CN101466828A - 融合伴侣细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供融合伴侣细胞。通过将来源于第1动物种的骨髓瘤细胞与来源于第2动物种且细胞周期中具有Extra－S期、并具有使染色体为多倍体的性质的白血病细胞进行融合，从而制作能够与小鼠以外的种制作异种杂交瘤的融合伴侣细胞。通过使该融合伴侣细胞与小鼠以外的物质产生细胞进行融合来制作异种杂交瘤，从而可以进行稳定的物质生产。

Description

融合伴侣细胞
技术领域
本发明涉及融合伴侣细胞(fusion partner cell)以及杂交瘤。
背景技术
杂交瘤(融合细胞)被用于利用培养细胞的物质生产中。动物细胞中产生商业上或学术上有用的物质的细胞也很多。但是，一般来说，动物细胞的培养是困难的，在维持物质产生能力的同时长期稳定地培养动物细胞的技术还未确立。于是，提出了下述技术：将在生物体外能够永久地进行稳定的培养的骨髓瘤制成融合伴侣细胞，通过使融合伴侣细胞与产生生理活性物质的细胞发生融合而制成杂交瘤，从而制作出具备培养能力和物质生产能力这两种特性的细胞。
使用细胞融合法的单克隆抗体如下生产：对杂交瘤所产生的抗体的产生量和结合性等性质进行试验，将所选的细胞单一化，然后使细胞增殖，制作出均匀的细胞群体，从而生产单克隆抗体。这些杂交瘤在体外或体内(以腹水的形式)进行培养增殖，为了抗体的大量生产而扩张。用于开发使用细胞融合法的单克隆抗体的方法是已知的(参照非专利文献1)。单克隆抗体与从抗血清中精制的多克隆抗体相比特异性地优异，在各种免疫学分析方法中成为重要的工具。
细胞融合在同种细胞间进行时仅称作杂交瘤。一般来说，小鼠的单克隆抗体等通过该方法来制作。与此相对，将由某个种类中分离出来、且与来自其他种类的永生化细胞发生融合而成的抗体产生细胞称作异种杂交瘤。所谓异种杂交的用语与异种间融合以同种意义使用，所制作出的细胞称作异种杂交瘤。进而，如果是融合三种动物种来源的细胞而成的抗体产生细胞，则也可称作三体瘤(trioma)。利用该方法制作的单克隆抗体为大鼠或仓鼠的抗体，使小鼠来源的骨髓瘤细胞与预先投予了预定抗原的大鼠或仓鼠的淋巴细胞融合，从而制作小鼠×大鼠或者小鼠×仓鼠的异种杂交瘤。如此获得的异种杂交瘤经过克隆而获得各种免疫动物来源的单克隆抗体。
目前为止，有关于制作人、兔、牛、羊的单克隆抗体的异种杂交瘤的报道(参照非专利文献2～5、专利文献1、2)。
但是，利用异种杂交瘤进行的单克隆抗体的制作随着进行融合的细胞的生物学系统的种间距离越远，则越难以产生抗体。例如，在小鼠×兔或者小鼠×人的杂交瘤中，抗体的产生是极其困难的。杂交瘤由于异常的染色体数，并不总是将同样的染色体对分离给子细胞，有时也会失去这些染色体。
非专利文献1：Waldman，T.，Science252：p1657-1662(1991)
非专利文献2：Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80：p7308-7312，1983
非专利文献3：Raybould等，Science240：p1788-1790，1988
非专利文献4：Kennedy等，J.Gen.Virol.69：p3023-3032，1988
非专利文献5：Flynn等，J.Immunol.Methods121：p237-246，1989
专利文献1：美国专利第4634664号说明书
专利文献2；美国专利第4977081号说明书
发明内容
本发明的目的在于提供在广范围的动物种中能够更容易地应用利用杂交瘤的稳定的物质生产的技术。具体地说，本发明的目的在于提供对杂交瘤的制作有用的新型融合伴侣及其制作方法。或者，本发明的目的在于提供通过由本发明获得的融合伴侣与物质生产细胞的融合而获得的杂交瘤、其制造方法、以及利用该杂交瘤的物质生产方法。
利用了细胞融合技术的物质的生产除了小鼠等有限的动物，还存在各种各样的课题。例如，无法提供可用作细胞融合所用的融合伴侣的细胞是小鼠以外的动物的细胞融合技术的重要课题之一。本发明人等发现，通过使特定的细胞融合，可获得作为融合伴侣有用的细胞。本发明人等所建立的融合伴侣细胞通过与小鼠以外的细胞融合，形成稳定的杂交瘤。而且确认了如此获得的杂交瘤在克隆期间也稳定地维持其表型(phenotype)，并且作为物质生产细胞也是有用的，进而完成了本发明。另外，还明确了通过本发明的杂交瘤，能够产生特异性地识别抗原的抗体。
即，本发明涉及以下的融合伴侣细胞以及该融合伴侣细胞与物质生产细胞的杂交瘤。或者，本发明涉及这些细胞的制造方法以及利用杂交瘤的物质的制造方法。
[1]一种融合伴侣细胞，其能够通过将以下的细胞(a)和(b)融合而获得，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞；
(b)来源于第2动物种、且在细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞。
[2]根据[1]所述的融合伴侣细胞，其中，第1动物种为小鼠，骨髓瘤细胞选自以下所示的小鼠骨髓瘤细胞和从这些细胞株诱导的细胞株，
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY和SP2/0-Ag14。
[3]根据[1]所述的融合伴侣细胞，其中，第2动物种为人，白血病细胞选自以下所示的白血病细胞和从这些细胞株诱导的细胞株，
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAMI。
[4]根据[1]所述的融合伴侣细胞，其中，第1细胞为SP2/0-Ag14，第2细胞为MEG-01。
[5]一种以保藏编号FERM BP-10761保藏的融合伴侣细胞SPYMEG。
[6]一种杂交瘤，其能够通过将以下的细胞(1)和(2)融合而获得，
(1)能够通过融合下述细胞(a)和(b)而获得的融合伴侣细胞，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞；和，
(2)第3细胞。
[7]根据[6]所述的杂交瘤，其中，第1动物种为小鼠，骨髓瘤细胞选自以下所示的小鼠骨髓瘤细胞和从这些细胞株诱导的细胞株，
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY和SP2/0-Ag14。
[8]根据[6]所述的杂交瘤，其中，第2动物种为人，白血病细胞选自以下所示的白血病细胞和从这些细胞株诱导的细胞株，
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAM1。
[9]根据[6]所述的杂交瘤，其中，第1细胞为SP2/0-Ag14，第2细胞为MEG-01。
[10]根据[6]所述的杂交瘤，其中，融合伴侣细胞是以保藏编号FERMBP-10761保藏的SPYMEG。
[11]根据[6]所述的杂交瘤，其中，第3细胞为来源于与第2细胞相同动物种的细胞。
[12]根据[11]所述的杂交瘤，其中，第3细胞为抗体产生细胞。
[13]一种制造融合伴侣细胞的方法，其包括以下工序：
(1)融合以下的细胞(a)和(b)的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞；
(2)培养在工序(1)中融合而成的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序。
[14]一种制造杂交瘤的方法，其包括以下工序：
(1)使通过[13]记载的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合的工序；和
(2)培养在工序(1)中融合而成的细胞，并从培养物中回收杂交瘤的工序。
[15]一种制造抗体产生细胞的方法，其包括以下工序：
(1)使通过[13]记载的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合而获得杂交瘤的工序；和
(2)将工序(1)中获得的杂交瘤作为抗体产生细胞回收的工序。
[16]根据[15]所述的方法，其还附加性地包括将工序(1)中获得的杂交瘤进行克隆的工序。
[17]一种制造抗体的方法，其包括以下工序：
(1)使通过[13]记载的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合而获得杂交瘤的工序；和
(2)培养在工序(1)中获得的杂交瘤，并从培养物中回收抗体的工序。
[18]根据[17]所述的方法，其还附加性地包括将工序(1)中获得的杂交瘤进行克隆的工序。
[19]一种制造针对感染性疾病(infectious disease)的抗体的方法，其包括以下工序：
(1)将通过[13]记载的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合而获得杂交瘤的工序，所述抗体产生细胞来源于有感染性疾病的病原体抗原的暴露经历的对象；和
(2)培养在工序(1)中获得的杂交瘤，并从培养物中回收针对感染性疾病的抗体的工序。
[20]根据[19]所述的方法，其中，感染性疾病为流感(即流行性感冒)、AIDS或病毒性肝炎中的任一种。
或者，本发明涉及可通过融合以下的细胞(a)和(b)而获得的融合细胞的作为融合伴侣细胞的用途。更具体地说，本发明包括该融合细胞的作为与抗体产生细胞的融合伴侣细胞的用途。
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞；
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞。
根据本发明，可以提供通过与异种细胞的细胞融合而形成稳定的杂交瘤的融合伴侣细胞。通过与本发明的融合伴侣细胞的细胞融合而获得的杂交瘤会稳定地生产物质。特别是，本发明的融合伴侣细胞通过与抗体产生细胞的细胞融合而形成产生来源于抗体产生细胞的抗体的杂交瘤。本发明的融合伴侣细胞的优选方式为通过与人或小鼠的抗体产生细胞的细胞融合而形成产生人抗体或小鼠抗体的杂交瘤。稳定地维持人的抗体产生细胞在以前是比较困难的。因此，提供了稳定地产生人的抗体的细胞是本发明的很大的效果。
杂交瘤稳定地维持表型不仅在物质的生产中、而且在细胞的克隆中也是重要的特征。例如，抗体产生细胞为了获得单克隆抗体而将杂交瘤克隆。细胞的克隆也就是获得由单一细胞增殖而成的细胞群体。因此，在反复进行单一细胞分裂的过程中，如果细胞的表型不稳定，则目标细胞的克隆是极其困难的。由本发明提供的杂交瘤由于稳定地维持细胞的表型，因此可以容易地进行克隆。
附图说明
图1为表示MEG-01的细胞周期的图。
图2为表示利用ELISA法的人IgG产生杂交瘤的筛选概念的图。
图3为比较本发明的融合伴侣细胞SPYMEG和现有的融合伴侣细胞Karpas的形态的照片。
图4为确认克隆KO142(+)、MK16(+)、MK99(+)的各洗脱级分的IgG的照片。图中的(+)表示ELISA阳性克隆、(-)表示ELISA阴性克隆。
图5为确认各克隆的洗脱级分、透析浓缩后的样品的IgG的照片。
图6为表示SPYMEG细胞融合的改良方法的工序的图。
图7为比较细胞融合方法的改良前后的集落形成数、IgG产生克隆数的图。表示了每4张96孔板的集落形成孔数、IgG产生孔数。通过细胞融合工序的改良，集落形成孔数、IgG产生孔数显著地增加，其中在流感的筛选中，获得了多个特异性地识别流感疫苗的抗体。首次成功地确立了特异性地识别抗原的抗体。
图8为表示与流感反应的IgG产生克隆的ELISA中的反应性的图。
图9为表示利用Western印迹法的对流感疫苗的反应性的图。
图10为表示精制人IgG(6-19)的SDS-PAGE和反应性的确认的图。表中的值为致敏了流感HA疫苗的ELISA的值，表示波长450nm处的吸光度。
具体实施方式
本发明中的“杂交瘤”是指通过细胞融合获得的细胞。通常，杂交瘤通过种类不同的细胞或同种的不同个体或组织来源的细胞的融合来制造。或者，使同种的相同细胞彼此融合而成的细胞也包括在杂交瘤中。进而，本发明的杂交瘤包括通过2个以上细胞的融合而获得的融合细胞。即，通过对由细胞A和细胞B的细胞融合获得的杂交瘤α进一步融合细胞C而获得的融合细胞β也包括在本发明的杂交瘤中。
(细胞A)×(细胞B)＝[杂交瘤α]
[杂交瘤α]×(细胞C)＝[杂交瘤β]
形成融合有上述3种细胞的杂交瘤β的细胞A、细胞B和细胞C所来源的种类是任意的。因此，这些细胞所来源的种类相同的情况和不同的情况均包含在本发明中。有时将通过3种细胞的融合而获得的杂交瘤特别地称作三体瘤。
本发明的优选方式中，细胞A(第1细胞)和细胞B(第2细胞)所来源的种类不同，细胞B和细胞C(第3细胞)所来源的种类相同。或者，细胞A和细胞C所来源的种类相同的情况，或者细胞A、细胞B和细胞C为均不同种的来源的情况，均包括在本发明的杂交瘤中。
一般来说，特别地将通过细胞融合获得的可在体外长期容易地培养的细胞称作杂交瘤。因此，本发明中优选的杂交瘤是指在细胞融合后可以在体外长期容易地培养的细胞。或者，本发明中优选的杂交瘤是指在有限稀释(limited dilution)后维持细胞增殖的细胞。换而言之，有限稀释后维持细胞增殖的细胞包括在细胞融合后可以在体外长期容易地培养的细胞中。
进而，本发明中优选的杂交瘤是维持细胞融合所利用的细胞的表型的细胞。本发明中，杂交瘤应维持的细胞的表型包括细胞所具有的生产物质的能力。例如，细胞融合所用的细胞为产生抗体或细胞因子的细胞时，本发明中优选的杂交瘤维持生产这些物质的能力。
但是，本发明的杂交瘤并非必须完全地维持细胞融合所用细胞所具备的表型。因此，例如当除了之前所示的抗体以外，也期待维持细胞表面抗原或细胞内蓄积的酶或转录因子的产生这些表型时，这些表型也包含在杂交瘤应维持的表型中。但是，当不需要生产这些物质时，即便是失去生产这些物质的能力的细胞，只要维持所需物质的生产，则包含在本发明的杂交瘤中。
本发明中的“融合伴侣细胞”是指可以通过与其它细胞融合来制作杂交瘤的细胞。本发明中，优选的融合伴侣细胞通过细胞融合而使在体外的细胞的长期存活成为可能。
进而，融合伴侣细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物是指在特定的培养条件下可以(或不可以)存活的表型。
动物细胞的选择标记物中已知有由次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶缺乏(以下简称为HGPRT缺乏)或胸苷激酶缺乏(以下简称为TK缺乏)所带来的次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)等。HAT敏感性的细胞无法在HAT选择培养基中进行DNA合成而死亡，但当与正常的细胞融合时，由于可以利用正常细胞的补救途径来继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会增殖。
HGPRT缺乏或TK缺乏的细胞分别可以在含有6-硫鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简称为8AG)或5’-溴脱氧尿苷的培养基中选择。正常的细胞由于将这些嘧啶类似物摄入到DNA中，因此会死亡，但缺乏这些酶的细胞由于不会摄入这些嘧啶类似物，因此可以在选择培养基中存活。另外，被称作G418耐受性的选择标记物通过新霉素耐受性基因，形成针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的耐受性。
本发明提供可通过融合以下的细胞(a)和(b)而获得的融合伴侣细胞：
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞。
另外，本发明还提供包含以下工序的制造融合伴侣细胞的方法：
(1)融合以下的细胞(a)和(b)的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞；和，
(2)培养在工序(1)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序。
本发明中，来源于第1动物种的骨髓瘤细胞是指来源于可单独地克隆的骨髓瘤的细胞。可单独地克隆是指在人工的培养环境下从1个细胞就可以开始增殖并维持增殖。
本发明中，来源于第1动物种的骨髓瘤细胞只要是可通过与白血病细胞的细胞融合而形成融合伴侣的细胞，则可以利用各种细胞。例如，作为可用作本发明的骨髓瘤细胞的公知的细胞，可以列举出以下的细胞株。以下所示细胞株的一览中，ATCC表示美国标准生物品收藏中心(AmericanTissue and Culture Collection)的保藏编号，JCRB表示JCRB细胞库(日本细胞库，Japanese Collection of Research Bioresources)的保藏编号。因此，这些细胞株均可以由该细胞库获得分售。另外，JCRB细胞库的细胞株通过日本科学研究资源库(Human Science Research Resources Bank，HSRRB)获得分售。
MOPC21(ATCC编号HB-8411)
P3X63AG8(ATCC编号T1B9)
SP2/0(ATCC编号CRL1581)
NS-1(ATCC编号TIB18)
P3.X63AG8.653(ATCC编号CRL1580)
F0(ATCC编号CRL1646)
S194/5.XXO.BU-1(ATCC编号CRL1580)
FOX-NY(ATCC编号CRL1732)
SP2/0-Ag14(JCRB编号0029)
这些细胞株中具备之前所述的优选特征的是一组小鼠骨髓瘤细胞株、或者从这些小鼠骨髓瘤细胞株诱导的细胞株。诱导的细胞株是指导入药剂耐受性等附加表型后重新进行克隆而得到的细胞株。
本发明的来源于第2动物种的白血病细胞是指细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞。一般来说，对于真核细胞，由以下的循环构成细胞周期。持续细胞增殖的细胞通过重复G1期～M期的循环来继续细胞分裂。另一方面，当停止细胞增殖时，成为M期后称为G0期的稳定状态，细胞周期停止。
-[G1期]-[S期]-[G2期]-[M期]-
这些各细胞周期中，S期为进行核酸合成的期间。此时认为构成染色体的基因组DNA被复制，做好细胞分裂的准备。倍增的基因组DNA在M期通过有丝分裂而分离为2个细胞。然而，在特定细胞中，在进行基因组DNA的复制后，观察到细胞分裂不进行的现象。将完成DNA的合成但未移向M期的细胞分裂的期间命名为Extra-S期。在未分裂的细胞中，所合成的基因组DNA蓄积，观察到细胞中的DNA的增加。例如，本发明中优选的白血病细胞MEG-01的平均染色体数为2n＝104，远远多于正常细胞(2n＝46)。这是由于MEG-01在增加基因组DNA的细胞周期中含有Extra-S期，从而具有使染色体成为倍数体的性质(Oncogene13：p695-703，1996)(图1)。
这样，在本发明中，通过使用细胞周期中含有Extra-S期、从而具有使染色体成为倍数体的性质的白血病细胞，可以期待防止来源于抗体产生细胞的染色体从异种杂交瘤上脱落的效果。
本发明的细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞来源于与上述骨髓瘤不同的动物种，且优选为来源于与后述的第3细胞的来源种类相同种的白血病细胞。白血病细胞可以由具有白血病的个体的造血组织或末梢血中获得。造血组织包括骨髓、脾脏或者淋巴结等。白血病例如可以列举出巨核细胞系白血病。例如，通过用Ficoll法离心分离末梢血并回收特定比重的细胞级分，从而可以分离白细胞或者单核细胞等。
进一步分离的白血病细胞的细胞周期中含有Extra-S期可以将细胞染色体的增加作为指标来进行确认。染色体的增加例如可以通过经12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)处理的细胞的倍数性(染色体总数)的增加来确认。倍数性的增加可以通过流式细胞仪或者倍数性分析仪来检测。
或者，还可将公知的白血病细胞用于本发明。例如，作为可作为本发明的来源于第2动物种的白血病细胞利用的公知的细胞，可以列举出以下的细胞株。MEG-01和HEL为人的巨核细胞系白血病细胞株(Blood 66：p1384-1392，1985、J.Clin.Invest.85：p1072-1084)。
MEG-01(ATCC编号CRL-2021)
HEL(JCRB编号0062)
UT-7(N.Komatsu et al.Cancer Res.51：341-348，1991)
M07e(Avanzi GC et al.J Cell Physiol.1990Dec；145(3)：458-64.)
MEG-A2(JCRB编号IFO50478)
DAM1(Blood89：p4238，1997)
特别是MEG-01作为选择标记物具有有用的8AG耐受性。另外，由于MEG-01本身不产生免疫球蛋白，因此作为与抗体产生细胞的杂交瘤的制作用融合伴侣是优选的。
本发明的融合伴侣细胞可以通过将来源于第1动物种的骨髓瘤细胞与来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞进行细胞融合而获得。细胞融合可以利用聚乙二醇(PEG法)或电融合法等公知的细胞融合技术。
聚乙二醇法的操作如下。首先，将骨髓瘤细胞与白血病细胞的细胞比就各个特定的融合条件进行最优化。对于聚乙二醇(PEG)的浓度，本领域技术人员可以根据PEG的分子量等条件来选择最佳的条件。例如，35％的PEG1500(Aldrich、Milwaukee、Wisconsin)是用于一般的细胞融合的条件之一。用1.5分钟的时间慢慢将1mL的35％PEG1500加入细胞团块/细胞混合物中后，缓慢地用不含血清的培养基、然后用含血清的培养基进行稀释，从而进行细胞融合。
为了使细胞融合变得容易而同样地可使用的其它方法包括电融合。该方法中，将细胞置于特殊的缓冲液中，通过施加电场使细胞排列。排列后的细胞与其它细胞的接触机会增加，可以有效地使细胞融合。
将融合混合物在含有例如15％胎牛血清的HB-GRO培养基(IrvineScientific，Santa Ana，California)150ml中制成细胞密度为8×105细胞/mL，以2.0×105细胞/孔分散于96孔板中。将细胞在5～10％CO2气氛下、37℃下孵育，制成8AG耐受性，从而可以获得融合伴侣细胞。所得融合伴侣细胞可以根据需要进行克隆。克隆后的融合伴侣细胞在杂交瘤的制造中有助于维持重现性。
例如，可以分别使用SP2/0-Ag14作为来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、使用MEG-01作为来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞。
如此提供的融合伴侣细胞其本身可长期稳定地传代，成为用于从抗体产生细胞获得单克隆抗体的普遍的融合伴侣细胞。即，与小鼠的同种杂交瘤中确立的小鼠骨髓瘤同样，作为可以利用小鼠以外的生物种来源的抗体产生细胞来稳定地获得杂交瘤的融合伴侣是有用的。通过本发明获得的融合伴侣细胞中，通过将小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14与人白血病细胞株MEG-01融合而获得的融合伴侣细胞SPYMEG以保藏编号FERM BP-10761保藏在专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)。
(a)保藏机构的名称和地址
名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6(邮编305-8566)
(b)保藏日：平成18年(2006年)2月24日
(c)保藏编号：FERM BP-10761
(由平成18年2月24日保藏的FERM P-20816转移)
本发明涉及可以使用上述融合伴侣细胞获得的杂交瘤。即，本发明提供可通过融合以下的细胞(1)和(2)而获得的杂交瘤。
(1)可以通过融合下述的细胞(a)和(b)而获得的融合伴侣细胞，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞；和，
(2)第3细胞。
另外，本发明还提供包括以下工序的制造杂交瘤的方法：
(1)融合下述的细胞(a)和(b)的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞；
(2)培养在工序(1)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序；
(3)使第3细胞与工序(2)中回收的融合伴侣细胞融合的工序；以及，
(4)培养在工序(3)中融合的细胞，并从培养物中回收杂交瘤的工序。
本发明的第3细胞为与第1细胞或第2细胞同种来源或者不同种来源的细胞。具体地例如可以利用来源于人、兔、小鼠、大鼠、牛、山羊和绵羊等的细胞。更具体地说，当使用通过小鼠来源的骨髓瘤(第1细胞)和人来源的白血病细胞(第2细胞)而获得的融合伴侣时，作为第3细胞优选的细胞为人或小鼠来源的细胞。特别是可以利用人来源的细胞作为第3细胞，这是本发明的融合伴侣细胞的很大优点。
本发明的第3细胞是可以期待最终能够长期培养的细胞。更具体地说，例如可将具有生产目标物质的能力的细胞作为第3细胞来使用。通过将这种细胞与本发明的融合伴侣进行细胞融合，可以获得能够长期地维持具有目标表型的细胞的杂交瘤。一般将通过制成杂交瘤而使细胞能够长期间维持的形式称作永生化。
本发明中，可以将产生目标生理活性物质的任意细胞作为第3细胞利用。本发明中优选的生理活性物质可以列举出抗体。即，抗体产生细胞作为本发明的第3细胞是优选的。抗体产生细胞例如可以列举出白细胞(末梢淋巴细胞)、脾细胞等。从生物体采集这些细胞的方法是公知的。作为第3细胞，更具体地可以列举出来源于有感染性疾病的病原体抗原的暴露经历的对象的抗体产生细胞。有感染性疾病的病原体抗原的暴露经历的对象可以列举出接种了感染性疾病的病原体抗原(疫苗)的对象、或者有感染性疾病的感染经历的对象等。本发明中，感染性疾病并无特别限定，优选可以列举出流感、AIDS、HCV或HBV等病毒性肝炎等。
特别是末梢血淋巴细胞作为本发明的抗体产生细胞是优选的。末梢血淋巴细胞可以通过采血容易地获得。通过根据本发明将小鼠的末梢血淋巴细胞制成杂交瘤，可以容易地获得产生小鼠抗体的杂交瘤。进而，通过根据本发明将人的末梢血淋巴细胞制成杂交瘤，可以容易地获得产生人抗体的杂交瘤。
本发明中，融合伴侣和第3细胞可以通过与上述第1细胞和第2细胞的细胞融合相同的方法来进行细胞融合。细胞融合可以利用PEG法或电融合法。例如，在使用作为本发明的融合伴侣的SPYMEG进行与人末梢血淋巴细胞的细胞融合时，优选的条件可以列举出以下条件。
首先，所融合的末梢血白细胞(PBL)的细胞数优选调整至1×107～108个。以2：1～10：1的比例混合SPYMEG和PBL，先离心分离使其沉淀，除去上清液。在所回收的细胞级分中加入聚乙二醇(PEG)使细胞融合。细胞融合所用的PEG的浓度为30％～70％、优选为40～60％、更优选为50％。根据细胞数，将0.1mL～2.0mL、优选0.6mL～1.0mL的PEG溶液用60秒～90秒的时间用吸管加入细胞中，同时进行搅拌混合。加完PEG溶液后，在该状态下用吸管搅拌混合2分钟～3分钟。之后，进一步用30秒～60秒的时间一点点地加入10～14mL的无血清培养基，同时进行搅拌混合。之后，加入无血清培养基并进行离心分离。离心后除去上清，用无血清培养基洗涤细胞1次。在HAT培养基(15％FBS、HAT(x50)、RPMI中)混悬洗涤后的细胞，接种于96孔板中。
对于无血清培养基和PEG，本领域技术人员可以适当利用通常的细胞融合中所使用的那些。例如，本发明的细胞融合中可以利用以下的培养基和PEG。
PEG：PEG1500(Aldrich、Milwaukee、Wisconsin)
HAT：HAT添加(50x)(GIBCO制、目录号No.21060-017)
无血清培养基：RPMI1640(SIGMA制、目录号No R8758)
除此以外，抗体产生细胞还可从免疫动物获得。预先将任意的抗原与适当的佐剂一起对免疫动物免疫。抗原还可以与载体蛋白相结合而成为免疫原。用于获得免疫原的载体蛋白可以使用钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)等。免疫动物一般利用兔、小鼠、大鼠、山羊或绵羊等。作为佐剂，一般使用Freund的完全佐剂(FCA)等(Adv.Tubercl.Res.，1：130-148，1956)。利用ELISA或Ouchterlony法追踪抗体效价，确认抗体效价充分地上升后，摘出抗体产生细胞并使该细胞分散，从而制成细胞融合所使用的抗体产生细胞。与人同样，通过回收脾细胞或末梢血淋巴细胞，可以回收抗体产生细胞。如此获得的抗体产生细胞通过与本发明的融合伴侣进行融合，可以制成本发明的杂交瘤。
这样，本发明的杂交瘤的制造方法中，通过在第3细胞中使用抗体产生细胞，可以制造抗体。即，本发明提供包括以下工序的制造抗体的方法：
(1)通过以下的工序获得融合伴侣细胞的工序，
(A)将以下的细胞(a)和(b)融合的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞，
(B)培养在工序(A)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序；
(2)使抗体产生细胞与工序(1)中获得的融合伴侣细胞融合，从而获得杂交瘤的工序；以及，
(3)培养在工序(2)中获得的杂交瘤，并从培养物中回收抗体的工序。
或者，本发明涉及对上述抗体的制造有用的产生抗体的细胞的制造方法。即，本发明提供包括以下工序的制造抗体产生细胞的方法：
(1)通过以下的工序获得融合伴侣细胞的工序，
(A)将以下的细胞(a)和(b)融合的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞，
(B)培养在工序(A)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序；
(2)使抗体产生细胞与工序(1)中获得的融合伴侣细胞再融合，从而获得杂交瘤的工序；以及，
(3)将工序(2)中获得的杂交瘤作为抗体产生细胞回收的工序。
通过使用本发明的融合伴侣细胞，可以获得稳定地产生抗体的杂交瘤。杂交瘤通过在适当的培养基中培养，可以优先地使细胞融合成功的细胞增殖。例如，使用本发明的SPYMEG作为融合伴侣细胞时，可以利用含有HAT的选择培养基。
在本发明的抗体制造方法或者抗体产生细胞的制造方法中，杂交瘤可以进行克隆。将杂交瘤进行克隆的方法是公知的。即，通过有限稀释法可以将杂交瘤进行克隆。经有限稀释的杂交瘤理论上形成从1个细胞增殖而成的细胞群体。如此获得的细胞群体为具有均匀的遗传特征的细胞群体、即克隆。由经克隆化的杂交瘤获得的抗体称作单克隆抗体。单克隆抗体是具有高度均匀的抗原结合表型的抗体。
即，本发明提供包括以下工序的单克隆抗体的制造方法：
(1)通过以下的工序获得融合伴侣细胞的工序，
(A)将以下的细胞(a)和(b)融合的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞，
(B)培养在工序(A)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序；
(2)使抗体产生细胞与工序(1)中获得的融合伴侣细胞融合而制成杂交瘤，并将产生目标抗体的杂交瘤进行克隆的工序；以及，
(3)培养工序(2)中经克隆的杂交瘤，并从培养物中回收单克隆抗体的工序。
或者，本发明涉及对上述抗体的制造有用的产生抗体的细胞的制造方法。即，本发明提供包括以下工序的制造抗体产生细胞的方法：
(1)通过以下的工序获得融合伴侣细胞的工序，
(A)将以下的细胞(a)和(b)融合的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞，
(B)培养在工序(A)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序；
(2)使抗体产生细胞与工序(1)中获得的融合伴侣细胞再融合，从而获得杂交瘤的工序；以及，
(3)将工序(2)中获得的杂交瘤作为抗体产生细胞回收的工序。
本发明中，可以将抗体产生细胞进行克隆。通过将产生目标抗体的抗体产生细胞进行克隆，可以制成产生单克隆抗体的细胞。即，本发明提供包括以下工序的产生单克隆抗体的杂交瘤的制造方法：
(1)通过以下的工序获得融合伴侣细胞的工序，
(A)将以下的细胞(a)和(b)融合的工序，
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、
(b)来源于第2动物种且细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞，
(B)培养在工序(A)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序；
(2)使抗体产生细胞与工序(1)中获得的融合伴侣细胞再融合而制成杂交瘤，并将产生目标抗体的杂交瘤进行克隆的工序；以及，
(3)将工序(2)中经克隆的杂交瘤作为抗体产生细胞回收的工序。
本发明的杂交瘤是在体外具有稳定的抗体产生能力的抗体产生细胞。因此，虽为异种杂交瘤，但在适当培养基中在细胞增殖的同时，抗体产生能力也维持。因此，在克隆的过程中失去必要的克隆的可能性较低。而且，已建立的杂交瘤克隆也可稳定地维持。
通过由本发明获得的杂交瘤或者其克隆的培养，可以产生抗体或单克隆抗体。使用无血清培养基或低浓度血清培养基等作为培养基时，抗体的精制变得容易，因此优选。基本的动物细胞培养基已知有DMEM培养基、RPMI1640培养基或ASF培养基103等。另外，还可接种于裸鼠或SCID小鼠的腹腔，以腹水的形式回收单克隆抗体。
当向培养基中加入血清时，可以以5～10％v/v利用胎牛血清(以下简称为FCS)。另外，当在这些培养基中培养本发明的杂交瘤时，添加公知的抗体产生增强因子是有利的。在体外增强抗体产生的成分已知有例如D-青霉胺、乙酰乙酸、双胍类、维生素K5、N-乙酰谷氨酸(特开平8-70858)、白细胞介素6(Nature，324：6092，73-6；1986)、糖醇(特开平2-200177)、脂多糖(特开平4-20294)、佛波酯(特开平1-171494)或丁酸(hyridome Vol.4，No.1，p63；1985)等。如此获得的单克隆抗体可以通过利用硫酸铵、硫酸钠等的盐析法、离子交换色谱法、凝胶过滤法或者亲和色谱法等进行精制。
以下通过实施例具体地说明本发明，但本发明并非局限于这些实施例。
另外，本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参考编入本说明书中。
实施例
[实施例1]
融合伴侣细胞的制作
根据常规方法用PEG使在RPMI+5％FCS(普通培养基)的培养液中培养的SP2/0-Ag-14(3×107)和MEG-01(3～6×107)的细胞进行融合。在普通培养基(RPMI+5％FCS)中培养融合细胞3天，在第3天用不含FCS的RPMI溶液培养19天。在第19天用含有8AG的普通培养基进行有限稀释，并培养5天。由于融合细胞发生了增殖，因此取其作为融合伴侣细胞SPYMEG。SPYMEG以保藏编号FERM BP-10761(由FERM P-20816转移)在2006年2月24日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。SPYMEG为8AG耐受性，用HAT培养基培养时死亡。
[实施例2]
利用PEG法制作异种杂交瘤
a)人末梢血白细胞的回收(比重离心法)
以每次10mL将肝素采血的人末梢血40mL分注于50mL的管中，加入25mL灭菌PBC并混合，叠置于以每次15mL分注有HISTOPAQUE(SIGMAH8889)的50mL管中，在800rpm、室温下离心30分钟。离心后回收白细胞层。
b)融合伴侣细胞(SPYMEG)的回收
回收在75cm2培养烧瓶中增殖的SPYMEG(培养基：10％FBS-RPMI)。
c)细胞融合
混合回收的人末梢血白细胞和SPYMEG，以达到2：1～10：1的比例，进行离心(从末梢血40mL获得4～8×107个。SPYMEG使用4个75cm2培养烧瓶的量)。在团块中加入0.6～1.0mL的50％PEG(PEG4000、MERCK CatNo.1097270100，用RPMI(RPMI1640、SIGMA、Cat No.R8758)等量稀释)，进行细胞融合。用RPMI无血清添加培养基洗涤后，在15％FBS(EQUITECH-BIO INC Lot.SFB30-1548)-HAT(HAT添加(BM-condimed、roche Cat No.663573)(50x)、GIBCO Cat No.21060-017)1％BM培养基160mL中悬浮，并接种于8张96孔板中。接种开始3天后更换培养基，在确认杂交瘤的集落形成的阶段(2～3周后)从96孔板中采样培养上清，进行1次筛选。
[实施例3]
IgG精制方案
以1滴/秒的流速将样品(培养上清)上样，回收通过液。用PBS/0.1％NaN3以最大流速洗柱(洗涤直至用吸光度计测达到A280＝0.05以下)。用柱床体积的2～5倍量的0.17M甘氨酸-HCl缓冲液(pH为2.3)以全速的流速进行解离。使用级分收集器将解离物收集于试管中。在试管中预先放入有解离物量(mL)的1/5以上的1M Tris-HCl缓冲液(pH为8.0)。解离物和中和用1M Tris-HCl缓冲液(pH为8.0)尽量迅速地混合。测定各级分的A280后，寻找有蛋白的级分，集中A280＝0.1以上的级分。
集中后用pH试纸确认了pH为8.0。集中的级分用12.5％凝胶、样品缓冲液(2ME+)进行SDS-PAGE，检验纯度。每个带道的样品量为5μg，以前的批次也等量电泳，进行比较。装于透析管中，用回收体积的100倍以上的PBS或PBS/0.1％NaN3以每次6小时以上透析3次以上。浓缩结束后用去离子水充分地洗涤透析管，充分地揉搓透析管，将附着在管壁上的蛋白质溶解，将浓缩液从管取出。之后测定浓度。
或者，还可以不使用级分收集器，而是集中解离物并在1个量筒、烧杯等中边搅拌边回收。此时也放入解离物回收量(mL)的1/5以上的中和用1M Tris-HCl缓冲液(pH为8.0)，回收后用pH试纸确认pH为8.0。如果pH为8.0以下时，加入中和用缓冲液，立即使pH为8.0。
[实施例4]
利用ELISA法测定人IgG
a)致敏板的制作
用致敏用缓冲液(PBS)将兔抗人IgG多克隆抗体稀释至10μg/mL，按50μl/孔分注到微孔板(Nunc MaxiSorp)中。在4℃下静置1晚。除去致敏用缓冲液，挥去水分。按100μl/孔分注封闭用缓冲液(PBS中含1％BSA、0.1％NaN3)，并在4℃下静置1晚。
b)ELISA法
将杂交瘤培养上清按50μl/孔分注到致敏微孔板(a中准备的板)中，在室温下静置反应1小时。除去反应液，用洗涤用缓冲液(0.05％Tween20/PBS)洗涤3次后，挥去水分。稀释识别抗体(过氧化物酶系，5000倍稀释后使用，抗人IgG POD识别多克隆抗体)，按50μl/孔分注后，在室温下静置1小时。调制酶底物液(四甲基联苯胺溶液)。除去板的识别抗体，用洗涤用缓冲液洗涤3次后，挥去水分。按50μl/孔分注酶底物液。在室温下反应15分钟左右。按50μl/孔分注反应停止液(2N硫酸)。利用酶标仪(plate reader)测定吸光度(主波长A450/副波长A620)。将本试验中使用的ELISA法的概念图示于图2。
[实施例5]
利用Western印迹法来确认人IgG
等量混合1mg/mL的抗体溶液和样品缓冲液，煮沸5分钟。将10μl(抗体5μg)上样于12.5％凝胶。进行SDS-PAGE，转印于PVDF膜(immobilon-Pcat No.IPVH00010)，在4℃下用O/N的2％脱脂奶粉/PBS进行封闭。作为检测用抗体，使用抗大鼠IgG POD×2500的10％BlockAce/PBS，在室温下处理1小时。用缓冲液(0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。底物使用PIERCE(Super signal WestPico化学发光底物、code.34080)，曝光1分钟，并进行显影。胶片使用Hyperfilm ECL Amersham Bioscience Cat No.RPN3103K，显影液使用RENDOL(富士胶片)，停止液使用3％醋酸，定影液使用RENFIX(富士胶片)。
[实施例6]
结果
a)融合伴侣细胞的制作
将所制作的融合伴侣细胞SYPMEG和现有的人融合伴侣细胞Karpas(Abraham Karpas et al.，Proc Natl Acad Sci USA.2001 Feb 13；98(4)：1799-1804)进行比较观察(图3)。SPYMEG为与一般的骨髓瘤细胞同样的球形细胞，与Karpas相比粘着性弱。进而，增殖能力高(未显示数据)。由此可知，SPYMEG作为融合伴侣细胞的性能高于Karpas。进而，所确立的融合伴侣细胞SPYMEF在冷冻后复苏，即便进行100mL培养(培养1个月)时产生能力也不会消失，是稳定的(未显示数据)。
b)融合有SYPMEG和人末梢血白细胞的杂交瘤(抗体产生细胞)的制作
表1表示由融合SYPMEG和人末梢血白细胞而获得的杂交瘤(抗体产生细胞)产生IgG。将杂交瘤接种于8张96孔微孔板(768孔)，显示形成了集落的孔数、其中产生了IgG的孔数、以及其中在培养3周以上时维持了IgG的产生的孔数。利用ELISA法进行筛选。
由此结果可知，通过本试验制作了产生IgG的杂交瘤。另外，从现有的融合伴侣细胞Karpas无法获得IgG产生克隆。由此说明，SYPMEG是与Karpas相比可更高效地制作杂交瘤的融合伴侣细胞。
表1
 
集落形成孔 IgG产生孔 IgG产生克隆数(LD前培养3周以上)
M.K1 230/768 73/230 31/73
K.O1 261/768 80/261 40/80
M.K2 205/768 47/205 26/47
T.M1 178/768 40/178 无
Karpas(T.M1) 10/768 2/10 0
将IgG产生克隆添加于蛋白质G柱后，对洗脱时的各洗脱级分利用SDS-PAGE和Western印迹法进行确认(图4)。图中的(+)表示ELISA阳性克隆、(-)表示ELISA阴性克隆。KO142级分2为ELISA阳性，用SDS-PAGE也确认了人IgG的存在，但用Western印迹法无法确认信号。认为此次是由于某种原因而无法检测。
进而，确认了各克隆的洗脱级分、透析浓缩后的样品(图5)。利用SDS-PAGE在ELISA阴性克隆中也确认了认为是IgG的H链、L链的条带，但使用抗人IgG抗体的Western印迹法的结果是未检测到，因此猜测是FBS来源的IgG。在ELISA阴性克隆的带道5上检测到了条带，但由于阴性的判断是培养上清的ELISA的结果，因此认为该克隆产生了极少量的IgG。另外，由此次的结果可知，SPYMEG本身也不产生人IgG。
表2表示由显示阳性的各克隆培养上清得到的精制IgG的产量。由培养上清100mL得到的精制IgG计算出的培养上清中的人IgG浓度为2～11μg/mL。确认是与通常的小鼠杂交瘤基本相同的浓度。
表2
 
培养上清量(ml) 浓度(mg/ml) 液量(ml) 产量(mg) 培养上清IgG浓度(μg/ml)
MK16(+) 100 0.329 0.6 0.1974 1.974
MK99(+) 100 0.572 2 1.144 11.44
KO120(+) 100 0.317 1 0.317 3.17
KO142(+) 100 0.616 0.6 0.3696 3.696
[实施例7]
异种杂交瘤的制作方法的改良
在[实施例2]中，将末梢血用PBS稀释，叠置于HISTPAQUE并进行离心，但为了获得纯度更高的白细胞(B细胞)，将末梢血与HetaSep(HETASTARCH)混合，进行除去红细胞的前处理，然后利用叠置于HISTPAQUE的方法来回收人末梢血白细胞(图6)。
具体地说，将来源于接种了流感HA疫苗的患者的末梢血约10ml放入15ml管中，加入2～3ml的HetaSep(StemCell Technologies Inc CAT#07906)。进行颠倒搅拌，并在室温下静置1小时。回收静置后的上清(橙色)，用巴氏吸管按照不要扰乱界面的方式缓慢地在15ml管中叠置于HISTPAQUE。在1800rpm、室温下离心分离30分钟，离心分离后，用巴氏吸管将溶液的正中间区域出现的白色带的层(白细胞层)回收于50ml管中。加入30ml左右的无血清培养基DMEM，在1600rpm下离心分离8分钟以进行洗涤。
利用[实施例2]中记载的方法，进行所回收的人末梢血白细胞与融合伴侣细胞SPYMEG的细胞融合。作为细胞融合的基础培养基，使用无血清培养基DMEM来代替RPMI。
对于所制作的异种杂交瘤，利用[实施例3]和[实施例4]中记载的方法，进行IgG的精制和利用ELISA法的人IgG的测定。结果，通过对异种杂交瘤的制作方法加以改良，确认了利用细胞融合获得的集落的形成数和IgG产生克隆数均有所增加(图7)。
[实施例8]
对流感疫苗的反应性的确认
确认通过[实施例7]的方法制作的IgG产生克隆对流感疫苗的反应性。具体地说，通过以下的工序，用夹心ELISA来确认致敏了流感疫苗的板和未进行任何致敏而仅进行了封闭的板(除去非特异性反应的克隆)中的克隆的IgG产生。
将用PBS稀释30倍的流感疫苗以50μl/孔分注到ELISA板中，并静置1晚(致敏)。作为流感疫苗，使用流感HA疫苗(化学和血液疗法研究所，日本)。该制剂如下调制：将流感病毒的A型和B型株分别单独地在发育鸡蛋中培养，利用蔗糖密度梯度离心法等将含有增殖了的病毒的尿囊液进行精制浓缩后，利用醚等来处理病毒粒子，制成血凝素(以下为HA)级分悬浮液，用福尔马林进行惰化后，使用磷酸盐缓冲氯化钠溶液，按照各株病毒的HA含有规定量的方式进行稀释，从而调制。
除去溶液，按200μl/孔加入封闭缓冲液，并静置1晚(封闭)。除去封闭缓冲液，按50μl/孔加入杂交瘤的培养上清，在室温下反应1小时。除去上清，用0.05％Tween PBS洗涤3次。
以5000倍稀释加入抗人IgGHRP识别抗体(MBL：206)，在室温下反应1小时。洗涤3次后，以每孔50μl加入显色底物，使其显色15分钟，加入反应停止液，用酶标仪测定吸光度(OD450)。
结果确认了有10个克隆左右对流感疫苗产生反应(图8)。通过本发明的异种杂交瘤，成功地确立了抗原特异性反应的人抗体。
[实施例9]
利用Western印迹法来确认人IgG
将流感HA疫苗作为样品，确认人IgG产生杂交瘤的培养上清的Western印迹法的反应性。
等量混合流感HA疫苗和样品缓冲液，煮沸5分钟。将20μl(疫苗10μl)上样于12.5％凝胶。进行SDS-PAGE，转印于PVDF膜(immobilon-P catNo.IPVH00010)，在4℃下用O/N的2％脱脂奶粉/PBS进行封闭。作为检测用抗体，使用抗人IgG HRP(MBL code 206)×3000的10％BlockAce/PBS，并在室温下处理1小时。用缓冲液(0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。底物使用PIERCE(Super signal WestPico化学发光底物、code.34080)，曝光1分钟，并进行显影。胶片使用Hyperfilm ECL Amersham Bioscience CatNo.RPN3103K，显影液使用RENDOL(富士胶片)，停止液使用3％醋酸，定影液使用RENFIX(富士胶片)。
结果，在克隆(6-19)中检测到了特异性的条带(图9)。
[实施例10]
精制人IgG(6-19)的SDS-PAGE和反应性的确认
首先，利用以下的工序，从[实施例9]的在Western印迹法中显示了反应性的人IgG产生杂交瘤的培养上清中精制对流感HA疫苗产生反应的人IgG。
以1滴/秒的流量将培养上清上样，回收通过液。用PBS/0.1％NaN3-PBS以最大流速洗柱(蛋白质G琼脂糖：Protein G Sepharose4 Fast Flow CatNo：17-0618-03)(洗涤直至用吸光度计测得A280＝0.05以下)。用柱床体积的2～5倍量的0.17M甘氨酸-HCl缓冲液(pH为2.3)以全速的流速进行解离。使用级分收集器将解离物收集于试管中。在试管中预先放入解离物量(ml)的1/5以上的中和用缓冲液1M Tris-HCl缓冲液(pH为8.0)，将解离物和缓冲液迅速地混合。测定各级分的A280后，将检测出蛋白质的级分中A280＝0.1以上的级分集中。集中后用pH试纸确认了pH为8.0。集中的部分用12.5％凝胶、样品缓冲液(2ME+)进行SDS-PAGE，检验纯度(图10)。将集中的级分装于透析管中，用回收体积的100倍以上的PBS或PBS/0.1％NaN3，以每次6小时以上透析3次。浓缩结束后用去离子水充分地洗涤透析管，充分地揉搓透析管，将附着在管壁上的蛋白质溶解，将浓缩液从管中取出。之后，对浓缩液进行浓度的测定。
由以上的结果确认了从培养上清200ml中获得2.5mg的精制IgG(图10)，且结合活性也得以保持。
本发明对于利用动物细胞的物质生产是有用的。具体地说，通过与本发明的融合伴侣的细胞融合，可以将生产有用物质的细胞制成在体外容易培养的杂交瘤。作为产生有用物质的细胞，可以列举出抗体产生细胞。
即，本发明作为抗体的制造方法是有用的。特别是本发明可以以人抗体产生细胞作为材料来制造杂交瘤。通过本发明获得的杂交瘤稳定地产生人抗体。例如，在从感染性疾病恢复的患者的血液中，产生将病原体或病原体所产生的毒素进行中和的抗体的细胞的存在的可能性较高。如果通过本发明将这种患者的抗体产生细胞制成杂交瘤，则可以产生对感染性疾病的治疗有用的抗体。
作为可通过本发明获得治疗用抗体的感染性疾病，例如可以列举出流感、AIDS、HCV或HBV等病毒性肝炎等。
或者，在癌症患者的抗体产生细胞中，有可能存在产生对癌细胞具有抑制作用的抗体的细胞。如果通过本发明将这种抗体产生细胞制成杂交瘤，则可以获得对癌症治疗有效的抗体。
根据本发明的抗体制造方法，可以利用人的抗体产生细胞来获得人的抗体。人抗体由于可以安全地投予给人，因此作为治疗用的抗体是优选的。为了将从一般用作单克隆抗体的制造工具的小鼠获得的抗体用于人的治疗而必须要进行嵌合化或人源化等修饰，而与此相比可知，本发明的抗体制造方法作为治疗用抗体的制造方法是有用的。

Claims (20)

1.一种融合伴侣细胞，其能够通过将下述的细胞(a)和(b)进行融合而获得：
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞；和，
(b)来源于第2动物种且在细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞。
2.权利要求1所述的融合伴侣细胞，其中，第1动物种为小鼠，骨髓瘤细胞选自以下所示的小鼠骨髓瘤细胞和从这些细胞株诱导的细胞株：
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY和SP2/0-Ag14。
3.权利要求1所述的融合伴侣细胞，其中，第2动物种为人，白血病细胞选自以下所示的白血病细胞和从这些细胞株诱导的细胞株：
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAMI。
4.权利要求1所述的融合伴侣细胞，其中，第1细胞为SP2/0-Ag14，第2细胞为MEG-01。
5.以保藏编号FERM BP-10761保藏的融合伴侣细胞SPYMEG。
6.一种杂交瘤，其能够通过将下述的细胞(1)和(2)进行融合而获得：
(1)能够通过将下述的细胞(a)和(b)进行融合而获得的融合伴侣细胞：
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞；和，
(b)来源于第2动物种且在细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞；以及，
(2)第3细胞。
7.权利要求6所述的杂交瘤，其中，第1动物种为小鼠，骨髓瘤细胞选自以下所示的小鼠骨髓瘤细胞和从这些细胞株诱导的细胞株：
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY和SP2/0-Ag14。
8.权利要求6所述的杂交瘤，其中，第2动物种为人，白血病细胞选自以下所示的白血病细胞和从这些细胞株诱导的细胞株：
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2和DAM1。
9.权利要求6所述的杂交瘤，其中，第1细胞为SP2/0-Ag14，第2细胞为MEG-01。
10.权利要求6所述的杂交瘤，其中，融合伴侣细胞是以保藏编号FERM BP-10761保藏的SPYMEG。
11.权利要求6所述的杂交瘤，其中，第3细胞为来源于与第2细胞相同动物种的细胞。
12.权利要求11所述的杂交瘤，其中，第3细胞为抗体产生细胞。
13.一种制造融合伴侣细胞的方法，其包括下述工序：
(1)将下述的细胞(a)和(b)进行融合的工序：
(a)来源于第1动物种的骨髓瘤细胞、和
(b)来源于第2动物种且在细胞周期中含有Extra-S期的白血病细胞；以及，
(2)培养在工序(1)中融合的细胞，并从培养物中回收融合伴侣细胞的工序。
14.一种制造杂交瘤的方法，其包括下述工序：
(1)使通过权利要求13所述的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合的工序；和，
(2)培养在工序(1)中融合的细胞，并从培养物中回收杂交瘤的工序。
15.一种制造抗体产生细胞的方法，其包括下述工序：
(1)使通过权利要求13所述的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合而获得杂交瘤的工序；和，
(2)将工序(1)中获得的杂交瘤作为抗体产生细胞回收的工序。
16.权利要求15所述的方法，其还附加性地包括将工序(1)中获得的杂交瘤进行克隆的工序。
17.一种制造抗体的方法，其包括下述工序：
(1)使通过权利要求13所述的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合而获得杂交瘤的工序；和，
(2)培养在工序(1)中获得的杂交瘤，并从培养物中回收抗体的工序。
18.权利要求17所述的方法，其还附加性地包括将工序(1)中获得的杂交瘤进行克隆的工序。
19.一种制造针对感染性疾病的抗体的方法，其包括下述工序：
(1)使通过权利要求13所述的方法获得的融合伴侣细胞与抗体产生细胞进行融合而获得杂交瘤的工序，所述抗体产生细胞来源于有感染性疾病的病原体抗原的暴露经历的对象；和，
(2)培养在工序(1)中获得的杂交瘤，并从培养物中回收针对感染性疾病的抗体的工序。
20.权利要求19所述的方法，其中，感染性疾病为流感、AIDS或病毒性肝炎中的任一种。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108251413A (zh) * 2018-02-05 2018-07-06 翁炳焕 一种用于制备细胞因子的杂交瘤t细胞株的构建
CN108998426A (zh) * 2018-06-15 2018-12-14 翁炳焕 一种粒系白血病融合基因检测质控参考株的制备

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY170725A (en) * 2011-09-09 2019-08-27 Univ Osaka Dengue-virus serotype neutralizing antibodies
CN104837866B (zh) * 2012-08-31 2018-09-28 国立大学法人大阪大学 人单克隆抗体结合/中和b型肉毒杆菌神经毒素
EP3070167A4 (en) 2013-11-06 2017-06-07 Osaka University Antibody having broad neutralizing activity in group 1 influenza a virus

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH652145A5 (de) * 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4574116A (en) * 1983-01-13 1986-03-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Methods and cell lines for immortalization and monoclonal antibody production by antigen-stimulated B-lymphocytes
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US4977081A (en) * 1987-05-04 1990-12-11 Adi Diagnostics, Inc. Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof
JPH01171494A (ja) 1987-12-26 1989-07-06 Tosoh Corp 培養細胞によるヒト免疫グロブリン産生能の増強法
JPH02200177A (ja) 1989-01-31 1990-08-08 Nippon Kayaku Co Ltd 動物細胞培養用組成物、培養方法および生理活性物質の製造法
JP2683946B2 (ja) 1990-05-11 1997-12-03 財団法人化学及血清療法研究所 細胞培養によるタンパク質産生方法
US6007814A (en) * 1992-06-15 1999-12-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapeutic uses of the hypervariable region of monoclonal antibody M195 and constructs thereof
JPH0870858A (ja) 1993-12-24 1996-03-19 Eiken Chem Co Ltd 動物細胞培養用培地
AU744637B2 (en) * 1996-10-09 2002-02-28 Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland, The Dendritic cell-specific antibodies
US7531643B2 (en) * 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
US6071737A (en) * 1998-03-16 2000-06-06 The Regents Of The University Of California Equine Neospora isolate and its uses
US6197582B1 (en) * 1998-03-18 2001-03-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
JP3888971B2 (ja) * 2000-08-08 2007-03-07 イムノメディクス， インコーポレイテッド 慢性骨髄性白血病の免疫療法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108251413A (zh) * 2018-02-05 2018-07-06 翁炳焕 一种用于制备细胞因子的杂交瘤t细胞株的构建
CN108998426A (zh) * 2018-06-15 2018-12-14 翁炳焕 一种粒系白血病融合基因检测质控参考株的制备

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