri-

phériques humaines normales et des CESS traitées à la mito-

mycine (cellules B-humaines transformées avec le virus EB et fournies par le Dr Peter Ralph du Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, Etats-Unis) et en faisant incuber la culture obtenue pendant 16 semaines dans du TCGF

(TCGF brut obtenu en cultivant 1 x 106 lymphocytes amyg-

daliens humains en présence de 0,1 % de PHA pendant 2 jours

et en séparant le surnageant aux fins d'utilisation).

On cultive la lignée cellulaire cytotoxique ( 3 x 103) en présence du surnageant semi-purifié pendant 24 h (dans un incubateur à CO 2 en utilisant un milieu RPMI 1640 + SFV à % à 370 C), et on la soumet à des impulsions à raison de 0,5 P Ci de 3 H-Td R pendant 5 à 8 heures On dilue en formant

une série le surnageant semi-purifié pour compter l'absorp-

tion de 3 H-Td R afin de déterminer l'activité TCGF Les résultats sont données dans la figure 6, o la dilution

du surnageant est reportée en abcisse, 1 étant la concentra-

tion initiale du surnageant à diluer et O étant un témoin dans lequel aucun surnageant n'est utilisé La valeur hachurée représente le surnageant semi-purifié préparé tout d'abord,

et la valeur non hachurée le surnageant semi-purifié pro-

venant de CEM-AG Le décompte d'absorption de H-Td R (C.P M x 10-3) est reporté en ordonnée Tous les résultats donnés sont des valeurs moyennes + écart-type obtenues

par des cultures en 3 exemplaires.

La figure 6 montre que la fraction semi-purifiée préparée à partir du surnageant de culture provenant du clone n 24-A de l'invention et ayant un poids moléculaire de 13 000 à 20 000 maintient une prolifération de la lignée cellulaire T cytotoxique humaine TCGF dépendante, et que

l'activité dépend de la concentration du facteur soluble.

On voit également que la fraction obtenue à partir de la lignée cellulaire parentale CME-AG R et approximativement

égale à la fraction ci-dessus en poids moléculaire ne pré-

sente aucune activité de croissance à une quelconque con-

centration.

( 3) Test de l'activité TCGF du surnageant de culture pro-

venant du clone no 38-B On teste l'activité TCGF des surnageants de culture obtenus dans l'exemple 4-( 3) et ( 4) de la même manière qu'en ( 2) ci-dessus en utilisant un système de dosage employant la

lignée cellulaire T cytotoxique TCGF-dépendante Les résul-

tats sont énumérés ci-dessous au tableau 3, o les groupes A à H ont les significations suivantes:

A: Groupe témoin sans supplément.

B: Groupe additionné du surnageant obtenu dans

l'exemple 4-l 4).

C: Groupe additionné du surnageant de culture de la cellule parente CEMAGR obtenu de la même manière

que dans l'exemple 4-( 4).

D: Groupe additionné du surnageant obtenu dans l'ex-

emple 4-( 3).

E: Groupe additionné du surnageant de culture pro-

venant de la cellule parente CEM-AGR obtenu de la

même manière que dans l'exemple 4-( 3).

F: Groupe additionné des macrophages humains ayant une densité de 0,5 x 105 cellules/ml et de PHA

( 0,1 %).

G: Groupe additionné de PHA ( 0,1 %).

H: Groupe additionné d'un TCGF brut ( 0,5 unité) obte-

nu en cultivant des lymphocytes amygdaliens humains ( 1 x 10 cellules/ml) en présence de PHA à 0,1 % pendant 2 jours (L'activité TCGF à partir de 1 x 106 cellules stimulées par PHA est définie

comme 1 unité de TCGF).

Tableau 3

Groupe Absorption de 3 H-Td R (cpm)

A 1936 + 838

B 5131 + 1684

C 2291 + 865

D 2170 + 628

E 1844 + 698

F 1995 + 1098

G 711 + 74

H 4214 + 333

Le tableau 3 montre l'activité TCGF du surnageant de culture obtenu à partir du clone n 38-B selon l'invention

stimulé par des macrophages humains Le surnageant prove-

nant de la lignée cellulaire parentale CEM-AGR ne présente

pas d'activité TCGF.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1 Lignée cellulaire leucémique T humaine déficiente en hypoxanthineguanine-phosphoribosyl-transférase (HGPRT)

et lignée cellulaire qui en dérive.

2 Lignée cellulaire telle que définie dans la revendication

1 qui est une lignée cellulaire leucémique T humaine défi-

ciente en HGPRT.

3 Lignée cellulaire telle que définie dans la revendication 2 qui a les caractéristiques d'identification de l'ATCC

n CRL-8081.

4 Lignée cellulaire telle que définie dans la revendication 1 o la lignée cellulaire dérivée est une lignée cellulaire hybride de cellules leucémiques T humaines déficiente en

HGPRT avec des cellules T humaines normales.

5 Lignée cellulaire telle que définie dans la revendication 4 o la lignée cellulaire hybride est capable de produire

une lymphokine.

6 Lignée cellulaire telle que définie dans la revendica-

tion 4 o la lignée cellulaire hybride est capable de

produire un facteur favorisant.

7 Lignée cellulaire telle que définie dans la revendication 4 o la lignée cellulaire hybride est capable de produire un facteur de croissance de cellule T. 8 Lignée cellulaire telle que définie dans la revendication 4 o la lignée cellulaire hybride a les caractéristiques

d'identification de l'ATCC N O HB 8082.

9 Procédé de production d'une lignée cellulaire leucémique T humaine déficiente en HGPRT caractérisée en ce-qu'on cultive des cellules leucémiques T humaines dans un milieu

contenant de la 8-azaguanine.

10 Procédé de production d'une lignée cellulaire hybride T humaine caractérisé en ce qu'on fusionne les cellules T leucémiques humaines déficientes en HGPRT avec des cellules

T humaines normales en utilisant unpromoteur de fusion.

11 Procédé tel que défini dans la revendication 10 o l'on fait proliférer de façon sélective dans un milieu sélectif les cellules hybrides résultant de la fusion des cellules leucémiques T humaines déficientes en HGPRT avec des cellules

T humaines normales.

12 Procédé tel que défini dans la revendication 11 o le

milieu sélectif contient de l'hypoxanthine, de l'aminopté-

rine et de la thymidine.

13 Procédé tel que défini dans la revendication 11 o l'on clone les cellules hybrides pour obtenir une lignée

cellulaire hybride apte à produire une lymphokine.

14 Procédé de production d'une lymphokine caractérisé en ce qu'on cultive la lignée cellulaire hybride telle que définie dans la revendication 5 pour obtenir la lymphokine.