FI76118B - Foerfarande foer framstaellning av en hgprt-defekt leukemisk human-t-cellinje. - Google Patents

Description

7611 8

Menetelmä ihmisen HGPRT-vajaan leukeemisen T-solulinjan valmistamiseksi Tämä keksintö koskee ennentuntemattomia ihmisen T-solulin-joja ja erityisesti (yhteensulautettuja) ihmisen T-hybridi-solulinjoja, erikoisesti sellaisia ihmisen T-hybridisolulin-joja, jotka erittävät lymfokiinejä (lymphokines), sekä parentaalista solulinjaa, joka voi sulautua yhteen ihmisen T-solujen kanssa tällaisten hybridisolujen muodostamiseksi. Keksintö koskee myös menetelmää näiden solulinjojen aikaansaamiseksi ja menetelmää lymfokiinien saamiseksi tällaisista solulinjoista.

Lymfosyytit eli imusolut, jotka osallistuvat ihmisen immunoin-tisysteemiin, luokitellaan yleensä kahteen lajiin, nimittäin kateenkorvasta peräisin.oleviin T-soluihin ja luuytimestä peräisin oleviin B-soluihin. On tunnettua, että B-solut erittävät vasta-aineita. On kehitetty menetelmä monokloonisten vasta-aineiden saamiseksi hybridoma-B-soluista, jotka on valmistettu risteyttämällä vasta-aineita tuottavia B-soluja ja myeloma-soluja, jotka toimivat parentaalisina soluina. /Katso julkaisua "Rinsho Kagaku (Clinical Science)" Voi. 16, No. 9, 1108-1114 (1980)/.

T-solut esittävät pääosaa immuunivasteen säätämisessä. Vaikka on vielä paljon jäljellä niiden ominaispiirteiden tutkimuksessa, on tunnettua, että T-solut erittävät monia liukoisia immuniuttasäätäviä tekijöitä (lymfokiinejä), kuten tekijän, joka ehkäisee vasta-aineen tuottamisen, liukoisia tekijöitä, jotka aiheuttavat muiden T-solujen lisäkasvun (interleukins), sekä muita tekijöitä. Näitä tekijöitä erittyy kuitenkin hyvin pienissä määrissä jopa in vivo, ja lisäksi on erittäin vaikeaa tuottaa, eristää ja kerätä niitä suurissa määrissä in vitro. Sen vuoksi on yritetty valmistaa T-hybridisoluja solufuusion avulla tällaisten tekijöiden aikaansaamiseksi in vitro, mutta tähän saakka ilmoitetut onnistuneet T-solujen 2 761 1 8 fuusiotapaukset ovat rajoittuneet vain hiirien T-soluihin. Yhtään ihmisen T-solujen onnistunutta risteytystä koskevaa tapausta ei ole vielä ilmoitettu. Ihmisen parentaalisia T-soluja, jotka voidaan sulauttaa yhteen ihmisen T-solujen kanssa, ei ole vielä kehitetty. Tarkemmin sanoen, vaikka tällainen parentaalinen solu ihmisen normaalin T-solun kanssa risteytystä varten aikaansaadaankin, parentaalinen solu tulee palautumaan alkuperäiseen tilaansa ennen risteytysprosessia ja/tai sen aikana, mikä on omiaan tekemään hybridoma-solujen valinnan melkein mahdottomaksi. Lisäksi, vaikka hybridoma-solut on valittu ja eristetty, on erittäin arvaamatonta, tulevatko hybridoma-solut olemaan toiminnallisesti stabiileja tai lisääntymään pitkän aikaa pidättäen niihin normaalista T-solusta siirtyneet geenit.

Koska on vaikeaa aikaansaada suuria määriä homogeenisia liukoisia immuniuttasäätäviä tekijöitä, erittäin suuria vaikeuksia kohdataan analysoitaessa niiden kemiallisia ja biologisia ominaispiirteitä. Niinpä mitään tutkimuksia ei ole tehty näiden tekijöiden kliinisen sovellutuksen ja niiden kliinisten vaikutusten suhteen. Lisäksi, koska ihmisen T-hybridi-solulinjoja ei ole vielä aikaansaatu, vähän tai ei lainkaan edistystä on tapahtunut ihmisen T-solujen päällä sijaitsevien pinta-antigeenien ja antigeenien T-solureseptori.en analyysissä, ihmisen T-solujen vähenemään kohdistuvassa tutkimuksessa sekä solujenmuodostus- ja immunologisissa tutkimuksissa, jotka koskevat ihmisen T-solujen erotusta, lisäkasvua ja aktivointia sinänsä.

Niinpä tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada parentaalinen solulinja, joka voidaan sulauttaa yhteen ihmisen T-solujen kanssa.

Keksinnön toisena tarkoituksena on aikaansaada menetelmä sellaisen parentaalisen solulinjan valmistamiseksi, joka voi sulautua yhteen ihmisen T-solujen kanssa.

7611 8 3

Lisäksi on keksinnön tarkoituksena aikaansaada ennentunte-mattomia hybridisolulinjoja, jotka on valmistettu parentaa-lisesta solulinjasta ja ihmisen T-soluista.

Vielä on keksinnön tarkoituksena aikaansaada menetelmä hybri-disolulinjan valmistamiseksi.

Edelleen on keksinnön tarkoituksena aikaansaada menetelmä suuren liukoisten immuniuttasäätävien tekijöiden määrän valmistamiseksi nopeasti ja helposti in vitro hybridisolu-linjaa käyttämällä.

Nämä keksinnön tarkoitukset ja muut piirteet ilmenevät seuraa-vasta selityksestä.

Tämä keksintö aikaansaa hypoksantiiniguaniinifosforibosyyli-transferaasista (HGPRT) vajaan ihmisen leukemisen T-solulin-jan, siitä johdettuja hybridisolulinjoja sekä menetelmän näiden solulinjojen valmistamiseksi. Erikoisesti keksintö aikaansaa ennentuntemattoman parentaalisen T-solulinjan, joka tekee mahdolliseksi ihmisen T-solujen fuusion, parentaa-lisesta solulinjasta ja ihmisen T-soluista valmistetut uudet hybridisolulinjat, sekä menetelmän tällaisten linjojen valmistamiseksi.

Nyt on suoritettu laaja tutkimus ihmisen T-solufuusioteknii-kan kehittämiseksi. Niinpä on todettu, että tietty solulinja voi sulautua yhteen ihmisen T-solujen kanssa, omaa herkkyyden viljelyväliaineen suhteen yhteensulautuneiden solujen valitsemista varten, kykenee säilymään viljelyksessä pysyvästi sekä soveltuu parentaaliseksi solulinjaksi ihmisen T-hybridi-solujen valmistusta varten. Nyt on myös todettu, että tämä linja käytettäessä sitä kantalinjana sulautuu yhteen ihmisen T-solujen kanssa aikaansaaden ihmisen hybridisoluja ja että hybridisolut voidaan helposti valita käyttämällä selektiivistä väliainetta. Lisäksi täten valmistetuista ihmisen T-hybridisoluista saadut kloonit sisältävät sellaisia, joilla 76118 4 on kyky tuottaa liukoisia immuniuttasäätäviä tekijöitä (lymfokines), jotka erittyvät ihmisen T-soluista ja jotka tunnetusti esittävät tärkeää osaa immuunivasteiden säätämisessä. Tämä keksintö on toteutettu näiden uusien tulosten perusteella.

Kuviot 1-4 esittävät graafisesti keksinnön mukaisten paren- p taalisen solulinjan CEM-AG ja T-hybridisolulinjan (klooni No. 24-A) mitogeeniherkkyyttä.

Kuviot 5 ja 6 esittävät graafisesti keksinnön mukaisen T-hybridisolulinjan (klooni No. 24-A) TCGF-aktiivisuuksia.

Keksinnön mukaisia parentaalista solulinjaa ja hybridisolu-linjoja voidaan viljellä jatkuvasti. Näitä solulinjoja, erikoisesti hybridisolulinjoja aikaansaamalla tulee mahdolliseksi tuottaa in vitro suuria määriä liukoisia immuniuttasäätäviä tekijöitä, jotka erittyvät ihmisen T-soluista, ts. liukoisia tekijöitä, jotka välittävät solujenvälisen reaktion immuunivasteessa, sekä analysoida näiden liukoisten tekijöiden kemialliset ja biologiset ominaisuudet, joita ei ole vielä täysin selvitetty, avustaen suuressa määrin näiden tekijöiden kliinisen soveltamisen ja vaikutuksen tutkimusta. Lisäksi ihmisen T-hybridisolulinjojen muodostaminen aikaansaa hyvin käyttökelpoisen keinon ihmisen T-solujen pinnalla sijaitsevien antigeenien ja antigeenien T-solureseptorien analysointia varten, ihmisen T-solujen vähenemään kohdistuvaa tutkimusta varten sekä niitä solujenmuodostus- ja immunologisia tutkimuksia varten, jotka koskevat ihmisen T-solujen erotusta, lisäkasvua ja aktivointia sinänsä.

Keksinnön mukainen uusi parentaalinen solulinja on johdettu ihmisen leukeemisesta T-solulinjasta, ja sille on tunnusomaista, että siitä puuttuu ainetta HGPRT. Parentaalisen solu-linjan sytologiset ja muut ominaispiirteet ovat seuraavat.

5 76118 (1) Morfologiset ominaispiirteet

Parentaalisilla soluilla on noin 2-3 kertaa niin suuri läpimitta kuin ihmisen normaaleilla perifeerisillä T-verisoluil-la, ja ne ovat melkein pallomaisia. Tuma täyttää suuren osan solusta, ja pieni määrä protoplasmaa on havaittavissa. Protoplasma sisältää jonkin verran jyväsiä. Valejalan kaltaisia lisäkkeitä voi esiintyä satunnaisesti.

(2) Kromosomien lukumäärä

Parentaalisia soluja inkuboidaan 3 tunnin ajan lämpötilassa 37°C kolkisiinin läsnäollessa pitoisuudella 0,1 ^ug/ml, minkä jälkeen ne lingotaan, käsitellään 0,075 M KCl-liuoksella ja kiinnitetään objektilasille yhdessä metanolin ja etanolin seoksen (3:1) kanssa. Tumakromosomien lukumäärä lasketaan mikroskooppisesti käyttäen 1000 kertaa suurentavaa öljyimmer-siolinssiä. Meta-kehitysvaiheessa olevista 100 solusta saatu laskentatulos ulottuu välille 69-87 keskiarvon ollessa 78. Tulokseton esitetty seuraavassa taulukossa.

Taulukko 1

Kromosomien 69 ?0 71 72 73 ?4 ?5 ?6 ?? lukumäärä ?°iU^SS ·· 1 3 4 4 4 4 4 11 12 lukumäärä

Kromosomien 78 ?g Q0 81 82 83 g4 Q5 86 87 lukumäärä

Solujen lukumäärä 10 9495 10 2121 (3) T-solun spesifisen antigeenin ilmaiseminen 5

Parentaalisia soluja, joiden määrä on 5 x 10 , inkuboidaan lämpötilassa 4°C 30 minuutin ajan yhdessä monokloonisen vasta- ainemäärän 100 yUl kanssa sen pitoisuuden ollessa sopiva (0,1 mg/0,5 ml vasta-aineita anti-Leu 1, anti-Leu 2A ja anti-Leu 3A laimennettuna vastaavasti 100-kertaisesti, 10-kertaisesti ja 10-kertaisesti määrään 100 ^ul). Monoklooniset vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Becton-Dickinson Co., Sunnyvale,

Ca., USA /J. Exp. Med., 153, 310-323 (1981]_/. Sen jälkeen solut pestään MEM-väliaineella (hankittu laitokselta Research 6 76118

Institute for Microbial Diseases, Osaka University, Osaka, Japani), joka sisältää 5 % FCS (sikiövasikan seerumia) reagoituna aineeseen FITC (fluoreseiini-isotiosyanaatti) konju-goidun kaniinin anti-hiiri-immunoglobuliinin (Miles-Yeda Ltd., Israel) kanssa, minkä jälkeen solut tutkitaan T-solun spesifisen antigeenin ilmaisun suhteen epäsuoran immunofluoresens-sin avulla. Kun 200 näistä soluista on tarkastettu, ainakin 95 % niistä ovat positiivisia vasta-aineiden anti-Leu 1 ja anti-Leu 3A suhteen ja 1 %:iin saakka niistä ovat positiivisia vasta-aineen anti-Leu 2A suhteen.

(4) Rosetinmuodostus 200 parentaalista solua tarkastetaan mikroskooppisesti 400-kertaisella suurennuksella rosetinmuodostuksen suhteen yhdessä solujen EAC /lampaan punaverisoluja (E), jotka on käsitelty anti-punasoluvasta-aineella (A) ja ihmissolutäyden-nyksellä (C)J kanssa sillä tuloksella, että aina 1 %:iin saakka ne ovat positiivisia.

(5) B-solun markkerin Ilmaiseminen

Pinta-immunoglobuliini (Ig) analysoidaan käyttämällä FITC-kon-jugoitua hiiren ihmissolujen vastaista immunoglobuliinia (Behring Werke AG, Marburg) suoran immunofluoresenssin avulla. Aina 1 %:iin saakka solut ovat positiivisia.

Ihmisen antigeeni HLA-DR (josta tästä lähtien käytetään merkintää "DR") analysoidaan käyttämällä monokloonista anti-DR-vasta-ainetta (toimittaja Becton-Dickinson Co.) epäsuoran immunofluoresenssin avulla. Aina 1 %:iin saakka analysoidut solut ovat positiivisia.

Ihmisen B-solun spesifisen antigeenin (B-antigeenin) esiintyminen analysoidaan epäsuoran immunofluoresenssin avulla käyttämällä monokloonista ihmisen B-solun vastaista vasta-ainetta, joka on saatu hybridisolulinjasta, joka on valmistettu myeloma-PSU-^-soluista (toimittaja Elbert Einstein College of Medicine) ja hiirenpernasoluista immunoituna ihmisen B-solulinjan avulla (CESS, toimittaja Dr. Peter Ralph, 7 76118

Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, USA) ja muunnettuna viruksella (Epstein-Barr virus) (katso julkaisua G. Kohler & C. Milstein, Nature, 256, 495, 1975), 1 % soluista on positiivisia. Vasta-aine reagoi B-solujen tai niiden linjojen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen tai niiden linjojen kanssa.

(6) HLA-fenotyyppi

Parentaalisia soluja inkuboidaan lämpötilassa 37°C 30 minuu tin ajan yhdessä anti-HLA-seerumin (toimittaja prof. Sasazuki, Tokyo Medical and Dental University, Japani) kanssa, minkä jälkeen niitä inkuboidaan 60 minuutin ajan yhdessä kaniinin komplementin kanssa, jonka komplementin tämän keksinnön mukainen parentaalinen solu on absorboinut ja joka sen jälkeen on tarkastettu eloonjäämisen suhteen. HLA-fenotyyppinä on A2, Ali, B8, B37 ja Bw 22.

(7) Lisäkasvu

Parentaaliset solut lisääntyvät tyydyttävästi viljelyväliai-neessa RPMI 1640 (Flow Laboratories, USA), joka sisältää 8-atsaguaniinia (8-AG, 100 ^uM), 10 % FCS, 5 x 10 ^ M 2-merkaptoetanolia ja 1 mM glutamiinia.

(8) Lisäkasvuolosuhteet

Parentaaliset solut lisääntyvät yleensä tyydyttävästi lämpötilan ollessa välillä 36-38°C ja pH-arvon välillä 7,2-7,3. Sopivinta on käyttää inkubaattoria, joka sisältää 5 % hiilidioksidia ja 95 % ilmaa.

(9) Jatkuva viljely

Parentaalisia soluja voidaan viljellä jatkuvasti ja rajattomasti.

(10) Säilytys jäädytetyssä muodossa

Parentaalisia soluja voidaan säilyttää nesteytetyssä typessä pitkiä aikoja.

e 76118 (11) Kestävyys 8-atsaguanilnin suhteen

Parentaaliset solut ovat kestäviä 8-atsaguaniinin (100 ^uM) suhteen ja kuolevat väliaineessa, joka sisältää hypoksantii-nia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT-väliaine). Tämä osoittaa, että parentaalisista soluista puuttuu ainetta HGPRT.

(12) Mltogeenl-herkkyys

Kun 10-100 ^ug/ml konkanavaliinia A (Con A) ja 1-10 % kasvi-lektiiniä, fytohemagglutiniinia (PHA) lisätään väliaineeseen, parentaalisen solulinjan kasvaminen estyy jossain määrin. Pokeweed-mitogeeni (PWM) samoin kuin proteiini A (Pro A) eivät vaikuta missään pitoisuudessaan linjan kasvuun.

Kuviot 1-4 esittävät näitä ominaispiirteitä. Kyseessä olevan 4 parentaalisen solulinjan 2 x 10 solua viljellään 60 tunnin ajan 10 % seerumia FCS sisältävässä väliaineessa RPMI 1640 erilaisten mitogeenipitoisuuksien läsnäollessa (kuviossa 1 mitogeeninä Con A, kuviossa 2 PHA, kuviossa 3 PWM ja kuviossa 4 Pro A). 0,2 ^uCi ^H-tymidiiniä (^H-TdR) lisätään väliai neeseen viimeisten 12 tunnin viljelyaikana. Viljelmät kerätään lasikuituliuskoille (Labo-Science Cell Harvester, Tokyo),

O

ja H-TdR deoksiribonukleiinihappo- fraktiossa määritetään neste-tuikelaskennalla. Kussakin kokeessa suoritetaan kolme viljelyä, ja tulosten keskiarvot (lO %:iin saakka standardipoikkeamassa) on esitetty. Kussakin graafisessa kuviossa mitogeenipitoisuus on merkitty vaaka-akselille ja ^H-TdR-laskentatulos (C.P.M. x 10 ^) pystyakselille. Käyrä (·—·) esittää tuloksia, jotka on saatu kyseessä olevalla parentaalisella solulinjalla, ja toinen käyrä (o-o) esittää tuloksia, jotka on saatu käyttäen kloonia 24A (keksinnön mukaisen ihmis-T-hybridisolulinjan kloonia), mikä selitetään myöhemmin.

Keksinnön mukainen HGPRT-vajaa ihmisen leukeminen T-solulinja, jolla on edellä mainitut ominaispiirteet, johdetaan esimerkiksi ihmisen leukemisista T-soluista (CCRF-CEM) (J. Kaplan, 9 761 1 8 T.C. Shope & W.D. Peterson, Jr., J. Exp. Med. 139, 1070-1076, 1974), ja se voidaan aikaansaada viljelemällä näitä soluja väliaineessa RPMI 1640, joka sisältää 10 % FCS ja 8-atsa-guaniinia (8-AG) sekä siirtämällä nämä solut peräkkäin sellaisiin väliaineisiin, joilla on suuremmat 8-AG-pitoisuu-det. Tarkemmin sanoen, soluja viljellään ensin 1 viikon ajan tämäntyyppisessä väliaineessa, joka sisältää esim. 2 ^,uM yhdistettä 8-AG, sitten 1 viikon ajan samassa väliaineessa, joka sisältää 16 ^uM yhdistettä 8-AG, ja sen jälkeen samalla tavoin väliaineissa, joissa yhdisteen 8-AG pitoisuus lisätään peräkkäin aina kaksinkertaiseksi. Lopuksi yhdisteen 8-AG suhteen vastustuskykyinen solulinja saadaan elossa väliaineesta, joka sisältää 100 ^,uM yhdistettä 8-AG. Saatu solulinja lisääntyy nopeasti väliaineessa, joka sisältää 100 ^uM yhdistettä 8-AG, ja sitä voidaan jatkuvasti viljellä samassa väliaineessa.

Näin saadulla linjalla on edellä mainitut ominaispiirteet, se on aikaisemmin tuntematon T-solulinja ja sitä voidaan viljellä jatkuvasti sekä säilyttää jäädyttämällä melkein rajattomasti.

Keksinnön mukaista HGPRT-vajaata solulinjaa voidaan viljellä erilaisissa ravintoväliaineissa, jotka ovat pääasiassa synteettisiä mutta jotka voivat sisältää luonnonvaraisen aineosan, kuten seerumia. Esimerkkejä käyttökelpoisista ravinto-väliaineista ovat RPMI 1640 (Flow Laboratories, USA) muunnettuna seerumia FCS, hevosseerumia, tai seerumintapaista lisäainetta käyttäen sekä Dulbecco-väliaine muunnettuna seerumittomalla Iscove-väliaineella. Tällaisissa väliaineissa kasvatettavat keksinnön mukaiset solut voidaan välittömästi sopeuttaa lisääntymään erilaisissa yleisesti käytetyissä väliaineissa, kuten FCS sisältävässä rajoittavassa Eaglen minimiväliaineessa (MEM). Keksinnön mukaisten parentaalisten solujen ylläpitämiseksi näiden väliaineiden ei tarvitse aina sisältää yhdistettä 8-AG, mutta edullisimmin 10 761 1 8 ne sisältävät mainittua yhdistettä. Solua voidaan viljellä näissä väliaineissa niissä olosuhteissa, joita yleensä käytetään tavallisten solujen viljelyssä. Yleensä parentaa-lisia soluja voidaan kasvattaa tyydyttävästi lämpötilassa, joka on välillä n. 36 - n. 38°C. Nestemäinen komponentti uusitaan 3-5 vuorokauden välein.

Vaikka tätä parentaalista solulinjaa ei hyväksytty talletettavaksi laitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japani, patentinhakijat säilyttävät sitä jatkuvasti sellaisissa olosuhteissa, että sitä on julkisesti saatavissa. Lisäksi solulinjan näyte on talletettu 1981-06-30 laitokseen American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, ja sille on annettu ATCC-n:o CRL 8081.

Keksinnön mukaista HGPRT-vajaata T-solulinjaa voidaan käyttää parentaalisena solulinjana ihmisen T-solujen yhteensulautta-mista varten. Keksintö aikaansaa myös menetelmän T-solujen yhteensulauttamiseksi parentaalisen solulinjan kanssa sekä siten saadun T-hybridisolulinjan kanssa.

Ihmisen T-soluja, joita voidaan käyttää T-solufuusioon, ei ole erityisesti rajoitettu. Esimerkkejä käyttökelpoisista T-soluista ovat sellaiset, jotka on saatu perifeerisestä verestä, luuytimestä, imusolmukkeista, pernasta, risoista, kateen-korvasta jne. Tällaisia T-soluja voidaan eristää ja puhdistaa erilaisilla tunnetuilla erotusmenetelmillä, kuten tavanmukaisilla fysikaalisilla ja kemiallisilla menetelmillä sekä pinta-membraaneihin tartuttamismenetelmällä, ja niitä voidaan käyttää keksinnön mukaiseen solufuusioon. Parannetun fuusiotehok-kuuden saavuttamiseksi nämä T-solut voidaan stimuloida erilaisilla mitogeeneillä ennen fuusiota. Esimerkkejä käyttökelpoisista mitogeeneistä ovat sellaiset, joilla on herkkyyttä T-solujen suhteen, kuten konkanavaliini A (Con A, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), puhdistettu tuberkuliini (PPD, toimittaja Dr. Takatsu, Institute for Cancer Research, Osaka University Medical School, Osaka, Japani), 7611 8 11 proteiini A (Pro A, Pharmacia Co., Ruotsi), fytohemaggluti-niini (PHA, Difco, Detroit, Mich., USA), Pokeweed-mitogeeni (PWM, GIBCO Laboratories, USA) jne. Käytettävät T-solut voivat olla aktivoituja yhdistetyn imusoluviljelyn avulla. Myöhemmin esitettävissä esimerkeissä ihmisen T-solujen ja mitogeenillä stimuloitujen T-solujen valmistus on selostettu yksityiskohtaisesti.

Fuusioreaktio HGPRT-vajäiden ihmisen leukeemisten T-solujen ja ihmisen T-solujen välillä suoritetaan olennaisesti samalla tavalla kuin tunnetussa solufuusiomenetelmässä sopivassa väliaineessa fuusionpromoottorin läsnäollessa. Virukset, kuten Sendai-virus (HVJ), ovat käyttökelpoisia fuusionpromoottoreita, mutta edullisinta on käyttää promoottorina äskettäin kehitettyä polyeteeniglykolia (PEG). Sopivinta on käyttää sellaista PEG-yhdistettä, jonka keskimääräinen molekyyli-paino on välillä n. 1000 - n. 6000. On sopivaa, että väliaine sisältää tätä PEG-yhdistettä pitoisuudella, joka on välillä n. 30 - n. 60 paino/tilavuus-%. Käyttökelpoisia viljely-väliaineita ovat MEM-väliaine joko sellaisenaan tai muunnettuna Dulbecco-väliaineella, väliaine RPMI 1640 sekä muut väliaineet, joita tavallisesti käytetään solujen viljelyyn. Haluttaessa väliaineeseen voidaan lisätä dimetyylisulfoksidia tai sentapaista apuainetta fuusiotehokkuuden parantamiseksi.

Fuusioon käytettävien keksinnön mukaisten parentaalisten solujen ja ihmisen T-solujen määrien suhteet eivät ole erityisesti rajoitettuja. Yleensä ihmisen T-solujen lukumäärä voi olla n. 1 - n. 10 kertaa niin suuri kuin parentaalisten solujen lukumäärä. Sopivimmin solut sulautetaan yhteen esimerkiksi seuraavalla tavalla. Tietyt määrät parentaalisia soluja ja ihmisen T-soluja sekoitetaan perusteellisesti keskenään väliaineessa, seos lingotaan ja erottunut neste poistetaan. Sopiva määrä lämpötilaan 37oc kuumennettua PEG-liuosta sekoitetaan jäljellä olevaan massaan, jolloin solufuusioreaktio alkaa. Kun sopivaa väliainetta on lisätty, seos lingotaan ja pinnalle nouseva neste poistetaan. Tämä 1* 76118 menettely toistetaan ja tuotteeksi saadaan haluttuja yhteen-sulautuneita soluja.

Haluttuja yhteensulautuneita soluja voidaan selektiivisesti aikaansaada viljelemällä saatua seosta sellaisen tavallisen väliaineen kanssa, joka sallii ainoastaan haluttujen hybridi-solujen lisäkasvun, mutta ehkäisee parentaalisten solujen lisäkasvun. (Ihmisen T-solut eivät luonnostaan kykene lisääntymään selektiivisessä väliaineessa). Tyypillinen tällainen väliaine on esimerkiksi väliaine, joka sisältää hypoksan-tiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT-väliaine). Tarkemmin määritellen, käyttökelpoinen HAT-väliaine valmistetaan -7 -4

esim. lisäämällä 4 x 10 M aminopteriiniä, 1 x 10 M

hypoksantiinia, 1,6 x 10 ^ M tymidiiniä ja, jos niin halutaan, 3 x 10'6 M glysiiniä 10-20 % seerumia FCS sisältävään MEM- tai RPMI-1640-väliaineeseen. Soluja viljellään HAT-väliaineessa tavallisella rajalaimennusmenetelmällä niin pitkän ajan, yleensä useista vuorokausista useihin viikkoihin, että se riittää aiheuttamaan muiden solujen (esim. yhteen-sulautumattomien ym.) kuin haluttujen hybridisolujen kuoleman, joten ainoastaan halutut yhteensulautuneet ihmisen T-solut tulevat selektiivisesti lisääntymään.

Näin saaduilla yhteensulautetuilla soluilla on ennentuntemat-tomia ominaispiirteitä, jotka eroavat parentaalisen solulinjan ja ihmisen T-solujen ominaispiirteistä karyotyyppinsä (tuma-kromosomien lukumäärä), solunpinnan fenotyypin, mitogeeni-herkkyyden, lymfokiinin tuottavuuden ym. suhteen. Vaikka yhteensulautettuja soluja voidaan edelleen kasvattaa jatkuvasti jossakin edellä mainitussa sopivassa väliaineessa, on edullista, että selektiivisesti valmistettuja soluja ensin viljellään 1-2 viikon ajan HT-väliaineessa, joka sisältää hypoksantiinia ja tymidiiniä, minkä jälkeen ne siirretään tavanmukaiseen väliaineeseen. Selitystarkoituksessa seuraa-vissa esimerkeissä saatujen yhteensulautettujen solujen ominaispiirteet on esitetty taulukossa 2 verrattuna niihin ominaispiirteisiin, jotka on parentaalisella solulinjalla 7611 8 13 (ts. HGPRT-vajäillä leukeemisilla ihmisen T-soluilla, joiden merkintä tästä lähtien on "CEM-AGR").

Taulukko 2

Hybridi- Ihmisen T-solu Taajuus Klooni Kromosomien solu n:o lukumäärä n:o (keskimäärin) 1 Stimuloimaton 1/12 24-A 79-97 PBL-T (89) 2 Con A-stimuloitu 1/24 36-B 79-100 kitarisa-T (89) 3 Con A-stimuloitu 1/8 38-B 79-96 PBL-T (88) 4 PPD-stimuloitu 1/8 41-III 75-93 PE-T (86) 5 Stimuloimaton 1/24 43-A 88-99 PBL-T (93) 6 Pro A-stimuloitu 1/24 47-A 81-98 PBL-T (89) 7 Pro A-stimuloitu 4/12 40-VI 82-91 PBL-T (87) 8 Pro A-stimuloitu 5/24 44-C 89-100 PBL-T (94) 9 Pro A-stimuloitu 3/24 47-B 87-100 PBL-T (93)

Parentaali- 69-87 nen solu CEM-AGK - - (78) 14 761 1 8

Taulukko 2 (jatkuu)

Hybridi- T-solun spesifisen anti- Rosetin B-merkitsimen solu geenin ilmaisu muodostus ilmaisu_

n:° Leu 1 Leu 2A Leu 3A E EAC I DR B

g antigeeni 1 ++ - ++ - - - - 2 -H- - ++ - - ___ 3 ++ -H- - - - - 4 -H- ++ - - - 5 -H- -H- - - - 6 -H- -H- - - -

7 ND ND - ND ND ND ND

8 ND - ND - NDNDNDND

9 ND ND ND ND ND ND

Parentaali- nen solu ++ ++ - -

Taulukossa 2 taajuus on esitetty suhteena A/B, jossa A on aikaansaatuja hybridisoluja sisältävien syvennysten lukumäärä ja B on sellaisten syvennysten lukumäärä, joihin on siirrostettu 2 x 10^ yhteensulautettua solua välittömästi fuusion jälkeen.

Kromosomien lukumäärä, T-solun spesifisen antigeenin ilmaisu, rosetin muodostus ja B-solun merkitsimen ilmaisu on määritetty samoilla menetelmillä kuin aikaisemmin on mainittu parentaali-sen solulinjan yhteydessä. Taulukossa olevat symbolit merkitsevät seuraavaa: ++ ... Vähintään 95 % soluista ovat positiivisia ... 1 %:iin saakka soluista ovat positiivisia ND ... Koetta ei suoritettu E ... Lampaan punaverisoluja

Seuraavassa on esitetty taulukkoon 2 viitaten ihmisen T-hybri-disolulinjan eri ominaispiirteiden yhteenveto, joka käsittää samat kohdat (1) - (12) kuin on esitetty parentaalisten solujen yhteydessä sekä lisäksi kohdan (13).

15 761 1 8 (1) Morfologiset ominaispiirteet

Linjan ominaispiirteet, vaikka ne ovat jonkin verran erilaiset kloonista klooniin, ovat olennaisesti samanlaiset kuin parentaalisella solulinjalla. Linja on jonkin verran suurempi kuin parentaalinen linja (1,2 - 1,5 kertaa niin suuri). Monien solujen pinnassa on useita viiksimäisiä ulkonemia.

(2) Karyotyyppi (tumakromosomien lukumäärä)

Vaikka kromosomien lukumäärä vaihteleekin kloonista klooniin, keskimääräinen kromosomien määrä on välillä 86-94, mikä on selvästi suurempi kuin parentaalisten solujen vastaava arvo 78.

(3) - (5) Nämä ominaispiirteet ovat identtisiä parentaalisten solujen kanssa useimmissa klooneissa.

(6) HLA-fenotyyppi

Parentaalisten solujen fenotyyppejä on havaittu jokaisessa kloonissa. Ainakin yksi ihmisen T-solujen HLA-fenotyyppi, joka on toinen kuin parentaalisten solujen fenotyypit, on havaittu jokaisessa kloonissa.

(7) - (10) Nämä ominaispiirteet ovat likimain samanlaiset kuin parentaa-lisilla soluilla jokaisessa kloonissa.

(11) Kestävyys 8-atsaguaniinin suhteen

Mikään klooni ei ole kestävä 8-atsaguaniinin suhteen.

(12) Mltogeeniherkkyys

Hybridisolulinjat ovat parentaalista solulinjaa vastaavia tai sitä herkempiä mitogeenien Con A ja PHA suhteen. Vaikka parentaalisella solulinjalla ei ole mitään herkkyyttä mito-geenin PVM suhteen, useat kloonit on todettu sille herkiksi.

(13) Lymfokiinien tuotto

Tietyt hybridikloonit kykenevät tuottamaan lymfokiinejä, erikoisesti aputekijöitä. Esimerkiksi kloonit 24-A, 38-B.

76118 16 kykenevät tuottamaan T-solun kasvutekijää (TCGF) seuraavissa esimerkeissä selostetulla menetelmällä. Lisäksi nämä kloonit ovat toiminnallisesti stabiileja, ts. pystyviä tuottamaan tekijää TCGF pitkän ajan jatkuvassa viljelyssä.

Yllämainitut ominaispiirteet osoittavat, että ennentuntematto-mia ihmisen T-hybridisolulinjoja aikaansaadaan tämän keksinnön avulla. Näiden hybridisolulinjojen aikaansaamisen todistavat seuraavat seikat: saadut kloonit eivät ole kestäviä 8-atsa-guaniinin suhteen, siis toisin kuin parentaalisessa solulin-jassa, niissä on suurempi lukumäärä tumakromosomeja ja niissä esiintyy muita HLA-fenotyyppejä kuin parentaalisessa solulin-jassa.

Näin saadut keksinnön mukaiset T-hybridisolulinjat, kasvatettuna tavallisessa väliaineessa tavanmukaisella menetelmällä, voidaan kloonata, jolloin linjat voidaan erottaa erillisiksi monokloonisiksi hybridisolulinjoiksi, joista kussakin on ainakin yksi ihmisen T-solun tumakromosomi. Linjaa voidaan kasvattaa jatkuvalla viljelyllä ylläpitäen ne ominaispiirteet, jotka perustuvat ihmisen T-solusta siirtyneisiin geeneihin, ja se on säilytettävissä jäädytettynä, mikä tekee mahdolliseksi yksityiskohtaisemman tutkimuksen ihmisen T-solujen suhteen. Kloonit käsittävät sellaisia, jotka kykenevät tuottamaan erilaisia lymfokiinejä, erikoisesti aputekijöitä, kuten kasvutekijää TCGF, jotka erittyvät ihmisen T-soluista ja joilla tunnetusti on tärkeä osuus immuunivasteen säätämisessä, niin että tällaisia klooneja aikaansaamalla on mahdollista tuottaa suuria määriä lymfokiinejä in vitro helposti ja nopeasti sekä siten aikaansaada uusia keinoja immunointisysteemin sairausten diagnoosia ja käsittelyä varten.

Yksityiskohtainen selostus esitetään yhdestä ihmisen T-hybridi-solulinjasta, joka on keksinnön mukaisesti aikaansaatu ja eristetty, nimittäin kloonista 24-A. Kuten seuraavista esimerkeistä ilmenee, tämä klooni on eräs niistä hybridoma-soluista, 7611 8 17 jotka on saatu yhteensulauttamalla parentaalinen solulinja ja ihmisen T-soluja, jotka on saatu perifeerisistä veri-imusoluista, ja jolla kloonilla on erilaisia yhteisiä ominaisuuksia yllämainittujen hybridisolulinjojen kanssa. Erikoisesti kloonin tumakromosomilukumäärä on välillä 79-97 (keskimäärin 89). Kloonissa esiintyy HLA-fenotyyppejä A2, AW24, Ali, B5, B8, B37 ja BW22, joihin sisältyvät parentaali-sen solulinjan fenotyypit (A2, Ali, B8, B37 ja BW22) sekä myös ihmisen T-solun fenotyypit (A2, AW24, B5 ja B40) paitsi B40. Kloonatulla solulinjalla on kuvioissa 1-4 esitetyt mitogeeni-herkkyydet. Niinpä tämän solulinjan kasvatus tulee ehkäistyksi melkein kokonaan mitogeenin PHA pitoisuuden ollessa 1 % ja myös mitogeenin PWM pitoisuuden ollessa välillä 0,5-1 %.

Kloonille on edelleen tunnusomaista suuri TCGF-aktiivisuus, kuten ilmenee esimerkeistä sekä kuvioista 5 ja 6.

Kun edellä selostettua keksinnön mukaista kloonia viljellään yllämainitun sopivan väliaineen kanssa, ihmisen T-solun kasvutekijää (TCGF) voidaan kerätä pinnalle nousevasta nesteestä. Niinpä tämä keksintö aikaansaa myös uuden menetelmän tekijän TCGF tuottamiseksi. Menetelmää selostetaan yksityiskohtaisesti eräässä seuraavista esimerkeistä.

Koska uutta yhteensulautettua solulinjaa, jolla on kyky tuottaa tekijää TCGF, ei hyväksytty talletettavaksi laitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japani, patentinhakijat säilyttävät linjan näytettä sellaisissa olosuhteissa, että sitä on julkisesti saatavissa. Yksi näyte talletettiin 1981-06-30 laitokseen ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., 20852, USA, ja sille on annettu ATCC-n:o HB8082.

Keksintöä selostetaan yksityiskohtaisemmin viitaten seuraa-viin esimerkkeihin, jotka koskevat parentaalisen solulinjan valmistusta, ihmisen T-solujen eristämistä, tällaisten solujen fuusiota sekä saatujen yhteensulautettujen linjojen koestusta.

ie 7 6118

Esimerkki 1 HGPRT-vajaitten ihmisen leukeemlsten T-solujen valmistus Ihmisen leukeemista T-solulinjaa, jonka on toimittanut Dr. Minowada, RPMI, Buffalo, viljellään väliaineessa RPMI 1640 (Flow Laboratories), joka sisältää 10 % seerumia FCS (Centaurus, Biological Co., Lot No. 527).

CCRF-CEM-solut suspendoidaan pitoisuudella 1 x 10^ solua/ml väliaineeseen RPMI 1640, joka sisältää 2 ^um 8-atsaguaniinia ja muunnettu lisäämällä 10 % seerumia FCS. 10 ml:n erä suspensiota viedään viljelypulloon (Corning Glass Works, Corning,

New York, USA), jota pidetään lämpökaapissa vaakasuorassa asennossa lämpötilassa 37°C 1 viikon ajan suspension haudottami-seksi, samalla johtaen 5 % hiilidioksidia ja 95 % ilmaa sisältävää seosta sen läpi. Eloonjääneet solut kerätään, suspendoidaan pitoisuudella 1 x 106 solua/ml samantyyppiseen väliaineeseen, joka sisältää kaksinkertaisen pitoisuuden eli 4 yUM 8-atsaguaniinia, ja niitä viljellään samalla tavoin 1 viikon ajan. Edellisessä viljelyssä eloonjääneitä soluja viljellään joka viikko käyttämällä aina tuoretta väliainetta, jonka 8-Ag-pitoisuus lisättiin joka viikko noin kaksinkertaiseksi (ts. 2 —► 4 —t 8 —*16 —*32 —*50 —* 75 —^ 100 ^uM) , joten lopuksi eloonjääneitä soluja saadaan väliaineeseen, joka sisältää 100 ^uM 8-atsaguaniinia. Siten haluttu 8-atsaguaniinin suhteen kestävä solulinja aikaansaadaan noin 8 viikossa.

D

Linjan merkintänä on "CEM-AG ". Linja kasvaa sen jälkeen nopeasti väliaineessa RPMI 1640, joka sisältää 8-atsaguaniinia samalla pitoisuudella (100 ^-uM) ja joka on muunnettu lisäämällä 10 % seerumia FCS, ja siitä lähtien linjaa pidetään samassa väliaineessa jatkuvasti viljeltäessä. Linjalla on samat sytologiset ja muut ominaispiirteet kuin aikaisemmin on selostettu.

Esimerkki 2

Ihmisen T-solujen valmistelu ja eristäminen (1) Perifeerisen veren T-solut 50 ml heparinoitua verta, joka on kerätty terveestä aikuisesta ihmisestä, lingotaan käyttäen imusolujen erotusnestettä sekä 7611 8 19 tiheysgradienttia ("Ficoll-Paque", tuottaja Pharmacia Japan 7

Co., Ltd., Japani) perifeerisen veren 5 x 10 imusolun eristämiseksi. T-solut eristetään imusoluista rosettoimalla neurami-nidaasilla käsiteltyjen lampaan punasolujen (SRBC) /T. Hirano, Τ’. Kuritani, T*. Kishimoto & T. Yamamura, J. Immunol., 119, 1235-1241 (19772/· Näin valmistetuista perifeerisen veren T-soluista käytetään nimitystä "stimuloimaton PBL-T".

g

Stimuloimattomat PBL-T-solut (1 x 10 solua/ml) stimuloidaan käyttäen 10 ^ug/ml mitogeeniä Con A ja 25 ^ug/ml mitogeeniä PPD tai mitogeeniä Pro A 48 tunnin ajan sellaisten stimuloitujen T-solujen aikaansaamiseksi, joille käytetään vastaavasti nimityksiä "Con A-stimuloitu PBL-T", "PPD-stimuloitu PBL-T" tai "Pro-A-stimuloitu PBL-T.

(2) Kltarisasta poistetut T-solut

Sellaisen potilaan kitarisoista poistettu risa, jolla on krooninen kitarisantulehdus, leikataan pieniksi palasiksi, joista käyttämällä MEM-väliainetta, joka sisältää hepariinia 10 yk-sikköä/ml ja 4 ^ug/ml ainetta amfoterisiini-B (Sankyo Co., Ltd.,

Japani), saadaan kitarisasoluja. Soluja lingotaan Ficoll- 8

Paque'n tiheysgradienttimenetelmällä 5 x 10 risaimusolun eristämiseksi. Risa-T-solut eristetään niistä samalla tavoin kuin edellä kohdassa (1) rosettoimalla neuraminidaasilla käsiteltyjen lampaan punasolujen kanssa. Solut (1 x 106 solua/ml väliaineessa MEM) stimuloidaan käyttäen mitogeeniä Con A 48 tunnin ajan stimuloitujen risa-T-solujen aikaansaamiseksi, joille soluille käytetään merkintää "Con A-stimuloitu risa-T".

(3) Keuhkopussin effuusiosta saadut T-solut

Imusoluja erotetaan tuberkuloosia sairastavan potilaan keuhko-pussin effuusiosta. Tarkemmin määritellen, 10O ml keuhkopussin effuusiota kerätään potilaasta rintaontelon punktiomene-telmällä, minkä jälkeen effuusiota lingotaan 5 minuutin ajan nopeudella 1500 rpm, se pestään kaksi kertaa MEM-väliaineella, joka sisältää hepariinia 10 yksikköä/ml, ja sitä lingotaan 20 7 61 1 8

Q

Ficoll-Paque'n tiheysgradienttimenetelmällä 3 x 10 imusolun eristämiseksi effuusiosta. T-solut saadaan effuusiosta samalla tavoin kuin edellä kohdassa (1). Soluja (1 x 106/ml) stimuloidaan 48 tunnin ajan käyttäen 25 ^ug/ml mitogeeniä PPD. Näin saaduille soluille käytetään nimitystä "PPD-stimu-loitu PE-T".

Esimerkki 3

Parentaalisten solujen ja ihmisen T-solujen fuusiointi, fuusioitujen solujen valinta ja kloonaus_

R

Parentaalisia soluja CEM-AG pidetään vilkkaan kasvun tilassa vaihtamalla päivittäin väliaine (RPMI 1640 + 10 % FCS + 100 ^uM 8-AG) kolmen päivän edeltävää fuusiota varten.

R 7 CEM-AG -soluja (1 x 10 ) ja kutakin esimerkissä 2 saatua ihmi- 7 sen T-solutyyppiä (2 x 10 ) käytetään fuusioon. Solut pestään kolme kertaa FCS-vapaalla MEM-väliaineella säilyttäen lämpötila arvossa 37°C, minkä jälkeen ne sekoitetaan perusteellisesti keskenään 50 ml:n kartiomaisessa putkessa ja niitä lingo-taan lO minuutin ajan nopeudella 1000 rpm. Nesteestä erotettuja solupalloja ravistetaan kevyesti, ja niille viedään 0,3 ml lämpötilaan 37°C kuumennettua 45 %:sta PEG-6000 (Koch-Light Co., Englanti). Sitten palloja ravistetaan perusteellisesti ja sen jälkeen niiden annetaan seistä lämpötilassa 37°C 6 minuutin ajan inkubaattorissa, joka sisältää 5 % hiilidioksidia ja 95 % ilmaa. FCS-vapaata MEM-väliainetta (kuumennettuna lämpötilaan 37°C) viedään inkubaattoriin nopeudella 2 ml/min., kokonaismäärän ollessa 12 ml. Edelleen 25 ml MEM-väliainetta lisätään nopeasti seokseen, saatua seosta lingotaan nopeudella 800 rpm 10 minuutin ajan, ja pinnalle noussut neste poistetaan. Lämpötilaan 37°C kuumennettua 20 % seerumia FCS sisältävää väliainetta RPMI 1640 lisätään varovasti CEM-AGR-solujen 5 pitoisuuden säätämiseksi arvoon 2 x 10 solua/ml. 1 ml seosta viedään mikroviljelylevyn (Linbro Scientific, USA) kuhunkin 2 cm läpimitaltaan olevaan 50 syvennykseen. 24 tunnissa puolet pintanesteestä poistetaan, ja 1 ml HAT-väliainetta (väliainetta RPMI 1640 + 20 % FCS, joka sisältää 1 x 10 * M hypoksan- -7 tiinia (Sigma Chemical Co., USA), 4 x 10 M aminopteriinia 21 761 1 8 (Sigma Chemical Co., USA ja 1,6 x 10 ^ M tymidiiniä (Sigma Chemical Co., USA) viedään syvennykseen. Sama menettely toistetaan joka toinen päivä viljellen soluja inkubaattorissa 2-4 viikon ajan lämpötilassa 37°C hiilidioksidiosakaasumäärän 5 % läsnäollessa. Kasvatetut solulinjat siirretään sen jälkeen HT-väliaineeseen, joka ei sisällä aminopteriiniä (A) (vastaten HAT-väliainetta ilman aminopteriiniä), niitä inkuboi-daan vielä viikon ajan, siirretään sitten HAT-vapaaseen väliaineeseen RPMI 1640 + 10 % FCS (tavanmukainen väliaine) ja kloonataan tavallisella menetelmällä. Tarkemmin eriteltynä, viljelmä laimennetaan pitoisuuteen 1 hybridisolu/ml tavanmukaisessa väliaineessa ja tätä viedään mikrolevyn (Falcon, USA) syvennyksiin määrässä 0,2 ml/syvennys. Puolet pintanesteestä poistetaan kustakin syvennyksestä joka toinen tai kolmas päivä, ja lämpötilaan 37°C kuumennettua tuoretta tavanmukaista vilje-lyväliainetta kaadetaan syvennykseen edelleen inkubointia varten, aikaansaaden hybridisolulinjojen monoklooneja. Näin saaduilla tyypillisillä klooneilla, ts. ihmisen T-hybridisolu-linjoilla, on taulukossa 2 esitetyt ominaispiirteet.

Esimerkki 4

Viljelmän pinnalle nousevan nesteen valmistus ihmisen T-hybridisoluista_ (1) Ilman stimulointia saatu pintaneste

Esimerkissä 3 saadut hybridikloonisolut, nimittäin 24-A, säädetään pitoisuuteen 1 x 10^ solua/ml väliaineessa RPMI 1640 + 10 % FCS, viedään sen jälkeen viljelylevyn (Linbro Scientific, USA) läpimitaltaan 2 cm oleviin syvennyksiin ja viljellään 2 vuorokauden ajan lämpötilassa 37°C inkubaattorissa hiilidioksidipitoisuuden 5 % läsnäollessa. Viljelmää lingotaan 10 minuutin ajan nopeudella 3000 rpm, ja neste kerätään, suodatetaan huokoisuuden 0,45 ^um omaavalla suodattimena sterilointia varten sekä tarkistetaan lymfokiiniaktiivisuuden suhteen.

(2) Mltogeenillä Con A stimuloitu pintaneste

Neste valmistetaan menetellen samoin kuin edellä kohdassa (1), paitsi että 1 ^ug/ml mitogeeniä Con A lisätään samaan väli- 22 7 61 1 8 aineeseen kuin kohdassa (1) käytettiin. Neste tutkitaan lymfokiiniaktiivisuuden suhteen.

(3) Mitogeenillä PHA stimuloitu pintaneste Esimerkissä 3 saatujen hybridikloonisolujen 38-B pitoisuus 5 säädetään arvoon 1 x 10 solua/ml käyttämällä väliainetta RPMI 1640 + 10 % FCS + 0,1 % PHA. Viljelmän neste saadaan samalla tavalla kuin edellä kohdassa (1).

(4) Makrofaagilla stimuloitu pintaneste

Perifeerisen veren imusoluja, jotka on saatu samalla tavoin kuin esimerkissä 2-(1), viedään Petri-maljaan, ja maljaan tart-tumattomat solut huuhdellaan pois. Jäljellejääneet maljaan tarttuneet solut irrotetaan pipetoimalla liuoksella HBSS (Hank'in tasapainoitettu suolaliuos)/0,2 % EDTA (tuote, jota toimittaa Sigma, USA), ja niitä käytetään ihmisen makrofaa-geina.

Makrofaagilla stimuloitua viljelynestettä saadaan samalla tavoin kuin edellä kohdassa (3), paitsi että ihmisen makrofaa-geja lisätään väliaineeseen pitoisuudella 0,5 x 10^ solua/ml.

Esimerkki 5

Ihmisen T-hybridisolulinjoista saadun pinnalle nousseen vilje- lynesteen lymfokiiniaktiivisuuden analysointi__

Esimerkissä 4 valmistetut viljelynesteet testataan lymfokiiniaktiivisuuden suhteen seuraavilla menetelmillä.

(1) Koe 1, joka koskee kloonista 24-A saadun viljelynesteen TCGF-aktllvisuutta__

Kateenkorvasoluja sisältäviä paloja otetaan 5-6 viikon ikäisistä BALB/C-hiiristä (Shizuoka Agricultural Cooperative Association for Laboratory Animals, Japani), ne leikellään pieniksi palasiksi, jotka pestään kaksi kertaa MEM-vällaineella ja suspendoidaan 10 % FCS sisältävään väliaineeseen RPMI 1640 muodostaen solususpensio, jonka pitoisuus on 1 x 10^ solua/ml. Esimerkissä 4-(l) tai (2) kloonista 24-A saatu pintaneste lisätään 0,1 ml:n erään suspensiota (1 x 105 solua), ja seos 23 76118 . 3 viedään tasopohjäiseen 0,2 ml:n mikrolevyyn (Falcon). H- 3 3 tymidiiniä ( H-tymidiiniä ( H-TdR) 0,5 ^,uCi/syvennys lisätään seokseen viimeisen 6 tunnin aikana, ja kateenkorvasoluja haudotetaan Con A-määrän 2 ,ug/ml läsnäollessa stimulointia varten.

/ 3

3 vuorokauden kuluttua viljelmä tarkastetaan H-TdR

D

sisällön suhteen. Soluista CEM-AG , ts. parentaalisesta solulinjasta saatu viljelyneste koestetaan samalla tavalla. Tulokset on esitetty kuviossa 5, jossa H-TdR

-3 lukema (C.P.M. x 10 ) on merkitty pystyakselille. Kohdas sa A on tulos, joka on saatu käyttämättä mitään viljelyn pinta- nestettä, kohdassa B samalla tavalla saadut tulokset käyttämäl- £ lä esimerkin 4-(l) pintanestettä ja solujen CEM-AG pinta-nestettä (jälkimmäinen esitetty viivoitettuna pylväänä, samoin kuin seuraavassa), kohdassa C samalla tavalla saadut tulokset g käyttämällä esimerkin 4-(2) pintanestettä ja solujen CEM-AG pintanestettä, sekä kohdassa D on tulos, joka on saatu käyttämällä 1 yug/ml pelkkää mitogeeniä Con A viljelynesteen sijasta. Kaikki tulokset (A)-(D) on ilmoitettu kolmen samanlaisen kokeen keskiarvoina + standardipoikkeama. Kuviosta 5 ilmenee, että kloonista 24-A saadut viljelynesteet (viivoittamattomat pylväät B ja C) aiheuttavat hiiren kateenkorvasolujen huomattavan lisäkasvun stimuloituna mitogeenillä Con A ja että tämä aktiivisuus on erikoisen suuri tapauksessa C saavutettuna käyttäen pintanestettä, joka on valmistettu stimuloimalla kloonia

O

24-A mitogeenillä Con A. Nähdään, että solujen CEM-AG tapauksessa ei kumpikaan stimuloimatta valmistettu pintaneste eikä mitogeenillä Con A stimuloimalla valmistettu pintaneste aikaansaa mitään T-solun kasvutekijää.

(2) Koe 2, joka koskee kloonista 24-A saadun viljelynesteen TCGF-aktiivisuutta___ '_ 50 ml:n erä esimerkissä 4-(l) saatua pintanestettä väkevöidään ja viedään sen jälkeen kolonnin Sephadex G-100 (Pharmacia, Ruotsi) läpi sellaisen fraktion aikaansaamiseksi, jonka mole-kyylipaino on välillä n. 13000 - n. 20000. Fraktio väkevöidään tilavuuteen 5 ml membraaneilla Amicon YM-5 (Amicon Corporation, Lexington, Mass.) puoliksi puhdistetun nesteen valmistamiseksi. Samalla tavoin puoliksi puhdistettua pintanestettä 24 761 1 8

D

valmistetaan parentaalisesta solulinjasta CEM-AG .

Aineesta TCGF riippuva ihmisen sytotoksinen T-solulinja valmistetaan MLC (yhdistetty imusoluviljely)-reaktiolla ihmisen normaalien perifeerisen veren T-solujen ja mitomysiinillä käsiteltyjen CESS-solujen (ihmisen B-soluja, jotka on muunnettu EB-viruksella ja joita toimittaa Dr. Peter Ralph, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, USA) välillä sekä inkuboimalla saatua viljelmää aineessa TCGF (raaka TCGF, joka on saatu viljelemällä 1 x 10 ihmisen kita-risaimusolua PHA-pitoisuuden 0,1 % läsnäollessa 2 vuorokauden ajan ja erottamalla pintaneste käyttöä varten).

Sytotoksista solulinjaa (3 x 10^) viljellään puoliksipuhdiste-tun pintanesteen läsnäollessa 24 tunnin ajan (C02~inkubaatto-rissa lämpötilassa 37°C käyttäen väliainetta RPMI 1640 + 10 % FCS) , ja H-TdR pulsseja 0,5 ^,uCi annetaan 3-8 tunnin ajan. Puoliksipuhdistettua nestettä laimennetaan sar-joittain H-TdR-sisällön laskemiseksi TCGF-aktiivisuuden määritystä varten. Tulokset on esitetty kuviossa 6, jossa nesteen laimennus on merkitty vaaka-akselille, 1 tarkoittaa laimennettavan nesteen alkuperäistä väkevyyttä ja O on kontrolli-koe, jossa ei lainkaan nestettä käytetty. Viivoitetut pylväät edustavat ensiksi valmistettua puoliksipuhdistettua pin- g tanestettä ja viivoittamattomat pylväät soluista CEM-AG saa- 3

tua puoliksipuhdistettua pintanestettä. Tymidiinin H-TdR

-3 lukema (C.P.M. x 10 ) on merkitty pystyakselille.

Kaikki esitetyt tulokset ovat kolmesta viljelystä saatuja keskiarvoja + standardipoikkeama.

Kuviosta 6 ilmenee, että keksinnön mukainen kloonista 24-A saadusta viljelynesteestä valmistettu puoliksipuhdistettu fraktio, jonka molekyylipaino on välillä 13000-20000, ylläpitää aineesta TCGF riippuvan ihmisen sytotoksisen T-solulinjan lisäkasvun ja että aktiivisuus riippuu liukoisen tekijän pitoisuudesta. Nähdään myös, että parentaalisesta solulinjasta 25 7611 8 g CEM-AG saatu fraktio, jolla on likimain sama molekyylipaino kuin edellisellä fraktiolla, ei osoita mitään kasvamis-aktiivisuutta millään pitoisuudella.

(3) Koe, joka koskee kloonista 38-B saadun viljelynesteen TCGF-aktii visuutta__

Esimerkissä 4-(3) ja (4) saatuja viljelynesteitä testataan TCGF-aktiivisuuden suhteen samalla tavalla kuin edellä kohdassa (2) määrityssysteemillä, jossa käytetään aineesta TCGF riippuvaa sytotoksista T-solulinjaa. Tulokset on esitetty taulukossa 3, jossa ryhmät A-H tarkoittavat seuraavaa: A: Kontrolliryhmä ilman mitään lisäystä.

B: Ryhmä, jossa lisäyksenä on esimerkissä 4-(4) saatu pinta- neste.

p C: Ryhmä, jossa lisäyksenä on kantasolun CEM-AG viljelyneste, joka on saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 4-(4).

D: Ryhmä, jossa lisäyksenä on esimerkissä 4-(3) saatu pinta- neste.

p E: Ryhmä, jossa lisäyksenä on kantasolun CEM-AG viljelyneste, joka on saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 4-(3).

F: Ryhmä, jossa lisäyksenä on ihmisen makrofaageja, joiden 5 tiheys on 0,5 x 10 solua/ml, sekä mitogeeniä PHA (0,1 %).

G: Ryhmä, jossa lisäyksenä on PHA (0,1 %).

H: Ryhmä, jossa lisäyksenä on epäkypsä TCGF (0,5 yksikköä), joka on saatu viljelemällä ihmisen risaimusoluja (1 x 10® solua/ml) PHA-pitoisuuden 0,1 % läsnäollessa 2 vuorokauden ajan. (TCGF-aktiivisuus 1 x 10® PHA-stimuloidusta solusta on määritetty yhtenä TCGF-yksikkönä).

26 7 61 1 8

Taulukko 3

Ryhmä ^H-TdR-yhteytys (cpm) A 1936 + 838 B 5131 + 1684 C 2291 + 865 D 2170 + 628 E 1844 + 698 F 1995 + 1098 G 711 + 74 H 4214 + 333

Taulukko 3 esittää sellaisen viljelynesteen TCGF-aktiivisuuden, joka on saatu keksinnön mukaisesti ihmisen makrofaagi-stimuloidusta kloonista 38-B. Kantasolulinjasta CEM-AG saatu pintaneste ei osoita TCGF-aktiivisuutta.

Claims (6)

27 / 61 1 8

1. Menetelmä ihmisen HGPRT-vajaan leukeemisen T-solulin-jan ATCC CRL-8081 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään ihmisen leukeemista T-solulinjaa CCRF-CEM 8-atsa-guaniidia sisältävässä väliaineessa ja otetaan talteen mainittu ihmisen HGPRT-vajaa leukeeminen T-solulinja, ATCC CRL-8081.

2. Menetelmä ihmisen T-hybridisolulinjän valmistamiseksi, tunnettu siitä, että fuusioidaan HGPRT-vajäitä ihmisen leu-keemisia T-soluja ATCC CRL-8081 normaalien ihmisen T-solujen kanssa käyttäen fuusionpromoottoria.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä lisäksi kasvatetaan selektiivisesti hybri-disoluja, jotka on saatu HGPRT-vajäiden ihmisen leukeemisten T-solujen ATCC CRL-8081 fuusiosta ihmisen normaalien T-solujen kanssa selektiivisessä väliaineessa.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selektiivinen väliaine sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hybridisolut kloonataan hybridisolulinjän ATCC HB8082 muodostamiseksi, jolla on kyky tuottaa lymfokiiniä.

6. Menetelmä lymfokiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään lymfokiinin muodostamiseksi hybridisolulinjaa ATCC HB8082, joka on muodostettu fuusioimalla hypoksantiini-guaniinifosforiboeyylitransferaasi (HGPRT)-vajaa ihmisen leukeeminen T-solulinja ATCC CRL-8081 normaalien ihmisen T-solujen kanssa.