DE3249567C2

DE3249567C2 - Hybridzell-Linie, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE3249567C2
Application number: DE3249567A
Authority: DE
Inventors: Tadamitsu Tondabayashi Osaka Kishimoto; Yuichi Takarazuka Hyogo Yamamura
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-06-12
Filing date: 1982-06-11
Publication date: 1986-10-02
Also published as: GB2102832A; IT8205179A0; AT387235B; NZ200849A; IT1164454B; AT377415B; FI822103A0; FI76118B; NO162669B; ES513027A0; NL8202379A; US4544632A; ATA230482A; DE3222072C2; AU555913B2; NO162669C; ES8305039A1; NO821949L; SE8203623L; AU8447482A

Description

Die Erfindung betrifft eine bestimmte Hybridzell-Linie (vgl. Anspruch 1), deren Herstellung (vgl. Anspruch 3) und Verwendung (vgl. Anspruch 6). Die Ansprüche 2,4 und 5 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Lymphozyten, die im humanen Immunsystem auftreten, werden im allgemeinen in T-Zellen, nämlich sich von Thymus ableitenden Zellen, und in B-Zellen, nämlich sich vom Knochenmark ableitenden Zellen, klassifiziert Es ist bekannt, daß die B-Zellen Antikörper absondern. Es wurde eine Technik entwickelt, um monoclonale Antikörper aus B-Zellenhybridomen herzustellen, wobei diese durch Zell-Hybridisierung von Antikörpern erzeugenden B-Zellen und Myeloma-Zellen, die als parentale Zellen dienen, hergestellt wurden (vgl. »Rinsho Kagaku (Clinical Science)«, Bd. 16, Nr. 9,1108-1114 (1980)).

T-Zellen spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Immunantwort. Obgleich viele ihrer Eigenschaften noch untersucht werden müssen, ist es bekannt, daß T-Zellen viele lösliche immunoregulatorische Faktoren (Lymphokine) abscheiden, wie einen Faktor, der die Antikörperbildung unterdrückt, lösliche Faktoren, die das Wachstum anderer T-Zellen (Interleukine) induzieren, etc. Jedoch werden diese Faktoren selbst in vivo in sehr geringen Mengen abgeschieden, und weiterhin ist es extrem schwierig, sie in großen Mengen in vitro herzustellen, zu isolieren oder zu sammeln. Man hat daher Versuche unternommen, T-Hybridzcllen durch Zellfusion herzustellen, damit man solche Faktoren in vitro herstellen kann. Die verschiedenen erfolgreichen Fälle einer T-Zellfusion, über die bis jetzt berichtet wurde, sind jedoch nur auf Mäuse-T-Zellen beschränkt Hinsichtlich der erfolgreichen Hybridisierung von humanen T-Zellen wurde bis jetzt noch nichts berichtet Humane T-parentale Zellen, die mit humanen T-Zellen fusioniert werden können, wurden bis jetzt noch nicht entwickelt. Genauer gesagt, wird die parentale Zelle, selbst wenn eine solche parentale Zelle für die Hybridisicrung mit der normalen huimnen T-ZeIIe erhalten wird, in ihren ursprünglichen Zustand vor und/oder während des Hybridierungsverfahrens zurückkehren, wodurch die Selektion von Hybridomen Fast unmöglich wird. Selbst wenn Hybridome ausgewählt und isoliert werden, ist es höchst unvorhersehbar, daß die Hybridome funktionell stabil sind oder während langer Zeit wachsen werden, während sie die Gene, die aus der normalen T-ZeIIe in sie übertragen wurden, zurückhalten.

Da es schwierig ist, große Mengen an homogenen löslichen immunoregulatorischen Faktoren herzustellen, treten bei der Analyse ihrer chemischen und biologischen Eigenschaften extreme Schwierigkeiten auf. So wurden bis jetzt noch keine Forschungen unternommen, die sich mit der klinischen Anwendung dieser Faktoren und ihrer klinischen Wirkungen befassen. Da humane T-Hybridzell-Linien bis jetzt noch nicht etabliert wurden, erfolgte bisher nur ein geringer oder kein Fortschritt bei der Analyse der Oberflächenantigene auf humanen T-Zellen und T-Zellen-Rezeptoren für Antigene und in der Erforschung von humanen T-Zellen-Untcrgruppen und bei cellularen und immunologischen Untersuchungen hinsichtlich der Differenzierung, dem Wachstum und so der Aktivierung humaner T-Zellen per se.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Hybridzell-Linien mit vorteilhaften Eigenschaften zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst.

Die Anmelderin hat ausgedehnt Untersuchungen durchgeführt, um eine humane T-Zellen-Fusionstechnik zu etablieren. Es wurde gefunden, daß eine spezifische Zeil-Linie, die mit humanen T-Zellen fusionieren kann, Sensitivität gegenüber dem Kulturmedium für die Seleklrion fusionierler Zellen besitzt und in der Kultur permanent verbleibt und als parentale Zeil-Linie für die Herstellung humaner T-Hybridzellen geeignet ist. Es

■t wurde weiterhin gefunden, daß die Linie, wenn sie als Ursprungslinie verwendet wird, mit humanen T-Zellen

' unter Bildung humaner Hybridzellen fusioniert und daß die Hybridzellen leicht unter Verwendung eines selektiven Mediums selektiert werden können. Die Clone, die aus den humanen T-Hybridzellen, die auf solche Weise hergestellt wurden, erhalten werden, schließen solche ein, die die Fähigkeit besitzen, lösliche immunoregulatorische Faktoren (Lymphokine) zu bilden, die von humanen T-Zellen abgesondert werden und von denen bekannt |] ist, daß sie eine wesentliche Rolle bei der Regulation der Immunantworten besitzen. Die vorliegende Erfindung

beruht auf diesen neuen Erkenntnissen.

In den F i g. 1 bis 4 sind graphische Darstellungen aufgeführt, die die Mitogenansprechbarkeit der parentalcn Zeil-Linie CEM-AG® und der T-Hybridzell-Linie (Clon Nr. 24-A) gemäß der Erfindung erläutern.

Die Fig.5 und 6 sind graphische Darstellungen, die die TCGF-Aktivitalen der T-Hybrid/ell-Linic (Clon Nr. 24-A) gemäß der Erfindung erläutern.
Die parentale Zeil-Linie und die erfindungsgemäßen Hybridzell-Linien können kontinuierlich kultiviert bzw.

gezüchtet werden. Mit der Etablierung dieser Zell-Linien, insbesondere der Hybridzell-Linien, wird es möglich, in vitro große Menge löslicher immunoregulalorischer Faktoren zu erzeugen, die aus humanen T-Zellen abgesondert werden, d. h. lösliche Faktoren, die die interzellulare Reaktion bei der Immunantwort vermitteln, und es wird möglich, die chemischen und biologischen Eigenschaften dieser löslichen Faktoren, die bis jetzt nicht vollständig geklärt wurden, zu analysieren, wodurch die Forschung hinsichtlich der klinischen Anwendung und der Wirkung dieser Faktoren wesentlich beeinflußt wird. Weiterhin ergibt die Etablierung humaner T-Hybridzell-Linien ein sehr nützliches Mittel für die Analyse von Oberflächenantigenen auf humanen T-Zellen und auf T-Zellenrezeptoren für Antigene, um humane T-Zel!en-Untergruppen zu untersuchen und für die zellularen und immunologischen Untersuchungen bei der Differenzierung, dem Wachstum und der Aktivierung humaner T-Zellen psr se.

Die neue parentale Zeil-Linie leitet sich von einer humanen T-leukämischen Zeil-Linie ab und ist dadurch gekennzeichnet, daß sie an HGPRT (Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase) defizient ist Die zytologischen und anderen Eigenschaften der parentalen Zeil-Linie sind wie folgt (Anstelle des in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Ausdrucks »parentale Zeil-Linie« kann man selbstverständlich auch »Ursprungszeil-Linie« schreiben.)

(1) Morphologische Eigenschaften

Die parentalen Zellen besitzen etwa Jen 2- bis 3fachen Durchmesser normaler humaner peripherer Blut-T-Zellen und sind fast kugelförmig. Der Nukleus nimmt einen großen Teil der Zelle ein, und eine geringe Menge an Protoplasma wird beobachtet Das Protoplasma enthält einige Körnchen (granula). Ein pseudopodiumähnliches Verfahren kann gelegentlich festgestellt werden.

(2) Anzahl der Chromosomen

Die parentalen Zellen werden in Anwesenheit von Colchizin in einer Konzentration von 0,1 μg/ml bei 37°C während 3 Stunden inkubiert, zentrifugiert, mit 0,075 M KCl behandelt und auf einen Objektträger mit einem Gemisch aus Methanol und Ethanol (3 :1) fixiert Die Zahl der nuklearen Chromosomen wird danach mikroskopisch unter Verwendung einer lOOOX-Olimmersionslinse gezählt Die Zellzahl für 100 Zellen in den Metaphasen liegt im Bereich von 69 bis 87 mit einem Durchschnitt von 78 und ist in der folgenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Anzahl der Chromosomen

69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87

Anzahl der 1 344444 11 12 10 9495 10 2 1 2 1

Zellen

(3) Expression des T-zellen-spezifischen Antigens

Die parentalen Zellen, 5 χ 10⁵ an der Zahl, werden mit ΙΟΟμΙ eines monoclonalen Antikörpers in einer geeigneten Konzentration (0,1 g/0,5 ml anti-Leu-1-, anti-Leu-2A- und anti-Leu-3A-Antikörper, jeweils lOOfach, lOfach bzw. lOfach verdünnt auf 100 μΐ) bei 4°C während 30 Minuten inkubiert. Die monoclonalen Antikörper werden gemäß J. Exp. Med., 153,310—323(1981) erhalten. Die Zellen werden danach mit einem M EM-Medium (abgeleitet von dem engl. Ausdruck »minimum essential Eagle media«), das 5% FCS (fötales Kalbsserum, vgl. J. Immunol. Bd. 119, No. 4, 1977 Seite 1236 linke Spalte) enthält, gewaschen, mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-konjugiertem Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin umgesetzt und dann auf die Expression von T-zellenspczifischem Antigen durch indirekte Immunofluoreszenz geprüft. Wenn 200 dieser Zellen geprüft werden, sind mindestens 95% positiv für anti-Leu-1- und anti-Leu-3A-Antikörpsr, und bis zu 1 % sind positiv für anti-Leu-2A-Anlikörper.

(4) RoscHenbildung

Zweihundert parentale Zellen werden mikroskopisch bei der 400fachen Vergrößerung für die Rosettenbildung mit EAC (roten Blutzellen (E) von Schafen, die mit Antierythrozytantikörper (a) und humanem Kompliment (C) behandelt worden sii/d) untersucht, mit dem Ergebnis, daß bis zu 1 % positiv sind.

(5) Expression von B-Zellen-Marker (Zellenkennzeichen)

Das Oberflächenimmunoglobulin (Ig) wird unter Verwendung von FITC-konjugiertem Maus-Antihumanimmunoglobulin durch direkte Immunofluoreszenz analysiert. Bis zu 1 % der Zellen sind positiv.

Humanes HLA-DR-Antigen (welches im folgenden als »DR« bezeichnet wird) wird unter Verwendung von

monoclonalem anti-DR-Antikörper durch indirekte Immunofluoreszenz geprüft. Bis zu 1% der analysierten

Zellen sind positiv.

Die Expression des humanen B-zellenspezifischen Antigens (B-Antigen) wird durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung von monoclonalem antihumanem B-Zellen-Antikörper, der aus einer Hybrid-

zell-Linie erhalten wurde, die aus Myeloma P3Ui (erhalten vom Albert Einstein College of Medicine) und Mäusemilzzellen hergestellt wurde und mit einer humanen B-Zell-Linie (CESS, erhalten von Dr. Peter Ralph vom Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, USA) immunisiert wurde und mit einem Virus (EPstein-Barr-Virus) transformiert wurde (vgl. G. Kohler und C. Milstein, Nature, 256, 495, 1975), analysiert. Bis zu 1% der Zellen sind positiv. Der Antikörper reagiert mit den B-Zellen oder den Linien davon, reagiert jedoch nicht mit den T-Zellen oder den Linien davon.

(6) HLA-Phenotyp

Die parentalen Zellen werden mit anti-HLA-Serum (erhalten von Prof. Sasazuki der Tokyo Medical and Dental University, Japan) bei 37°C während 30 Minuten inkubiert. Danach wird während 60 Minuten mil Kaninchenkomplement, adsorbiert an der parentalen Zelle, inkubiert, und dann wird die Überlcbensrate kontrolliert. Der HLA-Phenotyp ist A2, A11, B8, B37 und Bw 22.

(7) Wachstum

Die parentalen Zellen wachsen zufriedenstellend in RPMI-1640-KuIlurmedium (vgl. J. Immunol. Bd. 119, No. 4,1977 Seite 1236, linke Spalte), welches 8-Azaguanin (8-AG, 100 μΜ), 10% FCS, 5XiO-⁵M 2-Mercaptoethanol und 1 mM Glutamin enthält.

(8) Wachstumsbedingungen

Die parentalen Zellen wachsen im allgemeinen zufriedenstellend bei einer Temperatur von 36 bis 38° C und einem pH-Wert von 7,2 bis 7,3. Es ist sinnvoll, einen Inkubator, welcher 5% Kohlendioxid und 95% Luft enthält, zu verwenden.

(9) Kontinuierliche Kultur

Die parentalen Zellen können kontinuierlich und unbeschränkt inkubiert werden.

(10) Konservierung in gefrorener Form

Die parentalen Zellen können in flüssigem Stickstoff über sehr 'ange Zeit konserviert und gelagert werden.
(11) Resistenz gegenüber 8-Azaguanin

Die parentalen Zellen sind gegenüber 8-Azaguanin (100 μΜ) resistent und sterben in einem Medium (HAT-Medium), welches Hypoxanthin, Aminoterin und Thymidin enthält. Dies zeigt, daß die parentalen Zellen defizient an HGPRT sind.

(12) Mitogenansprechbereitschaft

Wenn 10 bis 100 μg/ml Concanavalin A (Con A) und 1 bis 10% Pflanzenlectin, Phytohemagglutinin (PHA) zu dem Medium zugegeben werden, wird das Wachstum der parentalen Zeli-Linie in gewissem Ausmaß inhibiert. Pokeweedmitogen (PWM), wie auch Protein A (Pro A) bewirken keinen Einfluß auf das Wachstum der Linie bei beliebigen Konzentrationen.

In den Fig. 1 bis 4 sind diese Eigenschaften dargestellt 2χ 10⁴ Zellen der parentalen Zell-Linie werden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Mitogenen (Fig. 1 für Con A, Fig.2 für PHA, Fig.3 für PWM und Fig.4 für Pro A) während 60 Stunden in einem RPMI-1640-Med'ium, welches 10% FCS enthält, gezüchtet. 0,2 μθ ³H-Thymidin (³H-TdR) wird zu dem Medium während der letzten 12 Stunden der Züchtung zugegeben. Die Kulturen werden auf Glasfaserstreifen (Labo-Science Cell Harvester) geerntet, und die ³H-TdR-Aufnahme in Deoxyribonucleinsäurefraktion wird durch Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt Bei jedem Versuch werden die Kulturen dreifach angesetzt, und die mittleren Werte (bis zu 10% in S. D.) werden angegeben. In jeder graphischen Darstellung ist die Konzentration des Mitogens als Abszisse aufgetragen und die

³H-TdR-Zählung (C. P. M. χ 10~⁵) als Ordinate. Die eine Linie (· ·) stellt das Ergebnis dar, das man mit der

erfindungsgemäßen parentalen Zell-Linie erhält, und die andere Linie (· ·) stellt das Ergebnis mit Clon 24A

(ein Clon der erfindungsgemäßen humanen T-Hybridzell-Linie) dar, wobei eine Erläuterung folgt
Die HGPRT-defiziente humane T-leukämische Zell-Linie, die die zuvor erwähnten Eigenschaften aufweist leitet sich beispielsweise von humanen T-Ieukämischen Zellen (CCRF-CEM) ab (J. Kaplan, T. C. Shope und W. D. Peterson, jun^ J. Exp. M ed. 139, 1070—1076, 1974) und kann erhalten werden, indem man solche Zellen in RPMI-1640-Medium, welches 10% FCS und 8-Azaguanin (8-AG) enthält züchtet, und dann diese Zellen auf solche Medien transferiert die erhöhte Konzentrationen an 8-AG aufweisen. Genauer gesagt werden die Zellen in Medien dieser Art gezüchtet welche beispielsweise 2 μΜ 8-AG für eine Woche zuerst enthalten, dann wird das gleiche Medium, welches 16 μΜ 8-AG enthält während einer Woche verwendet, und anschließend werden ähnliche Medien verwendet wobei die Konzentration an 8-AG 2fach aufeinanderfolgend erhöhl wird. Schließlich wird eine 8-AG-resistente Zell-Linie lebend in einem Medium erhalten, welches 100 μΜ -AG enthält Die entstehende Zell-Linie wächst stark in einem Medium mit 100 M 8-AG und kann kontinuierlich in dem gleichen

Medium gezüchtet werden.

Die so erhaltene Linie, die die zuvor erwähnten Eigenschaften aufweist, ist eine neue T-Zell-Linie, die zuvor »

nicht beschrieben wurde und die permanent gezüchtet werden kann und nach dem Gefrieren fast unbegrenzt |

gelagert und konserviert werden kann. j

Die HGPRT-defiziente erfindungsgemäße Zeil-Linie kann in verschiedenen Nährmedien, die im wesentlichen synthetisch sind, die aber natürliche Bestandteile, wie Serum, enthalten können, gezüchtet werden. Beispiele nützlicher Nährmedien sind PRMI-1640-Medium, modifiziert mil FCS, Pferdeserum oder ein serumähnliches Supplement (Ergänzung) und Dulbecco-Mcdium, welches mit lscove-modifiziertem Medium, das frei von Serum ist, modifiziert wurde. Die erfindungsgemäßen Zellen können auf solchen Medien gezüchtet werden, und sie können leicht so angepaßt werden, daß sie auf verschiedenen Medien, die im allgemeinen auf diesem Gebiet verwendet werden, wie FCS enthaltendem Minimum-im-wesentlichen-Eagle-Medium (MEM), gezüchtet werden können. Zur Erhaltung der parentalen Zellen müssen solche Medien nicht immer 8-AG enthalten, sie enthalten jedoch bevorzugt 8-AG. Die Zelle kann in diesen Medien und bei solchen Bedingungen gezüchtet werden, die im allgemeinen für die Züchtung normaler Zellen verwendet werden. Im allgemeinen können die parentülen Zellen zufriedenstellend bei 36 bis 38°C gezüchtet werden, wobei die flüssige Komponente alle 3 bis 5 Tage ersetzt wird.

Obgleich die zuvor erwähnte parentale Zeil-Linie vom Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, japan nicht akzeptiert wurde, wurde sie von den Anmeldern die ganze Zeit über in .solchem Zustand konserviert und gehallen, daß sie für die Öffentlichkeit zugänglich ist. Weiterhin wurde eine Probe der Zeil-Linie bei der American Type Culture Collection (ATCC), Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA am 30. Juli 1981 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer ATCC CRL 8081 erhalten.

Die HGPRT-defiziente T-Zell-Linie kann als parentale Zeil-Linie für die Fusion mit humanen T-Zellen verwendet werden. Die Erfindung betrifft u. a. ein Verfahren zur Fusion von T-Zellen mit der parentalen Zeil-Linie und die dabei erhaltenen T-Hybridzell-Linie.

Die humanen T-Zcllen, die für die T-Zellen-Fusion verwendet werden können, sind nicht besonders beschränkt. Beispiele nützlicher T-Zellcn sind solche, die man aus dem peripheren Blut, Knochenmark, Lymphonoden, der Milz, den Tonsillen, dem Thymus etc. erhält. Solche T-Zellen können nach verschiedenen Trennverfahren isoliert und gereinigt werden, die an sich bekannt sind, wie an sich bekannte physikalische Verfahren, chemische Verfahren und Haftungsverfahren an Oberflächenmembranen, und sie können für die erfindungsgemäßc Zellfusion verwendet werden. Damit man eine verbesserte Fusionsausbeute erhält, können diese T-Zellen mit verschiedenen Mitogcnen vor der Fusion stimuliert werden. Beispiele nützlicher Mitogene sind solche, die gegenüber T-Zellen Empfindlichkeit aufweisen, wie Concanavalin A (Con A, gereinigtes Tuberculin (PPD), Protein A (Pro A), Phytohämagglutinin (PHA), Pokeweed-Mitogen (PWM) etc. Die zu verwendenden T-Zellen können ebenfalls durch gemischte Lymphozytkultur aktiviert werden. Beispiele werden später aufgeführt, und die Herstellung humaner T-Zellen und milogenstimulierter T-Zellen wird näher erläutert.

Die Fusionsreaktion zwischen den HG PRT-defizienten humanen T-leukämischen Zellen und humanen T-Zellen wird im wesentlichen auf die gleiche Weise durchgeführt wie das Verfahren, das für die Zellfusion in Anwesenheit von Fusionspromotern in einem geeigneten Medium bekannt ist. Viren, wie der Sendai-Virus (HVJ), sind als Fusionspromotoren geeignet: es ist jedoch bevorzugt, das kürzlich entwickelte Polyethylenglykol ,

(I¹ECi) als Promotor zu verwenden. Es ist bevorzugt, PEC mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 40 |

etwa 1000 bis etwa 6000 zu verwenden. Es ist sinnvoll, daß das Medium solches PEG in einer Konzentration von etwa 30 bis etwa 60 G/V-% enthält. Nützliche Kulturmedien sind MEM-Medium, wie es ist, oder modifiert mit Dulbeeco-Medium, RPMl-1640-Medium und andere Medien, die normalerweise zum Züchten von Zellen verwendet werden. Gegebenenfalls kann das Medium Dimelhylsulfoxid oder einen ähnlichen Hilfsstoff eingearbeitet enthalten, um die Fusionsausbeute bzw. -effizienz zu verbessern.

Die Anteile an parentalen Zellen und humanen T-Zellen, die für die Fusion verwendet werden, sind nicht besonders, beschränkt. Im allgemeinen kann die Zahl der humanen T-Zellen etwa das 1- bis etwa lOfache der Zahl der parentalen Zellen betragen. Bevorzugt werden die Zellen beispielsweise auf folgende Weise fusioniert. Spezifizierte Mengen an parentalen Zellen und humanen T-Zellen werden gut miteinander in dem Medium vermischt, das Gemisch wird zentrifugiert, und das entstehende überstehende Material wirJ - rworfen. Eine geeignete Menge an PEG-Lösung, die auf 37°C erwärmt ist, wird dann mit der verbleibenden Masse vermischt, wodurch die Zellfusionsreaklion initiiert wird. Unter Zugabe eines geeigneten Mediums wird das Gemisch zentrifugiert, und das überstehende Material wird verworfen. Dieses Verfahren wird wiederholt und die gewünschten fusionierten Zellen werden gebildet.

Die gewünschten fusionierten Zellen können selektiv erhalten werden, indem man das entstehende Gemisch mildern üblichen selektiven Medium, welches das Wachstum nur der gewünschten Hybridzellen erlaubt, jedoch das Wachstum der parenlalen Zellen inhibiert, züchtet. (Inhärent sind die humanen T-Zellen nicht in der Lage, in dem selektiven Medium zu wachsen.) Ein typisches Beispiel für ein solches Medium ist beispielsweise ein Medium, welches I lypoxanthin, Amincpterin und Thymidin enthält (HAT-Medium). Genauer gesagt, wird ein geeignetes Beispiel von HAT-Medium hergestellt, indem man 4 χ 10-⁷ M Aminopterin, 1 χ 10-⁴M Hypoxanthin, 1,6 χ 10 -^Γ· M Thymidin und gegebenenfalls 3 χ 10-" M Glycin zu einem MEM- oder RPMi-1640-Medium, welches 10 bis 20% FCS enthält, zugibt. Die Zellen werden in dem HAT-Medium gemäß dem üblichen Begrenzungsverdünnungsverfahren während einer Zeit, im allgemeinen mehreren Tagen bis mehreren Wochen, gezüchtet, wobei die Zeil ausreicht, um den Tod von Zellen (beispielsweise nichtfusionierten Zellen etc.) — ausgenommen den gewünschten Hybridzellen — zu ermöglichen, und wobei nur die gewünschten humanen T-fusionierten Zellen selektiv wachsen.

Die so erhaltenen fusionierten Zellen besitzen neue Eigenschaften, die sich von denen der parentalen Zeil-Linie und der humanen T-Zellen unterscheiden, und zwar hinsichtlich ihres Karyotyps (Zahll der nuklearen

Chromosomen), des Phenotyps der Zelloberfläche, der Mitogenantwortbercitschaft, der Lymphokinproduktionsfähigkeit etc. Obwohl die fusionierten Zellen weiter kontinuierlich in einem geeigneten Medium, wie dem bereits erwähnten, gezüchtet werden können, ist es bevorzugt, daß die selektiv hergestellten Zellen in einem HT-Medium, welches Hypoxanthin und Thymidin enthält, während 1 bis 2 Wochen gezüchtet werden und danach in ein übliches Medium übertragen werden. Zur Erläuterung sind die charakteristischen Eigenschaften fusionierter Zellen, die man in den folgenden Beispielen erhält, in der folgenden Tabelle Il im Vergleich zu denen der parentalen Zeil-Linie (d.h. HGPRT-defiziente humane T-!eukämische Zellen, die im folgenden als »CEM-AG®« bezeichnet werden) angegeben.

ίο Tabelle II

Hybridzelle Nr.

Humane T-ZeIIe

Frequenz

Clone

Nr.

Chromosonizahl (l)urchschn.)

15

20

25

2 3 4 5 6 7

Nichtstimuliertes PBL-T Con A-stimuliertesTonsil-T Con Α-stimuliertes PBL-T PPD-stimuliertes PE-T Nichtstimuliertes PBL-T Pro Α-stimuliertes PBL Pro Α-stimuliertes PBL-T Pro Α-stimuliertes PBL-T Pro Α-stimuliertes PBL-T

1/12

1/24

1/8

1/24

4/12

5/24

3/24

24-A 36-B 38-B 41-111 43-A 47-A 40-Vl 44-C 4-B

Parentale Zelle CEM-AG®

79-97 (89)

79-100(89)

79-96(88)'

75-93(86)

88-99(93)

81-98(89)

82-91 (87)

89-100(94)

87-100(93)

69-87 (78)

Tabelle II (Fortsetzung)

30

Hybridzelle Nr.

Expression des T-zellenspezif. Antigens Leu 1 Leu 2A Leu 3A

Rosettcnbildung
E EAC

Expression des B-Markcrs

ig

DR

B-Antigcn

3 35 4

8 40 9 Parentale Zelle

ND ND ND

ND	ND	ND	ND
ND	ND	ND	ND
ND	ND	ND	ND

45

50

55

60

65

Die in Tabelle II aufgeführte Frequenz wird durch A/B ausgedrückt, worin A die Anzahl der Vertiefungen (wells) bedeutet, die etablierte Hybridzellen enthalten, und B die .Anzahl der Vertiefungen bedeutet, die mit 2 χ 10⁵ fusionierten Zellen unmitelbar nach der Fusion angeimpft sind.

Die Zahl der Chromosomen, die Expression des T-zellenspezifischen Antigens, die Roscltcnbildung und die Expression von B-Zellen-Markerwerden nach den gleichen Verfahren bestimmt, wie sie bereits für die parcntaic Zeil-Linie aufgeführt wurden. Die Symbole in der obigen Tabelle bedeuten das folgende.

+ + ... mindestens 95% der Zellen sind positiv

— ... bis zu 1 % der Zellen sind positiv

ND ... nicht ausgeführt (not done)

E ... rote Schafsblutzellen

Im folgenden sind unter Bezugnahme auf Tabelle II verschiedene Eigenschaften der humanen T-Hybridzell-Linie angegeben, welche die Punkte (1) bis (12), die für die parentalen Zellen aufgeführt wurden, und den Punkt (13) umfassen.

(1) Morphologische Eigenschaften

Die Eigenschaften der Linie sind, obgleich sie sich von Clon zu Clon etwas unterscheiden, im wesentlichen ähnlich wie die der parentalen Zeil-Linie. Die Linie ist etwas größer als die parentale Linie (1,2- bis l,5mal so groß). Viele der Zeilen besitzen zahlreiche whiskerartige Projektionen auf der Oberfläche.

(2) Karyotyp (Zahl der nuklearen Chromosomen)

Obwohl die Chromosomenzahl von Clon zu Clon variiert, liegt die mittlere Chromosomenzahl im Bereich von 86 bis 94 und ist offensichtlich größer als die der parentalen Zellen, die 78 beträgt.

In tier Mehrheit der Clone identisch mit den p;irenlalen Zellen.

(6) HLA-Phenotyp

Die Phenotypen der parenlalen Zellen werden in jedem Clon festgestellt. Mindestens ein HLA-Phenotyp der humanen T-Zellen, ausgenommen die der parentalen Zellen, wird in jedem Clon festgestellt.

(7) bis (10)

Ungefähr ähnlich wie die parentalen Zellen in jedem Clon.

(11) Resistenz gegenüber 8-Azaguanin

Kein Clon ist gegenüber 8-Azaguanin resistent.

(12) Mitogen-Ansprechbarkeit

Die Hybridzell-Linien sind hinsichtlich ihrer Ansprechbarkeit gegenüber Con A PHA mit der parentalen Zeil-Linie vergleichbar, oder sie sind höher. Obwohl die parentale Zeil-Linie keine Ansprechbarkeit bzw. Antwortbereitschaft gegenüber PWM zeigt, wurde festgestellt, daß eine Zahl von Clonen auf PWM antwortet.

(13) Produktivität von Lymphokinen

Bestimmte Hybridclone sind in der Lage, Lymphokine, insbesondere Helferfaktoren, zu produzieren. Beispielsweise besitzen die Clone Nr. 24-A, Nr. 38-B etc. die Fähigkeil, den T-Zellen-Wachstumsfaktor (TCGF) gemäß dem Verfahren, das in den folgenden Beispielen beschrieben wird, zu produzieren. Weiterhin sind die Clone funktionell stabil, d. h. fähig,TCGF durch kontinuierliche Kultur während langer Zeit zu bilden.

Die oben aufgeführten Eigenschaften zeigen, daß durch die vorliegende Erfindung neue humane T-Hybridzcll-Linien etabliert werden. Die Etablicrung von Hybridzell-Linien wird durch die Tatsache belegt, daß die Clone, die erhalten werden, nicht gegenüber 8-AG resistent sind — im Gegensatz zu der parentalen Zeil-Linie —, eine erhöhte Zahl an nuklearen Chromosomen aufweisen und andere H LA-Phenotypen besitzen als die der parentalen Zeil-Linie.

Die so erhaltene erfindungsgemäße humane T-Hybridzell-Linien können, wenn sie in einem üblichen Medium nach einem üblichen Verfahren gezüchtet werden, cloniert werden, wobei die Linien in individuelle monoclonale Hybridzell-Linien getrennt werden, wovon jede mindestens einen nuklearen Chromosomen der humanen T-ZeI-Ie enthält. Die Linie kann in einer kontinuierlichen Kultur gezüchtet werden, während die charakteristischen Eigenschaften, die auf den Genen beruhen, die von den humanen T-Zellen transferiert werden, erhalten bleiben. Sie ist im gefrorenen Zustand konservierbar, d. h. haltbar, wodurch es möglich wird, daß humane T-Zellen in Einzelheilen untersucht werden können. Die Clone umfassen solche, die verschiedene Lymphokine, insbesondere Helferfaktoren, wie TCGF, die von humanen T-Ze!!er. abgeschieden werden, bilden können und von denen bekannt ist, daß sie eine wichtige Rolle bei der Regulation der Immunantwort spielen, so daß es durch die Etablierung solcher Clone möglich wird, große Mengen an Lymphokinen in vitro leicht und schnell zu erzeugen und wodurch neue Mittel für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten im Immunsystem verfügbar sind.

Eine genaue Beschreibung folgt von einer der erfindungsgemäß etablierten und isolierten humanen T-Hybridzell-Linie, nämlich Clon Nr. 24-A. Wie aus den folgenden Beispielen offensichtlich wird, ist dieses Clon eines der Hybridomen, die man durch die Fusion der parentalen Zeil-Linie und humanen T-Zellen erhält, die man von periphcren Blutlymphozyten erhalten hatte, und es besitzt verschiedene Eigenschaften, die mit den oben erwähnten Hybridzell-Linien gleich sind. Insbesondere ist die nukleare Chromosomenzahl des Clons 79 bis 97 (durchschnittlich 89). Der Clon zeigt HLA-Phenolypen von A2, AW24, All, B5, B8, B37 und BW22 einschließlich derer der parentalen Zeil-Linie (A2, Al 1, B8, B37 und BW22) und ebenfalls die der humanen T-Zelle (A2, AW24, B5 und B40) ausgenommen B40. Die clonierte Zeil-Linie zeigt das Ansprechen bzw. die Antwort auf Mitogene (vgl. Fig. 1 bis 4). Ihr Wachstum wird fast vollständig bei 1% PHA inhibiert und wird ebenfalls bei einer PWM-Konzentration von 0,5 bis 1 % inhibiert.

Der Clon zeichnet sich weiter durch seine hohe TCGF-Aktivität aus, was aus den Beispielen und den Fig.5 und 6 folgt

Wird der erfindungsgemäße Clon, wie oben beschrieben, in einem geeigneten Medium, wie oben erwähnt, gezüchtet, so kann der entstehende humane T-Zellen-Wachstumsfaktor (TCGF) aus dem entstehenden überstehenden Material isoliert werden, was in den Beispielen auch näher erläutert wird.

Da die neue fusionierte Zeil-Linie, die die Fähigkeit besitzt, TCGF zu erzeugen, nicht vom Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan angenommen wurde, wurde eine Probe der Linie von den Anmeldern behalten und war der Öffentlichkeit frei verfügbar. Eine Probe wurde am 30. Juli 1981 bei ATCC; 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, USA hinterlegt, und ihr wurde die ATCC-Nr. HB8082 zugeordnet

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der parentalen Zeil-Linie, die Isolierung der humanen

T-Zellen, die Fusion solcher Zellen und die Prüfung der fusionierten erhaltenen Linien.

Beispiel
A. Herstellung von HGPRT-defizisnten humanen T-Ieukämischen Zellen

Humane T-leukämische Zeil-Linie CCRF-CEM, erhalten von Dr. Minowada, PRMI, Buffalo wird in RPMI-1640-Medium, welches 10% FCS enthält, gezüchtet.
Die CCRF-CEM-Zellen werden in RPMI-1640-Medium, welches 2μΜ 8-AG enthält und mit 10% FCS in

ίο einer Konzentration von 1 χ 10⁶ Zellen/ml modifiziert ist, suspendiert Ein 10-ml-Tei! der Suspension wird in eine Kulturflasche gegeben und für die Inkubation in einen Inkubator bei 37°C während einer Woche gestellt Die Flasche wird horizontal hingelegt, während ein Gemisch aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft durch den Inkubator geleitet wird. Die überlebenden Zellen werden gesammelt, in einer Konzentration von 1 χ 10^b ZcI-len/ml in der gleichen Art von Medium, welches 8-AG in der zweifachen obigen Konzentration, d. h. 4 μΜ.

enthält, suspendiert und auf ähnliche Weise während einer Woche gezüchtet. Die Zellen, die das vorerwähnte Kulturverfahren überleben, werden jede Woche unter Verwendung von frischem Medium gezüchtet, wobei die Konzentration von 8-AG ungefähr zweifach jede Woche (d. h. 2 — 4 — 8—> 16—«32 — 50—► 75 — 100 μηι) erhöht wird und wobei man schließlich überlebende Zellen in dem Medium, welches 100 μΜ 8-AG enthält, erhält Die gewünschte 8-AG-res;stente Zeil-Linie wird in acht Wochen erhalten. Die Linie wird als »CEM-AG®« bezeichnet Die Linie wächst danach auf einem RPMI-1640-Medium, das 8-AG in der gleichen Konzentration (100 μΜ) enthält und mit 10% FCS modifiziert ist, lebhaft und wurde seitdem im gleichen Medium durch kontinuierliche Kultur gehalten. Die Linie besitzt die gleichen zytologischen und andere Eigenschaften, wie sie bereits beschrieben wurden.

B. Herstellung und Isolierung humaner T-Zellen

(1) Periphere Blut-T-Zellen

Eine 50-ml-Menge an heparinisiertem Blut, welches einem gesundenen Erwachsenen entnommen wurde, wird unter Verwendung einer Lymphozytentrennungsflüssigkeit mit Dichtegradienl zentrifugiert, wobei 5 χ 10⁷ periphere Blutlymphozyten isoliert werden. Die T-Zellen werden aus den Lymphozylen isoliert, indem man ncuraniinidasebehandelten Schaferythrozyten (SRBC)(T. Hirano.T. Kurilani,T. Kishimoto und T. Yamamura, J. ImmunoL, 119, 1235—1241 (1977)) Rosetten bildet. Die so hergestellten peripheren Blut-T-Zellen werden als »nichlslimulierte PBL-T« bezeichnet.

Die nichtstimulierten PBL-T (1 χ 10^b Zellen/ml) werden stimuliert mit 10 μg/nπl Con A, 25 μg/ml PPD oder 10 μg/ml Pro A während 48 Stunden, wobei man stimulierte T-Zellen erhält, die als »Con-A-stimulierte PBL-T«, »PPD-stimulierte PBL-T« oder»Pro-A-stimulierte PBL-T« bezeichnet werden.

(2)T-Zellen von Tonsilla Palatina

Das Tonsill, welches aus Tonsilla palatina eines Patienten mit chronischer Tonsillitis entfernt wurde, wird in kleine Fragmente unter Verwendung eines MEM-Mediums, welches 10 Einheitcn/ml Heparin und 4 μg/ml Amphotericin-B enthält, unter Bildung tonsillarer Zellen geschnitten. Die Zellen werden mittels eines Ficoll-Paque-Dichtegradientenverfahrens zentrifugiert, wobei 5 χ 10⁸ lonsillare Lymphozyten isoliert werden. Die tonsillaren T-Zellen (2 χ 10⁸) werden daraus auf gleiche Weise, wie bei (1) oben, durch Rosettcnbildung mit neuraminidasebehandelten Schaferythrozylen isoliert. Die Zellen (1 χ IO^b Zellcn/ml MEM) werden mit 10 ^ig/ml Con Λ während 48 Stunden stimuliert, wobei man stimulierte tonsillare T-Zellen erhält, welche im folgenden als »Con-A-stimulierte Tonsil-T« bezeichnet werden.

(3) T-Zellen durch pleurale Effusion

Lymphozytische Zellen werden von der pleuralcn Effusion eines Patienten mit Tuberkulose abgetrennt. Insbesondere werden 100 ml pleurale Effusion von dem Patienten nach dem Thoracentcsisverfahrcn gesammelt, dann bei 1500 Upm während 5 Minuten zentrifugiert, zweimal mit MEM, welches 10 Einhciten/ml Heparin enthält gewaschen und gemäß dem Ficoll-Paquedichtegradientenverfahren zentrifugiert, wobei 3 χ 10^K Lymphozyten von der pleuralen Effusion isoliert werden. Die T-Zellen von der pleuralen Effusion werden auf gleiche Weise, wie oben bei (1) beschrieben, erhalten. Die Zellen (1 χ 10^b/ml) werden mit 25 μg/ml PPD während 48 Stunden stimuliert Die so erhaltenen Zellen werden als »PPD-stimulierte PE-T« bezeichnet

C. Fusion von parentalen Zellen und humanen T-Zellen, Selektion und Cloncn der fusionierten Zellen

Parentale Zellen CEM-AG® werden in einem Stadium schnellen Wachstums gehalten, indem man das Medium (RPMI 1640 +10% FCS +100 μΜ 8-AG) täglich während drei Tagen, die der Fusion vorhergehen, ersetzt.

CEM-AG® (1 χ 10⁷ Zellen) und jede Art der humanen T-Zellen (2 χ 10⁷), erhalten wie vorstehend unter B.

beschrieben, werden für die Fusion verwendet Die Zellen werden dreimal mit l⁷CS-freiem MEM-Mcdium, welches bei 37⁰C gehalten wird, gewaschen, dann gut in einem 50-inl konischen Rohr vermischt und bei 1000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert Die Pellets von Zellen, die sich von dem überstehenden Material abtrennen, werden etwas geschüttelt, und 0,3 ml 45% PI-G-6000, erhitzt auf 37"C, wird auf die Pellets angewen-

cjet. Die Pellets werden dann gut während 30 Sekunden geschüttelt und dann bei 37° C 6 Minuten in einem Inkubator, welcher 5% Kohlendioxid und 95% Luft enthält, stehengelassen. FCS-freies MEM (erhitzt auf 37°C) wird in den Inkubator in Gesamtmenge von 12 ml in einer Rate von 2 ml/min gegeben. Eine 25-ml-Menge von ΜΕΝί wird zu dem Gemisch schnell zugegeben, das entstehende Gemisch wird bei 800 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, und der Oberstand wird entfernt RFMI-1640-Medium, welches 20% FCS enthält und auf 37°C erwärmt wurde, wird iangsam zur Einstellung der Konzentration von CEM-AG® auf 2 χ 10⁵ Zellen/ml zugegeben. Eine 1-ml-Menge des Gemisches wird in jeden von 50 Vertiefungen gegeben, die sich in einer Mikrokulturplatte mit einem Durchmesser von 2 cm befinden. Nach 24 Stunden wird die Hälfte des Überstands verworfen, und 1 ml HAT-Medium (RPM1-1640- +20% FCS-Medium), enthaltend 1 χ 10-⁴ M Hypoxanthin, 4χ 10-⁷ M Arainoplerin und 1,6 χ 10-⁵ M Thymidin wird in die Vertiefungen gegeben. Das gleiche Verfahren wird alle zwei Tage wiederholt, um die Zellen in einem Inkubator in Anwesenheit von 5% Kohlendioxidgas bei 37° C während 2 bis 4 Wochen zu züchten. Die gewachsenen Zell-Linien werden dann auf HT-Medium, welches kein Aminopterin (A) (entsprechend Α-freiem HAT-Medium) enthält, transferiert, eine weitere Woche inkubiert und anschließend auf ein HAT-freies Medium von RPMI-1640 + 10% FCS (bekanntes Medium) transferiert und nach dem üblichen Verfahren cloniert. Genauer gesagt, wird die Kultur auf eine Hybridzelle/ml in einem üblichen Medium verdünnt und in die Vertiefungen von der Mikroplatte in einer Menge von 0,2 ml Vertiefung gegeben. Die Hälfte des Überstands wird von jeder Vertiefung alle 2 bis 3 Tage verworfen, und frisches bekanntes Kulturmedium, erhitzt auf 37°C, wird auf die Vertiefung für die weitere Inkubation gegossen, wodurch Monoclone der Hybridzell-Linien entstehen. Die typischen Clone, die so erhalten werden, d. h. humane T-Hybridzell-Linien, besitzen die in der zuvor erwähnten Tabelle Il aufgeführten Eigenschaften.

D. Herstellung von Kulturüberstand aus humanen T-Hybridzellen

(1) Überstand, der ohne Stimulierung erhalten wird

Zellen der Hybridclone, die, wie vorstehend unter C beschrieben, erhalten wurden, nämlich Nr. 24-A, werden auf eine Konzentration von 1 χ 10⁵ Zellen/ml in RPMI-1640- +10% FCS-Medium eingestellt und dann in die Vertiefungen, 2 cm im Durchmesser, einer Kulturplatte gegeben und dann in einem Inkubator in Anwesenheit von 5% Kohlendioxid bei 37%C während 2 Tagen gezüchtet. Die Kultur wird bei 3000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wird gesammelt, mit einem 0,45 μ-Milliporen-Filter für die Sterilisation filtriert und aufdieLymphokin-Aktivital geprüft.

(2) Con-A-slimulierter Überstand

Der Überstand wird auf gleiche Weise, wie oben beim Verfahren (1) beschrieben, hergestellt, außer daß 1 ng/nil Con A zu dem gleichen Medium, wie es bei (1) oben verwendet wurde, zugegeben wird. Der Überstand wird auf seine Lymphokinaktivität geprüft.

(3) PHA-stimulierter Überstand

Die Konzentration der Hybridclon Nr. 38-B-Zellen, erhalten gemäß Beispiel C, wird auf 1 χ 10^s Zellen/ml unter Verwendung von RPMI-1640 + 10% FCS + 0,1% PHA eingestellt. Ein Kulturüberstand wird auf gleiche Weise, wie unter (1) oben beschrieben, erhallen.

(4) Macrophage-stimulierter Überstand

Periphere Blullymphozyten, die auf gleiche Weise wie in Beispiel, B.-(l) erhalten wurden, werden in eine Petrischale gegeben, und die Zellen, die nicht an der Schale haften, werden abgewaschen. Die verbleibenden Zellen, die an der Schale haften, werden durch Pipettierung mit HBSS (Hank's ausgeglichene Salzlösung)/0,2% EDTA abgelöst, und als humane Macrophagen verwendet.

Ein macrophageslimulierter Kulturüberstand wird auf gleiche Weise, wie bei (3) oben beschrieben, erhalten, ausgenommen, daß die humanen Macrophagen zu dem Medium bei einer Konzentration von 0,5 χ 10⁵ Zellen/ml gegeben werden.

E. Analyse der Lymphokinaktivität des Kullurüberstands von humanen T-Hybridzell-Linien

Ein Kulturüberstand, hergestellt gemäß Beispiel, D., wird auf seine Lymphokinaktivität gemäß den folgenden Verfahren geprüft. |

(l)Tcst 1 für die TCGF-Aklivitäl des Kulturüberslands vom Clon Nr. 24-A

Thymozylcn werden aus 5 bis 6 Wochen allen BALB/C-Mäusen erhalten, in kleine Fragmente geschnitten, zweimal mit MEM gewaschen und in RPMI-1640-Mcdium, das 10% FCS enthält, suspendiert, wobei man eine Zellsuspcnsion mit einer Konzentration von 1 χ 10^h Zellen/ml erhält. Der Überstand des Clons Nr. 24-A, erhalten gemäß Beispiel, D.-(l) oder (2), wird zu einem 0,1-ml-Teil der Suspension (1 χ 10⁵ Zellen) gegeben, und das Gemisch wird in eine 0,2-ml-Mikroplatte mit flachem Boden gegeben. ³H-Thymidin (³H-TdR), 0,5 ^.CUVertiefung, wird zu dem Gemisch während der letzten 6 Stunden zugegeben, und die Thymozyten werden in Anwesenheit von 2 }ig/ml Con A für die Stimulierung inkubiert. Am dritten Tag wird die Kultur auf die ³H-TdR-Aufnah-

me geprüft Der Kulturüberstand von CEM-AG®, d. h. die parcnlalc Zeil-Linie, wird auf ähnliche Weise getesLci. Die Ergebnisse sind in Fig.5 angegeben, worin die ■ⁱH-TdR-Aufnahmezählung (C P. M.χ IO ^J) als Ordinate aufgetragen ist. Bei A ist das Ergebnis angezeigt, welches man erhält, ohne daß man irgendwelchen Kiiliuriiberstand verwendet, bei B ist das Ergebnis für den Oberstand von Beispiel, D.-(l) aufgeführt und das Ergebnis für

den Oberstand von CEM-AG®, welches auf ähnliche Weise erhalten wird (die nicht gestrichelte Säule enthält das erstsre, die gestrichelte Säule das letztere, was im folgenden ebenfalls gilt). Bei C sind die Ergebnisse des Oberstands von Beispiel, D.-(2) und das Ergebnis für einen Überstand, der ähnlich aus CEM-AG® erhallen wurde, dargestellt, und bei D ist das Ergebnis dargestellt, das man unter Verwendung von 1 ng/mi Con A nur im Falle des Kulturüberstands erhält Die Ergebnisse (A) bis (D) sind alle als mittlere Werte von +S. D. angegeben.

die man erhält, wenn man den gleichen Versuch dreimal wiederholt. In der Fi g. 5 ist gezeigt, daß die Kulturüberstände von Clon Nr. 24-A (nichtgestricheltes B und C) ein .signifikantes Wachstum der Mäusclhyniozylcn, stimuliert mit Con A, induzieren und daß diese Aktivität besonders im Falle von C hoch ist, welche man mit dem Überstand erhält, der durch Stimulierung des Clons Nr. 24-A mit Con A hergestellt wurde. Es ist erkenntlich, daß im Falle von CEM-AG® weder der Überstand, der ohne Stimulierung hergestellt wurde, noch der Oberstand, der durch Stimulierung mit Con A hergestellt wurde, einen T-Zellcn- Wachslumsfaktor ergibt

(2) Test 2 für die TCGF-Aktivität des Kullurüberstands vom Clon Nr. 24-A

Ein 50-ml-TeiI des Überstar.ds, erhalten in Beispiel, D.-(l), wird konzentriert und dann durch eine Sephadcx-G-100-Säule geleitet, wobei man eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 13 000 bis etwa 20 000 erhält, die auf 5 ml auf Amicon-YM-5-Membranen konzentriert wird, wobei man einen semigereinigten Überstand erhält Auf ähnliche Weise wird ein semigereinigter Überstand aus der parentalen Zeil-Linie CEM-AG® hergestellt

Eine TCGF-abhängige humane zytotoxische T-Zell-Linie wird gemäß MLC (gemischte Lymphozylenkultur)-Reaktion zwischen normalen humanen peripheren Blut-T-Zellen und milomycinbchandellem CESS (humane B-Zeilen mit EB-Virus transformiert und erhalten von Dr. Peter Ralph vom Sloan-Kctlering Institute for Cancer Research, New York, USA) hergestellt, und dann wird die entstehende Kultur 16 Wochen in TCGF (rohes TCGF, erhalten durch Züchtung von 1 χ 10⁶ humanen tonsillaren Lymphozytcn in Anwesenheit von 0,1% PHA während 2 Tagen und Abtrennung des Überstands für den Gebrauch) inkubierl.

Die zytotoxische Zeil-Linie (3 χ 10³) wird in Anwesenheil dos semigereiniglen Überstands während 24 Stunden gezüchteten einem CO2-Inkubator unter Verwendung von RPMI-1640- + 10% FCS-Mcdium bei 37°C), und 0,5 (iCi ¹H-TdR wird während 5 bis 8 Stunden pulsiert. Der semigercinigte Überstund wird reihenmiißig verdünnt, so daß die ¹I1-TdR-Aufnahme zur Bestimmung der TCGI'-Akiiviläi ge/.iihll werden konnte. Die Ergebnisse sind in F i g. 6 dargestellt, wo die Verdünnung des Überstands auf der Abszisse dargestellt ist und wobei 1

die Anfangskonzentration des Überstands, die verdünnt wird, und 0 ein Vergleich ist, bei dem kein Überstand verwendet wird. Die gestrichelten Werte stellen den semigereinigten Überstand, der zuerst hergestellt wurde, dar, und die nichtgestrichelten Werte sind der semigereinigte Überstand von CEM-AG®. Die 'H-TdR-Aufnahmezählung (C. P. M.x 10~³) wird als Ordinate aufgetragen. All die aufgeführten Ergebnisse sind als mittlere Werte ± S. D. angegeben, die man bei dreifachen Kulturen erhält.

Aus F i g. 6 folgt, daß die semigereinigte Fraktion, die aus dem Kullurüberstand von Clors Nr. 24-A gemäß der Erfindung hergestellt wurde und die ein Molekulargewicht von 13 000 bis 20 000 aufweist, das Wachstum der TCGF-abhängigen humanen zytotoxischen T-Zell-Linie erhält und daß die Aktivität von der Konzentration des löslichen Faktors abhängt. Es ist weiterhin erkennbar, daß die Fraktion, die man au.s der parcnlalcn Zcll-Linic CEM-AG® erhält und die ungefähr gleich ist im Molekulargewicht wie die obige Fraktion keine Wachslumsaktivität bei irgendeiner Konzentration aufweist.

(3) Test für die TCGF-Aktivität des Kulturüberstands aus dem Clon Nr. 38-B

Die Kulturüberstände, die gemäß dem Beispiel, D.-(3) und (4) erhallen wurden, werden auf ihre TCGF-Aklivitat auf gleiche Weise, wie bei (2) oben beschrieben, unter Verwendung eines Assaysyslcms unter Verwendung der TCGF-abhängigen zytotoxischen T-Zell-Linie geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 111 aufgeführt, worin die Gruppen A bis H die folgenden Bedeutungen aufweisen:

A: Konlmllgnippe ohne Supplement
B: Gruppe, die mit dem Überstand, erhalten gemäß Beispiel, D.-(4), suppiemenlicrt wurde

C: Gruppe, die mit dem Kulturüberstand aus der parenlalcn Zelle CEM-AG®, erhallen auf gleiche Wci.se wie in Beispiel, D.-(4), supplementiert wurde

D: Gruppe, supplementiert mit dem Überstand, erhalten gemäß Beispiel, D.-(3)

E: Gruppe, supplementiert mit dem Kulturüberstand von der parentalen Zelle CEM-AG®, erhalten auf gleiche eo Weise wie in Beispiel, D.-(3)

F: Gruppe, supplementiert mit den humanen Macrophagen mil einer Dichte von 0,5 χ 10^Γ> Zellen/ml und PI IA (0,1%)

G: Gruppe, supplementiert mit PHA (0,18%)

H: Gruppe, supplementiert mit rohem TCGF (0,5 Einheit), erhalten durch Kultivierung von humanen Tonsill-Lymphozyten(l χ 10⁶ Zellen/ml) in Anwesenheil von 0,1% PHA während zwei Tagen. (Die TCG F-Aklivitut von 1 χ 10⁶PHA-stimulierten Zellen wird als eine Einheit von TCG F definiert.)

	32 49 567
Tabelle III
Gruppe	'U-TciR-Aufnahmcicpm)
Λ	193b± 8J8
B	5131 + 1684
C	2291+ Ö65
D	2170± 628
E	1844± 698
F	19S5 + 1098
G	711± 74
H	4214+ 333

Aus der Tabelle III zeigt die TCG F-Aktivität des Kulturüberstands, der aus dem humanen macrophagestimulierlen Clon Nr. 38-B erfindungsgcmäß erhalten wurde. Der Überstand von derparentalen Zeil-Linie CEM-AG® 15 zeigt keineTCGF-Aktivität.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

I) 15

Claims

Patentansprüche:

1. Hybrydzell-Linie, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Hybridzell-Linie von HGPRT-armen humanen T-leukämischen Zellen mit normalen humanen T-Zellen ist

2. Zeil-Linie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß sie ein Lymphokin zu produzieren imstande ist

3. Verfahren zur Herstellung einer Zeil-Linie gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellfusion in Anwesenheit von Zellfusionsprornotern in einem geeigneten Medium durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man HGPRT-arme humane T-leukämische Zellen mit normalen humanen T-Zellen unter Verwendung eines Fusionspromotors fusioniert

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hybridzellen in einem selektiven Medium selektiv züchtet

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß man die Hybridzellen in einem Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält, züchtet

6. Verwendung der Hybridzell-Linie gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Lymphokins.

15