KR20090010053A - 융합 파트너 세포 - Google Patents

융합 파트너 세포 Download PDF

Info

Publication number
KR20090010053A
KR20090010053A KR1020087027724A KR20087027724A KR20090010053A KR 20090010053 A KR20090010053 A KR 20090010053A KR 1020087027724 A KR1020087027724 A KR 1020087027724A KR 20087027724 A KR20087027724 A KR 20087027724A KR 20090010053 A KR20090010053 A KR 20090010053A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
cells
fusion partner
antibody
hybridoma
Prior art date
Application number
KR1020087027724A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101429254B1 (ko
Inventor
나오마사 야마모토
미즈호 가네다
Original Assignee
가부시키가이샤 이가쿠세이부츠가쿠겐큐쇼
나오마사 야마모토
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 이가쿠세이부츠가쿠겐큐쇼, 나오마사 야마모토 filed Critical 가부시키가이샤 이가쿠세이부츠가쿠겐큐쇼
Publication of KR20090010053A publication Critical patent/KR20090010053A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101429254B1 publication Critical patent/KR101429254B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포와, 제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 가지고 염색체를 배수체로 하는 성질을 갖는 백혈병 세포를 융합시킴으로써, 마우스 이외의 종과도 헤테로 하이브리도마를 제작할 수 있는 융합 파트너 세포를 제작하였다. 이 융합 파트너 세포를 마우스 이외의 물질 생산 세포와 융합시켜 헤테로 하이브리도마를 제작함으로써, 안정된 물질 생산이 가능하게 되었다.

Description

융합 파트너 세포{Fusion partner cells}
본 발명은 융합 파트너 세포 및 하이브리도마에 관한 것이다.
하이브리도마(융합세포)는, 배양세포에 의한 물질 생산에 이용되고 있다. 동물세포 중에는 상업적으로 혹은 학술적으로 유용한 물질을 생산하는 것도 많다. 그러나, 일반적으로 동물세포의 배양은 어려워 물질생산능을 유지하면서 장기간에 걸쳐 안정하게 동물세포를 배양하는 기술은 확립되어 있지 않다. 그래서, 생체 밖에서 영구히 안정한 배양이 가능한 골수종 세포를 융합 파트너 세포로 하고, 융합 파트너 세포와 생리활성물질을 생산하는 세포를 융합시켜 하이브리도마로 함으로써 배양능과 물질생산능 모두의 형질을 구비한 세포를 만들어 내는 기술이 제안되었다.
세포 융합법을 이용하는 모노클로날 항체는, 하이브리도마가 생산하는 항체의 생산량이나 결합성 등의 성질을 시험하여 선택하는 세포를 단일화한다. 그리고, 세포를 증식시키고 균일한 세포집단을 만듦으로써 생산된다. 이들의 하이브리도마는 in-vitro 또는 in-vivo(복수로서)로 배양 증식되고, 항체의 대량생산을 위해 확장된다. 세포 융합법을 이용하는 모노클로날 항체를 개발하기 위한 방법은 이미 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 모노클로날 항체는 항혈청에서 정제한 폴리클로날 항체에 비해 특이성이 뛰어나다고 되어 있어 각종의 면역학적인 분석방법에 있어서 중요한 도구가 된다.
세포 융합이 동종의 세포 간에 행해지는 경우, 단지 하이브리도마라고 불린다. 일반적으로 마우스의 모노클로날 항체 등은 이 방법으로 제작된다. 이에 대해, 어느 종에서 단리되어 다른 종에서 유래하는 불사화 세포(immortalized cell)와 융합된 항체생산 세포는 헤테로 하이브리도마라고 불린다. 헤테로 하이브리드라는 용어는 이종간 융합과 동의어로 사용되고, 만들어진 세포는 헤테로 하이브리도마라고 불린다. 또, 3종류의 동물종 유래의 세포를 융합시킨 항체생산 세포이면 트리오마(tromas)라고도 불린다. 이 방법으로 제작되는 모노클로날 항체는 랫트나 햄스터의 항체이고, 마우스 유래의 골수종 세포와 미리 예정된 항원을 투여한 랫트나 햄스터의 림프구와 융합시켜 마우스×랫트 혹은 마우스×햄스터의 헤테로 하이브리도마가 제작된다. 이렇게 하여 얻어진 헤테로 하이브리도마는 클로닝되고, 각 면역동물 유래의 모노클로날 항체가 얻어진다.
현재까지 인간, 토끼, 소, 양의 모노클로날 항체를 제작하는 헤테로 하이브리도마에 대한 보고가 있다(비특허문헌 2-5, 특허문헌 1, 2 참조).
그러나, 헤테로 하이브리도마에 의한 모노클로날 항체의 제작은 융합하는 세포의 생물학적 계통의 종 사이가 멀어질수록 항체를 생산하는 것이 어렵다고 되어 있다. 예를 들면, 마우스×토끼 혹은 마우스×인간의 하이브리도마에서는 항체의 생산은 매우 어렵다. 하이브리도마는 이상한 염색체수 때문에 분리가 항상 동일한 염색체 쌍을 딸세포에 준다고는 할 수 없고, 이들의 염색체를 잃어버릴 수도 있다.
비특허문헌 1: Waldman,T., Science 252:p1657-1662(1991)
비특허문헌 2: Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80:p7308-7312, 1983
비특허문헌 3: Raybould 등, Science 240:p1788-1790, 1988
비특허문헌 4: Kennedy 등, J.Gen.Virol.69:p3023-3032, 1988
비특허문헌 5: Flynn 등, J.Immunol.Methods 121:p237-246, 1989
특허문헌 1: 미국특허 제4634664호 명세서
특허문헌 2: 미국특허 제4977081호 명세서
기술의 개시
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제
본 발명의 과제는, 하이브리도마에 의한 안정적인 물질 생산을 폭넓은 동물종에서 보다 용이하게 응용할 수 있는 기술을 제공하는 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 하이브리도마의 제작에 유용한 새로운 융합 파트너 및 그 제작방법의 제공을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 본 발명에 의해 얻어진 융합 파트너와 물질생산 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마, 그 제조방법, 그리고 해당 하이브리도마에 의한 물질의 생산방법의 제공을 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
세포융합기술을 이용한 물질의 생산은, 마우스 등의 제한된 동물을 제외하면 여러가지 과제가 남아 있었다. 예를 들면, 세포융합에 이용하는 융합 파트너로서 유용한 세포가 제공되지 않는 것은 마우스 이외의 동물에서의 세포융합기술의 중요한 과제의 하나이다. 본 발명자들은 특정의 세포를 융합시킴으로써 융합 파트너로서 유용한 세포를 얻을 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들이 수립한 융합 파트너 세포는, 마우스 이외의 세포와의 융합에 의해 안정된 하이브리도마를 생산해 낸다. 또한, 이렇게 하여 얻어진 하이브리도마는 클로닝 동안도 그 형질을 안정하게 유지하고, 물질생산 세포로서도 유용함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명의 하이브리도마에 의해 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 생산할 수 있음이 명백하게 되었다.
즉, 본 발명은 이하의 융합 파트너 세포 및 이 융합 파트너 세포와 물질생산 세포와의 하이브리도마에 관한 것이다. 단, 본 발명은 이들의 세포의 제조방법 및 하이브리도마를 이용하는 물질의 제조방법에 관한 것이다.
[1] 하기 세포 (a) 및 (b)를 융합함으로써 얻을 수 있는 융합 파트너 세포;
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포 및
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포.
[2] 제1 동물종이 마우스이고, 골수종 세포가 하기 마우스 골수종 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 [1]에 기재된 융합 파트너 세포;
MOPC21, P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653, F0, S194/5.XXO.BU-1, FOX-NY 및 SP2/0-Ag14.
[3] 제2 동물종이 인간이고, 백혈병 세포가 하기 백혈병 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 [1]에 기재된 융합 파트너 세포;
MEG-01, HEL, UT-7, M07e, MEG-A2 및 DAMI.
[4] 제1 세포가 SP2/0-Ag14이고, 제2 세포가 MEG-01인 [1]에 기재된 융합 파트너 세포.
[5] 수탁번호 FERM BP-10761로서 기탁된 융합 파트너 세포 SPYMEG.
[6] 이하의 세포 (1) 및 (2)를 융합함으로써 얻을 수 있는 하이브리도마;
(1)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합함으로써 얻을 수 있는 융합 파트너 세포 및
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포
(2)제3 세포.
[7] 제1 동물종이 마우스이고, 골수종 세포가 하기 마우스 골수종 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 [6]에 기재된 하이브리도마;
MOPC21, P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653, F0, S194/5.XXO.BU-1, FOX-NY 및 SP2/0-Ag14.
[8] 제2 동물종이 인간이고, 백혈병 세포가 하기 백혈병 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 [6]에 기재된 하이브리도마;
MEG-01, HEL, UT-7, M07e, MEG-A2 및 DAMI.
[9] 제1 세포가 SP2/0-Ag14이고, 제2 세포가 MEG-01인 [6]에 기재된 하이브리도마.
[1O] 융합 파트너 세포가 수탁번호 FERM BP-10761로서 기탁된 SPYMEG인 [6]에 기재된 하이브리도마.
[11] 제3 세포가 제2 세포와 같은 동물종에 유래하는 세포인 [6]에 기재된 하이브리도마.
[12] 제3 세포가 항체생산 세포인 [11]에 기재된 하이브리도마.
[13] 이하의 단계를 포함하는 융합 파트너 세포를 제조하는 방법;
(1)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(2)단계 (1)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계.
[14] 하기 단계를 포함하는 하이브리도마를 제조하는 방법;
(1) [13]에 기재된 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와 항체생산 세포를 융합시키는 단계 및
(2) 단계 (1)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 하이브리도마를 회수하는 단계.
[15] 하기 단계를 포함하는 항체생산 세포를 제조하는 방법;
(1) [13]에 기재된 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계 및
(2) 단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 항체생산 세포로서 회수하는 단계.
[16] 부가적으로 단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 클로닝하는 단계를 포함하는 [15]에 기재된 방법.
[17] 하기 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법;
(1) [13]에 기재된 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계 및
(2) 단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 항체를 회수하는 단계.
[18] 부가적으로 단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 클로닝하는 단계를 포함하는 [17]에 기재된 방법.
[19] 하기 단계를 포함하는 감염증에 대한 항체를 제조하는 방법;
(1) [13]에 기재된 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와, 감염증의 병원체 항원의 폭로 이력이 있는 대상 유래의 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계 및
(2) 단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 감염증에 대한 항체를 회수하는 단계.
[20] 감염증이 인플루엔자, AIDS 또는 바이러스성 간염 중 어느 하나인 [19]에 기재된 방법.
또한, 본 발명은 하기 세포 (a) 및 (b)를 융합함으로써 얻을 수 있는 융합 세포의, 융합 파트너 세포로서의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 해당 융합 세포의, 항체생산 세포와의 융합 파트너 세포로서의 용도를 포함한다.
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포 및
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포.
발명의 효과
본 발명에 의해, 이종의 세포와의 세포 융합에 의해 안정된 하이브리도마를 제공하는 융합 파트너 세포가 제공되었다. 본 발명의 융합 파트너 세포와의 세포 융합에 의해 얻어진 하이브리도마는 물질을 안정하게 생산한다. 특히, 본 발명의 융합 파트너 세포는, 항체생산 세포와의 세포 융합에 의해 항체생산 세포에서 유래하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 본 발명의 융합 파트너 세포는, 바람직한 태양에 있어서, 인간 또는 마우스의 항체생산 세포와의 세포 융합에 의해 인간항체 혹은 마우스항체를 생산하는 하이브리도마를 생산한다. 인간의 항체생산 세포를 안정하게 유지하기는 어려웠다. 따라서, 인간의 항체를 안정하게 생산하는 세포를 제공한 것은 본 발명의 큰 효과이다.
하이브리도마가 형질을 안정하게 유지하는 것은 물질의 생산뿐만 아니라, 세포의 클로닝에서도 중요한 특징이다. 예를 들면 항체생산 세포는, 모노클로날 항체를 얻기 위해 하이브리도마가 클로닝된다. 세포의 클로닝은 단일 세포에서 증식한 세포집단을 얻는 것이다. 따라서, 단일 세포가 분열을 반복하는 과정에서 세포의 형질이 안정되지 않으면, 목적으로 하는 세포의 클로닝은 매우 어렵다. 본 발명이 제공하는 하이브리도마는 세포의 형질을 안정하게 유지하므로, 용이하게 클로닝할 수 있다.
발명의 실시를 위한 최량의 형태
본 발명에 있어서 「하이브리도마」는 세포 융합에 의해 얻어진 세포를 말한다. 통상, 하이브리도마는 종이 다른 세포 혹은 동종의 다른 개체나 조직에 유래하는 세포의 융합에 의해 제조된다. 또한, 같은 종의 같은 세포끼리를 융합시킨 세포도 하이브리도마에 포함된다. 또한, 본 발명에서의 하이브리도마는 2 이상의 세포의 융합에 의해 얻어진 융합 세포를 포함한다. 즉, 세포 A와 세포 B의 세포 융합에 의해 얻어진 하이브리도마(α)에 대해, 다시 세포 C를 더 융합시킴으로써 얻어진 융합 세포(β)도, 본 발명에서의 하이브리도마에 포함된다.
(세포 A)×(세포 B)=[하이브리도마(α)]
[하이브리도마(α)]×(세포 C)=[하이브리도마(β)]
상기 3종류의 세포를 융합시킨 하이브리도마(β)를 제공하는 세포 A, 세포 B 및 세포 C가 유래하는 종은 임의이다. 따라서, 이들의 세포가 유래하는 종은 동일한 경우와 다른 경우가 본 발명에 포함된다. 3종류의 세포의 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마를 특히 트리오마라고 부르기도 한다.
본 발명의 바람직한 태양에서는, 세포 A(제1 세포)와 세포 B(제2 세포)가 유래하는 종은 다르고, 세포 B와 세포 C(제3 세포)가 유래하는 종은 동일하다. 혹은, 세포 A 및 세포 C가 유래하는 종이 동일한 경우 또는 세포 A, 세포 B 및 세포 C가 모두 다른 종에 유래하는 경우도, 본 발명에서의 하이브리도마에 포함된다.
일반적으로 세포 융합에 의해 얻어진, in vitro에서 장기간에 걸쳐 용이하게 배양할 수 있는 세포를 특히 하이브리도마라고 한다. 따라서, 본 발명에서의 바람직한 하이브리도마는 세포 융합 후에 in vitro에서 장기간에 걸쳐 용이하게 배양할 수 있는 세포를 말한다. 혹은, 본 발명에서의 바람직한 하이브리도마는 한계 희석(limited dilution) 후에 세포의 증식이 유지되는 세포이다. 바꿔 말하면, 한계 희석(limited dilution) 후에 세포의 증식이 유지되는 세포는 세포 융합 후에 in vitro에서 장기간에 걸쳐 용이하게 배양할 수 있는 세포에 포함된다.
또한, 본 발명에서의 바람직한 하이브리도마는 세포 융합에 이용한 세포의 형질을 유지하고 있는 세포이다. 본 발명에 있어서, 하이브리도마에서 유지되어야 할 세포의 형질에는 세포가 가지는 물질을 생산하는 능력이 포함된다. 예를 들면, 세포 융합에 이용한 세포가 항체나 사이토카인을 생산하는 세포의 경우, 본 발명에서의 바람직한 하이브리도마는 이들의 물질을 생산하는 능력을 유지한다.
단, 본 발명에서의 하이브리도마는 세포 융합에 이용한 세포가 구비하는 형질을 반드시 완전히 유지할 필요는 없다. 따라서, 예를 들면, 앞에 나타낸 항체 이외에 세포 표면 항원이나 세포 내에 축적하는 효소나 전사 인자의 생산도, 이들의 형질의 유지가 요구되는 경우에는 하이브리도마가 유지해야 할 형질에 포함된다. 그러나, 이들의 물질 생산이 필요하지 않는 경우에는, 이들의 물질을 생산하는 능력을 잃어버린 세포이어도 필요로 하는 물질의 생산을 유지하고 있는 한, 본 발명에서의 하이브리도마에 포함된다.
본 발명에 있어서 「융합 파트너 세포」란, 다른 세포와 융합함으로써 하이브리도마를 제작할 수 있는 세포를 말한다. 본 발명에 있어서, 바람직한 융합 파트너 세포는 세포 융합에 의해 in vitro에서의 세포의 장기간에 걸친 생존을 가능하게 한다.
또한, 융합 파트너 세포는 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정의 배양조건 하에서 생존할 수 있는(혹은 할 수 없는) 형질을 의미한다.
동물 세포에서의 선택 마커에는, 히포키산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라아제 결손(이하, HGPRT 결손이라고 생략함) 혹은 티미딘키나아제 결손(이하, TK 결손이라고 생략함)에 의해 초래되는 히포키산틴-아미노푸테린-티미딘 감수성(이하, HAT 감수성이라고 생략함) 등이 알려져 있다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA합성을 할 수 없어 사멸하는데, 정상적인 세포와 융합하면 정상세포의 샐비지(salvage) 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식하게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는 각각 6티오구아닌, 8아자구아닌(이하, 8AG라고 생략함) 혹은 5'브로모디옥시유리딘을 포함하는 배지에서 선택할 수 있다. 정상적인 세포는 이들의 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 통합함으로 인해 사멸하는데, 이들의 효소를 결손한 세포는 이들의 피리미딘 아날로그를 통합시킬 수 없으므로 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418내성이라고 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-디옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다.
본 발명은, 하기 세포 (a) 및 (b)를 융합함으로써 얻을 수 있는 융합 파트너 세포를 제공한다.
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포 및
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포.
또한, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 융합 파트너 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
(1)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포
(2)단계 (1)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포란, 단독으로 클로닝이 가능한 골수종(myeloma)에서 유래하는 세포이다. 단독으로 클로닝이 가능하다는 것은, 인공적인 배양 환경 하에서 하나의 세포로부터도 증식을 개시하고 유지할 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포는, 백혈병 세포와의 세포 융합에 의해 융합 파트너를 제공할 수 있는 한 어떠한 세포를 이용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명에서의 골수종 세포로서 이용 가능한 공지의 세포로서 하기 세포주를 예시할 수 있다. 하기 세포주의 리스트에서, ATCC는 American Tissue and Culture Collection의, 또한 JCRB는 JCRB 세포 뱅크(Japanese Collection of Research Bioresources)의 기탁번호임을 나타낸다. 따라서, 이러한 세포주는 모두 해당 셀 뱅크로부터 분양을 받을 수 있다. 또, JCRB 세포 뱅크의 세포주는 휴먼 사이언스 연구자원 뱅크(Health Science Research Resources Bank: HSRRB)를 통해 분양되어 있다.
MOPC21 (ATCC번호 HB-8411)
P3X63AG8 (ATCC번호 T1B9)
SP2/0 (ATCC번호 CRL 1581)
NS-1 (ATCC번호 TIB18)
P3.X63AG8.653 (ATCC번호 CRL 1580)
F0 (ATCC번호 CRL 1646)
S194/5.XXO.BU-1 (ATCC번호 CRL 1580)
FOX-NY (ATCC번호 CRL 1732)
SP2/0-Ag14 (JCRB번호 0029)
이러한 세포주 중에서 앞에서 말한 바와 같은 바람직한 특징을 구비하고 있는 것은, 일군의 마우스 골수종 세포주 혹은 이들 마우스 골수종 세포주에서 유도된 세포주이다. 유도된 세포주란, 약제 내성 등의 부가적인 형질을 다시 도입하여 클로닝한 세포주를 의미한다.
본 발명에서의 제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포는, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포이다. 일반적으로 진핵세포에서는 다음과 같은 사이클로 세포주기가 구성되어 있다. 세포 증식을 계속하는 세포는 G1기~M기의 사이클을 반복함으로써 세포 분열을 계속한다. 한편, 세포 증식을 정지할 때는, M기 후에 G0기라고 불리는 안정한 상태가 되어 세포주기가 정지한다.
-[G1기]-[S기]-[G2기]-[M기]-
이러한 각 세포주기 중에서, S기는 핵산의 합성(synthesis)이 행해지는 기간이다. 이때, 염색체를 구성하는 게놈 DNA가 복제되고, 세포분열의 준비가 갖추어진다고 생각된다. 2 배가 된 게놈 DNA는 M기에서 유사분열에 의해 2개의 세포로 분리된다. 그런데, 특정의 세포에서 게놈 DNA의 복제가 이루어진 후에 세포의 분열로 진행되지 않는 현상이 관찰되었다. DNA의 합성을 완료하면서 M기의 세포 분열로 이행하지 않는 기간은 Extra-S기라고 명명되었다. 분열하지 않는 세포에서는 합성된 게놈 DNA가 축적되고, 세포 중의 DNA의 증가가 관찰된다. 예를 들면, 본 발명에서의 바람직한 백혈병 세포인 MEG-01의 평균 염색체수는 2n=104로서, 정상 세포(2n=46)보다도 훨씬 많다. MEG-01이 게놈 DNA를 증가시키는 세포주기에 Extra-S기를 포함하고, 염색체를 배수체로 하는 성질을 가지기 때문이다(Oncogene 13: p695-703, 1996)(도 1). 이와 같이 본 발명에서는, 세포주기에 Extra-S기를 포함하고, 염색체를 배수체로 하는 성질을 가지는 백혈병 세포를 이용함으로써, 헤테로 하이브리도마로부터 항체생산 세포 유래의 염색체의 탈락을 막는 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서의 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포는, 앞에서 말한 골수종 세포와는 다른 동물종에 유래하면서, 바람직하게는 후술하는 제3 세포가 유래하는 종과 동일한 종에 유래하는 백혈병 세포이다. 백혈병 세포는, 백혈병을 가지는 개체의 조혈조직이나 말초혈로부터 얻을 수 있다. 조혈조직에는 골수, 비장 혹은 림프절 등이 포함된다. 백혈병으로서는, 예를 들면 거핵구계 백혈병을 들 수 있다. 예를 들면, 말초혈을 피콜법으로 원심분리하여 특정 비중의 세포분화를 회수함으로써, 백혈구 세포 혹은 단핵구 세포 등을 분리할 수 있다.
더욱 분리된 백혈병 세포가 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 것은 세포의 염색체의 증가를 지표로서 확인할 수 있다. 염색체의 증가는, 예를 들면 12-o-tetradecanoyl phorbol 13 acetate(TPA)로 처리한 세포의 배수성(염색체 총수)의 증가에 따라 확인할 수 있다. 배수성(ploiding)의 증가는 플로우사이토미터(flowcytometer)나 배수성 애널라이저(ploiding analyzer)에 의해 검출할 수 있다.
또한, 공지의 백혈병 세포를 본 발명에 이용할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명에서의 제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서 이용 가능한 주지의 세포로서 이하와 같은 세포주를 예시할 수 있다. MEG-01 및 HEL은 인간의 거핵구계 백혈병 세포주이다(Blood 66: p1384-1392, 1985, J.Clin.Invest.85: p1072-1084).
MEG-01(ATCC번호 CRL-2021)
HEL (JCRB번호 O062)
UT-7 (N.Komatsu et al. Cancer Res.51: 341-348, 1991)
M07e(Avanzi GC et al. J Cell Physiol. 1990 Dec;145(3):458-64.)
MEG-A2(JCRB No.IFO50478)
DAMI(Blood 89: p4238, 1997)
특히, MEG-01은 선택 마커로서 유용한 8AG 내성을 가진다. 또한, MEG-01 자신이 면역 글로불린을 생산하지 않기 때문에, 항체생산 세포와의 하이브리도마 제작용 융합 파트너로서 바람직하다.
본 발명의 융합 파트너 세포는, 제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포와, 제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포를 세포 융합함으로써 얻을 수 있다. 세포 융합에는, 폴리에틸렌글리콜(PEG)법이나 전기 융합법 등의 주지의 세포융합기술을 이용할 수 있다.
폴리에틸렌글리콜법의 조작은 다음과 같다. 우선, 골수종 세포와 백혈병 세포의 세포비는 각각 특정의 융합조건에 대해서 최적화된다. 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 농도는, PEG의 분자량 등의 조건을 기초로 당업자는 최적의 조건을 선택할 수 있다. 예를 들면, 35%의 PEG1500(Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)은 일반적인 세포 융합을 위한 조건의 하나이다. 1mL의 35% PEG1500을 세포 펠릿/세포 혼합물에 1.5분간 천천히 가한 후, 천천히 혈청 불포함 배지, 다음에 혈청 함유 배지로 희석함으로써 세포 융합이 이루어진다.
세포 융합을 쉽게 하기 위해 마찬가지로 사용될 수 있는 다른 방법에는 전기 융합이 포함된다. 이 방법에서는, 세포를 특수한 완충액 내에 두고, 전기장을 가함으로써 세포를 정렬시킨다. 정렬한 세포는 다른 세포와 접촉의 기회가 늘어 효율적으로 세포를 융합시킬 수 있다.
융합 혼합물을, 예를 들면 15% 소 태아 혈청을 함유하는 HB-GRO배지(Irvine Scientific, Santa Ana, California) 150ml 중에서 세포 밀도 8×105 세포/mL로 하고, 2.0×105 세포/웰로 96웰 플레이트에 분산시킨다. 세포를 5-10% CO2 분위기 하에서 37℃에서 배양하여 8AG내성으로 하고, 융합 파트너 세포를 얻을 수 있다. 얻어진 융합 파트너 세포는 필요에 따라 클로닝할 수 있다. 클로닝된 융합 파트너 세포는 하이브리도마의 제조에 있어서 재현성의 유지에 공헌한다.
예를 들면, 제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포로서 SP2/0-Ag14를, 제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포로서 MEG-O1을 각각 이용할 수 있다.
이렇게 하여 제공되는 융합 파트너 세포는, 그 자신이 장기간에 걸쳐 안정하게 계대(繼代)할 수 있어 항체생산 세포로부터 모노클로날 항체를 얻기 위한 보편적인 융합 파트너 세포가 된다. 즉, 마우스의 호모하이브리도마에 있어서 확립되어 있는 마우스 골수종 세포와 같이, 마우스 이외의 생물종 유래의 항체생산 세포를 이용하여 하이브리도마를 안정하게 가져올 수 있는 융합 파트너로서 유용하다. 본 발명에 의해 얻어진 융합 파트너 세포 중에서 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14와 인간 백혈병 세포주 MEG-01을 융합함으로써 얻어진 융합 파트너 세포인 SPYMEG는, 특허 생물 기탁 센터에 수탁번호 FERM BP-10761로서 기탁되어 있다.
(a)기탁기관의 명칭·수신인명
명칭: 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁센터
수신인명: 일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번 1호 중앙 제6(우편번호 305-8566)
(b)기탁일: 2006년 2월 24일
(c)수탁번호: FERM BP-10761
(2006년 2월 24일에 기탁된 FERM P-20816으로부터 이관)
본 발명은, 상기 융합 파트너 세포를 이용하여 얻을 수 있는 하이브리도마에 관한 것이다. 즉, 본 발명은, 하기 세포 (1) 및 (2)를 융합함으로써 얻을 수 있는 하이브리도마를 제공한다.
(1)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합함으로써 얻을 수 있는 융합 파트너 세포,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(2)제3 세포.
또한, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 하이브리도마를 제조하는 방법을 제공한다.
(1)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(2)단계 (1)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계,
(3)단계 (2)에서 회수한 융합 파트너 세포에 제3 세포를 융합시키는 단계 및
(4)단계 (3)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 하이브리도마를 회수하는 단계.
본 발명에서의 제3 세포는, 제1 세포 또는 제2 세포와 같은 종 혹은 다른 종에 유래하는 세포이다. 구체적으로는, 예를 들면 인간, 토끼, 마우스, 랫트, 소, 염소 및 양 등에 유래하는 세포를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 마우스 유래의 골수종 세포(제1 세포)와 인간 유래의 백혈병 세포(제2 세포)에 의해 얻어진 융합 파트너를 이용하는 경우, 제3 세포로서 바람직한 세포는 인간 혹은 마우스 유래이다. 특히 인간 유래의 세포를 제3 세포로서 이용할 수 있는 것은, 본 발명의 융합 파트너 세포의 큰 이점이다.
본 발명에서의 제3 세포는, 최종적으로 장기간에 걸친 배양을 가능하게 하는 것이 기대되는 세포이다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 목적으로 하는 물질을 생산하는 능력을 가지는 세포를 제3 세포로서 이용할 수 있다. 이러한 세포를 본 발명의 융합 파트너와 세포 융합함으로써, 목적으로 하는 형질을 가지는 세포를 장기간에 걸쳐 유지할 수 있는 하이브리도마를 얻을 수 있다. 하이브리도마로 함으로써, 세포가 장기간 유지할 수 있도록 하는 것을 일반적으로 불사화(immortalize)라고 한다.
본 발명에서는, 목적으로 하는 생리활성물질을 생산하는 임의의 세포를 제3 세포로서 이용할 수 있다. 본 발명에서의 바람직한 생리활성물질로서 항체를 들 수 있다. 즉, 항체생산 세포는 본 발명에서의 제3 세포로서 바람직하다. 항체생산 세포에는, 예를 들면 백혈구 세포(말초 림프구 세포), 비장 세포 등을 들 수 있다. 이러한 세포를 생체로부터 채취하는 방법은 공지되어 있다. 제3 세포로서는, 보다 구체적으로는 감염증의 병원체 항원에 노출된 이력이 있는 대상 유래의 항체생산 세포를 들 수 있다. 감염증의 병원체 항원에 대해 노출 이력이 있는 대상이란, 감염증의 병원체 항원(백신)이 백시네이션된 대상 또는 감염증에 감염 이력이 있는 대상 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 감염증은 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인플루엔자, AIDS, HCV나 HBV 등의 바이러스성 간염 등을 예시할 수 있다.
특히 말초혈 림프구는 본 발명에서의 항체생산 세포로서 바람직하다. 말초혈 림프구는 채혈에 의해 쉽게 얻을 수 있다. 마우스의 말초혈 림프구를 본 발명에 기초하여 하이브리도마로 함으로써, 마우스 항체를 생산하는 하이브리도마를 쉽게 얻을 수 있다. 또한, 인간의 말초혈 림프구를 본 발명에 기초하여 하이브리도마로 함으로써, 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 쉽게 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 융합 파트너와 제3 세포는 앞에서 말한 제1 세포와 제2 세포의 세포 융합과 같은 방법에 의해 세포 융합할 수 있다. 세포 융합에는 PEG법이나 전기 융합법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 파트너로서 SPYMEG를 이용하여 인간 말초혈 림프구와의 세포 융합을 하는 경우, 바람직한 조건으로서 다음과 같은 조건을 나타낼 수 있다.
우선, 융합시키는 말초혈 백혈구(PBL)의 세포수는 1×107~108개로 조정하는 것이 바람직하다. SPYMEG와 PBL을 2:1~10:1의 비율로 혼합하여 일단 원심분리하여 침전시키고, 상등액을 제거한다. 회수한 세포분획에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 가하여 세포를 융합시킨다. 세포 융합에 이용하는 PEG의 농도는 30%~70%, 바람직하게는 40~60%, 보다 바람직하게는 50%이다. 세포수에 따라 O.1mL~2.0mL, 바람직하게는 O.6mL~1.0mL의 PEG용액을 60초~90초에 걸쳐 피펫으로 세포에 가하면서 뒤섞는다. PEG용액을 다 가하면, 그대로 피펫으로 2분~3분 뒤섞는다. 그 후, 10~14mL의 무혈청 배지를 30초~60초에 걸쳐 조금씩 가하면서 뒤섞는다. 그 후, 무혈청 배지를 가하고 원심분리한다. 원심 후, 상청(上精)을 제거하고 세포를 무혈청 배지에서 1회 세정한다. 세정 후의 세포를 HAT배지(15% FBS, HAT(x50), in RPMI)로 현탁하고, 96-웰 플레이트에 접종한다.
당업자가 통상의 세포 융합에 사용하는 무혈청 배지나 PEG를 적절히 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서의 세포 융합에는 이하와 같은 배지나 PEG를 이용할 수 있다.
PEG: PEG1500(Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)
HAT: HAT supplement(50x)(GIBCO제, 카탈로그 No.21060-017)
무혈청 배지: RPMI1640(SIGMA제, 카탈로그 No.R8758)
그 밖에도, 항체생산 세포는 면역 동물에서 얻을 수도 있다. 미리 임의의 항원을 적절한 아주반트(adjuvant)와 함께 면역 동물에 면역한다. 항원은, 담체 단백질과 결합시켜 면역원으로 하는 것도 가능하다. 면역원을 얻기 위한 담체 단백질에는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 혹은 소 혈청 알부민(BSA) 등을 이용할 수 있다. 면역 동물에는 토끼, 마우스, 랫트, 염소 혹은 양 등이 일반적으로 이용된다. 아주반트로서는 프로인트 완전 보조제(FCA) 등이 일반적으로 이용된다(Adv. Tubercl. Res., 1:130-148, 1956). ELISA나 이중면역 확산법에 의해 항체가(antibody titer)를 모니터하고, 충분히 항체가가 상승한 것을 확인하여 항체생산 세포를 적출하고 그 세포를 분산시켜 세포 융합에 이용하는 항체생산 세포로 한다. 인간과 같이, 비장세포나 말초혈 림프구를 회수함으로써 항체생산 세포를 회수할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 항체생산 세포는, 본 발명의 융합 파트너와 융합함으로써 본 발명의 하이브리도마로 할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 하이브리도마의 제조방법에 있어서, 제3 세포에 항체생산 세포를 이용함으로써 항체를 제조할 수 있다. 즉, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
(1)하기 단계에 의해 융합 파트너 세포를 얻는 단계;
(A)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(B)단계 (A)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계;
(2)단계 (1)에서 얻은 융합 파트너 세포에 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계; 및
(3)단계 (2)에서 얻은 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 항체를 회수하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 항체의 제조에 유용한 항체를 생산하는 세포의 제조방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항체생산 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
(1)하기 단계에 의해 융합 파트너 세포를 얻는 단계;
(A)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(B)단계 (A)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계.
(2)단계 (1)에서 얻은 융합 파트너 세포에 항체생산 세포를 재융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계; 및
(3)단계 (2)에서 얻은 하이브리도마를 항체생산 세포로서 회수하는 단계.
본 발명의 융합 파트너 세포를 이용함으로써, 항체를 안정하게 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있다. 하이브리도마는 적절한 선택 배지에서 배양함으로써, 세포 융합에 성공한 세포를 우선적으로 증식시킬 수 있다. 예를 들면, 융합 파트너 세포로서 본 발명의 SPYMEG를 이용했을 때는 HAT를 포함하는 선택 배지를 이용할 수 있다.
본 발명에 의한 항체의 제조방법 혹은 항체생산 세포의 제조방법에 있어서, 하이브리도마는 클로닝할 수 있다. 하이브리도마를 클로닝하는 방법은 공지되어 있다. 즉, 한계 희석법에 의해 하이브리도마를 클로닝할 수 있다. 한계 희석된 하이브리도마는 이론적으로 1 세포에서 증식한 세포집단을 형성한다. 이렇게 하여 얻어진 세포집단은 균일한 유전적 특징을 가지는 세포집단, 즉 클론이다. 클론화된 하이브리도마에서 얻어지는 항체는 모노클로날 항체라고 불린다. 모노클로날 항체는 고도로 균일한 항원 결합특성을 가지는 항체이다.
즉, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 모노클로날 항체의 제조방법을 제공한다.
(1)하기 단계에 의해 융합 파트너 세포를 얻는 단계;
(A)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(B)단계 (A)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계;
(2)단계 (1)에서 얻은 융합 파트너 세포에 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마로 하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 클로닝하는 단계; 및
(3)단계 (2)에서 클로닝된 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 모노클로날 항체를 회수하는 단계.
혹은 본 발명은 상기 항체의 제조에 유용한 항체를 생산하는 세포의 제조방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항체생산 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
(1)하기 단계에 의해 융합 파트너 세포를 얻는 단계;
(A)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(B)단계 (A)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계.
(2)단계 (1)에서 얻은 융합 파트너 세포에 항체생산 세포를 재융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계; 및
(3)단계 (2)에서 얻은 하이브리도마를 항체생산 세포로서 회수하는 단계.
본 발명에서는, 항체생산 세포를 클로닝할 수 있다. 목적으로 하는 항체를 생산하는 항체생산 세포를 클로닝함으로써, 모노클로날 항체를 생산하는 세포로 할 수 있다. 즉, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조방법을 제공한다.
(1)하기 단계에 의해 융합 파트너 세포를 얻는 단계;
(A)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
(a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
(b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포,
(B)단계 (A)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계.
(2)단계 (1)에서 얻은 융합 파트너 세포에 항체생산 세포를 재융합시켜 하이브리도마로 하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 클로닝하는 단계; 및
(3)단계 (2)에서 클로닝된 하이브리도마를 항체생산 세포로서 회수하는 단계.
본 발명의 하이브리도마는 in vitro에서 안정한 항체생산능을 가진 항체생산 세포이다. 그 때문에, 헤테로 하이브리도마이면서, 적절한 배지 중에서 세포의 증식과 함께 항체생산능도 유지한다. 그 때문에, 클로닝의 과정에서 필요한 클론을 잃게 될 가능성이 낮다. 또, 일단 수립된 하이브리도마 클론도 안정하게 유지할 수 있다.
본 발명에 의해 얻어진 하이브리도마 혹은 그 클론의 배양에 의해, 항체 혹은 모노클로날 항체를 생산시킬 수 있다. 배지로서는 무혈청 배지 또는 저농도 혈청 배지 등을 이용하면, 항체의 정제가 용이하게 되므로 바람직하다. 기본적인 동물세포 배양배지로는 DMEM배지, RPMI1640배지 혹은 ASF배지 103 등이 알려져 있다. 또한, 누드 마우스나 스키드 마우스의 복강에 접종하여 복수로서 모노클로날 항체를 회수할 수도 있다.
배지에 혈청을 가할 때는, 소 태아 혈청(이하, FCS라고 생략함)을 5-10% v/v로 이용하면 된다. 또한, 이러한 배지에서 본 발명의 하이브리도마를 배양할 때, 주지의 항체생산 증강인자를 첨가하면 유리하다. in vitro에서 항체생산을 증강하는 성분에는, 예를 들면 D-페니실라민, 아세트 초산, 비구아나이드류, 비타민 K5, N-아세틸글루타민산(일본특허공개 평8-70858), 인터루킨 6(Nature, 324:6092, 73-6:1986), 당알코올(일본특허공개 평2-200177), 리포폴리사카라이드(일본특허공개 평4-20294), 포르볼 에스테르(일본특허공개 평1-171494) 혹은 부티르산(hybridoma Vol.4, No.1, p63;1985) 등이 알려져 있다. 이와 같이 하여 얻어진 모노클로날 항체는 황산 암모늄, 황산 나트륨 등에 의한 염석법, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과법 혹은 어피니티 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또, 본 명세서에서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 추가된다.
도 1은 MEG-O1의 세포주기를 나타낸 도면이다.
도 2는 ELISA법에 의한 인간IgG 생산 하이브리도마의 스크리닝의 개념을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 융합 파트너 세포 SPYMEG와 종래의 융합 파트너 세포 Karpas의 형태를 비교한 사진이다.
도 4는 클론 KO142(+), MK16(+), MK99(+)의 각 용출 분획의 IgG를 확인한 사진이다. 도면 중의 (+)은 ELISA 양성클론, (-)은 ELISA 음성클론을 나타낸다.
도 5는 각 클론의 용출 프랙션, 투석·농축 후의 샘플의 IgG를 확인한 사진이다.
도 6은 SPYMEG 세포융합의 개량방법의 단계를 나타내는 도면이다.
도 7은 세포융합방법의 개량 전후의 콜로니 형성수, IgG생산 클론수를 비교한 도면이다. 96홀 플레이트 4장당 콜로니 형성 웰수, IgG생산 웰수를 나타내었다. 세포융합의 단계를 개량함으로써, 콜로니 형성 웰수, IgG생산 웰수가 현저하게 증가하였고, 상기 웰 중에서 인플루엔자 백신을 특이적으로 인식하는 항체를 인플루엔자의 스크리닝을 통해 복수개 얻을 수 있었다. 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 확립에 비로소 성공하였다.
도 8은 인플루엔자에 반응하는 IgG생산 클론의 ELISA에서의 반응성을 나타내는 도면이다.
도 9는 Western-blotting에 의한 인플루엔자 백신에 대한 반응성을 나타내는 도면이다.
도 1O은 정제 인간 IgG(6-19)의 SDS-PAGE 및 반응성의 확인을 나타내는 도면이다. 표 중의 값은 인플루엔자 HA백신을 감작한 ELISA의 값으로, 파장 450nm에서의 흡광도를 나타낸다.
[실시예 1]
융합 파트너 세포의 제작
RPMI+5% FCS(통상 배지)의 배양액으로 배양해 온 SP2/0-Ag-14(3×107)와 MEG-01(3~6×107)의 세포를 통상의 방법에 따라 PEG로 융합시켰다. 융합 세포를 3일간 통상의 배지(RPMI+5% FCS)에서 배양하고, 3일째에 FCS를 포함하지 않는 RPMI용액에서 19일간 배양하였다. 19일째에 8AG를 포함하는 통상 배지에서 한계 희석을 하고, 5일간 배양하였다. 융합 세포가 증식하여 왔으므로, 이를 취하여 융합 파트너 세포 SPYMEG로 하였다. SPYMEG는 수탁번호 FERM BP-10761(FERM P-20816으로부터 이관)로서 2006년 2월 24일자로 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터에 기탁되었다. SPYMEG는 8AG내성이고, HAT배지에서 배양하면 사멸하였다.
[실시예 2]
PEG법에 의한 헤테로 하이브리도마의 제작
a)인간 말초혈 백혈구의 회수(비중원심법)
헤파린 채혈한 인간 말초혈 40mL을 1OmL씩 50mL의 튜브에 분주하고, 멸균 PBC를 25mL 가하여 혼합하고, HISTOPAQUE(SIGMA H8889)를 50mL튜브에 15mL씩 분주 한 것에 중층하고 800rpm, 30 분간 실온에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 백혈구층을 회수하였다.
b)융합 파트너 세포(SPYMEG)의 회수
75cm2 배양 플라스크에서 증식시킨 SPYMEG(배지: 10% FBS-RPMI)를 회수하였다.
c)세포 융합
회수한 인간 말초혈 백혈구와 SPYMEG를 2:1~10:1의 비율이 되도록 혼합하여 원심하였다(말초혈 40mL에서 4~8×107개 얻어졌다. SPYMEG는 75cm2 프라스코 4개분을 사용하였다). 펠렛에 50% PEG(PEG4000, MERCK Cat No 1097270100, RPMI(RPMI1640, SIGMA, Cat No R8758)에서 등량 희석) 0.6-1.0mL 가하여 세포 융합을 하였다. RPMI혈청 무첨가 배지에서 세정 후, 15% FBS(EQUITECH-BIO INC Lot.SFB30-1548)-HAT(HAT supplement(BM-condimed, roche Cat No 663573)(50x), GIBCO Cat No 21060-017)1% BM 배지 160 mL에서 현탁하고, 96-웰 플레이트 8장에 접종하였다. 접종으로부터 3일 후에 배지를 교환하고, 하이브리도마의 콜로니 형성이 확인된 단계에서(2~3주일 후) 96-웰 플레이트로부터 배양상청을 샘플링하여 1차 스크리닝을 하였다.
[실시예 3]
IgG정제 프로토콜
샘플(배양상청)을 유속 1적/초로 용리하고, 유통 분획(flow through fraction)을 수집하였다. PBS/0.1% NaN3로 칼럼을 유속을 최대로 하여 세정하였다(흡광도계로 A280=0.05 이하가 될 때까지 세정하였다). 칼럼 베드 부피의 2-5배량의 0.17M Glycine-HCl 완충액 pH 2.3으로 유속은 전속으로 해리하였다. 분획 콜렉터를 이용하여 해리물을 시험관에 모았다. 시험관에는 1 M Tris-HCl 완충액 pH8.0을 해리물량(mL)의 1/5 이상 넣어 두었다. 해리물과 중화용 1M Tris-HCl 완충액 pH8.0은 가능한 한 빨리 혼합하였다. 각 분획의 A280을 측정 후, 단백이 있는 프랙션을 찾아 A280=0.1 이상의 프랙션을 풀링(pooling) 하였다.
풀링한 후 pH 시험지로 pH 8.0임을 확인하였다. 풀링한 것은 12.5% 겔, 샘플 완충액(2ME+)에서 SDS-PAGE를 행하여 순도를 체크하였다. 각 레인당 샘플량은 5 ㎍으로 하고, 이전 로트(lot)도 동량 영동하여 비교하였다. 투석 튜브에 채워서 회수 부피의 100배 이상의 PBS 또는 PBS/0.1% NaN3로 1회 6시간 이상 3회 이상 투석하였다. 농축 종료 후 투석 튜브를 탈이온수로 충분히 세정하고 나서 투석 튜브를 잘 비벼 튜브벽에 붙은 단백질을 녹이고, 농축액을 튜브로부터 꺼냈다. 그 후, 농도를 측정하였다.
혹은, 분획 콜렉터를 이용하지 않고 해리물을 모아 1개의 메스실린더, 비커 등으로 교반하면서 회수할 수도 있다. 이 경우도 중화용 1M Tris-HCl 완충액 pH 8.0을 해리물 회수량(mL)의 1/5 이상 넣고, 회수 후 pH시험지로 pH 8.0임을 확인한다. 만약 pH 8.0 이하일 때는 중화용 완충액을 가하여, 즉석에서 pH 8.0으로 한다.
[실시예 4]
ELISA법에 의한 인간IgG의 측정
a)감작 플레이트의 제작
토끼 항인간IgG 폴리클로날 항체를 감작용 완충액(PBS)으로 10㎍/mL로 희석하였다. 50μl/웰씩 마이크로 플레이트(Nunc MaxiSorp)에 분주하였다. 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 감작용 완충액을 제거하고 수분을 흔들어 취하였다. 차단용 완충액(BSA 0.1% NaN3 in PBS)를 100μl/well씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하였다.
b)ELISA법
하이브리도마 배양상청을 감작 마이크로 플레이트(a에서 준비한 것)에 50μl/well씩 분주하였다. 실온에서 1시간 정치 반응하였다. 반응액을 제거하고, 세정용 완충액(0.05% Tween 20/PBS)으로 3회 세정 후, 수분을 흔들어 취하였다. 표식항체(Peroxidase계 5000배 희석하여 사용, 항인간IgG POD 표식 폴리클로날 항체)를 희석하고, 50μl/well씩 분주한 후, 실온에서 1시간 정치하였다. 효소기질액(테트라메틸벤티딘 용액)을 제조하였다. 플레이트의 표식항체액을 제거하고, 세정용 완충액으로 3회 세정 후, 수분을 흔들어 취하였다. 효소기질액을 50μl/웰씩 분주하였다. 실온에서 15분 정도 반응시켰다. 반응 정지액(2N H2SO4)을 50μl/웰씩 분주하였다. 플레이트 리더에 의해 흡광도(주요파장 A450/부파장 A620)를 측정하였다. 본 시험에서 이용한 ELISA법의 개념도를 도 2에 나타내었다.
[실시예 5]
웨스턴-블롯팅에 의한 인간IgG의 확인
1mg/mL의 항체 용액과 샘플 완충액을 등량 혼합하고, 5분간 자비(煮沸)하였다. 10μl(항체 5㎍)를 12.5% 겔에 어플라이하였다. SDS-PAGE를 행하고, PVDF막(immobilon-PCatNo IPVH00010)에 전사하여 4℃ O/N in 2% 스킴밀크/PBS로 블로킹하였다. 검출용 항체로서 항랫트 IgG POD×2500 in 10% BlockAce/PBS를 이용하여 실온에서 1시간 처리하였다. 완충액(0.05% Tween 20 in PBS)으로 3회 세정하였다. 기질은 PIERCE(super signal WestPico Chemiluminescenct Substrate, code.34080)을 이용하고, 노광은 1분 현상하였다. 필름은 Hyperfilm ECL Amersham Bioscience Cat No RPN3103K를 이용하고, 현상액은 렌돌(후지필름), 정지액은 3% 초산, 정착액은 렌픽스(후지필름)를 각각 이용하였다.
[실시예 6]
결과
a)융합 파트너 세포의 제작
제작한 융합 파트너 세포 SPYMEG와 기존의 인간 융합 파트너 세포Karpas(Abraham Karpas et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Feb 13;98(4):1799-1804)를 비교하여 관찰하였다(도 3). SPYMEG는 일반적인 마우스 골수종 세포와 같이 구형의 세포로서, Karpas에 비교하여 접착성이 약하였다. 또한, 증식능은 높았다(데이터 미도시). 이러한 것으로부터, SPYMEG의 융합 파트너 세포로서의 성능은 Karpas보다도 높은 것으로 나타났다. 또한, 확립된 융합 파트너 세포 SPYMEG는 동결 후에 기면(起眠)하고 100mL배양(1개월 배양)을 했을 때에도 생산능을 소실하지 않고 안정적인 것이 나타났다(데이터 미도시).
b)SPYMEG와 인간 말초혈 백혈구 세포를 융합한 하이브리도마(항체생산 세포)의 제작
표 1에 SPYMEG와 인간 말초혈 백혈구 세포를 융합하여 얻어진 하이브리도마(항체생산 세포)로부터의 IgG의 생산을 나타내었다. 하이브리도마를 96-웰 마이크로 플레이트 8장(768웰)에 접종하고, 콜로니를 형성한 웰 수, 그 중 IgG를 생산한 웰 수, 또 그 중에서 3주일 이상 배양했을 때에 IgG의 생산을 유지한 웰 수를 나타내었다. ELISA법에 의한 스크리닝을 수행하였다.
이 결과로부터, 본 시험에 의해 IgG를 생산하는 하이브리도마가 제작된 것으로 나타났다. 또한, 기존의 융합 파트너 세포 Karpas로부터는 IgG생산 클론을 얻을 수 없었다. 이로부터, SPYMEG는 Karpas보다도 효율적으로 하이브리도마를 제작할 수 있는 융합 파트너 세포인 것으로 나타났다.
콜로니 형성 웰 IgG생산 웰 IgG생산 클론수(LD전 3주일 이상 배양)
M.K 1 230/768 73/230 31/73
K.O 1 261/768 80/261 40/80
M.K 2 205/768 47/205 26/47
T.M 1 178/768 40/178 미(未)
karpas (T.M 1) 10/768 2/10 0
IgG생산 클론을 프로틴 G칼럼에 첨가한 후 용출시켰을 때의 각 용출 분획에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴-블롯팅에 의해 확인하였다(도 4). 도면 중의 (+)은 ELISA 양성 클론, (-)은 ELISA 음성 클론을 나타낸다. KO142 프랙션 2는 ELISA양성이고, SDS-PAGE에서도 인간IgG의 존재가 확인되었지만, 웨스턴-블롯팅에서는 시그널을 확인할 수 없었다. 이번에는 어떠한 원인으로 검출할 수 없었던 것이 생각되었다.
또한, 각 클론의 용출 프랙션, 투석·농축 후의 샘플을 확인하였다(도 5). SDS-PAGE에서 ELISA 음성 클론에서도 IgG의 H쇄, L쇄라고 생각되는 밴드가 확인되고 있는데, 항인간 IgG항체를 이용한 Western-blot의 결과 검출되지 않은 점에서 FBS유래의 IgG라고 예상되었다. ELISA 음성 클론의 lane5에서 밴드가 검출되고 있는데, 음성의 판단이 배양상청에서의 ELISA의 결과인 점에서 이 클론은 극히 소량 IgG를 생산하는 것으로 여겨진다. 또한, 이번의 결과로부터, SPYMEG 자신도 인간IgG를 생산하지 않는 것이 확인되었다.
표 2에 양성을 나타낸 각 클론 배양상청으로부터의 정제IgG의 수량을 나타내었다. 배양상청 100mL로부터의 정제IgG에서 산출한, 배양상청 중의 인간IgG 농도는 2~11㎍/mL이었다. 통상의 마우스 하이브리도마와 거의 동등한 농도인 것이 확인되었다.
배양상청량 (ml) 농도 (mg/ml) 액량 (ml) 수량 (mg) 배양상청 IgG 농도(㎍/ml)
MK16(+) 100 0.329 0.6 0.1974 1.974
MK99(+) 100 0.572 2 1.144 11.44
KO120(+) 100 0.317 1 0.317 3.17
KO142(+) 100 0.616 0.6 0.3696 3.696
[실시예 7]
헤테로 하이브리도마의 제작방법의 개량
[실시예 2]에서는 말초혈을 PBS로 희석하고 HISTPAQUE에 중층하여 원심분리하였지만, 보다 순도가 높은 백혈구(B세포)를 얻기 위해 말초혈을 HetaSep(HETASTARCH)와 혼합하여 적혈구를 제거하는 전처리를 하고 나서, HISTPAQUE에 중층하는 방법에 의해 인간 말초혈 백혈구를 회수하였다(도 6).
구체적으로는, 인플루엔자 HA백신의 접종을 받은 환자 유래의 말초혈 약 10 ml을 15 ml튜브에 넣고, HetaSep(StemCell Technologies Inc CAT#07906)을 2~3ml 가하였다. 전도(轉倒)교반을 하고 실온에서 1시간 정치하였다. 정치 후의 상등(오렌지색)을 회수하고, HISTPAQUE를 15 ml튜브에 계면을 흩뜨리지 않도록 파스퇴르 피펫으로 천천히 중층하였다. 1800rpm, 30분간 실온에서 원심분리를 하고, 원심분리 후, 용액의 한가운데 형성된 백색 밴드-양 층(백혈구층)을 파스퇴르 피펫으로 50ml 튜브에 회수하였다. 30ml정도의 무혈청 배지 DMEM을 가하고, 1600rpm으로 8 분간 원심분리를 하여 세포를 세정하였다.
[실시예 2]에 기재된 방법에 의해, 회수된 인간 말초혈 백혈구와 융합 파트너 세포 SPYMEG의 세포 융합을 하였다. 세포 융합을 위한 기초 배지로서 PRMI 대신에 무혈청 배지 DMEM을 이용하였다.
제작된 헤테로 하이브리도마에 대해 (실시예 3) 및 (실시예 4)에 기재된 방법에 의해, IgG의 정제 및 ELISA법에 의한 인간IgG의 측정을 하였다. 그 결과, 세포 융합에 의해 얻어진 콜로니의 형성수 및 IgG생산 클론수 모두 헤테로 하이브리도마의 제작방법에 개량을 가함으로써 증가하는 것으로 확인되었다(도 7).
[실시예 8]
인플루엔자 백신에 대한 반응성의 확인
[실시예 7]의 방법에 의해 제작된 IgG생산 클론의 인플루엔자 백신에 대한 반응성을 확인하였다. 구체적으로는, 하기 단계에 의해 인플루엔자 백신을 감작한 플레이트 및 아무것도 감작하지 않고 블로킹만을 행한 플레이트(비특이 반응하는 클론의 제거)에서의 클론의 IgG생산을 샌드위치 ELISA로 확인하였다.
인플루엔자 백신을 PBS로 30배 희석한 것을 ELISA 플레이트에 50μl/well 분주하여 하룻밤 정치하였다(감작). 인플루엔자 백신으로서는 인플루엔자 HA백신(화학 및 혈액요법 연구소, 일본)을 이용하였다. 본 제는 인플루엔자 바이러스의 A형 및 B형 균주(株)를 각각 개별적으로 발육 계란으로 배양하고, 증식한 바이러스를 포함하는 요막강액(尿膜腔液)을 자당밀도 구배원심법 등에 의해 정제 농축 후, 바이러스 입자를 에테르 등에 의해 처리하여 헤마글루티닌(이하, HA) 화분 부유액으로 하고 포르말린으로 불활화한 후, 인산염 완충 염화 나트륨액을 이용하여 각 균주의 바이러스의 HA가 규정량 포함되도록 희석 조정되어 있다.
용액을 제거하고, 블로킹 완충액을 200μl/웰 가하여 하룻밤 정치하였다(블로킹). 블로킹 완충액을 제거하고, 하이브리도마의 배양상청을 50μl/well 가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 상청을 제거하고, 0.05% TweenPBS로 3회 세정하였다.
항인간 IgGHRP표식항체(MBL:206)를 5000배 희석으로 가하여 1시간 실온에서 반응시켰다. 3회 세정 후, 발색기질을 50μl씩 가하여 15분간 발색시키고, 반응 정지액을 가하여 플레이트 리더로 흡광도(OD450)를 측정하였다.
그 결과, 1O 클론만큼 인플루엔자 백신에 반응하는 클론이 확인되었다(도 8). 본 발명의 헤테로 하이브리도마에 의해, 항원 특이적으로 반응하는 인간항체의 확립에 성공하였다.
[실시예 9]
Western-blotting에 의한 인간IgG의 확인
인플루엔자 HA백신을 샘플로서 하여 인간IgG 생산 하이브리도마의 배양상청의 Western-blotting의 반응성을 확인하였다.
인플루엔자 HA백신과 샘플 완충액을 등량 혼합하여 5분간 자비하였다. 20μl(백신 10μl)를 12.5% 겔에 적용하였다. SDS-PAGE를 수행하여 PVDF막(immobilon-P CatNo IPVH00010)에 전사하고, 4℃ O/N in 2% 스킴밀크/PBS로 블로킹하였다. 검출용 항체로서 10% BlockAce/PBS 중의 항인간IgG HRP(MBL code 206)×3000 를 이용하여 실온에서 1시간 처리하였다. 완충액(0.05% Tween 20 in PBS)으로 3회 세정하였다. 기질은 PIERCE(super signal WestPico Chemiluminescenct Substrate, code.34080)을 이용하고, 노광은 1분으로 하여 현상하였다. 필름은 Hyperfilm ECL Amersham Bioscience Cat No RPN3103K를 이용하고, 현상액은 렌돌(후지필름), 정지액은 3% 초산, 정착액은 렌픽스(후지필름)를 각각 이용하였다.
그 결과, 클론(6-19)에서 특이적인 밴드를 검출하였다(도 9).
[실시예 10]
정제 인간IgG(6-19)의 SDS-PAGE 및 반응성의 확인
우선, (실시예 9)의 Western-blotting에서 반응성을 나타낸 인간IgG 생산 하이브리도마의 배양상청으로부터 하기 단계에 의해 인플루엔자 HA백신에 반응하는 인간IgG를 정제하였다.
배양상청을 유량 1적/초로 적용하고, 유통분획을 회수하였다. PBS/0.1% NaN3-PBS로 칼럼(Protein G 세파로스: Protein G sepharose 4 Fast Flow CatNo:17-0618-03)을 유속을 최대로 하여 세정하였다(흡광도계로 A280=0.05 이하가 될 때까지 세정하였다). 칼럼 베트 부피의 2-5배량의 0.17M Glycine-HCl 완충액 pH 2.3으로 유속은 전속으로 해리한다. 분획 콜렉터를 이용하여 해리물을 시험관에 모았다. 시험관에는 중화용 완충액 1M Tris-HCl 완충액 pH8.0을 해리물량(ml)의 1/5 이상 넣어 두고, 해리물과 완충액을 신속히 혼합하였다. 각 분획의 A280을 측정 후, 단백질이 검출된 분획 중에서 A280=0.1 이상의 프랙션을 풀링하였다. 풀링 후 pH 시험지로 pH 8.0임을 확인하였다. 풀링한 것은 12.5% 겔, 샘플 완충액(2ME+)으로 SDS-PAGE를 행하여 순도를 체크하였다(도 1O). 풀링한 프랙션을 투석 튜브에 채워 회수 부피의 100배 이상의 PBS 또는 PBS/0.1% NaN3로 1회 6시간 이상 3회 투석을 수행하였다. 농축 종료 후 투석 튜브를 탈이온수로 충분히 세정하고 나서, 투석 튜브를 잘 비벼 튜브벽에 붙은 단백질을 녹이고, 농축액을 튜브로부터 꺼냈다. 그런 다음, 농축액에 대해 농도를 측정하였다.
이상의 결과, 배양상청 200ml에서 2.5mg의 정제IgG를 얻을 수 있고(도 1O), 결합활성도 유지되어 있는 것으로 확인되었다.
본 발명은, 동물세포를 이용한 물질 생산에 유용하다. 구체적으로는, 본 발명의 융합 파트너와의 세포 융합에 의해, 유용 물질을 생산하는 세포를 in vitro에서의 배양이 용이한 하이브리도마로 할 수 있다. 유용 물질을 생산하는 세포로서는 항체생산 세포를 들 수 있다.
즉, 본 발명은 항체의 제조방법으로서 유용하다. 특히, 본 발명은 인간항체 생산 세포를 재료로 하여 하이브리도마를 제조할 수 있다. 본 발명에 의해 얻어진 하이브리도마는 인간항체를 안정하게 생산한다. 예를 들면, 감염증으로부터 회복한 환자의 혈액에는 병원체 혹은 병원체가 생산하는 독소를 중화하는 항체를 생산하는 세포가 존재할 가능성이 높다. 이러한 환자의 항체생산 세포를 본 발명에 의해 하이브리도마로 하면, 감염증의 치료에 유용한 항체를 생산할 수 있다.
본 발명에 의해 치료용의 항체를 얻을 수 있는 감염증으로서, 예를 들면 인플루엔자, AIDS, HCV나 HBV 등의 바이러스성 간염 등을 나타낼 수 있다.
혹은 암환자의 항체생산 세포에는, 암세포에 대한 장해작용을 가지는 항체를 생산하는 세포가 존재할 가능성이 있다. 이러한 항체생산 세포를 본 발명에 의해 하이브리도마로 하면, 암의 치료에 유효한 항체를 얻을 수 있다.
본 발명의 항체의 제조방법에 의하면, 인간의 항체생산 세포를 이용하여 인간의 항체를 얻을 수 있다. 인간항체는 인간에 대해 안전하게 투여할 수 있으므로, 치료용 항체로서 바람직하다. 모노클로날 항체의 제조 도구로서 일반적으로 이용되고 있는 마우스에서 얻어진 항체를 인간의 치료에 이용하기 위해서는 키메라화나 인간화 등의 수식이 필요한 것과 비교하면, 본 발명의 항체의 제조방법이 치료용 항체의 제조방법으로서 유용한 것은 명백하다.

Claims (20)

  1. 하기 세포 (a) 및 (b)를 융합함으로써 얻을 수 있는 융합 파트너 세포;
    (a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포 및
    (b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 동물종이 마우스이고, 골수종 세포가 하기 마우스 골수종 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 융합 파트너 세포;
    MOPC21, P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653, F0, S194/5.XXO.BU-1, FOX-NY 및 SP2/0-Ag14.
  3. 제1항에 있어서,
    제2 동물종이 인간이고, 백혈병 세포가 하기 백혈병 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 융합 파트너 세포;
    MEG-01, HEL, UT-7, M07e, MEG-A2 및 DAMI.
  4. 제1항에 있어서,
    제1 세포가 SP2/0-Ag14이고, 제2 세포가 MEG-01인 융합 파트너 세포.
  5. 수탁번호 FERM BP-10761로서 기탁된 융합 파트너 세포 SPYMEG.
  6. 하기 세포 (1) 및 (2)를 융합함으로써 얻을 수 있는 하이브리도마;
    (1)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합함으로써 얻을 수 있는 융합 파트너 세포 및
    (a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
    (b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포
    (2)제3 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    제1 동물종이 마우스이고, 골수종 세포가 하기 마우스 골수종 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 하이브리도마;
    MOPC21, P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653, F0, S194/5.XXO.BU-1, FOX-NY 및 SP2/0-Ag14.
  8. 제6항에 있어서,
    제2 동물종이 인간이고, 백혈병 세포가 하기 백혈병 세포 및 이들의 세포주에서 유도된 세포주로 구성되는 군에서 선택되는 하이브리도마:
    MEG-01, HEL, UT-7, M07e, MEG-A2 및 DAMI.
  9. 제6항에 있어서,
    제1 세포가 SP2/0-Ag14이고, 제2 세포가 MEG-01인 하이브리도마.
  10. 제6항에 있어서,
    융합 파트너 세포가 수탁번호 FERM BP-10761로서 기탁된 SPYMEG인 하이브리도마.
  11. 제6항에 있어서,
    제3 세포가 제2 세포와 같은 동물종에 유래하는 세포인 하이브리도마.
  12. 제11항에 있어서,
    제3 세포가 항체생산 세포인 하이브리도마.
  13. 하기 단계를 포함하는 융합 파트너 세포를 제조하는 방법;
    (1)하기 세포 (a) 및 (b)를 융합하는 단계,
    (a)제1 동물종에서 유래하는 골수종 세포,
    (b)제2 동물종에서 유래하는 백혈병 세포로서, 세포주기에 Extra-S기를 포함하는 백혈병 세포
    (2)단계 (1)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 융합 파트너 세포를 회수하는 단계.
  14. 하기 단계를 포함하는 하이브리도마를 제조하는 방법;
    (1)제13항에 기재된 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와 항체생산 세포를 융합시키는 단계, 및
    (2)단계 (1)에서 융합한 세포를 배양하고, 배양물로부터 하이브리도마를 회수하는 단계.
  15. 하기 단계를 포함하는 항체생산 세포를 제조하는 방법;
    (1)제13항에 따른 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계, 및
    (2)단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 항체생산 세포로서 회수하는 단계.
  16. 제15항에 있어서,
    부가적으로 단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 클로닝하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 하기 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법;
    (1)제13항에 기재된 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계 및
    (2)단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 항체를 회수하는 단계.
  18. 제17항에 있어서,
    부가적으로 단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 클로닝하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 하기 단계를 포함하는 감염증에 대한 항체를 제조하는 방법;
    (1)제13항에 기재된 방법에 의해 얻어진 융합 파트너 세포와, 감염증의 병원체 항원의 노출 이력이 있는 대상 유래의 항체생산 세포를 융합시켜 하이브리도마를 얻는 단계, 및
    (2)단계 (1)에서 얻은 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 감염증에 대한 항체를 회수하는 단계.
  20. 제19항에 있어서,
    감염증이 인플루엔자, AIDS 또는 바이러스성 간염 중 어느 하나인 방법.
KR1020087027724A 2006-04-13 2007-04-13 융합 파트너 세포 KR101429254B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006110889 2006-04-13
JPJP-P-2006-110889 2006-04-13
PCT/JP2007/058129 WO2007119808A1 (ja) 2006-04-13 2007-04-13 融合パートナー細胞

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090010053A true KR20090010053A (ko) 2009-01-28
KR101429254B1 KR101429254B1 (ko) 2014-08-18

Family

ID=38609568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087027724A KR101429254B1 (ko) 2006-04-13 2007-04-13 융합 파트너 세포

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8173425B2 (ko)
EP (1) EP2009094B1 (ko)
JP (1) JP5160412B2 (ko)
KR (1) KR101429254B1 (ko)
CN (1) CN101466828B (ko)
BR (1) BRPI0710650A2 (ko)
DE (1) DE602007007071D1 (ko)
RU (1) RU2431667C9 (ko)
WO (1) WO2007119808A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013035345A2 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Osaka University Dengue-virus serotype neutralizing antibodies
WO2014034127A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 Osaka University Binding/neutralizing human monoclonal antibodies against botulinum neurotoxin type b
US20160264648A1 (en) 2013-11-06 2016-09-15 Osaka University Antibody having broad neutralization activity against group 1 influenza a viruses
CN108251413A (zh) * 2018-02-05 2018-07-06 翁炳焕 一种用于制备细胞因子的杂交瘤t细胞株的构建
CN108998426A (zh) * 2018-06-15 2018-12-14 翁炳焕 一种粒系白血病融合基因检测质控参考株的制备

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH652145A5 (de) * 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4574116A (en) * 1983-01-13 1986-03-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Methods and cell lines for immortalization and monoclonal antibody production by antigen-stimulated B-lymphocytes
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US4977081A (en) 1987-05-04 1990-12-11 Adi Diagnostics, Inc. Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof
JPH01171494A (ja) 1987-12-26 1989-07-06 Tosoh Corp 培養細胞によるヒト免疫グロブリン産生能の増強法
JPH02200177A (ja) 1989-01-31 1990-08-08 Nippon Kayaku Co Ltd 動物細胞培養用組成物、培養方法および生理活性物質の製造法
JP2683946B2 (ja) 1990-05-11 1997-12-03 財団法人化学及血清療法研究所 細胞培養によるタンパク質産生方法
US6007814A (en) * 1992-06-15 1999-12-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapeutic uses of the hypervariable region of monoclonal antibody M195 and constructs thereof
JPH0870858A (ja) 1993-12-24 1996-03-19 Eiken Chem Co Ltd 動物細胞培養用培地
US6479247B1 (en) * 1996-10-09 2002-11-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Dendritic cell-specific antibodies
US7531643B2 (en) * 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
US6071737A (en) * 1998-03-16 2000-06-06 The Regents Of The University Of California Equine Neospora isolate and its uses
US6197582B1 (en) 1998-03-18 2001-03-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
DK1309627T3 (da) * 2000-08-08 2009-12-21 Immunomedics Inc Immunoterapi for kronisk myelocytisk leukæmi med nögent anti-NCA-90-antistof

Also Published As

Publication number Publication date
JP5160412B2 (ja) 2013-03-13
RU2431667C2 (ru) 2011-10-20
RU2431667C9 (ru) 2012-03-27
WO2007119808A1 (ja) 2007-10-25
BRPI0710650A2 (pt) 2011-08-23
EP2009094A1 (en) 2008-12-31
RU2008144703A (ru) 2010-05-20
CN101466828B (zh) 2011-12-21
KR101429254B1 (ko) 2014-08-18
EP2009094A4 (en) 2009-05-13
JPWO2007119808A1 (ja) 2009-08-27
DE602007007071D1 (de) 2010-07-22
US20100028946A1 (en) 2010-02-04
EP2009094B1 (en) 2010-06-09
US8173425B2 (en) 2012-05-08
CN101466828A (zh) 2009-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU646108B2 (en) Method for the production of antibodies
GB2113715A (en) Process for the production of human mono-clonal antibodies
JPS61128886A (ja) ヒト体細胞ハイブリドセルラインおよびその製造法
EP1064551B1 (en) Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
KR20090010053A (ko) 융합 파트너 세포
US8859278B2 (en) Fully human hybridoma fusion partner cell lines
JPS6054687A (ja) ヒト　モノクロ−ン抗体の製法
EP0107528B1 (en) Human nonsecretory plasmacytoid cell line
JP2004502454A5 (ko)
EP0096839B1 (en) Method for producing human antibody
RU2741095C2 (ru) Способ получения клеточных линий, стабильно продуцирующих человеческие моноклональные антитела класса igg
JP2764101B2 (ja) ヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株
JPH0551277B2 (ko)
JP3043023B2 (ja) ハイブリドーマ
Kertayadnya et al. Anti-JDV monoclonal antibodies and immunocytochemical tests
JPS6024182A (ja) ヒトｂ細胞ライン
JPS6167482A (ja) ヒトモノクロナル抗体産生細胞の無限増殖法
JPS59132885A (ja) 新規細胞ライン
JPH03297382A (ja) ヒト―ヒトハイブリドーマ作製用親細胞株及びその取得方法
JPH044871A (ja) ヒトモノクローナル抗体分泌細胞の作製方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170728

Year of fee payment: 4