DE2425678A1

DE2425678A1 - Verfahren zur herstellung eines impfstoffs gegen infektioese pferdeanaemie

Info

Publication number: DE2425678A1
Application number: DE19742425678
Authority: DE
Inventors: Iii James Henry Rand
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1974-01-23
Filing date: 1974-05-28
Publication date: 1975-07-24
Also published as: CA1024890A; US3873690A; GB1465345A; JPS50101523A

Description

James Henry Hamid III Euclid, Ohio , ' ¥. St. A.

¥erfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Infektiöse

ale Ist eil - ilber die ganze Welt verbreitete erjiste Pferdekrankheiic, die durch -Insekten, wie Steckfllejgen und/oder Micken, von einem Pferd auf das andere übertragen wird. Die KrausScSieit scheint sich In I - oplschep und halbtropischem Klima schneller auszubreiten; Ihr Vorkomeeia Ist afner auf diese Gegenden nicht beschränkt. Charakteristische Syraptor dieser Krankheit erseheinen gewöhnlich drei bis vier Wochen nach der Infektion. &i ihnen gehören Fieber, geiiShiälißJ' von

C und etwas höher, Häsrsoglobullinverlurt Innerhalb i, wobei die Zahl der roten BlutBellen TQn 10 Millionen auf % oder 5 Billionen sinken kann; es können extranukle'are Ko2°per im den weißen Zellen des Tieres auftreten, es kann zu Blutungen Im Äuge, Gelbsucht, Blutungen In der Schleimhaut, an der Irnngemiwursel und dei* Bindehaut koiaien, es können auch Ödeme Im ^iszeralen Unterleib . ad In den Glledmüaßen auftreten, und außerdem kaum Hegalosplenle Im RektuEi der Tiere auftreten.

Bisher· war eine spezielle tierärztliche Behandlung jßl-eht bekannt,

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da die Fürsorge für die Pferde sich auf die Reinlichkeit und dit gute Ernährung beschränkte, und deshalb verlief die Gesundung von infizierten Tieren sehr langsam, und in den schlimmsten Fällen konnte man nichts weiter tun, als die Tiere zu töten, wenn die Krankheit ein vorgerücktes Stadium erreicht hatte. Die Infektion wird leicht von einem Pferd auf das andere übertragen, und es bereitet große Schwierigkeiten, die Ausbreitung der Krankheit einzudämmen, weil es vorkommen kann, daß ein Pferd sich scheinbar von der Krankheit erholt, dabei aber ein Keimträger bleibt und andere Tiere infiziert, was nicht nachzuweisen ist.

Es wurde nun gefunden, daß die infektBse Pferdeanämie eine Viruskrankheit ist, die durch eine besondere Art des Hapten-Virus hervorgerufen wird, die Proteinüberzüge aufweist, dii nicht antigen sind, d.h. die infolge ihres nit drigen MolekuLit·- gewiehts nicht die Erzeugung von starken Antikörpern auslö3d.. Die Erfindung macht von einem infizierten Teil dea Körpers des kranken Tieres Gebrauch, wobei die Milz bevorzugt wird, indem das undenaturierte Protein aus dem lienalen Material extrahiert und durch eine chemische Bindung, wie bia-diazotiertea Bensidin, an ein Freisdprotein, wie Kaninchen-iriauraglobulJn, gekuppelt wird, wodurch die Moleküle vergrößert werden, so daß das Material nunmehr instande ist, starke Antikörper zu erzeugen.

Das Ausgangsmaterxal zur Herstellung des Impfstoffs geciäß der Erfindung ist vorzugsweise die Milz eines oder mehrerer mit infektiöser Pferdeanämie infizierter Tiere. Die hierfür verwendeten Milzen können von verschiedenen Tieren, vorzugsweise von Pferden, stammen, und werden eingetauscht und zentrifugiert, um das Antigen zu erhalten. Die Milz wird bei einer niedrigen Temperatur von etwa -U bis -15 C mit einem fluorsubsti-

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tuierten Kohlenwasserstoff, vorzugsweise Trichlortrifluoräthan, als Lösungsmittel extrahiert. Die Homogenisierung des lienalen Materials erfolgt bei hoher Geschwindigkeit, vorzugsweise bei 15.000 bis 85.OOO U/min. Nach dem Homogenisieren läßt man das Material absitzen, wobei sich eine obere Schicht aus Nukleinsäuren und Salzlösung, eine Mittelschicht aus Protein im Gemisch mit der Fluorkohlenstoffverbindung und eine Unterschicht aus FluorkohlenstoffVerbindung und Fett ausbildet. Die aus Protein und Fluorkohlenstoffverbindung bestehende Schicht wird abgetrennt, und es werden im allgemeinen mindestens drei und vorzugsweise etwa 6 bis 10 solcher Homogenisierungs- und Trennvorgänge angewandt, um das bevorzugte lösliche Antigen zu erhalten. Dieses lösliche Protein- und Fluorkohlenstoffmaterial wird dann nach dem Frolin'schen Verfahren.untersucht, um den Prozentsatz an Protein zu bestimmen. Hierauf wird das Material mit Fremdprotein gemischt, wofür Kaninchen-Gammaglobulin, wie die Cohnfraktion II von Kaninchen-Gammaglobulin, bevorzugt wird. Das Verfahren zum Extrahieren der Cohnfraktion II ist von E.J. Cohn im "Journal of American Cancer Society", Bd. 68 (1946), S. M459₃ beschrieben. Unter Verwendung gleicher Gewichtsteile des (berechneten) Proteingehalts des Protein-Fluorkohlenstoffmaterials und des Kaninchen-Gammaglobulins werden diese beiden Stoffe langsam bei Raumtemperatur zusammen gerührt, wobei man etwa 5₉O bis 10,0 %_s bezogen auf das Gewicht des Gammaglobulins, angesäuertes bis-diazotiertes Benzidin (vorzugsweise 7₃6 %) langsam-zusetzt. Der Zusatz des bis-diazotierten Bezidins führt zur Koagulation, und beim weiteren Rühren fällt ein bräunlicher Proteinniederschlag aus, der aus der Komplexverbindung aus dem infektiösen Pferdeanämievirusprotein, dem diazotierten Benzidin und dem Gammaglobulin besteht. Diese Komplexverbindung wird zu einem Pulver gefriergetrocknet und in Ansätze zu je 1 ml zerlegt.

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Impfverfahren

Unter Verwendung des oben beschriebenen Impfstoffes und Prüfung der Ergebnisse wurde das immunisierende Antigen Pferden intrakutan injiziert. Im allgemeinen betrug das Volumen der immunisierenden Dosis 1 ml Komplexverbxndung aus Haptenprotein, bisdiazotiertem Benzidin und Kaninehen-Gammaglobulin, die, wie oben beschrieben, gefriergetrocknet worden war und durch Mischen mit ungefähr der gleichen Menge eine.s Trägers, gewöhnlich unvollständigem Freund'sehen Adjuvans oder gepufferter Kochsalzlösung, regeneriert wurde.

Beispiel 1

Zwei gesunde Pferde, von denen zuvor durch den Cogginsschen Test und die Abwesenheit klinischer Symptome nachgewiesen worden war, daß sie frei von infektiöser Pferdeanämie (EIA) waren, wurden für diesen Versuch verwendet. Eines der Pferde erhielt in Zeitabständen von je einer Woche sechs Injektionen von 1 ml Impfstoff (mit dem oben beschriebenen Träger) und dann zwei weitere Injektionen der gleichen Menge in Zeitabständen von einem Monat. Das andere Pferd diente als Kontrolle und bekam keine ImpfstoffInjektionen. An beiden Pferden wurden vollständige hämatologische Untersuchungen durchgeführt, und an dem geimpften Pferd wurde das Auftreten von zellulärer Immunität beobachtet, was durch die Hemmung der Wanderung von Leukozyten oder Makrophagen nachgewiesen wurde, die bei dem Kontrollpferd nicht auftrat, " Wenn zelluläre Immunität festgestellt worden war, erhielten beide Pferde eine tödliche Dosis von EIA, nämlich 10 ml einer 10 -fachen Verdünnung des Serums _sdas einem Pferd entnommen worden war, welches Virusträger des EIA-Virus war » Elf Tage nach der Impfung zeigte das Kontrollpferd die typischen Symptome der Krankheit, nämlich Fieber von 40,6 ⁰C, Anämie, visceral.es . ödem usw., und dieses Pferd wurde getötet.

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Das geimpfte Pferd andererseits zeigte einen Monat später keine Anzeichen der Krankheit. Dann erhielt dieses Pferd eine Dosis des Serums eines Virusträgerpferdes, die tausendmal größer war als die oben erwähnte tödliche Dosis. Einen Monat später wurden immer noch keine Anzeichen der Krankheit beobachtet. Schließlich erhielt dieses Pferd eine Virusdosis, die 1 Million mal größer war als die oben erwähnte Dosis; hierauf begann das Tier, eine sehr schwache Form einiger der Symptome der EIA-Krankheit zu zeigen. . '

Beispiel 2

Bei diesem Versuch wurden zwei gesunde Pferde wechselseitig geimpft, indem das Serum von dem ersten Pferd dem zweiten und das Serum von dem zweiten Pferd dem ersten eingeimpft wurde, ein Verfahren, das gewöhnlich angewandt wurde, um bei-den betreffenden Tieren'eine etwaige natürliche Virusinfektion festzustellen und die Möglichkeit der Anwesenheit des EIA-Virus auszuschließen. Einige Wochen später wurde eines dieser Pferde subkutan mit i ml des gekuppelten EIA-Impfstoffes geimpft, der, wie oben beschrieben, hergestellt und gefrier-getrocknet worden war. Dieses gekuppelte Antigen war mit 1 1/2 ml destillierten» Wasser als Träger regeneriert worden, und eine kleinere Menge dieses regenerierten Impfstoffes wurde auf mikrobiologische Sterilität geprüft. Diese Impfung des Versuchspferdes wurde in - . Zeiträumen von je einer Woche sechsmal und in Zeitabständen von einem Monat noch zweimal wiederholt. Während dieser Zeiträume wurde jeweils am Impftag eine vollständige hämatologische Untersuchung von Blutproben durchgeführt, die den Pferden in Zeitabständen von einer Woche entnommen wurden. Zusammen mit den hämatologischen Routineuntersuchungen wurde eine Leukozytenwanderungsuntersuchung ausgearbeitet und routinemäßig durchgeführt und geprüft. Etwa zwei Wochen nach der letzten wöchent-

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lichen Injektion des Impfstoffes an das Versuchspferd machte sich eine ausgeprägte Hemmung der Leukozytenwanderung in dem Serum des geimpften Pferdes bemerkbar, während sich bei dem nicht-geimpften Pferd bei der Wanderungsuntersuchung keine Änderung zeigte. Diese Hemmungserscheinung bei dem Versuchspferd zeigte auch weiterhin
einen erheblichen Grad von zellulärer Immunität bis zum Tage der
nachstehend beschriebenen Reizimpfung. Einen Monat nach der letzten der beiden oben erwähnten monatlichen Impfungen des Versuchspferdes erhielt dieses Pferd eine Injektion von 10 ml einer 10 -fachen Verdünnung der oben beschriebenen tödlichen Dosis des einem Virusträgerpferd entnommenen EIA-Serums. Einen Monat später und auch noch danach zeigte das geimpfte Pferd kein Anzeichen oder Symptom der EIA-Krankheit. Seine Hämatologie ist auch jetzt noch völlig
normal, und alle seine Reaktionen, Temperatur und andere klinische Anzeichen sind ebenfalls normal. Eine Woche nach»der Reizimpfung
des Versuchspferdes erhielt das nicht-geimpfte Pferd eine Reizimpfung mit 10 ml einer 10 fachen Verdünnung der tödlichen Dosis des EIA-Serums eines infizierten Pferdes, und dieses Pferd mußte
elf Tage später, als es Fieber von 40,6 ⁰C hatte und die klinischen Anzeichen der Krankheit stark fortgeschritten waren, getötet werden.

Beispiel 3

Bei diesem Versuch wurden 13 Pferde, wie oben beschrieben, wechselseitig geimpft, um etwaige natürliche Virusinfektionen bei diesen Tieren festzustellen und die Möglichkeit der Anwesenheit des EIA-Virus bei einem der Tiere auszuschließen. 7 der Pferde, die zufallsmäßig ausgewählt wurden, wurden durch Impfen mit 1 ml des mit einem Träger, wie oben beschrieben, regenerierten gekuppelten Antigens geschützt; zu diesem Zweck wurden sechs Impfungen in Zeitabständen von je einer Woche und zwei weitere Injektionen in Zeitabständen
von je einem Monat durchgeführt. Dann erhielten alle 13 Pferde
eine tödliche Dosis des EIA-Virus aus dem Serum eines infizierten

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Virusträgers, wie oben beschrieben. Alle 6 ungeschützten Pferde verendeten. Keines der zuvor geimpften und geschützten Pferde erkrankte an der EIA-Krankheit oder zeigte irgendwelche Symptome dieser Krankheit. Blut der behandelten Pferde wurde normalen, gesunden Pferden injiziert, und keines dieser normalen Pferde erkrankte an der EIA-Krankheit.

Beispiel 4

7 normale, gesunde Pferde wurden zunächst wechselseitig geimpft, indem das Serum des ersten Pferdes dem zweiten, das Serum des zweiten Pferdes dem dritten usw. und schließlich das Serum des siebenten Pferdes dem ersten injiziert wurde. Hierdurch wurde die Möglichkeit einer Virusinfektion dieser Tiere sowie der Anwesenheit des EIA-Virus in einem der Tiere ausgeschlossen. Eines der Pferde wurde aufs Geratewohl als Kontrolltier ausgewählt. Die anderen 6 Pferde wurden mit 1 ml des gekuppelten EIA-Impfstoffes in dem üblichen Träger geimpft. Die Impfungen wurden in Zeitabständen von einer Woche sechsmal und in Zeitabständen von 1 Monat noch zweimal wiederholt, wie oben beschrieben. An den Blutproben aller 7 Pferde wurden jede Woche hämatologische Untersuchungen durchgeführt, bis sich eine deutliche Hemmung der Leukozytenwanderung in dem Serum der 6 geimpften Pferde bemerkbar machte. Dann erhielten alle 7 Pferde je 10 ml einer 10~ -fachen Verdünnung einer normalen tödlichen Dosis des einem Virusträgerpferd entnommenen EIA-Serums. Die Impfungen erfolgten, wie oben beschrieben, subkutan. Während des folgenden Monats zeigten sich an den Pferden bei prophyOaktischen Untersuchungen keinerlei Anzeichen oder klinische Zeichen der EIA-Krankheit. Das Kontrollpferd verendete. Die prcphyikktisch geimpften Pferde erhielten Reiz-Impfungen mit verschiedenen Verdünnungen des positiven EIA-Serums, und selbst bei Anwendung des Virus-Serums in voller

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Stärke zeigte keines der Pferde, die die Reizimpfung erhielten, irgendwelche Anzeichender EIA-Krankheit; solche Anzeichen treten gewöhnlich ungefähr in der dritten Woche nach der Infektion auf. Das Serum eines der als positiv festgestellten Tiere wurde einem gesunden Pferd injiziert, und dieses Pferd zeigt keinerlei klinische Anzeichen der EIA-Krankheit, obwohl die Inkubationszeit von über 1 Monat bereits lange vergangen ist.

100 normale Pferde wurden mit einem erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff gegen die EIA-Krankheit geimpft, und es haben sich innerhalb eines langen Zeitraums weit über die normale Inkubationszeit hinaus keinerlei klinische Symptome eingestellt. 10 Rennpferde, von denen klinisch festgestellt wurde, daß sie an der EIA-Krankheit litten, wurden durch Impfung mit je 1 ml des, wie oben beschrieben, gefriergetrockneten und mit etwa der gleichen Menge eines der oben beschriebenen Träger regenerierten gekuppelten Antigens behandelt, wobei die Impfungen sechsmal in Zeitabständen von je einer Woche und dann zweimal in Zeitabständen von je zwei Monaten durchgeführt wurden. 90 Tage später hatten sich die Pferde vollständig von der EIA-Krankheit erholt und konnten wieder an Pferderennen teilnehmen. Durch Infektion mit der EIA-Krankheit werden Pferde fast immer getötet; aber keines dieser Pferde verendete, und einige gewannen sogar ihre Rennen.

Das oben für die Herstellung des EIA-Impfstoffes erwähnte Kaninchen-Gammaglobulin kann durch Gammaglobulin von Lämmern, Ziegen oder anderes Gammaglobulin von anderen Tieren als Pferden ersetzt werden; das Gammaglobulin von Kaninchen wird jedoch bevorzugt, weil es billiger und leichter erhältlich ist und ■ in standartisierter Form zur Verfügung steht.

Die hier als infektiöse Pferdeanämie (EIA) bezeichnete Krankheit

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wird mitunter auch _a^s "Sumpffieber¹¹ bezeichnet.

Als Kupplungsmittel zum Kuppeln des Gammaglobulins an das Virusprotein kann man einen der folgenden Stoffe verwenden: bis-diazotiertes Benzidin, m-Xylylendiisocyanat, Toluylen-2,4-diisocyanat, Bicyclohexylcarbodiimid, 3,3'-Dimethylbenzidin, 3,3^f-Dichlorbenzidin und a,a^!-Bis-p-toluidin.

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Claims

28. Mai 1974 James Henry Rand III R-57077 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen infektiöse Pferdeanämie, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein Organ eines Kranken, mit dem Virus der infektiösen Pferdeanämie infizierten Tieres einmaischt,

(b) das undenaturierte Protein des Virus durch Extraktion des eingemaischten Gutes bei -4 bis -15 C mit Trichlortrifluoräthan und Zentrifugieren mit 15·000 bis 85.000 U/min, herstellt,

(c) eine gegebene Gewichtsmenge dieses Proteins mit im wesentlichen der gleichen Gewichtsmenge eines nicht vom Pferd stammenden Gammaglobulins unter Rühren mischt, •wobei man als Kupplungsmittel bis-diazotiertes Benzidin, m-Xylylendiisocyanat, Toluylen-2,4-diisocyanat, Bicyclohexylcarbodiimid, 3_S3'-Dimethylbenzidin, 3,3'-Dichlorbenzidin oder α,α'-Bis-p-toluidin in einer Menge von etwa J ,6 % der genannten gegebenen Gewichtsmenge zusetzt und dadurch das gewünschte Antigen für den Impfstoff ausfällt und

(d) den Niederschlag zu einem Pulver gefriertrocknet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c) als Gammaglobulin Kaninchen-Gammaglobulin und als Kupplungsmittel bis-diazotiertes Benzidin verwendet.

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des Impfstoffes für die Injektion an Pferde das in Stufe (c) gewonnene Antigen durch Vermischen des Pulvers mit ungefähr dem gleichen Volumen an destilliertem Wasser, gepufferter Kochsalzlösung oder unvollständigem Freund'scheÄi Adjuvans regeneriert.

4. Erzeugnis, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Anspruch hergestellt ist.

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