DE3235924T1

DE3235924T1 - Monoklonaler antikoerper

Info

Publication number: DE3235924T1
Application number: DE823235924T
Authority: DE
Inventors: Ewin Samuel Great Wilbraham Cambridgeshire Lennox; Steven Howard Dr. Cambridge Cambridgeshire Sacks
Original assignee: CELLTECH Ltd SLOUGH BERKSHIRE; Celltech R&D Ltd
Current assignee: Lonza Group AG
Priority date: 1981-03-06
Filing date: 1982-03-08
Publication date: 1983-05-05
Also published as: WO1982003089A1; JPH0526470B2; DE3235924C2; US4760026A; JPS58500366A

Description

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstand und ermöglicht insbesondere auf dem Gebiete der Biotechnologie die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers als Reagenz zur Blutgruppenbestimmung.

Das Eindringen von Fremdmaterial (antigenem Material) in den Körper eines zu den Wirbeltieren gehörenden Lebewesen ruft eine Immunreaktion hervor, die verhindern

soll, daß das antigene Material den Körper schädigt

und die die Entfernung eines solchen Materials aus dem Körper erleichtern soll. Das Immunsystem erreicht dies durch Produktion von Immunoglobulinmolekülen (im folgenden als Antikörper bezeichnet), welche die Eigenschaft besitzen, das Antigenmaterial selektiv zu erkennen und

sich an hierfür charakteristische Stellen desselben

zu binden. Diese Stellen sind als Determinanten bekannt und ein Antigen kann eines oder mehrere derartiger Determinanten aufweisen. Durch das Immunsystem erzeugte Antikörper haben jeweils nur gegenüber einer Determinante

eine Spezifität, doch kann eine Vielzahl unterschiedlicher Antikörper gebildet werden, wenn das Antigenmaterial, gegen welches Antikörper gerichtet sind, mehr als eine Determinante besitzt.

Die Hauptfunktion von Antikörpern ist der Schutz des Körpers vor schädlichem Fremdmaterial durch Agglutination desselben, wodurch die normalen Körperprozesse unterstützt werden, dieses Material zu entfernen.

Die Agglutination von Antigenmaterial durch Antikörper hat jedoch auch eine praktische Bedeutung außerhalb des

Körpers auf dem Gebiete der BlutgruppenbeStimmung.

Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) haben auf ihrer

Oberfläche eine Anzahl von verschiedenen distinktiven Antigendeterminanten, deren Charakter die Klassifizierung dos Blutes in bestimmte Gruppen oder Typen ermöglicht

(z.B. A, B, 0, A₁B, A₀B, B ,). Bei der Transfusion in τ ώ cora

von Blut von einem Spender an einen Empfänger ist es wesentlich, daß das transfundierte Blut die gleiche Blutgruppe wie das Blut des Empfängers hat, da andernfalls das Immunsystem des Empfängers Antikörper gegen die fremden Determinanten auf der Oberfläche der trans-

fundierten Erythrocyten erzeugt. Die Reaktion derartiger Antikörper mit Fremderythrocyten bildet die Basis für die Technik der Blutgruppenbestimmung.

Ganz allgemein kann gesagt werden, daß die Gruppenbe-20

Stimmung von Blutproben auf der Feststellung einer

Agglutination oder sonstigen Ausfällungen von Erythrocyten in der Blutprobe beruht, wenn Antiserum zu den auf der Oberfläche dieser Gruppe von Erythrocyten

befindlichen Determinanten zugesetzt wird. Die Agglu-25

tination ist ein makroskopischer Effekt, der leicht mit dem Auge erkannt oder automatisch maschinell festgestellt werden kann.

Die Hauptquelle von Reagenzien zur Blutgruppenbestimmung wurde bisher durch die Hyperimmunisierung von Menschen erzielt. Dabei wird in einen Menschen eine beträchtliche, jedoch nicht lethale Dosis eines Blutserums eines von demjenigen des betreffenden Menschen unterschiedlichen

Typs eingebracht. Dies ruft die normale immunologische ο ο

Reaktion hervor, die zu der Produktion von Antikörpern im Blut dieses Menschen führt, und eine Probe dieses

Blutes wird sodann entnommen und daraus ein Antikörperpräparat hergestellt. Ein derartiges Präparat kann zur Bestimmung der Gruppe einer unbekannten Blutprobe verwendet werden, da es eine sichtbare Flokkulation oder Agglutination der Erythrocyten hervorruft, wenn die unbekannte Blutprobe vom gleichen Typ ist, wie das ursprürjglich in den menschlichen Serumspender eingeführte Blut.

In der Praxis kennt man zwei Typen von Blutgruppentests (vergleiche F. Dunsford,c. Bowley, Techniques in blood grouping, 2nd edition 1967 ). Gemäß dem ersten Test wird eine Probe des zu bestimmenden Blutes auf eine Blutgruppen-Testplatte aufgebracht (vergleiche British Pharmacopeoia:Determination of ABO donors). Diese Blutprobe wird sodann auf der Platte mit einer Antiserumprobe vermischt. Eine dabei erfolgende Agglutination zeigt an, daß die zu bestimmende unbekannte Blutprobe zu der gleichen Blutgruppe gehört wie diejenige, gegenüber welcher das Antiserum erzeugt wurde. In der Praxis werden solche Platten-Agglutinations-

25 blutgruppentests routinemäßig in Notfällen durchgeführt.

Gemäß dem zweiten Typ dieser Tests wird die zu bestimmende Blutprobe zusammen mit einem Antiserum in

eine in einem Teströhrchen befindliche physiologische Kochsalzlösung eingebracht und während einer Standard-Zeitspanne (2 h) stehen gelassen. Das Auftreten einer Agglutination kann sodann bewertet werden durch die Sedimentation, die innerhalb der Standard-Zeitspanne

35 erfolgt ist. Im Falle von Unglücks- oder Notfällen

kann eine Zentrifuge zur Beschleunigung des Testes . verwendet werden.

Die Effizenz eines bestimmten Blutgruppentestreagenz

wird beurteilt naeh der Geschwindigkeit, mit welcher 5

es Agglutinate bildet und nach der Art und Weise, in welcher seine Fähigkeit, als ein Agglutinin zu wirken, mit der Konzentration variiert.

Die erstgenannte dieser Kriterien wird üblicherweise als "Avidität" bezeichnet. Die Aviditätszeit eines bestimmten Blutgruppentestreagenz ist definiert als diejenige Zeit, die vom Zeitpunkt des Vermischens der Blutprobe mit dem Reagenz bis zum Zeitpunkt des Auftretens einer wahrnehmbaren Agglutination der Probe

verstreicht.

Zur Bestimmung der Verdünnungscharakteristika eines Blutgruppentestreagenz kann ein Salzlösungs-Agglutinations-

titer gemessen werden. Diese Meßung erfolgt in der Weise, 20

daß eine Anzahl von Doppelreihen gleichen Volumens von Salzlösungsverdünnungen des zu bestimmenden Blutgruppentestreagenz hergestellt werden. Zu jeder Verdünnungsprobe wird eine bekannte Menge der entsprechenden Erythrocytensuspension zugesetzt. Die gleiche Menge

an Suspension wird zu allen Verdünnungen zugegeben. Jede Verdünnungsprobe wird während einer Standard-Zeitspanne (in der Regel 2 h) stehen gelassen, worauf eine Agglutinationszählung unter einem Mikroskop vorgenommen wird.

Die Probe mit der höchsten Verdünnung, bei welcher eine 30

merkliche Agglutination eintritt, wird bestimmt und diese Verdünnung wird als "Salzlösungs-Agglutionationstiter" bezeichnet. Ein Reagenz mit einem hohen SaIzlösungs-Agglutinationstiter stellt daher ein potentes Agglutinin dar.

Zwei Probleme ergeben sich offensichtlich bei der Her-

Stellung von Antikörpern gegen Erythrocytendeterminanten

bei Anwendung der Technik der Hyperimmunisierung eines 5

Menschen. Erstens stehen Spender für Blutserum nur begrenzt zur Verfügung, und außerdem hat sich heutzutage im Hinblick auf die steigende Häufigkeit größerer chirurgischer Eingriffe der Bedarf nach Blutgruppenbestimmungen merklich erhöht. Dies führt zu einem Engpaß in der Versorgung mit menschlichem Blutserum, das auch für andere medizinische Zwecke gebraucht wird. Außerdem neigt der Agglutinationseffekt von natürlich erzeugten Antikörpern gegen Erythrocyten zur Erzielung von etwas variierenden Ergebnissen. Eine Ursache hierfür liegt darin begründet, daß die Immunreaktion zur Erzielung eines "Cocktails" von Antikörpern führt, von dem jede Antikörperkomponente eine spezifische Wirkung auf eine Determinante hat, wie oben erläutert wurde. Es ist unmöglich, die verschiedenen Antikörper

in diesem Cocktail voneinander zu trennen, weshalb übliche Antisera Gemische von Antikörpern enthalten, wobei die Gemische von Tier zu Tier (selbst bei dem gleichen Genus) und von Tag zu Tag variieren. Der

gleiche Determinantensatz liegt nicht auf allen

Erythrocyten der gleichen Gruppe vor, was dazu führt, daß die Reaktion sehr variabel ist.in zahlreichen Füllen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß ein zur Blutgruppenbestimmung geeignetes Reagenz die folgenden

Voraussetzungen erfüllen muß:

1. Es muß spezifisch sein für das entsprechende Antigen,

2. es muß ausreichend potent sein, um gute makroskopische

Reaktionen gegenüber den schwächeren Blutgruppen

zu ergeben, und zwar sowohl in Notfällen als auch

bei Routinemethoden der Blutgruppenbestimmung,

3. es muß stabil sein unter den Bedingungen des Gebrauchs und
4. es muß leicht verfügbar sein zu vernünftigen Kosten.

Neuere Fortschritte in der Molekularbiologie haben zu einer Technik für die Produktion hochspezifischer Antikörper geführt durch Erzeugung einer Hybridzelle (odereines Hybridoms ) aus einer AntikÖrper-produzierenden Milzzelle und einer Myelomzelle. Diese Technijc von Kohler und Milstein (Eur. J. Immunol, 6 , 292-295 (1976); Nature 256, 495 bis 497 (1975); Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)) stellt eine Methode zur Erzeugung einer unbegrenzten Quelle für Antikörper dar. Die dabei erzeugten Antikörper werden als monoklonale Antikörper bezeichnet, da die Hybridzelle, welche sie hervorbringt, nur einen Typ von Immunoglobulinmolekül , d.h. nur Immunoglobulin, das gegen eine Determinante spezifisch ist, produziert. Hybridomzellen vereinigen in sich die beiden wünschenswerten Merkmale von Myelomzellen und Lymphozyten. Das heißt, Myelomzellen sterben nicht ab und können sich selbst ^Ln vitro replizieren , während andererseits Lymphozyten die wünschenswerte Eigenschaft haben, Antikörper auszustoßen. Derartige Hybridzellen sind daher eine dauernde Quelle für reines, wohldefiniertes Immunoglobulin. Die Herstellung von Hybridzellen erfolgt in der Regel durch Immunisierung einer Maus mit dein geeigneten Antigen und, nachdem genügend Zeit zum Ablauf der Immunoreaktion gelassen worden ist, wird das Tier getötet und dessen Milz ent" nommen. Eine Zellsuspension wird sodann aus der Milz hergestellt und diese Suspension wird mit einer Suspension von Mäuse-Myelomzellen vermischt. Polyethylenglykol kann zur Förderung der Fusion der beiden Zellarten eingesetzt werden. Die erhaltenen individuellen

Hybridomkulturen, die von einer Lymphozytzelle ab-P-stammen, bilden spezifisch einen Typ von Antikörper, d.h. einen Antikörper, der nur gegen eine bestimmte Determinante spezifisch ist.

Diese Technik wurde angewandt von Voak et al (Vox Sanguinis _3_9, 134-1 40 (1980)) zur Erzeugung eines "monoklorialen Antikörpers gegen die Determinanten von Erythrozyten des Α-Typs und es zeigte sich, daß diese monoklonalen anti-A-Körper brauchbare Reagenzien zur Blutgruppenbestimmung darstellen.

Es bestand jedoch die weitverbreitete Meinung, daß die

Immunisierung von Mäusen mit Humanblutzellen vom B- T> -j nicht zur Bildung von Milzzellen führt, die zu einer Fusion mit Myelomzellen befähigt sind unter Bildung 2_ von Hybridomzellen, die anti-B-Immunoglubulin hervorbringen,

Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß dies nicht der Fall ist und daß eine erfolgreiche Fusion leicht erzielbar ist unter Bildung von Hybri-

_oir domzellen, die hochwirksames monoklonales anti-B aus- ^b

stoßen und damit ein spezifisches Blutgruppentest-reagenz hoher Avidität, das sich durch einen brauchbaren SaIzlösungs-Agglutinationstiter auszeichnet, produzieren. Es hat sich außerdem als möglich erwiesen, eine Gleich-

OQ gewichtskonstante und eine Dissoziationsratenkonstante für den Immunokomplex, der sich zwischen dom monoklonalen anti- B und den Blutkörperchen von B-Typ.bildet, zu definieren. Bisher war eine derartige quantitative Analyse der Festigkeit des zwischen einem Blutgruppen-

gc test-Reagenz und roten Blutkörperchen gebildeten Immunokomplexes nicht möglich, da die bisher bekannten Blutgruppen test -Reagenzien ein Gemisch aus Immunoylobulin unter-

ι - Jo -

schiedlicher Spezifität darstellten. Der beste bisher erzielbare Wert war daher ein Durchschnittswert.

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zeichnet sich durch eine Spezifität für eine Antigendeterminante eines Blutkörperchens vom B-Typ aus. Der hier verwendete Ausdruck "Blutkörperchen-B-Tif" umfaßt alle roten Blutkörperehen, die eine oder mehrere Antigendeterminanten besitzen, die ausschließlich auf Blutkörperchen vom-B-Typ vorliegen. Beispiele für Blut-

tpyen und B

tpyen mit derartigen Determinanten sind B, AB, A„B

cord'

Beim erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper handelt es sich vorzugsweise um ein Maus IgM-monoklonales anti-B-Immunoglobulin.

Vorzugsweise besitzt der monoklonale Antikörper die

Fähigkeit, eine Agglutination einer Probe von B-Typ-Blut, das diese Determinante aufweist, zu bewirken. Es zeigte sich, daß insbesonders wertvolle derartige Eigenschaften dann resultieren, wenn der monoklonale

Antikörper eine Gleichgewichtskonstante der Wechsel-25

wirkung zwischen dem Antikörper und den Blutkörperchen vom B-Typ aufweist, die größer als 1,3 χ 10 M , ins-

8—1 besondere größer als 1,2 χ 10 M ist. Bei den hier

und im folgenden angegebenen Werten für die Gleichgewichtskonstante handelt es sich um funktioneile 30

Affinitäten, d.h. um Meßungen der Wechselwirkung zwischen polyvalentem Antikörper (IgM) und rotem Blutkörperchen. In dieser Hinsicht unterscheiden sie sich von Intrinsic Affinitäten, die sich aus den Wechselwirkungen zwischen

univalentem Antikörper (IgG) und Antigen ergeben. In-35

trinsic-Affinitäten sind nicht direkt vergleichbar mit

funktionellen Affinitäten. Die Werte, die für die

erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper berechenbar sind, hängen vom verwendeten Assay ab, wie dies im

folgenden beschrieben wird. 5

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung weist der monoklonale Antikörper eine Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und dem Blutkörperchen vom B-Typ der Blutgruppe B auf, die kleiner ist als 2,2 χ 10~ s ,

-4-1 vorzugsweise niedriger als 7,6 χ 10 s

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung besitzt der monoklonale Antikörper eine Geschwindigkeitskonstante

der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus

dem monoklonalen Antikörper und Blutkörperchen vom

_ B-Typ der Blutgruppe A B,die kleiner ist als 5,0 χ 10

— 1 — 3 — 1

s , vorzugsweise niedriger als 3,4 χ 10 s

Bei den hier und im folgenden angegebenen Dissoziationskonstanten handelt es sich um funktioneile Affinitäten wie oben beschrieben.

Zur Durchführung des in den Patentansprüchen angegebenen erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Hybridzellen vor dem Klonieren vorzugsweise einer Selektion unterworfen.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Myelomzellen

um NS1-Zellen. Die zur Durchführung des Verfahrens

verwendbaren Hybridomzellen sind zur Sekretion des

erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers befähigt, der als Reagenz zur Blutgruppenbestimmung verwendbar ist.

Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher

erläutert, in der darstellen

Figur 1 Kurven der im Gleichgewicht befindlichen Bindung von

323592A

-/It-

^J J-markierten anti-B-Antikörpern mit

Erythrocyten der Gruppe B/ 5

Figur 2 ein modifiziertes Scratchard-Diagramm der

im Gleichgewicht befindlichen Bindung von

J-markierten anti-B-Antikörpern mit Erythrocyten der Gruppe B, Figur 3 Kurven, welche die Dissoziationsrate von

J-markierten anti-B-Antikörpern von Erythroycyten der Gruppe B bei 4 ⁰C und bei Raumtemperatur zeigen,

125 Figur 4 Kurven, welche die Dissoziationsrate von

J-markierten anti-B-Antikörpern von 2x10

A.B-Erythrocyten bei Raumtemperatur zeigen.

Die Herstellung der Hybridomzellen wurde -wie folgt durchgeführt.

Geeignete Mäuse wurden durch Testung von Serumproben für anti-B-Aktivität nach Absorption mit Blutkörperchen der Gruppe 0 zur Entfernung von anti-Spezies-Antikörpern ausgewählt. Einer Maus mit einem anti-B-Agglu-

tinationstiter von 1:8 nach der Absorption wurden

intraperitoneal 100ug einer Substanz der Gruppe B in 0,1 ml ergänztem Freund-Medium (Difco Bacto) injiziert, was 5 Wochen später wiederholt und nach weiteren 9 Wochen mit 200ug B-Substanz in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung durch intravenöse Injektion aufgefrischt wurde. 3 Tage später wurde die Milz entfernt und eine Zellsuspension hergestellt.

Milzzellen (10 ) wurden fusioniert, mit Mausmyelom -NS1-

Zellen (10 ) unter Verwendung von Polyethylenglykol 35

(vergleiche Cotton et al, Eur. J. Immunol., 3, 135 - 140,

3 2 3 5 9

i -A'

(1973); Dunsford and Bowley,Techniques in Blood Grouping 2nd edition 1967; Galfre et al,Nature, 26^, 550-552, p. (1977)). Wachsende Zellhybride wurden selektiert nach ihrer Fähigkeit, eine spezifische anti-B-Aktivität hervorzurufen die im überstand der Kulturlösung durch Agglutinationstest unter Verwendung von menschlichen A-, B- und O-Erythrocyten bestimmt wurde. Anti-D-sekretierende Hybride wurden zwei mal auf weichem Agar kloniert und gezüchtet eventuell in 1 1 Schleuderkulturen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM Gibco Biocult), das ergänzt war mit 5 % V/V fötal-Kalbserum (FCS, Sera-Lab). Die klonierten Hybride wurden in flüssigem

,_c Stickstoff aufbewahrt. 1 b

Der Gewebekulturüberstand, weicherden monoklonalen Antikörper enthielt, wurde gewonnen durch Zentrifuga-tion zur Entfernung von Zellen und Bruch stücken, Filtration durch „₀ Milliporfilter und Zugabe von 10 mM Hepes-Puffer und 0,1 % Natriumazid. Aliquote Teile jeder Charge wurden sodann bei 4 ⁰C für Routineuntersuchungen oder bei -20 ⁰C als Vorratssubstanz aufbewahrt.

₂P- Im einzelnen wird bei der Herstellung von Hybridzellen wie folgt vorgegangen.

Als Versuchstiere wurden B10.BR, C3H/He-mg- und andere

Mäuse zunächst von OLAC, 1976 Ltd. (Bicester, GB) und OQ später von Medical Research Council, bei denen es sich

um von OLAC-Tieren gezüchtete Stämme handelte, erhalten. AKR-Mäuse wurden von Banting and Kingman ( York, GB) erhalten. (C3H χ BALB/c) F - Mäuse und Lou, DA und AO Ratten wurden im Tierhaus des Medical Research Council ge- gezüchtet; Wistar, PVG, WAG und Sprague-Dawley-Ratten wurden von Banting and Kingman erhalten.

-Ih-

Die zum Testen und Immunisieren eingesetzten Mäuse

waren 6 bis 8 Wochen alt. 5

Zur Immunisierung unter Verwendung von menschlichen Substanzen der Gruppe B wurde wie folgt vorgegangen.

Vom Clinical Research Centre, Harrow, GB, wurde Human-10

B- (und-A) Substanz erhalten, welche der in Phenol (95 %) unlösliche, in Ammoniumsulfat (100 %) unlösliche, in Äthanlol (45 bis 55 %) unlösliche und in Wasser lösliche Extrakt von gefriergetrockneter Ovarialzysten-

flüssigkeit ist, der nach der Methode von Morgan (1965) 15

gewonnen ist. Es handelt sich dabei um Glykoproteine, die zu 80 bis 85 %■ aus Kohlehydraten (L-Glucose, D-Galactose, N-Acetyl -D -flucosamin, N-Acetyl-D-Galactose), zu 15 bis 20 % aus Aminosäuren (vorwiegend aus

L-Threonin , L-Serin und L-Prolin) und zu 1 bis 2 % 20

aus Salinsäure> bestehen. Sie wurden in lyophilisiertem Zustand erhalten und in einer Konzentration von 2 mg/ml in 0,9 %-iger Kochsalzlösung gelöst und bei -20 ⁰C aufbewahrt.

Zur Herstellung einer Emulsion von B-Substanz in ergänztem Freund-Medium (CFA) wurde wie folgt vorgegangen.

1 ml B-Substanz in einer Konzentration von 2 mg/ml

in 0,9 % Kochsalzlösung wurde zu 1 ml CFA (Difco Bacto, 30

ein Gemisch von Bayol F, Öl und Mannidoleatdetergens mit einem Gehalt an Mycobacterium tuberculosis ) zugegeben. Das Gemisch wurde kräftig homogenisiert in zwei 5 ml-Glasspritzen (Chance, Warley,GB), die im rechten Winkel miteinander verbunden waren durch einen 2-Weghahn, und

intermittierend auf Eis gekühlt, bis sich (nach 10 bis

Λ-e-

20 min) eine weiße Creme gebildet hatte, die nicht dispergierte, wenn ein Tropfen derselben auf Wasser aufgebracht wurde. CFA stellt noch immer eines der besten Hilfsmittel für Immunreaktionen dar (vergleiche Bomford, 1980). Wiederholte Injektionen wurden an verschiedenen Stellen apliziert, da sich eine Granulo matose bilden kann.

Die Immunisierung wurde wie folgt durchgeführt.

Um geeignete Mäuse aufzufinden, wurde nicht-immunisierten Versuchstieren am Schwanz Blut entnommen und ]_5 das Serum wurde nach Absorption mit Erythrocyten der Gruppe 0 zur Entfernung von anti-Spezies-Antikörpern nach der Röhrchen-Agglutinationsmethode mit B-Erythrocyten getestet.

20 6 bis 8 Wochen alten weiblichen B10.BR-Mäusen und

C3H/He-mg-Mäusen mit hohem anti-B-Titer wurde intraperitoneal (i.p.) eines der folgenden 3 Präparate injiziert: 100 ug B- Substanz in 0.1 ml CFA (siehe unten), 10 ug B-Substanz im gleichen Medium oder

25 0,1 ml gepackte, 4 mal gewaschene Erythrocyten der B-Gruppe. Den Mäusen wurde 2 Wochen später Blut am Schwanz entnommen.

B10.BR-Mäusen, die einen hohen Serumtiter hatten, wurde eine erneute i.p. Injektion von 100 ug oder 10 ug B-Substanz nach 5 Wochen, oder eine erneute Gabe von 0,1 ml Zellen nach 3, 4 und 5 Wochen nach der ersten Injektion verabreicht. Den Mäusen wurde am Schwanz Blut entnommen nach 1 Woche, 3 Wochen und 6 Wochen nach der letzten Injektion.

/6-

9 Wochen nach der zweiten Injektion von 100 μg wurden der B10.BR-Maus2 200 iiq B-Substanz in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung injiziert. 3 Tage später wurde die Milz entnommen und eine Zellsuspension hergestellt zur Fusion mit Myelomzellen.

Die Sera wurden wie folgt gesammelt:

0,5 ml am Schwanz entnommenes und in Plastikröhrchen gesammeltes Blut wurden bei 37 "C 1h lang gerinnen gelassen und vom Röhrchen gelöst, um die Retraktion des Gerinnsels zu fördern. Abgetrennte Sera wurden verdünnt mit 0,9 % Salzlösung, 20 min in einem 56 ⁰C warmen Wasserbad inkubiert und je nach Erfordernis mit 0- oder A.-Blutkörperchen absorbiert. Aliquote Teile wurden bei -20 ⁰C aufbewahrt.

Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Blutgruppe B wurde wie folgt durchgeführt :

Die allgemeine Richtlinie der angewandten Prozeduren folgte den von Kohler und Milstein (Literaturstelle siehe oben) festgelegten Grundprinzipien zur Herstellung monoklonaler Antikörper mit der gewünschten Reaktivität;

Milzzellen

Myelomzellen

HGPRT ase + ve spezifisch Ig + ve terminal differenziert

HGPRT ase - ve spezifisch Ig - ve sterben nicht ab

Ul/.ellon

HGPRT ase + ve spezifisch Ig + ve sterben nicht ab.

323

Nicht-verschmolzene Myelomzellen haben keine HGPRT ase

und sterben daher in selektiven Medium (vergleiche 5

Littlefield, Science 1_4_5/ 709 - 710,1964). Nicht- verschmolzene Milzzellen überleben nicht in Gewebekulturen. Nur Hybride von Milzzellen und Myelomzellen haben sowohl HGPRT ase als auch die Fähigkeit, nicht abzusterben, und überleben daher; diejenigen, welche Antikörper, der erforderlichen Spezifität sekretieren,können sodann selektiert werden, d.h. Hybridzellen vereinigen insich die Vorteile beider Stammzellen.

Die folgenden Stammlösungen wurden hergestellt: 15

50%-ige Polyethylenglykol (P.E.G.)-Lösung.

10 g P.E. G. 1500 (BDH Lot 6573370) wurden im Autoklaven behandelt und unmittelbar danach in ein 45 ⁰C warmes Wasserbad überführt, worauf 10 ml DMEM bei 37 ⁰C zugesetzt wurden.

Aminopterin-Stammlösung 1000X.

25 Aminopterin (Sigma) wurde gelöst zu 0,176 mg/ml in

0,008 M NaOH, leicht erwärmt, und im Dunkeln bei -20 ⁰C aufbewahrt.

HT-Stammlösung 100X. 30

136,1 mg Hypoxanthin (Sigma) und 38,7 5 mg Thymidin wurden durch Erhitzen auf Siedetemperatur in 100 ml DDW gelöst und in aliquoten Teilen von 50 ml bei

-20 ⁰C aufbewahrt. 35

50 ml DMEM 50 ml HT 100X

Die fertiggestellte Lösung wurde filtriert (Millipore, Porengröße 0,22 um) und in aliquoten Teilen von 13 ml bei -20 ⁰C aufbewahrt. Beim Auftauen wurde HT durch

Erwärmen auf 60 bis 70 ⁰C wieder in Lösung gebracht. 5

HAT-Medium 5OX.

45 ml DMEM

50 ml HT 100X 10

D ml Aminopterin 1000X

Die Lösung wurde filtriert, aufbewahrt und aufgetaut wie oben beschrieben in aliquoten Teilen von 13 ml.

HAT in 20 % FCS-DMEM (HAT-Medium) 1X.

400	ml	DMEM	901112)
100	ml	FCS (Charge
8	ml	P/S
8	ml	Glutamin
6	ml	Pyr.	5OX
10,6	ml	HAT-Medium

— 4 —

(1,0 χ 10 M Hypoxanthin, 4,0 χ 10 M Aminopterin,

1,6 χ 10 ⁵M Thymidin). 25

HT in 20 ■% FCS-DMM (HT-Medium) 1X.

10,6 ml HT 5OX wurde anstelle von HAT 5OX in der oben angegebenen Formulierung angewandt.

Die folgenden Ausdrücke finden Verwendung:

Serum-frei DMEM = DMEM + PS + glut. + pyr.

2.0 I FCS - DMEM = Serum-freies DMEM + 20 % FCS

35 HAT-Medium = 20 % FCS - DMEM + HAT

HT-Medium = 20 % FCS - DMEM +HT

ι - β -

Die Produktion und frühzeitige Selektion von anti-B-Myelomhybriden wurde wie folgt durchgeführt.:

Eine Zellverschmelzung wurde wie von Kohler et al

(Literturstelle siehe oben) vorgenommen. Zur Herstellung wurden die folgenden Medien über Nacht bei 37 ⁰C in einer Atmosphäre von 5 % C0„ in Luft (Leec-incubator) ins Gleichgewicht gebracht: (1) 50 % PEG-Lösung; (2) Serumfreies DMEM und (3) 20 % FCS-DMEM mit einem Gehalt von 1,5 ml aliquoten Proben, verteilt in 48 Linbro-Gefäßen.

Am Morgen, an dem die . Fusion stattfand, wurde die Milz aseptisch entnommen und die Zellen wurden in 10 ml Serum-freiem DMEM verteilt und in ein 10 tnl-Zentrifugenröhrchen überführt. Nachdem die Zellzusammenballungen 5 bis 10 min lang sedimentieren" gelassen worden v/uren _f _Wurden Suspensionszellen mit einer Pipette entnom-2Q men und 2 mal in Serum-freiem DMEM gewaschen. Die eine Milz ergab 1,4 mal 10 Suspensionszellen. 10 derselben wurden gesammelt in 5 bis 10 ml. Serum-freiem DMEM. Gleichzeitig wurden 10 Myleom-NSI-Zellen, die in Wirbelkultur (spinner culture) zu 2,6 χ 10 /ml wuchsen, 2 mal gewaschen und erneut in 5 ml Serum-freiem DMEM suspendiert.

Medien mit einem Gehalt an Milzzellen (10 ) und Myelomzellen (10 ) wurden in ein 50 ml-Corning-Röhrchen eingebracht und die Zellen wurden pelletisiert durch Zentrifugation bei 400 g während 5 min , RT, und das Medium wurde so vollständig wie möglich unter Verwendung einer an eine Saugpumpe angeschlossenen Pasteur-Pipette abgesaugt. Während das Röhrchen in einem Becher mit 37 ⁰C warmen Wasser gehalten wurde, wurde 1 ml 50 %-ige PEG-Lösung (bei 37 ⁰C ins Gleichgewicht gesetzt) allmählich

innerhalb von 1 min zugegeben, worauf eine weitere min lang schwach gerührt wurde mit der für die Zugabe verwendeten Pipettenspitze. Die Suspension wurde sodann verdünnt durch langsame Zugabe von Serum-freiem DMEM (bei 37 ⁰C ins Gleichgewicht gesetzt) in einer Rate von 1 ml/ min während 2 min, 2 ml/min während 4 min, 1O ml tropfenweise und dann freilaufend bis 50 ml, unter schwachem Schütteln des Röhrchens bei jeder Zugabe. Nach dem Zentrifugieren (400 g während 5 min) wurden die Zellen in 25 ml 20 %. FCS-DMEM (ins Gleichgewicht gesetzt) suspendiert durch sanftes Pipettieren mit der für die Zugabe verwendeten 24 ml-Pipette. Das Fusionsgemisch in 20 % FCS-DMEM wurde sodann in 0,5 ml-Aliquotenteilen in 48 Linbro-Gefäße verteilt, welche 1,5 ml ins Gleich-

gewicht gesetztes Medium aus 20 % FCS-OMEM enthielten.

Als Zuchtzellen wurden die verbleibenden .Milzzellen

verdünnt und tropfenweise in einer Ilenge von etwa 20

4x10 /Gefäß zugesetzt. Kulturentröge wurden sodann bei 37 ⁰C in einer Atmosphäre von 5 % CO^ in Luft bei über 4 5 % Feuchtigkeit inkubiert.

Am folgenden Tage (Tag 1) und an den Tagen 2, 3, 7 und nach der Zellfusion wurde die obere Hälfte jedes Kultur-

mediums entfernt (unter Verwendung einer separaten Pasteur-Pipette für jedes Gefäß, um eine mögliche kreuzweise Verunreinigung zu vermeiden) und ersetzt durch ein gleiches Volumen von HAT-Selektivmedium (Littlefield, 1964), das mit 5 % CO„ in Luft ins Gleichge-

wicht gesetzt worden war.

~22

Die Kulturen wurden täglich auf Hybridwachstum und mögliche Verunreinigung durch Hefezellen oder Mikroorganismen inspiziert, wobei die Kulturen so kurz wie möglich außerhalb des Inkubators gelassen wurden. Sobald das Wachstum der Zellmonoschicht kurz vor dem Zusammenfließen war (etwa 14 bis 21 Ta<je nach der ZuIifusion), was in etwa dem Zeitpunkt entsprach, wo das Medium einen Farbumschlag von Phenolrot von rot nach

10 gelb bewirkte, wurden die Kulturüberstände zunächst

getestet (durch Agglutination mit roten Blutkörperchen der Gruppen A, B und 0). Positive Kulturen wurden an diesem Tag unterteilt durch Suspendieren der Zellen mit einer 1 ml-Pipette und Überführung von 1 ml der Zellsuspension in 1 ml HAT-Medium (bei 37 ⁰C ins Gleichgewicht gesetzt); die ursprüngliche Kultur wurde mit HAT-Medium aufgefüllt. Die aufgeteilten Kulturen wurden in separaten Inkubatoren gezüchtet, um gegen einen Inkubatorausfall Vorsorge zu treffen, und sie

20 wurden periodisch durch Agglutination getestet und

sobald wie möglich in flüssigem N_ in FCS, das 10 % DMSO enthielt, eingefroren. Negative Kulturen wurden erneut getestet, sobald das Medium Gelbfärbung zeigte. Einer etwaigen Verunreinigung durch Hefezellen oder Mikroorganismen wurde dadurch begegnet, daß 4 5 %-iger EtOH zugegeben und nach 5 min die Kultur angesaugt und <ias leere Gefäß mit EtOH gewaschen wurde. Irgendwelches verspritztes oder verschüttetes Medium auf

dem Kulturtrog wurde immer sofort abaesaugt. 30

Nach 4 bis 10 Tagen nach der ursprünglichen Testung der Fusionsgefäße wurden Subkulturen erneut getestet und aliquote Teile positiver Kulturen wurden eingefroren

oder für das Klonen zubereitet.

Die Isolierung von anti-B-sekretierenden Hybridklonen wurde wie folgt durchgeführt. '

Das Klonieren von Zellen von selektierten Kulturen erfolgte auf . Weichagar, wie dies von Cotton et al beschrieben ist (Literaturstelle siehe oben). Eine Lösung von 0,5 % Agar in HAT-Medium wurde hergestellt durch Zugabe von 50 ml 1 %-igem Agar (Difco Bacto) in 0,9 %-iger Salzlösung zu 50 ml HAT-DMEM 2X (100 ml 2X DMEM + -4 ml P/S + 4 ml glut. + 3 ml pyr. + 75 ml FCS + 7,8 ml 5OX HAT), wobei die beiden Lösungen eine Temperatur von 45 °C aufwiesen. Das Agargemisch wurde in 9 cm-Petrischalen (Nunc) zu 15 ml/Schale einpepettiert und bei abgenommenem Deckel in einem laminarsaugenden Gewebekultur-Abzugs-

schrank 5 min lang verfestigen gelassen, worauf in einem begastcn Inkubator 30 min lang ins Gleichgewicht gesetzt wurde.

Zu 1 ml Zellen in einer Reihe von 6 Dreifachverdünnungen in Linbro-Gefäßen mit DMEM wurde 1 ml 0,5 % Agar HAT-DMEM zugegeben. Das 2 ml -Gemisch wurde über dem verfestigten Agar gleichmäßig ausgebreitet, wie zuvor luftgetrocknet und bei 37 ⁰C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ in Luft inkubiert.

Nach 14 bis 20 Tagen hatten sich diskrete makroskopische Zellkolonien gebildet, von denen viele aus Einzelzellen stammten. Diese wurden aus Schalen, welche die geringste

Zahl von Kolonien (normalerweise 10 bis 20) enthielten, entnommen unter Verwendung einer fein gezogenen Pasteur Pipette, und in Linbro-Gefäße eingeimpft, welche 1 ml HAT-DMEM, ins Gleichgewicht gesetzt in einem begasten

Inkubator, enthielten.

Nach dem üblichen Zyklus von Kulturwachstum, Testung

-34-

auf Agglutination, Aufteilung der Kulturen und Einfrieren von einigen derselben in flüssigem N , wurden

selektierte Klone HAT entzogen durch Reihentransfer 5

der Hälfte der Kultur in ein gleiches Volumen von

HT -Medium für 2 bis 3 Passagen und danach in 20 % FCS-DMEM, was insgesamt 5 bis 6 Tage beanspruchte.

Zellen wurden wie zuvor rekloniert, jedoch in_2 0 % FCS-DMEM, das 0,5 % Agar enthielt. 2 mal klonierte Linien wurden selektiert, und zwar (1) im Hinblick auf ihre Fähigkeit, daß der Kultur-überstand eine starke Agglutination mit roten Blutkörperchen ergab

und (2) im Hinblick auf ein rasches Wachstum von

Zellen hoher Dichte. Ausgewählte Klone wurden adaptiert an das Wachstum in niedrig-konzentriertem FCS durch Reihentransfer alle 2 Tage der Hälfte der Kultur.auf Medien, die 10 %, 5 % bzw. 2,5 % FCS enthielten.

Beim Klonieren durch Begrenzung der Verdünnung mit

Zuchtzellen handelt es sich um eine Methode, die bei Hybridzellen angewandt wurde, die nicht zufriedenstellend wuchsen, wenn sie in geringer Dichte auf Agar ausgebreitet wurden. Zellsuspensionen wurden in einer

2-fach Reihe auf 1 in 32 verdünnt in Linbro-Gefäßen, wobei verschiedene Reihen hergestellt wurden. Zu entsprechenden Reihen wurden 100 μΐ Nährmedium zugegeben, das einen Typ der folgenden Zuchtzellen enthielt:

(1) 4 χ 10 B10.BR-Thymuszellen

on r:

(2) 4 χ 10 B10.BR Milzzellen

(3) 4 χ 10⁵ bestrahlte 3T3 Mausfibroblastzellen

(20 000 rad bei I rad/s)

235924

- IS-

(4) 4x10 Mitomycin-behandelte * B10.BR Thymuszellen

(5) 4 χ 10 Mitomycin-behandelte * B10.BR-MiIzzellen

(6) keine

0,1 ml Mitomycin C (Sigma) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in EBSS wurde zu 1 ml Medium mit einem Gehalt an 10 Zellen zugesetzt, worauf inkubiert und 3 mal gewaschen wurde.

halt an 10 Zellen zugesetzt, worauf 30 min bei 37 ⁰C

Das Hybridzellenwachstum wurde bei geringen Verdünnungen auf Eignung zur Entnahme isolierter Kolonien überprüft.

Die Aufbewahrung von Hybridzellen in flüssigem N~ 15 wurde wie folgt durchgeführt.

Gefrorene..; Hybridgut wurde aus exponentiell wachsenden Zellen bei 2 bis 8 χ 10 Zellen/ml hergestellt. Pelletisierte Zellen aus 10 ml Kulturüberstand wurden resuspendiert in 2 ml 90 % FCS - 10 % DMSO (d.h. zu etwa 10 /ml) und aufgeteilt in 2 sterile Friergefäße (10 /Gefäß) . Die Gefäße wurden 2 bis 4 h auf Eis gekühlt, dann über Nacht in der Dampfphase eines Linde-Tanks mit flüssigem N_ und schließlich in flüssiges N_ eingetaucht. Auf diese Weise erfolgt die Kühlung der Zellen in einer Rate von etwa 1 ⁰C /min.

Zum Züchten von Zellen aus gefrorenem Beständen wurde ein Gefäß in einem Wasserbad von 37 ⁰C rasch aufgetaut und der Inhalt wurde langsam verdünnt in 10 ml Nährmedium. Pelletisierte Zellen (400 g, 5 min) wurden resuspendiert in 5 ml 5 - 10 % FCS-DMEM.

Gefäße mit 10 Zellen wurden aus Wirbelkulturen hergestellt, so daß eine 50 ml-Kultur sofort gestartet werden konnte.

Zur Nomenklatur von Antikörper-sektretierenden Hybridzellen, z.B. dem anti-B produzierenden Klon NB1/19.112.28, 5

ist folgendes zu sagen.

Jeder Hybrid wird mit einem Namen bezeichnet, der sich auf das Fusionsexperiment bezieht, im obicjcn Falle bezieht sich das N in NB1 auf das Abstammungsmyelom NS1 ; B bezieht sich auf anti-B-Milzzellen.

Die erste Zahl, hier 19, bezieht sich auf das ursprüngliche _/ unklonierte Kulturgefäß, aus dem dieser Klon abstammt.

Die folgenden Zahlen, hier 112 und 28, definieren die Kulturgefäße, in denen selektierte Klone gezüchtet werden nach der ersten bzw. zweiten Agarklonierung.

Kulturgefäße in einem Linbro-Trog werden nummeriert

1-24 oder bezeichnet A1-1D6. Wenn somit 5 Tröge verwendet werden, geht die Nummerierung der Gefäße von 1-120 oder 1A1-5D6.

Die vollständige Bezeichnung bezieht sich auf den ZeIl-25

klon , den produzierten monoklonalen Antikörper und dessen Antigenspezifität.

Charakterisierung des monoklonalen anti- B

3 stabile Gewebekulturlinien (NB1/19.112.28, NB1 6.36.36 und NB1/48.30.40) von klonierten anti-B produzierenden Hybridzellen wurden gewonnen aus einer Fusion zwischen Mausmilzzellen, die einer Vorbehandlung durch Antigen der Gruppe B unterworfen worden waren, und einer Mausmyelomline. Der Gewebekulturüberstand, der sekretierten

J2.1

-26-

monoklonalen Antikörper enthielt, wurde von jeder der drei Linien separat getestet.
5

Proben von Human-anti-B vom Blood Group Reference Laboratory (BGRL No 7327) und von einem kommerziellen Lieferanten wurden verwendet, wobei jede von der gleichen Charge genommen wurde, um die Effizienz des durch die Hybridomzellen gebildeten monoklonalen anti-B zu bestimmen.

Hamagglutinations tests wurden nach der Methode von Dunsford und Bowley (vergleiche oben) durchgeführt. Bei den roten Blutkörperchen handelte es sich um solche von ACD oder um geronnene Proben (vom Reginal Blood Transfusion Centre, Cambrige), die weniger als 7 Tage alt waren und 4 mal vor Gebrauch gewaschen wurden. 20 %-ige Suspensionen von roten Blutkörperchen in physiologischer Kochsalzlösung wurden für die Plattentests verwendet und 2 %-ige Suspensionen für den Standard-2h-Schwerkraftsedimentations-Röhrchentest. In Steigerungstests wurde Gebrauch gemacht von 2 %-igen papainisierten Zellsuspensionen oder 20 %-igem Rinderalbumin. Antikörper-Verdünnungen erfolgten in physiologischen Kochsalzlösungen,

Im Standard-2h-Sedimentations-Röhrchentest ergaben voll ausgewachsene Kulturüberstände anti-B-Agglutinationstiter, die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt sind. 30

ω
ο

to

cn

to O

σι

Tabelle 1

Salzlösungs-Agglutinationstiter (+) dreier monoklonaler anti-B-reagentien im Vergleich mit Human-anti-B

	Monoklonal-an ti-B	NB1/6.36.36	NB1/48.30.40	Human- anti-B	handelsübl. Serum
	NB1/19.112.28	32	16	BGRL 7327	256
A₁B	1 024	64	256	32	512
A₂B	2 048	64	512	32	512
B	2 048	16(8-64)	8(4-8)	32	NT
B cord*	1 024(512-1 024)	0	0	16(4-32)	0
^A1	0	0	0	0	0
0	0		0

makroskopischer Endpunkt

Durchschnittstiter mit 6 verschiedenen Blutproben (die Klammerausdrücke geben
die Bereiche an)

nicht getestet

Die Unterschiede zwischen den drei monoklonalen Antikörpern waren reproduzierbar in diesen und anderen der beschriebenen Tests. Der Antikörper NB1/19.112.28 ergab konsistent ausgezeichnete Ergebnisse.

Wie zu erwarten war, ergaben AB adult-und B cord-Zellen etwas niedrigere Titer als ausgewachsene A„B und B-Zellen, was den schwächeren B-Status des erstgenannten Zellentyps wieder^spiegelt.

Alle getesteten Reagentien ergaben eine angemessene Agglutination mit allen Zelltypen des Testschemas, hervorragend war jedoch die Aktivität von NB1/19.112.28, selbst mit den 6 Beispielen schwacher cord-Blutproben, wie sich aus der Tabelle ergibt. Der Bereich der NB1/19.112.28-Aktivität mit fünf verschiedenen A₁ B-Blutproben (in der Tabelle nicht aufgeführt) betrug 256 bis 1024 (Durchschnittstiter 512) , verglichen mit 16,32 (Durchschnitt 32) bei Verwendung von BGRL-anti-B.

In weiteren Versuchen wurde der Salzlösungs-Agglutinationstiter von NB1/48- und NB1/19- Reinigungsprodukten mit 2 %-igen B- und A B-Zellen gemessen. Fraktionen von gereinigtem NB1/48 und Nß1/19 wurden in der Mikrozentrifuge zentrifugiert und sorgfältig verdünnt ind PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung), bis A„_Rn ⁼ 1/00 (d.h. bei 100 ug/ml),

1 % <ou

unter der Annahme, daß A₁ , _onr. = 10. Ammoniumsulfat-

I CHI f ZÖU

fraktionen des Kulturüberstands (aus dem die Fraktionen gereinigt wurden) wurden mikrofugiert und verdünnt auf 1/16 in P.B.S.. Reihen-Doppeltverdünnungen wurden in P.B.S., pH 7,4, hergestellt durch genaues Pipettieren mit einer Hamilton-Injektionsspritze, die zwischen den einzelnen Pipettierprozeduren 4 mal gespült wurde. Aliquote Teile von 25 μΐ jeder Verdünnung wurden in Glasröhrchen inku-

biert mit 25 μΐ 2% roten Blutkörperchen (5 χ 10 ), suspendiert in P.B.S., bei pH 7,4 während 2h bei Raumtemperatur. Zeilpellets wurden sorgfältig auf Glasobjektträger überführt und auf Agglutination untersucht. In diesem Versuch wurden Kulturüberstände wie in Tabelle 1 angegeben verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt.

10 15 20 25 30 35

ω O

cn ο

Tabelle 2 Salzlösungs-Agglutinationstiter von NBI/19 und NB1/48-Reinigungs

produkten

!Reziproke Antikörper-Verdünnung

Kulturüberstand
70 χ Amm.sulf . Cut (1/16

)

N

2

4

0

16

32

64

120

256

512 1024 2040

- -

( + )Titar

B

Fraktion 1 (100 pq/ml)

C
C

C
V

V

⁺

(I)

GW

GW
GW

W
W

W

64
32

Kulturüberstand
70 χ Amm.aulf . Cut (1/1

6)

V

₊₊

+

( + )

GW

W

— — —

32

AB

Fraktion 1 (100 pq/ml)

♦

(I)

W

W
W

-

_

16
0

ι

+

(+)

GW

W

-

- .-

4

NÜ1/19

Cut
ug/ml

(1/16)
)

L
C
V

C
V
++

V
V

V ++
V ++

+

GW
( + )

-

512
64

KuItürüberstand
125 χ Amm.aulf .
Fraktion 2 (100

Cut

(1/16)

C
C

C
V

V
V

V
++

v.
++

++ +·
++ +

f +
+:

(+)
(+)

W

W
W

256
512

Kulturüberstand
A-B 125 χ Amm.sulf .

jug/ml

)

V

++

+

+ +

GW

-

- ■

64

Fraktion 2 (100

"32

In Tabelle 2 bedeuten:

C "vollständige Agglutination" 5 V "sehr starke Agglutination"

Zwischengrade der Agglutination

GW "wird schwach" 10 W "schwach"

In den Plattenagglutinationstests, welche die Antikörperavidität reflektieren, machen die schwächeren Reaktionen von B cord- und A B-adult-Zellen im Vergleich mit adult-B- und A-B-Zellen klarer die anti-B-Aktivitäten der verschiedenen Reagenzien.deutlich. Diese Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt.
20

GO O

to

σι

to O

Cn

Tabelle

Aviditätzeiten monoklonaler anti-B-Reagentien im Vergleich

zum Human-anti-B (Angaben in s)

B cord

Monoklonal-anti-B

NB1/19.112.28

5(4-7)

4 7(6-9)

NB1/6.36.36

17(10-25)

B 22(15-38)

fTB 1/40. 30.40

21(12-30)

8 32(16-47) Human -anti-B

BGRL 7327

21(15-32)

8
22(16-32)

handelsübl. Serum

4(3-6)

4
5(4-5)

# Durchschnittsergebnisse mit 20 verschiedenen Proben (die Klammerausdrücke geben

den Zeitspannenbereich wieder) + Durchschnittsergebnisse mit 8 verschiedenen Proben

	• W	•	OJ
	I ·	:nj
		• co
		cn
		CO






• •cc 4
• · ·♦
• * β

33 -

Mit A₁B- und B cord-Zellen bewirkte inonoklonales anti-B NB1/19.112.18, das unkonzentriert und ohne Zusätze angewandt wurde, innerhalb von Sekunden eine starke Agglutinationsreaktion ähnlich derjenigen mit handelsüblichem Reagenz. Obwohl das BGRL-Reagenz makroskopisch adequate Ergebnisse ergab, waren die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Verklumpung schlechter.

In einem weiteren Versuch wurden die Platten-Agglutinationszeiten von 20 % B-und A B-roten Blutkörperchen durch NB1/48 und NB1/19- Reinigungsprodukte gemessen. Die verwendeten Reagenzien waren die in Tabelle 2 beschriebenen mit der Ausnahme, daß die roten Blutkörperchen in 20 % 2 μΙ-Aliquotenteilen jeder Verdünnung , vermischt mit 20 μΐ roten Blutkörperchen auf einer opaken Glasscheibe, zum Einsatz gelangten und regelmäßig gerüttelt wurden. Eine Pedal- gesteuerte Stoppuhr wurde im Moment des Mischens gestartet. Die folgende Tabelle 4 zeigt die Zeit (s) bis zum Eintritt der Agglutination und das Ausmaß der Agglutination nach 5 min. Das Ausmaß der Agglutination ist wie in Tabelle 3 definiert, d.h. 13V bedeutet, daß + Agglutination nach 13s eintrat, und daß nach 5 min eine sehr starke Agglutination erfolgt war.

co O

Tabelle

O cn o (j-.

Plattenagglutination (s) von 20 % B- und A B-roten Blutkörperchen durch NBI/19 - und NB1/48-Reinigungsprodukte

Reziproke Antikörperverdünnung

NB1/48

KuItürüberstand 70 χ Amm.sulf . Cut (1/16) Fraktion 1 (100 'ng/ml)

Kulturüberstand

70 χ Amm.sulf . Cut (1/16) Fraktion 1 (lOOuq/ral)

NB1/19

Kulturüberstand

125 χ Amm. sulf, .cut (1/16)

Fraktion 2 (100 pq/rol) KuItürüberstand

125 χ Amm. sulf. . Cut (1/16) Fraktion 2 (100 μη/ml)

	16v	20++	52+
NT	1B++	32+	NT
12++	21 +	41 +	Il
78+	101 +	NT	Il
NT	209+	H	Il
79+	>1B0+	Il	Il

3c	5c	7v	tiQv
NT	5c	Bv	10v
6v	10v	25++	NT
9v	13v	2Ov	31++
NT	11v	17v	19++
23v	33v	71++	NT

16

NT

Il Il

16

NT

19++

NT

Il Il Il

r-o co cn

-2s-

Die erhaltenen Ergebnisse mit Doppe l.verdünnungen

verschiedener Reagentien sind in der folgenden 5

Tabelle 5 aufgeführt und sie zeigen die relative

Wirksamkeit von NB1/1-9 .1 1 2 . 28. So ergab zum Beispiel bei 4-facher Verdünnung das Präparat des Kulturüberstands unter Testbedingungen eine zufriedenstellende Reaktion mit A₁ B-Zellen im Vergleich zum im Handel

verfügbaren anti-B-Serum.

ω ο

bo cn

(SD O

cn

Cn

Tabelle 5 Einfluß der Verdünnung auf die Aviditätszeiten (s) von anti-B-Reagentien

mit A B-Zellen

NB1/19.112.28 *

Verdünnungsfaktor
4 8 16
10 16 26

BGRL anti-B-Serum

■handelsübl. anti-B-Serum

19 >100

22

57

* Gibt einen Titer von 1:512 mit den in diesem Test verwendeten A B-Zellen.

Nicht jeder monoklonale Antikörper mit ΛΒΟ-Spezifität ist zur Blutgruppenbestimmung gleichermaßen geeignet. In den hier gegebenen Beispielen waren zwei der drei c monoklonalen anti-B-Verbindungen als Blutgruppenreagenzien weniger geeignet, wobei jedoch deren Eigenschaften mit denen des BGRL-Standards vergleichbar waren.

Die Spezifität des monoklonalen anti-B erlaubt die Meßung _n einer quantitativen funktionellcn Affinität. Die funktionelle Affinität kann auf zweierlei Weise ausgedrückt werden.

Erstens kann die funktioneile Affinität als eine Gleich-

, ._ gewichtskonstante für die Assoziationsreaktion zwischen ο

einem Molekül von monoklonalem anti-B IgM und einer B-Determinante (des entsprechenden immunochemischen Typs) auf ein Erythrocyt ausgedrückt werden. Die Gleichgewichtskonstante (im folgenden mit K bezeichnet) wird

„_n erhalten, indem zunächst die Gleichgewichts-Bindungs-

125

menge von J-markierten anti-B-Antikörpern mit Gruppe B-Erythrocyten bei verschiedenen Konzentrationen des in der Lösung vorliegenden bindungsfähigen Antikörpers gemessen wird. Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt:

Alle Tests wurden als Doppelbestimmung durchgeführt.

Lineare Verdünnungsreihen von J-markiertem NB1/19 und NB1/48 wurden in Pufferlösung (0.8 % BSA-EBSS + 10 mM Hepes + 0,1 % NaN.,, pH 7,4) hergestellt durch genaues 2Q Einpipettieren unter Verwendung einer Hamilton-Injektionsspritze, die zwischen dem Gebrauch in den einzelnen

-IOC

Röhrchen 5 mal gespült wurde. 25 μΙ-Anteile des J-markierten Antikörpers wurden zu 1,5 ml Beckman-Mikrofugierröhrchen zugegeben, worauf 15 μΐ Puffer mit gg einem Gehalt an 2 χ 10 frischen Zellen der Gruppe B zugesetzt wurden. Die Probengemische wurden bei 4 ⁰C auf einer Rolle inkubiort. Nach 6h wurden 1,5 ml

eiskalte Pufferlösung rasch zugegeben und unmittelbar danach schloß sich eine 15 s lange Mikrozentrifugenbehandlung und die Entfernung des Überstands an, wobei die Zeit von der Zugabe des Puffers bis zum Einschalten der Mikrozentrifuge 2 bis 4 s betrug. In Vergleichsinkubationsversuchen wurden 2 χ 10 A -Zellen durch

125 B-Zellen ersetzt und die Bindungswerte von J-mar-

lü kiertem NB1/19 und ND1/48, die 1,2 bis 2,0 % bzw. 0,9 bis 1,2 1 der zugesetzten bindungsfähigen Impulse betrugen, wurden von den Versuchswerten abgezogen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 1 wiedergege-

125 15 ben, wo die Menge an gebundenem J-Antikörper

(cpm χ 10 ) aufgetragen ist gegen die Menge an zugesetztem bindungsfähigem Antikörper ^g) für NB1/19 und NB1/48. Anhand dieser Kurven ist es möglich, ein modifiziertes Scratchard-Dicörauiil der Gleichgewichts-

125

20 bindungcharakteristika von J-markiertem anti-B

mit Gruppe B-Erythrocyten herzustellen. Ein derartiges Diagramm ist in Figur 2 gezeigt, wo Werte für sowohl NB1/19 als auch NB1/48 wiedergegeben sind, wobei für letztere Verbindung die Kurve im vergrößertem Maßstab in dem Einsatzbild wiedergegeben ist. In beiden Fällen ergibt eine Extrapolierung auf die X-Achse die Menge an gebundenem Antikörper bei Sättigung.

Die Gleichgewichtskonstante kann aus dem Scratchard-Diagramm leicht errechnet werden.

Alternativ kann die funktioneile Affinität als eine Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für die Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes ausgedrückt werden, der zwischen einem Molekül aus monoklonalem anti-B-IgM und einer B-Determinante (des entsprechenden

AO

immunochemisehen Typs) auf einer.i. Erythrocyt gebildet ist. Die Dissoziationsgeschwindigkeits- oder Dissoziationsratenkonstante (im folgenden , ₁ bezeichnet) kann aus

125 einer Kurve der Dissoziation mit der Zeit eines J-markierteη monoklonalen anti-B von Erythrocyten berechnet werden durch Messung des Gradienten einer Tangente an die Dissoziationskurve, die durch die Zeit 0 konstruiert ist.

125 In einem Versuch wurde die Dissoziationsrate von J-markiertem anti-B-Antikörper von Gruppe B-Erythrocyten bei 4 ⁰C und RT gemessen unter Bedingungen eines Uber-

12 5 Schusses an kaltem Antikörper. 25 μΙ-Anteile von J-markiertem NB1/19 (bindungsfähiger Antikörper: 6,0 χ cpm, 50 ng) oder NB1/48 (9,0 χ 10 cpm; 124 ng) wurden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eingebracht,und danach 25 μΐ Puffer (0,8 % BSA-EBSS + 1OmM liepes + 0,1 % NaN,,

6
pH 7,4), der 2 χ 10 Gruppe B-Erythrocyten enthielt.

Die Gemische wurden bei 4 ⁰C auf einer Rolle inkubiert. Nach 1h wurde zu 4 dieser Röhrchen 1,5 ml eiskalte Pufferlösung rasch zugesetzt und die Zellen wurden sofort pelletisiert mit einer 15s Rotationen einer Eppendorf-Mikrozentrifuge. Der Überstand wurde schnell entfernt und die Zellen wurden zur Messung der gebundenen Radioaktivität (cpm) überführt.

Zu den verbliebenen Teströhrchen, die 2h lang inkubiert waren, wurden 25 μΐ eines 125-fachen Ammoniumsulfatkonzentrats von NB1 /1 9-Kulturübersta'nd,verdünnt 1/10 in Puffer, zugesetzt. Die 75 μΙ-Gemische wurden sodann bei 4 ⁰C oder RT auf einer Rolle inkubiert. Nach verschiedenen Zeiten (15 min bis 24 h) wurden 1,5 ml kalte Pufferlösung zugegeben und die Zellen wurden sofort pelletisiert und wie oben angegeben

¹ ~ Uo -

gezählt. In Kontroll-Inkubationsversuchen wurden 2x10 Λ1-Zellen anstelle der Gruppe B-Zellen eingesetzt und die Bindung von NB1/19 und NB1/48 nach einer Inkubation von 1h bei 4 ⁰C, welche 1,1 % bzw. 1,9 % der zugesetzten Ir.pulse betrug, wurde von den Versuchswerten abgezogen. Die Bindung wurde sodann ausgedrückt als Prozent der Irrpulse , die am Ende der 2h-Vorinkubationsperiode gebunden waren. 100 % Bindung durch J-mar-

4 kiertes NB1/19 und NB1/48 betrug 9,1 χ 10 cpm bzw.

4 715 χ 10 cpm.

Im endgültigen Reaktionsgemisch lag kaltes NB1/19 in mindestens 40-fachem Überschuß über markierten Antikörper vor unter der Annahme, daß die Konzentration an monoklonalem Antikörper im Kulturüberstand mindestens 10 μΐ/ml beträgt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 3 wiedergegeben, in der gezeigt wird:

a) die Dissoziation über eine 24h-Periode und

b) die ersten 45 min, die auf eine vergrößerte Zeitskala aufgetragen sind.

In einem weiteren Versuch wurde die Dissoziationsrate

"IOC CL

von J-markierten anti-B-Antikörpern von 2x10

B - oder A B-Erythrocyten bei RT unter den Bedingungen eines Überschusses an kaltem Antikörper bestimmt. Die Versuchsbedingungen waren identisch mit denjenigen, die im Zusammenhang mit Figur 4 beschrieben sind, jedochmit der Ausnahme, daß nach der Zugabe von kaltem Antikörper zum Antigen-markierten Antikörperkomplex die Zellen pelletisiert wurden in 2 min-Intervallen während einer Zeitspanne von 10 min. Die Auswertung der Ergebnisse war ebenfalls identisch. Die folgenden Bedingungen und Werte wurden angewandt bzw. erhalten:

3 ? 3 5 9 2 A

zugesetzte bindungsfähige

125_T _ . .. J-Antikorp.

(cpm) (ng)

Fig. 4 (i)[nb1/19:6,9 χ 10⁵

[nB1/48: 9,0 χ 10⁵

¹⁰ Fig. 4(ii) [nb/1/19: wie oben :NB1/48:

Untergrundimpuls

χ 100 %

χ A--Zellen Bindungs-

■ (1 % zugesetzt cpm)

0,3 % 1,3 χ 10'

0,5 % 5,2 χ 10⁴

wie oben "3,7 χ 10' 4,1 χ 10~

Die Ergebnisse sind in Figur 4 wiedergegeben, in der darstellen:

Kurve i) Erythrocyten der B-Gruppe und Kurve ii) Erythrocyten der Gruppe A₁B.

D.ie funktionellen Affinitäten, die in den oben angegebenen Versuchen gemessen wurden, und die Eigenschaften, die durch andere, oben beschriebene Tests gemessen wurden, sind in den folgenden Tabellen 6 und 7 zusammengefaßt bezüglich der Wirkung von NB1/19.112.18 bzw. NB1/48.30.40.

ω co to bo ►"-■

CJi . O CJi ■■ O Cn

Tabelle 6 Characteristica des monoklonalen anti-B-Äntikörpers NB.1 /1 9. 11 2 . 28 auf

B- und A₁ B-rote Blutkörperchen

K^a	is"¹	1	Q Agglutination
(M"¹)		)	Zeit (s)
			bei 100 ixg/ral
	3,8 χ		IgM
2,3 X 10⁸	0 ,17 χ	ίο"⁴	6-2
NT	10"³	23-5

Titer	ug IgM
bei 100 ug/ml	benötigt für
IgM	4 χ 10 röte
	Blutkörp.
64 (32-64)	0,31
64 (32-64)	1,20

a = aus dem Scatchard-Diagram abgeleitete Gleichgewichtskonstante ,

125
b = Dissozxationskonstante für j-markierten Antikörper (10 min-Kurve) :.,«:.

c = Plattenagglutination χ 20 % Zellen in Salzlösung: 25 μΐ Antikörper + 25 μΐ Zellen ] _m ^

d = 2h Röhrchenagglutination χ 20 % Zellen in Salzlösung: 25 μΐ Antikörper + 25 μΐ Zellen ' CO

e = Menge an Antikörper, die erforderlich ist, um gerade eine vollständige Agglutination ■."*.*·cd

von 4 χ 10 roten Blutkörperchen in einem Reaktionsvolumen von 50 μΐ zu bewirken, ." '. ¹^

d.h. in einer 2h - Röhrchenagglutination χ 2 % Zellen in Salzlösung unter Ver- ' '··'

Wendung von 25 μΐ Antikörper in unterschiedlichen Konzentrationen + 25 μΐ rote

Blutkörperchen NT= nicht getestet

ω
ο

to cn

to ο

■ σι " ο σι

Tabelle 7 Characteristica des monoklonalen anti-B-Antikörpers NB1/48.30.40 auf

B- und A.B-rote Blutkörperchen

K
(M"¹)

k« Agglutination

(s"¹) Zeit (S)

bei 100 ug/ml

IgM

Titer ug IgM

bei 100 ug/ml benötigt für 4 χ 10 rote Blutkörp.

B 2,7 χ 10

A. B X⁷T

1,1 x 10 12-4 2,5 χ 10~² 79 32 (16-32)
4 (2-8)

5,0 20,0

' cn •'■co

Es wurden noch weitere Tests durchgeführt zur Untersuchung der Effizenz von NB1/19.112.28 als Blutgruppenbestimmungsreagens in automatischen Blutgruppenbestimmungsmaschinen, zur Untersuchung seiner Selektivität bei Verwendung von papainisierten roten Blutkörperchen und zur Untersuchung seiner termischen Stabilität.

Automatische Blutgruppenbestimmungstests wurden durchgeführt mit dem neuesten Autogrouper 16C mit optischer DichteaDlosmg und Microprocessor-Ausdruck . Die Reagenzien wurden verstärkt durch Verwendung von 1 % Methylcellulose und 0,25 % Bromelin.

Monoklonaler Antikörper NB1/19.112.28 - Kulturüberstand, verdünnt 1 in 15, wurde im Autogrouper 16C getestet mit 844 c itrat-versetzten Spenderblutproben. Die in derfolgenden Tabelle 8 aufgeführten Ergebnisse waren ausgezeichnet und waren die gleichen, wie sie mit BGRL-anit-B, verdünnt 1 in 10, von den gleichen Proben erhalten wurden. Keines der Reagentien ergab falsche positive oder falsche negative Resultate.

Tabelle 8

Automatische Blutgruppenbestimmung von Spenderblut mit monoklonalem anti-B NB1/19.112.28

35 0

Anzahl etestet

Positive Reaktionen	Negative Reaktionen
28	0
5	0
64	0
0	355
0	392

3/3 59 24

In den oben beschriebenen Röhrchen- und Platten-Salzlösungstests und in den automatisierten Tests unter Verwendung von Zellen, die mit 1 % Methylzellulose und 0,25 % Bromelin verstärkt worden waren, reagierte monoklonales anti-B niemals mit A- oder O-Zellen. Die anti-B-Spezifität von NB1/1 9.1 1 2 . 28. wurde auch beibehalten mit papainisierten roten Blutkörperchen und unter Verwendung von 20 % Albumin, wie die folgende Tabelle 9 zeigt. Erkennbare Verstärkung von NB1/19.112, 28- Agglutinationsaktivität war in diesen Tests festzustellen und besonders ausgeprägt mit Α,,Β-Zellen, die mit Papain versetzt waren.

Tabelle 9

Auswirkung von Papain und 20 % Albumin auf Agglutinationstiter bei Raumtemperatur

Monoklonales anti-B NB1/19.112.28

Salzlösg. Papain Albumin

Human-anti-B
BGRL 7327

Salzlösg. Papain Albumin

A.B 256

512 512

1 024 512 1 024 1 024 1 024 1 024

16 32 16 32 32 64 32 64 32

Zur Durchführung der Stabilitätstests wurden aliquote Teile von 2 ml unverdünntem NB1/19.112.28-Kulturüberstand

• ·

-4-T

verschiedenen Bedingungen ausgesetzt und danach bei Raumtemperatur erneut auf Titer und Avidität getestet.

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen führte zu keiner Verminderung der anti-B-Aktivität, wie sich aus der folgenden Tabelle 10 ergibt.

Tabelle 10

Stabilität von monoklonalem anti-B (NB1/19.112.28)

gegenüber	Einfrieren/Auftauen	Aviditätszeit (s) χ A₁B-Zellen	Überst. *1:2 Überst.
Zahl der Einfrier-/ Auftaustufen	Agglutination Titer χ Α B-Zellen	'1:1	7
		5	7
χ 1	1 024	4	7
χ 2	1 024	5	7
χ 3	1 024	5	7
χ 4	1 024	5
χ 5	512

* Die Verdünnungen wurden durchgeführt im Anschluß an die Behandlung des unverdünnten Uberstands

Die durchgeführten Tests zur Bestimmung der thermischen Stabilität über kurze Zeitspannen zeigten, daß monoklonales anti-B stabil ist bei der Lagerung bei -20 ⁰C und 4 ⁰C und bei der Inkubation bei 56 ⁰C, wie die

3735924

folgende Tabelle 11 zeigt.

Tabelle 11

Temperaturempfindlichkeit von NB1/19.112.28

Behandlung

Salzlösungstiter χ A₁B-Zellen

2 Wochen bei - 20 ⁰C	512
1 Woche bei 4 ⁰C	512
24 h bei 20 ⁰C	512
24 h bei 37 ⁰C	512
1/2 h bei 56 ⁰C	512

Aviditätszeit (s) χ Α B-Zellen

1:1 Uberst. *1:2 Uberst. *1:4 Uberst.

6 7 6

Der unverdünnte Kulturüberstand hatte eine Wirksamkeit, die mindestens gleich derjenigen eines hyper immunen handelsüblichen Reagenz war, ohne daß Zusätze verwendet wurden. Er ergibt eine rasche Plattenreaktion mit dichter Agglutination, die geeignet ist zur Bestimmung der schwächeren Typen von B (A B- und B cord-Zellen),

30

mit denen der Fachmann bei der routinemäßigen Blutgruppenbestimmung befaßt ist. Er kann auch in zuverlässiger Weise für automatisches Ausdrucken von Blutgruppen verwendet werden.

Zwei mal klonierte Antikörper-produzierende Hybridzellenlinien wurden angepaßt an das Wachstum in großen Gewebekulturgefäßen und, nach wiederholter Passage, sekretieren sie kontinuierlich Antikörper mit gleichförmigen Eigenschaften. Große Volumen aktiven Kulturüberstands, die durch kontinuierliches Wachstum erzeugt sind, haben den Vorteil, daß sie weitaus weniger Auslesetests benötigen, als zur Zeit zur Erzeugung des gleichen Volumens Human-Reagenz aus einer großen Zahl von individuell ausgewählten Serumspendern erforderlich sind , was die Testsarbeitsbelastung wesentlich erleichtert. Außerdem können die ohnehin niedrigen Kosten (zur Zeit etwa h 5 ) für Materialien, die zur Herstellung von 1 1 wirksamen Kulturüberstand benötigt werden, noch weiter vermindert werden durch Verwendung eines angemessen verdünnten Präparats von aktivem Überstand (vergleiche Tabelle 5).

35

Claims

Patentansprüche

3. Monoklonaler Antikörper nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Gleichgewichtskonstante der Wechselwirkung zwischen dem Antiköper und den Blutkörperchen vom B-Typ größer als

1,3 χ 10⁷ m"¹ ist.

4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Gleichgewichtskonstante der Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und den Blut:

ist.

ο -ι

Blutkörperchen vom B-Typ größer als 1,2 χ 10 M

5. Monoklonaler Antikörper nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Geschwindigkeits-

30 konstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und den B-Typ-Blutkörperchen der Blutgruppe B kleiner als 2,2 χ 10~ s~ ist.

6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5, dadurch

35 gekennzeichnet, daß dessen Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und dem B-Typ-Blutkörperchen der Blutgruppe B kleiner als 7,6 χ 10~ s ist.

7. Monoklonaler Antikörper nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dessen Geschwindigkeitskonstante der Dissiziationsreaktion eines Inununokomplexes aus dem Antikörper und B-Typ-Blutkörperchen der Blutgruppe A₁B kleiner als 5,0 χ 10 s ist.

8. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 7, dätlurch gekennzeichnet, daß desssen Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationsreaktion eines Immunokomplexes aus dem Antikörper und B-Typ Blutkörperchen der Blutgruppe AB kleiner als 3,4 χ 10 s ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einer Maus eine Substanz der Gruppe B injiziert, die Maus tötet, ihr die Milz entnimmt und eine Suspension von Milzzellen bildet,
-die Milzzellen mit Maus-Myelomzellen fusioniert unter

Bildung von Hybridzellen,
-die Hybridzellen kloniert und -die klonierten Hybridzellen den Antikörper sekretieren

25 ^läßt·

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hybridzellen vor dem Klonieren einer Selektion unterwirft.

11. Verfahren nach Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Myelomzellen NS1-Zellen einsetzt.

12. Monoklonaler Antikörper, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 9.

2.3 5 9.24.

—s

13. Hybridomzellen zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 9, die zur Sekretion von monoklonalen Antikörpern nach Ansprüchen 1 oder 2 befähigt sind.

14. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Ansprüchen 1 oder 2 als Reagenz zur Blutgruppenbestimmung. „.