JPH0458960B2

JPH0458960B2 -

Info

Publication number: JPH0458960B2
Application number: JP56032728A
Authority: JP
Inventors: Masato Sugi; Masao Fujimoto; Takeshi Watanabe; Yasushi Okumura
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1981-03-06
Filing date: 1981-03-06
Publication date: 1992-09-18
Also published as: JPS57146594A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ハイブリドーマを用いてサイクリツ
クヌクレオチドに対するモノクローナル抗体を製
造する方法に関するものである。ジイー・ケーラー（G.KO¨hler）およびシー・
ミルスタイン（C.Milstein）らにより、動物を免
疫して得られる抗体産生細胞（主に脾細胞を用い
る）とマウスの骨髄腫細胞をPEG（ポリエチレン
グリコール）を用いて細胞融合すると、ある抗原
に対して特異的な抗体を分泌しながら無限に増殖
するハイブリドーマ（融合細胞）のクローンが得
られることが明らかにされた（ネイチユア
Nature vol.256.page 495〜497. 1975）さらにガ
ン細胞およびウイルス抗原に対するモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマに関しては、コ
プロウスキー（Koprowski）らにより特許出願
されている（特開昭54−17185号公報．特開昭54
−143513号公報参照）。さらに種々の抗原に対す
るモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマが作
製され、多数のクローンが世界中の研究室で確立
されている。一方、アデノシン−3′、5′−サイクリツクモノ
りん酸（以下、「CAMP」と略称する）はホルモ
ン作用の媒体として広く研究され、グアノシン−
3′−5′サイクリツクモノりん酸（以下、「CGMP」
と略称する）．イノシン−3′，5′−サイクリツク
モノりん酸（以下、「CIMP」と略称する）．シチ
ジン−3′，5′−サイクリツクモノりん酸（以下、
「CCMP」と略称する）．ウリジン−3′，5′−サイ
クリツクモノりん酸（以下、「CUMP」と略称す
る）についてもその生理作用が明らかにされつつ
ある。これらの研究が進むにつれ、生体が病気等
の非生理的状態におかれた場合に細胞あるいは体
液内のサイクリツクヌクレオチドの含量が変動す
る現象が認められ、多くの病態とサイクリツクヌ
クレオチドとの関連が解明されてきている。した
がつて、これらサイクリツクヌクレオチドの生体
内含量の測定には、基礎医学研究分野はもちろ
ん、臨床医学の分野においても病気の診断、予防
もしくは治療に重要な意義が認められている。サイクリツクヌクレオチドの臨床的定量に応用
可能な方法として、近年ラジオイムノアツセイ
（radioimmunoassay）法やエンザイムイムノア
ツセイ（enzyme immunoassay）法が開発され
た。このようなイムノアツセイに供する抗サイク
リツクヌクレオチド抗体は、家兎などの動物をサ
イクリツクヌクレオチドの人工抗原で免疫して得
られる抗血清から調製されている。しかしなが
ら、このような抗血清はたとえば家兎１羽あたり
50〜60mlであり、サイクリツクヌクレオチドに親
和性の高い抗体が得られても量的な制限があり、
イムノアツセイに応用した場合ロツト間で特異性
のバラツキが生じるおそれがあつた。本発明者らはサイクリツクヌクレオチドに高い
親和性と特異性を有するモノクローナル抗体を大
量かつ安定に製造する方法を開発すべく研究を重
ねた結果、従来、まつたく知られていなかつたマ
ウスにおいても、家兎で抗血清を作製するときに
使用していた人工抗原を抗原として用いることに
より高い親和性と特異性を有する抗サイクリツク
ヌクレオチド抗体を産生する抗体産生細胞が得ら
れること、および該抗サイクリツクヌクレオチド
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハ
イブリドーマを製造し、該ハイブリドーマに抗サ
イクリツクヌクレオチド抗体を生産させる方法に
より、サイクリツクヌクレオチドに対して高い親
和性と特異性を有するモノクローナル抗体を同一
活性を保持したまま無限に生産することが可能に
なり、ロツト間のバラツキの問題が解消され、イ
ムノアツセイにおいて再現性の高い測定値が得ら
れることを知見し、本発明を完成した。サイクリ
ツクヌクレオチドハプテン特異性を持つモノクロ
ーナル抗体の生産の報告は従来なく、またこのモ
ノクローナル抗体が該サイクリツクヌクレオチド
に高い親和性を有し、したがつて高い測定感度が
得られるイムノアツセイ用抗体となりうることは
本発明ではじめて明らかにされた。本発明において「サイクリツクヌクレオチド」
とは、CAMP、CGMP、CIMP、CCMPおよび
CUMPのいずれかを指称するものである。また、
「抗サイクリツクヌクレオチド抗体」とは、元来
サイクリツクヌクレオチドのいずれかの人工抗原
で免疫されることによつて動物の抗体産生細胞に
より生産される該サイクリツクヌクレオチドに対
して特異性を有する抗体を指称し、本発明におい
てはこれをマウス由来の抗体産生細胞とミエロー
マ細胞とを融合させて得たハイブリドーマにより
生産させることを目的とする。以下、本発明方法について具体的に説明を加え
る。 (a) 抗体産生細胞の調製抗体産生細胞の調製は目的とするサイクリツク
ヌクレオチドの種類に対応するサイクリツクヌク
レオチドの人工抗原でマウスを免疫し、マウスの
抗体産生細胞を取得する方法によればよい。サイ
クリツクヌクレオチドの人工抗原としては、サイ
クリツクヌクレオチドの2′−０位にジカルボン酸
とのエステル結合を介して担体蛋白を結合させた
ものが適用できる。ジカルボン酸としては、通常
コハク酸、グルタール酸などが用いられ、担体蛋
白としては、血清アルブミン、グロブリン、ヘモ
シアニン、オボアルブミン、フイブリノーゲンな
とが用いられる。抗体産生細胞としては脾細胞、
胸線細胞、リンパ節細胞、および／または末梢血
細胞が使用される。 (b) ミエローマ細胞の調製本発明方法において使用されるミエローマ細胞
としては、マウスまたはラツト由来の細胞株が適
用できる。使用する細胞ラインは好ましくは薬剤
抵抗性のものであり、未融合のミエローマ細胞が
選択培地で生存せず、一方ハイブリドーマが生存
するようにすべきである。最も普通に用いられる
のは、８−アザグアニン抵抗性の細胞ラインで、
これはヒポキサンチンホスホリボシルトラン
スフエラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl
transferase）を欠損し、ヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン（HAT）培地に生育でき
ない性質を有する。また、使用する細胞ラインは
いわゆる「非分泌型」のものであることが好まし
い。たとえば、マウスミエローマ、MOPC−21
ライン由来のP₃／×63−Ag8U₁（P₃U₁）、P₃／×
63−Ag8・６・５・３、P₃／NSI−１−Ag4−
１、Sp₂／０−Ag14、ラツトミエローマ210・
RCY3・Ag1・２・３などを好適に用いることが
できる。 (c) 細胞融合通常イーグル最少基本培地（MEM）、
RPMI1640などの培地中で１〜５×10⁷個のミエ
ローマ細胞と抗体産生細胞１〜５×10⁸個を混合
し、（混合比は通常１：４〜１：10）細胞融合が
行われる。融合促進剤としては、平均分子量が
1000〜6000のポリエチレングリコール（PEG）
が好ましいが他の融合促進剤、たとえばポリビニ
ルアルコール、ウイルスなどを使用することもで
きる。PEGの使用濃度は通常30〜50％である。 (d) 選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖細胞融合を終えた細胞は、15％血清含有
RPMI1640の培地などで適当に希釈し、マイクロ
タイタープレートに10⁵〜10⁶ウエル程度にまく。
各ウエルに選択培地（たとえばHAT培地）を加
え、以後適当に選択培地交換を行い、培養する。
ミエローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株
を用いれば、未融合のミエローマはHAT培地で
は10日目ぐらいまでに全部死滅し、また抗体産生
細胞は正常細胞なのでインビトロ（invitro）で
は長期間生育できない。したがつて、培養10〜14
ぐらいから生育してくるものはすべてハイブリド
ーマである。 (e) 抗サイクリツクヌクレオチド抗体生産ハイブ
リドーマの検索ハイブリドーマのスクリーニングは常法によれ
ばよく、特に限定はない。たとえば、ハイブリド
ーマの生育したウエルの上清の一部を採取し、目
的とする抗サイクリツクヌクレオチド抗体の種類
に対応する標識したサイクリツクヌクレオチドと
インキユベーシヨンし、標識サイクリツクヌクレ
オチドとの結合能をチエツクすることにより、抗
サイクリツクヌクレオチド抗体を分泌しているウ
エルを探索することができる。すなわち、¹²⁵Ｉ、³
Ｈなどのラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、
発光物質などで標識したサイクリツクヌクレオチ
ドとのインキユベーシヨン終了後、反応液につい
てBF分離を行ない、抗原−抗体結合物画分につ
いて標識量を測定することにより抗サイクリツク
ヌクレオチド抗体の存在および結合能を検定する
ことができる。また、固定サイクリツクヌクレオチドと標識第
二抗体を使用する固相法も適用することができ
る。 (f) クローニング各ウエル中には２種類以上のハイブリドーマが
生育している可能性があるので、限界希釈法など
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体
生産ハイブリドーマを取得する。 (g) 抗体取得のためのインビトロおよびインビボ
増殖最も純粋なモノクローナル抗体は、所望のハイ
ブリドーマを10〜15％ウシ胎児血清含有
RPMI1640培地などの適当な培養液で培養し、そ
の培養上清液から得ることができる。一方、さらに大量に抗体を得るためには、ミエ
ローマ細胞の由来動物と同系の動物にプリスタン
（２，６，10，14−テトラメチルペンタデカン）
などの鉱物油を腹腔内投与し、その後ハイブリド
ーマを投与することにより、インビボ（invivo）
でハイブリドーマを大量に増殖させればよい。こ
の場合、ハイブリドーマは10〜18日位で腹水腫瘍
を形成し、血清および腹水中に高濃度（約１〜20
mg／ml）の抗体が生ずる。この中にはサイクリツ
クヌクレオチドと関連のない宿主動物由来の抗体
も含有されるが、通常モノクローナル抗体濃度の
５％以下であるので、イムノアツセイに際して数
万倍に希釈して用いる場合には全く問題にならな
い。しかし必要に応じ、腹水を硫安分画後、サイ
クリツクヌクレオチドを結合させたセフアロース
4Bなどのアフイニテイークロマトグラフイーな
どによつて精製することができる。以下、本発明方法の実施例を挙げてより具体的
な説明とする。ただし、これらは単なる実施態様
の例示であつて、本発明方法を何ら限定するもの
ではない。実施例１抗cGMP抗体の製造 BALB／ｃマウス（６〜８週令）にサクシニ
ルcGMPヒト血清アルブミン（ScGMPHSA）を
HSAとして50mgを完全フロインドアジユバンド
と１：１で混合し、２週間おきに２〜３回腹腔内
投与し、最後に30mgを静注した。最後免疫から３日後にマウスの脾細胞を採取
し、MEMで３回洗浄した。マウス骨髄腫細胞
（P₃U₁）をMEMで１回洗い、脾細胞とP₃U₁を
10：１〜４：１で混合して遠心後、ペレツトに50
％PEG1000、MEM溶液１mlを徐々に加え、１分
間遠心管をゆつくり回転させて細胞融合を行つ
た。１分後MEM1mlを加えてゆつくり回転させ、
さらに30秒ごとにMEMを１mlづつ加えて最終的
に８〜10mlとした。再び遠心し、ペレツトを15％
ウシ胎児血清含有RPMI1640培地にP₃U₁として
５×10⁴cell／0.1mlとなるように懸濁し、96ウエ
ルマイクロプレートに0.1mlづつまいた。１日後、HAT培地を0.1mlを添加し、その後３
〜４日ごとに半分量をHAT培地で交換したとこ
ろ、７日目ぐらいからいくつかのウエルでハイブ
リドーマが生育しはじめ、２〜３週間でほぼ全ウ
エルでハイブリドーマの生育が認められた。ハイブリドーマの生育してきたウエルの上清
0.1mlをとり¹²⁵Ｉ−ScGMPとインキユベーシヨン
し、これと結合するものを探したところ、20〜30
％の確率でScGMPに対する結合能を持つ抗体を
分泌しているウエルを認めることができた。結合
能の高いものをいくつか選び、限界希釈法により
クローニングを行つた。１回の細胞融合で16のク
ローンが得られた。クローニングした細胞を15％ウシ胎児血清含有
RPMI1640培地を用いて96ウエル→24ウエルプレ
ート→25cm²フラスコとスケールアツプして培養
し、上清を集めた。この上清中に得られた抗
cGMP抗体の力価（¹²⁵Ｉ−ScGMPが50％結合す
るときの希釈倍率）は1000〜5000で、十分cGMP
のイムノアツセイに使用できるものであつた。次に、２×10⁶以上の細胞を、プリスタン0.5ml
を予め投与したマウスに腹腔内投与し、腹水腫瘍
をつくらせて腹水を採取した。このときの抗
cGMP抗体の力価は５万〜1000万であつた。前記インビトロ培養上清を希釈し、抗cGMP抗
体として競合的RIAに供したところ、cGMPを
1.5fmol／tubeから測定可能であつた。また
CAMPとの交叉反応性もより改善された。なお、
競合的RIAの手法はビオケミカル・メデイシン
（Biochemical Medicine）Vol.18、Page257−
273（1977）の方法によつた。これらのクローンの産生するモノクローナル抗
cGMP抗体の性質をまとめると、第１表および第
２表のとおりである。

【表】

【表】実施例２ ScGMPHSAの代りにサクシニルcAMPHSA
（ScAMPHSA）を用いて実施例１と同様に免疫
して抗cAMP抗体産生のマウス脾細胞を採取し
た。これを実施例１と同様にP₃U₁と融合させて
ハイブリドーマを得、¹²⁵Ｉ−ScAMPを用いてス
クリーニングした。次いでクローニングした後、
インビトロでハイブリドーマを培養して得られた
培養上清中の抗cAMP抗体の力価は20〜1000であ
つた。これらのクローンの産生するモノクロ−ナル抗
cAMP抗体の性質は第３表のとおりである。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１サイクリツクヌクレオチドの人工抗原をマウ
スに免疫して得られる抗体産生細胞とミエローマ
細胞を融合させてハイブリドーマを製造し、該ハ
イブリドーマを培養し、測定目的とするサイクリ
ツクヌクレオチドに対して高い親和性と特異性を
有し、且つ競合的RIAで1.5fmo／tube（0.1ml
容）の濃度の該サイクリツクヌクレオチドを測定
できるモノクローナル抗サイクリツクヌクオチド
抗体を採取することを特徴とする抗サイクリツク
ヌクレオチド抗体の製造方法。