JPS6167482A - ヒトモノクロナル抗体産生細胞の無限増殖法 - Google Patents
ヒトモノクロナル抗体産生細胞の無限増殖法Info
- Publication number
- JPS6167482A JPS6167482A JP18962284A JP18962284A JPS6167482A JP S6167482 A JPS6167482 A JP S6167482A JP 18962284 A JP18962284 A JP 18962284A JP 18962284 A JP18962284 A JP 18962284A JP S6167482 A JPS6167482 A JP S6167482A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、免疫グロブリン産生細胞を不滅化し、長期に
分裂増殖せしめる方法に関する。
分裂増殖せしめる方法に関する。
（従来の技術）
ケラ−とミルスタインにより開示されたマウスのハイブ
リドーマ技術は、多くの特異的なモノクロナル抗体の獲
得をもたらした。
リドーマ技術は、多くの特異的なモノクロナル抗体の獲
得をもたらした。
しかし、該技術を異種動物に拡張し、ヒトのモノクロナ
ル抗体を獲得しようと、幾多の努力がはられれたが、必
ずしも成功していない。
ル抗体を獲得しようと、幾多の努力がはられれたが、必
ずしも成功していない。
これには以下の理由が挙げられる。
１１）、マウス−ヒトの異種動物間ハイプリドーマの場
合、ヒト由来の染色体がハイブリドーマから脱落する現
象は避けられず、長期にヒトの抗体を産生させることは
極めて困難である。
合、ヒト由来の染色体がハイブリドーマから脱落する現
象は避けられず、長期にヒトの抗体を産生させることは
極めて困難である。
１２）、ヒト−ヒトハイブリドーマの場合、同種動物間
ハイプリドーマであるゆえ、前記の問題点は原理的に克
服できるものの、Ｘ６３．５Ｐ１２など常用されるマウ
ス骨髄腫のＨＡＴ感受性欠損株に匹敵する細胞融合効率
を有するヒトの細胞株は未だ見い出されていない。
ハイプリドーマであるゆえ、前記の問題点は原理的に克
服できるものの、Ｘ６３．５Ｐ１２など常用されるマウ
ス骨髄腫のＨＡＴ感受性欠損株に匹敵する細胞融合効率
を有するヒトの細胞株は未だ見い出されていない。
ヒトのモノクロナル抗体は、ヒトの免疫系にのみ認識し
うるヒトの抗原（アロ抗原）の識別や、ヒトの癌細胞に
特異的に出現すると期待される癌抗原の識別、その他種
々の自己抗原の識別に有効であるとされ、診断、治療分
野への応用展開の期待は大きい。
うるヒトの抗原（アロ抗原）の識別や、ヒトの癌細胞に
特異的に出現すると期待される癌抗原の識別、その他種
々の自己抗原の識別に有効であるとされ、診断、治療分
野への応用展開の期待は大きい。
かかる状況下で、最も効果的に免疫グロブリン産生細胞
を無限増殖化する方法として従来知られているのは、エ
プスタイン・バール・ウイルス（以下、ＥＢＶと略記す
る）による形質転換を行う方法である。通常ＥＢＶを利
用する場合、マーモセットの細胞株であるｆ３９５−８
株など、ＥＢｖを細胞外に放出する細胞株の培養上清を
添加した培養系で免疫グロブリン産生細胞を培養する方
法が用いられる。
を無限増殖化する方法として従来知られているのは、エ
プスタイン・バール・ウイルス（以下、ＥＢＶと略記す
る）による形質転換を行う方法である。通常ＥＢＶを利
用する場合、マーモセットの細胞株であるｆ３９５−８
株など、ＥＢｖを細胞外に放出する細胞株の培養上清を
添加した培養系で免疫グロブリン産生細胞を培養する方
法が用いられる。
（発明が解決しようとする問題点）
しかし、上記方法を用いると、ヒト以外の細胞を用いる
ため、ヒト以外の細胞由来の未知の産物が培養系に混入
する恐れが否定できず、診断、治療への応用が制限され
るのが実情であった。
ため、ヒト以外の細胞由来の未知の産物が培養系に混入
する恐れが否定できず、診断、治療への応用が制限され
るのが実情であった。
（問題点を解決するだめの手段）
本発明者は、ヒトの細胞系のみを用いて免疫グロブリン
産生細胞の無限増殖化せしめる方法を開発すべく鋭意検
討を加えた結果、本発明を完成し、上記の問題点を克服
するに至った。
産生細胞の無限増殖化せしめる方法を開発すべく鋭意検
討を加えた結果、本発明を完成し、上記の問題点を克服
するに至った。
すなわち、本発明は、ＥＢＶ遺伝子を保有するヒトＢ細
胞株と、免疫グロブリン産生細胞を含む血液系幹細胞由
来細胞群とを共培養することＫより、免疫グロブリン産
生細胞を無限増殖化する方法である。
胞株と、免疫グロブリン産生細胞を含む血液系幹細胞由
来細胞群とを共培養することＫより、免疫グロブリン産
生細胞を無限増殖化する方法である。
ＥＢＶ遺伝子を保有するヒトＢ細胞株とは、染色体中に
ＥＢ’Ｖが組み込まれた細胞株であり、直接細胞株遺伝
子の配列から該ウィルスの存在を同定することも可能で
あるが、ＥＢＶ遺伝子の保有によりもたらされるＥＢＶ
関連核抗原（以下、ｇＢＮＡと略記する）の存在を螢光
抗体法などの免疫学的手法により同定することもできる
。
ＥＢ’Ｖが組み込まれた細胞株であり、直接細胞株遺伝
子の配列から該ウィルスの存在を同定することも可能で
あるが、ＥＢＶ遺伝子の保有によりもたらされるＥＢＶ
関連核抗原（以下、ｇＢＮＡと略記する）の存在を螢光
抗体法などの免疫学的手法により同定することもできる
。
該細胞株は、ヒト体内に存在するリンパ球の培養を継続
することにより、極めて低い出現確率ではあるがトラン
スフオームし、無限増殖可能となった細胞群にクローニ
ングを施し、モノクロンの状態で得られた細胞株のうち
、ＥＢＮＡの存在と表面免疫グロブリンを螢光抗体法で
同定できる細胞を選択することにより獲得することがで
きる。
することにより、極めて低い出現確率ではあるがトラン
スフオームし、無限増殖可能となった細胞群にクローニ
ングを施し、モノクロンの状態で得られた細胞株のうち
、ＥＢＮＡの存在と表面免疫グロブリンを螢光抗体法で
同定できる細胞を選択することにより獲得することがで
きる。
免疫グロブリン産生細胞を含む血液系幹細胞由来細胞群
とは、骨髄中に存在する血液系幹細胞から分化成熟し、
赤血球、血小板、多形核白血球、単球およびリンパ球な
どの一群の細胞であるが、少なくともリンパ球のうち、
免疫グロブリン産生を担う細胞を含む細胞群であること
が必要である、リンパ球には、免疫グロブリン産生細胞
以外に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞などの存在が知られているが
、これらの細胞が共存することは、本発明の実施に障害
にならない。
とは、骨髄中に存在する血液系幹細胞から分化成熟し、
赤血球、血小板、多形核白血球、単球およびリンパ球な
どの一群の細胞であるが、少なくともリンパ球のうち、
免疫グロブリン産生を担う細胞を含む細胞群であること
が必要である、リンパ球には、免疫グロブリン産生細胞
以外に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞などの存在が知られているが
、これらの細胞が共存することは、本発明の実施に障害
にならない。
旦体的には、免疫グロブリン産生細胞を含む血液系幹細
胞由来細胞群としては、末梢血リンパ球両分、リンパ節
細胞画分、牌臓細胞画分などを利用することにより目的
を達成することができる、これら細胞画分には、相対的
に免疫グロブリン産生細胞を多く含んでいる。
胞由来細胞群としては、末梢血リンパ球両分、リンパ節
細胞画分、牌臓細胞画分などを利用することにより目的
を達成することができる、これら細胞画分には、相対的
に免疫グロブリン産生細胞を多く含んでいる。
ＥＢＶｔｙｔ伝子金保有するヒトＢ細胞系細胞株と免疫
グロブリン産生細胞を含む血液系幹細胞由来細胞群の共
培養に用いる培地は特に制限はないが、一般的には、リ
ンパ球培養用のＲＰＭＩ−１６４０などの培地に牛胎児
血清（以下、Ｆｅ２と略記する）を５〜２０％程度添加
して用いればよい。
グロブリン産生細胞を含む血液系幹細胞由来細胞群の共
培養に用いる培地は特に制限はないが、一般的には、リ
ンパ球培養用のＲＰＭＩ−１６４０などの培地に牛胎児
血清（以下、Ｆｅ２と略記する）を５〜２０％程度添加
して用いればよい。
たＹし、混合させる両細胞は、片や細胞株であり、片や
正常細胞であるため、細胞株の増殖を適切に阻止しなけ
れば、目的とする免疫グロブリン産生細胞の無限増殖化
は達成できない。
正常細胞であるため、細胞株の増殖を適切に阻止しなけ
れば、目的とする免疫グロブリン産生細胞の無限増殖化
は達成できない。
この細胞株の増殖を阻止する方法としては、ミルシュタ
インとケラ−によって免疫学の領域に持ち込まれた融合
細胞の選択方法であるヒポキサンチン、グアニン、７オ
ス７オリボシルトランスフエラーゼ（以下、）（ＧＰＲ
Ｔと略記する）を欠損した変異細胞株を、ヒボキサンチ
ン、アミノプテリン、グアニン（以下、ＨＡＴと略記す
る）を含む培地で培養すればよい。該方法の利点は、変
異細胞株を獲得しさえすれば、その後、免疫グロブリン
産生細胞との共培養に際して、細胞障害性を有する薬剤
の添加を極少におさえ、効果的に無限増殖化できること
にある。
インとケラ−によって免疫学の領域に持ち込まれた融合
細胞の選択方法であるヒポキサンチン、グアニン、７オ
ス７オリボシルトランスフエラーゼ（以下、）（ＧＰＲ
Ｔと略記する）を欠損した変異細胞株を、ヒボキサンチ
ン、アミノプテリン、グアニン（以下、ＨＡＴと略記す
る）を含む培地で培養すればよい。該方法の利点は、変
異細胞株を獲得しさえすれば、その後、免疫グロブリン
産生細胞との共培養に際して、細胞障害性を有する薬剤
の添加を極少におさえ、効果的に無限増殖化できること
にある。
その他、ヒトＢ細胞株をマイトマイシンＣ１アクチノマ
イ７ンＤなどの薬剤処理、もしくはγ線照射などにより
、増殖性を失なわせて共培養に供してもよい。
イ７ンＤなどの薬剤処理、もしくはγ線照射などにより
、増殖性を失なわせて共培養に供してもよい。
共培養に供するＢ細胞株は、免疫グロブリンを細胞表面
に保有する細胞であれば特に制限はないが、最も一般的
なグロブリンクラスであるＩｇＧ型抗体を培養上宿から
容易に検出できる点でスクリーニングしやすい、ＩｇＭ
、Ａ、Ｄ、およびＥ型抗体を細胞表面に保有するＢ細胞
株を用いることが好ましい。
に保有する細胞であれば特に制限はないが、最も一般的
なグロブリンクラスであるＩｇＧ型抗体を培養上宿から
容易に検出できる点でスクリーニングしやすい、ＩｇＭ
、Ａ、Ｄ、およびＥ型抗体を細胞表面に保有するＢ細胞
株を用いることが好ましい。
また、より好ましくは、特開昭５８−２１６１２５に開
示されたＢ細胞株Ｒ，ＰＭＩ−１７８８およびその８−
アザグアニンを含む培地で選択したＨＡＴ感受性Ｂ細胞
株（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ８１１８）がある。
示されたＢ細胞株Ｒ，ＰＭＩ−１７８８およびその８−
アザグアニンを含む培地で選択したＨＡＴ感受性Ｂ細胞
株（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ８１１８）がある。
一般的に、共培養に際して夾雑するＴ細胞もしくはＮＫ
ＮＵ胞は、免疫グロブリン産生細胞の無限増殖化に阻害
的に作用し、その効率を低下させる。
ＮＵ胞は、免疫グロブリン産生細胞の無限増殖化に阻害
的に作用し、その効率を低下させる。
しかしながら、ＲＰＭＩ−１７８８およびＣＲＬ−８１
１８を用いた場合、本発明の実施を阻止することはない
。
１８を用いた場合、本発明の実施を阻止することはない
。
いずれの方法を用いた場合でも、より効率良く無限増殖
細胞を得るためには、共培養系にレバミゾール、サイク
ロスポリンＡなどの細胞障害性Ｔ細胞もしくｌ″ｉＮＫ
ｉＮＫ細＠に働く薬剤の添加は有効である。
細胞を得るためには、共培養系にレバミゾール、サイク
ロスポリンＡなどの細胞障害性Ｔ細胞もしくｌ″ｉＮＫ
ｉＮＫ細＠に働く薬剤の添加は有効である。
本発明による免疫グロブリン産生細胞の無限増殖化の機
序は、充分には解明されていないが、共培養にエリ、ｇ
ＢＶがヒトＢ細胞株より免疫グロブリン産生細胞に移入
され、免疫グロブリン産生細胞は無限増殖能を獲得する
ものと考えられる。
序は、充分には解明されていないが、共培養にエリ、ｇ
ＢＶがヒトＢ細胞株より免疫グロブリン産生細胞に移入
され、免疫グロブリン産生細胞は無限増殖能を獲得する
ものと考えられる。
共培養により増殖してきた細胞集団は、はぼ２週間経過
後に明確にｉ祭できる。このとき、その培養上清を採取
し、目的とする抗原との反応性をＲＩＡ法、ＥＩＡ法、
螢光抗体法などにより検定すればよい。目的とする抗体
を産生ずる細胞集団は、再度、最初の共培養に供した細
胞株と温合して再播種することにより、クローン化した
状態で抗原１時異的な抗体を産生ずるクローン化細胞株
として獲得することができる。
後に明確にｉ祭できる。このとき、その培養上清を採取
し、目的とする抗原との反応性をＲＩＡ法、ＥＩＡ法、
螢光抗体法などにより検定すればよい。目的とする抗体
を産生ずる細胞集団は、再度、最初の共培養に供した細
胞株と温合して再播種することにより、クローン化した
状態で抗原１時異的な抗体を産生ずるクローン化細胞株
として獲得することができる。
（発明の効果）
この方法を用いれば、ヒトの病原性ウィルス、癌、ＨＬ
Ａ抗原、自己免疫原性を有する自己組織形成々分などに
対するモノクロナル抗体を容易に獲得でき、その診断お
よび治療に及ぼす意義は大きい。
Ａ抗原、自己免疫原性を有する自己組織形成々分などに
対するモノクロナル抗体を容易に獲得でき、その診断お
よび治療に及ぼす意義は大きい。
以上、本発明全一般的に述べてきたが、さらに実施例に
てヒト胃ガン由来の培養細胞株ＫＡＴＯ−■と反応する
抗体を産生ずる細胞株を得る方法について詳細に説明す
る。ただし、この実施例は本発明の具体的例示であって
、本発明を限定するものでないことは言うまでもない。
てヒト胃ガン由来の培養細胞株ＫＡＴＯ−■と反応する
抗体を産生ずる細胞株を得る方法について詳細に説明す
る。ただし、この実施例は本発明の具体的例示であって
、本発明を限定するものでないことは言うまでもない。
実施例
ヒト胃癌患者摘出リンパ節細胞から培養細胞ＫＡＴＯ−
旧に反応性を有する抗体産生細胞株を獲得する方法 （１１リンパ節細胞の調製 胃癌病巣の所属リンパ節をハサミで細片し、ハンクス平
衡塩液に分散させた。続いてステンレスメツシュ（す１
００）を用いて戸別し、内在するリンパ球を１０１個獲
得した。
旧に反応性を有する抗体産生細胞株を獲得する方法 （１１リンパ節細胞の調製 胃癌病巣の所属リンパ節をハサミで細片し、ハンクス平
衡塩液に分散させた。続いてステンレスメツシュ（す１
００）を用いて戸別し、内在するリンパ球を１０１個獲
得した。
＋２１ＥＢＶ遺伝子を保有するヒ）Ｂ細胞株の調製
１０μ？／ｍｌの８−アザグアニンおよび２０％のＦｅ
２を含む培地ＲＰＭＩ−１６４０で培養したＣＲＬ８１
１８を２．５ Ｘ １０丁個用意した。
２を含む培地ＲＰＭＩ−１６４０で培養したＣＲＬ８１
１８を２．５ Ｘ １０丁個用意した。
（３１共培養
両細胞を混合し、２０％のＦｅ２を含むＨＡＴ培地１０
０−に分散させた。この培地を９６ｗｅｌｌマイクロテ
ストプレートに１００μ４／ｗｅｌｌの容量で分注し、
計１０枚のプレートを作成した。
０−に分散させた。この培地を９６ｗｅｌｌマイクロテ
ストプレートに１００μ４／ｗｅｌｌの容量で分注し、
計１０枚のプレートを作成した。
３日後および８日後に培地を添加もしくは半量交換し、
１４日後、上清を１００μｔずつ抜き取り、Ｋ Ａ Ｔ
Ｏ−ＩＩＩ細胞株との反応性吟味に供した。
１４日後、上清を１００μｔずつ抜き取り、Ｋ Ａ Ｔ
Ｏ−ＩＩＩ細胞株との反応性吟味に供した。
このとき培養した９ ６０ ｗｅｌｌ中７８６ ｗｅｌ
ｌに細胞の増殖が認められた。
ｌに細胞の増殖が認められた。
［４１Ｋ Ａ Ｔ Ｏ−ＩＩＩ細胞株との反応性検討９
６ｗｅ１１４Ｖ底プレート１０枚に、１０５細胞／ｗｅ
１１の条件で細胞を分注し、それぞれの共培養上清を添
加し、１時間反応させた。つづいて細胞を洗浄し、標的
細胞株表面に残存する抗体を、ペルオキシダーゼを用い
たＥＩＡ法により検出したところ、１１ ｗｅｌｌに陽
性の反応を得た、（５）陽性細胞のクローン化 ここで得られた陽性ｗｅｌｌに存在する細胞を懸濁し、
９６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌあたり、該細胞５個
、ＣＲＬ８１１ Ｂ細胞株１０４個および２０％ＦＣ８
を含むＨＡＴ培地５０μｔの条件で、再度共培養を行い
、コロニー出現後、上清分析を施し、適切なｗｅｌｌか
らクローン化したＫＡＴＯ−ＩＦＦに反応性を有する免
疫グロブリン産生細胞株を１１種獲得した、 比較例 実施例１に用いたと同一の患者由来のリンパ節細胞１０
７個を用い、Ｂ細胞株ＣＲＬ８１１８を用いないこと以
外は、実施例１と同様の方法で培養を行ったが、ＫＡＴ
Ｏ−ｆｆＩに反応性を有する抗体を産生じていると思わ
れるｗｅｌｌは、共培養開始４週間後においても認めら
れなかった。
６ｗｅ１１４Ｖ底プレート１０枚に、１０５細胞／ｗｅ
１１の条件で細胞を分注し、それぞれの共培養上清を添
加し、１時間反応させた。つづいて細胞を洗浄し、標的
細胞株表面に残存する抗体を、ペルオキシダーゼを用い
たＥＩＡ法により検出したところ、１１ ｗｅｌｌに陽
性の反応を得た、（５）陽性細胞のクローン化 ここで得られた陽性ｗｅｌｌに存在する細胞を懸濁し、
９６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌあたり、該細胞５個
、ＣＲＬ８１１ Ｂ細胞株１０４個および２０％ＦＣ８
を含むＨＡＴ培地５０μｔの条件で、再度共培養を行い
、コロニー出現後、上清分析を施し、適切なｗｅｌｌか
らクローン化したＫＡＴＯ−ＩＦＦに反応性を有する免
疫グロブリン産生細胞株を１１種獲得した、 比較例 実施例１に用いたと同一の患者由来のリンパ節細胞１０
７個を用い、Ｂ細胞株ＣＲＬ８１１８を用いないこと以
外は、実施例１と同様の方法で培養を行ったが、ＫＡＴ
Ｏ−ｆｆＩに反応性を有する抗体を産生じていると思わ
れるｗｅｌｌは、共培養開始４週間後においても認めら
れなかった。
Claims (1)
- エプスタイン・バール・ウィルス遺伝子を保有するヒト
Ｂ細胞株と、免疫グロブリン産生細胞を含む血液系幹細
胞由来細胞群とを共培養することを特徴とする免疫グロ
ブリン産生細胞の無限増殖化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18962284A JPS6167482A (ja) | 1984-09-12 | 1984-09-12 | ヒトモノクロナル抗体産生細胞の無限増殖法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18962284A JPS6167482A (ja) | 1984-09-12 | 1984-09-12 | ヒトモノクロナル抗体産生細胞の無限増殖法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6167482A true JPS6167482A (ja) | 1986-04-07 |
Family
ID=16244376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18962284A Pending JPS6167482A (ja) | 1984-09-12 | 1984-09-12 | ヒトモノクロナル抗体産生細胞の無限増殖法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6167482A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7802771B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-09-28 | Fujikin Incorporated | Fluid control device |
-
1984
- 1984-09-12 JP JP18962284A patent/JPS6167482A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7802771B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-09-28 | Fujikin Incorporated | Fluid control device |
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