BRPI0710650A2

BRPI0710650A2 - células parceiras de fusão

Info

Publication number: BRPI0710650A2
Application number: BRPI0710650-5A
Authority: BR
Inventors: Yamamoto Naomasa; Kaneda Mizuho
Original assignee: Medical & Biol Lab Co Ltd; Yamamoto Naomasa
Priority date: 2006-04-13
Filing date: 2007-04-13
Publication date: 2011-08-23
Also published as: JP5160412B2; EP2009094B1; WO2007119808A1; RU2431667C9; KR20090010053A; RU2431667C2; DE602007007071D1; EP2009094A1; KR101429254B1; EP2009094A4; US20100028946A1; CN101466828B; CN101466828A; RU2008144703A; US8173425B2; JPWO2007119808A1

Abstract

CéLULAS PARCEIRAS DE FUSãO. Células parceiras de fusão que permitem a produção de hetero-hibridomas, mesmo a partir de espécies diferentes de camundongo, foram produzidas por fusão de células de mieloma derivadas a partir de uma primeira espécie de animal com células de leucemia derivadas a partir de uma segunda espécie de animal, que tenha uma fase S extra no ciclo celular e que tenha a propriedade de diploidização. A produção estável de substâncias pode ser conseguida por produção de hetero-hibridomas através de fusão celular entre as células parceiras de fusão e células que produzem substâncias de um animal diferente de camundongo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULASPARCEIRAS DE FUSÃO"

Campo Técnico

A presente invenção se refere a células parceiras de fusão e ahibridomas.

Antecedentes da Invenção

Hibridomas (células fundidas) são usadas na produção de subs-tâncias usando células de cultura. Existem muitas células animais que pro-duzem substâncias comercialmente ou academicamente úteis. No entanto,em geral, é difícil cultivar células animais, e não existe técnica para se culti-var de maneira estável células animais durante um longo período, enquantose mantém a sua capacidade de produzir substâncias. Sob tais circunstân-cias, foi proposta uma técnica para criar células compreendendo tanto carac-terísticas da estabilidade de crescer em cultura quanto a capacidade de pro-duzir substâncias. Com essa técnica, são feitos hibridomas por fusão de cé-lulas que produzam uma substâncias biologicamente ativa e, como célulasparceiras de fusão, células de mieloma, que possam ser passadas indefini-damente e de maneira estável in vitro.

Quando anticorpos monoclonais são produzidos pelo método defusão de células, hibridomas são testados com relação às suas característi-cas, tais como a produtividade de anticorpos e atividade de ligação, e as cé-lulas selecionadas são clonadas até homogenidade. Então, as células sãocrescidas até populações de células homogêneas, para produzir anticorposmonoclonais. Tais hibridomas são crescidos por culturas in vitro ou iri vivo(em ascitos) e expandidos para produzir anticorpos em grande escala. Ométodo para desenvolvimento de anticorpos monoclonais usando o métodode fusão de células já é conhecido (ver o Documento de Não Patente 1).

Acredita-se que anticorpos monoclonais sejam mais superiores em especifi-cidade, quando comparados a anticorpos policlonais purificados a partir deanti-soros. Portanto, anticorpos monoclonais são usados como uma podero-sa ferramenta em vários métodos de ensaios imunológicos.

Quando células a partir da mesma espécie são fundidas, as cé-lulas fundidas são chamadas simplesmente de "hibridomas". Em geral, anti-corpos monoclonais de camundongo e os similares são produzidos por estemétodo. Por outro lado, células que produzem anticorpos obtidas fundindo-se células isoladas a partir de uma espécie particular com células imortaliza-das derivadas a partir de uma espécie diferente são chamadas de "hetero-hibridomas". O termo "hetero-híbrido" é sinônimo de fusão heteróloga, e ascélulas produzidas são chamadas de "hetero-hibridomas". Além disso, célu-las que produzem anticorpos, produzidas por fusão de células derivadas apartir de três espécies animais são chamadas de "triomas". Anticorpos mo-noclonais produzidos por esse métodos são anticorpos de rato de hâmster.Hetero-hibridomas entre camundongo e rato ou entre camundongo e hâms-ter são produzidos por fusão de células de mieloma de camundongo comlinfócitos derivados a partir de ratos ou de hâmsters, aos quais um antígenode interesse tem sido fora administrado. Hetero-hibridomas assim obtidossão clonados e fornecem anticorpos monoclonais, que são derivados a partirde cada animal imunizado.

Até agora, relatos têm sido publicados hetero-hibridomas queproduzem anticorpos monoclonais humanos, de coelho, bovinos e de ove-lhas (ver os Documentos de Não Patente 2 a 5 e Documentos de Patente 1e 2).

Entretanto, a produção de anticorpos monoclonais por hetero-hibridomas é considerada como sendo mais difícil conforme a distância filo-genética entre a espécie de células a serem fundidas aumenta. Por exemplo,é extremamente difícil se produzir anticorpos usando hibridomas entre ca-mundongo e coelho, ou camundongo e humano. Uma vez que hibridomastêm um número aberrante de cromossomas, a segregação nem sempre dis-tribui os mesmos pares de cromossomas para as células filhas e algunscromossomas podem ser perdidos.

Documento de Não Patente 1: Waldman, T., Science 252:1657-1662 1991

Documento de Não Patente 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:7308-7312, 1983Documento de Não Patente 3: Raybould et al., Science240:1788-1790, 1988

Documento de Não Patente 4: Kennedy et al., J. Gen. Virol.69:3023-3032,1988

Documento de Não Patente 5: Flynn et al., J. Immunol. Methods121:237-246,1989

Documento de Patente 1: relatório descritivo da patente norte-americana de número 4.634.664

Documento de Patente 2: relatório descritivo da patente norte-americana de número 4.977.081

Revelação da InvençãoProblemas a serem solucionados pela invenção

Um objetivo da presente invenção é fornecer técnicas que permi-tam a produção estável e simples de substâncias usando hibridomas emuma ampla gama de espécies animais. Especificamente, o objetivo da pre-sente invenção é fornecer novas parceiras de fusão que sejam úteis na pro-dução de hibridomas e métodos para produção das parceiras de fusão. Ou-tro objetivo da presente invenção é fornecer hibridomas obtidos por fusão decélulas que produzem substância e as parceiras de fusão obtidas de acordocom a presente invenção, métodos para produzir os hibridomas e métodospara produzir substâncias usando os hibridomas.Meios para solucionar os problemas

Havia vários problemas na produção de substâncias usandotécnicas de fusão de células, exceto para alguns animais limitados, tais co-mo camundongos. Por exemplo, não existe célula útil que possa ser usadacomo parceiras de fusão em fusão de células, e isto é um problema essenci-al que tem que ser superado em técnicas de fusão de células para outrosanimais. Os presentes inventores constataram que células úteis como par-ceiras de fusão poderiam ser obtidas por fusão de tipos particulares de célu-las. Hibridomas estáveis são fornecidos por fusão de células não murinascom células parceiras de fusão estabelecidas pelos presentes inventores. Ospresentes inventores demonstraram que hibridomas assim obtidos retinham,de maneira estável, os fenótipos ao longo do processo de clonagem e queeram também úteis como células que produzem substância. Os presentesinventores, portanto, completaram a presente invenção. Além disso, os pre-sentes inventores demonstraram que anticorpos que reconheceram antíge-nos de maneira específica poderiam ser produzidos por uso dos hibridomasda presente invenção.

Especificamente, a presente invenção se refere às células par-ceiras de fusão descritas abaixo, e hibridomas entre as células parceiras defusão e células que produzem substância. A presente invenção também serefere a métodos para a produção destas células e a métodos para produçãode substâncias usando os hibridomas.

[1] uma célula parceira de fusão que pode ser obtida por fusão

de:

(a) uma célula de mieloma derivada a partir de uma primeira es-pécie de animal, e

(b) uma célula de leucemia derivada a partir de uma segundaespécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra;

[2] a célula parceira de fusão de [1], sendo que a primeira espé-cie de animal é camundongo e a célula de mieloma é selecionada a partir do

grupo consistindo nas linhagens de células de mieloma de camundongoMOPC21, P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653, FO, S194/5.XXO.BU-1,FOX-NY e SP2/0-Ag14, e linhagens de células derivadas a partir destas li-nhagens;

[3] a célula parceira de fusão de [1], sendo que a segunda espé-cie de animal é humana e a célula de leucemia é selecionada a partir do

grupo consistindo nas linhagens de células de leucemia MEG-01, HEL, UT-7, M07e, MEG-A2 e DAMI, e linhagens de células derivadas a partir destaslinhagens de células;

[4] a célula parceira de fusão de [1], sendo que a primeira célulaé SP2/0-Ag14 e a segunda célula é MEG-01;

[5] a célula parceira de fusão SPYMEG depositada sob o núme-ro de acesso FERM BP-10761;[6] um hibridoma que pode ser obtido por fusão:

(1) de uma célula parceira de fusão que pode ser obtida por fu-são de:

(a) uma célula de mieloma derivada a partir de uma primeira es-pécie de animal; e

(b) uma célula de leucemia derivada a partir de uma segundaespécie animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra; e

(2) uma terceira célula;

[7] o hibridoma de [6], sendo que a primeira espécie de animal écamundongo e a célula de mieloma é selecionada a partir do grupos consis-tindo nas linhagens de células de mieloma de camundongo MOPC21,P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653, F0, S194/5.XXO.BU-1, FOX-NYe SP2/0-Ag14, e linhagens de células derivadas a partir destas linhagens decélulas;

[8] o hibridoma de [6], sendo que a segunda espécie de animal éhumana e a célula de leucemia é selecionada a partir do grupos consistindonas linhagens de células de leucemia MEG-01, HEL, UT-7, M07e, MEG-A2 eDAMI, e linhagens de células derivadas a partir destas linhagens de células;

[9] o hibridoma de [6], sendo que a primeira célula é SP2/0-Ag14e a segunda célula é MEG-01;

[10] o hibridoma de [6], sendo que a célula parceira de fusão éSPYMEG depositada sob o número de acesso FERM BP-10761;

[11] o hibridoma de [6], sendo que a terceira célula é uma céluladerivada da mesma espécie de animal que aquela a partir da qual a segundacélula deriva;

[12] o hibridoma de [11], sendo que a terceira célula é uma célu-la que produz anticorpos;

[13] um método para a produção de uma célula parceira de fu-são, que compreende as etapas de:

(1) fusão de:

(a) uma célula de mieloma derivada a partir de uma primeira es-pécie de animal; e(b) uma célula de leucemia derivada de uma segunda espéciede animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra; e

(2) cultivo da célula fundida na etapa (1) e coleta da célula par-ceira de fusão a partir da cultura;

[14] um método para a produção de um hibridoma, que compre-

ende as etapas de:

(1) fusão de uma célula que produz anticorpos com a célula par-ceira de fusão obtida pelo método de [13]; e

(2) cultivo da célula fundida na etapa (1) e coleta do hibridoma a partir da cultura;

[15] um método para produção de uma célula que produz anti-corpos, que compreende as etapas de:

(1) obtenção de um hibridoma por fusão de uma célula que pro-duz anticorpos com a célula parceira de fusão obtida pelo método de [13]; e

(2) coleta do hibridoma obtido na etapa (1) como uma célula queproduz anticorpos;

[16] o método de [15], que adicionalmente compreenda a etapade clonagem do hibridoma obtido na etapa (1);

[17] um método para produção de um anticorpo, que compreen- de as etapas de:

(2) cultivo do hibridoma obtido na etapa (1) e coleta do anticor-pos a partir da cultura;

[18] o método de [17], que adicionalmente compreenda a etapade clonagem do hibridoma obtido na etapa (1);

[19] um método para produção de um anticorpo contra uma do-ença infecciosa, que compreenda as etapas de:

91) obtenção de um hibridoma por fusão da célula parceira de fusão obtida pelo método de [13] com uma célula que produz anticorpos de-rivada a partir de um sujeito que tenha sido exposto a um antígeno patogêni-co de uma doença infecciosa; e(2) cultivo do hibridoma obtido na etapa (1) e coleta de um anti-corpo contra a doença infecciosa a partir da cultura; e

[20] o método de [19], sendo que a doença infecciosa é gripe,AIDS ou hepatite viral.

Alternativamente, a presente invenção se refere ao uso de célu-

las fundidas como células parceiras de fusão, que podem ser obtidas porfusão das células de (a) e de (b) descritas abaixo. De maneira específica, apresente invenção inclui o uso das células fundidas, como células parceirasde fusão a serem fundidas com células que produzem anticorpos.

(a) Células de mieloma derivadas a partir de uma primeira espé-cie de animal; e

(b) Células de leucemia derivadas a partir de uma segunda es-pécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra.

[Efeitos da Invenção]

A presente invenção fornece células parceiras de fusão quepermitem a produção de hibridomas estáveis quando fundidas com célulasheterólogas. Hibridomas obtidos por fusão de células com células parceirasde fusão da presente invenção produzem substâncias de maneira estável.Em particular, a fusão de células entre células que produzem anticorpos e as células parceiras de fusão da presente invenção resulta em hibridomas queproduzem anticorpos que são derivados a partir das células que produzemanticorpos. Em uma concretização preferida, a fusão de células entre as cé-lulas parceiras de fusão da presente invenção e células que produzem anti-corpos humanas ou de camundongo resulta em hibridomas que produzem anticorpos humanos ou de camundongo, respectivamente. Previamente,pensou-se que a manutenção de células que produzem anticorpos humanosfosse difícil. Portanto, a presente invenção tem o efeito significativo de forne-cer células que produzem anticorpos humanos de maneira estável.

A manutenção estável de fenótipos em hibridomas é uma carac- terística importante não somente na produção de substâncias, mas, também,na clonagem de células. Por exemplo, como células que produzem anticor-pos, hibridomas são clonados para se obter anticorpos monoclonais. A cio-nâgem de células significa que uma população de células é obtida a partir deuma única célula. Portanto, é muito difícil clonar células de interesse se osfenótipos celulares forem instáveis nos ciclos de divisão de células únicas.Uma vez que os hibridomas fornecidos pela presente invenção mantêm, demaneira estável, seus fenótipos celulares, eles podem ser prontamente clo-nados.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um diagrama mostrando o ciclo celular de MEG-01.

A figura2 é um diagrama mostrando o esquema de seleção porELISA para hibridomas que produzem IgG humana.

A figura 3 mostra fotografias retratando uma comparação morfo-lógica entre a célula parceira de fusão da presente invenção, SPYMEG euma célula parceira de fusão, Karpas.

A figura 4 mostra fotografias retratando a confirmação de IgG emcada fração de eluição de clones K0142(+), MK16(+) e MK99(+). Nessasfotografias, (+) e (-) indicam clones ELISA-positivos e ELISA-negativos, res-pectivamente.

A figura 5 mostra fotografias retratando a confirmação de IgG naamostra depois de diálise e de concentração de fração de eluição de cadaclone.

A figura6 é um diagrama mostrando cada etapa do método defusão de células aperfeiçoado usando SPYMEG.

A figura 7 é um diagrama mostrando uma comparação dos nú-meros de colônias formadas e de clones que produzem IgG entre antes edepois de aperfeiçoamento do método de fusão de células. O número decavidades positivas para formação de colônias e o número de cavidadespositivas para produção de IgG em quatro placas de 96 cavidades são mos-trados. Ambos os números de cavidades positivas para formação de colôniae para a produção de IgG foram significativamente aumentados por aperfei-çoamento da etapa de fusão de células. A partir das cavidades, múltiplosanticorpos que reconheciam vacina contra gripe de maneira específica foramobtidos via seleção de gripe. Portanto, anticorpos que reconhecem o antíge-no de maneira específica foram estabelecidos de maneira bem sucedida pe-la primeira vez.

A figura 8 é um diagrama mostrando a reatividade de clones queproduzem igG em relação a gripe em ELISA.

A figura 9 é uma fotografia mostrando um Western blot para ava-liar a reatividade em relação à vacina contra gripe.

A figura 10 é uma fotografia mostrando SDS-PAGE de IgG hu-mana purificada (6-19) e confirmação de sua reatividade. Os valores indica-dos na Tabela são absorbância no comprimento de onda de 450 nm em E-LISA usando placas sensibilizadas com vacina HA contra gripe.

Melhor Modo de Realização da Invenção

Aqui, "hibridoma" se refere a uma célula obtida por fusão de cé-lulas. Em geral, hibridomas são produzidos por fusão de células heterólogas,ou células que sejam homólogas, porém, derivadas a partir de animais ou detecidos diferentes. Hibridomas também incluem células que resultam de fu-são de células homólogas de um tipo de célula idêntico. Além disso, os hi-bridomas da presente invenção também incluem células fundidas obtidas porfusão de duas ou mais células. Especificamente, os hibridomas da presenteinvenção também incluem célula β fundida obtida por fusão de célula C comhibridoma α resultando de fusão de células entre célula A e célula B.

(célula A) χ (célula B) = [hibridoma a][hibridoma α] χ (célula C) = [hibridoma β]

sendo que os três tipos de células, a saber célula A, célula B e célula C, quesão fundidos para se obter o hibridoma β, podem ser derivados a partir dequalquer espécie de animal. Conseqüentemente, na presente invenção, asespécies a partir das quais as células são derivadas podem ser idênticas oupodem ser diferentes. Em particular, aos hibridomas obtidos por fusão detrês tipos de células refere-se ocasionalmente como "triomas".

Em uma concretização preferida da presente invenção, a espé-cie da célula A (a primeira célula) e da célula B (a segunda célula) são dife-rentes uma da outra, enquanto que a espécie da célula B e da célula C (aterceira célula) são as mesmas. Os hibridomas da presente invenção tam-bém incluem células fundidas obtidas quando as espécies da célula A e dacélula C são as mesmas ou as espécies da célula A, da célula B e da célulaC são diferentes umas das outras.

Em geral, células que forem obtidas por fusão celular e que po-dem ser prontamente passadas in vitro durante um longo período, são parti-cularmente chamadas de "hibridomas". Conseqüentemente, hibridomas pre-feridos da presente invenção são células que possam ser prontamente pas-sadas in vitro durante um longo período depois da fusão celular. Alternati-vamente, os hibridomas preferidos da presente invenção são células quecontinuam a crescer depois de se limitar a diluição. Em outras palavras, cé-lulas que continuam a crescer depois de se limitar a diluição estão incluídasnas células que podem ser prontamente passadas in vitro durante um longoperíodo depois de fusão de células.

Além disso, os hibridomas preferidos da presente invenção sãocélulas que mantêm o fenótipo das células usadas na fusão celular. Na pre-sente invenção, fenótipos celulares, que devem ser mantidos em hibridomas,incluem a capacidade de células em produzir substâncias. Por exemplo,quando as células usadas em fusão celular produzem um anticorpo ou cito-cina, hibridomas preferidos da presente invenção mantêm a capacidade deproduzir estas substâncias.

Entretanto, os hibridomas da presente invenção não necessari-amente mantêm todos os fenótipos das células usadas na fusão celular. Por-tanto, quando a manutenção de outros fenótipos, por exemplo, a produçãode antígenos de superfície celular, ou enzimas e fatores de transcrição, quesão acumulados em células, for desejada, em adição à produção dos anti-corpos descritos acima, estes fenótipos estão também incluídos nos fenóti-pos a serem mantidos pelos hibridomas. No entanto, quando a produção detais substâncias não for necessária, hibridomas carecendo da capacidade deproduzir as substâncias também estão incluídos nos hibridomas da presenteinvenção, tanto quanto eles continuem a produzir substâncias necessárias.

Aqui, "células parceiras de fusão" se refere a células que permi-tem a produção de hibridomas quando fundidos com outras células. Célulasparceiras de fusão preferidas da presente invenção permitem que as célulassobrevivam in vitro durante um longo período depois da fusão celular.

Além disso, células parceiras de fusão, de preferência, têm mar-cadores de seleção apropriados para seleção. Um marcador de seleção serefere a um fenótipo que permita (ou que não permita) a sobrevivência sobcondições de cultura particulares.

Marcadores de seleção de células animais conhecidos incluemsensibilidade à hipoxantina-aminopterina-timidina (nas partes que se se-guem, abreviada como "sensibilidade à HAT"), resultando de deficiência emhipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (nas partes que se seguem a-breviada como "deficiência em HGPRT") ou deficiência em timidina quinase(nas partes que se seguem, abreviada como "deficiência em TK"). Em meiode seleção por HAT, células sensíveis a HAT não podem sintetizar ADN e,portanto, morrerão. Entretanto, quando fundidas com células normais, ascélulas resultantes podem continuar a sintetizar ADN por meio da via de sal-vação que se origina a partir das células normais e, portanto, podem crescermesmo em meio de seleção por HAT.

Células deficientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadasusando-se meio contendo 6-tioguanina, 8-azaguanina (nas partes que seseguem, abreviada como "8AG"), ou 5'-bromodeoxiuridina. Células normaissão mortas devido à incorporação desses análogos de pirimidina ao ADN.Ao contrário, células carecendo dessas enzimas podem sobreviver no meiode seleção porque elas não permitem a incorporação destes análogos depirimidina. Outro marcador de seleção chamado de resistência à G418 con-fere resistência à antibióticos de 2-deoxiestreptamina (análogos de gentami-cina) devido ao gene de resistência à neomicina.

A presente invenção fornece células parceiras de fusão que po-dem ser obtidas por fusão de:

(b) células de leucemia derivadas a partir de uma segunda es-pécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra.A presente invenção também fornece métodos para produção decélulas parceiras de fusão, que compreende as etapas de:

(1) fusão de:

(b) células de leucemia derivadas a partir de uma segunda es-pécie de animal, cujo ciclo celular tem uma fase S extra; e

(2) cultivo das células fundidas na etapa (1) e coleta das célulasparceiras de fusão a partir da cultura.

Aqui, células de mieloma derivadas a partir de uma primeira es-pécie de animal significa células que se derivem de mielomas, que possamser clonadas de maneira independente. A expressão "possam ser clonadasde maneira independente" significa que o crescimento pode ser começadomesmo a partir de uma única célula e a passagem pode ser feita de maneiracontínua sob condições de cultura artificiais.

Na presente invenção, as células de mieloma derivadas a partirda primeira espécie de animal podem ser quaisquer células, tanto quantoelas forneçam parceiras de fusão quando fundidas com células de leucemia.Células conhecidas, que podem ser usadas como as células de mieloma dapresente invenção incluem, por exemplo, aqueles descritos abaixo. Na lista-gem de linhagens de células abaixo, "ATCC" representa um número de a-cesso no American Tissue and Culture Collection, enquanto que "JCRB" re-presenta um número de acesso no banco de células JCRB (Japanese Col-lection of Research Bioresources). Conseqüentemente, todas as linhagensde células estão disponíveis a partir dos bancos de células. As linhagens decélulas no banco de células JCRB estão distribuídas via Health Science Re-search Resources Bank (HSRRB).

MOPC21 (número ATCC: HB-8411)

P3X63AG8 (número ATCC: Τ1B9)

SP2/0 (número ATCC: CRL 1581)

NS-1 (número ATCC: TIB18)

P3.X63AG8.653 (número ATCC: CRL 1580)FO (número ATCC: CRL 1646)S194/5.XXO.BU-1 (número ATCC: CRL 1580)FOX-NY (número ATCC: CRL 1732)SP2/0-Ag14 (número JCRB: 0029)

Dessas linhagens de células, aquelas tendo as característicaspreferidas descritas acima são o grupo de linhagens de células de mielomade camundongo e de linhagens de células derivadas a partir destas linha-gens de células de mieloma de camundongo. As linhagens de células deri-vadas significam linhagens de células que sejam reclonadas depois da intro-dução de fenótipos adicionais, tais como resistência à droga.

Na presente invenção, as células de leucemia derivadas a partirda segunda espécie de animal são células de leucemia, cujo ciclo celulartenha uma fase S extra. O ciclo celular geral de células eucarióticas é mos-trado abaixo. Células em crescimento continuam a se dividir enquanto repe-tem o ciclo a partir da fase G1 até a fase Μ. O crescimento celular é inter-rompido quando o ciclo celular alcança um estado estável chamado de faseGO, depois da fase .

-[fase G1 ]-[fase S]-[fase G2]-[fase M]-

Em cada ciclo celular, a fase S é um período de síntese de ácidonucléico. Nesse período, concebe-se que o ADN genômico constituindo ocromossoma seja replicado e que a célula seja preparada para divisão celu-lar. O ADN genômico que dobrou na fase M é segregado em duas célulaspor mitose. Entretanto, um fenômero foi observado em células particulares,onde o ciclo celular não se processou até o estágio de divisão celular depoisda replicação de ADN genômico. O período de pós-síntese de ADN, no qualo ciclo celular não se processa até a divisão celular na fase M, foi denomi-nado de "fase S extra". Constatou-se que as células não divididas acumulamADN genômico sintetizado e, portanto, contêm uma quantidade aumentadade ADN. Por exemplo, o número de cromossomas médio em MEG-01, que éuma linhagem de células de leucemia preferida na presente invenção, é 2n =104. Isso é muito maior do que o número de cromossomas de células nor-mais (2n = 46). A razão é que MEG-01 tem uma fase S extra em seu ciclocelular, que aumenta o ADN genômico e, portanto, tem a propriedade dediploidização (Oncogene 13:695-703, 1996) (figura 1).

Portanto, espera-se que a presente invenção tenha o efeito deprevenir a perda de cromossomas derivada das células que produzem anti-corpos em hetero-hibridomas por uso de células de leucemia que tenhamuma fase S extra em seu ciclo celular e a propriedade diploidizante.

Na presente invenção, as células de leucemia, cujo ciclo celulartenha uma fase S extra, são derivadas a partir de uma espécie que seja dife-rente daquela a partir da qual o mieloma descrito acima deriva, e, de prefe-rência, da mesma que aquela a partir da qual a terceira célula descrita abai-xo derive. Tais células de leucemia podem ser obtidas a partir de tecidoshematopoiéticos ou de sangue periférico de animais com leucemia. Os teci-dos hematopoiéticos incluem medula óssea, baço, nódulos linfáticos, e ossimilares. Leucemia inclui, por exemplo, leucemia megacariocítica. Leucóci-tos, células mononucleares ou tais podem ser separadas, por exemplo, porcentrifugação de sangue periférico e coleta de frações celulares com umagravidade específica particular pelo método de Ficoll.

Além disso, se as células de leucemia separadas tiverem umafase S extra em seu ciclo celular, pode ser avaliado pelo uso, como um indi-cador, do aumento de cromossomas nas células. O aumento de cromosso-mas pode ser confirmado, por exemplo, com base no aumento na ploidia (onúmero total de cromossomas) de células tratadas com 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA). Tais aumentos na ploidia podem ser detectadoscom um citômetro por escoamento ou analisador de ploidia.

Alternativamente, células de leucemia conhecidas também po-dem ser usadas na presente invenção. Células conhecidas, que podem serusadas como células de leucemia derivadas da segunda espécie de animalna presente invenção, incluem, por exemplo, as linhagens de células indica-das abaixo. MEG-01 e HEL são linhagens de células de leucemia megacari-ocítica (Blood 66:1384-1392, 1985; J. Clin. Invest. 85:1072-1084).

MEG-01 (número ATCC CRL-2021)

HEL (número JCRB 0062)UT-7 (Ν. Komatsu et al., Câncer Res. 51: 341-348, 1991)

M07e (Avanzi GC et al., J. Cell Physiol. 1990 Dec; 145(3):458-64)

MEG-A2 (número JCRB IF050478)

DAMI (Blood 89:4238, 1997)

Em particular, MEG-01 mostra resistência à 8AG, que é útil co-mo um marcador de seleção. Além disso, uma vez que MEG-01 não produzqualquer imunoglobulina, ela é preferida como uma parceira na fusão comcélulas que produzem anticorpos para preparar hibridomas.

As células parceiras de fusão da presente invenção podem serobtidas por fusão de células entre células de mieloma derivadas a partir deuma primeira espécie de animal e de células de leucemia derivadas a partirde uma segunda espécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S ex-tra. Técnicas de fusão celular conhecidas, tais como o método de polietilenoglicol (PEG) e de eletrofusão podem ser usados para se conseguir fusãocelular.

O método de polietileno glicol é conduzido de acordo com o se-guinte procedimento. Primeiro, a razão entre células de mieloma e de leu-cemia é otimizada dependendo de cada condição de fusão particular. Ostécnicos especializados no assunto podem selecionar a concentração ótimade polietileno glicol (PEG) com base no peso molecular de PEG ou tal. Porexemplo, 35% de PEG1500 (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) é uma das exi-gências para a fusão celular geral. 1 mL de 35% de PEG1500 é lentamenteadicionado aos péletes celulares / mistura de células durante um período de1,5 minutos. Então, a suspensão celular é gradualmente diluída com meiolivre de soro e, então, com meio contendo soro para se conseguir a fusãocelular.

Outros métodos convenientes, que também podem ser usadospara se conseguir a fusão celular, incluem eletrofusão. Nesse método, ascélulas são colocadas em um tampão especial e, então, são alinhadas poraplicação de voltagem. As células alinhadas podem ser fundidas em conjun-to, de maneira eficiente, devido a uma chance aumentada de contato entresi.

A mistura de fusão é suspensa, por exemplo, em uma densidadecelular de 8 χ 105 células/mL em 150 mL de meio HB-GRO (Irvine Scientific,Santa Ana, Califórnia) contendo 15% de soro de bezerro fetal. As célulassão, então, amostradas por alíquota em 2,0 χ 105 células/cavidade em pla-cas de 96 cavidades. As células podem ser incubadas sob uma atmosferade 5% a 10% de CO2 à 37°C para se obter células parceiras de fusão resis-tentes 8AG. As células parceiras de fusão resultantes podem ser clonadas,se necessário. As células parceiras de fusão clonadas contribuem para amanutenção de reprodutibilidade na produção de hibridomas.

Por exemplo, SP2/0-Ag14 pode ser usado como a célula de mie-loma derivada a partir da primeira espécie de animal, enquanto MEG-01 po-de ser usada como a célula de leucemia derivada a partir da segunda espé-cie de animal, cujo ciclo celular tem uma fase S extra.

As células parceiras de fusão fornecidas conforme descrito aci-ma, podem, elas mesmas, ser passadas durante um longo período, e, por-tanto, podem ser usadas como células parceiras de fusão gerais para seobter anticorpos monoclonais a partir de células que produzem anticorpos.Especificamente, como linhagens de mieloma de camundongo estabelecidaspara produzir homo-hibridomas de camundongo, as células podem ser usa-das como parceiras de fusão que permitam a provisão de estável de hibri-domas usando células que produzem anticorpos derivadas a partir de espé-cies diferentes de camundongos. Dentre as células parceiras de fusão obti-das de acordo com a presente invenção, a célula parceira de fusão SPY-MEG, obtida por fusão da linhagem de células de mieloma de camundongoSP2/0-Ag14 com a linhagem de células de leucemia humana MEG-01, foidepositada sob o número de acesso FERM BP-10761 no International Pa-tent Organism Depositary.

(a) Nome e endereço da instituição depositáriaNome: National Institute of Advanced Industrial Science and Te-chnology, International Patent Organism Depositary

Endereço: (Código postal: 305-8566) Central 6, 1-1-1 Higashi,Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão

(b) Data de depósito: 24 de fevereiro de 2006

(c) Número de deferimento: FERM BP-10761

(transferido a partir de FERM P-20816 depositado em 24 de fevereiro de2006)

A presente invenção se refere a hibridomas, que podem ser ob-tidos usando as células parceiras de fusão descritas acima. De maneira es-pecífica, as presente invenção fornece hibridomas que podem ser obtidospor fusão de:

(1) células parceiras de fusão que podem ser obtidas por fusãode:

(b) células de leucemia derivadas a partir de uma segunda es-pécie animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra; e

(2) uma terceira célula.

A presente invenção também fornece métodos para produzir hi-bridomas, que compreendem as etapas de:(1) fusão de:

(b) células de leucemia derivadas a partir de uma segunda es-pécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra;

(2) cultivo das células fundidas na etapa (1) e coleta das célulasparceiras de fusão a partir da cultura;

(3) fusão de uma terceira célula com as células parceiras de fu-são coletadas na etapa (2); e

(4) cultivo das células fundidas na etapa (3) e coleta dos hibri-domas a partir da cultura.

A espécie da terceira célula da presente invenção é igual ou di-ferente da espécie da primeira célula ou da segunda célula. De maneira es-pecífica, é possível usar células a partir de humanos, coelhos, camundon-gos, ratos, bovinos, cabras, ovelhas ou similares. Mais especificamente,quando forem usadas parceiras de fusão, obtidas a partir de mieloma decamundongo (a primeira célula) e células de leucemia humana (a segundacélula), a terceira célula será, de preferência, derivada a partir de humano oucamundongo. Em particular, o fato de que células humanas podem ser usa-das como a terceira célula é uma grande vantagem das células parceiras defusão da presente invenção.

Espera-se que a terceira célula da presente invenção seja umacélula que finalmente permita cultivo de longo prazo. Mais especificamente,por exemplo, células tendo a capacidade para produzir substâncias de inte-resse podem ser usadas como a terceira célula. Hibridomas, que permitem amanutenção de longo prazo de células tendo um fenótipo de interesse, po-dem ser obtidas através de fusão celular entre as células descritas acima e aparceira de fusão da presente invenção. A formação de hibridomas, quepermitem a manutenção de longo prazo de células, é, em geral, chamadasde "imortalização".

Na presente invenção, qualquer célula que produza uma subs-tância biologicamente ativa de interesse pode ser usada como a terceira cé-lula. Substâncias biologicamente ativas preferidas da presente invenção in-cluem anticorpos. Em outras palavras, células que produzem anticorpos sãopreferidas como a terceira célula da presente invenção. Células que produ-zem anticorpos incluem, por exemplo, leucócitos (linfócitos periféricos) e cé-lulas de baço. Métodos para a coleta de tais células a partir de um corpo vivosão conhecidos. Exemplos mais específicos da terceira célula incluem célu-las que produzem anticorpos derivadas de animais tendo um histórico deexposição a antígeno patogênico de uma doença infecciosa. Animais tendoum histórico de exposição a antígeno patogênico de uma doença infecciosaincluem animais vacinados com um antígeno patogênico (vacina) de umadoença infecciosa e animais que tenham experimentado uma infecção. Aqui,a doença infecciosa não está limitada de maneira particular; entretanto, e-xemplos preferidos incluem gripe, AIDS e hepatites virais, tais como HCV eHBV.Em particular, linfócitos de sangue periférico são preferidos co-mo as células que produzem anticorpos da presente invenção. Linfócitos desangue periférico podem ser prontamente obtidos por coleta de sangue. Hi-bridomas que produzem anticorpos de camundongo podem ser prontamenteobtidos por preparação de hibridomas a partir de linfócitos de sangue perifé-rico de camundongo de acordo com a presente invenção. Alternativamente,hibridomas que produzem anticorpos humanos podem ser prontamente obti-dos por preparação de hibridomas a partir de linfócitos de sangue periféricohumano de acordo com a presente invenção.

Na presente invenção, a parceira de fusão pode ser fundida coma terceira célula pelo mesmo método que aquele usado na fusão celular en-tre a primeira e a segunda células descritas acima. A fusão celular pode serconseguida por uso do método com PEG ou por eletrofusão. Por exemplo,quando linfócitos de sangue periférico humano forem fundidos com SPY-MEG como a parceira de fusão da presente invenção, as condições preferi-das incluem as seguintes condições.

Primeira, o número de leucócitos de sangue periférico (PBLs) aserem fundidos é, de preferência, ajustado para 1 x 10"7 a 10"8 células. SPY-MEG e PBL são combinadas em conjunto em uma razão de 2:1 a 10:1. Ascélulas são precipitadas por centrifugação, e o sobrenadante resultante éremovido. Polietileno glicol (PEG) é adicionado à fração de células coletadaspara fundir as células. A concentração de PEG usada na fusão celular é de30% a 70%, de preferência, 40% a 60%, e, mais preferivelmente, 50%. De-pendendo do número de células, 0,1 a 2,0 mL, de preferência, 0,6 a 1,0 mLde uma solução de PEG são adicionados às células durante um período de60 a 90 segundos, enquanto se mistura usando-se uma pipeta. Depois que asolução de PEG é adicionada, a suspensão de células é continuamente mis-turada com a pipeta durante dois a três minutos adicionais. Então, 10 a 14mL de meio livre de soro é adicionado pouco a pouco, enquanto se misturadurante um período de 30 a 60 segundos. Um meio livre de soro é, então,adicionado, e a mistura é centrifugada. Depois da centrifugação, o sobrena-dante é removido e as células são lavadas uma vez com meio livre de soro.As células lavadas são suspensas em meio HAT (RPMI contendo 15% deFBS e HAT (x 50)) e plaqueadas em placas com 96 cavidades.

Meios livres de soro e PEG1 que, em geral, são usados em fusãode células pelos técnicos especializados no assunto, podem ser empregadosde maneira adequada. Por exemplo, os meios e PEG listados abaixo podemser usados na fusão celular da presente invenção.

PEG: PEG1500 (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)

HAT: suplemento de HAT (50x) (GIBCO; número de catálogo21060-017)

meio livre de soro: RPM11640 (SIGMA; número de catálogoR8758)

Alternativamente, células que produzem anticorpos também po-dem ser obtidas a partir de animais imunizados. Animais são imunizadospreviamente com um antígeno arbitrário em conjunto com um adjuvante a-propriado. O antígeno pode estar conjugado com uma proteína de veículo, e,então, usado como um imunógeno. Tais proteínas de veículo para a prepa-ração do imunógeno incluem hemocianina de concha de fechadura (KLH) ealbumina de soro bovino (BSA). Em geral, animais a serem imunizados in-cluem coelhos, camundongos, ratos, cabras e ovelhas. Adjuvantes conven-cionais incluem adjuvante completo de Freund (FCA) (Adv. Tubercl. Res.1:130-148, 1956). A concentração de anticorpos é monitorada por ELISA oupelo método de Ouchterlony. Depois que a concentração é confirmada a serelevada para a um nível satisfatório, as células que produzem anticorpos sãocoletadas. As células que produzem anticorpos suspensas são usadas emfusão celular. Células que produzem anticorpos podem ser obtidas por cole-ta de células de baço ou de linfócitos de sangue periférico pelo mesmo pro-cedimento que aquele usado para células humanas. Células que produzemanticorpos assim obtidas podem ser fundidas com parceiras de fusão dapresente invenção, para preparar hibridomas da presente invenção.

Conforme descrito acima, anticorpos podem ser produzidos poruso de células que produzem anticorpos como a terceira célula nos métodosda presente invenção para produzir hibridomas. Especificamente, a presenteinvenção fornece métodos para produção de anticorpos, que compreendemas etapas de:

(1) obtenção de células parceiras de fusão via as etapas de:

(A) fusão de:

(a) células de mieloma derivadas de uma primeira espécie de

animal; e

(b) células de leucemia derivadas a partir de uma segunda es-pécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra; e

(B) cultivo das células fundidas na etapa (A) e coleta das células parcelas de fusão a partir da cultura;

(2) obtenção de hibridomas por fusão de células que produzemanticorpos com as células parceiras de fusão obtidas na etapa (1); e

(3) cultivo dos hibridomas obtidos na etapa (2) e coleta dos anti-corpos a partir da cultura.

Alternativamente, a presente invenção se refere a métodos paraa preparação das células que produzem anticorpos acima descritas, que sãoúteis na produção de anticorpos. Especificamente, a presente invenção for-nece métodos para a preparação de células que produzem anticorpos, quecompreendem as etapas de: (1) preparação de células parceiras de fusão via as etapas de:

(A) fusão de:

(a) células de mieloma derivadas de uma primeira espécie deanimal; e

(b) células de leucemia derivadas a partir de uma segunda es- pécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra; e

(B) cultivo das células fundidas na etapa (A) e coleta das célulasparceiras de fusão a partir da cultura;

(2) preparação de hibridomas por refusão de células que produ-zem anticorpos com as células parceiras de fusão preparadas na etapa (1); e

(3) coleta dos hibridomas preparados na etapa (2) como célulasque produzem anticorpos.Hibridomas, que produzem anticorpos de maneira estável, po-dem ser obtidos por uso das células parceiras de fusão da presente inven-ção. De maneira bem sucedida, células fundidas podem ser proliferadas, demaneira preferida, por cultivo dos hibridomas em um meio de seleção apro-priado. Por exemplo, meios de seleção contendo HAT podem ser usadosquando SPYMEG da presente for usado como células parceiras de fusão.

Os métodos da presente invenção, para produção de anticorposou de células de produção de anticorpos, podem compreender hibridomasde clonagem. Métodos para clonagem de hibridomas são conhecidos. Espe-cificamente, hibridomas podem ser clonados pelo método de limitação dediluição, Teoricamente, hibridomas diluídos por limitação de diluição formampopulações de células, cada uma das quais é crescida a partir de uma únicacélula. Uma tal população celular tem características homogêneas, e, por-tanto, é um clone. Anticorpo obtido a partir de um hibridoma clonado é cha-mado de anticorpo monoclonal. Anticorpos monoclonais têm propriedadesde ligação a antígeno altamente uniformes.

Especificamente, a presente invenção fornece métodos para aprodução de anticorpos monoclonais, que compreendem as etapas de:

(1) preparação de células parceiras de fusão via as etapas de:(A) fusão de:

(2) preparação de hibridomas por fusão de células que produ-zem anticorpos com as células parceiras de fusão preparadas na etapa (1) eclonagem dos hibridomas que produzem anticorpos na etapa (2) e coletados anticorpos monoclonais a partir da cultura.

A presente invenção também se refere a métodos para produçãode células que produzem anticorpos que são úteis na produção dos anticor-pos descritos acima. De maneira específica, a presente invenção fornecemétodos para produção de células que produzem anticorpos, que compre-endem as etapas de:

(B) cultivo das células fundidas na etapa (A) e coleta das células

parceiras de fusão a partir da cultura;

(2) preparação de hibridomas por refusão de células que produ-zem anticorpos com as células parceiras de fusão preparadas na etapa (1);e

(3) obtenção das células que produzem anticorpos a partir doshibridomas na etapa (2).

Células que produzem anticorpos podem ser clonadas na pre-sente invenção. Células que produzem anticorpos monoclonais podem serobtidas por clonagem de células que produzem anticorpos que produzemanticorpos de interesse. De maneira específica, a presente invenção fornecemétodos para a produção de hibridomas que produz anticorpos monoclo-nais, que compreende as etapas de:

(1) preparação de células parceiras de fusão via as etapas de:

(A) fusão de:

(2) preparação de hibridomas por refusão de células que produ-zem hibridomas com as células parceiras de fusão preparadas na etapa (1)e clonagem de hibridomas que produzem anticorpos de interesse; e

(3) coleta, como células que produzem anticorpos, dos hibrido-mas clonados na etapa (2).

Os hibridomas da presente invenção são células que produzemanticorpos tendo uma capacidade estável de produzir anticorpos in vitro.Portanto, as células podem ser crescidas em um meio apropriado, enquantoretenham a capacidade de produzir anticorpos, embora elas sejam hetero-hibridomas. Portanto, a perda de clones vitais durante o processo de clona-gem é menos provável. Em adição, clones de hibridoma estabelecidos po-dem ser mantidos de maneira estável.

Anticorpos ou anticorpos monoclonais podem ser produzidos porcultivo de hibridomas ou seus clones obtidos de acordo com a presente in-venção. Meios livres de soro ou meios contendo uma baixa concentração desoro são usados, de preferência, por causa da conveniência da purificaçãode anticorpos. Meios basais para cultivo de células animais incluem DMEM,RPM11640 e ASF 103. Alternativamente, hibridomas ou seus clones podemser inoculados na cavidade peritoneal de camundongos nus ou camundon-gos SCDI para coletar anticorpos como ascitos.

Meios de cultura podem ser suplementados com 5% a 10% v/vde soro bovino fetal (nas partes que se seguem abreviados como "FCS").Quando hibridomas da presente invenção forem cultivados em tais meios decultura, fatores conhecidos que intensificam a produção de anticorpos sãoadicionados de maneira vantajosa aos meios. Agentes que intensificam aprodução de anticorpos in vitro incluem, por exemplo, D-penicilamina, ácidoacetoacético, agentes de biguanida, vitamina K5, ácido N-acetilglutâmico(Publicação Kokai de Pedido de Patente Japonês de N9 (JP-A) H8-70858(pedido de patente japonês publicado, não examinado), interleucina 6 (Natu-re 324(6092): 73-6, 1986), álcoois de açúcar (JP-A (Kokai) H2-200177), Iipo-polissacarídeos (JP-A (Kokai) H4-20294), ésteres de forbol (JP-A (Kokai)H1 -171494) e ácido butírico (hibridoma 4(1):63, 1985). Anticorpos monoclo-nais assim obtidos podem ser purificados por relargagem, tal como, utilizan-do sulfato de amônio ou sulfato de sódio, cromatografia de troca iônica, fil-tração em gel, cromatografia por afinidade e similares.

A presente invenção é ilustrada abaixo, de maneira específica,com referência aos Exemplos, mas, ela não deve ser construída como es-tando limitada e eles.

Todos os documentos da técnica anterior citados aqui são aquiincorporados por referência.Exemplos

Exemplo 1 - Preparação de células parceira de fusão

Células de SP2/0-Ag-14 (3 χ 107 células) e MEG-01 (3 a 6 χ 107células) foram cultivadas em RPMI suplementado com 5% de FCS (meiopadrão), e, então, foram fundidas em conjunto de acordo com o método con-vencional usando PEG. As células fundidas foram cultivadas no meio padrão(RPMI suplementado com 5% de FCS) durante três dias. O meio foi trocadopor RPMI livre de FCS no dia 3, e, então, as células foram cultivadas durante19 dias. As células foram diluídas com o meio padrão contendo 8AG por limi-tação de diluição no dia 19, e, então, cultivadas durante cinco dias. As célu-las fundidas proliferadas foram coletadas e denominadas de "células parcei-ras de fusão SPYMEG". SPYMEG foi depositado sob o número de acessoFERM BP-10761 (transferidos a partir de FERM P-20816) em 24 de feverei-ro de 2006 no National Institute of Advanced Industrial Science and Techno-logy, International Patent Organism Depositary. SPYMEG era resistente a8AG e foi morta quando cultivada no meio HAT.

Exemplo 2 - Preparação de hetero-hibridomas pelo método com PEG

(a) Coleção de leucócitos de sangue periférico humano (centri-fugação por densidade)

Sangue periférico humano (40 mL) foi coletado usando-se hepa-rina e amostrado por alíquota (10 mL) em tubos de 50 mL. 25 mL de PBCestéril foram adicionados a cada tubo. Depois da mistura, o sangue foi so-breposto a uma alíquota de 15 mL de HISTOPAQUE (SIGMA H8889) emtubos de 50 mL. Os tubos foram centrifugados à 800 rpm e à temperaturaambiente durante 30 minutos, depois de centrifugação, as camadas de leu-cócitos foram coletadas.(b) Coleção de células parceiras de fusão (SPYMEG)

Células SPYMEG foram crescidas em frascos de cultura de 75cm2 (meio: RPMI contendo 10% de FBS) e coletadas.

(c) Fusão celular

Os leucócitos de sangue periférico humano coletados e célulasSPYMEG foram combinadas em uma razão de 2:1 a 10:1 e, então, centrifu-gadas. 4 a 8 x 107 células foram obtidas a partir de 40 ml_ de sangue perifé-rico. SPYMEG foi cultivado usando-se quatro frascos de 75 cm2. 0,6 a 1,0mL de 50% de PEG (PEG4000; MERCK, número de catálogo 1097270100foi diluído com um volume igual de RPMI (RPMI1640; SIGMA, número decatálogo R8758)) foram adicionados ao pélete para realizar a fusão celular,depois de lavagem com RPMI livre de soro, as células foram suspensas em160 mL de 1% de BM contendo 15% de FBS (EQUITECH-BIO INC., LoteSFB30-1548) e HAT (suplemento de HAT (BM-condimed; Roche, número decatálogo 663573) (50 x), GIBCO número de catálogo 21060-017) e plaquea-das em oito placas de 96 cavidades. O meio foi trocado três dias depois doplaqueamento. Quando colônias de hibridoma foram confirmados como es-tando formados (depois de dois a três semanas), os sobrenadantes de cultu-ra foram amostrados a partir das placas de 96 cavidades para a primeiraseleção.

Exemplo 3 - protocolo de purificação de IgG

As amostras (sobrenadantes de cultura) foram eluídas em umataxa de escoamento de 1 gota / segundo. As frações percoladas foram cole-tadas. As colunas foram lavadas com PBS contendo NaN3 à 0,1% na taxade escoamento máxima (lavada até a absorbância à 280 se tornou 0,05 oumenor, durante o monitoramento com um espectrofotômetro). As colunasforam eluídas com duas a cinco volumes de leito de coluna de tampão glici-na 0,17 M - HCl (pH 2,3) na taxa de escoamento máxima. Usando-se umcoletor de fração, o eluato foi coletado em tubos de teste contendo tampãoTris 1 m - HCl (pH 8,0) de um volume de um quinto ou maior do que o volu-me de fração de eluição (mL). As frações eluídas foram misturadas com otampão Tris de neutralização (tampão Tris 1 M - HCl (pH 8,0)), tão logoquanto possível. Depois de medição de A280 de cada fração, as frações fo-ram ensaiadas com relação a proteínas. Frações com A280 de 0,1 ou maio-res foram reunidas.

Depois da reunião, o pH foi confirmado como sendo 8,0 usando-se uma fita de teste de pH. A pureza da reunião foi avaliada por SDS-PAGEusando 12,5% de gel e tampão de amostra (2ME+). cada pista continha 5 μςde uma amostra. A mesma quantidade de uma batelada prévia foi tambémsubmetida à eletroforese para comparação. A solução reunida foi empacota-da em um tubo de diálise e dializada contra PBS ou PBS contendo NaN3 à0,1% com um volume 100 vezes ou mais daquele da solução reunida. A diá-lise foi repetida três vezes ou mais e cada diálise foi realizada durante seishoras ou mais. Depois de concentração, o tubo de diálise foi lavado comple-tamente com água deionizada. A seguir, o tubo de diálise foi gentilmentebem esfregado para dissolver a proteína que se adere à parede do tubo, asolução concentrada foi removida do tubo. A seguir, a concentração foi medida.

Alternativamente, sem usar um coletor de fração, a solução eluí-da pôde ser coletada para um cilindro de medição, bécher ou similar, en-quanto se agita. Mesmo nesse caso, o tampão Tris de neutralização (tampãoTris-HCI (pH 8,0)) é usado com um volume de um quinto ou mais do volumede fração de eluição (mL). Depois da coleta, o pH é confirmado como sendo8,0 usando-se uma fita de teste de pH. Se o pH for menor que 8,0, ele é a-justado para 8,0 imediatamente por adição do tampão de neutralização.

Exemplo 4 - Medição de IgG humana por ELISA

(a) Preparação de placas sensibilizadas

Um anticorpo policlonal de IgG anti-humana de coelho foi diluídopara 10 pg/mL com um tampão de sensibilização (PBS) e amostrado poralíquota (50 pL/cavidade) em microplacas (Nunc MaxiSorp). As placas foramdeixadas a repousar à 4°C durante uma noite. O tampão de sensibilizaçãofoi removido e o líquido restante foi removido espremendo-se as aplacas.Um tampão de bloqueio (PBS contendo 1% de BSA e 0,1% de NaN3) foi adi-cionado (100 pL/cavidade) e as placas foram deixadas a repousar à 4°C du-rante uma noite.

(b) ELISA

Sobrenadantes de cultura de hibridomas foram amostrados poralíquota (50 µL/cavidade) para microplacas sensibilizadas (preparadas con-forme descrito em (a)). As placas foram incubadas e deixadas a repousar àtemperatura ambiente durante uma hora. A solução de reação foi removida eas placas foram lavadas três vezes com um tampão de lavagem (contendoPBS 0,05% de Twenn 20). O líquido restante foi removido espremendo-se asplacas. Um anticorpo marcado foi diluído (marcado com peroxidase; diluído5.000 vezes e, então, usado; anticorpo policlonal anti - lgG humana marcadocom POD) e amostrado por alíquota (50 μL/cavidade) para as placas. Então,as placas foram deixadas a repousar à temperatura ambiente durante umahora. Uma solução de substrato (tetrametilbenzidina) foi preparada. A solu-ção de anticorpos marcados foi removida a partir das placas. Depois de Ia-vagem três vezes com tampão de lavagem, o líquido restante foi removidoespremendo-se as placas. A solução de substrato foi amostrado por alíquota(50 µL/cavidade). As placas foram incubadas à temperatura ambiente duran-te 15 minutos. Tomou-se alíquota de uma solução de terminação de reação(H2SO4 2 N) (50 μL/cavidade) para as placas. A absorbância (comprimentode onda principal, 450 nm; comprimento de onda secundário, 620 nm) foimedido com uma leitura de placa. O diagrama esquemático de ELISA usadoneste experimento é mostrado na figura 2.Exemplo 5 - Confirmação de IlG humana por Western blotting

Uma solução de 1 mg/mL de anticorpo foi combinada com umvolume igual de tampão de amostra. A mistura resultante foi fervida durante5 minutos. 10 μL da mistura (5μg de anticorpo) foi carregada por sobre umgel à 12,5%. SDS-PAGE foi realizado e a amostra foi transferida por sobreuma membrana de PVDF (Immobilon-P número de catálogo IPVH00010). Amembrana foi bloqueada com leite desnatado à 2% contendo PBS à 4°C,durante uma noite, e, então, tratada com BIockAce à 10% contendo PBS ePOD anti-lgG de rato x 2.500 como um anticorpos de detecção à temperatu-ra ambiente, durante uma hora. A membrana foi lavada três vezes com umtampão (Tween 20 à 0,05% contendo PBS). O substrato usado foi PIERCE(super signal West Pico Chemiluminescent Substrate, código 34080). Depoisde um minuto de exposição, o filme (Hyperfilm ECL; Amersham Bioscience,número de catálogo RPN3103K) foi revelado usando-se RENDOL (Fuji Film)como um revelador. A solução de parada e o fixador usados foram ácidoacético à 3% e RENFIX (Fuji Film), respectivamente.Exemplo 6 - Resultados

(a) Preparação de células parceiras de fusão

A linhagem de células parceiras de fusão preparada SPYMEGfoi avaliada (figura 3) por sua comparação com uma linhagem de célulasparceiras de fusão humana conhecida, Karpas (Abraham Karpas et ai, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 13 de fevereiro de 2001; 98(4): 1799-1804). Como ou-tras células de mieloma de camundongo padrão, células SPYMEG eram es-féricas. A adesão foi mais fraca do que aquela de Karpas. A atividade decrescimento foi mais forte (dados não mostrados). Essas constatações suge-rem que o desempenho de SPYMEG, como uma célula parceira de fusão, émais elevada do que aquela de Karpas. Além disso, a linhagem de célulasparceiras de fusão estabelecida SPYMEG era viável mesmo depois de con-gelamento e estável sem perda da capacidade de produção, mesmo depoisde uma cultura na escala de 100 mL durante 1 mês (dados não mostrados).

(b) Preparação de hibridomas (células que produzem anticorpos)por fusão de células SPYMEG e leucócitos de sangue periférico humano

A Tabela 1 mostra a produção de IgG por hibridomas (célulasque produzem anticorpos) preparadas por fusão de células SPYMEG e Ieu-cócitos de sangue periférico humano. Os hibridomas foram plaqueados emoito microplacas de 96 cavidades (768 cavidades). A Tabela 1 mostra o nú-mero de cavidades positivas para a formação de colônias, o número de ca-vidades positivas para a produção de IgG entre elas, e o número de cavida-des positivas para a produção contínua de IgG durante um período de trêssemanas ou mais entre elas. A seleção foi realizada por ELISA.

Esse resultado demonstra que hibridomas que produzem IgGforam preparados nesse experimento. Além disso, nenhum clone que produ-za IgG poderia ser obtido por uso da linhagem de células parceiras de fusãoconhecidas de Karpas. Essa constatação sugere que SPYMEG é uma linha-gem de células parceiras de fusão que permite a produção mais eficiente dehibridomas do que Karpas.

Tabela 1.

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Clones que produzem IgG foram carregados por sobre uma co-luna com proteína G. Frações eluídas a partir da coluna foram avaliadas porSDS-PAGE e Western blotting (figura 4). Nessa figura, (+) e (-) indicam clo-nes ELISA-positivos e ELISA-negativos, respectivamente. Fração 2 deK0142 foi positiva em ELISA, e SDS-PAGE demonstrou a presença de IgGhumana nessa fração; entretanto, o sinal não foi detectável por Western blot-ting. Assumiu-se que a detecção falhou por alguma razão.

Além disso, frações eluídas de cada clone foram dialisadas econcentradas, e as amostras resultantes foram testadas (figura 5). Em SDS-PAGE, bandas suspeitas de corresponderem cadeias de IgG HeL foramencontradas mesmo em clones ELISA-negativos; entretanto, as bandas nãoeram detectáveis por Western blotting usando um anticorpo anti-lgG huma-na, e, assim, concebeu-se que deviam corresponder à IgG derivada a partirde FBS. Uma banda foi detectada na pista 5 para um clone ELISA-negativo.Concebeu-se que esse clone produza IgG em um nível muito baixo, conside-rando que ele foi julgado a ser negativo, com base no resultado de ELISApara a cultura sobrenadante. Além disso, o resultado descrito acima de-monstra que a própria SPYMEG não produz IgG humana.

A Tabela 2 mostra o rendimento em IgG purificada a partir dosobrenadante de cultura de cada clone positivo. Quando calculado com basena quantidade de IgG purificada a partir de 100 mL de sobrenadante de cul-tura, a concentração de IgG humana em cada sobrenadante de cultura erade 2 a 11 pg/mL. Portanto, a concentração foi confirmada a ser comparávelàquela para um hibridoma de camundongo padrão.

Tabela 2

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Exemplo 7 - Aperfeiçoamento do método para a preparação de hetero-hibridomas

No Exemplo 2, sangue periférico diluído com PBS foi sobrepostopor sobre HISTOPAQUE, seguido por centrifugação. Entretanto, para se ob-ter leucócitos (células B) com pureza mais elevada, leucócitos de sangueperiférico humano foram coletados por remoção de eritrócitos como um pré-tratamento por mistura de sangue periférico com HetaSep (HETASTARCH),e, então, superposição do sangue por sobre HISTOPAQUE (figura 6).

Especificamente, cerca de 10 ml_ de sangue periférico derivadode um paciente inoculado com vacina HA contra gripe foram transferidospara um tubo de 15 mL, e 2 a 3 mL de HetaSep (StemCeII Technologies Inc.,CAT#07906) foram adicionados a ele. O sangue foi misturado por inversão,e, então, deixado a repousar à temperatura ambiente durante uma hora. Osobrenadante resultante (cor laranja) foi coletado, e HISTOPAQUE foi so-breposto por sobre ele em um tubo de 15 mL, lentamente, usando-se umapipeta de Pasteur, tomando-se cuidado para não perturbar a interface. Otubo foi centrifugado à 1.800 rpm e à temperatura ambiente durante 30 minu-tos. Depois de centrifugação, a camada semelhante a banda branca (cama-da de leucócitos) formada no meio da solução foi coletado para um tubo de50 mL com uma pipeta de Pasteur. Cerca de 30 mL de DMEM livre de soroforam adicionados, e a mistura resultante foi centrifugada à 1.600 rpm, du-rante oito minutos para lavar as células.Como uma parceira de fusão, células SPYMEG foram fundidascom leucócitos de sangue periférico humano coletados pelo método descritono Exemplo 2. Ao invés de RRMI, DMEM livre de soro foi usado como ummeio de base para a fusão de células.

IgGs foram purificadas a partir dos hetero-hibridomas prepara-dos e as IgGs humanas foram avaliadas por ELISA usando-se os métodosdescritos nos Exemplos 3 e 4. O resultado mostrou que ambas as colôniasformadas depois da fusão celular e clones que produzem IgG foram aumen-tados como um resultado de aperfeiçoamento do método para produção dehetero-hibridomas (figura 7).

Exemplo 8 - Confirmação de reatividade em relação à vacina contra gripe

Clones que produzem IgG preparados pelo método descrito noExemplo 7 foram confirmados como sendo reativos em relação à vacina con-tra gripe. De maneira especificada produção de IgG em cada clone foi avali-ada por ELISA sanduíche conforme descrito abaixo, usando placas sensibili-zadas com vacina contra gripe e placas não sensibilizadas que estavam so-mente bloqueadas para remover clones que exibem uma reação não especí-fica.

A vacina contra gripe foi diluída 30 vezes com PBS e amostradapor alíquota (50 μ L/cavidade) para placas de ELISA. As placas foram deixa-das a repousar durante uma noite (sensibilização). A vacina contra gripe u-sada foi vacina HA contra gripe (The Chemo-Sero-Therapeutic ResearchInstitute1 Japão). As cepas de vírus A e B da gripe foram cultivadas separa-damente em ovos de galinha embrionários. O fluido alantônico contendo ví-rus propagado foi purificado e concentrado por centrifugação com gradientede densidade de sacarose ou similar. As partículas virais foram tratadas cométer ou similar, para preparar frações em suspensão de hemaglutinina (naspartes que se seguem, abreviada como "HA"). Depois da inativação comformalina, a preparação foi diluída usando-se solução de cloreto de sódiotamponada como fosfato, de modo que ela continha uma quantidade pre-determinada de HA de cada cepa viral.

Depois que a solução foi removida, 200 μL do tampão de blo-queio foi adicionado a cada cavidade. As placas foram deixadas a repousardurante uma noite (bloqueio). O tampão de bloqueio foi removido, e sobre-nadantes de cultura de hibridomas foram adicionadas (50 pL/cavidade) àsplacas. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma hora. Os sobrenadantes foram removidos e as cavidades foram lavadas trêsvezes com PBS contendo 0,05% de Tween.

Um anticorpos anti-lgG humana marcado com HRP (MBL: 206)foi diluído 5.000 vezes e adicionado às placas. As placas foram incubadas àtemperatura ambiente durante uma hora. Depois de lavagem três vezes, 50 pL de substrato cromogênico foram adicionadas a cada cavidade. Depois de15 minutos de incubação para o desenvolvimento de cor, uma solução deparada foi adicionada e a absorbância (D0450) foi medida com uma leitorade placa.

Como um resultado, cerca de dez clones foram constatados co- mo sendo reativos em relação à vacina contra gripe (figura 8). Anticorposhumanos específicos quanto ao antígeno foram estabelecidos de maneirabem sucedida por uso dos hetero-hibridomas da presente invenção.Exemplo 9 - Confirmação de IgG humana por Western blottina

A reatividade de sobrenadantes de cultura de hibridomas que produzem IgG humana foi avaliada por Western blotting usando vacina HAcontra gripe como uma amostra.

A vacina HA contra gripe foi combinada com um volume igual detampão de amostra. A mistura foi fervida durante cinco minutos. 20 μL damistura (10 μL de vacina) foi carregada por sobre 12,5% de gel. SDS-PAGE foi realizada e a amostra foi transferida por sobre uma membrana de PVDF(Immobilon-P número de catálogo IPVH00010). A membrana foi bloqueadacom PBS contendo leite desnatado à 2% à 4°C, durante uma noite, e, então,tratada com PBS contendo BIockAce à 10% e anti-IgG humana-HRP (MBLcódigo 206) χ 3000 como anticorpo de detecção à temperatura ambiente durante uma hora. A membrana foi lavada três vezes com um tampão (PBScontendo Tween 20 à 0,05%). O substrato usado foi PIERCE (super signalWest Pico Chemiluminescent Substrate, código 34080). Depois de um minu-to de exposição, o filme (Hyperfilm ECL; Amersham Bioscience, número decatálogo RPN3103K) foi desenvolvido usando RENDOL (Fuji Film) como umrevelador. A solução de parada e o fixador usados foram ácido acético à 3%e RENFIX (Fuji Film), respectivamente.

Como um resultado, uma banda específica foi detectada para oclone (6-19) (figura 9).

Exemplo 10 - SDS-PAGE de IqG humana purificada (6-19) e confirmação desua reatividade

Primeiro, usando o procedimento descrito abaixo, IgGs humanasreativas em relação à vacina HA contra gripe foram purificadas a partir dossobrenadantes de cultura de hibridomas que produzem IgG humana, asquais demonstrou-se serem reativas por Western blotting conforme descritono Exemplo 9.

Os sobrenadantes de cultura foram eluídos em uma taxa de es-coamento de 1 gota/segundo. As frações de percolação foram coletadas. Acoluna (Protein G Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, número decatálogo 17-0618-03)) foi lavada com PBS contendo NaN3 à 0,1% na taxa deescoamento máxima (lavada até que a absorbância em 280 se tornasse 0,05ou menor, enquanto se monitora com um espectrofotômetro). A coluna foieluída com dois a cinco volumes de leito de coluna de tampão de glicina-HCl0,17 M (pH 2,3) na taxa de escoamento máxima. Usando-se um coletor defração, o eluato foi coletado em tubos de teste contendo tampão Tris-HCl 1M (pH 8,0) de um volume de um quinto ou mais do que o volume de fraçãode eluição (mL). As frações eluídas foram misturadas com tampão, tão logoquanto possível. Depois de medição de A280 de cada fração, as frações fo-ram ensaiadas para proteína. Frações com A280 de 0,1 ou maiores foramreunidas. Depois da reunião, o pH foi confirmado como sendo 8,0 usandouma fita de teste de pH. A pureza do conjunto foi avaliado por SDS-PAGEusando-se 12,5% de gel e tampão de amostra (2ME+) (figura 10). O conjun-to de frações foi empacotado em um tubo de diálise e dialisado contra PBSou PBS contendo NaN3 0,1% com um volume 100 vezes ou mais daquele dasolução reunida. A diálise foi repetida três ou mais vezes, e cada diálise foirealizada durante seis horas ou mais. Depois de concentração, o tubo dediálise foi lavado completamente com água deionizada. A seguir, o tubo dediálise foi suavemente bem esfregado para solubilizar a proteína aderindo àparede do tubo, a solução concentrada foi removida a partir do tubo. Então, a concentração da solução concentrada foi medida.

O resultado mostrou que 2,5 mg de IgG purificada foram obtidosa partir de 200 ml_ de sobrenadante de cultura (figura 10) e a IgG retêve aatividade de ligação.Aplicabilidade Industrial

A presente invenção é útil na produção de substâncias usandocélulas animais. Especificamente, hibridomas que podem ser prontamentecultivados in vitro podem ser obtidos por fusão da parceira de fusão da pre-sente invenção com células que produzem substâncias úteis. Tais célulasque produzem substâncias úteis incluem células que produzem anticorpos.

Especificamente, a presente invenção é útil como métodos paraa produção de anticorpos. Em particular, a presente invenção permite a pro-dução de hibridomas usando células que produzem anticorpos humanoscomo material. Hibridomas obtidos de acordo com a presente invenção pro-duzem anticorpos humanos de maneira estável. Por exemplo, sangue a par- tir de pacientes, que se recuperaram de doenças infecciosas, muito prova-velmente contém células que produzem anticorpos que neutralizam os agen-tes patogênicos ou toxinas produzidas pelos agentes. Anticorpos, que sãoúteis no tratamento de doenças infecciosas, podem ser produzidos por pre-paração de hibridomas a partir de células que produzem anticorpos de tais pacientes, de acordo com a presente invenção.

Doenças infecciosas, para as quais anticorpos terapêuticos po-dem ser obtidos de acordo com a presente invenção, incluem, por exemplo,gripe, AIDS e hepatites virais, tais como HCV e HBV.

Além disso, células que produzem anticorpos de pacientes com câncer provavelmente incluem células que produzem anticorpos que têm aatividade de danificar células de câncer. Anticorpos eficazes no tratamentode câncer podem ser obtidos por produção de hibridomas a partir de taiscélulas que produzem anticorpos de acordo com a presente invenção.

Anticorpos humanos, podem ser obtidos a partir de células queproduzem anticorpos humanos por uso dos métodos de produção de anti-corpos da presente invenção. Uma vez que anticorpos humanos podem ser administrados de maneira segura a seres humanos, eles são adequadoscomo anticorpos terapêuticos. Modificações, tais como quimerização e hu-manização são necessárias no tratamento de seres humanos com anticor-pos obtidos a partir de camundongos, que sejam comumente usados comouma ferramenta para a produção de anticorpos monoclonais. Quando com-parados a tais modificações, os métodos que produzem anticorpos da pre-sente invenção são obviamente úteis como métodos para a produção deanticorpos terapêuticos.

Claims

1. Célula parceira de fusão, que pode ser obtida por fusão de:(a) uma célula de mieloma derivada a partir de uma primeira es-pécie de animal, e(b) uma célula de leucemia derivada a partir de uma segundaespécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra.

2. Célula parceira de fusão, de acordo com a reivindicação 1, naqual a primeira espécie de animal é camundongo e a célula de mieloma éselecionada a partir do grupo consistindo nas linhagens de células de mie-loma de camundongo MOPC21, P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653,FO, S194/5.XXO.BU-1, FOX-NY e SP2/0-Ag14, e linhagens de células deri-vadas a partir destas linhagens de células.

3. [Some texts missing on original document 38]

4. Célula parceira de fusão, de acordo com a reivindicação 1, naqual a primeira célula é SP2/0-Ag14 e a segunda célula é MEG-01.

5. Célula parceira de fusão SPYMEG depositada sob o númerode acesso FERM BP-10761.

6. Hibridoma que pode ser obtidos por fusão de:(1) uma célula parceira de fusão que possa ser obtida por fusãode:(a) uma célula de mieloma derivada a partir de uma primeira es-pécie de animal; e(b) uma célula de leucemia derivada a partir de uma segundaespécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra; e(2) uma terceira célula.

7. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 6, no qual a primei-ra espécie de animal é camundongo e a célula de mieloma é selecionado apartir do grupo consistindo nas linhagens de células de mieloma de camun-dongo M0PC21, P3X63AG8, SP2/0, NS-1, P3.X63AG8.653, FO,S194/5.XXO.BU-1, FOX-NY e SP2/0-Ag14, e linhagens de células derivadasa partir destas linhagens de células.

8. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 6, no qual a segun-da espécie de animal é humana e a célula de leucemia é selecionada a partirdo grupo consistindo nas linhagens de células de leucemia MEG-01, HEL,UT-7, M07e, MEG-A2 e DAMI, e linhagens de células derivadas a partir des-tas linhagens de células.

9. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 6, no qual a primei-ra célula é SP2/0-Ag14 e a segunda célula é MEG-01.

10. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 6, no qual a célulaparceira de fusão é SPYMEG depositada sob o número de acesso FERMBP-10761.

11. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 6, no qual a tercei-ra célula é uma célula derivada a partir da mesma espécie de animal queaquela a partir da qual a segunda célula deriva.

12. Hibridoma, de acordo com a reivindicação 11, no qual a ter-ceira célula é uma célula que produza anticorpos.

13. Método para produção de uma célula parceira de fusão, quecompreende as etapas de:(1) fusão de:(a) uma célula de mieloma a partir de uma primeira espécie deanimal; e(b) uma célula de leucemia derivada a partir de uma segundaespécie de animal, cujo ciclo celular tenha uma fase S extra; e(2) cultivo da célula fundida na etapa (1) e coleta da célula par-ceira de fusão a partir da cultura.

14. Um método para a produção de um hibridoma, que compre-ende as etapas de:(1) fusão de uma célula que produza anticorpos com a célulaparceira de fusão obtida pelo método de acordo com a reivindicação 13; e(2) cultivo da célula fundida na etapa 91) e coleta do hibridoma apartir da cultura.

15. Método para produção de uma célula que produza anticor-pos, que compreende as etapas de:(1) obtenção de um hibridoma por fusão de uma célula que pro-duza anticorpos com a célula parceira de fusão obtida pelo método de acor-do com a reivindicação 13; e(2) coleta do hibridoma obtido na etapa (1) como uma célula queproduz anticorpos.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, que compreendeadicionalmente a etapa de clonagem do hibridoma obtido na etapa (1).

17. Método para produção de um anticorpo, que compreende asetapas de:(1) obtenção de um hibridoma por fusão de uma célula que pro-duza anticorpos com a célula parceira de fusão obtida pelo método de acor-do com a reivindicação 13; e(2) cultivo do hibridoma obtido na etapa (1) e coleta do anticorpoa partir da cultura.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, que compreendeadicionalmente a etapa de clonagem do hibridoma obtido na etapa (1).

19. Método para produção de um anticorpo contra uma doençainfecciosa, que compreende as etapas de:(1) obtenção de um hibridoma por fusão da célula parceira defusão obtida pelo método de acordo com a reivindicação 13, com uma célulaque produza anticorpos derivada a partir de um sujeito que tenha sido ex-posto a um antígeno patogênico de uma doença infecciosa; e(2) cultivo do hibridoma obtido na etapa (1) e coleta de um anti-corpo contra a doença infecciosa a partir da cultura.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual a doençainfecciosa é gripe, AIDS ou hepatite viral.