DE2854723A1

DE2854723A1 - Heterovakzine gegen das trichomonas- syndrom und ihr herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE2854723A1
Application number: DE19782854723
Authority: DE
Inventors: Ljubinko Stojkovic
Original assignee: Solco Basel AG
Current assignee: ICN Switzerland AG
Priority date: 1977-12-23
Filing date: 1978-12-19
Publication date: 1979-06-28
Also published as: FR2412314A1; GR65648B; IL56177A; CA1119095A; US4238478A; BE872884A; DK152174C; NL179543C; AR220548A1; FR2412314B1; AU4292778A; NO149316C; AT368390B; IN150348B; FI65166C; ES476703A1; FI783946A; CH639280A5; YU42170B; DK152174B

Description

Heterovakzine gegen das Trichomonas-Syndrom und ihr Her-

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind eine neue, zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms wertvolle Heterovakzine, ein Verfahren zur Herstellung derselben und ihre Verwendung.

Die Gattung Trichomonas_vaginalis gehört zu den Protozoen und, nach systematischer Einteilung der Protozoen von Bedeutung in der Humanmedizin, zur Klasse der Mastigophora oder Flagellata. Es ist ein prinzipiell pathogener Parasit, der im weiblichen und männlichen Urogenitaltrakt gefunden xörd. Die Uebertragung geschieht hauptsächlich durch Kohabitation, aber Infektionen durch Gegenstände sind auch nachgewiesen worden.

Obschon die Männer der Infektion ebenso häufig wie die Frauen ausgesetzt sind, weisen sie klinische Symptome wesentlich seltener auf; der Grossteil der Trichomonadenträger ist beschwerdefrei oder¹ beachtet eine leichte Sekretion- Symptom einer Urethritis - überhaupt nicht.

Für die Frau liegt die praktische Bedeutung der Infektion zuerst in der Störung der Genitalorgane durch massive eitrige Entzündungen der Scheide mit ihren oft entscheidenden Folgen für eine normale Ehe. Die Infektion bleibt im allgemeinen nicht auf die Scheide beschränkt,

909826/0836

meistens wird die begleitende pathogene Mischflora in den oberen Genitaltrakt durch die Trichomonaden mitgeschleppt und führt zu Entzündungen der Gebärmutteranhänge (Adnexitis), mit welchen die Gefahr einer Tubargravidität oder eines Verschlusses der Eileiter (Sterilität) einhergeht. Sowohl die chronische Infektion als auch die wiederkehrenden Rückfälle bewirken eine erhebliche Entzündung der Portio vaginalis uteri und der Cervix; Folge davon sind lokale Gewebsalterationen, welche von der rückbildungsfähigen Dysplasie bis zu Vorstufen des Gebärmutterhals-Karzinoms reichen. Das vielfAiItige klinische Bild wird gesamthaft als Trichomonas-Syndrom bezeichnet.

Obschon das Präparat Metronidazol [i-(2-Hydroxyäthyl)-2-methyl-5-nitroimidazol] zur Abtötung der Trichqmqnas_vaginalis durchaus geeignet und für diese Indikation in die Therapie eingeführt worden ist, zeigt die Zahl der Erkrankungen dennoch keine Abnahme, sondern eher eine ansteigende Tendenz; je nach Ländern sollen zwischen 3,5 und 88 % der Bevölkerung von der Infektion befallen sein, so dass man hier bereits von einer Volkskrankheit sprechen kann.

Die Ausbreitung der Infektion, und die immer wieder beobachtete Reinfektion werden durch die erhöhte Promiskuität kräftig gefördert. Zudem werden die Hartnäckigkeit der Infektion und eine gewisse Therapieresistenz durch den sich stets verbreitenden Dauergebrauch von ovulationshemmenden Steroiden begünstigt, da bekanntlich alle hypoovariellen Zustände, d.h. ein relativer Mangel an körpereigenen ovariellen Hormonen, die Epithelproliferation

909826/0836

-D-

in der Scheide hemmen.

Es wurde nun gefunden, dass unter der Vielzahl natürlich vorkommender Stämme (zur Zeit sina etwa 4.000 verschiedene Stämme bekannt) des Lactobacterium acido-Philum - auch Lactoba.cillus_acidO2hilus, Milchsäurebaktetien, Lactobakterien, Milchsäurelangstäbchen₃ Döderlein' Stäbchen oder Döderlein¹ Bakterien genannt - selche vorliegen, aus Vielehen eine zur Behandlung des Trichomonas-Syndroms wertvolle Heterovakzine hergestellt werden kann.

10 Die einzelnen Stämme sind 1976 aus der Vagina

von an diesem Syndrom leidenden Frauen im Spital entnommen worden. Die Stämme sind am 17. Oktober 1977 in lyophilisiertem Zustand beim "Centraalbureau voor Schimmelcultures" in Baarn (Niederlande) unter den Bezeichnungen

15 CBS 465.77 bis CBS 472.77 (acht einzelne Stämme) hinterlegt worden.

In morphologischer Hinsicht unterscheiden sich die verschiedenen Stämme u.a. nach der Grosse der gebildeten Kolonien: manche Kolonien sind sehr klein, durchsichtig und kreisförmig, andere Kolonien sind grosser und haben die Gestalt einer Rosette, deren Oberfläche zerfurcht ist. Mikroskopisch betrachtet gehören alle acht Bakterienstämme zu den grampositiven polymorphen Bazillen, die in Form von Ketten oder Palisaden vorkommen.

25 Das biochemische Verhalten dieser Stämme kann

durch ihr Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen wie folgt charakterisiert werden:

909826/0836

	Kohlenstoff
	quelle:
	Arabinose
	■Cellobiose
	Lactose
	Maltose
O	Mannitol
to co	Melibiose
ro as	Raffinose
/0836	Rhamnose Salicin Sucrose
	Trehalose
	Xylose
	Ribose
	Stärke

Tabelle 1

Lactobacterium_acidoghilum, Stamm CBS-Nr.:
465.77 466.77 467-77 468.77 469-77 470.77 471-77 472.77

■κ-

Die Stämme CBS 466.77, 467-77 und 469.77 zeigen dieselben biochemischen bzw. fermentativen Eigenschaften.

Die erfindungsgemässe Heterovakzine besteht also aus inaktivierten Mikroorganismen von Stämmen des Lacto- ^§£terium_acidophilum, Vielehe oben genannt sind, in einer physiologisch verträglichen Lösung, wobei die Mikroorganismen aus einem Teil dieser Stämme oder aus allen diesen Stämmen stammen und in annähernd gleicher Anzahl je Stamm vorliegen. Es sollen Mikroorganismen von mindestens drei Stämmen in der Vakzine vorliegen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Heterovakzine besteht darin, dass man von den zuvor genannten Stämmen von Lactobacterium acidophilus einen ' Teil bis alle jeweils für sich allein auf einem geeigneten flüssigen Nährboden unter aeroben Bedingungen züchtet, nach Abschluss der Züchtung das gebildete biologische Material abtrennt und nach bekannten Methoden inaktiviert und die aus den einzelnen Stämmen erhaltenen und inaktivierten Mikroorganismen in einer physiologisch verträglichen Lösung miteinander in Mengen vermischt, welche jeweils der nach Abschluss der Züchtung oder nach der Inaktivierung festgestellten Dichte der Kultur (Anzahl Mikroorganismen per ml Kulturflüssigkeit) umgekehrt proportional sind.

Die erwähnten Stämme sind so ausgewählt, dass bei Durchführung des Verfahrens unter Verwendung aller acht eine allgemein wirksame Vakzine erhalten wird.

Darunter versteht man eine Vakzine, welche praktisch bei jedwelcher Patientin überhaupt wirksam ist bzw. mit welcher, ungeachtet der Herkunft der Infektion, das Tricho-

309826/0836

chomonas-Syndrom erfolgreich behandelt werden kann. Deshalb stellt die Vakzine, in welcher inaktivierte Mikroorganismen aus den acht genannten Stämmen vorliegen, die bevorzugte Form der Erfindung dar und die Herstellung der Vakzine unter Verwendung der acht genannten Stämme ist die bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens.

Für die Züchtung der Stämme können verschiedene, in der Mikrobiologie übliche flüssige Nährböden verwendet werden. Als besonders zweckmässig hat sich ein Nährboden der folgenden Zusammensetzung erwiesen:

Tryptose-pepton Casein-hydrolysat Fleischextrakt Hefe-dialysat 15 K₂HPO₁,

Triammoniumcitrat

Natriumacetat

Salzgemisch

Polyoxyäthylenderivate der Sorbitanoleate

20 (Tween 80 ^R)

Glucose
Lactose
destilliertes Wasser bis auf

Das oben erwähnte Salzgemisch besteht aus:

MgSOj, -7 H₂O 11,5 g

MnSO₁,. 2 H₂O 2,4 g

FeSO^-7 H₂O 0,68 g

destilliertes Wasser bis auf 100 ml

909826/0836

5	g
8	g
10	g
100	ml
2	g
2	g
5	g
5	ml
1	ml
10	g
10	g
1000	ml

Das flüssige Medium wird auf einen pH-Wert von 6,1 bis 6,8j vorzugsweise 6,5, eingestellt und während 20 Minuten im Autoklav bei einer Temperatur von 115 ⁰C sterilisiert .

5 Der Nährboden vvird in sterilisierte Gefässe,

z.B. Erlenmeyerkolben, verteilt und der Inhalt jeden Gefässes mit einer Probe eines einzelnen Stammes angeimpft. Die Züchtung wird zweckmässig bei einer Temperatur von 32 bis 45 ⁰C, vorzugsweise bei etwa 37 ⁰C, z.B. während 48 Stunden durchgeführt. Nach dieser Zeitspanne oder wenn sich eine für die beabsichtigte Vakzineproduktion ausreichende Menge biologisches Material gebildet hat, wird dieses unter sterilen Bedingungen gesammelt und durch Zentrifugieren von dem anhaftenden Nährboden befreit; z.B. kann man während 1 Stunde bei 3000 Umdrehungen/Min, zentrifugieren.

Der aus dem biologischen Material bestehende Bodenkörper wird dann wieder in Suspension gebracht, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung, und hierauf nach bekannter Methode inaktiviert. Zur Inaktivierung eignet sich ganz besonders eine Behandlung mit Formaldehyd und Phenol; vorteilhaft erweisen sich eine Konzentration der Suspension von 0,3 % in Bezug auf Formaldehyd und von 0,5 % in Bezug auf Phenol und eine Behandlungsdauer von 3 bis 5 Tagen. Nach der Inaktivierung wird die Suspension wiederum zentrifugiert, z.B. während 1 Stunde bei 3OOO Umdrehungen/Min. , um das inaktivierte Material von dem zur Inaktivierung benutzten Mittel, bzw. vom Ueberschuss an Formaldehyd und Phenol, zu befreien.

909826/0838

285A723

Das aus jedem einzelnen Stamm erhaltene Material wird wiederum in Suspension gebracht, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung, und einer Prüfung auf Sterilität sowie einer Prüfung auf das Vorhandensein von noch lebensfähigen Lactobakterien nach den weiter unten bebeschriebenen Methoden unterworfen. Wenn beide Prüfungen negativ ausfallen, d.h. wenn sich das Material zur Herstellung der Vakzine eignet, wird die bei jedem Stamm erreichte Dichte der Kultur bzw. die Anzahl Mikroorganismen

10 per ml Kulturflüssigkeit bestimmt.

Ist es aus irgendeinem Grund nicht möglich, die Vermischung der einzelnen biologischen Materialien unmittelbar nach der Inaktivierung vorzunehmen, sollen die entsprechenden Suspensionen inzwischen bei einer Temperatur von 4 ⁰C aufbewahrt werden. Man kann auch die inaktivierten Mikroorganismen eines jeden Stammes lyophilisieren und in diesem Zustand bei etwa 4 ⁰C aufbewahren. Die lyophilisierten Stämme können bei dieser Temperatur während einer Zeitspanne von mindestens drei Jahren unverändert gelagert werden. Als Schutzkolloid für die Lyophilisierung eignet sich insbesondere ein Medium aus 5₃6 % Gelatine, 37>5 % Saccharose und 0,5 % Galciumlactobionat; zweckmässig wird während 24 Stunden lyophilisiert.

Schliesslich wird das aus den einzelnen Stämmen jeweils erhaltene und inaktivierte Material in solcher Menge vermischt, dass daraus eine in Bezug auf die Anzahl Mikroorganismen eines jeden Stammes per ml annähernd gleichwertige Vakzine entsteht. Die erhaltene Vakzine wird

909826/0836

mit Vorteil mittels physiologischer Kochsalzlösung so

weit verdünnt3 dass sie per ml etwa 14 χ 10 Mikroorganismen enthält.

Die Vakzine hat einen Gesamtstickstoff-Gehalt von 3j68 mg$ der Trockensubstanz (Bestimmung nach Kjeldahl). Es hat sich als zweckmässig erwiesen, ein Konservierungsmittel, beispielsweise Formaldehyd oder Phenol (Konzentration an Formaldehyd bzw. Phenol z.B. 0,25 %) oder Nafriumäthylmercurithiosalicylat (Thiomersal), zuzusetzen und die Vakzine während etwa 30 Tagen bei einer Temperatur von 4 ⁰C reifen zu lassen, bevor sie in Ampullen abgefüllt wird. Vorzugsweise enthält eine Ampulle 0,5 ml der beschriebenen Vakzine. Selbstverständlich sollen auch diese letzten Massnahmen unter sterilen Bedingungen und. in pyro-

15 genfreiem Glasmaterial durchgeführt werden.

Der Ampulleninhalt kann auch lyophilisiert und bis zum Zeitpunkt der Verwendung in Worm einer Trockenampulle, vorzugsweise bei etwa 4 ⁰C, gelagert werden. Die Haltbarkeit der Vakzine, ob in Form der üblichen Ampullen oder als Trockenampulle, beträgt mindestens drei Jahre ab Herstellung, wenn sie bei einer Temperatur von 2 bis 8 ⁰C (normale Kühlschranktemperatur) aufbewahrt wird; bei Aufbewahrung bei etwa 20 ⁰C ist die Vakzine ca. 6 Monate haltbar. Es soll noch erwähnt werden, dass eine Zeitspanne von drei Jahren die von der Weltgesundheitsorganisation für eine inaktivierte Vakzine (Totimpfstoff) maximal zugelassene Verwendungsdauer darstellt.

Auf der Vakzine sollen, bevor sie für die therapeutische Anwendung freigegeben wird, die folgenden Prü-

909826/0836

fungen durchgeführt werden:

1. Prüfung auf Sterilität (1. Sterilitätsprüfung);

2. Prüfung auf Toxizität;

3. Prüfung auf Antigen-Wirkung;

4. Prüfung auf Vorhandensein noch lebensfähiger Lacto-

bakterien (2. Sterilitätsprüfung).

Dabei verfährt man vorzugsweise nach den Vorschriften der Weltgesundheitsorganisation (Erfordernisse für biologische Substanzen, Technische Berichte der WGO Nr. 323,

10 1966) und der Europäischen Pharmakopoe II, 1971.

Zur Prüfung auf Sterilität wurde je 1 ml Vakzine in Reagenzgläser mit dem Thioglycolat-Nährmedium und in solche mit dem Sabourauu¹ Bouillon gegeben, die Reagenzgläser wurden hernach während 10 Tagen bei einer Temperatur von 37 ⁰C inkubiert und eine entsprechende Reihe von gleich behandelten Reagenzgläsern wurde während derselben Zeitspanne bei einer Temperatur von 25 ⁰C inkubiert. Es zeigte sich, dass sämtliche Reagenzgläser in den beiden Reihen steril geblieben waren.

Die Prüfung auf Toxizität erfolgte beim Meerschweinchen und bei der weissen Maus. Es wurden fünf Meerschweinchen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 300 g je 5 ml Vakzine (d.h. 10 mal mehr als die für den Menschen vorgesehene Einzeldosis) intramuskulär - 2,5 ml in jedem Hinterbein - verabreicht; nach einer Beobachtungszeit von 14 Tagen waren die fünf Tiere unverändert gesund, auch in den behandelten Beinen wurden keine Reaktionen festgestellt. Andererseits wurden zehn weissen Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g

909826/0836

-Ii₁-

je 0,5 ml Vakzine intramuskulär in einem Hinterbein verabreicht; nach einer Beobachtungszeit von 14 Tagen waren die zehn Mäuse unverändert gesund.

Die Prüfung auf Antigen-Wirkung erfolgte zuerst in vivo beim Meerschweinchen. Von den im vorhergehenden
Abschnitt erwähnten Tieren wurden drei nach 14 Tagen mit je 1 ml Vakzine intrakardial behandelt; trotz der verhältnismässig hohen Dosis wurde keine anaphylaktische Reaktion beobachtet. Sodann wurde die Vakzine auch in vitro, nach der Immunodiffusion-Methode von Ouchterlony gegenüber

Proben von normalem menschlichem Serum geprüft; es wurde keine positive Reaktion festgestellt. ·

Zur Prüfung auf das Vorhandensein von noch Iebensfähigen Lactobakterien wurden Proben der Vakzine auf einem zur Isolierung und Identifizierung dieser Mikroorganismen geeigneten festen Nährboden gezüchtet. Es eignet sich dafür ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:

Wasser

20 Tripcasein

Lösung 1 Lösung 2 Lösung 3 Lösung 4

25 frische Hefe

Witte-Pepton

lösliche Stärke, 0,5 % (in gelöstem Zustand)

Wasser bis auf

909826/0836

800	ml
16	g
50	ml
10	ml
10	ml
10	ml
100	g
10	g
5	g
iooo	ml

Die oben genannten, jeweils wässrigen Lösungen bestehen

.Lösung 1 : 10#ige NaCl-Lösung

Lösung 2 : 2#ige KCl- und 5#ige Na₂C0₇-Löt>ung Lösung 3 : 2#ige CaCl₂- und l#ige MgClg-Lösung Lösung 4 : 2,5#ige K₂HPO₁₁ -Lösung

Der erhaltenen Endlösung werden 25 g Agar-agar zugegeben, der pH-Wert wird auf 5_S5 bis 6,7_a vorzugsweise auf ca. 6,0 eingestellt und das Medium während 20 Minuten im Autoklav bei einer Temperatur von 115 ⁰C sterilisiert. Hierauf wird eine Lösung von 3 g Maltose, 10 g
Glucose und 10 g Lactose in 100 ml Wasser und hernach
30 ml einer l^igen Cysteinhydrochlordd-Lösung zugegeben; jede dieser Lösungen wird .zuvor durch Sterilfiltration,

z.B. durch ein Glasfilter Gr, sterilisiert. Schliesslich werden diesem Medium noch 10 % an defibriniertem menschlichem Blut zugesetzt. Der so hergestellte Blutagar-Nährboden wird mit Proben der Vakzine beimpft und bei
einer Temperatur von 37 ⁰C bebrütet. Zur Kontrolle werden Proben von Lactobacterium_acidoghilum unter denselben Bedingungen .eingeimpft und gezüchtet.

Es konnten dabei in der Vakzine keine lebenden Mikroorganismen nachgewiesen werden, was die vollständige Inaktivierung durch die bevorzugte, Formaldehyd und Phenol verwendende Methode beweist. Die erfindungsgemasse Vakzine ist also-ein sogenannter Totimpfstoff. Da sie andererseits ihre Wirkung gegen eine Infektion und ihre Folgeerscheinungen entfaltet, welche durch einen artfremden Mikroorganismus - Trichomonas_vaginalis - verursacht werden,

909826/0836

gehört sie zur Klasse der Heterovakzine.

Die Vakzine bewirkt u.a. die Bildung von spezifischen Antikörpern gegen Lactobacterium_acidoghilum, insbesondere gegen dessen abnorme und polymorphe Formen, welehe für die pathologische Veränderung des pH-Wertes der Scheide bei dem Trichomonas-Syndrom mitverantwortlieh sind. Diese immunisierende Wirkung lässt sich sowohl im Tierversuch als auch bei der klinischen Prüfung folgendermassen beweisen.

Im Tierversuch wurden zwei Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2950 bzw. 3200 g verwendet und in einem Abstand von zwei Wochen zweimal mit je 0,5 ml Vakzine in- · travenös geimpft. Ein Monat nach der zweiten. Behandlung wurde den Tieren Blut entnommen und daraus das Serum gewonnen. Wenn sich Antikörper gebildet haben, so soll das Serum in einer Verdünnung von mindestens 1:50 spezifisch die Lactobakterien jener Stämme agglutinieren lassen, aus welchen die Vakzine hergestellt wurde; das Serum weist dann in der untersuchten Verdünnung einen positiven Titer an Agglutininen auf. Bei dem ersten bzw. dem zweiten Kaninchen war der Titer der Agglutinine vor der Impfung negativ bei einer Serumverdünnung von jeweils 1:10; ein Monat nach der zweiten Behandlung war er positiv bei einer Verdünnung von 1:160 bzw. 1:80.

25 Die neue Vakzine ermöglicht die kurative und

prophylaktische Behandlung des Trichomonas-Syndroms und der akuten, chronischen und asymptomatischen Trichomoniasis. Ob kurativ oder prophylaktisch, es wird die

909826/0836

folgende Posologie empfohlen: Verabreichung einer Dosis von 0,5 ml (d.h. etwa 7 x 10 Mikroorganismen) intramuskulär, dreimal mit einem Abstand von jeweils 2 Wochen, gefolgt von einer Rappelinjektion mit derselben Dosis (O₃5 ml) ein Jahr nach dem Beginn der Behandlung.

Entsprechend der angegebenen Posologie sind klinische Prüfungen angestellt und dabei von 97 Patientinnen serologische Untersuchungen durchgeführt .worden. Den Patientinnen wurde nach einem festgelegten Zeitplan Blut entnommen und das gewonnene Blutserum auf das Vorhandensein von Lactobakterien-Antikörpern hin geprüft. Dazu wurde das Serum in geometrisch zunehmender Verdünnung (von 1:10 bis 1:1280) mit einem der Vakzine entsprechenden Antigen oder Agglutinogen behandelt und die eventuell erfolgende Agglutination beobachtet. Als Agglutinogen verwendete man eine frisch hergestellte, d.h. weniger als drei Monate alte, Suspension von inaktivierten Mikroorganismen des Lactobacterium_acidop_hilum derselben Stämme, in demselben Mengenverhältnis und in derselben Konzentration (14 χ 10 Mikroorganismen per ml) wie die Vakzine selbst; zur Inaktivierung benutzte man Phenol in einer Konzentration von 0,25 % der Suspension. Das Auftreten und die zeitliche Entwicklung der Agglutinine im Serum als Folge der Impfung gehen aus den Werten des Titers in der folgenden Tabelle deutlich hervor.

909826/0836

Tabelle 2

Verteilung des Agglutinintiters vor und nach der Impfung

Titer	Vor der	scher Mit	1:56,4	des Titers I	2	Wochen \|3	Monate	6 Monate	1	12 Monate
	Impfung	telwert		nach der	3. Injektion	0	nach Impfungsbeginn
	16		1	1	3	■ ι
1:10	0		0	0	3	1
1:20	8		» 2	3	6	3
1:40	13		0	1	16	8
1:80	29		3	5	40	17
1:16Ο	18		13	11	20	16
1:320	13		49	Ii η HO	3	15
1:640	0		25	24	92	3
1:1280	0		4	3		0
Total*"	97		97	96		64
Geometri					1:257

	1:356	1:293	1:120

Der Abfall bei dem Total nach 3, 6 und 12 Monaten ist durch Patientinnen bedingt, die nicht mehr zur Kontrolle kamen.

909826/0836

Aus dem oben stehenden geometrischen Mittelwert des Titers lässt sich z.B. 2 Wochen nach Abschluss der Impfung eine Erhöhung des Titers um einen Paktor von (im durchschnitt) 6,3 berechnen. Ein Jahr nach Beginn der Impfung, d.h. zu dem Zeitpunkt der Wiederauffrischungsinjektion (Rappelinjekticn), ist der Agglutinintiter noch 2,1 mal höher als zuvor, wodurch der langwährende Erfolg der Impfung teilweise erklärt werden kann.

Berücksichtigt man die Erhöhung des Titers während der auf der Impfung unmittelbar folgenden Zeitspanne, d.h. in der Zeit zwischen der ersten und der zweiten Blutentnahme, so verteilt sie sich auf die Patientinnen wie folgt:

T_ab_e_lle__3

15 · Erhöhung des Agglutinintiters

Paktor der

_{2χ 4χ 8χ χ6χ} Erhöhung

Anzahl Patientinnen 13 " 13 21 10 6 7

Anteil der " Patientinnen 13,41 13,4$ 21,6$ 10,3$ 6,2% 7,2% am Total

Von dem Erfolg der Behandlung vermag der folgende zusammenfassende klinische Bericht ein Bild zu geben. 200 Frauen im Alter von 15 bis 59 Jahren, welche an dem Trichomonas-Syndrom litten, sind mit der Vakzine (aus den

809826/0836

acht genannten Stämmen hergestellt) ambulant behandelt worden; die Kontrollen erstreckten sich über eine Zeitspanne von zum Teil mehr als 2 Jahren (2 Patientinnen sind nicht mehr zur Kontrolle erschienen). I38 Patientinnen, d.h. 69 % vom Total, waren zuvor wiederholt mit oralen oder vaginalen Präparaten, insbesondere Metronidazol, behandelt worden, jedoch wegen erneuter Infektion ohne Langzeiterfolg. Vor Behandlungsbeginn wurde jeweils neben der Blut- und Urinuntersuchung eine gynäkologische Untersuchung inklusive Kolposkopie und Pap-Smear durchgeführt; parallel dasu wurden Abstriche der Vulva, der Scheide, der Cervix und der Urethra vorgenommen und daraus ein Nativpräparat sowie auch ein nach Gram und ein nach Giemsa gefärbtes Präparat hergestellt und eine Kultur auf Tri-

15 ^chomonas_vaginalis angelegt. Alle diese Untersuchungen wurden 6 Wochen, 4 Monate und 12 Monate nach dem Beginn der Behandlung wiederholt.

Vor Therapiebeginn war bei 145 der 200 Patientinnen (72,5 %) eine ausgeprägte Symptomatik des Trichomonas-Syndroms feststellbar, mit starker Kolpitis, Pruritus, reichlichem grün-gelblichem, übel riechendem Fluor, Dyspareunie, Dysurie usw.; die Kolposkopie zeigte Oedem und Rötung des Vaginal- und Portioepithels. Ausserdem wurde bei 6l Patientinnen eine Erythroplakie der Portio,

25 bei 13 anderen eine, chronische Cervicitis gefunden. Bei den restlichen 55 Patientinnen (27,5 %) war die Symptomatik diskreter - leichte Kolpitis.

Die Behandlung erfolgte nach der oben angegebenen Posologie. Bei den leichten Kolpitis-Fällen wurde keine

909826/0836

zusätzliche Therapie angewendet; zur Milderung akuter Symptome wurde eine lokale Applikation von Antibiotica und bei schweren Zuständen zusätzlich eine lokale Applikation eines Präparates aus Mikroorganismen von gegen Moniliasis wirksamen Stämmen des Tfa.ctobacteriurn_acidop_hilum vorgenommen. Metronidazol oder ähnliche Nitroimidazolderivate wurden jedoch in keinem Fall gegeben.

Wenn man den Vaginalsekret gemäss Jirovec [W. Ritzerfeld, Der Gynäkologe 2^ (1), Seiten 2-6 (I969)] in folgende Klassen einteilt 3 so lässt sich der Erfolg der Behandlung aus Tabelle 4 deutlich ablesen: Klasse I : Bild der gesunden Frau
Klasse II : nicht eitriger bakterieller Ausfluss Klasse III: eitriger bakterieller Ausfluss

15 (Klasse IV

Klasse V Klasse VI

Gonorrhoe - davon keine Fälle in der Untersuchung ainbezogen)

Trdchomoniasis (positives Nativpräparat) Vaginalimykose (Candida albicans)

909826/0836

	Anzahl	Tabelle 4	-	Klasse Klasse V VI
Zeitpunkt der Unter suchung	200	Klasse Klasse II III	47 23,5	194 6 97 % 3 %
Vor Impfungs- beginn	200	-	27 13,5	14 % 7 %
2 Wochen nach 3. Injektion	198	139 69,5 %	32 16,2	9 % 4,5 %
3 Monate nach 3. Injektion	198	164 82 %		9 % 4,5 %
12 Monate nach Impfungs- beginn	157 79,3 %

Die 9 Patientinnen, bei welchen bei der zweiten Kontrolle, drei Monate nach Abschluss der Impfung, Trichomonas vaginalis noch mikroskopisch nachweisbar war, blieben weiterhin therapierefraktar; auch eine perorale Behandlung mit einem Trichomonazid änderte daran nichts. Ausserdem verblieben auch nach 12 Monaden Veränderungen an der Cervix in Form chronischer Cervicitis oder massiver Erythroplakie. Vielleicht sind diese Misserfolge darauf zurückzuführen, dass diese Frauen trotz korrekter Impfung zu keiner genügenden Antikörperbildung imstande waren.

Von 198 behandelten Patientinnen wiesen nach

909826/0836

12 Monaten 189 (95,5 %) ein Vaginalsektret der Klasse II und III auf, d.h. waren in Bezug auf ihre Trichomoniasis geheilt. Diese Heilungsrate wurde bei 55 Patientinnen mit leichten Kolpitiden ohne jedwelche Zusatztherapie erreicht. Die Patientinnen sind, zum Teil jetzt über 2 Jahre, weiter beobachtet worden; während dieser Zeit sind keine Rückfälle oder Reinfektionen aufgetreten, was auf diesem Gebiet der Medizin ein Novum darstellt und auf die Wiederherstellung eines stabilen trichomonadenfeindliuhen Vaginalirn/lieus hinweisen dürfte. Schliesslich scheint die Vakzine auch einen positiven Einfluss auf Cervixveränderungen und Läsionen der Portio zu haben. Das Gesamtergebnis erscheint noch auffallender, wenn man bedenkt, dass der grössere Teil der Fälle mit verschiedenen chemischen Verbindungen lokal und systemisch bereits behandelt worden war, jedoch nur mit vorübergehendem Erfolg.

Abgesehen von einer gelegentlichen Rötung oder einer leicnten Schwellung im Bereich der Injektionsstelle traten bei keiner der Patientinnen während der Behandlung oder unmittelbar danach unerwünschte Nebenwirkungen auf. Es wurden auch keine allergischen oder toxischen Reaktionen festgestellt.

Es soll von der Impfung abgesehen werden, wenn ■ akute febrile Infektionen, -Krankheiten des hämatopoetischen Systems oder schwere Niereninsuffiziens vorliegen.

Eine gleichzeitige Behandlung des Partners ist bei den mit der Vakzine behandelten Frauen zwar erwünscht, vom Blickpunkt der Patientin aus ist sie aber nicht unbedingt notwendig, da jene durch die Impfung immun wird.

909826/0836

Claims

Heterovakzine gegen das Trichomonas-Syndrom und ihr Herstellungsverfahren ..Patentansprüche

1. Heterovakzine zur therapeutischen Behandlung
des Trachomonas-Syndr'oms, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus inaktivierten Mikroorganismen von Stämmen des Lactobac- ££ri^u5L§£idophilum, welche beim "Centraalbureau voor Schimmelcultures" in Baarn (Niederlande) unter den Bezeichnungen CBS 465.77, CBS 466.77, CBS 467.77, CBS 468.77, CBS 469.77, CDS 470.77, CBS 471.77 und CBS 472.77 hinterlegt sind, in
einer physiologisch verträglichen Lösung besteht, wobei

die Mikroorganismen aus einem Teil der genannten Stämme

oder aus allen genannten Stämmen stammen und in annähernd gleicher Anzahl je Stamm vorliegen.

2. Heterovakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus inaktivierten Mikroorganismen aus
allen acht genannten Stämmen besteht.

20.11.78/Dr.FR/gl _{W9 8 2} 6 / 0 8 3 6

ORIGINAL INSPECTED

3. Heterovakzine nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

gekennzeichnet, dass sie etwa 14 χ 10 inaktivierte Mikroorganismen per ml enthält.

4. Heterovakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem ein Konservierungsmittel enthält.

5. Verfahren zur Herstellung der Heterovakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3₃ dadurch gekennzeichnet, dass man von den folgenden Stämmen von Lactobacterium acidoghilum, welche beim "Centraalbureau voor Schimmelcultures" in Baarn (Niederlande) unter den Bezeichnungen CBS 465.77, CBS 466.77, CBS 467.77, CBS 468.77, CBS 469.77,' CBS 470.77, CBS 471.77 und CBS 472.77 hinterlegt sind, einen Teil bis alle jeweils für sich allein auf einem geeigneten flüssigen Nährboden unter aeroben Bedingungen züchtet, nach Abschluss der Züchtung das gebildete biologische Material abtrennt und nach bekannten Methoden inaktiviert und die aus den einzelnen Stämmen erhaltenen und inaktivierten Mikroorganismen in einer physiologisch

20 verträglichen Lösung miteinander in Mengen vermischt,

welche jeweils der nach Abschluss der Züchtung oder nach der Inaktivierung festgestellten Dichte der Kultur (Anzahl Mikroorganismen per ml Kulturflüssigkeit) umgekehrt proportional sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man alle acht genannten Stämme einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch

109826/0836

gekennzeichnet, daöS die Züchtung bei einem pH-Wert von oder um 6,5 und bei einer Temperatur von oder um 37 °^c durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inaktivierung des gebildeten biologischen Materials durch Behandlung mit Formaldehyd und Phenol, vorzugsweise in einer in Bezug auf Formaldehyd 0,3%igen und in Bezug auf Phenol 0,5$igen Lösung, durchführt.

9■ Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die inaktivierten Mikroorganismen in die physiologisch verträgliche Lösung in solcher Menge zugibt oder die erhaltene Vakzine mit der physiologisch verträglichen Lösung so weit verdünnt, dass per

ml etwa 14 χ 10 inaktivierte Mikroorganismen vorliegen.

10. Verwendung der Heterovakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms.

909826/0836