JPS61231995A - 永久的なヒト組織球細胞系統の突然変異体 - Google Patents
永久的なヒト組織球細胞系統の突然変異体Info
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- JPS61231995A JPS61231995A JP61076817A JP7681786A JPS61231995A JP S61231995 A JPS61231995 A JP S61231995A JP 61076817 A JP61076817 A JP 61076817A JP 7681786 A JP7681786 A JP 7681786A JP S61231995 A JPS61231995 A JP S61231995A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は他の細胞の無限生存化に用いられつる酵素欠乏
性のヒトの永久的な細胞系統に関する。永久的な細胞系
統の細胞との融合による細胞の無限生存化の技術は久し
い以前から知られている。かかるハイブリッド細胞また
はハイブリドーマは例えば血球を腫瘍細胞と融合させる
ことにより得られろ。Ｋ６ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ氏により記載されたような（Ｎａｔｕｒｅ ２５６
４９５〜４９７（１９７５） ）古典的な方法では、永
久的に生育する腫瘍細胞としてのマウスのミエローマ細
胞をマウスのＢ−リンパ球と融合させた。かかる融合か
ら生育するノ・イブリッド細胞は例えばかかるハイブリ
ッド細胞培養物の培養上澄みから簡単にそして大量に単
離されつる物質を分泌しうる。Ｂ−リンノぐ球とミエロ
ーマ細胞との融合の場合は、ノ・イブリッド細胞は均質
な抗体集団（モノクローナル抗体）を産生じ、その場合
適当な選択法により所望の特異性を有するモノクローナ
ル抗体を産生ずるかかるノ・イブリッド細胞クローンが
単離されそしてさらに培養されつる。
性のヒトの永久的な細胞系統に関する。永久的な細胞系
統の細胞との融合による細胞の無限生存化の技術は久し
い以前から知られている。かかるハイブリッド細胞また
はハイブリドーマは例えば血球を腫瘍細胞と融合させる
ことにより得られろ。Ｋ６ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ氏により記載されたような（Ｎａｔｕｒｅ ２５６
４９５〜４９７（１９７５） ）古典的な方法では、永
久的に生育する腫瘍細胞としてのマウスのミエローマ細
胞をマウスのＢ−リンパ球と融合させた。かかる融合か
ら生育するノ・イブリッド細胞は例えばかかるハイブリ
ッド細胞培養物の培養上澄みから簡単にそして大量に単
離されつる物質を分泌しうる。Ｂ−リンノぐ球とミエロ
ーマ細胞との融合の場合は、ノ・イブリッド細胞は均質
な抗体集団（モノクローナル抗体）を産生じ、その場合
適当な選択法により所望の特異性を有するモノクローナ
ル抗体を産生ずるかかるノ・イブリッド細胞クローンが
単離されそしてさらに培養されつる。
ハイブリッド細胞がどの物質を産生じつるかは原則的に
は融合に用いられた融合相手細胞の如何による。マウス
のＢ−リンパ球をミエローマ細胞と融合させるとかかる
ハイブリッド細胞から産生される物質はネズミ科起原の
モノクローナル抗体であるが、一方ミエローマ細胞の融
合相手としてヒトの３〜９７２球を用いる場合は、それ
により生成するハイブリッド細胞は用いられたミエロー
マ細胞がヒトまたはネズミ科起原のものであるか、また
は異種ハイブリッド細胞（人間／マウス）でさえあるか
に拘らず人間の免疫グロブリンのすべての特性を有する
抗体を産生ずる。
は融合に用いられた融合相手細胞の如何による。マウス
のＢ−リンパ球をミエローマ細胞と融合させるとかかる
ハイブリッド細胞から産生される物質はネズミ科起原の
モノクローナル抗体であるが、一方ミエローマ細胞の融
合相手としてヒトの３〜９７２球を用いる場合は、それ
により生成するハイブリッド細胞は用いられたミエロー
マ細胞がヒトまたはネズミ科起原のものであるか、また
は異種ハイブリッド細胞（人間／マウス）でさえあるか
に拘らず人間の免疫グロブリンのすべての特性を有する
抗体を産生ずる。
Ｂ ＋ １７７２球を永久的に生育する細胞（選択され
たミエローマ系統）と融合させるのにしばしば行われる
のと同様の方法でＴ−リンパ球を適当な融合相手と融解
させることも同様に行われる（Ｊ、 Ｅｘｐ、、Ｍｅｄ
、 １５４１８２；７−１８３７（１９８１）参照）。
たミエローマ系統）と融合させるのにしばしば行われる
のと同様の方法でＴ−リンパ球を適当な融合相手と融解
させることも同様に行われる（Ｊ、 Ｅｘｐ、、Ｍｅｄ
、 １５４１８２；７−１８３７（１９８１）参照）。
かかるハイブリドーマ細胞が産生ずる物質はＴ−細胞の
性質に応じて’Ｉ’ −リンパ球により産生されうるよ
うな因子である。かかる因子は例えばインターロイキン
、インターフェロン、リンフ才力インおよび他の直接ま
たは間接的に免疫調節作用する物質でありうる。Ｂ−細
胞ハイブリドーマに匹敵する方法でかかるハイブリッド
も同様にこれら因子の産生源として使用でき、その際適
当な選択および試験法により専ら、または特に大量に所
望の物質を産生ずるかかるハイブリッド細胞がクローニ
ングされそしてさらに培養されつる。
性質に応じて’Ｉ’ −リンパ球により産生されうるよ
うな因子である。かかる因子は例えばインターロイキン
、インターフェロン、リンフ才力インおよび他の直接ま
たは間接的に免疫調節作用する物質でありうる。Ｂ−細
胞ハイブリドーマに匹敵する方法でかかるハイブリッド
も同様にこれら因子の産生源として使用でき、その際適
当な選択および試験法により専ら、または特に大量に所
望の物質を産生ずるかかるハイブリッド細胞がクローニ
ングされそしてさらに培養されつる。
Ｂ−リンパ球とミエローマ細胞との融合とまさに同様に
Ｔ ＋ ＩＪンパ琢についてもこれまでわずかな永久的
な細胞系統しか適当な融合相手として証明されていない
。適当な融合相手としては、適当な相手細胞と融合でき
そして融合後に・・イブリッド細胞として所望の物質を
分泌できそして相手の細胞からもまた融合により生成し
たハイブリッド細胞からも分離されつる永久的に生育す
る細胞系統が考えられる。原則的には相当する融合相手
からのノ・イブリッド細胞の分離にはあらゆる区別用基
準（例えば表面抗原でもあるような異なるマーカー）が
利用されつる。
Ｔ ＋ ＩＪンパ琢についてもこれまでわずかな永久的
な細胞系統しか適当な融合相手として証明されていない
。適当な融合相手としては、適当な相手細胞と融合でき
そして融合後に・・イブリッド細胞として所望の物質を
分泌できそして相手の細胞からもまた融合により生成し
たハイブリッド細胞からも分離されつる永久的に生育す
る細胞系統が考えられる。原則的には相当する融合相手
からのノ・イブリッド細胞の分離にはあらゆる区別用基
準（例えば表面抗原でもあるような異なるマーカー）が
利用されつる。
しかしながら特に適当な選択法としては融合相手と比較
してハイブリッド細胞の生育性質の変化を利用する操作
があげられる。この目的には永久的な生育を保証するこ
とが意図されそしてその生育性質が変えられている細胞
として、例えば母細胞と比較してヒポキサンチン−グア
ニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを合成できな
い（ＨＧＰＲＴ−一突然変異体）という特定の酵素欠乏
を有する永久的な細胞系統の突然変異体が用いられつる
。永久的な細胞系統のかかる酵素欠乏した突然変異体は
適当なヒポキサンチン−アミプテリン−チミジン選択培
地（ＨＡＴ培地）中で生存できない。かかる酵素が欠乏
した突然変異体および例えば血球でありうるような、か
かる欠陥を伴わない細胞からのノ・イブリドーマのみが
かかる選択培地中で生存しつる。他の知られた方法と比
較してかかる選択法は永久的に生育する細胞系統の細胞
からのノ・イブリッド細胞を単離するためには極度に効
果的な方法である。しかしながら適当な酵素が欠乏した
融合しつる永久的に生育する細胞系統を入手しうること
はこの方法を用いるための前提条件である。
してハイブリッド細胞の生育性質の変化を利用する操作
があげられる。この目的には永久的な生育を保証するこ
とが意図されそしてその生育性質が変えられている細胞
として、例えば母細胞と比較してヒポキサンチン−グア
ニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを合成できな
い（ＨＧＰＲＴ−一突然変異体）という特定の酵素欠乏
を有する永久的な細胞系統の突然変異体が用いられつる
。永久的な細胞系統のかかる酵素欠乏した突然変異体は
適当なヒポキサンチン−アミプテリン−チミジン選択培
地（ＨＡＴ培地）中で生存できない。かかる酵素が欠乏
した突然変異体および例えば血球でありうるような、か
かる欠陥を伴わない細胞からのノ・イブリドーマのみが
かかる選択培地中で生存しつる。他の知られた方法と比
較してかかる選択法は永久的に生育する細胞系統の細胞
からのノ・イブリッド細胞を単離するためには極度に効
果的な方法である。しかしながら適当な酵素が欠乏した
融合しつる永久的に生育する細胞系統を入手しうること
はこの方法を用いるための前提条件である。
本発明は細胞系統Ｕ−９５７の突然変異体として（Ｉｎ
ｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ １７５６５〜５７７ （１
９７＜Ｓ）参照）ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼを合成できずそしてそれゆえ
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含有する
培地（ＨＡＴ−培地）中で生育できず死滅する融合しつ
る細胞系統の調製について記載するものである。リンパ
球にとっての融合相手として利用されつるこれまで知ら
れたＨＧＰＲＴ−一細胞系統と対照的に本発明において
記載される細胞系統Ｕ−９５７のＨＧＰＲＴ−一突然変
異体は単球との融合に使用されつる。
ｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ １７５６５〜５７７ （１
９７＜Ｓ）参照）ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼを合成できずそしてそれゆえ
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含有する
培地（ＨＡＴ−培地）中で生育できず死滅する融合しつ
る細胞系統の調製について記載するものである。リンパ
球にとっての融合相手として利用されつるこれまで知ら
れたＨＧＰＲＴ−一細胞系統と対照的に本発明において
記載される細胞系統Ｕ−９５７のＨＧＰＲＴ−一突然変
異体は単球との融合に使用されつる。
単球は種々の物質を分泌し、そのうちインターロイキン
またはリンフ才力インおよびＴＮＦ （腫瘍壊死因子）
のようなものを比較的大量に調製しうるものが望ましい
であろう。この目的には永久的に生育する単球−ハイブ
リッドが適当である。
またはリンフ才力インおよびＴＮＦ （腫瘍壊死因子）
のようなものを比較的大量に調製しうるものが望ましい
であろう。この目的には永久的に生育する単球−ハイブ
リッドが適当である。
Ｂ−・リンパ球に対する知見は他の免疫能細胞に対する
知見と比較すると非常に大きいが蓄線動物および人間に
おける’ｌ’ ＋ １７７、Ｊ球および単球の性質の研
究は以下の事実により困難である。
知見と比較すると非常に大きいが蓄線動物および人間に
おける’ｌ’ ＋ １７７、Ｊ球および単球の性質の研
究は以下の事実により困難である。
すなわち’ｌ’ ＋ １７ンパ球および単球中においで
ある種の機能上の活性が誘発されうるとしても、この刺
激は他の非特異的な効果を誘発しうる措置を必要とする
。さらに１刺激の再現性が低（そして限定された量のみ
の分泌された生成物しか得られない。刺激される細胞集
団も正確には限定され得ない、何故なら限定された生育
速度しか有しない少数の細胞のみしか入手できないから
である。少数の他の細胞型自体の存在は、夾雑する小さ
い割合の細胞自体が驚（べき生物学的効果をひき起しつ
るという事実にかんがみ無視できない。
ある種の機能上の活性が誘発されうるとしても、この刺
激は他の非特異的な効果を誘発しうる措置を必要とする
。さらに１刺激の再現性が低（そして限定された量のみ
の分泌された生成物しか得られない。刺激される細胞集
団も正確には限定され得ない、何故なら限定された生育
速度しか有しない少数の細胞のみしか入手できないから
である。少数の他の細胞型自体の存在は、夾雑する小さ
い割合の細胞自体が驚（べき生物学的効果をひき起しつ
るという事実にかんがみ無視できない。
Ｂ−細胞ハイブリッド細胞と反対に単球ハイブリッドに
は免疫グロブリン検出のような単一の試験系は何ら可能
でない。未知の因子についてはこれまで骨の折れる官能
試験系でのみ試験できた。それゆえ単球との融合により
、単球の機能研究におけるこれらの困難を克服する永久
的に生育する単球ハイブリッドを調製することを許容す
る永久的な細胞系統の必要が存在した。
は免疫グロブリン検出のような単一の試験系は何ら可能
でない。未知の因子についてはこれまで骨の折れる官能
試験系でのみ試験できた。それゆえ単球との融合により
、単球の機能研究におけるこれらの困難を克服する永久
的に生育する単球ハイブリッドを調製することを許容す
る永久的な細胞系統の必要が存在した。
驚くべきことに、細胞系統Ｕ−９５７の細胞をエチルメ
タンスルホネート（ＥＭＳ）で処理しそしてこの細胞を
６−チオグアニンの増大する濃度で処理しそしてそれぞ
れに生き残る細胞を分離することにより、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ ： ＥＣ２，４，２，８）を合成せずそして
ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有
する培地（ＨＡＴ−培地）中で生育できず死滅する突然
変異した細胞を得ることができた。
タンスルホネート（ＥＭＳ）で処理しそしてこの細胞を
６−チオグアニンの増大する濃度で処理しそしてそれぞ
れに生き残る細胞を分離することにより、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ ： ＥＣ２，４，２，８）を合成せずそして
ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有
する培地（ＨＡＴ−培地）中で生育できず死滅する突然
変異した細胞を得ることができた。
それゆえ本発明はヒポキサンチン−グアニン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼが欠乏しておりそしてヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培
地（）ＬＡＴ−培地）中で死滅するものである永久的な
ヒト組織球細胞系統Ｕ−９３７の突然変異体に関する。
ボシルトランスフェラーゼが欠乏しておりそしてヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培
地（）ＬＡＴ−培地）中で死滅するものである永久的な
ヒト組織球細胞系統Ｕ−９３７の突然変異体に関する。
この突然変異体の細胞は単球との融合相手として適当で
ある。この方法で調製されたハイブリッドは単球から細
胞培養物中に分泌されるインターロイキンまたはＴＮＦ
のような物質を得るのに適する。Ｕ−９３７の前記した
突然変異体は適当なハイブリッドを得るための中間生成
物と見なされつる。
ある。この方法で調製されたハイブリッドは単球から細
胞培養物中に分泌されるインターロイキンまたはＴＮＦ
のような物質を得るのに適する。Ｕ−９３７の前記した
突然変異体は適当なハイブリッドを得るための中間生成
物と見なされつる。
この突然変異体を得るには細胞系統Ｕ−９３７の細胞な
ＲＰＭ１１６４０のような培地中で抗生物質および場合
により仔牛脂児血清を添加して生育せしめる。対数的な
生育を保証するには、細胞の濃度は５ Ｘ １０５／ｍ
をこえるべきでない。培地は毎週２回交換された。
ＲＰＭ１１６４０のような培地中で抗生物質および場合
により仔牛脂児血清を添加して生育せしめる。対数的な
生育を保証するには、細胞の濃度は５ Ｘ １０５／ｍ
をこえるべきでない。培地は毎週２回交換された。
細胞を突然変異させるにはそれらを約１００μ？／−の
エチルーメタンースルホネートヲ含有スル培地中で約１
２時間培養した。次に細胞を通常の生育培地巾約３日間
増殖させた。
エチルーメタンースルホネートヲ含有スル培地中で約１
２時間培養した。次に細胞を通常の生育培地巾約３日間
増殖させた。
突然変異した細胞を選択するには次にＲＰＭＩ培地中の
細胞の懸濁液に６−チオグアニン０．５μ？／−を加え
た。細胞の９０−以上が死滅すると、１２−０−テトラ
−デカノイル−ホルボール−１６−アセテート（ＴＰＡ
）をｔ２ Ｘ １０−９モＶｔの濃度で含有する新た
な培地を３日間添加した。これにより生存する細胞が培
養容器の底に付着し、一方死滅した細胞は懸濁液中に残
存しておりそして液体で流し去ることができた。分離さ
れた生存する細胞が６−チオグアニンの存在下に指数関
数的生育を示す場合は、６−チオグアニンの存在下に指
数関数的生育を示す場合は６−チオグアニンの濃度を倍
にしそし、て生存する細胞の分離についてまさにここに
記載された方法を反復した。細胞を６−チオグアニンの
増大してゆく濃度で約３か月間処理し生存する細胞をそ
れぞれ取得すると約６５μ？／−の６−チオグアニンを
含有する培地中で生育する細胞集団が得られた。
細胞の懸濁液に６−チオグアニン０．５μ？／−を加え
た。細胞の９０−以上が死滅すると、１２−０−テトラ
−デカノイル−ホルボール−１６−アセテート（ＴＰＡ
）をｔ２ Ｘ １０−９モＶｔの濃度で含有する新た
な培地を３日間添加した。これにより生存する細胞が培
養容器の底に付着し、一方死滅した細胞は懸濁液中に残
存しておりそして液体で流し去ることができた。分離さ
れた生存する細胞が６−チオグアニンの存在下に指数関
数的生育を示す場合は、６−チオグアニンの存在下に指
数関数的生育を示す場合は６−チオグアニンの濃度を倍
にしそし、て生存する細胞の分離についてまさにここに
記載された方法を反復した。細胞を６−チオグアニンの
増大してゆく濃度で約３か月間処理し生存する細胞をそ
れぞれ取得すると約６５μ？／−の６−チオグアニンを
含有する培地中で生育する細胞集団が得られた。
この方法で得られた６−チオグアニン抵抗性ノ細胞は６
５μＶ−の６−チオグアニンを含有する培地からクロー
ニングされた。平行して、かかるクローンがＨＡＴ−培
地中４８時間以内で死滅することも確認された。かかる
細胞集団から次に単一の細胞がクローニングされた。か
かるクローンは次に単球と融合されて相当するハイブリ
ッド細胞が得られうる。
５μＶ−の６−チオグアニンを含有する培地からクロー
ニングされた。平行して、かかるクローンがＨＡＴ−培
地中４８時間以内で死滅することも確認された。かかる
細胞集団から次に単一の細胞がクローニングされた。か
かるクローンは次に単球と融合されて相当するハイブリ
ッド細胞が得られうる。
細胞クローンはオートラジオグラフィーおよびシンチレ
ーション分光測定によりＨＧＰＲＴ活性について検査さ
れた。標識剤としては６Ｈ−ヒポキサンチンが用いられ
た。通常のＵ−９３７細胞および培地はそれぞれ正およ
び負の対照として用いられた。
ーション分光測定によりＨＧＰＲＴ活性について検査さ
れた。標識剤としては６Ｈ−ヒポキサンチンが用いられ
た。通常のＵ−９３７細胞および培地はそれぞれ正およ
び負の対照として用いられた。
Ｕ−９３７細胞の約半分がエチルメタンスルホネートで
の処理および続く正常な培地中での３日間を生き残った
。これはトリパンブルー排除試験により、およびＴＰＡ
の添加が細胞の半分を底に付着するに至らしめる事実に
より示された。
の処理および続く正常な培地中での３日間を生き残った
。これはトリパンブルー排除試験により、およびＴＰＡ
の添加が細胞の半分を底に付着するに至らしめる事実に
より示された。
このことが細胞系統Ｕ−９３７の生存する細胞の性質で
ある。この方法は有毒な類似体６−チオグアニンを用い
る選択にも生存する細胞の分離にとって同様に有用かつ
時間節約的であることが示された。このクローニングに
より倍加時間４８時間を有する３種類のクローンが得ら
れた。これらクローンはＨＡＴ−培地中で死滅した。
ある。この方法は有毒な類似体６−チオグアニンを用い
る選択にも生存する細胞の分離にとって同様に有用かつ
時間節約的であることが示された。このクローニングに
より倍加時間４８時間を有する３種類のクローンが得ら
れた。これらクローンはＨＡＴ−培地中で死滅した。
Ｕ−９３７の未処理出発細胞はオートラジオグラフィー
において核領域中に強い標識化を示すが、選択されたク
ローンはそのＨＧＰＲＴ−欠乏ゆえに ゛はとん
ど標識化を示さなかった。このことは５Ｈ−ヒポキサン
チンとり込みを直接測定することにより確認された。３
種の突然変異したクローンは未処理Ｕ−９３７細胞の値
の最大４．１チを示し九。
において核領域中に強い標識化を示すが、選択されたク
ローンはそのＨＧＰＲＴ−欠乏ゆえに ゛はとん
ど標識化を示さなかった。このことは５Ｈ−ヒポキサン
チンとり込みを直接測定することにより確認された。３
種の突然変異したクローンは未処理Ｕ−９３７細胞の値
の最大４．１チを示し九。
突然変異したクローンの表現型を判定するには、適当な
基質を用いて酸ホスファターゼ、酸エステラーゼおよび
ナフトールＡｓ−Ｄクロロ酢酸エステルを分解するエス
テラーゼの発現について試験した。さらに発現された酸
ホスファターゼおよびエステラーゼのイソ酵素構造を等
電点電気泳動により判定した。
基質を用いて酸ホスファターゼ、酸エステラーゼおよび
ナフトールＡｓ−Ｄクロロ酢酸エステルを分解するエス
テラーゼの発現について試験した。さらに発現された酸
ホスファターゼおよびエステラーゼのイソ酵素構造を等
電点電気泳動により判定した。
種々のモノクローナル抗体とクローンとの反応性は酵素
としてアルカリホスファターゼを用いる間接的な酵素−
免疫検定により、冷凍された細胞遠心分離調製物につい
て測定された。Ｔ−細胞特異的な抗体としては、現在技
術による抗体ＯＫ’ｌ：’ ３．４．８および１１ （
０ｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ−ｔｉｃａｌｓ社展品
、米国ニューシャーシー州）が使用されそしてＢ−細胞
会合性抗原の測定には血漿細胞を除（Ｂ−細胞用の一般
的な試薬である抗体Ｔｏ １５ （Ｆａ、 Ｄａｋｏ社
製品、米国カリフォルニア州すンタバーバラ）が使用さ
れた。さらに同様にＯｒ ｔｈｏ社のモノクローナル抗
体ＯＫＭ、抗ヒト単球１および２ならびにＫｉ−Ｍ系列
のモノクローナル抗体すなわちＫｉ−Ｍ １−８ （Ｂ
ｌｏｏｄ（１９８３）６２ ｓ ５８５ ＊ Ｊ−Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、 （１９８３） １３１ ｔ ２７１９
： Ｃｅｌｌ−Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９８３） ８２
，１７４； Ａｍ、 Ｊ、 Ｐａｔｈｏｌ、 （１９８
４）１１７．４４１）も使用された。
としてアルカリホスファターゼを用いる間接的な酵素−
免疫検定により、冷凍された細胞遠心分離調製物につい
て測定された。Ｔ−細胞特異的な抗体としては、現在技
術による抗体ＯＫ’ｌ：’ ３．４．８および１１ （
０ｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ−ｔｉｃａｌｓ社展品
、米国ニューシャーシー州）が使用されそしてＢ−細胞
会合性抗原の測定には血漿細胞を除（Ｂ−細胞用の一般
的な試薬である抗体Ｔｏ １５ （Ｆａ、 Ｄａｋｏ社
製品、米国カリフォルニア州すンタバーバラ）が使用さ
れた。さらに同様にＯｒ ｔｈｏ社のモノクローナル抗
体ＯＫＭ、抗ヒト単球１および２ならびにＫｉ−Ｍ系列
のモノクローナル抗体すなわちＫｉ−Ｍ １−８ （Ｂ
ｌｏｏｄ（１９８３）６２ ｓ ５８５ ＊ Ｊ−Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、 （１９８３） １３１ ｔ ２７１９
： Ｃｅｌｌ−Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９８３） ８２
，１７４； Ａｍ、 Ｊ、 Ｐａｔｈｏｌ、 （１９８
４）１１７．４４１）も使用された。
Ｕ−９３７突然変異体クローンの表現型を本来のＵ−９
３７細胞ならびに正常な人間の血液単球および腹膜マク
ロファージと比較した。未処理のＵ−９６７細胞に対し
てもまたＵ−９５７細胞の他の知られた酵素欠乏クロー
ンに対しても突然変異体クローンの表現型においては何
ら実質上の相違は見出されなかった。
３７細胞ならびに正常な人間の血液単球および腹膜マク
ロファージと比較した。未処理のＵ−９６７細胞に対し
てもまたＵ−９５７細胞の他の知られた酵素欠乏クロー
ンに対しても突然変異体クローンの表現型においては何
ら実質上の相違は見出されなかった。
新規な細胞クローンは形態学的には丸（なつた細胞核お
よび中程度の大きさの細胞質を示す。
よび中程度の大きさの細胞質を示す。
これらは何らナフトールＡｓ−Ｄ−クロロアセテーター
ゼ活性またはミエロペルオキシダーゼ活性を示さない。
ゼ活性またはミエロペルオキシダーゼ活性を示さない。
酸エステラーゼおよび酸ホスファターゼについての試験
では高い強度の拡散したかまたは粒状の反応パターンが
示された。
では高い強度の拡散したかまたは粒状の反応パターンが
示された。
等電点電気泳動では、新規なりローンにより発現される
酸エステラーゼが５種のイソ酵素からそして発現された
酸ホスファターゼが１１種のイソ酵素からなることが示
された。パターンは正常なヒトの単球のそれとは区別で
きないが、一方腹膜マクロファージは卓球の基本パター
ンに加え２個の付加的なバンドを酸エステラーゼのパタ
ーン中において示した。
酸エステラーゼが５種のイソ酵素からそして発現された
酸ホスファターゼが１１種のイソ酵素からなることが示
された。パターンは正常なヒトの単球のそれとは区別で
きないが、一方腹膜マクロファージは卓球の基本パター
ンに加え２個の付加的なバンドを酸エステラーゼのパタ
ーン中において示した。
新規なりローンおよびもとのＵ−９５７細胞はモノクロ
ーナル抗体Ｋｉ−Ｍ ３、Ｋｉ−Ｍ ７ならびにＯＫＭ
とのみ反応するが、血液単球および過半数の組織マクロ
ファージは抗体に１−Ｍｌ、２．５．６．７および８な
らびにＭｏｎｏ １およびＭｏｎｏ ２と反応すること
が知られている。
ーナル抗体Ｋｉ−Ｍ ３、Ｋｉ−Ｍ ７ならびにＯＫＭ
とのみ反応するが、血液単球および過半数の組織マクロ
ファージは抗体に１−Ｍｌ、２．５．６．７および８な
らびにＭｏｎｏ １およびＭｏｎｏ ２と反応すること
が知られている。
ここに記載されているＨＧＰＲＴ−欠乏クローンはそれ
らの生育性質、酵素欠乏および表現型特注に関し６か月
以上安定なままである。
らの生育性質、酵素欠乏および表現型特注に関し６か月
以上安定なままである。
ここに記載された新規な細胞クローンは人間の単球／マ
クロファージ細胞系統の生体外等価物と見なされつる。
クロファージ細胞系統の生体外等価物と見なされつる。
ヒトの単球／マクロファージおよびＵ−９５７細胞の近
接した関連性が知られている。
接した関連性が知られている。
ここに記載されたクローンの細胞はＰＥＧの存在下に古
典的なり一細胞ハイブリッドについて記載された方法（
Ｎａｔｕｒｅ ２５６４９５（１９７５））に従い、末
梢血液から単離されたヒトの卓球と融合された。単球な
る概念には骨髄から末梢血液または組織までのすべての
分化段階が理解されるべきである。生成するハイブリッ
ド細胞は単球の予期された形態学的特徴を示す。融合相
手からのこれらハイブリッドの最初の選択はＨＡＴ−培
地中で永久的に生育しつるそれらの能力に基づく。
典的なり一細胞ハイブリッドについて記載された方法（
Ｎａｔｕｒｅ ２５６４９５（１９７５））に従い、末
梢血液から単離されたヒトの卓球と融合された。単球な
る概念には骨髄から末梢血液または組織までのすべての
分化段階が理解されるべきである。生成するハイブリッ
ド細胞は単球の予期された形態学的特徴を示す。融合相
手からのこれらハイブリッドの最初の選択はＨＡＴ−培
地中で永久的に生育しつるそれらの能力に基づく。
形態学的な特徴の外にこれらハイブリッドクローンは単
球に特異的な因子を産生じつるそれらの能力により単球
ハイブリッドとしても特性化された。従ってかくの如（
調製された単球ハイブリッドの細胞培養上澄み液中にお
けるインターロイキン−１活性は文献記載のインターロ
イキン−１−試験系（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ、 １６６
３１８〜５５５ （１９８４） ）により証明されつる
。インターロイキン−１は文献上優勢な意見に従い生理
学的条件下に活性化された単球によってのみ分泌される
。
球に特異的な因子を産生じつるそれらの能力により単球
ハイブリッドとしても特性化された。従ってかくの如（
調製された単球ハイブリッドの細胞培養上澄み液中にお
けるインターロイキン−１活性は文献記載のインターロ
イキン−１−試験系（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ、 １６６
３１８〜５５５ （１９８４） ）により証明されつる
。インターロイキン−１は文献上優勢な意見に従い生理
学的条件下に活性化された単球によってのみ分泌される
。
同様にして他の因子を分泌するハイブリッドも調製され
つる。
つる。
特許出願人 ベーリングヴエルケ・アクテエンゲゼル
シャフト 外２名
シャフト 外２名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼが欠乏しておりそしてヒポキサンチン、ア
ミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（ＨＡＴ−
培地）中で死滅するものである永久的なヒト組織球細胞
系統Ｕ−９３７の突然変異した細胞。 ２）単球の融合相手としての前記特許請求の範囲第１項
記載の細胞の使用。 ３）細胞系統Ｕ−９３７の細胞を動物細胞の突然変異の
ために既知の化学薬剤（好ましくはエチルメタンスルホ
ネート）で、そして次に０．５μｇ／ｍｌから少くとも
５０μｇ／ｍｌまで段階的に上昇する濃度の６−チオグ
アニンで処理し、それぞれの段階で生き残つた細胞を分
離しそして後続の段階に用い、そして終りに得られた実
際上何らヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼが発現されない細胞を増殖させること
を特徴とする前記特許請求の範囲第１項記載の突然変異
した細胞の製法。 ４）前記特許請求の範囲第１項記載の細胞と単球との融
合により得られる細胞ハイブリッド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853512559 DE3512559A1 (de) | 1985-04-06 | 1985-04-06 | Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase-negative mutante einer histiozytischen permanenten humanen zellinie |
| DE3512559.4 | 1985-04-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61231995A true JPS61231995A (ja) | 1986-10-16 |
Family
ID=6267439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61076817A Pending JPS61231995A (ja) | 1985-04-06 | 1986-04-04 | 永久的なヒト組織球細胞系統の突然変異体 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0197489A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61231995A (ja) |
| AU (1) | AU5566386A (ja) |
| DE (1) | DE3512559A1 (ja) |
| ES (1) | ES8703518A1 (ja) |
| IL (1) | IL78417A0 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3520844A1 (de) * | 1985-06-11 | 1986-12-11 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Thymidin-kinase (ec 2.7.1.21)-mangelmutanten einer humanen monocytischen zellinie |
| US6063375A (en) * | 1996-09-10 | 2000-05-16 | Medical University Of South Carolina | Semiallogeneic cell hybrids and related methods for treating cancer |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4647535A (en) * | 1981-08-12 | 1987-03-03 | Research Corporation | Human nonsecretory plasmacytoid cell line |
| DE3520844A1 (de) * | 1985-06-11 | 1986-12-11 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Thymidin-kinase (ec 2.7.1.21)-mangelmutanten einer humanen monocytischen zellinie |
-
1985
- 1985-04-06 DE DE19853512559 patent/DE3512559A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-04-01 EP EP86104440A patent/EP0197489A3/de not_active Withdrawn
- 1986-04-03 IL IL78417A patent/IL78417A0/xx unknown
- 1986-04-04 ES ES553723A patent/ES8703518A1/es not_active Expired
- 1986-04-04 AU AU55663/86A patent/AU5566386A/en not_active Abandoned
- 1986-04-04 JP JP61076817A patent/JPS61231995A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8703518A1 (es) | 1987-02-16 |
| AU5566386A (en) | 1986-10-16 |
| ES553723A0 (es) | 1987-02-16 |
| DE3512559A1 (de) | 1986-10-16 |
| EP0197489A3 (de) | 1989-03-29 |
| IL78417A0 (en) | 1986-08-31 |
| EP0197489A2 (de) | 1986-10-15 |
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