JPS62250363A - 抗リパ−ゼモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ）産業上の利用分野 リパーゼは、種々の動物の膵臓中に主として存在する酵
素である。この膵臓由来のリパーゼは膵疾患において血
中で特異的に上昇し、臨床診断における有用性が認めら
れている。本発明は抗リパーゼモノクローナル抗体およ
びその製造性に関するものである。

２）従来の技術 リパーゼの活性測定法としては天然基質であるオリーブ
油を用いる方法および合成基質として三酪酸ジメルカブ
ロールまたはα−ナフチルパルミテー１・を用いろ方法
等が報告されている。

これらの方法は血中に存在するリパーゼ活性を測定する
ものであるが、一部の膵疾患（慢性膵炎等）において低
値感度が悪く、疾患の識別が困難であるという欠点を有
していた。

また、上記欠点を改良するため、リパーゼ量を活性では
なくタンパク量として測定しようとする試みより免疫学
的測定法（イムノアッセイ）が開発された。これらのイ
ムノアッセイにおいて使用する抗体は従来の方法、即ち
ウサギ等の動物に抗原で免疫して、血清より分離して得
るものであるため、抗体を作製する度に大工の抗原が必
要となり、得られる抗体１も少なく、抗体自体も均質な
ものではなく免疫する動物の個体差によるバラツキが生
ずるという欠点を有している。

３）発明が解決しようとする問題点 イムノアッセイにおいて安価で大量に、かつ均一の抗体
を用いることが有利となるため、このような特性を有す
る抗体の入手が要望されてきた。

そして、ケーラー（Ｋ６ｈｌｅｒ）とミルシュタイン（
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）は１９７５年に、抗原で感作したマ
ウスの牌細胞のリンパ球と骨Ｉｆ腫細胞（ミエローマ細
胞）とを融合させることによって得られる融合細胞（ハ
イブリドーマ）を用いて、単一、均質な抗体（モノクロ
ーナル抗体）を製造しうろことを示した。

この報告以来、種々のハイブリドーマおよびモノクロー
ナル抗体について報告されてきたが、抗リパーゼモノク
ローナル抗体についての報告はない。

４）問題を解決するための手段 本発明者らはリパーゼを簡便に感度よく迅速に測定する
ことができるイムノアッセイに適用しうる抗体を提供す
ることを目的として、鋭意に検討した結果、抗リパーゼ
抗体産生リンパ球とミエローマ細胞とを融合させて得た
ハイブリドーマが、大量の抗リパーゼモノクローナル抗
体を産生ずることおよびその抗体が前記の目的を達成で
きることを見い出し、本発明を完成した。

即ち、本発明はリパーゼと抗原抗体反応特異性を有する
抗リパーゼモノクローナル抗体および抗リパーゼモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを培養し、培養物から
抗リパーゼモノクローナル抗体を採取することを特徴と
する抗リパーゼモノクローナル抗体の製造方法に関する
ものである。

本発明に用いられるハイブリドーマを得るには、ます哺
乳動物、好ましくはマウスまたはラットに抗原としてリ
パーゼを感作する。使用するリパーゼはヒト膵液等より
精製したものを用いる。従来の方法に準じて免疫した動
物より、リンパ球を採取する。　・ 一方、骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては被免疫動
物と同じ種由来のものを使用することが好ましく、かつ
未融合のミエローマ細胞がハイブリドーマ選択培地で生
育しないものが好ましい。一般的には８・アザグアニン
抵抗性のものが用いられる。このような理由より市販の
マウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ３−６−５−３．
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　）　、ラットミエローマ
細胞（２１Ｏ・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・３）等を使用す
るのが好ましい。

次にＭＥＭ、　ＲＰＭＩ　１６４０等の培地に上記リン
パ球およびミエローマ細胞を！ｊ、ｊｌｌし混合した後
、融合促進剤を用いて融合する。融合促進剤としては種
々の高分子物質やウィルス等を用いることができるが、
好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いれ
ばよい。ＰＥＧは平均分子ＰＩｋ４００〜２０，０００
のものが使用できるが、好ましくはｌ　、　０００〜７
　、５００のものを用いるのがよく、使用濃度は４０〜
６０ｖｏ１．％が好ましい。　融合細胞は洗浄して融合
促進剤を除去した後、１０〜２０ｖｏ１．％の血清を含
むＭＥＭ、またはＲＰＭＩ　１６４０培地に懸濁して、
９６穴培養皿等に０．５〜１．５ｘ　１０　　個／大の
割合で分注し、各穴に選択培地の一種であるヒボキサン
チン−アミノプテリン−チミジン（）ＩＡＴ）培地を加
え培養させるとハイブリドーマのみ生育する。目的の抗
体を産生じているハイブリドーマの検索は培養上溝中の
抗体価をイムノアッセイで行うことができる。この方法
で選択された穴には２伸以上のハイブリドーマのクロー
ンが存在する可能性があるので、クローニングにより単
クローン（モノクローン）にする。クローニング方法と
しては、例えば限界希釈法で行うことができる。即ち、
各大当たり０．５〜５個になるように希釈して９６穴培
養皿に分注して培養後、コ１コニ−が出現したら大当た
り１個のコロニーのみしか存在しない穴のハイブリドー
マを選び、上記と同様の操作を繰り返しモノクローンを
得ることができる。以上の方法により抗リパーゼモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを作製すること
ができる。

本発明の抗リパーゼモノクローナル抗体は上記で得たハ
イブリドーマを培養して大量に得ることができる。培養
法としては培地を用いて培養容器で培養してその上溝液
から抗体を採取する方法、またはバイプリドーマを１０
’〜１０７個、同系の動物の腹腔内に投与し、ハイブリ
ドーマが増殖した時に血）Ｓおよび腹水を採取する方法
がある。

このようにして得られた抗体は必要に応じて精製して使
用することができる。即ち、硫安分画、イオン交換、ア
ブィニティクロマトグラフィ等の手段で精製することが
できる。

次に、本発明を実施例により具体的に説明する。

５）実施例と参考ηす 参考例Ｉ Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｓら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅ
ｔ　８ｉｏｐｔ＋ｙｓｉｃａＡｃｔａ、３Ｉｎ、２５７
　（１９７４）の方法に従って、ヒト膵液よりＤ　Ｅ　
Ａ　Ｅ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム、ＣＭ−ｃｅｌｌｕ
ｌｏｓｅカラム、５ｅｐｌ＋ａｄｅｘ　Ｇ−７５カラム
により精製を行い、抗原としてリパーゼを得た。

参考例２ ６退動の８ＡＬＢ／Ｃマウスに参考例１て得た１００尾
のリパーゼをフロイントコンプリードアシュバンドと１
：ｌに混和乳化し、腹腔に投与し、２週間毎に同様に投
与した。２ケ月後リパーゼ１００尾を静注して追加免疫
し、静注３日後に牌臓を取り出し、ＨＡＮＫＳ培地にほ
ぐして洗浄し、血清無添加ＲＰＭＩ　１６４０培地に懸
濁した。他方、マウスのミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ
８−１３・５・３）を培養し対数増殖期にある細胞を集
め、血清無添加ＲＰＭＩ　１６４０培地に！！ｊ濁した
。ミエローマ細胞１０　個とｇｌ！細胞細胞ｌ個を混和
し、遠心分離により細胞を集めた後、５０ｖｏ１．％の
ＰＥＧ４０００を１ｍｌ徐々に加え、攪拌した後、血清
無添加ＲＰＭＩ　１６４０培地を徐々に加えてＰ　Ｅ　
Ｇ　４０００を希釈した。遠心分離によりＰＥＧ溶液を
除き、ＨＡ　Ｔ培地１０ｍ１を加えて９６穴培養皿に各
穴０．１　ｍｌずつ分注した。４日後に、ＨＡＴ培地を
０．１　ｍｌずつ添加し、３日毎に半量分の培養液を捨
て、新しいＨＡＴ培地を加えた。１４日後には９６穴中
９６穴でハイブリドーマの生育が認められたので、その
抗体産生能をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で検出した。即ち、抗原
のリパーゼを９６穴マイクロタイタープレートに吸着さ
せ培養上清を添加した後、アルカリ性ホスファターゼを
標識した第二抗体を加えて検出することにより、７個発
色するものが認められ、そのうち、特に発色度の高い３
株を選択し２４穴培養皿ヘハイブリドーマを移行した。

この時４適齢ＢＡＬＤ／Ｃマウスより調製した牌細胞１
０７個を添加したＨＴ培地（ＨＡ　Ｔ培地よりアミノプ
テリンを抜いたもの）１ｍｌを同時に添加した。３日後
にＨＴ培地を１ｍｌずつ添加し５日後に上述の方法にお
いて抗体産生能を確認後、９６穴培養皿に０．５〜５個
／大の割合で細胞を希釈して培養する限界希釈法により
クローニングを行い、ハイブリドーマＭＬ−１を得た。

実施例１ 参考例２で得たハイブリドーマＭＬ−１を１５ｖｏ１．
％の牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ　ｌＧ４０培地て培
養し、細胞濃度１０　個／ｍｌとなった上清液を採取し
て抗リパーゼモノクローナル抗体を得た。

次にハイブリドーマＭＬ−１，１ｘ１０７個を２．６．
１０．１４−テトラメチルペンタデカン０．５ｍｌを投
与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与し、１４日後に
血清０．７ｍｌ／匹および腹水５ｍ１／匹を採取し、抗
リパーゼモノクローナル抗体を得た。

上記二つの抗体はヒトリパーゼと反応し、かつＥＩＡ（
酵素免疫測定法）に適応可能であった。

参考例３ 参考例１て得たリパーゼを用いて、参考例２と同様に別
のＢＡＬＢ／Ｃマウスて免疫、融合しクローニングして
ハイブリドーマＭＬ−２，ＭＬ−３を得た。

実施例２ 参考例３で得たハイブリドーマ２種を実施例１と同様に
培養し、その上清澄より抗リパーゼモノクローナル抗体
２種を得た。　これらの抗体はいずれもヒトリパーゼと
反応し、かつＥＩＡに適応可能であった。

６）発明の効果 実施例、参考例の項より明らかな如く、本発明より得た
ハイブリドーマを培養して大量に得た抗リパーゼモノク
ローナル抗体はヒトリパーゼと反応し、かつＥＩＡに適
応可能であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）リパーゼと抗原抗体反応特異性を有するモノクロ
   ーナル抗体（以下抗リパーゼモノクローナル抗体という
   。）
2. （２）抗リパーゼモノクローナル抗体を産生するハイブ
   リドーマを培養し、培養物から抗リパーゼモノクローナ
   ル抗体を採取することを特徴とする抗リパーゼモノクロ
   ーナル抗体の製造方法。