DK169586B1 - Histil ukendt rottemyelomacellelinie, hybridcellelinie afledt deraf, in vitro cellekultursystem og cellefusionssystem omfattende celler herfra, fremgangsmåde til fremstilling af en hybridcellelinie samt fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer - Google Patents

Description

i DK 169B86 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt rottemyelomacel-lelinie, en hybridcellelinie afledt deraf, et in vitro cellekultursystem og et cellefusionssystem omfattende celler herfra, en fremgangsmåde til fremstilling af en hybridcellelinie samt en fremgangsmåde til fremstil -5 ling af monoklonale antistoffer.

Man har fornylig rettet opmærksomheden mod fremstilling af antistoffer ud fra cellelinier fremkommet ved cel!efusionsteknikker fra en passende parentalcellelinie. Fremgangsmåden er blevet anvendt ved én af flere musemyelomacellelinier, som forældrecellelinien, der sammensmeltes 10 med celler fra immuniserede mus eller rotter til frembringelse af en hybridmyeloma, som derefter dyrkes for derved at fremstille antistoffer mod det ved immuniseringen anvendte immunogen. Den særlige fordel ved denne fremgangsmåde er, at den kan anvendes til fremstilling af stærkt specifikke antistoffer under anvendelse af ikke rensede immunogener.

15 Skønt fremgangsmåden har tilvejebragt et vigtigt nyt værktøj til anvendelse inden for immunologien, har den hidtil lidt af visse begrænsninger hidrørende fra arten af de tilgængelige parentalcellelinier.

Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en ny cellelinie til anvendelse ved fremstilling af monoklone antistof-20 fer med visse fordele i forhold til musemyelomacellelini erne, som i øjeblikket er disponible til dette formål.

Den foreliggende opfindelse omfatter følgelig en rottemyelomacelle-linie med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3.

Cellelinien ifølge den foreliggende opfindelse har adskillige for-25 dele i forhold til musemyelomacelleli ni erne. In vivo dyrkningen af en hybridcellelinie til fremstilling af antistoffer har visse fordele i sammenligning med in vitro vævsdyrkningsmetoder indbefattende de signifikant højere niveauer af antistof pr. ml, som opnås i animalsk serum i sammenligning med et dyrkningsmedium. Det må af flere grunde foretrækkes 30 at anvende rotter til in vivo dyrkningen frem for mus, f.eks. er udbyttet af serum og ascitesfluidum højere, kuldene er i almindelighed større, og rotter kan bedre end mus respondere på antigenstimulation. Desuden er rotter nødvendige til fremstilling af monoklonale xenogene anti-muse- og allogene anti-rotte-antistoffer, men vi er nået frem til, at 35 hybridceller fremstillet ved kombination af celler fra immuniserede rotter med en musemyeloma forældrecellelinie ikke let dyrkes i hverken mus eller rotter. Desuden kan rottecellelinien ifølge den foreliggende opfindelse have fordele ved visse heterologe fusioner, såsom med kanin- 2 DK 169586 B1 eller menneskeceller.

Skønt en rottemyelomacellelinie er blevet beskrevet i litteraturen, har vi fundet denne helt uegnet til brug som forældrecellelinie ved fremstillingen af monoklonale antistoffer, og det var nødvendigt at un-5 derkaste denne cellelinie en omfattende udvælgelsesproces og/eller mutation for at fremstille cellelinien ifølge den foreliggende opfindelse. Udgangspunktet for fremstillingen af den foreliggende cellelinie var den 8-azaguanin-resi stente mutant 210.RCY3.Agl af rottemyelomatumoren S210 (Cotton og Milstein, Nature, 1973, 244, 42). Denne mutant blev indled-10 ningsvis undersøgt for evne til at smelte sammen med normal eller immuniseret rottemilt og gav skuffende resultater. Ikke desto mindre subklo-nedes cellerne to gange i blød agar, og klonen Y3-Ag 1.2.3 udvalgtes endelig til yderligere undersøgelse, hvilket ikke gav nogen revertanter, når portioner på 10^ celler undersøgtes. Imidlertid var denne klons fu-15 sionseffektivitet i begyndelsen fortsat utilfredsstillende, og den blev derfor dyrket kontinuerligt i en såkaldt spinnerkolbe og undersøgt for fusionseffektivitet på forskellige tidspunkter. Det var først efter en dyrkningsperiode på 5 måneder omfattende såvel perioder med lav som med høj celletæthed, at cellelinien ifølge den foreliggende opfindelse, som 20 viste gode fusionsegenskaber, opnåedes. Cellelinien blev deponeret ved C.N.C.M. hos Institut Pasteur i Paris den 9. januar 1979, hvor depotet er identificeret ved C.N.C.M.-nummeret 1-078. Et reserveforråd af cellelinien betegnet som Y3-Ag 1.2.3 opbevares ved MRC's Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, England, hvorfra en er-25 statningskultur vil kunne fås fra Dr. C. Milstein.

I det følgende benyttes betegnelsen 1-078 sideløbende med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 for rottemyelomacellel i ni en ifølge opfindelsen.

Cellelinien ifølge den foreliggende opfindelse har samme generelle morfologi som forældrelinien 210.RCY3.Agl, idet den omfatter små ikke-30 runde celler, som er tilbøjelige til at gro i klumper, men i almindelighed med bedre vækstegenskaber end forældren. Desuden er den, ligesom forældrelinien, resistent over for 8-azaguanin, den producerer og afsondrer en unik let kæde af kappa-type med kodebetegnelse S210, og den dør i hypoxanthin/aminopterin/thymidin (HAT) medium. Linien har natur-35 ligvis også den særlige yderligere egenskab, at den vil undergå vellykket sammensmeltning med rottemiItceller på et godt effektivitetsniveau, som i almindelighed ligger i intervallet fra 1 pr. 10 til 10 celler. Cellerne i rottecellelinie nr. 1-078 ser meget mindre ud end muse-P3- DK 169586 B1 3 X63-Ag8 myelomacell er, idet de tidligere vækststadier er mindre tydelige under mikroskopet. (Dette gælder også for nogen, men ikke alle de fra cellerne 1-078 afledte hybridceller). Rottecelleliniens kloningsevne i blød agar er god, idet linien og dens rotte-rotte hybrider i al mi ndelig-5 hed afføder temmelig diffuse kloner i sammenligning med de tætte kloner, som fås ved muselinien og dens muse-muse hybrider.

1-078 cellerne kan opbevares i flydende nitrogen og kan dyrkes i forskellige former for næringskulturmedium. Den foreliggende opfindelse angår følgelig også et in vitro cellekultursystem omfattende celler af 10 rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 i et næringsmedium derfor. Selv om et sådant cellekultursystem er et in vitro system, hvor kulturmediet er et i det væsentlige syntetisk medium, kan det naturligvis indeholde ingredienser stammende fra en naturlig kilde, såsom serum. Eksempler på sådanne kulturmedier er Dulbecco's modifikation af Eagle's 15 "minimum essential medium" (kan f.eks. fås fra Gibco Biocult Ltd., Paisley, Scotland) med et serumsupplement såsom 10% eller mindre kalvefoster- eller varmeinaktiveret hesteserum eller alternativt under anvendelse af Iscove-modifikationen, som ikke indeholder serum. Med en mindre tilpasningsperiode kan de i et sådant medium dyrkede celler dyrkes i an-20 dre medier, såsom "RPMI 1640" med kalvefosterserum og forskellige andre medier, som er almindeligt anvendt ved celledyrkning og beskrevet i litteraturen inden for dette område.

Cellelinien ifølge den foreliggende opfindelse er af speciel nytte ved fremstillingen af hybridcellelinier, som kan anvendes til fremstil-25 ling af monoklonale antistoffer.

Opfindelsen omfatter endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en hybridcellelinie, som er ejendommelig ved, at den omfatter, at man sammensmelter celler af rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 med milt- eller andre immunocytceller fra et dyr, som er sensibi-30 liseret over for et immunogen, under anvendelse af et middel, som fremmer fusionen af disse celler. De sensibiliserede immunocytceller kan tages fra forskellige kilder, men det har vist sig, at de bedste resultater fås ved anvendelse af rotteceller frem for celler fra en anden vært, såsom mus, etc. Sensibilisering af immunocytcellerne kan finde 35 sted normalt, dvs. gennem naturligt forekommende immunisering, men det foretrækkes at fremstille dem gennem direkte immunisering, idet det krævede immunogen administreres til værtsdyret. Efter fusion anvendes kloning og subkloning så bekvemt til udvælgelse af én eller flere passende 4 DK 169586 B1 hybrider.

Opfindelsen omhandler endvidere et in vitro cellekultursystem, som er ejendommeligt ved, at det omfatter celler af rottemyelomacelleli ni en med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 i et næringsmedium derfor, og et in vitro 5 cellekultursystem, som er ejendommeligt ved, at det omfatter celler af en hybridcel lelinie afledt af celler fra rottemyelomacelleli ni en med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 ved fusion heraf med immunocytceller fra et dyr, som er sensibiliseret over for et immunogen, i et næringsmedium derfor.

Fusionen mellem egnede immunocyter og cellerne i cellelinien kræver 10 i almindelighed sammenblanding i et passende medium indeholdende et middel, som fremmer fusionen. Den foreliggende opfindelse omfatter således et cellefusionssystem, som er ejendommeligt ved, at det omfatter celler af rottemyelomacelleli ni en med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 og immunocytceller fra et dyr, som er sensibiliseret over for et immunogen, f.eks.

15 miltceller fra en mus eller især en rotte, i et .næringskulturmedium derfor sammen med et middel, som fremmer fusionen af disse celler. Et sådant kulturmedium er bekvemt et syntetisk medium, selvom det naturligvis om ønsket kan indeholde ingredienser fra en naturlig kilde. En sådan mulighed er imidlertid mindre sandsynlig i dette tilfælde, idet det fore-20 trækkes, at serum ikke er til stede i mediet. Eksempler på sådanne kulturmedier er Eagle's "minimum essential medium" og dets Dulbecco-modifi-kation samt "RPMI 1640" og forskellige andre medier, som er almindeligt anvendt ved celledyrkning og beskrevet i litteraturen inden for dette område. Skønt der kan anvendes forskellige fusionsmidler, f.eks. et vi-25 rus såsom Sendai-virus, foretrækkes polyethylenglycol, f.eks. PEG 1500. Cellefusion med disse midler er dokumenteret i litteraturen og illustreret i de ledsagende eksempler, men som vejledning kan det nævnes, at der ofte anvendes fra ca. 40 til ca. 55% polyethylenglycol, idet den optimale koncentration afhænger af molekylvægten, f.eks. ca. 50% ved PEG 1500, 30 og at der om ønsket kan sættes dimethyl sul foxid til polyethylenglycolen. Isoleringen af hybridcellelinien kan bekvemt understøttes ved erstatning af det oprindelige medium med HAT medium, som er toxisk over for foræld-recellelinien, men ikke i almindelighed toxisk over for hybridcellelinien.

35 Som antydet ovenfor kan immunocytceller sensibiliseret over for det krævede immunogen fås ved hjælp af alternative fremgangsmåder. De kan således bekvemt fås enten ved udvælgelse af naturligt forekommende immunocyter af den krævede type eller ved fremgangsmåder beskrevet inden for DK 169586 B1 5 området omfattende, at man til dyret administrerer en serie doser af im-munogenet, i de tilfælde, hvor det er hensigtsmæssigt sammen med et ad-juvans, såsom Freund's adjuvans, efterfulgt af udvinding af milten eller andre immunocytceller. Anvendelsen af naturligt forekommende immunocyter 5 er af speciel interesse i det tilfælde, man tænker sig at anvende menne-skeimmunocytceller, hvor administrering af immunogenet kan være mindre attraktiv, og de gennem en infektion, som patienten har fået, naturligt fremstillede immunocyter kan være mere passende. Et område, som er af speciel interesse i relation til naturlige immunocyter, er fremstilling-10 en af autoantistoffer.

Opfindelsen kan bringes til anvendelse på immunocyter fra direkte eller naturligt immuniserede dyr, som er sensibiliseret over for et bredt spektrum af immunogener indbefattende antigener, såsom proteiner og glycoproteiner, oligo-.og polysaccharider, liposaccharider, haptener 15 og lignende, f.eks. peptider, neurotransmittere oghormoner. Immunogener, som er overflademarkører, og som er afledt fra neoplastisk materiale, især faste tumorer, er af betragtelig interesse, men opfindelsen kan også bringes til anvendelse på bakterie- og virus-antigener og på immunogener afledt af protozoer og svampe.

20 Den foreliggende opfindelse indbefatter således yderligere en hy bridcellelinie, som er ejendommelig ved, at den er afledt af celler fra rottemyelomacellelinien med betegnelsen V3-Ag 1.2.3 ved fusion heraf med milt- eller andre immunocytceller fra et dyr, f.eks. fra en mus eller især fra en rotte, som er sensbil i seret over for et immunogen.

25 Hybridcellerne kan bekvemt dyrkes i samme generelle type kulturme dium som forældrecellerne og som diskuteret tidligere heri.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af mo-noklonale antistoffer, der er ejendommelig ved, at den omfatter, at man dyrker celler af en hybridcel 1 el i ni e ifølge opfindelsen i et in vitro 30 eller in vivo dyrkningsmedium derfor og derefter, om ønsket, isolerer antistofferne fra mediet.

Den anvendte hybrideel 1 elinie ifølge opfindelsen kan være fremstillet ved fusion af celler af rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 med immunocytceller, som er sensibiliseret over for et immuno-35 gen.

Til fremstillingen af de monoklonale antistoffer inokuleres hybridcellerne bekvemt i en rotte til frembringelse af en fast eller ascitisk tumor. Efter en passende vækstperiode dræbes dyret, og ascites og/eller 6 DK 169586 B1 serum opsamles til isolering af antistoffet, bekvemt ved fremgangsmåder, som er beskrevet inden for området til et sådant formål. Sådanne fremgangsmåder indbefatter præcipitation, dialyse, kromatografi indbefattende anvendelse af immunoadsorbenter, og anvendelse af membranfiltre.

5 Den foreliggende opfindelse omfatter således også en fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer, der er ejendommelig ved, at man inokulerer en rotte med hybridcellelinien ifølge opfindelsen til frembringelse af en fast eller ascitisk tumor, og derefter isolerer antistofferne fra rottens serum eller ascitesfluidum.

10 Skønt en sådan in vivo produktion af antistoffer har visse specielle fordele som tidligere beskrevet i sammenligning med in vitro produktion, er der visse anvendelser for antistoffer, som snarere er af immunologisk end af kemisk natur, hvor arten snarere end niveauet af urenheder, som stammer fra in vivo fremstilling, kan betyde, at in vitro frem-15 stilling foretrækkes. I andre tilfælde kan dette være nødvendigt, fordi cellerne ikke gror in vivo. Eksempler på egnede vævskulturfremgangsmåder indbefatter massiv vækst i såkaldte spinner-beholdere og andre kendte massekulturfremgangsmåder, som er vel dokumenteret inden for området.

Desuden må det bemærkes, at vævskultur har fordelen ved større teknisk 20 enkelhed i sammenligning med anvendelsen af dyr, men dette udlignes sædvanligvis af de lavere udbytter og den forøgede målestok, der som følge deraf er nødvendig. I almindelighed kan der anvendes rensningsprocedurer lig dem, der er omtalt ovenfor for antistoffer fremstillet ved in vivo metoder.

25 De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede antistoffer har forskellige anvendelser inden for terapi, og især inden for diagnostik, og også ved sådanne fremgangsmåder som affinitetskromatografi. Det mod Fd-fragmentet rettede antimuse-IgG monoklonale antistof, som beskrives senere, er et eksempel på en monoklonalt antistof-producerende hy-30 brid, som tilvejebringer et reagens, der er anvendeligt som andet antistof i indirekte bindingsanalyser og andre sandwich-fremgangsmåder. Andre monoklonale antistoffer, som kan fremstilles, indbefatter antistoffer til forskellige tumorceller af human oprindelse, som genkender subpopulationer af menneskeceller, og som er af potentiel anvendelighed ved hæ-35 matologisk diagnose. En anden type anvendelse eksemplificeres ved anvendelsen af et antistof over for et naturligt forekommende stof, såsom et protein til rensning af det pågældende stof.

Cellelinien ifølge den foreliggende opfindelse har bevist, at den DK 169586 B1 7 er særlig værdifuld til udvinding af antistofproduktionsaktivitet i højt udbytte. I et eksperiment blev hybrider opnået fra cellelinien ved fusion af denne med miltceller af en immuniseret rotte således analyseret for evne til at udskille Ig, som var forskellig fra myeloma-forældren, 5 hvilket blev foretaget ved SDS-PAGE-analyse af de udskilte produkter. Ud af 12 undersøgte kulturer (alle sandsynligvis monoklonale) udskilte 11 Ig-kæder, og kun én udskilte ikke kæder, som var forskellige fra myeloma-forældren, således at over 90% af de undersøgte kulturer udskilte nye immunoglobuliner. Desuden er der i almindelighed blevet opnået niveauer 10 på mindst 80% med cellelinien ifølge den foreliggende opfindelse, hvilket er højere end den værdi, der er opnået for det af Kohier og Milstein i European Journal of Immunology, 1976, 6, 511, beskrevne musesystem, som sjældent giver højere niveauer end 50%, idet det samlede niveau, der normalt opnås, er 40-60%.

15 Den foreliggende opfindelse illustreres i det efterfølgende nærmere ved eksempler.

Eksempler DMM-10% FCS, der anvendtes i eksemplerne, fremstilledes ved sammen-20 blanding af følgende ingredienser.

500 ml "Dulbecco MEM" (med 4500 mg glucose/liter, uden natriumpyru-vat. Gibco-Biocult katalog nr. 320-1965). 5 ml natriumpyruvat MEM 100 mM (Gibco-Biocult katalog nr. 320-1360). 10 ml penicillin/-25 streptomycin, 5000 enheder penicil1in/5000 mcg streptomycin/ml.

(Gibco-Biocult katalog nr. 600-5070). 50 ml kalvefosterserum udvalgt fra forskellige portioner (Sera-Lab katalog nr. 5-000-ia).

DMM-HS og medium D fremstilles på lignende måde, men ved hhv. at 30 erstatte kalvefosterserum med hesteserum eller at udelade det.

Eksempel 1

Fremstilling af rottemyelomacellelinie 1-078

Indholdet af en frisk flaske frosne 210.RCY3-Ag.l celler dyrkedes 35 ved 37°C i en plastflaske indeholdende "Eagle's minimum essential medium" - Dulbecco's modifikation (DMM) suppleret med 10% varmeinaktiveret hesteserum (HS) og en atmosfære af 10% - 90% luft. Efter 3 ugers dyrkning suspenderedes 500 celler, taget ved logaritmisk vækst, i 2 ml 8 DK 169586 B1 DMM indeholdende 10% HS og 0,25% agar ved 37°C, og suspensionen udlagdes på 15 ml DMM indeholdende 10% HS og 0,5% agar størknet på en vævskultur Petri-skål med en diameter på 9 cm. Cellerne inkuberedes så i 2 uger ved 37°C i en atmosfære mættet med vand og indeholdende 7% CO2 i luft. De 5 tyve hurtigst groende af de opnåede kloner blev udtaget og overført til dyrkningsskåle, hvorefter de undersøgtes for resistens over for 8-aza-guanin og evne til at producere og udskille den lette S210-kæde. På denne basis udvalgtes én klon (Y3-Ag.l.2), og hele fremgangsmåden blev gentaget til isolering af en subklon (Y3-Ag.l.2.3).

10 Denne subklon dyrkedes i en dyrkningskolbe ved 37eC på DMM supple ret med 10% HS, og da den voksede kraftigt (1 uge), overførtes den til en 1-liter spinnerkolbe indeholdende samme medium og en atmosfære af 10% CO2 - 90% luft. Efter 3 måneders kontinuert vækst i spinnerkolben anbragtes ca. 10 ml af kulturen i en kulturflaske, og mediet erstattedes 15 langsomt med DMM suppleret med 10% FCS (kalvefosterserum) i løbet af 2 uger. Kulturen overførtes så til en spinnerkolbe, og cellerne dyrkede kontinuert i yderligere 2 måneder omfattende forskellige vækstperioder 4 6 ved meget lave (ca. 10 celler/ml) og høje (ca. 1 til 2 x 10 celler/ml) celletætheder. Cellernes fusionseffektivitet undersøgtes på forskellige 20 stadier under fremgangsmåden, og en synlig forbedring bemærkedes i den sidste vækstmåned.

På stadiet 5 måneders vækst i kolben ved 37eC blev et antal prøver,

C

hver indeholdende 2 til 5 x 10 celler, udtaget og frosset i nærværelse af 10% dimethyl sul foxid (DMS0) og 90% FCS ved en temperaturgradient på 25 ca. Γ for hver 2 minutter. Dette er de celler, som er deponeret ved C.N.C.M. under nummeret 1-078.

Fusioner gennemføres bedst under anvendelse af kulturer, der er dyrket logaritmisk i mindst 2 uger. Med henblik på brug tøes celler af en oprindelig prøve eller af friskfremstillede nyfrosne forråd hurtigt 30 og fortyndes til 10 ml med DMM indeholdende 10% FCS, centrifugeres, re-suspenderes i 10 ml DMM indeholdende 10% FCS og dyrkes i en kulturkolbe som tidligere beskrevet i overensstemmelse med de ovenfor anførte kriterier. Kulturer dyrket i tidsrum på over 6 måneder har ikke vist forringelse af fusionseffektivitet og kan endog udvise en forbedring deri, men 35 for det formål at bibeholde cellelinien uden afvigelse anvendes opbevaring under flydende nitrogen frem for kontinuert vækst.

DK 169586 B1 g

Eksempel 2

Fremstilling af hybrid mellem cellelinie 1-078 og miltceller fra en rotte hyperimmuniseret med muse-IgG

Rotter af DA-stammen immuniseredes ved fem trædepudeinjektioner med 5 3 ugers intervaller med 100 μg muse-IgG i komplet Freund's adjuvans og blev indgivet en intravenøs booster-injektion med samme mængde IgG i saltvand uden adjuvans fire dage før fusion. Miltceller fra rotterne blev først forberedt til fusion i Dulbecco's phosphat-pufrede saltvand (PBS) indeholdende 2% kalvefosterserum (FCS). Cellerne vaskedes så med 10 Dulbecco's modificerede medium i fravær af serumsupplement (medium D), o η og 10 miltceller blandedes med 5 x 10 celler af cellelinien 1-078 suspenderet i medium D. Blandingen centrifugeredes i et 50 ml konisk plastrør ved 600 g i 7 minutter, og supernatanten fjernedes så, og cellepillen splittedes, ved at man blidt slog på bunden af røret. Videre 15 operationer gennemførtes ved ca. 37eC. En 1 ml pipette indeholdende 0,8 ml 50% polyethylenglycol (PEG) 1500 (frisk fremstillet eller opbevaret i mørke) i medium D (pH 7,6-7,8 indikeret med phenol rødt) anvendtes til blidt at suspendere cellerne, mens opløsningen tilsattes i løbet af 1 minut. Suspensionen blev holdt på 37°C i 1 minut, og 1 ml medium D til -20 sattes i løbet af endnu et tidsrum på 1 minut. Så tilsattes yderligere 20 ml medium D i løbet af 5 minutter, og cellerne centrifugeredes og re-suspenderedes blidt i Dulbecco's modificerede medium (DMM) indeholdende 20% FCS. Suspensionen fordeltes i 48 x 2 ml brønde i "Linbro BCL-5041" bakker. Efter 24 timers forløb erstattedes halvdelen af mediet med HAT-25 holdigt medium (Littlefield, Science, 1964, 145, 709). Denne operation blev gentaget de to efterfølgende dage og derefter hveranden dag.

Kraftig vækst i en brønd efter 13-15 dages forløb blev taget som tegn på én eller flere vellykkede hybridkloner. Kun seks af subkulturerne viste hybridvækst. Det brugte medium fra hver hybridkultur undersøg-30 tes ved indirekte hæmagglutinering af røde blodlegemer fra får (SRBC), som var blevet sensibiliseret med forskellige monoklonale museantistof-

O

fer, der er specifikke for SRBC, ved følgende fremgangsmåde: 2,5 x 10 SRBC blev ved inkubation i 1 time ved stuetemperatur belagt med 5 ml kultursupernatanter af anti-SRBC hybrid-myelomaer (Kohier og Milstein, 35 European Journal of Immunology, 1976, 6, 511) minimalt fortyndet for at undgå agglutinering. De belagte SRBC centrifugeredes ned, og pillen re-suspenderedes i 2,5 ml PBS. Lige store dele på 25 /il fordeltes i V-bund mi krotiter-bakker, og 25 μΐ supernatant fra hybridkulturen sattes til 10 DK 169586 B1 hver brønd. Efter inkubation i 1 time centrifugeredes pladen ved 200 g i 4 minutter og blev derefter holdt i en 45° hældning i 30-60 minutter.

På denne måde udvalgtes én kultur (YA 2/40), som var klart positiv, når SRBC blev belagt med Sp3 (et IgGl), men negativ ved belægning med Sp2 5 (et IgG2b) eller Spl (IgM). Denne positive hybrid klonedes i blød agar, og otte individuelle kloner udvalgtes. Alle disse kloner viste sig at være positive ved undersøgelse med Sp3-belagt SRBC. For hver af de otte kloner blev det ved klonen udskilte antistof mærket internt ved at cel-lerne i 24 timer inkuberedes med C-lysin. Supernatanterne analyseredes 10 så som beskrevet af Kohier og Milstein, ibid, under anvendelse af natri-umdodecylsulfatpolyacrylamid (10%) gelelektroforese (SDS-PAGE) efter total reduktion og i soelektrisk fokusering (IEF). Alle kloner så ud til at være identiske, idet de åbenbarede en tung kæde med en mol vægt på ca.

50.000 og et enkelt bånd i letkædezonen (i modsætning til forældrecel-15 lelinien, som manglede båndet for tung kæde). Det var ikke muligt at vise tilstedeværelsen af to separate forventede lette kæder (myeloma parental og antistof specifik) sandsynligvis i kraft af, at de har lignende mobiliteter. Tre af de otte kloner klonedes igen for at sikre renhed og forøge stabiliteten. En af subklonerne, betegnet YA2/40H(LK) udvalgtes 20 til nærmere undersøgelse af egenskaber som nedenfor beskrevet.

Egenskaber af hybridcellelinie YA2/40H(LK) 3

Binding af det internt [ H-Lys] mærkede antistof YA2/40 til celler belagt med forskellige klasser anti-SRBC antistof viste, at hybriden 25 genkendte adskillige muse-IgG, men ikke tre IgM-myelomaer. Binding til Spl (IgM) belagte celler gav samme værdi som baggrundsbindingen til ik-ke-belagte celler, mens binding til Sp3 (Iggl) og Sp2 (Igg2) belagte celler var hhv. 4,9 og 35 gange baggrunden, en forskel, som korrelerer med antallet af antigeniske positioner genkendt med Sp2 og Sp3 (antallet 30 af antigeniske positioner genkendt med Spl er en mellemting mellem Sp2 og Sp3).

Belægning med Sp2 gav en følsom fremgangsmåde til analyse for binding af [^H] YA2/40H(LK), og yderligere specificitetsundersøgelser blev foretaget ved inhibering af denne binding. Disse undersøgelser bekræfte-35 de, at hybriden genkendte proteiner fra både γΐ og 72 underklasserne af IgG. Inhiberingen var mindst 50 gange mindre effektiv ved IgM, selvom der ved høje proteinkoncentrationer blev iagttaget nogen inhibering, sandsynligvis på grund af IgG urenheder i præparatet. Inhiberingsunder- 11 DK 169586 B1 søgelser med MOPC 21 og dens varianter IF1 (som mangler CH3-området) og IF2 (som mangler CHl-området) og også med F (ab')2-fragmentet af MOPC 21 (som mangler CH2- og CH3-områderne) viste, at den antigeniske determinant i IgGl befinder sig i CHl-regionen.

5 I artsspecificitetsundersøgelser viste det monoklone antistof YA2/40 sig at være fuldstændig negativt over for menneske-, heste- eller rotteserum, men viste nogen grad af krydsreaktion med kaninserum. Derimod krydsreagerede det ganske effektivt med marsvineserum. Dette krydsreaktionsmønster mellem de forskellige IgG-arter viser, at den antigeni-10 ske determinant involverer en lighed i lokal struktur mellem marsvinet og de forskellige muse-underklasser, som imidlertid afviger fuldstændigt fra mennesket, hesten og rotten.

Eksempel 3 15 Fremstilling af hybrid mellem cellelinie 1-078 og miltceller fra DA-rot-te immuniseret med celler fra AO-rotte

En rotte af DA-stammen immuniseredes med celler fra en AO-rotte under anvendelse af en fremgangsmåde lig den, der er beskrevet i Eksempel 2 for immunisering med muse-IgG. Miltceller fra rotten sammensmeltedes 20 så med cellelinien 1-078, igen under anvendelse af en fremgangsmåde lig den, der er beskrevet i Eksempel 2, idet kulturen deltes i 96 celler og fik lov til at gro i 4 uger i selektivt medium. Hybriderne af de forskellige kulturer analyseredes ved deres evne til at udskille Ig forskellig fra myeloma-forældren under anvendelse af SDS-PAGE analyse. De 25 opnåede resultater er vist i Tabel I nedenfor.

30 35 12 DK 169586 B1

Tabel I

Præferencefiksering af hybrid immunoglobulinudskillelsen phenotype efter fusion med rottemyelomalinien 5 _

Antal kulturer 96

Kulturer, der viser vækst af hybrider 17 10 Antal, der viser udskillelse af Y3-lignende let kæde* 11

Antal, der viser udskillelse af Ig-kæder, •som er forskellige fra Y3* 11 15

Antal, der viser udskillelse af Y3 let kæde 1 i fravær af Ig-kæder* *

Kun 12 af de hybridvisende kulturer undersøgtes ved SDS-PAGE-20 analyse af udskilte produkter, da 5 af kulturerne havde et antal celler, som var utilstrækkeligt til en meningsfyldt undersøgelse.

Eksempel 4

Fremstilling af hybrider mellem cellelinie 1-078 og miltceller sensibi-25 liseret på forskellig måde

Under anvendelse af en lignende fremgangsmåde som den i Eksempel 2 beskrevne er der blevet fremstillet forskellige hybridcellelinier, som giver antistoffer mod forskellige mål indbefattende knoglemarvceller, celler fra neoplastisk materiale, komplementceller og medikamenter. Dis-30 se hybrider og de væsentligste træk ved deres fremstilling er summeret i den efterfølgende Tabel II. I denne tabel angiver de forskellige overskrifter det til frembringelse af de sensibiliserede miltceller anvendte immuniseringsmiddel, antallet af subkulturer af hybrider, der viser aktiv vækst, antallet af sådanne subkulturer, som viser positiv aktivitet 35 over for immuniseringsmidlet, antallet af kloner isoleret fra disse subkulturer og endelig antistofmålet for disse kloner, som i almindelighed svarer til det anvendte sensibiliseringsmiddel.

13 DK 169586 B1

Tabel II

Sensibiliserings- Vellykket Positive Isolerede Antistofmiddel vækst kulturer kloner mål 5 _

Menneske- 80/96 4-5 3 Menneskekomplement (C3) komplement (C3)

Museknoglemarv- 62/64 >35 21 Museknogle- 10 celler marvceller

Human B celler 96/96 >30 6 Human B

(Daudi) (til dato) celler (Daudi) 15 Human colon 7/48 4 3 Human colon carcinoma carcinoma

Protein-koblet 18/24 1 isolering serotonin serotonin igang 20 _

Eksempel 5

In vivo fremstilling af monoklonalt antistof over for muse-IgG

(1) YA/40H(LK) celler fremstillet som beskrevet i Eksempel 2 dyr- 25 kes som faste tumorer i FI (Lou X DA) rotter ved subkutan injektion af 5 x 107 celler. Efter ca. 10 dages forløb begynder en tumor at vise sig på injektionsstedet. Når et dyr begynder at vise tegn på lidelse, aflives det ved total åreladning fra arterierne efter total anæstesi. Det opsam- lede blod får lov til at koagulere i 30 min. ved 37eC, og serumet klares 30 så ved centrifugering. Serumudbyttet er typisk mellem 5 og 10 ml pr. dyr, og serumet indeholder 10 til 15 mg/ml IgG målt ved radial immunodiffusion, hvilket gav anledning til en fremtrædende myeloma-båndkompo-nent ved celluloseacetatelektroforese.

(2) I en variant af ovenstående fremgangsmåde dyrkes tumoren som 35 en ascitisk tumor til tilvejebringelse af såvel blod som ascitesfluidum som antistofkilde. Tumoren frembringes ved en intraperitoneal injektion af 0,5 ml pristan ca. 2 uger før den intraperitoneale injektion af 5 x 107 celler. Når et dyr begynder at vise tegn på lidelse, aflives det, 14 DK 169586 B1 blodet opsamles og behandles som ovenfor, og ascitesfluidum tages fra det døde dyr efter kirurgisk frilæggelse af abdominal kaviteten. Udbyttet af ascitesfluidum er typisk ca. 10 ml pr. dyr, og fluidet indeholder 5 til 10 mg/ml IgG.

5 Serumet og/eller ascitesfluidet opnået ved (1) og (2) ovenfor kan renses yderligere til en efter den påtænkte brug passende grad ved hjælp af kendte fremgangsmåder beskrevet inden for området, f.eks. ved de i Eksempel 6 beskrevne fremgangsmåder.

10 Eksempel 6

In vitro fremstilling af monoklonalt antistof over for muse-IgG

YA2/40H(LK) celler fremstillet som beskrevet i Eksempel 2 tilpasses til vækst i nærværelse af en minimal mængde serum (5% eller mindre). Når de først er tilpasset, dyrkes cellerne i- 5-1 i ter spinner-kolber indehol-15 dende "Eagle's minimum essential medium" - Dulbecco's modifikation suppleret med 5% kalvefosterserum under en atmosfære af 10% CO^ - 90% luft. Cellerne dyrkes, indtil de når den stationære fase når suspensionen indeholder fra 10 til 50 μg antistof pr. ml.

For at rense antistofpræparatet ^ sættes ammoniumsulfat til sus-20 pensionen til frembringelse af 50% mætning, og det resulterende bundfald opsamles. Bundfaldet opløses i et minimalt volumen phosphatpufret saltvand, og opløsningen dialyseres over for samme medium til frembringelse af et renset antistofpræparat.

25 ^ I en variant af ovenstående fremgangsmåde dyrkes cellerne i logaritmisk fase ved en minimal serumkoncentration og fortyndes så direkte med medium, som ikke indeholder serum, men indeholder vækstadditiver, såsom de af Iscove anbefalede.

^ I en yderligere variant af ovenstående fremgangsmåde fortsættes 30 rensningsproceduren under anvendelse af DEAE-kromatografi eller immuno-adsorbenter, f.eks. anti-rotte immunoglobulin, eller den beskrevne fremgangsmåde erstattes alternativt med anvendelse af membranfiltre.

Claims (16)

1. Rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3.

2. Hybridcellelinie, KENDETEGNET ved, at den er afledt af celler fra rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 ved fusion heraf med immunocytæller fra et dyr, som er sensibiliseret over for et immunogen.

3. In vitro cellekultursystem, KENDETEGNET ved, at det omfatter celler af rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 i et næri ngsmedi um derfor.

4. -In vitro cellekultursystem, KENDETEGNET ved, at det omfatter 15 celler af en hybridcel lelinie afledt af celler fra rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 ved fusion heraf med immunocytæller fra et dyr, som er sensibiliseret over for et immunogen, i et næringsmedium derfor.

5. Cellefusionssystem, KENDETEGNET ved, at det omfatter celler af rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 og immunocytceller fra et dyr, som er sensibiliseret over for et immunogen, i et næringskulturmedium derfor sammen med et middel, som fremmer fusionen af disse celler. 25

6. Cellefusionssystem ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at immuno-cytcellerne er mil tæller.

7. Cell efus i onssystem ifølge krav 5 eller 6, KENDETEGNET ved, at 30 immunocytcellerne er rotteceller.

8. Cellefusionssystem ifølge krav 5, 6 eller 7, KENDETEGNET ved, at midlet, som fremmer fusion, er polyethylenglycol.

9. Cellefusionssystem ifølge krav 5-8, KENDETEGNET ved, at det omfatter celler af rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 og miltceller fra en rotte, som er sensibiliseret over for et immunogen, i et næringskulturmedium derfor sammen med polyethylenglycol. DK 169586 B1

10. Fremgangsmåde til fremstilling af en hybridcellelinie ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den omfatter, at man sammensmelter celler af rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 med immunocytceller 5 fra et dyr, som er sensibiliseret over for et immunogen, under anvendelse af et middel, som fremmer fusionen af disse celler.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, KENDETEGNET ved, at dyret er sensibiliseret over for immunogenet ved administrering af immunogenet 10 til dyret.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer, KENDETEGNET ved, at den omfatter, at man dyrker celler af en hybridcellelinie ifølge krav 2 i et in vitro eller in vivo dyrkningsmedium derfor 15 og derefter, om ønsket, isolerer antistofferne fra mediet.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer ifølge krav 12, KENDETEGNET ved, at hybridcellelinien er fremstillet ved fusion af celler af rottemyelomacellelinien med betegnelsen Y3-Ag 1.2.3 20 med immunocytceller, som er sensibiliseret over for et immunogen.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at immunocyt-cellerne hidrører fra et dyr, som er sensibiliseret over for immunogenet ved administrering af immunogenet til dyret. 25

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, KENDETEGNET ved, at dyret, hvorfra immunocytcellerne hidrører, er en rotte.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 12, 13, 14 eller 15, KENDETEGNET 30 ved, at cellerne af hybridcellelinien dyrkes ved, at man inokulerer en rotte med cellelinien til frembringelse af en fast eller ascitisk tumor og derefter isolerer antistofferne fra rottens serum eller ascitesflui-dum. 35