DE2854723B2

DE2854723B2 - Hetero-Impfstoff zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2854723B2
Application number: DE2854723A
Authority: DE
Inventors: Ljubinko Riehen Stojkovic (Schweiz)
Original assignee: Solco Basel AG
Current assignee: ICN Switzerland AG
Priority date: 1977-12-23
Filing date: 1978-12-19
Publication date: 1981-02-12
Also published as: NO149316B; PH16435A; DE2854723C3; IT1109099B; AR220548A1; ZA786978B; GB2010677A; SE7813201L; PL211979A1; BE872884A; IL56177A0; AT368390B; CH639280A5; YU303078A; AU4292778A; FI65166B; ES476703A1; DD141163A5; DK152174C; MX5876E

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft einen neuen Hetero-Impfstoff zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syridroms und Verfahren zu seiner Herstellung.

Mikroorganismen der Gattung Trichomonas vaginalis gehören zu den Protozoen und gemäß der systematischen Einteilung der Protozoen, die in der Humanmedizin von Bedeutung sind, zur Klasse der Mastigophora oder Flagellata. Dabei handelt es sich um einen prinzipiell pathogenen Parasiten, der im weiblichen und männlichen Urogenitaltrakt gefunden wird. Die Übertragung erfolgt hauptsächlich durch Kohabitation, es sind aber auch schon Infektionen durch Gegenstände nachgewiesen worden.

Obgleich Männer der Infektion ebenso häufig ausgesetzt sind wie Frauen, weisen sie wesentlich seltener klinische Symptome auf; der Großteil der Trichomonadenlrägcr ist besch weidefrei oder beachtet eine leichte Sekretion - Symptom für eine LJrethritis überhaupt nicht.

Bei Frauen liegt die praktische Bedeutung der Infektion zuerst in der Störung der Genitalorgane durch massive eitrige Entzündungen der Scheide mit ihren oft entscheidenden Folgen für eine normale Ehe. Die Infektion bleibt im allgemeinen nicht auf die Scheide beschränkt, sondern meistens wird die begleitende pathogene Mischflora durch die Trichomonaden in den oberen Genhaitrakt mitgeschleppt und führt zu Entzündungen der Gebärmutteranhänge (Adnexitis), weiche die Gefahr einer Tubargravidität oder eines Verschlusses der Eileiter (Sterilität) mit sich bringen. Sowohl die chronische Infektion als auch die wiederkehrenden Rückfälle führen zu einer erheblichen Entzündung der Portio vaginalis uteri und der Cervix, in deren Gefolge lokale Gewebsveränderungen auftreten, die von der rückbildungsfähigen Dysplasie bis zu Vorstufen des Gebärmutterhals-Karzinoms reichen. Das vielfältige klinische Bild der Trichomonadeninfektion wird insgesamt als Trichomonas-Syndrom bezeichnet.

Obgleich das im Handel erhältliche Präparat Metronidazol [1 -(2-HydroxyäthyI)-2-methyl-5-nitroimidazol] zur Abtötung von Trichomonas vaginalis durchaus geeignet ist und für diese Indikation therapeutisch verwendet wird, hat die Anzahl der Erkrankungen bisher keineswegs abgenommen, sondern zeigt eher eine steigende Tendenz; je nach Land sind inzwischen zwischen 3,5 und 88% der Bevölkerung von der Infektion befallen, so daß hier von einer Volkskrankheit gesprochen werden kann.

Die Ausbreitung der Infektion und die immer wieder zu beobachtenden Reinfektionen werden durch die erhöhte Promiskuität .kräftig gefördert. Zudem werden die Hartnäckigkeit der Infektion und eine gewisse Therapie-resistenz durch den sich ständig ausweitenden Dauergebrauch von ovulationshemmenden Steroiden begünstigt, da bekanntlich alle hypoovariellen Zustände, d. h. ein relativer Mangel an körpereigenen ovariellen Hormonen, die Epithelproliferation in der Scheide hemmen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, einen Impfstoff zu entwickeln, mit dessen Hilfe es möglich isi, das durch Infektionen durch Trichomonas vaginalis hervorgerufe ne Trichomonas-Syndrom auf wirksame Weise zu bekämpfen.

Auf der Suche nach einer Lösung dieser Aufgabe wurde nun gefunden, daß unter der Vielzahl der in der Natur vorkommenden Stämme des Lactobacterium acidop'iilum (auch als Lactobacillus acidophilus, Milchsäurebacterium, Lactobacterium, Milchsäurelangstäbchen, Döderlein-Stäbchen odei Döderlein-Bacterium bezeichnet) (zur Zeit sind etwa 4000 verschiedene Stämme bekannt) einige mit Erfolg für die Behandlung des Trichomonas-Syndroms eingesetzt werden können, da aus ihnen ein wertvoller Hetero-Impfstoff gewonnen werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein Hetero-Impfstoff zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er aus inaktivierten Mikroorganismen von Stämmen des Lactobacterium acidophilum, die beim »Centraalbureau voor Schimmelcultures« in Baum (Niederlande) unter lcn Bezeichnungen CBS 465 77, CBS 466 77, CIiS 467 77, CBS 468 77, CHS 464 77. CHS 470 77. CBS 47 I 77 Lind CBS 472 77 hinterlegt sind, in einer phv ,iologiseh verträglichen Lösung besieht, wobei die Mikroorganismen aus einem Teil der gciumitcn Stämme oder ,ms allen genannten Stämmen stammen und in annähernd gleicher Anzahl je Stamm vorliegen.

Mit dem erfindungsgemäßen Hetero-lmpfstoff ist es möglich, das Trichomonas-Syndrom auf wirksame Weise therapeutisch zu behandeln und er führt zu einer Immunität

In dem erfindungsgemäßen Hetero-lmpfstoff bestehen die inaktivierten Mikroorganismen vorzugsweise aus aller, acht obengenannten Stämmen und gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung enthält er die inaktivierten Mikroorganismen in einer Anzahl von etwa 14 χ H)⁹ pro mL

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sollen in dem Hetero-lmpfstoff Mikroorganismen von mindestens drei der obengenannten Stämme vorliegen.

Die obengenannten einzelnen Stämme von Lactobacterium acidophilum sind 1976 aus der Vagina von an dem Trichomonas-Syndrom leidenden Frauen im Krankenhaus entnommen worden. Sie wurden am 17.

Ill Oktober 1977 im lyophilisierten Zustand beim »Centraalbureau voor Schimmelcultures« in Baarn (Niederlande) unter den Bezeichnungen CBS 465 77 bis CBS 472 77 hinterlegt

In morphologisf her Hinsicht unterscheiden sich die verschiedenen Stämme u. a. nach der Größe der gebildeten Kolonien voneinander: manche Kolonien sind sehr klein, durchsichtig und kreisförmig, andere Kolonien sind größer und haben die Gestalt einer Rosette, deren Oberfläche zerfurcht ist Mikroskopisch betrachtet gehören alle acht Bakterienstämme zu den grampositiven polymorphen Bazillen, die in Form von Ketten oder Palisaden vorkommen.

Das biochemische Verhalten dieser Bakterienstämme kann durch ihr Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen wie nachfolgend angegeben charakterisiert werden:

Tabelle I KohlenslolTquelle Laclobuclcrium acidophilum. SUimm CBS-Nr.

465.77 466.77 467.77 »68.77

469.77

470.77

471.77

472.77

Arubinosc

Cellobiose

Lactose

Maltose

Mannitol

Melibiose

Ralllnose

Rhamnosc

Salicin

Sucrose

Trchaloso

Xylose

Ribosc

Stärke

Die Bakterienstämme CBS 466 77, 467 77 und 469 77 weisen die gleichen biochemischen bzw. fermentativen Eigenschaften auf.

Der erfindungsgemäße Hetero-lmpfstoff kann nach einem einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß von den genannten Stämmen von Lactobaktenum acidophilum ein Teil bis alle jeweils für sich allein auf einem geeigneten flüssigen Nährboden unter aeroben Bedingungen bei einem ph-Wert von etwa 6,5 und einer Temperatur von etwa 37° C gezüchtet werden, nach Abschluß der Züchtung das gebildete biologische Material abgetrennt und nach bekannten Methoden inaktiviert wird und die aus den einzelnen Stämmen erhaltenen inaktivierten Mikroorganismen in einer physiologisch verträglichen Lösung in Mengen miteinander vermischt werden, die jeweils der na.h Abschluß der Züchtung oder nach der Inaktivierung festgestellten Dichte der Kultur (Anzahl der Mikroorganismen pro ml Kulttirlliissigkcil) umgekehrt proportional sind.

Vorzugsweise wurden bei der Durchführung des crfindiingsgumiiUcn Verfahrens alle acht genannten Biiklcricnstämmc eingesetzt

Die Inaktivierung des bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildeten biologischen Materials erfolgt vorzugsweise durch Behandlung mit Formaldehyd und Phenol, insbesondere in einer in bezug auf Formaldehyd O,3°/oigen und in bezug auf Phenol 0,5%igen Lösung.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die inaktivierten Mikroorganismen der physiologisch verträglichen Lösung in einer solchen Menge zugegeben oder der erhaltene Impfstoff wird mit der physiologisch verträglichen Lösung so weit verdünnt, daß pro ml etwa 14xlO⁴ inaktivierte Mikroorganismen vorliegen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung aller obengenannten acht Bakterienstämme erhält man einen generell wirksamen Impfstoff. Darunter versteht man einen Impfstoff, der praktisch bei jeder beliebigen Patientin wirksam ist bzw. mit dessen Hilfe es möglich ist, ungeachtet der Herkunft der Infektion das Trichomonas-Syndrom erfolgreich zu behandeln. Dieser Impfstoff, in dem inaktivierte Mikroorganismen aus allen acht genannten Stämmen vorliegen, stellt daher eine besonders bevorzugte Alisführungsform der Erfindung dar.

Selbstverständlich kann der erfindungsgemäße Hetcro-Impfstoff auch ein Konservierungsmittel enthalten.

Für die Züchtung der obengenannten Baktericnslämme können verschiedene, in der Mikrobiologie übliche flüssige Nährböden verwendet werden. Als besonders zweckmäßig hat sich ein Nährboden der folgenden Zusammensetzung erwiesen:

Tryptose-Pepton 5 g

Caseinhydrolysat 8 g

Fleischextrakt 10 g

Hefedialysat 100 ml

K₂H PO* 2 g

Triammoniumcitrat 2 g

Natriumacetat 5 g

Salzgemisch 5 ml
Polyoxyäthylenderivatc der

Sorbitanolcate 1 ml

Glucose 10 g

Lactose 10 g
destilliertes Wasser ad 100 ml

Das oben erwähnte Salzgemisch besteht aus:
MgSO., -7 HjO 11.5 g

MnSOj -2 H-O
FeSO₄-7 H:O
destilliertes Wasser

2.4 g
0.68 g
ad 100 nil

Das flüssige Medium wird auf einen pH-Wert von b.l bis 6,8. vorzugsweise 6,5. eingestellt und 20 Minuten lang im Autoklav bei einer Temperatur von 115'C sterilisiert.

Der Nährboden wird in sterilisierte Gefäße, z. B. Erlenmeyerkolben, verteilt und der Inhalt jeden Gefäßes wird mit einer Probe eines einzelnen Stammes geimpft. Die Züchtung wird zweckmäßig bei einer Temperatur von 32 bis 45⁰C. vorzugsweise bei etwa 37°C, z. B. 48 Stunden lang durchgeführt. Nach dieser Zeitspanne oder wenn sich eine für die beabsichtigte Impfstoffherstellung ausreichende Menge biologisches Material gebildet hat. wird dieses unter sterilen Bedingungen gesammelt und durch Zentrifugieren von dem anhaftenden Nährboden befreit, beispielsweise durch 1 stündiges Zentrifugieren bei 3000 Umdrehungen/Min.

Der aus dem biologischen Material bestehende Bodenkörper wird dann wieder in Suspension gebracht, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung, und hierauf auf bekannte Weise inaktiviert. Zur Inaktivierung eignet sich ganz besonders eine Behandlung mit Formaldehyd und Phenol; besonders vorteilhaft ist eine Konzentration der Suspension von 0,3% an Formaldehyd und von 0,5% an Phenol und eine Behandlungsdauer von 3 bis 5 Tagen. Nach der Inaktivierung wird die Suspension erneut zentrifugiert, z. B. 1 Stunde lang bei 3000 Umdrehungen/Min., um das inaktivierte Material von dem zur Inaktivierung benutzten Mittel bzw. vom Überschuß an Formaldehyd und Phenol zu befreien.

Das aus jedem einzelnen Stamm gewonnene biologische Material wird erneut in Suspension gebracht, vorzugsweise in physiologischer Kochsalzlösung, und einer Prüfung auf Sterilität sowie einer Prüfung auf das Vorhandensein von noch lebensfähigen Lactobakterien nach den weiter unten beschriebenen Methoden unterworfen. Wenn beide Prüfungen negativ ausfallen, d.h. wenn sich das Material zur Herstellung des Impfstoffes eignet, wird die bei jedem Stamm erreichte Dichte der Kultur, d. h. die Anzahl der Mikroorganismen pro ml Kulturflüssigkeit, bestimmt.

1st es aus irgendeinem Grund nicht möglich, die Vermischung der einzelnen biologischen Materialien unmittelbar nach der Inaktivierung vorzunehmen, sollci. die entsprechenden Suspensionen inzwischen bei einer Temperatur von 4^CC aufbewahrt werden. Man kann auch die inaktivierten Mikroorganismen eines jeden Stammes lyophilisieren und in diesem Zustand bei clwa 4°C aufbewahren. Die lyophiliskxten Stämme können bei dieser Temperatur mindestens drei Jahre lang unverändert gelagert werden. Als Schutzkolloid für die Lyophilisierung eignet sich insbesondere ein Medium aus 5,6% Gelatine. 37,5% Saccharose und 0.5% Calciumlactobionat: zweckmäßig wird 24 Stunden lang lyophilisierl.

Schließlich wird das aus den einzelnen Stämmen jeweils erhaltene und inaktivierte biologische Material in solcher Menge vermischt, daß daraus ein in bezug auf die Anzahl der Mikroorganismen eines jeden Stammes pro ml annähernd gleichwertiger Impfstoff entsteht. Der erhaltene Impfstoff wird zweckmäßig mil einer physiologischen Kochsalzlösung so weit verdünnt, daß er pro ml etwa 14 χ 10" Mikroorganismen enthält.

Der erfindungsgemäßc Impfstoff hat einen Gesamtstickstoff-Gehalt von 3.b8 mg% der Trockensubstanz (Bestimmung nach Kjeldahl). Es hat sich als besonders zweckmäßig erwiesen, ein Konservierungsmittel, beispielsweise Formaldehyd oder Phenol (Konzentration an Formaldehyd bzw. Phenol /.. B. 0.25%) oder NatriumäihylquecksilberOOthiosalicylai. zuzusetzen und den Impfstoff etwa 30 Tage lang bei einer Temperatur von 4"C reifen zu lassen, bevor er in Ampullen abgefüllt wird. Vorzugsweise enthält eine Ampulle 0.5 ml des erfindungsgemäßen Impfstoffes. Selbstverständlich sollen auch diese letzten Maßnah men unter sterilen Bedingungen und in pyrogenfrcicm Glasmaterial durchgeführt werden.

Der Ampulleninhalt kann auch lyophilisierl und bis zum Zeitpunkt seiner Verwendung in Form einer Trockenampulle, vorzugsweise bei etwa 4 C. gelagert werden. Die Haltbarkeit des Impfstoffes, ob in Form der üblichen Ampullen oder als Trockenampullc. beträgt mindestens drei Jahre ab Herstellung, wenn er bei einer Temperatur von 2 bis 8^rC (normale Kühlschranktcmpcratur) aufbewahrt wird; bei Aufbewahrung bei etwa 20°Cistder Impfstoff etwa 6 Monatelang haltbar. Es sei noch erwähnt, daß eine Zeitspanne von drei Jahren die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für einen inaktivierten Impfstoff (Totimpfstoff) maximal zugelassene Verwendungsdauer darstellt.

Mit dem erfindungsgemäßen Impfstoff sollen, bevor er für die therapeutische Anwendung freigegeben wird, die folgenden Prüfungen durchgeführt werden:

1. Prüfung auf Sterilität (1. Sterilitätsprüfung);

2. Prüfung auf Toxizität;

3. Prüfung auf Antigen-Wirkung;

4. Prüfung auf Vorhandensein noch lebensfähiger Lactobakterien (2. Sterilitätsprüfung).

Dabei verfährt man vorzugsweise nach den Vor-Schriften der Weltgesundheitsorganisation (Erfordernisse für biologische Substanzen, Technische Berichte der WHO Nr. 323. 1966) und der Europäischen Pharmakopoell, 1971.

Zur Prüfung auf Sterilität wurde je I ml Impfstoff in Reagenzgläser mit dem Thioglycolat-Nährmedium und in solche mit dem Sabouraud' Bouillon gegeben, die Reagenzgläser wurden danach 10 Tage lang bei einer Temperatur von 37' C inkubiert und eine entsprechende

Reihe von gleich behandelten Reagenzgläsern wurde während derselben Zeitspanne bei einer Temperatur von 25'C inkubiert. Es zeigte sich, daß sämtliche Reagenzgläser in den beiden Reihen steril geblieben waren.

Die Prüfung auf Toxizität erfolgte beim Meerschweinchen und bei der weißen Maus.

Es wurden fünf Meerschweinchen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 300 g jeweils 5 ml Impfstoff (d.h. lOmal mehr als die für den Menschen vorgesehene Einzeldosis) intramuskulär - 2.5 ml in jedes Hinterbein - verabreicht. Nach einer Beobachtungszeil von 14 Tagen waren die fünf Tiere unverändert gesund, auch in den behandelten Beinen wurden keine Reaktionen festgestellt.

Andererseits wurden zehn weißen Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g jeweils 0.5 ml Impfstoff intramuskulär in ein Hinterbein verabreicht: nach einer Beobachtungszeit von 14 Tagen waren die zehn Mäuse unverändert gesund.

Die Prüfung auf Antigen-Wirkung erfolgte zuerst in vivo beim Meerschweinchen. Von den im vorhergehenden Abschnitt erwähnten Versuchstieren wurden drei nach 14 Tagen mit jeweils 1 ml Impfstoff intrakardial behandelt: trotz der verhältnismäßig hohen Dosis wurde keine anaphylaklische Reaktion beobachtet.

Sodann wurde der Impfstoff auch in vitro nach der Immunodiffusions-Methode von Ouchterlony gegenüber Proben von normalem menschlichen Serum geprüft: es wurde keine positive Reaktion festgestellt.

Zur Prüfung auf das Vorhandensein von noch lebensfähigen Lactobakterien wurden Proben des Impfstoffes auf einem zur Isolierung und Identifizierung dieser Mikroorganismen geeigneten festen Nährboden gezüchtet. Es eignet sich dafür ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:

Wasser	800 ml
Tripcasein	16g
Lösung 1	50 ml
Lösung 2	lOmi
Lösung 3	lOml
Lösung 4	10 ml
frische Hefe	100 g
Witte-Pepton	lOg
lösliche Stärke, 0.5%
(in gelöstem Zustand)	5g
Wasser	ad 1000 ml

Die obengenannten, wäßrigen Lösungen bestanden jeweils aus:

Lösung 1: 10%igeNaCI-Lösung
Lösung 2: 2%ige KCl- und 5%ige Na₂COj-Lösung
Lösung 3: 2°/oige CaCl₂- und 1 %ige MgCl₂-Lösung Lösung 4: Z5%ige K₂HPO₄-Lösung

Der erhaltenen Endlösung wurden 25 g Agar-Agar zugegeben, der pH-Wert wurde auf 53 bis 6,7, vorzugsweise auf etwa 6.0, eingestellt und das Medium wurde 20 Minuten lang im Autoklav bei einer Temperatur von 115° C sterilisiert Hierauf wurden eine Lösung von 3 g Maltose, 10 g Glucose und 10 g Lactose in 100 ml Wasser und danach 30 ml einer l%igen Cysteinhydrochlorid-Lösung zugegeben; jede dieser Lösungen wurde zuvor durch Sterilfiltration, z. B. durch ein Glasfilter, sterilisiert Schließlich wurden diesem Medium noch 10% defibriniertes menschliches B'ut

zugesetzt. Der so hergestellte Blutagar-Nährboden wurde mit Proben des Impfstoffes beimpft und bei einer Temperatur von 37^CC inkubiert. Zur Kontrolle wurden Proben von Lactobacterium acidophilum unter den gleichen Bedingungen eingeimpft und gezüchtet.

In dem Impfstoff konnten keine lebenden Mikroorganismen nachgewiesen werden, was die vollständige Inaktivierung durch die bevorzugte, Formaldehyd und Phenol verwendende Methode beweist. Der erfindungsgemäße Impfstoff ist daher ein sogenannter Totimpfstoff. Da er andererseits seine Wirkung gegen eine Infektion und ihre Folgeerscheinungen entfaltet, die durch einen artfremden Mikroorganismus — Trichomonas vaginalis — verursacht werden, gehört er zur Klasse der Heiero-impfsiofie.

Der erfindungsgemäße Impfstoff bewirkt u. a. die Bildung von spezifischen Antikörpern gegen Lactobacterium acidophilum, insbesondere gegen dessen abnorme und polymorphe Formen, die für die pathologische Veränderung des pH-Wertes der Scheide bei dem Trichomonas-Syndrom mitverantwortlich sind. Diese immunisierende Wirkung läßt sich sowohl im Tierversuch als auch bei der klinischen Prüfung folgendermaßen nachweisen.

Im Tierversuch wurden zwei Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2950 bzw. 3200 g verwendet und in einem Abstand von zwei Wochen zweimal mit jeweils 0.5 ml Impfstoff intravenös geimpft. 1 Monat nach der zweiten Behandlung wurde den Tieren Blut entnommen und daraus das Serum gewonnen. Wenn sich Antikörper gebildet haben, so sollte das Seaim in einer Verdünnung von mindestens 1 :50 spezifisch die Lactobakterien jener Stämme agglutinieren. aus denen der Impfstoff gewonnen wurde. Das Serum weist dann in der untersuchten Verdünnung einen positiven Titer an Agglutininen auf. Bei dem ersten bzw. dem zweiten Kaninchen war der Titer der Agglutinine vor der Impfung negativ bei einer Serumverdünnung von jeweils 1 :10, 1 Monat nach der zweiten Behandlung war er positiv bei einer Verdünnung von 1 :160 bzw. 1 :80.

Der erfindungsgemäße Impfstoff ermöglicht die kurative und prophylaktische Behandlung des Trichomonas-Syndroms und der akuten, chronischen und asymptomatischen Trichomoniasis. Ob kurativ oder prophylaktisch, es wird die folgende Dosierung empfohlen: Verabreichung einer Dosis von 0,5 ml (d. h. etwa 7 χ 10'Mikroorganismen) intramuskulär, dreimal in einem Abstand von jeweils 2 Wochen, gefolgt von einer Rappelinjektion mit der gleichen Dosis (0,5 ml) 1 Jahr nach Beginn der Behandlung.

Entsprechend der angegebenen Dosierung wurden klinische Prüfungen durchgeführt und bei 97 Patientinnen wurden serologische Untersuchungen durchgeführt Den Patientinnen wurde nach einem festlegten Zeitplan Blut entnommen und das gewonnene Blutserum auf das Vorhandensein von Lactobakterien-Antikörpern hin geprüft Dazu wurde das Serum in geometrisch zunehmender Verdünnung (von 1:10 bis 1 :1280) mit einem dem Impfstoff entsprechenden Antigen oder Agglutinogen behandelt und die eventuell auftretende Agglutination beobachtet Als Agglutinogen wurde eine frisch hergestellte, & h. weniger als 3 Monate alte Suspension von inaktivierten Mikroorganismen des Lactobacterium acidophilum der gleichen Stämme, in dem gleichen Mengenverhältnis und in der gleichen Konzentration (14 χ ΙΟ⁹ Mikroorganismen pro ml) wie der Impfstoff selbst verwendet Zur

030167/244

ίο

Inaktivierung wurde Phenol in einer Konzentration von 0,25% in der Suspension verwendet. Das Auftreten und die zeitliche Entwicklung der Agglutinine im Serum als

Tabelle 2

Verteilung des Agglutinintiters vor und nach der Impfung Folge der Impfung gehen aus den Werten des Titers in der folgenden Tabelle 2 eindeutig hervor.

Tiler	Vor der Impfung	2 Wochen nach der 3.	3 Moiiiile Injektion	(i Monale	12 Monate nach Inipl'ungs- beginn
<1 : 10	16	1	1	1	1
1 : 10	0	0	0	0	1
I :20	8	2	3	3	3
I :40	13	0	1	3	S
1 :80	29	3	5	6	17
1 : 160	18	13	11	16	16
1 :320	13	49	48	40	15
1 :640	0	25	24	20	3
1 : 1280	0	4	3	3	0
Total*)	97	97	96	92	64
Geometrischer Mittel wert des Titers	1 :56,4	1 : 356	1 : 293	1 : 257	1 : 120

*) Der Abfall bei dem Total nach 3, 6 und 12 Monaten ist durch Patientinnen bedingt, die nicht mehr zur Kontrolle kamen.

Aus dem oben stehenden geometrischen Mittelwert des Titers läßt sich z. B. 2 Wochen nach Abschluß der Impfung eine Erhöhung des Titers um einen Faktor von (im Durchschnitt) 6,3 berechnen. Ein Jahr nach Beginn der Impfung, d. h. zu dem Zeitpunkt der Wiederauffrischungsinjektion (Rappelinjektion), ist der Agglutinintiter noch 2,1 mal höher als zuvor, wodurch der langwährende Erfolg der Impfung teilweise erklärt werden kann.

Berücksichtigt man die Erhöhung des Titers während der auf der Impfung unmittelbar folgenden Zeitspanne, d. h. in der Zeit zwischen der ersten und der zweiten Blutentnahme, so verteilt sie sich auf die Patientinnen wie folgt:

Tabelle 3 Erhöhung des Agglutinintiters	Faktor der 2x	Erhöhung 4 x	8x	16X	32 χ	64 x und mehr
	13 13,4%	13 13,4%	21 21,6%	10 10,3%	6 6,2%	7 7,2%
Anzahl der Patientinnen Anteil der Patientinnen am Total

Von dem Erfolg der Behandlung vermag der folgende zusammenfassende klinische Bericht ein Bild zu geben. 200 Frauen im Alter von 15 bis 59 Jahren, welche an dem Trichomonas-Syndrom litten, sind mit dem Impfstoff (aus den acht genannten Stämmen hergestellt) ambulant behandelt worden; die Kontrollen erstreckten sich über eine Zeitspanne von zum Teil mehr als 2 Jahren (2 eo Patientinnen sind nicht mehr zur Kontrolle erschienen). 138 Patientinnen, d.h. 69% vom Total, waren zuvor wiederholt mit oralen oder vaginalen Präparaten, insbesondere Metronidazol, behandelt worden, jedoch wegen erneuter Infektion ohne Langzeiterfolg. Vor Behandlungsbeginn wurde jeweils neben der Blut- und Urinuntersuchung eine gynäkologische Untersuchung ...-.· inklusive Kolposkopie und Pap-Smear durchgeführt; parallel dazu wurden Abstriche der Vulva, der Scheide, der Cervix und der Urethra vorgenommen und daraus ein Nativpräparat sowie auch ein nach Gram und ein nach Giemsa gefärbtes Präparat hergestellt und eine Kultur auf Trichomonas vaginalis angelegt Alle diese Untersuchungen wurden 6 Wochen, 4 Monate und 12 Monate nach dem Beginn der Behandlung wiederholt

Vor Therapiebeginn war bei 145 der 200 Patientinnen (72^%) eine ausgeprägte Symptomatik des Trichomonas-Syndroms feststellbar, mit starker Kolpitis, Pruritus, reichlichem grün-gelblichem, übel riechendem Fluor, Dyspareunie, Dysurie usw.; die Kolposkopie zeigte ödem und Rötung des Vaginal- und Portioepithels. Außerdem wurde bei 61 Patientinnen eine Erythropla-Jde der Portio, bei 13 anderen eine chronische Cervicitis

gefunden. Bei den restlichen 55 Patientinnen (27,5%) war die Symptomatik diskreter — leichte Kolpitis.

Die Behandlung erfolgte nach der oben angegebenen Posologie. Bei den leichten Kolpitis-Fällen wurde keine zusätzliche Therapie angewendet; zur Milderung akuter Symptome wurde eine lokale Applikation von Antibiotica und bei schweren Zuständen zusätzlich eine lokale Applikation eines Präparates aus Mikroorganismen von gegen Moniliasis wirksamen Stämmen des Lactobacterium acidophilum vorgenommen. Metronidazol oder ähnliche Nitroimidazolderivate wurden jedoch in keinem Fall gegeben.

Wenn man den Vaginalsekret gemäß Jirovec [W. Ritzerfeld, Der Gynäkologe 2 (1), Seiten 2-6 (1969)] in folgende Klassen einteilt, so läßt sich der Erfolg der Behandlung aus Tabelle 4 deutlich ablesen:

Klasse 1: Bild der gesunden Frau
Klasse U: nicht eitriger bakterieller Ausfluß
Klasse III: eitriger bakterieller Ausfluß
(Klasse IV: Gonorrhoe — davon keine Fälle in der in Untersuchung einbezogen)

Klasse V: Trichomoniasis(positives Nativpräparat)
Klasse VI: Vaginalimykose (Candida albicans)

Tabelle 4	Anzahl	Klasse Il	Klasse III	Klasse V	Klasse Vl
Zeitpunkt der Untersuchung	200	-	-	194 97%	6 3%
Vor Impfungsbeginn	200	139 69,5%	47 23,5%	14 7%	-
2 Wochen nach 3. Injektion	198	164 82%	27 13,5%	9 4,5%	-
3 Monate nach 3. Injektion	198	157 79,3%	32 16,2%	9 4,5%	-
12 Monate nach Impfungsbeginn

Die 9 Patientinnen, bei welchen bei der zweiten Kontrolle, drei Monate nach Abschluß der Impfung, Trichomonas vaginalis noch mikroskopisch nachweisbar war, blieben weiterhin therapierefraktär; auch eine perorale Behandlung mit einem Trichomonazid änderte daran nichts. Außerdem verblieben auch nach 12 Monaten Veränderungen an der Cervix in Form chronischer Cervicitis oder massiver Erythroplakie. Vielleicht sind diese Mißerfolge darauf zurückzuführen, daß diese Frauen trotz korrekter Impfung zu keiner genügenden Antikörperbildung imstande waren.

Von 198 behandelten Patientinnen wiesen nach 12 Monaten 189 (95,5%) ein Vaginalsekret der Klasse II und III auf, d. h. waren in bezug auf ihre Trichomoniasis geheilt. Diese Heilungsrate wurde bei 55 Patientinnen mit leichten Kolpitiden ohne jedwelche Zusatztherapie erreicht Die Patientinnen sind, zum Teil jetzt über 2 Jahre, weiter beobachtet worden; während dieser Zeit sind keine Rückfälle oder Reinfektionen aufgetreten, was auf diesem Gebiet der Medizin ein Novum darstellt und auf die Wiederherstellung eines stabilen trichomonadenfeindlichen Vaginalmilieus hinweisen dürfte.

ίο Schließlich scheint der Impfstoff auch einen positiven Einfluß auf Cervixveränderungen und Läsionen der Portio zu haben. Das Gesamtergebnis erscheint noch auffallender, wenn man bedenkt, daß der größere Teil der Fälle mit verschiedenen chemischen Verbindungen lokal und systemisch bereits behandelt worden war, jedoch nur mit vorübergehendem Erfolg.

Abgesehen von einer gelegentlichen Rötung oder einer leichten Schwellung im Bereich der Injektionsstelle traten bei keiner der Patientinnen während der Behandlung oder unmittelbar danach unerwünschte Nebenwirkungen auf. Es wurden auch keine allergischen oder toxischen Reaktionen festgestellt.

Es soll von der Impfung abgesehen werden, wenn akute febrile Infektionen, Krankheiten des hämatcpoetischen Systems oder schwere Niereninsuffizienz vorliegen.

Eine gleichzeitige Behandlung des Partners ist bei den mit dem Impfstoff behandelten Frauen zwar erwünscht, vom Blickpunkt der Patientin aus ist sie aber nicht

so unbedingt notwendig, da jene durch die Impfung immun wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Hetero-Impfstoff zur therapeutischen Behandlung des Trichomonas-Syndroms, dadurch ge- kennzeichnet, daß er besteht aus inaktivierten Mikroorganismen von Stämmen des Lactobacterium acidophilum, die beim »Centraalbureau voor Schimmelcultures« in Baarn (Niederlande) unter den Bezeichnungen CBS 465 77, CBS 466 77, CBS 467 77, CBS 468 77, CBS 469 77, CBS 470 77, CBS 471 77 und CBS 472 77 hinterlegt sind, in einer physiologisch verträglichen Lösung besteht, wobei die Mikroorganismen aus einem Teil der genannten Stämme oder aus allen genannten Stämmen stammen und in r> annähernd gleicher Anzahl je Stamm vorliegen.

2. Hetero-Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er etwa 14xlO⁹ inaktivierte Mikroorganismen pro ml enthält

3. Verfahren zur Herstellung des Hetero-Impfstof- >ci fes nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß von den in Anspruch 1 genannten Stämmen von Lactobacterium acidophilum ein Teil bis alle jeweils für sich allein auf einem geeigneten flüssigen Nährboden unter aeroben >> Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 6,5 und einer Temperatur von etwa 37° C gezüchtet werden, nach Abschluß der Züchtung das gebildete biologische Material abgetrennt und nach bekannten Methoden inaktiviert wird und die aus den einzelnen u> Stämmen erhaltenen inaktivierten Mikroorganismen in einer physiologisch verträglichen Lösung in Mengen miteinander vermischt werden, die jeweils der nach Abschluß der Züchtung oder nach der Inaktivierung festgestellten Dichte der Kultur r> (Anzahl der Mikroorganismen pro ml Kulturflüssigkeit) umgekehrt proportional sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Inaktivierung des gebildeten biologischen Materials durchgeführt wird durch Behandlung mit Formaldehyd und Phenol, vorzugsweise in einer in bezug auf Formaldehyd 0,3%igen und in bezug auf Phenol 0,5%igen Lösung.