JPS6210098A - 抗ＨＢｓモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
抗ＨＢｓモノクロ−ナル抗体Info
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- JPS6210098A JPS6210098A JP14667485A JP14667485A JPS6210098A JP S6210098 A JPS6210098 A JP S6210098A JP 14667485 A JP14667485 A JP 14667485A JP 14667485 A JP14667485 A JP 14667485A JP S6210098 A JPS6210098 A JP S6210098A
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- JP
- Japan
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- antibody
- mouse
- hbs antigen
- hbs
- cell
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Immunology (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、モノクローナル抗ＨＢｓ抗体及びそれを産生
ずるハイブリドーマ（融合細胞株）に関するものである
。
ずるハイブリドーマ（融合細胞株）に関するものである
。
Ｂ型肝炎ウィルスの感染の診断は、患者の血液中のＨＢ
ｓ抗原の検出によって確認される。
ｓ抗原の検出によって確認される。
血中のＨＢｓ抗原は、Ｂ型肝炎ウィルスの外被￥フ５ｚ
ｂ−うトｈ−コト 形で存在する。更に、この抗原にはａｄｒ −ａｄｗ・
ａｙｒ・ａｙｗの４つの亜をが存在し、我国ではａｄｒ
とａｄｗが多いといわれている。一方、我国人口の２％
前後がＨＢｓ抗原キャリヤーであるといわれており、そ
の殆どは無症候性キャリヤーである。しかし、その一部
で慢性肝炎、肝硬変、原発性肝癌等の肝障害を有する。
ｂ−うトｈ−コト 形で存在する。更に、この抗原にはａｄｒ −ａｄｗ・
ａｙｒ・ａｙｗの４つの亜をが存在し、我国ではａｄｒ
とａｄｗが多いといわれている。一方、我国人口の２％
前後がＨＢｓ抗原キャリヤーであるといわれており、そ
の殆どは無症候性キャリヤーである。しかし、その一部
で慢性肝炎、肝硬変、原発性肝癌等の肝障害を有する。
この意味で、Ｂ型肝炎ウィルスの感染の有無を知ること
は非常に意義のあることであり、又このウィルスに対す
る抗体、及びワクチンの研究は予防疫学面においても重
要な意味をもつ。
は非常に意義のあることであり、又このウィルスに対す
る抗体、及びワクチンの研究は予防疫学面においても重
要な意味をもつ。
この数年、Ｂ型肝炎ウィルスに関する研究は、遺伝子組
換え技術、或いは細胞工学等の目ざましい発達によって
進歩している。こうした技術を利用したＨＢｓ抗原に対
するモノクローナル抗体、及びその利用についての研究
は、Ｍｌｒｃｉｎｉａｋら〔Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、８０．３８２１（１９８３））
の報告や特開昭５６−１５８７１８にみられる。モノク
ローナル抗ＨＢｓ抗体は、一般的にはマウスをＨＢｓ抗
原で免疫し、抗体価が上昇したところのマウス牌細胞を
採取し、培養可能な免疫グロブリン非産生性のマウスミ
エローマ（骨髄腫）細胞と混合し、ポリエチレングリコ
ール法によりハイブリドーマを作製し、融合した細胞を
細胞培養用マイクロタイタブレートに分注して培養すれ
ば、抗ＨＢｓ抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合が起
こった場合において、融合細胞は分裂増殖をはじめ特異
抗体を得ることができる。
換え技術、或いは細胞工学等の目ざましい発達によって
進歩している。こうした技術を利用したＨＢｓ抗原に対
するモノクローナル抗体、及びその利用についての研究
は、Ｍｌｒｃｉｎｉａｋら〔Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ ｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、８０．３８２１（１９８３））
の報告や特開昭５６−１５８７１８にみられる。モノク
ローナル抗ＨＢｓ抗体は、一般的にはマウスをＨＢｓ抗
原で免疫し、抗体価が上昇したところのマウス牌細胞を
採取し、培養可能な免疫グロブリン非産生性のマウスミ
エローマ（骨髄腫）細胞と混合し、ポリエチレングリコ
ール法によりハイブリドーマを作製し、融合した細胞を
細胞培養用マイクロタイタブレートに分注して培養すれ
ば、抗ＨＢｓ抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合が起
こった場合において、融合細胞は分裂増殖をはじめ特異
抗体を得ることができる。
モノクローナル抗ＨＢｓ抗体の作製に際しては、試験管
内で産生抗体の確認が行なわれ、目的とする抗体産生ク
ローンのみが選択されるため、非特異的な反応を示す抗
体は除外されることになる。
内で産生抗体の確認が行なわれ、目的とする抗体産生ク
ローンのみが選択されるため、非特異的な反応を示す抗
体は除外されることになる。
従って、動物の免疫に用いる抗原は余り純粋でなくても
よいし、吸収操作の必要性もいらない。更に、抗ＨＢｓ
抗体を産生ずる・・イブリドーマを液体窒素中に保存し
ておき、必要に応じてマウスの腹腔内に注入すれば、高
力価の抗ＨＢｓ抗体を大量に作製することができる。こ
のようにして得られる抗体は、常に一定の抗原決定基と
のみ反応する同一力価のＨＢｓ抗体であることから、こ
れを用いれば、抗体差による成績の変動は起こり得ない
はずであり、同一レベルで成績を評価することができる
。
よいし、吸収操作の必要性もいらない。更に、抗ＨＢｓ
抗体を産生ずる・・イブリドーマを液体窒素中に保存し
ておき、必要に応じてマウスの腹腔内に注入すれば、高
力価の抗ＨＢｓ抗体を大量に作製することができる。こ
のようにして得られる抗体は、常に一定の抗原決定基と
のみ反応する同一力価のＨＢｓ抗体であることから、こ
れを用いれば、抗体差による成績の変動は起こり得ない
はずであり、同一レベルで成績を評価することができる
。
本発明の目的は、このような技術背景のもとに完成され
たものであり、ＨＢｓ抗原の測定用、或いはＢ型肝炎感
染予防の免疫製剤を製造するうえできわめて有用な特性
を有するモノクローナル抗ＨＢｓ抗体を提供するもので
ある。
たものであり、ＨＢｓ抗原の測定用、或いはＢ型肝炎感
染予防の免疫製剤を製造するうえできわめて有用な特性
を有するモノクローナル抗ＨＢｓ抗体を提供するもので
ある。
本発明のモノクローナル抗ＨＢｓ抗体は、２種類のハイ
ブリドーマＨ−ＮＳ−４又はＨ−ＮＴ−９により産生さ
れ、この抗体はＨＢｓ抗原のａｄｒに対して反応を示し
、抗ＩｇＧ抗体・抗ＩｇＧｘをＤ Ｍ Ｅ （Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ）培地と１
０％牛脂児血清で培養し、この培地中に分泌したＨＢｓ
抗原（ａｄｒ ）を超遠心分離し、得られたＨＢＳ抗原
で免疫したマウスの牌細胞（リンパ球細胞）とマウスミ
エローマ細胞（Ｐ３Ｕ１ ）の細胞融合により得る。こ
のハイブリドーマは、親Ｐ３Ｕ１ぶ と形態学的に類似し、平均の大きさが１２蛙ｍである均
一な細胞群として現われ、ガラス又はプラスチックと部
分的に結合するが、攪拌操作によって分離される。Ｈ−
ＮＳ−４はプラスチックの表面に生育するが、Ｈ−ＮＴ
−９は層をなすように生長する特長がある。
ブリドーマＨ−ＮＳ−４又はＨ−ＮＴ−９により産生さ
れ、この抗体はＨＢｓ抗原のａｄｒに対して反応を示し
、抗ＩｇＧ抗体・抗ＩｇＧｘをＤ Ｍ Ｅ （Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ）培地と１
０％牛脂児血清で培養し、この培地中に分泌したＨＢｓ
抗原（ａｄｒ ）を超遠心分離し、得られたＨＢＳ抗原
で免疫したマウスの牌細胞（リンパ球細胞）とマウスミ
エローマ細胞（Ｐ３Ｕ１ ）の細胞融合により得る。こ
のハイブリドーマは、親Ｐ３Ｕ１ぶ と形態学的に類似し、平均の大きさが１２蛙ｍである均
一な細胞群として現われ、ガラス又はプラスチックと部
分的に結合するが、攪拌操作によって分離される。Ｈ−
ＮＳ−４はプラスチックの表面に生育するが、Ｈ−ＮＴ
−９は層をなすように生長する特長がある。
細胞融合は、例えば、Ｋ５ｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉ
ｎ （ＥｕｒＪ、Ｉｍｎｕｎｏｌ、６ 、２９２ （１
９７６） ）の方法に従って行なうことができる。
ｎ （ＥｕｒＪ、Ｉｍｎｕｎｏｌ、６ 、２９２ （１
９７６） ）の方法に従って行なうことができる。
ハイブリドーマの選択（ＨＡＴセレクシ目ン）は、選択
培地における選択的増殖により行なう。
培地における選択的増殖により行なう。
例えば、細胞融合後、ＨＡＴ培地（アミノプテリン４
Ｘ １０−７Ｍ１ ヒポキサンチンＩ Ｘ １０−４
Ｍ、チミジン１ 、６ｘ １０−５ Ｍ）を加えて、マ
イクロタイタープレートの上に１穴当たり５Ｘ１０５
個細胞程度にまき、以後適当にＨＡＴ培地を交換して
培養する。この培地中では、ミエローマ細胞は約７日日
ぐらいで死滅し、又正常細胞である抗体産で、長期間に
わたり生育する細胞はノ・イブリドーマとなる。
Ｘ １０−７Ｍ１ ヒポキサンチンＩ Ｘ １０−４
Ｍ、チミジン１ 、６ｘ １０−５ Ｍ）を加えて、マ
イクロタイタープレートの上に１穴当たり５Ｘ１０５
個細胞程度にまき、以後適当にＨＡＴ培地を交換して
培養する。この培地中では、ミエローマ細胞は約７日日
ぐらいで死滅し、又正常細胞である抗体産で、長期間に
わたり生育する細胞はノ・イブリドーマとなる。
抗ＨＢｓ抗体産生細胞の選択については、ＥＬＩ Ｓ
Ａ （Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｒｒｍｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ ）法（ごより抗体を産生ず
るＩ・イブリドーマが確認されたならば、クローニング
を行なう。抗体の回収は、・・イブリドーマをＢａ１ｂ
、＜Ｃマウスの腹腔に１０７個細胞程度の細胞を注射し
て腹水を採取すると、高抗体価の抗体が得られる。精製
を必要とする場合には、腹水を硫安分画後、ＤＥＡＥセ
ルロースイオン変換クロマトグラフィー、抗マウス血清
を結合したセファロース４Ｂ等を用いたアフィニティー
クロマトグラフィー、ゲル濾過装置等によって′精製す
ることが可能である。
Ａ （Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｒｒｍｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ ）法（ごより抗体を産生ず
るＩ・イブリドーマが確認されたならば、クローニング
を行なう。抗体の回収は、・・イブリドーマをＢａ１ｂ
、＜Ｃマウスの腹腔に１０７個細胞程度の細胞を注射し
て腹水を採取すると、高抗体価の抗体が得られる。精製
を必要とする場合には、腹水を硫安分画後、ＤＥＡＥセ
ルロースイオン変換クロマトグラフィー、抗マウス血清
を結合したセファロース４Ｂ等を用いたアフィニティー
クロマトグラフィー、ゲル濾過装置等によって′精製す
ることが可能である。
ハイブリドーマの保存は、９０％ＦＣ５及び１０％ＤＭ
ＳＯ（ジメチルスルフオキシド）に細胞を浮遊させ、通
常液体チッ素中に保存する。
ＳＯ（ジメチルスルフオキシド）に細胞を浮遊させ、通
常液体チッ素中に保存する。
本発明のモノクローナル抗ＨＢｓ抗体は、ガラス又はプ
ラスチックビーズ等に物理的又は化学的に結合させるこ
とによって固定化すれば、検体試料中のＨＢｓ抗原測定
におけるＥＩＡ法やＲＩＡ法等に利用できる。他の用途
としては、セファロースなどの坦体にブロムシアンなど
で固定化し、ｆ（Ｂｓ−７フイニテイーカラムを作製し
、このカラムにＢ型肝炎つィルス粒子を含む体液を通過
させることにより、このウィルス粒子を除去するこを、
このアフィニティーカラムに通すことにより、ＨＢｓ抗
原のみをカラムに吸着させ、洗浄後、適当な溶出液を用
いることで高純度なＨＢｓ抗原を得ることが可能である
。
ラスチックビーズ等に物理的又は化学的に結合させるこ
とによって固定化すれば、検体試料中のＨＢｓ抗原測定
におけるＥＩＡ法やＲＩＡ法等に利用できる。他の用途
としては、セファロースなどの坦体にブロムシアンなど
で固定化し、ｆ（Ｂｓ−７フイニテイーカラムを作製し
、このカラムにＢ型肝炎つィルス粒子を含む体液を通過
させることにより、このウィルス粒子を除去するこを、
このアフィニティーカラムに通すことにより、ＨＢｓ抗
原のみをカラムに吸着させ、洗浄後、適当な溶出液を用
いることで高純度なＨＢｓ抗原を得ることが可能である
。
以下、実施例で本発明を説明する。
実施例１
完全フロイントのアジュバントと生食に溶解用いて最終
免疫し、３日後に牌を切除した。この牌をＲＰＭ１１６
４０培地中で小片に切断後、肺細胞を組織中より取り出
した。得られた牌細胞約１０８個は、約２ Ｘ １０７
個のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とＲＰＭ１１６４０培地中
で混合し、遠心によりペレットを得た。これにポリエチ
レングリコール４０００とＲＰＭ１１６４０培地の等景
況合液を１ ｍ ｌ加えて細胞融合を行ない、その後Ｒ
ＰＭ１１６４０培地９ ｍ ｌを除々に添加した。次に
細胞含有液を遠心し、ポリエチレングリコールを除去し
た。■５％ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４０培地（以下Ｎ５
−１と略）３０ｍＡ’を加えて静かにけん濁後、９６穴
のマイクロタイタープレートに１穴当たり１０５個とな
る様にまいた。以後、適当にＨＡＴ培地を交換して培養
し、その後、培地はＨＡＴ培地からＨＴ培地に変え、更
にＭＳ−１培地に変えた。
免疫し、３日後に牌を切除した。この牌をＲＰＭ１１６
４０培地中で小片に切断後、肺細胞を組織中より取り出
した。得られた牌細胞約１０８個は、約２ Ｘ １０７
個のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とＲＰＭ１１６４０培地中
で混合し、遠心によりペレットを得た。これにポリエチ
レングリコール４０００とＲＰＭ１１６４０培地の等景
況合液を１ ｍ ｌ加えて細胞融合を行ない、その後Ｒ
ＰＭ１１６４０培地９ ｍ ｌを除々に添加した。次に
細胞含有液を遠心し、ポリエチレングリコールを除去し
た。■５％ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４０培地（以下Ｎ５
−１と略）３０ｍＡ’を加えて静かにけん濁後、９６穴
のマイクロタイタープレートに１穴当たり１０５個とな
る様にまいた。以後、適当にＨＡＴ培地を交換して培養
し、その後、培地はＨＡＴ培地からＨＴ培地に変え、更
にＭＳ−１培地に変えた。
この培地中で生育できた細胞を含むウェルの上清を用い
て、ＨＢｓ抗体産生細胞をＥＬＩＳＡ法により選別した
。ＨＢｓ抗原をコートしたマイクロタイタープレートに
ハイブリドーマの培養上清を加えて反応させ、洗浄後、
更にアルカリフォスファターゼ結合ウサギ抗マウス血清
を加えてマウスの抗体と結合したアルカリフォスファタ
ーゼの活性を測定した。
て、ＨＢｓ抗体産生細胞をＥＬＩＳＡ法により選別した
。ＨＢｓ抗原をコートしたマイクロタイタープレートに
ハイブリドーマの培養上清を加えて反応させ、洗浄後、
更にアルカリフォスファターゼ結合ウサギ抗マウス血清
を加えてマウスの抗体と結合したアルカリフォスファタ
ーゼの活性を測定した。
得られた抗ＨＢｓ抗体を産生ずるウェルは２個あり、こ
れをＨ，−ＮＳ−４とＨ−ＮＴ−９とした。
れをＨ，−ＮＳ−４とＨ−ＮＴ−９とした。
抗ＨＢｓ抗体を産生ずるウェルには２種以上のハイブリ
ドーマが生育している可能性がある。
ドーマが生育している可能性がある。
ため、限界希釈法を２回行なうことにより、モノクロー
ナル抗体産生細胞を得た。
ナル抗体産生細胞を得た。
このモノクローナル産生細胞をＭＳ−１培地中で培養す
ることによって大量に増殖させる。
ることによって大量に増殖させる。
このとき、培養上清中にモノクローナル抗体が生産され
た。このノ・イブリドーマを、前もってプリスタンを腹
腔内に投与しておいたＢａ １ ｂ／Ｃマウスの腹腔内
に１０７個細胞投与すると、１週間後、腹水中に大量の
モノクローナル抗体とハイブリドーマがそれぞれＨ−Ｎ
ｓ−４・２ｍ１１０７個細胞、及びＨ−ＮＴ−９−２ｍ
１４ｘｌＯ’個細胞回収できた。
た。このノ・イブリドーマを、前もってプリスタンを腹
腔内に投与しておいたＢａ １ ｂ／Ｃマウスの腹腔内
に１０７個細胞投与すると、１週間後、腹水中に大量の
モノクローナル抗体とハイブリドーマがそれぞれＨ−Ｎ
ｓ−４・２ｍ１１０７個細胞、及びＨ−ＮＴ−９−２ｍ
１４ｘｌＯ’個細胞回収できた。
ハイブリドーマＨ−ＭＳ−４、及びＨ−ＮＴ−９より得
られたモノクローナル抗体のクラス、サブクラス、タイ
プの決定は、それぞれのクローンを腹腔内に投与して得
られた腹水を、遠心分離で融合細胞を除去後５０％で硫
安分画し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）
で透析′して部分精製モノクローナル抗体を得て行なっ
ニー法により検討した結果、Ｈ−ＮＳ−４及び特許出願
人 林へ仏γ↓シノテスＰｋ片健ｐ汀膿゛ｅしム人痕材
帆会、 年１頁の続き
られたモノクローナル抗体のクラス、サブクラス、タイ
プの決定は、それぞれのクローンを腹腔内に投与して得
られた腹水を、遠心分離で融合細胞を除去後５０％で硫
安分画し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）
で透析′して部分精製モノクローナル抗体を得て行なっ
ニー法により検討した結果、Ｈ−ＮＳ−４及び特許出願
人 林へ仏γ↓シノテスＰｋ片健ｐ汀膿゛ｅしム人痕材
帆会、 年１頁の続き
Claims (2)
- （１）ＨＢｓ抗原と反応し、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＧ＿
１、及び抗Ｋ鎖抗体と反応性を示すことを特徴とする抗
ＨＢｓモノクローナル抗体。 - （２）ＨＢｓ抗原で免疫したマウス脾細胞とマウスミエ
ローマ細胞との細胞融合株により得られる特許請求の範
囲第１項記載の抗ＨＢｓモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14667485A JPS6210098A (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 抗ＨＢｓモノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14667485A JPS6210098A (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 抗ＨＢｓモノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6210098A true JPS6210098A (ja) | 1987-01-19 |
Family
ID=15413038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14667485A Pending JPS6210098A (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 抗ＨＢｓモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6210098A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5079173A (en) * | 1987-08-19 | 1992-01-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Methods, hybridomas, monoclonal antibodies and sensitized cells for measuring hbs antigen |
-
1985
- 1985-07-05 JP JP14667485A patent/JPS6210098A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5079173A (en) * | 1987-08-19 | 1992-01-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Methods, hybridomas, monoclonal antibodies and sensitized cells for measuring hbs antigen |
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