DK162720B - Monoklonalt antistof imod hepatitis b-overfladeantigen, fremgangsmaade til fremstilling af det monoklonale antistof, hybridoma og reagens indeholdende dette hybridoma til brug ved fremstillingen og anvendelse af antistoffet til paavisning af hepatitis b-antigen - Google Patents

Description

i

DK 162720 B

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof imod hepatitis B-overfladeantigen (HBs-Ag), hvilket antistof sekreteres af en hidtil ukendt hybridomacellelinie, en fremgangsmåde til fremstilling af dette antistof, et 5 hybridoma og et reagens indeholdende dette hybridoma til brug ved fremstillingen og anvendelsen af dette monoklonale antistof i prøvesystemer for hepatitis B-virusinfektioner.

Udviklingen af nye cellelinier, der kan subdyrkes kontinuerligt, har inden for de seneste år været et vigtigt 10 forskningsområde. Et særligt anvendelsesområde for sådanne cellelinier ligger i fremstillingen af antistoffer, og indførelsen af somatisk cellehybridisering (dvs. cellefusion) har tilvejbragt et forskningsværktøj, der muliggør fremstilling af rene monoklonale antistoffer. Ved fusion af celler, 15 der har antistof sekretion, med myelomaceller og kloning af de derved fremkomne hybrider med antistofsekretion i vævskultur har det vist sig muligt at fremstille og udvælge en stabil, monoklonal hybridcellelinie, der er i stand til at afsondre et særligt antistof. Det er således muligt at sikre 20 produktion af rene, monospecifikke antistoffer, eftersom de i den monoklonale cellelinie opstår ud fra én oprindelig, antistofsekreterende celle.

Denne evne til at fremstille rene, monospecifikke antistoffer er indlysende til stor nytte for nøjagtig scree-25 ning, rensning af antigenet og til terapeutiske/præventive anvendelsesformål, og den foreliggende opfindelse angår anvendelse af denne teknik i forbindelse med hepatitis B-virusinfektioner.

Diagnosen af akut og kronisk hepatitis B-infektion 30 afhænger af påvisningen af HBs-antigen i patientens blod.

Dette sker i reglen ved en radioimmunoafprøvning ved anvendelse af kanin- eller heste-anti-HBs-serum absorberet på polystyrenperler. HBs-antigenet i patientens serum bindes til antistoffet i fast fase og kan derefter påvises ved en 35 yderligere tilførsel af radiomærket anti-HBs. En anden teknik til påvisning af HBs-Ag i leveren benytter dobbeltlags-im-

DK 162720 B

2 munofluorescens. Disse to metoder medfører imidlertid en indledningsvis procedure, hvor antiserummet produceres i kaniner, og antistofferne renses ved kostbar og tidkrævende affinitetschromatografi.

5 Anvendelsen af radioimmunoprøveteknik til påvisning af HBs-antigen er velkendt i forbindelse med blodtransfusioner, men har ikke i stor udstrækning været anvendt til screening af hospitalspatienter i almindelighed. Bortset fra det indlysende behov herfor til reducering af infek-10 tionsrisikoen inden for hospitalet kan identificeringen af især obstetriske patienter, der er bærere af hepatitisvirus, være af stor betydning, eftersom identificering af en mor, der er en sådan bærer, kan muliggøre indgivelse af hyper-immunglobulin til barnet kort efter fødslen og derved i 15 betydelig grad reducere risikoen for, at det udvikler hepatitis, og at det bliver kronisk bærer.

Enhver udvidelse af screeningen for hepatitis B-virus-infektion og af den eventuelle behandling af denne sygdom vil kræve store kvantiteter let tilgængeligt anti-HBs-serum 20 af høj kvalitet. Man har nu fundet frem til en hidtil ukendt, monoklonal hybridcellelinie, som betegnes RF-HBs-1. Den har vist sig at være stabil ved dyrkning, og den sekreterer et monoklonalt antistof imod hepatitis B-overfladeantigen. Desuden kan denne cellelinie opbevares i og udvindes fra 25 flydende nitrogen og udgør således en let tilgængelig forsyning af rent, monospecifikt antistof imod hepatitis B--overfladeantigen.

Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse hermed et monoklonalt antistof imod hepatitis B-overflade-30 antigen, hvilket antistof er ejendommeligt ved, at det er sekreteret fra hybridomacellelinie RF-HBs-1. Det er ønskeligt, at det monoklonale antistof er praktisk taget frit for andet immunologisk materiale.

Det monoklonale (og derfor monospecifikke) antistof 35 ifølge opfindelsen kan udvindes fra en ovenstående kulturvæske eller fra museascitesvæske eller -serum som anført

DK 162720 B

3 nedenfor. Det udviser aktivitet imod HBs-Ag og udfældes af kaninantiserum frembragt imod den tunge muse-IgG^-kæde og imod den lette muse-K-kæde, men ikke af kaninantiserum imod mus-IgG2ar -IgG2b# -IgM eller -IgA eller imod de lette muse-5 -λ-kæder. Det monoklonale antistof er således et -museimmunoglobulin, der reagerer med hovedundertyper i HBs-Ag (ad og ay) og kan fremstilles ved at dyrke cellelinien RF-HBs-1.

I det følgende er der desuden beskrevet yderligere 10 to hybridomacellelinier (betegnet I og II), som kan producere yderligere to monoklonale antistoffer imod HBs-Ag. Disse yderligere antistoffer kan ved anvendelse sammen med RF--HBs-l-antistof forøge dettes virkning, især ved afprøvninger.

15 Cellelinierne RF-HBs-1, I og II er hybridomacelle linier, der er fremstillet ved fusionering af miltceller fra Balb/c-mus, der i forvejen er immuniseret med koncentreret hepatitis B-overfladeantigen (HBs-Ag), med den HAT-sen-sitive musemyelomacellelinie (P3-NSl/l-Ag4-l) ved metoden 20 ifølge Kohier og Milstein (Eur. J. Immunol. 6, 292 (1976)).

Ved hjælp af kloningsprocesser under anvendelse af tre af disse fusionerede cellelinier har man isoleret de monoklonale hybridomacellelinier, der er betegnet RF-HBs-1, I og II.

Cellelinierne RF-HBs-1, I og II fremkommer hver især 25 som en forholdsvis ensartet cellepopulation, der morfologisk ligner ophavs-NS1-myelomaet, både hvad angår størrelse og form, idet de har en gennemsnitlig størrelse på 13 μια. De ser alle sfæriske ud i kultur og har en centralt anbragt kerne med et stort cytoplasmaareal, der er lig med eller 30 større end kernevoluminet. RF-HBs-1 afviger fra ophavslinien derved, at den selv om den lige som ophavslinien vokser delvis fæstnet til et fast substrat, f .eks. glas eller plast, kan løsnes fra denne overflade ved kraftig omrøring og ikke kræver trypsinisering eller behandling med EGTA. Den vokser 35 også som suspensionskultur i dyrkningsbeholdere med omrører.

I vokser delvis fæstnet til et substrat og kræver trypsinise-

DK 162720 B

4 ring til subkultur, medens II vokser som en statisk suspensionskultur, hvor overførsel sker ved fortynding af kulturen, f.eks. 1:10. Cellerne har fordoblingstider på hhv. 14,6 timer, 10,7 timer og 9,2 timer og kan vokse i RPMT-FCS-medium 5 (se nedenfor), og de kræver hver fodring med 2-3 dages mellemrum og subdyrkning med 2-3 dages mellemrum for RF-HBs--l's vedkommende, 3-4 dages mellemrum for I's vedkommende og 2-3 dages mellemrum for II's vedkommende.

Hybridomacellelinieme RF-HBs-1, I og II sekreterer 10 hver især et antistof, og cellelinierne har hver især fortsat med at sekretere antistof i mindst tre måneder ved kontinuerlig dyrkning.

Følgelig angår den foreliggende opfindelse også hybri-domacellelinien, der er betegnet RF-HBs-1, der sekreterer 15 monoklonalt antistof imod hepatitis B-overfladeantigen, idet cellelinien fortrinsvis foreligger i praktisk taget ren form fri for andet cellemateriale, og præparater indeholdende cellelinien sammen med et næringsmedium, der er i stand til at opretholde cellelinien. Et passende medium 20 indeholder en carbonkilde, en nitrogenkilde og om nødvendigt vitaminer og/eller uorganiske salte, og et eksempel på et sådant medium er RPMI-1640 suppleret med kalvefosterserum, f.eks. RPMI-FCS (se nedenfor).

Ved fremstillingen af hybridomacellelinien RF-HBs-1 25 immuniseres Balb/c-mus ved intraperitoneal injektion af 0,2 ml renset HBs-antigen fortyndet 1:1 med fuldstændig Freund's adjuvans (CFA) til en endelig antigenkoncentration på 0,7 mg/ml. HBs-antigenet (undertype adw), der anvendes, er renset for HBs-antigen-positivt serum ved hjælp af caesiumchlorid-30 -massefyldegradient-centrifugering. Fire uger efter får musene en booster-injektion på 0,2 ml af HBs-antigen/CFA--blandingen. Seks uger efter får musen, der giver den højeste serumtiter af antistof imod HBs-antigen, bestemt ved fast-faseradioimmunoafprøvning, en yderligere boosterinjektion 35 intraperitonealt med HBs-antigen i CFA og aflives 5 dage efter den sidste boosterinjektion, og milten fjernes.

DK 162720 B

5

Milten iturives i RPMI-164O-medium suppleret med 10% volumen/volumen kalvefosterserum, 2 mM glutamin og 100 internationale enheder af såvel penicillin som streptomycin (RPMI--FCS) ved 37°C, pH 7,2 og natriumbicarbonatkoncentration på 5 2 g/liter, og den fremkomne suspension føres flere gange forsigtigt ind og ud af én steril 10 ml sprøjte. Den enkelte cellesuspension dekanteres fra de få tiloversblevne klumper af ikke-opdelt milt, og cellerne vaskes to gange i serumfrit RPMI-1640 og centrifugeres ved 1500 G i 5 minutter. Den 10 vaskede cellepellet resuspenderes i RPMI-1640.

En halvt sammenflydende kultur af musemyelomaceller P3-NSl/l-Ag4-l (dvs. en cellekultur i et aktivt vækststadium, der har været holdt i kontinuerlig dyrkning ved 37“C i RPMI--1640-medium suppleret med 10% (volumen/volumen) kalvefoster-15 serum, 2 mM glutamin, 100 IE penicillin og 100 μg streptomycin og 2 x 10”5 mol 8-thioguanin puf ret med bicarbonat/C02) frigøres fra dyrkningsbeholderen ved mild trypsinisering og vaskes to gange med serumfrit RPMI-1640 ved centrifugering ved 400 G. De vaskede celler resuspenderes i RPMI-1640 og 20 tælles.

For at fremkalde hybridisering blandes hele miltcellepopulationen med myelomacellerne i et rundbundet, sterilt 10 ml centrifugeglas i forholdet 10:1 miltceller til myeloma-celler og kombineres til en pellet ved centrifugering ved 25 1500 G. Efter fjernelse af den ovenstående væske sættes 1 ml af en 40%'s (vægt/vægt) opløsning af polyethylenglycol (PEG). 1500 i RPMI-1640, der er blevet forvarmet til 37*C, til cellepelleten og blandes forsigtigt med cellerne. Celle--PEG-blandingen inkuberes ved 37*C i nøjagtig 7 minutter, 30 og derefter fortyndes PEG-opløsningen gradvis fra cellerne ved gentagen tilsætning af lige store voluminer (RPMI-1640, • indtil PEG-koncentrationen er under 0,5% (vægt/vægt). Suspensionen centrifugeres ved 1500 G, og cellepelleten resuspenderes forsigtigt og vaskes to gange i serumfrit RPMI-35 -1640, idet der centrifugeres ved 1000 G. Den vaskede cel lepellet resuspenderes forsigtigt i 1 ml RPMI-FCS og in-

DK 162720 B

6 kuberes i to timer ved 37*C, og cellerne fordeles derefter med 1 x 106 celler/ml i RPMI-FCS på 24 x 2 ml multihul-vævskulturplader og dyrkes ved 37*C i en atmosfære af 5% C02 og 95% luft.

5 24 timer efter fusion erstattes halvdelen af dyrk ningsmediet i hver kolbe med HAT-medium (RPMI-FCS suppleret med 1 x 10“4 M hypoxanthin, 4 x 10~7 M aminopterin og 1,6 x 10”5 M thymidin). Kulturerne suppleres med frisk HAT--medium på følgende måde: Hver dag i de første 3 dage og 10 med 2-3 dages mellemrum derefter for at sikre udvælgelse af hybridceller, der kan gro i HAT-medium.

HAT-mediet erstattes af HT-medium (RPMI-FCS + hypo-xanthin og thymidin) trinvis, idet man begynder dag 40 efter fusion og derefter tilpasset til vækst i RPMI-FCS på dag 52 15 efter fusion.

Ovenstående væske fra hybridkulturerne afprøves for antistof imod HBs-antigen, så snart hullerne viser vækst på mere end 100 celler. Kun ét dyrkningshul indeholdt antistofproducerende celler, selv om andre huller faktisk inde-20 holdt levedygtige hybridceller.

De antistofproducerende hybridceller fra dette ene hul klones derefter, til at begynde med ved hjælp af begrænsende fortynding af de originale kulturer på et fødelag af miltceller fra en ikke-immuniseret Balb/c-mus, idet hybrider-25 ne dyrkes i klynge i 96 x 0,2 ml skåle i RPMI-FCS. Der fremkommer vækst i 16 huller, for hvilke det var bekræftet, at de kun indeholder én hybridcelle ved begyndelsen af kloningsprogrammet, og herfra udvælges cellelinien RF-HBs som givende en stabil hybridcellelinie, som sekreterer monoklonale anti-30 stoffer imod HBs-antigen. Denne celleklon genklones derefter to gange, hvorved fås 100% antistofproducerende kloner.

Til fremstillingen af den repræsentative hybridoma-cellelinie I immuniseres 6-uger gamle Balb/c hanmus med affinitetsrenset HBs-Ag (undertype ay) ved hjælp af intra-35 peritoneale injektioner med 20 /xg HBs-Ag i fuldstændig Freund's adjuvans (CFA : 0,2 ml pr. mus). 2 uger senere får

DK 162720 B

7 musene en boosterinj eJction intraperitonealt med 5 /xg HBs-Ag i CFA, og den mus, der giver den højeste titer af serum-anti-HBs-Ag, får efter yderligere 2 ugers forløb en boosterin jektion intraperitonealt med 5 μg HBs-Ag i saltvand. 3 5 dage efter den sidste boosterinjektion aflives musene, og milten udtages. På dette tidspunkt har musen en anti-HBs--Ag-titer i serum på 1:1000. Alle anti-HBs-Ag-målinger bestemmes ved "AUSAB” radioimmunoafprøvning (Abbott Laboratories) , og antistoftitre er i den foreliggende beskrivelse 10 anført som den fortynding, der giver 50% af maksimal binding.

Miltcellerne fra den immuniserede mus adskilles i RPMI-FCS ved 37'C, pH 7,2 og natriumbicarbonatkoncentration på 2,0 g/liter. Den samlede miltcellepopulation vaskes to gange med serumfrit medium (RPMI-1640) og blandes med P3-15 -NSl/l-Ag4-l musemyelomaceller i forholdet 10:1 (miltcelle:-myelomacelle), omdannes til pellet og resuspenderes i 1 ml 40%'s (vægt/vægt) polyethylenglycol (PEG) 1500 i RPMI-1640.

Efter 7 minutters inkubering fortyndes PEG forsigtigt fra cellerne ved hjælp af gradvis tilsætning af RPMI-1640. Cel-20 lesuspensionen vaskes en gang i RPMI-1640, centrifugeres ved 1500 G og inkuberes derefter i 2 timer i 3 ml RPMI-FCS, hvorefter cellerne anbringes i 2 ml dyrkningshuller med 2 x 106 celler/hul. Alle arbejdsoperationer udføres ved 37°c.

Cellerne dyrkes natten over ved 37*C i RPMI-FCS i en 25 atmosfære af 5% C02 og 95% luft, og derefter erstattes halvdelen af mediet i hvert dyrkningshul med HAT-medium. Kulturerne næres med frisk HAT-medium på denne måde med en dags mellemrum i de første 3 dage og derefter med 2-3 dages mellemrum til udvægelse af hybridcellerne fra de HAT-sensi-30 tive myelomaceller. Ca. 3 uger efter fusion indføres hybridcellerne igen i RPMI-FCS-medium.

Af de oprindelige 168 huller frembringer 148 vækst af hybridceller, hvoraf 4 viser produktion af anti-HBs-Ag--aktivitet. Af disse 4 har en hybridkultur, der er fremkommet 35 20 dage efter fusion, fortsat med at producere antistof imod HBs-Ag. Denne cellelinie er blevet klonet 3 gange, og

DK 162720 B

8 en af de fremkomne antistof-producerende kloner er den cellelinie, der betegnes I.

Til fremstillingen af den repræsentative hybridoma-cellelinie II immuniseres 6-uger gamle Balb/c hanmus med 5 affinitetsrenset HBs-Ag (undertype ad) ved hjælp af intra-peritoneale injektioner med 20 μg HBs-Ag i fuldstændig Freund's adjuvans (CFA; 0,2 ml pr. mus). 3 uger efter får musene en intraperitoneal boosterinjektion 5 μg HBs-Ag i CFA, og den mus, der giver den højeste 'titer af serum-anti-10 -HBs-Ag, får efter yderligere 10 dage en intraperitoneal boosterinjektion på 5 μg HBs-Ag i saltvand. 5 dage efter den sidste boosterinjektion aflives musen, og milten udtages.

På dette tidspunkt har musen en serum-anti-HBs-Ag-titer på 1:7000.

15 Derefter er arbejdsgangen identisk med den, der an vendes til fremstilling af hybridomacellelinien I fra dis-sociering af miltcellerne fra den immuniserede mus indtil fordelingen ved 37°C af de hybridiserede celler i 2 ml dyrkningshuller med 2 x 106 celler/hul. Dyrknings- og udvæl-20 gelsesbetingelser er også identiske med ovenstående arbejdsgang, og af de oprindelige 144 huller frembringer 129 vækst af hybridceller, hvoraf 5 viser produktion af anti-HBs-Ag--aktivitet. Af disse 5 har en hybridkultur, der fremkom 15 dage efter fusion, fortsat med at producere antistof mod 25 HBs-Ag. Denne cellelinie er blevet klonet tre gange, og en af de fremkomne antistofproducerende kloner er den cellelinie, der er betegnet II.

Et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse beror på en fremgangsmåde til propagering af hybridomacel-30 lelinie RF-HBs-1. Denne cellelinie kan, ligesom cellelinierne I og II, propageres, ved at cellelinien dyrkes i et næringsmedium derfor. Denne propageringsmetode udgør ligeledes et middel til fremstilling af antistoffet ifølge opfindelsen, der kan adskilles fra dyrkningsmediet. Et passende nærings-35 dyrkningsmedium til cellerne ifølge den foreliggende opfindelse indeholder en carbonkilde, en nitrogenkilde og, om

DK 162720 B

9 nødvendigt, vitaminer og/eller uorganiske salte og er f.eks. RPMI-1640 suppleret med kalvefosterserum, f.eks. i en mængde på ca. 10 vægtprocent baseret på dyrkningsmediet. Det ovenfor beskrevne RPMI-FCS er særlig egnet. Når cellerne dyrkes, er 5 en egnet begyndelseskoncentration 1 x 105 celler/ml for RF--HBs-1, 1 x 105 celler/ml for I og 2 x 105 celler/ml for II. Disse koncentrationer skal helst ikke overstige hhv.

1 x 106 celler/ml, 2 x 106 celler/ml og 3 x 106 celler/ml.

Foruden at dyrke cellelinierne i et næringsmedium er 10 det også muligt at implantere hver af cellelinierne i en mus til etablering af en ascitestumor. Dette sker i reglen ved intraperitoneal injektion af f.eks. 4 x io5 - 1 x 106 celler pr. mus i med pristan (2,6,10,14-tetramethyl-penta-decan) primede Balb/c mus. Etablering af en ascitestumor 15 kan også ske i mus, der ikke er pristanprimede, og i så fald skal der til propagering af RF-HBs-l-celler injiceres I x 106 - 2 x 106 celler pr. mus, medens det minimale antal celler pr. mus, når det drejer sig om I og II, er 4-5 x 105. Cellelinierne kan også dyrkes som en fast tumor ved 20 subcutan injektion.

De monoklonale antistoffer, der sekreteres af hybrido-maet, kan derefter udvindes fra ascitesvæsken eller fra museserummet, og denne fremgangsmåde, der omfatter både propagering af cellelinien RF-HBs-1 og fremstilling af anti-25 stoffer derudfra, udgør endnu et aspekt af den foreliggende opfindelse. Denne metode til opnåelse af monoklonale antistoffer frembyder den fordel, at udbyttet af antistoffer f.eks. kan være helt op til 10 gange større end det udbytte, der kan opnås ved massedyrkning af cellerne. Cellernes op-30 vækst i musen tager normalt ca. 2-3 uger.

Antistoffet ifølge opfindelsen og antistofferne I og II kan anvendes urensede fra sådanne kilder, der er beskrevet ovenfor, eller de underkastes fortrinsvis rensning før anvendelse. Således renses antistoffer, der skal kobles til 35 "Sepharose®" til brug ved affinitetschromatografi, i reglen ved ammoniumsulphatfældning, medens antistoffer, der skal

DK 162720B

10 ioderes eller biotinkonjugeres, i reglen underkastes protein A-rensning.

Hybridomacelleme ifølge opfindelsen og hybridoma-cellerne I og II kan opbevares i med FCS suppleret RPMI-5 -164O-medium indeholdende f.eks. 20% FCS ved frysning i flydende nitrogen med f.eks. 5 x 106 celler/ml eller mere under anvendelse af 10% dimethylsulphoxid som kryobeskyt-telsesmiddel. Indfrysningshastigheden reguleres fortrinsvis til 1-2"/minut mellem +40"C og -100"C, og de frosne celler 10 kan opbevares under -100"C/ f.eks. ved -170°C i et kuldeskab med flydende nitrogen.

Det monospecifikke antistof, der produceres af cellelinien RF-HBs—1, har særlig værdi til tilvejebringelse af nøjagtige screeningsprøver for patienter inficeret med hepa-15 titis B-virus, enten alene eller i forbindelse med andre antistoffer, som erkender HBs-Ag, især antistoffer fra cellelinierne I og II. Antistofferne kan anvendes i prøvesystemer, der benytter f.eks. immunofluorescensmikroskopi eller immunoelektronmikroskopi, til påvisning af tilstedeværelse 20 af HBs-Ag i cellemateriale eller i serum. Kvantitative prøver kan udføres ved radiometrisk fastfaseafprøvning, og RF-HBs--l-antistof er anvendeligt i så henseende, eftersom det erkender en antigen epitop, der forekommer med forholdsvis stor hyppighed på HBs-Ag-molekylet. Imidlertid benytter 25 særlig anvendelige radiometriske fastfaseprøvesystemer ifølge den foreliggende opfindelse kombinationer af RF-HBs-1 og andre, monoklonale antistoffer.

Andre antistoffer, der erkender HBs-Ag, og som har stor affinitet over for epitoper, der forekommer med lav 30 hyppighed på HBs-Ag, kan anvendes sammen som en fast fase i en radiometrisk prøve til påvisning af HBs-Ag, enten alene eller med RF-HBs-l-antistof som belyst i de følgende eksempler. Anvendelsen af en fast fase, der indbefatter antistofferne I og II alene, er anvendelig ved en ettrinsradio-35 prøve for HBs-Ag (eksempel 7 nedenfor belyser, hvorledes disse to antistoffer indbyrdes erkender alle HBs-Ag-moleky-

DK 162720 B

11 ler) , hvorimod tilsætning af RF-HBs-l-antistof til fastfasen fungerer som yderligere beskyttelsesforanstaltning, når det anvendes i en totrinsprøve, eftersom RF-HBs-l-antistof, selv om det har lavere affinitet for HBs-Ag end de to andre 5 monoklonale antistoffer, selv erkender alle HBs-Ag-molekyler, således at binding af antigenet til fastfasen sikres. I radiometriske fastfaseprøvesystemer, der anvender disse monoklonale antistoffer, anvendes RF-HBs-l-antistoffet fortrinsvis som det radiomærkede sporstof, ikke blot fordi 10 dette antistof erkender alle HBs-Ag-molekyler, men også fordi det, da det erkender en epitop af HBs-Ag, der forekommer med stor hyppighed på molekylet, giver et højere antal tællinger ved prøven, end de to andre antistoffer gør, enten hver for sig eller kombineret. Støtte for anven-15 delse af alle tre monoklonale antistoffer ved en radiometrisk afprøvning fås ved undersøgelse af konkurrerende binding (se eksempel 4 nedenfor), der belyser, at hverken I- eller Il-antistoffer hæmmer bindingen af RF-HBs-l-antistof til HBs-Ag.

20 En foretrukket diagnostisk fremgangsmåde ifølge op findelsen omfatter derfor inkubering af en serumprøve taget fra et menneske eller dyr enten ved en totrinsprøve med RF--HBs-l-antistoffet og antistofferne I og II i fast fase, vask af den faste fase og inkubering heraf med radiomærket 25 RF-HBs-l-antistof som sporstof eller ved en ettrinsprøve med I- og Il-antistoffer i fast fase og radiomærket RF-HBs--1-antistof som sporstof. I hvert af disse prøvesystemer omfatter den faste fase fortrinsvis et plast- eller glassubstrat, hvorpå antistofferne udstryges. Substratet fore-30 ligger fortrinsvis i form af perler, stave eller rør, f.eks. af polystyren. Den foreliggende opfindelse angår også disse overtrukne substrater, f.eks. perler, og et diagnoseprøvesæt, der omfatter en første beholder, der indeholder et plasteller glassubstrat, såsom perler, stave eller rør, overtruk-35 ket med RF-HBs-1-, I- og Il-antistoffer eller med I- og II--antistoffer alene, og en anden beholder, der indeholder

DK 162720 B

12 RF-HBs-l-antistof, hvortil der er knyttet et radiomærkestof.

I disse prøvesystemer er det, i stedet for at anvende RF--HBs-l-antistof sammen med de to monoklonale antistoffer I og II, muligt at anvende RF-HBs-l-antistof sammen med et 5 eller flere andre, monoklonale antistoffer, der erkender HBs-Ag, men som er forskellige fra I og II.

Alternative prøvemetoder ifølge opfindelsen kan i stedet for at anvende et radiomærkestof anvende f.eks. et enzymmærkestof, der i reglen vil være knyttet til RF-HBs-Ι-ΙΟ -antistoffet. Det er endvidere også muligt at anvende antistoffet RF-HBs-1 ifølge opfindelsen ved en hæmagglutinerings-prøve for HBs-Ag.

Det monoklonale antistof RF-HBs-1 ifølge opfindelsen kan, koblet til en fast fase, såsom cyanogenbromidaktiveret 15 ,,Sepharose®4B" (,,CnBr-S4BM, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige), anvendes til at fjerne HBs-Ag fra f.eks. menneske- eller dyremateriale, enten med henblik på at fremstille HBs-Ag i renset form til anvendelse ved fremstilling af vacciner eller til fjernelse af HBs-Ag fra materiale, 20 der skal gives til patienter.

Det monoklonale antistof fra RF-HBs-1 er også nyttigt til kliniske anvendelser som et anti-virusmiddel, når der skal indgives antistof direkte til patienter. Det monoklonale antistof kan spille en rolle ved behandlingen af patienter, 25 der er bærere af hepatitis B-virus og kan neutralisere virussets smittefarlighed ved at hæmme dets kombinering med receptorstedet på celler og ligeledes forøge phagocytosen og den intracellulære fordøjelse af vira. Potentielt kan anvendelsen af det monoklonale antistof i denne sammenhæng som en er-30 statning for hyperimmunt gamma-globulin overflødiggøre, at der gives store mængder ikke-specifikt immunoglobulin smammen med de små mængder af det specifikke antistof, som det er tilfældet med almindeligt serum. Antistoffet, kan også tjene til at nedbryde tolerancen i HBV-bærere ved binding til 35 HBs-Ag og gøre det mere immunogent.

Den monoklonale cellelinie RF-HBs-1 er deponeret hos

DK 162720 B

13

Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) i Institut Pasteur, Paris, den 26. marts 1980 og har fået numret 1-117.

5 Eksempel 1

In vitro-dvrknina af cellelinie RF-HBs-1 RF-HBs-l-celler podes i en mængde på 1 x 105 celler/ml i RPMI-164O-medium suppleret med 5-20% (volumen/volumen) kalvefosterserum. Cellernes væksthastighed er i det væsent-10 lige den samme i alle medier (fordoblingstid på 14,6 timer ± 2,5), men væksten vedligeholdes i et længere tidsrum i 15 og 20% kalvefosterserum.

En podetæthed på 1 x 105 celler/ml anbefales til optimal vækst, selv om der kan anvendes lavere podetætheder, 15 men disse resulterer i en længere latent vækstfase. Sub-dyrkning skal ske hver 2-3 dage.

Sksempel_2

In vivo-dvrkning af cellelinier 20 2A; RF-HBs-1 20 6 uger gamle Balb/c-mus med en intraperitoneal injektion af 0,5 ml pristan (2,6,10,14-tetramethylpentadecan) på dag 1 og dag 7. På dag 14 implanteres i hver mus intra-peritonealt 1 x 106 levedygtige hybridoma-RF-HBs-l-celler.

25 10 dage efter implanteringen viser alle musene tegn på massiv tumorvækst og aflives, og ascitesvæsken opsamles via en nål størrelse 19. Ascitesvæsken centrifugeres ved 2000 G, og de klare, ovenstående væsker, der indeholder RF-HBs-l-antistof, opsamles og opbevares ved -20°C.

30 2B: Cellelinie I

Balb/c-mus primes med 2 intraperitoneale injektioner af 0,5 ml pristan, der gives med 2 mellemrum på 1 uge før implantering af celler af type I. Hver mus implanteres derefter med 4 x 105 levedygtige celler af type I og frembringer 35 ascitestumorer. Efter 20-25 dage, når musene har produceret et maksimumsudbytte af ascitesvæske, aflives de, og det

DK 162720 B

14 konstateres, at deres ascitesvæske indeholder ca. 20 mg/ml protein, hvoraf 150 Mg/ml er rent antistof I.

2C: Cellelinie II

Balb/c-mus primes med 2 intraperitoneale injektioner 5 af 0,5 ml pristan, der gives med 2 mellemrum på 1 uge før implantering af celler af type II. Derefter implanteres hver mus med 5 x 10^ levedygtige celler af type II og frembringer ascitestumorer. Efter 15-20 dage har musene produceret maksimumsudbytte af ascitesvæske, der viser sig at inde-10 holde 180 Mg/ml antistof II.

Eksempel 3

Overtræknina af polvstvrenperler med de monoklonale antistoffer RF-HBs-1. I ocr II

15 Polystyrenperler overtrækkes med hvert enkelt, mono- klonalt antistof i form af ascitesvæske i forskellige fortyndinger i pH 9,6 bicarbonatpuffer (0,015 M Na2C03: 0,035 M NaHC03) ved inkubering i en time ved 20°C under omrøring efterfulgt af mindst 16 timers inkubering ved 4eC i samme 20 antistof/pufferblandinger. Derefter vaskes perlerne og inkuberes i 4 timer ved stuetemperatur med 200 μΐ 125I-HBs-Ag (Abbott Laboratories) til bestemmelse af de optimale overtrækningsbetingelser (se tabel I nedenfor).

25 TABEL I

cpm

Fortynding af - ascitesvæske RF-HBs-1 I II 1 2 3 4 5 6 1:10 12.500 2 1:25 - 4143 3 1:50 15.100 9420 7275 4 1:100 17.900 9134 7667 5 1:200 - 8399 8806 6 1:400 - 8521 6717 1:1000 6090

DK 162720 B

15 pH-værdien på 9,6, der anvendes til overtrækningspufferen i dette eksempel, har vist sig at være optimale. Endvidere vil antistofferne, når perler overtrækkes med kombinationer af monoklonale antistoffer, som omfatter anti-5 stoffet RF-HBs-1, i reglen blive tilsat sammen til perlerne, idet tilsætning efter hinanden af de monoklonale antistoffer til perlerne ikke giver nogen forbedring.

Når perlerne først er overtrukket med antistof, kan de efter 3 gange vask med destilleret vand tørres ved cen-10 trifugering over en absorberende pude. Disse perler forbliver stabile ved -20'C i mindst 3 måneder.

Eksempel 4

Erkendelse af HBs-Aq 15 Det monoklonale antistof, der produceres af celle linien RF-HBs-1, erkender en epitop, der er fælles for ad-og ay-subtyperne af HBs-Ag, og som er forskellig fra de epitoper af HBs-Ag, der erkendes af antistofferne I og II, som det belyses i følgende studium af konkurrerende binding.

20 Polystyrenperler overtrukket med HBs-Ag af blandet undertype ("AUSAB": Abbott Laboratories) inkuberes natten over ved stuetemperatur med 50 /xg/ml af hvert af de protein A-rensede antistoffer RF-HBs-1, I eller II eller med en ækvivalent titer af hesteantiserum mod HBs-Ag og derefter i 25 yderligere 4 timer ved stuetemperatur med 125I-RF-HBs~l-eller 125I-antistof I ioderet som beskrevet i eksempel 5 (100.000 cpm). Resultaterne er anført i tabel II nedenfor.

DK 162720 B

16

TABEL IX

Procentvis binding Blokerende antistof 125l-RF-HBs-l 125l-antistof I

5 - 50 μq/ml RF-HBs-1 52% 120% 50 pg/ml I 110% 26% 50 pg/ml II 111%

Hesteantiserum mod 10 HBs-Ag (ved ækv. titer) 70%

Kontrol (50% NBCS) 100% 100%

Resultaterne viser, at medens RF-HBs-1 og antistof I 15 inhiberer deres egen binding, sker der ingen bindingsibhibe-ring med de andre antistoffer. Hesteantiserum inhiberer på den anden side RF-HBs-l-antistofbinding.

Eksempel 5 20 Anvendelse af cellelinieantistoffer ved radiometrisk prove RF-HBs-l-antistof renses fra ascitesvæske fra mus implanteret med RF-HBs-l-cellelinie ved eluering ved pH 5,5 ud fra en protein A-"Sepharose®,,-kolonne (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) ifølge Prowse og Jenkin's me-25 tode, jfr. Immunochemistry 15, 429-436, 1978. 5 μq RF-HBs--1-antistof renset på denne måde ioderes med 0,5 mCi 125I ved anvendelse af 2,5 μq "Chloramin T" i et samlet reaktionsvolumen på 15 μΐ, idet der inkuberes i 30 sekunder ved 4"C, således at der fås et ækvimolært bindingsforhold mellem 30 125j 0g antistof. (Antistofferne I og II renses på samme måde og ioderes).

Polystyrenperler overtrukket med RF-HBs-l-antistof eller med antistof I eller II eller kombinationer af disse monoklonale antistoffer eller "Ausria®II"-perler inkuberes 35 med 200 μΐ af enten humant -ve-HBs-Ag-serum eller med 200 μΐ menneskeserum indeholdende 20 pg/ml HBs-Ag i 2 timer ved 45°C, vaskes og inkuberes i yderligere en time ved 45°C med

DK 162720 B

17 I-RF-HBs-l, l25i-antistof I eller 12^I-antistof II (ca.

100.000 cpm pr. prøve), vaskes og tælles. Resultaterne udtrykt enten som cpm (gennemsnit af mindst 2 prøver) eller som forholdet mellem tællinger opnået med +ve-HBs-Ag-prøven 5 og -ve-HBs-Ag-prøven (+/-).

TABEL III

Fast Sporstof 10 fase - RF-HBs-l Antistof I Antistof II "AUSRIA%I" CPM +/- CPM +/- CPM +/- CPM +/- 15 RF-HBs-l + 694 21 167 2,6 1723 27 33 65 64

Antistof I + 1473 70 21 20 -

Antistof II + 1487 45 33 RF-HBs-l+ + 2287 51 25 Antistof I 45 RF-HBs-l+ + 1370 76 742 3,7

Antistof 1+ - 18 198

Antistof II

30 -

Antistof 1+ + 2009 52

Antistof II - 39 "AUSRIA®EIn + 1393 19,6 176 2,2 3445 59 35 - 71 81 58

Denne tabel viser, at det højeste +/” forhold og derfor den mest følsomme prøve fås, når alle tre monoklonale 40 antistoffer anvendes i den faste fase med 125I-RF-HBs-l som sporstof.

DK 162720 B

18

Eksempel 6

Grænser for påvisning af HBs-Aq

Polystyrenperler overtrukket med optimale koncentrationer af enten monoklonalt RF-HBs-l-antistof eller mono-5 klonale antistoffer I eller II eller med kombinationer af disse antistoffer inkuberes i 2 timer ved 45° C med 200 μΐ af enten -ve-HBs-Ag-serum fra mennesker eller med 200 μΐ menneskeserum indeholdende kendte mængder HBs-Ag, vaskes og inkuberes med 200 μΐ 125I-RF-HBs-l (200.000 cpm pr. prøve) 10 i yderligere en time ved 45°c.

Resultaterne er anført nedenfor .i tabel IV, der også viser resultater af en lignende titrering af HBs-Ag ved hjælp af "AUSRIA®II". Resultaterne er udtrykt som cpm (gennemsnit af mindst 2 eksperimenter) eller som +/- forhold.

19 DK 162720 B

oo η σ es - - I * · " *· HH \ in σ <f I—I 1 I H ' · ' <Τ + " <! <ΰ

Η H

od Di _ _I

MM !>. CO O O C Γ{ as g c> oo o en ' ιιη· '

5<J d Η H in CS Η H

s Γ__O o· H___:_ +

l—I

+ MM r- oo O <t H O

Η Ή *H 1 ~ ~ Γ Γ _Γ _Γ 1 '

i q o \ i cvl V© CH Csl pH i—I rH

01 P P + «-<

Cd 01 w

ΐΰ 4J e O Γ'"* st CS CS 00 CO VO

d g n d · O O -i en es Η Η i H

pj <; <; y es i—i + *

HH

hm vo en σ ό en »« k « * Λ Λ /j i i i <n en h es es H 1 1 1

0 O \ o en H

40 4-1 + H

HH H CO CS O H es H 00 μ 4j gHinHinr^mH' m

CSC d o σ O <t* H H

<J <J y 10 H r-1 o ______— o o + H ^ m σ m s}·

HlW I I ' 1 1 Ό io \ h en m sf· ® 01 4J + m h p

HH i—.. T—j <j" i—1 'd' P

> ,4j goooeneoOO' 1 '<i g H dC desvoencsescs fa j oi < o es X, B _ i h * M onr^Hcno ..

m i i i P

0 \00vOsJ-eSHHH op P + H *3 h oo σ en o O eo σ .S Ϊ

4J gr»inHencsvoeS 1 cs P

CJ desHinencsHH H ® < O es £ H 5) k " ” p * M vomooH-d· o d U-ι i » » ~ “ H 1 es

H O V^OenvOOOVOSfHHV

P + Γ>. en h jg H esHenHr-ονοσσΗ > 4J «('»OstooenoenesHcs

C d-i^enHHH P

< S* H %

•iH

____—- P

H ^ 1 i en O h es o 0) \ „ , » « » i i i i i ·’

rt + r- en Η Η Η P

S oi d g o σ cs i 1 1 r| S dHO-tfoovo 10 Sk O in cs H g1

. _____ _ *iH

o S

ti “

to bO

P P <D c o oi oi /1

£ ££ S

in §

0 h m m r-» X

in cs vo en H O S

1 V · * * ** " * oa tiO oomesi—looooo M C es h * 33 ή

DK 162720 B

20

Eksempel 7 Påvisning af HBs-Aq-positive prøver

Portioner på 200 μΐ af 300 prøver af menneskeserum, påvist at være -fve-HBs-Ag eller -ve-HBs-Ag ved hjælp af 5 enten "AUSRIA II® RIA" eller "Hepatest®" (253 +ve, 47 -ve), inkuberes i 2 timer ved 45“C med polystyrenperler overtrukket med enten de monoklonale antistoffer I eller II eller med en blanding af antistofferne RF-HBs-1, I og II. Efter vask inkuberes perlerne i yderligere en time ved 456C med 125I-10 RF-HBs-1 (200.000 cpm pr. prøve), vaskes og tælles.

Som vist i tabel V nedenfor er de af 253 HBs-Ag-posi-tive prøver 219 positive med antistof I, men 34 er negative. Imidlertid giver alle de 34 prøver, der viste sig at være HBs-Ag-positive, men som ikke reagerede med antistof I, 15 positive værdier, når de prøves med antistof II anvendt som fast fase. På lignende måde påvises 10 af de 253 +ve-HBs-Ag-prøver, der afprøves, ikke med antistof II, når det anvendes alene som fast fase, men de samme 10 giver alle positive værdier, når de prøves med antistof I anvendt som fast 20 fase.

TABEL V

Antal " AUSRIA®II"/- Anti- Anti- RF-HBs-Isprøver "Hepatest®" stof I stof II Antistof I +

25 Antistof II

209 + + + + 34 + - + + 10 + + - + 30 47 - - -

Eksempel 8

Radiometrisk totrinsafprøvninq for HBs-Aq 35 Polystyrenperler overtrukket med antistofferne RF- -HBs-1, I og II inkuberes i forskellige tidsrum ved 20, 37 eller 45°C med 200 μΐ menneskeserum, der indeholder 55 /zg/ml

DK 162720 B

21 HBs-Ag eller med 200 μΐ -ve-HBs-Ag-menneskeserum. Perlerne vaskes og inkuberes i yderligere tidsrum ved 20, 37 eller 45“C med 125I-RF-HBs-l-sporstof, vaskes og tælles.

5 TABEL· VI

1. inkubation 2. inkubation +/” tællingsforhold

i timer i timer 20’C 37*C 45*C

10 4 1 463 289 227 4 2 643 475 329 4 4 559 280 213 8 16 352 395 453 1 4 226 182 378 15 2 4 435 272 229 4 4 559 280 213 16 4 719 286 453 20 Anbefalede inkubationstider for en totrinsafprøvning med monoklonale RF-HBs-antistoffer for HBs-Ag er således som følger: 1. inkubation af serum med perler overtrukket med monoklonalt antistof: 25 enten 4 timer ved stuetemperatur eller 16 timer ved stuetemperatur 2. inkubation af vaskede perler med RF-HBs-l-sporstof: 2 timer ved stuetemperatur. 1 2 3 4 5 6

Eksempel 9 2

Radiometrisk ettrinsafprøvnincr for HBs-Ag 3

Polystyrenperler overtrukket med antistofferne I og 4 II (1:200 fortyndinger af ascitesvæske) inkuberes i forskel 5 lige tidsrum ved 20*C med 200 μΐ af enten -ve-HBs-Ag-men- 6 neskeserum eller med menneskeserum indeholdende 20 ng/ml HBs-Ag og med 10 μΐ 125I-RF-HBs-l (100.000 cpm pr. prøve), vaskes og tælles. Resultaterne udtrykt som cpm (gennemsnit

DK 162720 B

22 af to særskilte eksperimenter) eller som forholdet mellem tællinger opnået med +ve-HBs-Ag- og -ve-HBs-Ag-prøver.

TABEL VII

5 Inkubations- cpm +/*“ tællingstid, timer +ve-HBs-Ag -ve-HBs-Ag forhold 2 1470 14 105 10 4 2026 23 88 5 2563 20 128

Coinkubation af perle, prøve og sporstof som i dette 15 eksempel giver bedre resultater, end hvis perlen og prøven præibkuberes, og resultaterne er kun lidt forskellige fra dem, der opnås, hvis sporstof og prøve præinkuberes.

Denne ettrinsprøve er mulig, fordi antistofferne er monoklonale, således at de til forskel fra gængse antisera 20 ikke konkurrerer om antigenbindingssteder og er et attraktivt system til anvendelse, når der kræves meget hurtige undersøgelsesmetoder for HBs-Ag, f.eks. i blodtransfusionscentre og i blodproduktlaboratorier, eftersom den indebærer færre manipulationer end en totrinsprøve. Denne prøve kan udføres 25 i løbet af 2 timer uden tilsyneladende tab af følsomhed.

Eksempel 10

Brug af RF-HBs-l-antistof til affinitetschromatografi af HBs-Ag 30 RF-HBs-l-antistof, delvis renset for ascitesvæske ved hjælp af fældning med ammoniumsulfat, kobles til "CNBr-S4B" (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) som angivet af fabrikanten. 100 ml menneskeserum indeholdende HBs-Ag føres ned gennem denne kolonne, hvilket resulterer i en 35 98,7%'s fjernelse af HBs-Ag fra serummet. Yderligere kan 100% af det fjernede antigen elueres fra kolonnen ved hjælp af 3 M Kl. Antigenet er immunogent i mus og kaniner og viser

DK 162720 B

23 sig at være frit for andre urenheder fra menneskeserum ved immunoelektrophorese imod et kaninantiserum imod helserum.

Eksempel li 5 Anvendelse af RF-HBs-l-antistof ved lokalisering af HBs-Aa i cellemateriale RF-HBs-l-antistof i ovenstående væsker fra kulturer af RF-HBs-l-celler anvendes til identificering af HBs-Ag i frosne snit af leverbiopsier fra HBV-bærende mennesker eller 10 chimpanser eller i celler, der bærer viruset, idet antigen--antistof-komplekset gøres synligt med et gedeantiserum imod museimmunoglobulin, koblet til et fluorescensmolekyle. Desuden konjugeres protein A-renset RF-HBs-l-antistof til biotin ved inkubation af 1 mg RF-HBs-l-antistof i 1 ml bi-15 carbonat-saltvandspuffer med pH 8,3 (0,1 M NaHC03 : 0,5 M NaCl) i 4 timer ved 20°c med 90 pg biotinsuccinamid opløst ved 1 mg/ml i DMSO. Efter dialyse natten over ved 4"C mod phospha tpuf ret saltvandsopløsning anvendes RF-HBs-l-antistof--biotin-konjugatet kombineret med et avidinfluorochromkon-20 jugat eller med avidin-ferritin for at synliggøre HBs-Ag ved henholdsvis immunofluorescerende mikroskopi og ved im-munoelektronmikroskopi.

Claims (15)

1. Monoklonalt antistof imod hepatitis B-overfladeantigen, kendetegnet ved, at det er sekreteret fra hybridomacellelinie RF-HBs-l (CNCM-I-117).

2. Antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er praktisk taget frit for andet immunologisk materiale.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer imod hepatitis B-overfladeantigen, kende- 10 tegnet ved, at hybridomacellelinie RF-HBs-l (CNCM-I-117) dyrkes, og at de frembragte antistoffer udvindes.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at cellelinien dyrkes in vitro i et næringskulturmedium derfor, og at antistofferne udvindes fra den oven- 15 stående kulturvæske.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at cellelinien etableres som en ascitestumor i mus ved implantering af cellelinien, og at antistofferne udvindes fra musens ascitesvæske eller serum.

6. Fremgangsmåde til diagnosticering af tilstedevæ relsen af hepatitis B-overf ladeantigen i en biologisk prøve, kendetegnet ved, at der anvendes antistoffer sekreteret af hybridomacellelinie RF-HBs-l (CNCM-I-117) ved immunofluorescensmikroskopi eller immunoelektronmikroskopi 25 eller i et radiometrisk afprøvningssystem med fast fase eller ved en enzymmærket immunoafprøvning.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at en serumprøve taget fra et menneske eller dyr inkuberes med RF-HBs-l-antistof og et eller flere andre, 30 monoklonale antistoffer, der erkender HBs-Ag, i fast fase, at den faste fase vaskes og inkuberes med radiomærket eller enzymmærket RF-HBs-l-antistof som sporstof.

8. Prøvesæt, kendetegnet ved, at det indbefatter en første beholder, der indeholder et plastsubstrat 35 overtrukket med monoklonalt antistof sekreteret af RF-HBs-l (CNCM-I-117) og et eller flere andre, monoklonale antistof- DK 162720 B fer, der erkender HBs-Ag, samt en anden beholder, der indeholder monoklonalt antistof sekreteret af hybridomacellelinie RF-HBs-l (CNCM-I-117), til hvilket antistof der er knyttet et radiomærkestof eller et enzymmærkestof.

9. Prøvesæt ifølge krav 8, kendetegnet ved, at substratet er overtrukket med RF-HBs-l-antistof, og med andre, monoklonale antistoffer, som erkender HBs-Ag.

10. Prøvesæt ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at plastsubstratet er af polystyren i form af 10 perler, stave eller rør.

11. Hybridomacellelinie RF-HBs-l (CNCM-I-117), k e n-detegnet ved, at den sekreterer et monoklonalt antistof imod hepatitis B-overfladeantigen.

12. Cellelinie RF-HBs-l (CNCM-I-117) ifølge krav 11, 15 kendetegnet ved, at den er praktisk taget fri for andet cellemateriale.

13. Fremgangsmåde til formering af en hybridomacellelinie ifølge krav 11 eller 12 in vitro, kendetegnet ved, at cellelinien dyrkes i et næringskulturmedium 20 derfor.

14. Fremgangsmåde til formering af en hybridomacellelinie ifølge krav 11 eller 12 in vivo, kendetegnet ved, at cellelinien implanteres i en mus til etablering af en ascitestumor.

15. Præparat, kendetegnet ved, at det indbefatter en hybridomacellelinie ifølge krav 11 eller 12 samt et næringsmedium, der er i stand til at opretholde cellelinien.