SU997599A3 - Способ получени гетеровакцины дл лечени синдрома трихомонада - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОВАКЦИНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИНДГОМА ТРИХОМОНАДА

1

Изобретение относитс  к медицине.и касаетс  способа получени  Ъетеровакцины дл  лечени  синдрома трихомонада.

Известен способ получени  гетеро вакцины, заключающийс  в том, что на -питательных средах отдельно выращивают культуры микроорганизмов (коклюшные , дифтерийные, столбн чные), затем смешивают в определенных пропорци х убитые коклюшные микроорганизмы и анатоксины изобретени  - получение гетеровакцины дл  лечени  синдрома трихомонада.

Указанна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  гетеровакцины дл  лечени  синдрома трихомонада Lactobacter1um acidophilum штаммы CBS 465,77, CBS 466.77,, CBS 467.77, CBS 468.77, CBS 469.77, CBS 470.77, CBS 471.77. и/или CBS 472.77 порознь выращивают в жидкой питательной среде в аэробных услови х, отдел ют полученную биомассу , инактивируют ее и смешивают 3-8 штаммов микроорганизмов в равных количествах в физиологическом растворе или в объемах, обратно пропорциональных концентраци м микроорганизмов .

При этом выращивание осуществл ют при рН 6,1-6,8 и 32-45 С.

Инактивацию провод т 0,3%-ным раствором формальдегида и 0,5%-ным раствором фенола. . Кроме того, с целью повышени  устойчивости гетеровакцины, после смешени  микроорганизмов добавл ют формальдегид, фенол или натрий-этилртуть тиосалицилат .

Штаммы вз ты в 1976 г. из влагалища женщин, страдак цих синдромом трихомонада .

Штаммы внесены 17.10.77 в лиофи-. , лизированном состо нии в Centreal bu reau voor Sch iramel -cultures (BaopH, Нидерланды ) под обозначением от CBS 465.77 до CBS 472.77 ( восемь отдель ных штаммов),

Все восемь штаммов  вл ютс  грамполржительными , имеют форму цепей или палисада.

Штаммы различны по морфологии и величине образующихс  колоний, отдельные колонии очень малы и имеют форму круга, другие колонии больше и

имеют форму розетки с бороздками на поверхности.

Биохимические свойства штаммов представлены в табл. 1.

Таблица

Штаммл CBS 466.77, 467.77 и 469.77 обладает одинаковыми биохимическими и ферментативными свойствами.55

Штаммы подобраны таким образом, что при применении всех восьми штам .мов получают вакцину, эффективную дл  каждого пациента, с помощью которых независимо от происхождени  ин- 60 фекции успешно вылечивают от синдрома трихомонада.

Дл  культивировани  штаммов примен ют жидкие питательные среды, наи-65

более целесообраз следукэдий состав:

Триптоэо-пептон , г

Гидролизат.

казеина, г .

М сной

экстракт, г

Диализат

дрожже.воЛ, мл ., г

Триаммоний

цитрат, г Ацетат натри , г5 Солевар смесь, мл5 , Твин-80 мл1 Глюкоза, г10 , Лактоза, г10 Дистиллированна  ,вода , мл До 1000 Солева  смесь состоит из, г: МдЗОд 7 ,5 MnSO 2 ,4 FeSO. . 7 HiO0,68 Дистиллированна  вода, мл До 100 рН жидкой питательной среды довод т до 6,1-6,8, предпочтительно 6,5, среду.стерилизуют в актоклаве при 20 мин, затем разливают по колбам Эленмейера, куда внос т об разцы каждого штамма. Культивирование провод т при , .предпочтительно при 48 ч. По истечении этого времени ма риал собирают в стерильных услови х и центрифугируют 1 ч при 3000 д, Осадок, образовавшийс  из биологического материала, перевод т в суспензию, предпочтительно в физио логическом растворе, и затем инакти вируют обработкой формальдегида и фенолом, предпочтительна концент раци  суспензии 0,3% в расчете на формальдегид и 0,5% в расчете на ф нол при длительности обработки 3-5 дн. После йнактивировани  суспензию снова центрифугируют 1 ч при 3000 д чтобы освободить инактивироваНный материал от избытка формальдегида и фенола. Материал, полученный от каждого отдельного штамма, снова перевод т в суспензию, предпочтительно в физиологическом растворе, и провод испытание на стерильность и .на наличие жизнеспособных лактобактерий При отрицательных результатах этих испытаний определ ют плотность кул туры дл . каждого штамма или число микроорганизмов на 1 мл культураль ной жидкости. При .невозможности смешивани  от дельных суспензий непосредственно после инактивации их хран т при 4 либо каждый штамм лиофилизируют и этом состо нии хран т при 4°С не менее 3-х лет. В качестве защитног коллоида дл  лиофилизации пригодна среда, состо ща ,из, %: желатин 5, сахароза 37,5 и лактобионат кальци 0,5. Лиофилизацию провод т 24 ч. Инактивированный материал из от . дельных штаммов смешивают в равных количествах. Полученную вакцину ра бавл ют физиологическим раствором так, что она содержит в 1 мл 14-10 микроорганизмов. Общее содержание азота в вакцине составл ет 3,68% сухого вещества. Дл  повьаиени  устойчивости к вакцине добавл ют консервирующее средство, например формашьдегид или ф.енол, в концентрации 0,25% или этил-ртутьтиосалицилат натри  и оставл ют вакцину при 30 дн, прежде чем заполнить ею ампулы емкостью 0,5 мл. Заполнение апирогенных ампул производ т в стерильных услови х, ампулы лиофилизируют и хран т при 4°С. При 2-8с вакцина сохран етс  три года, при 20°С - 6 мес. Вакцину испытывсиэт на стерильность, токсичность, антигенное действие и наличие жизнеспособных лактобактерий.. Дл  испытани  на стерильность по 1 мл вакцины помещают в пробирки с тиогликолевой питательной средой и с бульоном -Сабуро ,, пробирки инкубируют 10 дн при З7с и соответствукнций р д обработанных пробирок инку-. бируют в течение того же времени при . Все пробирки в р дах .оказались стерильными. Испытание на токсичность производ т на морских свинках и белых мышах. П ти морским свинкам со средним живым весом 300 г внутриьйлшечно ввод т по 5 мл вакцины С по 2,5 мл в каждую заднюю конечность). После наблюдени  в.течение 14 дн все животные остались , здоровы,в обработанных конечност х не Обнаружено никаких реакций .Вакцину в, дозе 0,5 мл ввод т-также в заднюю конечность дес ти белым мышам со средним живым 20 г. После йаблю ени  в течение 14 дн все оказа-/ лись здоровыми. Испытание на антигенное действие провод т сначала на трех морских свинках, которым через 14 дн ввод т внутрисердечно по 5 мл вакцины, . при этом никакой анафилактической реакции не наблюдаетс . Затем вакциг ну испытывают in vitro в реакции нм мунодиффузии по Оухтерлони с нормальной человеческой сывороткой, при этом положительна  реакци  отсутствует .; Дл  испытани  на наличие жизнеспособных лактобактерий пробы вакцины культивируют на плотной питательной среде следующего состава: Вода, мл800 Трипказеин, г 16 Раствор 1, мл50 Раство.р 2, мл10 Раствор 3, МП10 Раствор 4, мл10 Свежиедрожжи, г 10 Пептон серебр ный, г 10 . Крахмал растворимый 0,5%-гный, г 5 Вода, мл До 1000 Раствор 1 состоит из 10%-ного раствора NaCI , раствор 2 состоит из 2%-ного раствора КС1 и 5%-ного раст вора , раствор 3 состоит из 2%-ного раствори 1 -ного раствора MgCl и раствор 4 состоит из 2,5%-ного раствора Kj HPOjj.. К полученным растворам добавл ют 25 г агар-агара, довод т рН до знач ни  5,5-6,7, предпочтительно б, и стерилизуют 20 мин в автоклаве при . Затем добавл ют 100 мл водно раствора, содержащего 3 г мальтозы, 10 г глюкозы и 10 г лактозы, после чего добавл ют 30 мл 1%-ного раство ра цистеингидрохлорида, причем каждый из этих растворов предварительно стерилизуют через стекл нный фильтр GjВ последнюю очередь в среду внос т 10% дефибринированной человечес кой крови. Питательную среду засевают пробами вакцины и посевы инкубируют при . В качестве контрол среду засевают Lactobacterгцт асГЬорНИит ,и культивирование осущест вл ют при тех же услови х. В вакцине не обнаружено ни одног жизнеспособного микроорганизма. Tie. она  вл етс  убитой, при этом она оказывает действие против инфекций , вызываемых микроорганизмами вида Тг i chomonas vaginal is, т.е. от носит.с  к классу гетеровакцин. Вакцина вызывает образование спе цифических антител против Lactobacter I urn acidophilum, в частности про тив полиморфных форм, ответственных Эа патологические изменени  величины рН влагалища при трихомонадном синдроме. Иммунизирующее действие вакцины доказано на следующих опытах с животными и клинических испытани х. Двум кроликам с живым весом 2950 г и 3200 г делают внутривенное вливание с интервалом в 2 нед. Через

16

1:10

1:10

1:20

О 3 мес ц после второго вливани  берут кровь и выдел ют сыворотку. В случае образовани  антител дают сыворотке агглютинироватьс  в разведении 1:50 лактобактери ми тех штаммов, из которых готовитс  вакцина , при этом сыворотка в исследуемом разведении имеет положительный tHT.p агглютинина.. У обоих кроликов титр агглютинина перед вливанием был отрицательный при разведении 1:10, через мес ц после второго вливани  титр стал положительным при разведении 1:160 или 1:180. Вакцина позвол ет проводить лечебную и профилактическую обработку синдрома трихомонада ( острого, хронического и асимптоматического). Дл  лечебных .и профилактических делей рекомендуетс  дозировка О,5 мл (7 -ID микроорганизмов) внутримышечно , три раза с интервалом в две недели с побледующим введением той же дозы инъекцией Раннел  через год после начала.лечени . Клинические исследовани  провод т на 97 пациентках, которые подвергаютс  серологическим исследовани м. У пациенток согласно временному графику отбирают кровь и полученную сыворотку КР0ВИ испытывают на присутствие лактобактериальных антител. Дл  этого сыворотку в возрастающем разведении Сот 1:10 до 1:1280) обрабатывают вакциной из соответствующих антигенов или агглютининов и наблюдают происход щую агглютинацию. В качестве агглютининов используют свежеприготовленную суспензию инактивированных микроорганизмов LactobacteriUrn acfdophilum тех же штаммов в том же весовом соотношении и,,,э той же концентрации (14-10 микроорганизмов на 1 мл, что и сама вакцина. По вление в сыворотке агглютинина и нарастание его титров показано в табл. 2. Таблица 2 Учитыва  повышение титра агглюти- 40 иина в период между первым и вторым Повышение титра 2Х Число пациенток 13 Дол  пациенток от об13 ,4 21,6 щего, % 13,4

Приме Р 200 женщин в возрасте 15-59 лет, страдающих синдромом трихомонада, амбулаторно лечились вакциной, изготовленной- из 8 штаммов. Контроль осуществл ло на прот жении 2-х лет. 138 пациенток (69% от общего кс личества) прежде безуспешно лечились метронидазолом. Перед начапом лечени  нар ду с исследованием

:Продолжение табл. 2

крови и мочи .проводилось гинекологическое исследование, включа  колпоскопию и исследование по Pap-Smear,

параллельно были вз ты мазки из влагалища , вульвы, шейки матки иурехры дл  приготовлени  нативных препаратов и препаратов, окрашенных по . Граму и Гимзу. Культура была нанесена на Trichomonas vagi nails. Исслёзабором крови, пациенток можно распределить , как указано в табл. 3. ТаблицаЗ 64Х и более 7 10,3 6,2

довани  были повторно проведены через б нед, 4 и 12 мес- после начала лечени ..

Перед началом лечени  у 145 пациенток 172,5%) была установлена выраженна  симптоматика синдрома трихомонада с сильным кольпитом, зудом обильными зелено-желтоватыми дурно пахнущими беЛ ми, диспареунией и дизигией, при колпоскопии вы влены отек и эритема эпители  и влагалищной части шейки матки и влагалища. Кроме того, у 61 пациентки была установлена эритроплаки  влагалищной части шейки матки, у 13 - хронический цервицит. У остальных 55 пациен ток С 27/5%) обнаружен только легкий кольпит.

Лечение проводилось согласно приведенной дозировке. В случа х легПеред началом

200 вакцинации

139

200 ( 69,5%)

164

198 С82%

157

198 ( 79,3%.;

Дев ть пациенток, у которых при втором контроле (через три мес ца после вакцинации) микроскопически еще определ лась Trichomonas vaginal is, остались невосприимчивыми далее к лечению, пероральное ввёдение трихомонацида также ничего не изменило.

Через 12 мес также остались изменени  шейки матки в форме хронического цервицита или значительной эритроплакйи , что объ сн етс  тем, что эти

iKoro кольпита дополнительна  терапи не примен лась/при острых симптомах : назначали антибиотики, а при т желых состо ни х - дополнительно локальное применение препарата из штаммов Lactobacterturn acldophllum, эффективного против MonIIt a s i s. Метронидазол или подобные ему нитроимидазольные производные не назначали ни в одном случае. Если выделени  из влагалища классифицировать по ifirovec, то успешность лечени  можно проследить ио табл. 4, где класс I означает отсутствие заболевани , класс II -, нёгнойные бактериальные бели, класс III - гнойные бактериальные бели, клас.с 1У - гоноре  (исследованию такие случаи не подвергались;, класс V - трихомонад (положительный нативный препарат), класс VI - микоз влагалища (Candida alb Jeans).

; Таблица 4

6

194 C3%j

(97%;

14

47 .

(7%; ( 23,5%;

27

(4,5%; ( 13,5%)

9

32 (16,2%У

(4,5%;

Claims (4)

1. йсенщины способны к образованию антйтел . 198 (95,5% пациенток, подвергшихс  лечению, через 12 мес были вылечены от трихомоноэа(до лечени  у них выдел лись вагинальные бели по классу II и III). Тот же результат был получен у 55 пациенток с легкими кольпитами без дополнительной терапии. Пациентки через два года снова подвергались наблюдению, за это врем  не вы вилось ни одного случа  реинфекции. Во врем  лечени  и после него не было установлено никаких аллергии ческих и .токсических-реакций, однако следует воздержатьс  от вакцинации 3 случае острых лихорадочных .инфекций, болезней систеьш гематопоэза или т желой почечной недостаточности . Формула изобретени  1. Способ получени  гетеровакцины дл  лечени  синдрома трихрмонада 3 а к л ю ч а ю щ и и с   FTOM,, что Lactobacterlura acldophllum штам мы CBS 465.77, CBS 466.77, CBS467.7 CBS 468.77, CBS 469.77, CBS 470.77/ CBS 471.77 и/или CBS 472.77 порознь выращивают IB скидкой питательной сре да ri.-аэробных услови х, отдел ют полученную биомассу, илактцвируют ее и смешивают 3-8 штаммов микроор|ганизмов в равных количествах в ,физиологическом растворе или в объемах, обратно пропорциональных концентраци м микроорганизмов.
2. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю д и и с   тем, что выращивание осуществл ют при рН 6,1-6,8 и 3245 С .
3. 3.Способ по п. 1, о т л и ч a-s ю щ и и с   тем, что инактивацию провод т 0,3%-ным раствором формаль дегида и 0 5%-ным раствором фенола.
4. 4.Способ по п. 1, о т л и ч аю щи и с   тем, что, с целью повы шени  устойчивости гетеровакцины, после смешивани  микроорганизмов . добавл ют формальдегид, фенол или натрий-этилртутьтиосалицйлат. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. МРТУ-42 263-68 на АКДС вакину .