DE1926817C - Brucellose Antigene enthaltende Vaccme - Google Patents

Description

sich eine neue Agglutination zeigt, ,ind solche, in denen das verwendete Serum noch agglutinierende Antikörper im Überschuß enthielt. Die kleinste Sertimmenge, die eine erneute Agglutination der Antigene der Gläser der Serie Nr. 2 erlaubt, entspricht der notwendigen und ausreichenden Menge von agglutinierendem Serum, die gleichsam zur Sättigung der gesamten in der Serie Nr. I verwendeten agglutinierenden Antigene erforderlich ist.

Diese Methode gestattet die leichte Bestimmung .ler Mengenverhältnisse der Antigene und des Immun-.rums in vitro, die angewendet werden müssen, um J ie Vaccine gemäß dor Erfindung herzustellen.

/ur Herstellung der Vaccine genügt es dann, die mitsprechenden Mengen von Antigen und Immun- '5 <-. mm. vorzugsweise unter Rühren ''.1/UsIcUeH.

lemiiü einei Abänderung des Verfahrens ist es , benfalls möglich, die Antigene in Gegenwart eines !"berschusscs an Immunserum einzustellen, und da-

ich z.B. durch Filtrieren das Serum abzutrennen, ,!,■λ anschließend für andere Zwecke verwendet wer-. ;·.:η kann.

Beispielsweise konnte festgestellt werden, daß man ■■ine Vaccine gegen die Brticellose erhallen kann, die vollkommen nicht agglutinogen ist und keine Bildun» ²S .mi agglutinierenden Antikörpern verursacht, wobei -.'ie Vaccine 5 bis ¹O Milliarden Bakterien je ml Serum :ind einen Titer von 800Ί inter-ationalen F.inheiten besitzt.

Die Erfindung wird durch die '" llgenden Beispiele niiher erläutert:

B e i s ρ i L¹ I 1

Herstellung einer nicht agglutinogcnen Antibrucellose-Vaccine mit Hilfe von Blutserum

I. Herstellung der Bestandteile

35

Λ. Bakterien der Gattung Brucella

Man verwendet entweder einen Bruceilastamm wie /. B. Brucella abortus Stamm Buck 1⁽) oder einen über 4< > ein brucellosekrankes Tier isolierten Brucellas'.amm. Der ausgewählte Brueellastamm wird auf Kulturmedien gesät, die entweder flüssig (Serum-Bouillon. Tryptose-Glyzerin-Bouillon) oder fest (Serum-Gelose. Tryptose-Glyzerin-Gelose) sind.

Gemäß der üblichen bakteriologischen Verfahrensweise besät man den Brueellastamm über 20 sterile Kulturmedien vom Typ einer Scrum-Gelose-Schrägkullur in Roux-Kolben von 1 Liter Inhalt. Die besäten Kolben werden für 4 Ί age in einen Brutschrank 5" mit einer Temperatur von 37 C gesetzt. Danach werden die erhaltenen Bakterienkolonien geerntet, wobei man 10 ml sterile isotonische physiologische Kochsalzlösung in jeden Kolben gießt und die Bakterien in der Lösung suspendiert.

Die gesamten verschiedenen Bakteriensuspensionen werden in einer sterilen Flasche gesammelt, und es wird gemäß der üblichen Verdünnungsmethode durch Einsäen auf Gelose eine Kulturreirx. hergestellt.

Durch Verwendung von geeigneten Verdünnungen wird eine Baktiensuspensioii hergestellt, die etwa 100 Milliarden Bakterien je ml Suspension enthält. Man bringt 5 ml der Bakteriensuspension dieses Titers in ein Zentrifugenrohr. Diese Probe wird mit großer Geschwindigkeit 30 Minuten lang zentrifugiert. Es werden zwei Phasen in dem Zenlrifugenrohr erhalten. iKimlich eine überstehende llüssige Phase A, die in einer auf 4 C tiehaltenen !lasche aufgefangen und auf vollständige Abwesenheit von Mikrobenkörpern geprüft wird, und eine dickflüssige Phase B, die am Boden absetzt. Sie besteht aus Baklerienkörpern.

Die Phase B wird entnommen und erneut in 10 ml einer auf 5^U ■■ verdünnten Formaldehydlösung suspendiert. Die mit Formol inaktivierte Bakteriensuspension wird im Reagenzglas in ein Wasserbad von 58 C 30 Minuten lang eingestellt und anschließend 30 Minuten lang mit großer Geschwindigkeit zentrifugiea. Man erhält zwei Phasen im Zentrifugenrohr, nämlich eine überstellende flüssige Phase, die verworfen wird, und eine dickflüssige bakterienhaltige Phase B₁, die sich am Boden absetzt.

Die Phase B, setzt sich aus durch Wärme und Formol inaktivierten Bruceilabakterien zusammen.

Die Bakierienphase B₁ wird dann m ein Reagenzglas gebracht und in der gesamten Phase A wieder suspendiert. Diese letzte Bakteriensuspension (A ^; B₁) wird als Suspension C bezeichnet. Sie enthalt annähernd 500 Milliarden inaktivierte Biucellabi'sterien in einem Volumen von etwa 5 ml.

Die Bakteriensuspension C" bildet den ersten Bestandteil der erfindungsgemäßen Vaccine.

B. Antibruediose-Serum

Fun Antibrueellose-Serum, das reich an Anliköi pern ist. wird durch Hvperimmuni'.ation eines erwachsenen gleich warmblütigen Tieres mit Hilfe einer agglutinogenen Anlibrucel lose-Vaccine gewonnen.

Man injiziert beispielsweise einem zweijährigen und von jeder Krankheit freien Hammel subkutan eine Suspension \on Brucella abortus Stamm Buck I¹J, die 20 Milliarden lebeiiue Bakterien enthält. Line gleiche Injektion nimmt man 8 :md 1 : 'age nach der ersten Vaecinierung vor. 10 lage nach der letzten Vaccmeinjektiun entnimmt man dem Tier nüchtern durch Punktion der Halsvene Blut. Man entnimmt steril 200 ml Blut in eine Hasche, läßt da* Blut gerinnen und fängt das Serum in einer neuen Flasche auf. Das Serum wird durch Aufwärmen im Wasserbad bei 56 C 30 Minuten lang inaktiviert. Die Sterilität des Serums wird g-prüft. Der Titer der agglutinierenden Antikörper des Serums wird nach dem langsamen Serumagglutinationsverfahren von Wright im Röhrchen bestimmt. E-.in agglutinierendes Serum mit einem Titer von 8000 internationalen agglutinierenden Einheiten pro ml stellt den zweiten Bestandteil der Vaccine dar.

2. Vaccineherstelluiig

Die endgültige Herstellung der Vaccine wird folgendermaßen durchgeführt:

Man gießt in eine sterile Flasche 5 ml der Suspension C und IOD ml des agglutinierenden Antibrucellose-Serums mit einem Titer von 8000 internationalen agglutinierenden Einheiten.

Diese Mengenverhältnisse von Vaccine und Serum sind diejenigen, die gemäß der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt vvotden sind.

Das Gemisch wird 60 Minuten in ein Wasserbad einer Temperatur von 37 C gestellt, dann bei 37' C 24 Stunden unter zeitweilig unterbrochenem und mäßigem Rühren in einen Brutschrank gestellt und anschließend 24 Stunden auf 4 C gekühlt. Man erhält so die endgültige Substanz von 500 ml Volumen.

die 500 Milliarden inaktivierte Brucellabakterien enthält. Die Sterilität des Endproduktes wird geprüft. Die hergestellte Vaccine wird darauf den üblichen Unschädlichkeits- und Wirksamkeitskontrollen unterworfen.

Es wird ferner eine Spezialkontrolle zur Bestimmung der agglutinogenen Eigenschaften dei Vaccine durchgeführt. Hierzu wird die Vaccine Tieren injiziert, von deren Serum man eine Agglutininbestimmung durchführt, beispielsweise 15, 30 und 45 Tage nach der Seruminjektion.

B e i s η i e 1 2

Herstellung einer nicht agglutinogenen Antibrucellose-Vaecine mit Hilfe von Lactoserum

Herstellung der Bestandteile

Λ. Bakterien der Gattung Brucella

Die Bakterien des Stammes Brucella E 19 werden gemäß Beispiel 1 hergestellt.

B. Antibrucellose-l.actoserum

Das Antibruce'.lose-l.actoserum wird in folgender Weise hergestellt. Man geht aus von einem inaktiven Stamm Brucella B I¹J und einem lebenden Stamm Brucd'.a B 19. Bei einer milchgebenden Kuh führt man die folgenden Injektionen durch:

Im Zeitraum von 2 Wochen werden zwei Injektionen je Woche von 100 Millionen inaktivierten Brucella B 19 und anschließend innerhalb von 3 Wochen zwei Injektionen von 10 Millionen lebenden Brucella B 19 je Woche vorgenommen. Alle Injektionen werden in eine Zitze durchgeführt.

Das Abziehen des Serums beginnt 48 Stunden riüch der letzten Injektion. Man trennt die kleinen BuUeimilchbestandteile durch Lab ab und extrahiert die Immunoglobuline durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat.

Die Gegenwart von Antikörpern wird durch Titerhestimmung bei der Serum-Agglutination bestimmt. Nach dem Beginn der Serumgewinnung werden weiterhin zweimal wöchentlich H) Millionen lebeider Brucella vom Stamm B 19 injiziert.

Unter diesen Bedingungen wird wahrnehmbar die höchM ■ Konzentration von Antibrucellose-Antikörpern in dem Serum erzielt. Man kann jedoch auch eine von diesen Bedingungen abweichende Scrumgewinnung vornehmen, ohne deshalb vom Erfindungsgedanken abzuweichen.

2. Vaccineherstellung

Man stellt die Vaccine gemäß der Erfindung, mit Hilfe der gemäß A hergestellten Antibruceüose-Vaccine und dem gemäß B hergestellten Lactoserum her. Die erhaltene Vaccine weist ähnliche qualitative Eigenschaften auf, wie die gemäß Beispiel 1 erhaltene Vaccine.

Claims (1)

1. ι *

   nisinus die gegen die Krankheit spezifischen Anti-

   Patcnianspruch: körper auf einmal geliefert werden, wodurch d,c

   Anti-ene dem Organismus den Aufbau seiner eigen, π

   Bruceliose-Antigene enthaltende Vaccme, d a - Antikörper gestatten. Gemäß der Erfindung werden durch gekennzeichnet, daß sie soviel 5 demgegenüber die Mengenverhältnisse der Anngcn. Brucellose-Immunseriim enthält, daß alle aggluli- und des Immunserums genau besiiu.-Mi, damit noueiien Stellen des Brucellose-Antigens ab«e- uichtagglutinogene Vaccine erhalten wird sättigt sind " Weiterhin werden die Seroanavaccine des bekanr.

   ten Typti- im allgemeinen durch Inaktivierung ein,■ ίο Mikroorganismus durch Formol und Hinzufügen lh

   Serums oewonnen, wahrend die Vaccine gemäß el·:.

   Frfindung auf der Basis von Anligenen gebildc. w,-den. die an sich inaktiv sind.

   Die lirlindurm betrilfl eine Brucellose-Antigene GemaT. der Erfindung wird vorzugsweise das ν,

   enthaltende Vaccine. " .5 wendete Antigen mit einem heterologen lmmunv-n

   Aus der dreschen Ausleueschrift 1 ItX 703 ist die Ncihmukn. d. h. einem Serum, das von einer ander _ Herstellung einer Brueellose-Vaecine bekannt, wobei Tierait s:ammt als diejenige, fur die esbestimmt : eine an Antigene!) reiche Baktcriensuspeiision aus In bestimmten lallen kann jedoch ein homoloj.-einer Bruccllakuluir extrahiert wird. Da diese Vaccine Imnuinsuum ebenfalls in Verbindung mit dem Au. auüluiinoiiene Antigene enthält, verursacht sie eine 20 gen verwendet werden.

   Biidun» von agglutinierenden Antikiirpern in dein Das gemäß dei I rfindunu verwendc'.e Antnj.

   l-mplangeroiganiMiius, die spüler von den durch eine kann en Antigen auf der Basis von Bestandteil normale Reaktion neuen eine Krankheit eines nicht ode: Fviakten von Mikroben sein. Is kann / geimpften Organismus gebildeten Antikörpern nicht aus Bakterien, die durch ein Inaktivierungsniil!,; unterschiedene erden koiiüen. Hierdurch ist es prak- 25 wie Formol. Warme oder Merthiolat. vollkomm-.v tisch nicht möglich, festzustellen, ob man es mit inaktiviert «orden sind, oiler aus vollständigen IeIx ·. einem kranken oder mit einem geimpften Organismus den Bakteiien, die einem verdünnten oder avirulc:: /u tun hat. was /u Fehldiamiosen führen kann. ten Stamm angehören, bestehen.

   Is wurde gemäß der' deutschen Auslegeschrilt Das Antigen kann auch durch agglutinogene, ein=. ·.

   12(o^l)|h schim vorgeschlagen, solche Brucellose- 30 I.w· uniei worfenen Bak'-rien gebildet werden. w< Vaeeinen zu \eiwenden, die weder toxisch noch bei die l.yse z.B. durch enzymatische Finwiikuiv. agglutinine!) sind, also keine Bildung von nachweis- durch Ultraschall oder auf chemischem Wege nii'.ie! . ba'i· agglutinierenden Antikörpern im geimpften Orga- Produkten wie Basen oder Säuren erfolgt ist. Π..< ■ nisiiius nach sich ziehen, weil die Agglulininbildung Aminen kann außerdem ein aus Bakterier.hüllen odei unerwünscht sei. Solche nicht agglutiiiogenen Vacci- 35 durch IMraktion erhaltenes agglutinogenes Antigen neu weiden aus Mutanten von Bru'-'ila-Stämmen. sein

   \01 zugsweise aus einem in »rauher« Phase kultivier- Das gemäß der Frfindung verwendete Se um kanu

   ten Mikrobensiamm hergestellt. entweder Blutseruni oder l.aetoserum sein. Is muLl

   Die bekannten nicht agglutinogenen Vaccinen be- nur der einzigen Bedingung genügen, daß es eine eni-Iriedigen jetloch nicht vollständig, da sie trotz der 40 sprechend der Natur des Antigens der Vaccine aus-Fabrika'ionskontrollen, denen sie unterworfen sind. reichende Dosis Antikörper enthält, in gewissen Fällen zur Bildung einer nicht zu ver- Das Herstellungsverfahren für die crfindungsge-

   nachlässigeiulen Menge von agglutinierenden Anti mäße Vaeeine ist im wesentlichen dadurch gekennkörpern Anlaß geben, was dazu führt, daß Organis- zeichnet, daß man auf eine bestimmte Menge von men als kr nk betrachtet werden, die einfach geimpft 45 agglutiriogenen Brucellose-Antikörpern eii.e zur Abworden waren. Fs wurde gelinden, daß eine Brucel Sättigung der agglutinogenen Stellen des Antigens lose-Antigene enthaltende Vaccine, die dadurch ge notwendige und ausreichende Menge Immunscrum kennzeichnet ist, daß sie soviel Brucellose-lmmun- einwirken läßt.

   serum enthält, daß alle agglutinogenen Stellen des Zur Bestimmung der notwendigen und ausreichen-

   Brucellose-Antigens ahgesätiigt sim',, in dem l-.mp- 5" den Menge des Serums kann man folgendermaßen längerorganismus keine oder nur so wenig agglutinie- vorgehen:

   rende Antikörper bildet, daß jede Verwechslung eines Man gießt eine bestimmte Menge von agglutinoge-

   geinv'.ftcn mit einem kranken Orcanimiis vermieden nein Aminen und jeweils unterschiedliche Mengeiv wild. von agglutinierendem Immunserum in eiiv Reihe von

   Die eilindungsgemiiße Riucellosr-Antigciic enlha!- r,5 Reagen/glascrn (Serie Nf. I). Man hält die Gläser mil iende Vaccine verliert ihren agglininogenen ('harakler de: Miscliung aus Antigen und Serum auf 37 C Darilerart. daß ilie agglutinierenden Antikörper im ge- a f wirii das Serum in jedem Reagenzglas gewonnen. impften Organismus nicht mit der Menge der duieh was durch Zentrifugieren durchgeführt werden kann. die Reaktion des Orüanimtis neueniiber der Kiankheit wenn '.las Aniiiien teili:henförmig vorliegt, und durch liervor'ieiuleneii agühitinieieiiden Aniiköi|x.r vcr- fi» I iliiieren und F.xlrahieren über eine chromatograwechselt werden können. AüIVulrm besitzt si;.· den Ii -ehe Siitile. wenn das Antigen löslich ist. Vorteil, dall ihre ImmunisicMiiH'skiaft den bisher be Die derart .ms der Reageuzglasieihe (Serie Nr. I)

   kannten BiucelloscA'.ii-cincii .illiviiic:n iilvilci'cn ist. gewonnenen Seren werden in eine neue Reihe von ja sogai eine im->pc/iiis;-hc luununisier.'iu; ."inch ce-'en Reagenzgläsern (Serie Nr. 2) gegossen und mit neuen andere Kia'ikheilen mi'iliih i'i. 65 vorbestimmten Mengen von agglutinogeiiem Antigen

   \ uii hck.iimicii S ;■'an.p. .1.'CiIiCIi 'ink im lieiiiv'i sich /iisamnicniiebracht. Man beläßt die Röhren mit der die eiliiulnni" ι, iiKil'i· V.iccin,- duich ili.· 1 .iisiiche. neuen Mischui'n' aus Antigen und Serum 24 Stunden ■ !■iU linn'·. ei S.-iii:Mi.r. .n ■ in· η dem Ι'ΊιηΜ.ιιι.ί imii'.i lui ^;~ <' Die H.\. .< n/'.'l;iser der Serie Nr. ?. in denen