DD141163A5

DD141163A5 - Verfahren zur herstellung einer heterovakzine

Info

Publication number: DD141163A5
Application number: DD78210129A
Authority: DD
Inventors: Ljubinko Stojkovic
Original assignee: Solco Basel Ag
Priority date: 1977-12-23
Filing date: 1978-12-22
Publication date: 1980-04-16
Also published as: FR2412314A1; GR65648B; IL56177A; CA1119095A; US4238478A; BE872884A; DK152174C; NL179543C; AR220548A1; FR2412314B1; AU4292778A; NO149316C; AT368390B; IN150348B; FI65166C; ES476703A1; FI783946A; CH639280A5; YU42170B; DE2854723A1

Abstract

Die Vakzine besteht aus inaktivierten Mikroorganismen von bestimmten, bei einer Sammelstelle hinterlegten Lactobacterium aeidophilum-Stämmen in einer physiologisch verträglichen Lösung. Die Mikroorganismen, vorzugsweise aus acht Stämmen, liegen in etwa gleicher Anzahl je Stamm vor; sie werden durch aerobe Züchtung gewonnen. Die Vakzine erzeugt eine Immunität und eignet sich zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Heterovakzine zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms·

Bekannte technische Lösungen

Die Gattung Trichomonas vaginalis gehört zu den Protozoen und, nach systematischer Einteilung der Protozoen von Bedeutung in der Humanmedizin, zur Klasse der Mastigophora oder Plagellata. Es iet ein prinzipiell pathogener Parasit, der im weiblichen und männlichen Urogenitaltrakt gefunden wird· Die Übertragung geschieht hauptsächlich durch Kohabitation, aber Infektionen durch Gegenstände sind auch nachgewiesen worden,

Obschon die Männer der Infektion ebenso' häufig wie die Frauen ausgesetzt sind, weisen sie klinische Symptome wesentlich seltener auf; der Großteil der Trichomonadenträger ist beschwerdefrei oder beachtet eine leichte Sekretion-Symptom einer Urethritis - überhaupt nicht»

Pur die Frau liegt die praktische Bedeutung der Infektion zuerst in der Störung der Genitalorgane durch massive eitrige

I U I £ W A_{2 0} 12K/210 129

Entzündungen der Scheide mit ihren oft entacheidenden Polgen für eine normale Ehe. Die Infektion bleibt im allgemeinen nicht auf die Scheide beschränkt, meistens wird die begleitende pathogene Mischflora in den oberen Genitaltrakt durch die Trichomonaden mitgeschleppt und führt zu Entzündungen der Gebärmutteranhänge (Adnexitis), mit welchen die Gefahr einer Tubargravidität oder eines Verschlusses der Eileiter (Sterilität) einhergeht. Sowohl die chronische Infektion als auch die wiederkehrenden Rückfälle bewirken eine erhebliche Entzündung der Portio vaginalis uteri und der Cervix; Folge davon sind lokale Gewebsalterationen, welche von der rückbildungsfähigen Dysplasie bis zu Vorstufen des Gebärmutterhals-Karzinoms reichen» Das vielfältige klinische Bild wird gesamthaft als Trichomongs-Syndrom bezeichnet,

Obschon das Präparat Metronidazol £i-(2~Hydroxyäthyl)-2-methyl-5-nitroimidazol] zur Abtötung der Trichomonas vaginalis durchaus geeignet und für diese Indikation in die Therapie eingeführt worden ist, zeigt die Zahl der Erkrankungen dennoch keine Abnahme, sondern eher eine ansteigende Tendenz j je nach Ländern sollen zwischen 3,5 und 88 % der Bevölkerung von der Infektion befallen sein, so daß man hier bereits von einer Volkskrankheit sprechen kann.

Die Ausbreitung der Infektion und die immer wieder beobachtete Reinfektion werden durch die erhöhte Promiskuität kräftig gefördert. Zudem werden die Hartnäckigkeit der Infektion und eine gewisse Therapieresistenz durch den sich stets verbreitenden Dauergebrauch von ovulationshemmenden" Steroiden begünstigt, da bekanntlich alle hypoovariellen Zustände, d,h_e ein relativer Mangel an körpereigenen ovariellen Hormonan, die Epithelproliferation in der Scheide hemmen.

10129 -3- ' Berlin,d_e19.4.1979

AP C 12Κ/21Ο 129

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, mit einem neuen Totimpfstoff ein Mittel zur kurativen und ptophylaktlochen Bekämpfung der Triohomoniasis und des Trichomonas-Syndroms zu entwickeln·

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer Heterovakzine bereitzustellen.

Es wurde nun gefunden, daß unter der Vielzahl natürlich vor-« kommender Stämme (zur Zeit sind etwa 4,000 verschiedene Stämme bekannt) des Lactobacterium acidophilum - auch Lactobacillus acidophilus, Milchsäurebakterien, Lactobakterien, Milchßäurelangstäbchen, Döderlein¹ Stäbchen oder Db'derlein' Bakte-» rien genannt - solche vorliegen, aus welchen eine zur Behandlung dee Trichomonas-Syndroms wertvolle Heterovakzine hergestellt werden kann.

Die einzelnen Stämme sind 1976 aus der Vagina von an diesem Syndrom leidenden Frauen im Spital entnommen worden. Die Stämme sind am 17«0ktober 1977 in lyophilisiertem Zustand beim "Centraalbureau voor Schimmeli&ultures" in Baärn (Niederlande) unter den Bezeichnungen CBS 465_e77 bis CBS 472.77 (acht einzelne Stämme) hinterlegt worden.

In morphologischer Hinsicht unterscheiden sich die verschiedenen Stämme u»a. nach der Größe der gebildeten Kolonien! manche Kolonien sind sehr klein, durchsichtig und kreisförmig, andere Kolonien sind größer und haben die Gestalt einer Rosette, deren Oberfläche zerfurcht ist. Mikroskopisch betrachtet gehören alle acht Bakterienstämme zu den grampositiven polymorphen Bazillen, die in Form von Ketten oder Palisadan vorkommen.

Das biochemische Verhalten dieser Stämme kann durch ihr Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen wie folgt charakterisiert werden:

Tabelle 1

Kohlenstoff- · Lactobacterium^acidoghilum, Stamm CBS-Nr.:

^qUelle: 465.77 466.77 467.77 468.77 469-77 470.77 471.77 472.77

Arabinose - + + + +

Cellobiose +"- - - -- -

Mannitol - + ' + + ' + '+ _.._

Melibiose ' + '+ ' + - '+- + - t

Rhamnose .+ + '+.'+: '+ .'+ - ' +

Trehalose + + + + + ' + - -

Ribose ' + + + + + +'· - +·:

Stärke . ί - - - - - '

2 10129 -S-

Die Stämme CBS 466.77, 467.77 und 469-77 zeigen dieselben biochemischen bzw. fermentativen Eigenschaften.

Die erfindungsgemässe Heterovakzine besteht also aus inaktivierten Mikroorganismen von Stämmen des Lactobacterium acidophilum, welche oben genannt sind, in einer physiologisch verträglichen Lösung, wobei die Mikroorganismen aus einem Teil dieser Stämme oder aus allen diesen Stämmen stammen ur,d in annähernd gleicher Anzahl je Stamm vorliegen. Es sollen Mikroorganismen von mindestens 3 Stämmen in der Vakzine vorliegen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Heterovakzine besteht darin, dass man von den zuvor genannten Stämmen von Lactobacterium_acidoOhilum einen Teil bis alle jeweils für sich allein auf einem geeigneten flüssigen Nährboden unter aeroben Bedingungen züchtet, nach Abschluss der Züchtung das gebildete biologische Material abtrennt und nach bekannten Methoden inaktiviert und die aus den einzelnen Stämmen erhaltenen und inaktivierten Mikroorganismen in einer physiologisch verträglichen Lösung miteinander in Mengen vermischt, welche jeweils der nach Abschluss der Züchtung oder nach der Inaktivierung festgestellten Dichte der Kultur (Anzahl Mikroorganismen per ml Kulturflüssigkeit) umgekehrt proportional sind..

Die erwähnten Stämme sind so ausgewählt, dass bei Durchführung des Verfahrens unter Verwendung aller acht eine allgemein wirksame Vakzine erhalten wird.

Darunter versteht man eine Vakzine., welche praktisch bei jedwelcher Patientin überhaupt wirksam i3t bzw. mit welcher, ungeachtet der Herkunft der Infektion, das.Tricho-

2 1 0129 -«-

chomonas-Syndrom erfolgreich behandelt werden kann. Deshalb stellt die Vakzine, in welcher inaktivierte Mikroorganismen aus den acht genannten Stämmen vorliegen, die bevorzugte Form der Erfindung dar und die Herstellung der 5 Vakzine unter Verwendung der acht.genannten Stämme ist die bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens.

Für die Züchtung der Stämme können verschiedene, in der Mikrobiologie übliche flüssige Nährböden verwendet werden. Als besonders zweckmässig hat sich ein Nährboden 10 der folgenden Zusammensetzung erwiesen:

Tryptose-pepton 5 g

Casein-hydrolysat 8 g

Fleischextrakt 10 g

Hefe-dialysat 100 ml

K₂KPO₁₁ 2 g

Triammoniumcitrat 2 g

Natriumacetat 5g

Salzgemisch 5 ml

Polyoxyäthylenderivate der ' ~) Sorbitanoleate y 1 ml

(Tween 80 ^R) J

Glucose 10 g

Lactose 10 g

destilliertes Wasser bis auf 1000 ml

Das oben erwähnte Salzgemisch besteht aus:

. MgSO₄-7 H₂O 11,5 g

MnSO₁₁-2 H₂O 2,4 g

FeSO₁₁-? H₂O 0,68 g

destilliertes Wasser bis auf 100 ml

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Das flüssige Medium wird auf einen pH-Wert von 6,1 bis 6,8, vorzugsweise 6,5, eingestellt und während 20 Minuten im Autoklav bei einer Temperatur von 115 ⁰C sterilisiert.

Der Nährboden wird in sterilisierte Gefässe, z.B. Erlenmeyerkolben, verteilt und der Inhalt jeden Gefässes mit einer Probe eines einzelnen Stammes angeimpft. Die Züchtung wird zweckmässig bei einer Temperatur von 32 bis 45 ⁰C, vorzugsweise bei etwa 37 ⁰C, z.B. während 48 Stunden durchgeführt. Nach dieser Zeitspanne oder wenn sich eine für die beabsichtigte Vakzineproduktion ausreichende Menge-biologisches Material gebildet hat, wird dieses unter sterilen Bedingungen gesammelt und durch Zentrifugieren von dem anhaftenden Nährboden befreit; z.B. kann man während 1 Stunde bei 3000 Umdrehungen/Min. zentrifugieren.

Der aus dem biologischen Material bestehende Bodenkörper wird dann wieder in Suspension gebracht, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung, und hierauf nach bekannter Methode inaktiviert. Zur Inaktivierung eignet sich ganz besonders eine Behandlung mit Formaldehyd und Phenol; vorteilhaft erweisen sich eine Konzentration der Suspension von 0,3 % in Bezug auf Formaldehyd und von 0,5 % in Bezug auf Phenol und eine Behandlungsdauer von bis 5 Tagen. Nach der Inaktivierung wird die Suspension wiederum zentrifugiert, z.B. während 1 Stunde bei 3000 Umdrehungen/Min., um das inaktivierte Material von dem zur Inaktivierung benutzten Mittel, bzw. vom Ueberschuss an Formaldehyd und Phenol, zu befreien.

10129

Das aus jedem einzelnen Stamm erhaltene Material wird wiederum in Suspension gebracht, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung, und einer Prüfung auf Sterilität sowie einer Prüfung auf das Vorhandensein von noch lebensfähigen Lactobakterien nach den weiter unten bebeschriebenen Methoden unterworfen. Wenn beide Prüfungen negativ ausfallen, d.h. wenn sich das Material zur Herstellung der Vakzine eignet, wird die bei jedem Stamm erreichte Dichte der Kultur bzw. die Anzahl Mikroorganismen

10 per ml Kulturflüssigkeit bestimmt.

Ist es aus irgendeinem Grund nicht möglich, die Vermischung der einzelnen biologischen Materialien unmittelbar nach der Inaktivierung vorzunehmen, sollen die entsprechenden Suspensionen inzwischen bei einer Temperatur von 4 ⁰C aufbewahrt werden. Man kann auch dip inaktivierten Mikroorganismen eines jeden Stammes lyophilisieren und in diesem Zustand bei etwa 4 ⁰C aufbewahren. Die lyophilisierten Stämme können bei dieser Temperatur während einer Zeitspanne von mindestens drei Jahren unverändert gelagert werden. Als Schutzkolloid für die Lyophilisierung eignet sich insbesondere ein Medium aus 5₃6 % Gelatine, 37,5 % Saccharose und 0,5 % CaIciumlactobionat; zweckmässig wird während 2k Stunden lyophilisiert.

Schliesslich wird das aus den einzelnen Stämmen jeweils erhaltene und inaktivierte Material in solcher Menge vermischt, dass daraus eine in Bezug auf die Anzahl Mikroorganismen eines jeden Stammes per ml annähernd gleichwertige Vakzine entsteht. Die erhaltene Vakzine wird

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mit Vorteil mittels physiologischer Kochsalzlösung so

weit verdünnt, dass sie per ml etwa 14 χ 10 Mikroorganismen enthält. '

Die Vakzine hat einen Gesamtstickstoff-Gehalt von 3,68 mg$ der Trockensubstanz (Bestimmung nach Kjeldahl). Es hat sich als zweckmässig erwiesen, ein Konservierungsmittel, beispielsweise Formaldehyd oder Phenol (Konzentra-. tion an Formaldehyd bzw. Phenol z.B. 0,25 %') oder Nat'riumäthylmercurithiosalicylat (Thiomersal), zuzusetzen und die Vakzine während etwa 30 Tagen bei einer Temperatur von 4 ⁰C reifen zu lassen, bevor sie in Ampullen abgefüllt wird. Vorzugsweise enthält eine Ampulle 0,5 ml der beschriebenen Vakzine. Selbstverständlich sollen auch diese letzten Massnahmen unter sterilen Bedingungen und. in pyrogenfreiem Glasmaterial durchgeführt werden.

Der Ampulleninhalt kann auch lyophilisiert und bis zum Zeitpunkt der Verwendung in Form einer Trockenampulle, vorzugsweise bei etwa 4 ⁰C, gelagert werden. Die Haltbarkeit der Vakzine, ob in Form der üblichen Ampullen oder als Trockenampulle, beträgt mindestens drei Jahre ab Herstellung, wenn sie bei einer Temperatur von 2 bis 8 ⁰C (normale Kühlschranktemperatur) aufbewahrt wird; bei Aufbewahrung bei etwa 20 ⁰C ist die Vakzine ca. 6 Monate haltbar. Es soll noch erwähnt werden, dass eine Zeitspanne von drei Jahren die von der Weltgesundheitsorganisation für eine inaktivierte Vakzine (Totimpfstoff) maximal zugelassene Verwendungsdauer darstellt.

Auf der Vakzine sollen, bevor sie für die therapeutische Anwendung freigegeben wird, die folgenden Prü-

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- to-

fungen durchgeführt werden:

1. Prüfung auf Sterilität (1. Sterilitätsprüfung);

2. Prüfung auf Toxizität;

J, Prüfung auf Antigen-Wirkung;

*J. Prüfung auf Vorhandensein noch lebensfähiger Lacto-

bakterien (2. Sterilitätsprüfung).

Dabei verfährt man vorzugsweise nach den Vorschriften der Weltgesundheitsorganisation (Erfordernisse für biologische Substanzen, Technische Berichte der WGO Nr. 323,

10 1966) und der Europäischen Pharmakopoe II, 1971.

Zur Prüfung auf Sterilität wurde je 1 ml Vakzine in Reagenzgläser mit dem Thioglycolat-Nährmedium und in solche mit dem Sabouraud' Bouillon gegeben, die Reagenzgläser wurden hernach während 1Ö Tagen bei einer Temperatur von 37 ⁰C inkubiert und eine entsprechende Reihe von gleich behandelten Reagenzgläsern wurde während derselben Zeitspanne bei einer Temperatur von 25 ⁰C inkubiert. Es zeigte sich, dass sämtliche Reagenzgläser in den beiden Reihen steril geblieben waren.

Die Prüfung auf Toxizität erfolgte beim Meerschweinchen und bei der weissen Maus. Es wurden fünf Meerschweinchen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 300 g je 5 ml Vakzine (d.h. 10 mal mehr als die für den Menschen vorgesehene Einzeldosis) intramuskulär - 2,5 ml in jedem Hinterbein -.verabreicht; nach einer Beobachtungszeit von 14 Tagen waren die fünf Tiere unverändert gesund, auch in den behandelten Beinen wurden keine Reaktionen festgestellt. Andererseits wurden zehn weissen Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g

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je 0,5 ml Vakzine intramuskulär in einem Hinterbein verabreicht; nach einer Beobachtungszeit von 14 Tagen waren die zehn Mäuse unverändert gesund.

Die Prüfung auf Antigen-Wirkung erfolgte zuerst in vivo beim Meerschweinchen. Von den im vorhergehenden Abschnitt erwähnten Tieren wurden drei nach 14 Tagen mit je 1 ml Vakzine intrakardial behandelt; trotz der verhältnismässig hohen Dosis wurde keine anaphylaktische Reaktion beobachtet. Sodann wurde die Vakzine auch in vitro, nach der Immunodiffusion-Methode von Ouchterlony gegenüber

Proben von normalem menschlichem Serum geprüft; es wurde keine positive'Reaktion festgestellt.

Zur Prüfung auf das Vorhandensein von noch Iebensfähigen Lactobakterien wurden Proben der Vakzine auf einem zur Isolierung und Identifizierung dieser Mikroorganismen geeigneten festen Nährboden gezüchtet. Es eignet sich dafür ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:

Wasser

20 Tripcasein

Lösung 1 Lösung 2 Lösung 3 Lösung 4

25 frische Hefe

Witte-Pepton

lösliche Stärke, 0,5 % (in gelöstem Zustand)

Wasser bis auf

8oo	ml
16	g
50	ml
10	ml
10	ml
10	ml
100	ε
10	S
5	g
ΪΌ00	ml

2 1 Q129-"U

Die oben genannten, jeweils wässrigen Lösungen bestehen aus:

.Lösung 1 : 10#ige NaCl-Lösung "

Lösung 2 : 2#ige KCl- und 5%ige NagCQ^-Lösuiig 5 Lösung 3 : 2#ige CaCl₂- und l#ige MgCl₂-Lösung Lösung 4 : 2,5$ige K₂HPC₁₁-Lösung

Der erhaltenen Endlösung werden 25 g-Agar-agar zugegeben, der pH-Wert wird auf 5,5 bis 6,7, vorzugsweise auf ca. 6,0 eingestellt und das Medium während 20 Minuten im Autoklav bei einer Temperatur von 11.5 ⁰C sterilisiert. Hierauf wird eine Lösung von 3 g Maltose, 10 g Glucose und 10 g Lactose in 100 ml Wasser und hernach 30 ml einer l$igen Cysteinhydrochlorid-Lösung zugegeben; jede dieser Lösungen wird .zuvor durch Sterilfiltration,

z.B. durch ein Glasfilter G₁-, sterilisiert. Schliesslich werden diesem Medium noch 10 % an defibriniertem menschlichem Blut zugesetzt. Der so hergestellte Blutagar-Nährboden wird mit Proben aer Vakzine beimpft und bei einer Temperatur von 37 ⁰C bebrütet. Zur Kontrolle werden Proben von Lactobacterium_acidophilum unter denselben Bedingungen .eingeimpft und gezüchtet.

Es konnten dabei in der Vakzine keine lebenden Mikroorganismen nachgewiesen werden, was die vollständige Inaktivierung durch die bevorzugte, Formaldehyd und Phenol verwendende Methode beweist. Die erfindungsgemasse Vakzine ist also-ein sogenannter Totimpfstoff. Da sie andererseits ihre Wirkung gegen eine Infektion und ihre Folgeerscheinungen entfaltet, welche durch einen artfremden Mikroorganismus - Trichomonas_vaginalis - verursacht werden,

2 1012 9 ~

gehört sie zur Klasse der Heterovakzine.

Die Vakzine bewirkt u.a. die Bildung von spezifischen Antikörpern gegen Lactobacterium_acido2hilum, insbesondere gegen dessen abnorme und polymorphe Formen, welehe für die pathologische Veränderung des pH-Wertes der Scheide bei dem Trichomonas-Syndrom mitverantwortlich sind. Diese immunisierende Wirkung lässt sich sowohl im Tierversuch als auch bei der klinischen Prüfung folgendermassen beweisen. .

Im Tierversuch wurden zwei Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2950 bzw. 3200 g verwendet und in einem Abstand von zwei Wochen zweimal mit je 0,5 ml Vakzine intravenös geimpft. Ein Monat nach der zweiten Behandlung wurde den Tieren Blut entnommen und daraus das Serum gewonnen. Wenn sich Antikörper gebildet haben, so soll das Serum in einer Verdünnung von mindestens 1:50 spezifisch die Lactobakterien jener Stämme agglutinieren lassen, aus welchen die Vakzine hergestellt wurde; das Serum weist dann in der untersuchten Verdünnung einen positiven Titer an Agglutininen auf. Bei dem ersten bzw. dem zweiten Kaninchen war· der Titer der Agglutinine vor der Impfung negativ bei einer Serumverdünnung von jeweils 1:10; ein Monat nach der zweiten Behandlung war er positiv bei einer Verdünnung von l:l60 bzw. 1:80.

Die neue Vakzine ermöglicht die kurative und prophylaktische Behandlung des Trichomonas-Syndroms und der akuten, chronischen und asymptomatischen Yrichomoniasis. Ob kurativ oder prophylaktisch, es wird die

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folgende Posologie empfohlen: Verabreichung einer Dosis

von 0,5 ml (d.h. etwa 7 x 10 Mikroorganismen) intramuskulär, dreimal mit einem Abstand von jeweils 2 Wochen, gefolgt von einer Rappelinjektion mit derselben Dosis (0,5 ml) ein Jahr nach dem Beginn der Behandlung.

Entsprechend der angegebenen Posologie sind klinische Prüfungen angestellt und dabei von 97 Patientinnen serologische Untersuchungen durchgeführt worden. Den Patientinnen wurde nach einem festgelegten Zeitplan Blut entnommen und das gewonnene Blutserum auf das Vorhandensein von Lactobakterien-Antikörpern hin geprüft. Dazu wurde das Serum in geometrisch zunehmender Verdünnung (von 1:10 bis 1:1280) mit einem der Vakzine entsprechenden Antigen oder Agglutinogen behandelt und die eventuell erfolgende Agglutination beobachtet.·Als Agglutinogen verwendete man eine frisch hergestellte, d.h. weniger als drei Monate alte, Suspension von inaktivierten Mikroorganismen des Lactobacterium_acidophilum derselben Stämme, in demselben Mengenverhältnis und in der-

9 ^;

selben Konzentration (14 χ 10 Mikroorganismen per ml) wie die Vakzine selbst; zur Inaktivierung benutzte man Phenol in einer Konzentration von 0,25 % der Suspension. Das Auftreten und die zeitliche Entwicklung der Agglutinine im Serum als Folge der Impfung gehen aus den Werten des Titers in der folgenden Tabelle deutlich hervor.

2 10129 --»*-

Tabelle 2

Verteilung des Agglutinintiters vor und nach der Impfung

Titer	Vor der	-	1:56,4	des Titers j	• 2 Wochen 3 Monate	S Monate	1	1	12 Monate
	Impfung	nach der 3· Injektion	0	0	nach Iiap f ungsb e ginn
O-: 10	16	1			- 1
	0	0	3	3	1
1:10			1	3
1:20	8	• 2	5	6	3
1:40	13	0	11	16	8
1:80	29	3	48	40	17
1:160	18	13	24	20	16
1:320	13 ·	49	3	3	15
1:640	0	25	96	92	3
1:1280	0	4			0
Total*'	97	97			64
Geometri			1:293	1:257
scher Mit
telwert	1:356	1:120

* Der Abfall bei dem Total nach 3, 6 und 12 Monaten ist durch Patientinnen bedingt, die nicht mehr zur Kontrolle kamen.

2 1 0129 -"»-

Aus dem oben stehenden geometrischen Mittelwert des Titers lässt sich z.B. 2 Wochen nach Abschluss der Impfung eine Erhöhung des Titers um einen Faktor von (im Durchschnitt) 6,3 berechnen. Ein Jahr nach Beginn der Impfung, d.h. zu dem Zeitpunkt der Wiederauffrischungsinjektion (Rappelinjektion), ist der Agglutinintiter noch 2,1 mal höher als zuvor, wodurch der langwährende Erfolg der Impfung teilweise erklärt werden kann.

Berücksichtigt man die Erhöhung des Titers während der auf der Impfung unmittelbar folgenden Zeitspanne, d.h. in der Zeit zwischen der ersten und der zweiten Blutentnahme, so verteilt sie sich auf die Patientinnen wie folgt:

15 Erhöhung des Agglutinintiters

Faktor der _o ,. _o . _c ,„ _cu , . 2x 4x 8x lbx 32x 6Mx und mehr

Erhöhung

Anzahl

Patientinnen 13 13 21 10 6 7 Anteil der .

Patientinnen 13,4$ 13,4* 21,-6* 10,3* 6,2$ 7,2* am Total

Von dem Erfolg der Behandlung vermag der folgen de zusammenfassende klinische Bericht ein Bild zu geben. 200 Frauen im Alter von 15 bis 59' Jahren, welche an dem Trichomonas-Syndrom litten, sind mit der Vakzine (aus den

2 10129 -ι*-

acht-genannten Stämmen hergestellt) ambulant behandelt worden; die Kontrollen erstreckten sich über eine Zeitspanne von zum Teil mehr als 2 Jahren (2 Patientinnen sind nicht mehr zur Kontrolle erschienen). 138 Patientinnen, d.h. 69 % vom Total, waren zuvor wiederholt mit oralen oder vaginalen Präparaten, insbesondere Metronidazol, behandelt worden, jedoch wegen erneuter Infektion ohne Langzeiterfolg. Vor Behandlungsbeginn wurde jeweils neben der Blut- und Urinuntersuchung eine gynäkologische Untersuchung inklusive Kolposkopie und Pap-Smear durchgeführt; parallel dazu wurden Abstriche der Vulva, der Scheide, der Cervix und der Urethra vorgenommen und daraus ein Nativpräparat sowie auch ein nach Gram und ein nach Giemsa gefärbtes Präparat hergestellt und eine Kultur auf Trichomonas_vaginalis angelegt. Alle diese Untersuchungen wurden 6 Wochen, '4 Monate und 12 Monate nach dem Beginn der Behandlung wiederholt. · .

Vor Therapiebeginn war bei 145 der 200 Patientinnen (72,5 %) eine ausgeprägte Symptomatik des Trichomonas-Syndroms feststellbar, mit starker Kolpitis, Pruritus, reichlichem grün-gelblichem, übel riechendem Fluor, Dyspareunie, Dysurie usw.; die Kolposkopie, zeigte Oedem und Rötung des Vaginal- und Portioepithels. Ausserdem wurde bei 6l Patientinnen eine Erythroplakie der Portio, bei 13 anderen eine, chronische Cervicitis gefunden. Bei den restlichen 55 Patientinnen (27,5 %) war die Symptomatik diskreter - leichte Kolpitis.

Die Behandlung erfolgte nach der. oben angegebenen Posologie. Bei den leichten Kolpitis-Pällen wurde keine

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zusätzliche Therapie angewendet; 'zur Milderung akuter Symptome wurde eine lokale Applikation von Antibiotica und bei schweren Zuständen zusätzlich eine lokale Applikation eines Präparates aus Mikroorganismen von gegen Moniliasis wirksamen Stämmen des L§ctobacterium_acido£hilurn vorgenommen. Metronidazol oder ähnliche Nitroimidazol· derivate wurden jedoch in keinem Fall gegeben.

Wenn man den Vaginalsekret gemäss Jirovec [W. Ritzerfeld, Der Gynäkologe 2_ (1), Seiten 2-6 (1969)] in folgende Klassen einteilt, so lässt sich der Erfolg der Behandlung aus Tabelle ^ deutlich ablesen: Klasse I : Bild der gesunden Frau Klasse II : nicht eitriger bakterieller Ausfluss Klasse III: eitriger bakterieller Ausfluss

(Klasse IV : Gonorrhoe - davon keine Fälle in der Untersuchung einbezogen)

Klasse V : Trichomoniasis (positives Nativpräparat) Klasse VI : Vaginalimykose (Candida albicans)

210129 -&-

	Anzahl	Tabelle 4	Klasse III	Klasse V	Klasse VI	ί
Zeitpunkt der Unter suchung	200	Klasse II	-	194 97 %	6 3 *
Vor Impfungs beginn	200	-	47 23,5 °i	14 ί 7 %
2 Wochen nach 3· .· Injektion	198	139 69,5 %	27 13,5 ?	9 I 4,5 5
3 Monate nach 3. Injektion	198	164 82 %	32 16,2 5	9 ί 4,5 J
12 Monate nach Impfungs- beginn	157 79,3 %

Die 9 Patientinnen, bei welchen bei der zweiten Kontrolle, drei Monate nach Abschluss der Impfung, Trichomonas vaginalis noch mikroskopisch nachweisbar war, blieben weiterhin therapierefraktar; auch eine perorale Behandlung mit einem Trichomonazid änderte daran nichts. Aussero.em verblieben auch nach 12 Monaten Veränderungen an der Cervix.in Form chronischer Cervicitis oder massiver Erythroplakie. Vielleicht sind diese Misserfolge darauf zurückzuführen, dass diese Frauen trotz korrekter Impfung zu keiner genügenden Antikörperbildung imstande waren.

Von 198 behandelten Patientinnen wiesen nach

2 1 O 12.9-

12 Monaten 189 (95,5 %) ein Vaginalsektret der Klasse II und III auf, d.h. waren in Bezug auf ihre Trichomoniasis geheilt. Diese Heilungsrate wurde bei 55 Patientinnen mit leichten Kolpitiden ohne jedwelche Zusatztherapie erreicht. Die Patientinnen sind, zum Teil jetzt über 2 Jahre, weiter beobachtet worden; während dieser Zeit sind keine Rückfälle oder Reinfektionen aufgetreten, was auf diesem Gebiet der Medizin ein Novum darstellt und auf die Wiederherstellung eines stabilen trichomonadenfeindlichen Vaginalml:l;ieus hinweisen dürfte. Schliesslich scheint die Vakzine auch einen positiven Einfluss auf Cervixveränderungen und Läsionen der Portio zu haben. Das Ge-. samtergebnis erscheint noch auffallender, wenn man bedenkt, dass der grössere Teil der Fälle mit verschiedenen chemischen Verbindungen lokal und systemisch bereits behandelt worden war, jedoch nur mit vorübergehendem Erfolg. .

Abgesehen von einer gelegentlichen Rötung oder einer leichten Schwellung im Bereich der Injektionsstelle traten bei keiner der Patientinnen während d^r Behandlung oder unmittelbar danach unerwünschte Nebenwirkungen auf. Es wurden auch keine allergischen oder toxischen Reaktionen festgestellt.

Es soll von der Impfung abgesehen werden, wenn akute febrile Infektionen, Krankheiten des'hämatopoeti-. sehen Systems oder schwere Niereninsuffizienz vorliegen.

Eine gleichzeitige Behandlung des Partners ist bei den mit der Vakzine behandelten Frauen zwar erwünscht, vom Blickpunkt der Patientin aus ist sie aber nicht unbedingt notwendig, da jene durch die Impfung immun wird.

Claims

Erfindungsansprach

1* Verfahren zur Herstellung einer Heterovaksine zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms, gekennzeichnet dadurch, daß man von den folgenden Stämmen von Lactobacterium acidophiluin, welche beim "Centraalbureau voor Schimmele ultüres" in Baarn (Niederlande) unter den Bezeichnungen CBS 465.77, CBS 466.77, CBS 467.77, CBS 468,77, CBS 469.77 _f CBS 470*77, CBS 471.77 und CBS 472,77 hinterlegt sind, einen Teil bis alle jeweils für sich allein auf einem geeigneten flüssigen Nährboden unter aeroben Bedingungen züchtet, nach Abschluß der Züchtung das gebildete biologische Material abtrennt und nach bekannten Methoden inaktiviert und die aus den einzelnen Stämmen erhaltenen und inaktivierten Mikroorganismen in einer physiologisch verträglichen Lösung miteinander in Mengen vermischt, welche jeweils der nach Abschluß der Züchtung oder nach der Inaktivierung festgestellten Dichte der Kultur (Anzahl Mikroorganismen per ml Kulturflüssigkeit) umgekehrt proportional sind,

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2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man alle acht genannten Stämme einsetzt.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Züchtung bei einem pH-Wert -von oder um 6,5 und bei einer Temperatur von oder um 37 ⁰C durchgeführt wirdc

4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Inaktivierung des gebildeten biologischen Materials durch Behandlung mit Formaldehyd und Phenol, vorzugsweise in einer in Bezug auf Formaldehyd 0,3%igen und in Bezug auf Phenol 0,5?£igen Lösung, durchführt.

5* Verfahren nach Punkt' 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die inaktivierten Mikroorganismen in die physiologisch verträgliche Lösung in solcher Menge zugibt oder die erhaltene Vakzine mit der physiologisch verträglichen Lösung

so weit verdünnt, daß per ml etwa I4 χ 1Cr inaktivierte Mikroorganismen vorliegen«

6· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß ein Konservierungsmittel hinzugegeben wird.