NO149316B - Fremgangsmaate til fremstilling av en heterovaksine til terapeutisk behandling av trichomonas-syndromet - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av en heterovaksine til terapeutisk behandling av Trichomonas-syndromet.

Slekten Trichomonas vaginalis hører til protozoene og etter systematisk inndeling av protozoene av betydning i humanmedisinen til klassen Mastigophora eller Flagellata. Det er en prinsipiell patogen parasitt som finnes i den kvinnelige og mannlige urogenitalkanalen. Overføringen foregår hovedsakelig ved kohabitasjon, men det kan også påvises infeksjoner ved hjelp av gjenstander.

Ennskjønt menn er utsatt for infeksjon like så hyppig som damer, har de kliniske symptomer vesentlig sjeld-nere, størstedelen av Trichomona-bærere er uten ubehag og en lett sekresjon - symptom for en uretritis - iakttas over-hodet ikke.

For damer ligger den praktiske betydning av infeksjonen i første rekke i forstyrrelse av genitalorganene ved massiv matriøs betennelse av skjeden med dens ofte avgjørende følger for et normalt ekteskap. Infeksjonen forblir vanlig-vis ikke begrenset til skjeden, for det meste medslepes en medfølgende patogen blandingsflora i den øvre genitalkanal ved Trichomonader og fører til betennelser i livmorvedheng (Adnexitis), hvormed inngår faren for en tubargraviditet eller en lukning av egglederen (sterilitet). Såvel den kro-niske infeksjon som også de tilbakevendende tilbakefall bevirker en betraktelig betennelse av Porio vaginalis uteri og Cervix, en følge herav er lokale vevsendringer som strekker seg fra tilbakedannelsesdyktig dysplasi til forstadier av livmorhalskarsinomet. Det mangfoldige kliniske bilde be-tegnes samlet Trichomonas-syndromet.

Ennskjønt preparatet "Metronidazol" [1-(2-hydroksy-etyl)-2-metyl-5-nitroimidazol] er godt egnet til utryddelse av Trichomonas vaginalis og er blitt innført ved denne indi-kasjon i terapien, viser antall sykdommer allikevel ingen nedgang, men heller en økende tendens, alt etter land skal mellom 3,5 og 88% av befolkningen være angrepet av infeksjonen således at man her allerede kan tale om en folkesykdom. .Utbredelsen av infeksjonen og den alltid tilbakevendende iakttatte reinfeksjon befordres kraftig ved den økende promiskuitet. Dessuten begunstiges infeksjonens hard-nakkedhet og en viss terapiresistens ved den stadig utbredte permanente bruk av ovulasjonshemmende steroider, da som be-kjent alle hypovarielle tilstander, dvs. en relativ mangel på kroppsegne ovarielle hormoner, hemmer epitelprolifera-sjonen i skjeden.

Det ble nu funnet at blant det flertall av natur-lig forekommende stammer (for tiden er det kjent ca. 4.000 forskjellige stammer) av Lactobacterium acidophilum, også kalt Lactobacillus acidophilus, melkesyrebakterier, laktobakterier, melkesyrelangstaver, Døderleins staver eller Døderleins bakterier, foreligger noen hvorfra det kan frem-stilles en verdifull heterovaksine til behandling av Trichomonas-syndromet .

De enkelte stammer er 1976 uttatt fra vagina fra damer som lider av dette syndrom. Stammene er 17. oktober 1977 deponert i lyofilisert tilstand ved "Centraalbureau voor Schimmelcultures" i Baarn (Holland) under betegnelsen CBS 465.77 til CBS 472.77 (åtte enkelte stammer).

I morfologisk henseende adskiller de forskjellige stammer seg bl.a. ved størrelse av dannede kolonier: mange kolonier er meget små, gjennomsiktige og sirkelformet, andre kolonier er større og har form av en rosett hvis overflate er istykkerrevet. Mikroskopisk sett hører alle åtte bakterie-stammer til de grampositive, polymorfe basiller som forekom-mer i form av kjeder eller palisader.

Disse stammers biokjemiske forhold kan karakteri-seres som følger ved hjelp av deres vekst på forskjellige karbonkilder:

Stammene CBS 466.77, ASI. 11 og 469.77 viser de

samme biokjemiske resp. fermentative egenskaper.

Heterovaksine fremstilt ifølge oppfinnelsen består altså av inaktiverte mikroorganismer av stammer av Lactobacterium acidophilum som er nevnt ovenfor i en fysiologisk tålbar oppløsning idet mikroorganismene stammer fra en del av disse stammer eller fra alle disse stammer og foreligger i tilnærmet samme antall pr. stamme. Det skal fore-ligge mikroorganismer av minst tre stammer i vaksinen.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av en heterovaksine til terapeutisk behandling av Trichomonas-syndromet er karakterisert ved at minst tre av de følgende stammer av Lactobacterium acidophilum, som er deponert ved "Centraalbureau voor Schimmelcultures" i Baarn (Holland) under betegnelsene CBS 465.77, CBS 466.77, CBS 467.77, CBS 468.77, CBS 469.77, CBS 470.77, CBS 471.77 og CBS 472.77, dyrkes hver for seg i et flytende næringsmedium under aerobe betingelser, etter avslutning av dyrkingen fraskilles det dannede biologiske materiale og inaktiveres etter kjente metoder, hvoretter de fra de enkelte stammer dannede og inaktiverte mikroorganismer blandes med hverandre i like store mengder i en fysiologisk tålbar oppløsning eller de enkelte, inaktiverte kulturer blandes med hverandre i volum-mengder som er omvendt proporsjonale med en etter avslutning av dyrkingen eller etter inaktivering fastslått tetthet av kulturene (antall mikroorganismer pr. ml kulturvæske).

De nevnte stammer er valgt således at ved gjennom-føring av fremgangsmåten under anvendelse av alle åtte fås en generelt virksom vaksine. Herunder forstår man en vaksine som praktisk talt er virksom hos enhver kvinnelig pasi-ent, resp. hvorved det med resultat uaktet infeksjonens opp-rinnelse kan behandles Trichomonas-syndromet. Derfor er vaksinen hvori det foreligger inaktiverte mikroorganismer av de åtte nevnte stammer foretrukket, og fremstillingen av vaksinen under anvendelse av de åtte nevnte stammer er den foretrukne utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. For dyrking av stammene kan det anvendes forskjellige i mikrobiologien vanlige flytende næringsgrunnlag. Som spesielt hensiktsmessig har det vist seg næringsmedium av følgende sammensetning:

Ovennevnte saltblanding består av:

Det flytende medium innstilles til en pH-verdi på 6,1 - 6,8, fortrinnsvis 6,5, og steriliseres i løpet av 20 minutter i autoklav ved en temperatur på 115°C.

Næringsmediet fordeles i steriliserte kar, f.eks. Erlenmeyerkolber, og innholdet av hvert kar podes med en

prøve av en enkeltstamme. Dyrkingen gjennomføres hensiktsmessig ved en temperatur på 32 - 4 5°C, fortrinnsvis ved ca. 37°C, f.eks. i 48 timer. Etter dette tidsrom eller når det har dannet seg en for den tilsiktede vaksineproduksjon tilstrekkelig mengde biologisk materiale, samles dette under

sterile betingelser og fris ved sentrifugering for vedheng-ende næringsmedium, f.eks. kan man sentrifugere i løpet av 1 time ved 3000 omdr./min.

Det av det biologiske materiale bestående bunnfall bringes deretter igjen i suspensjon, fortrinnsvis i fysiologisk koksaltoppløsning og inaktiveres derpå etter kjent metode. Til inaktivering egner det seg helt spesielt en behandling med formaldehyd og fenol, fordelaktig viser det seg en konsentrasjon av suspensjonen på 0,3% med hensyn til formaldehyd og på 0,5% med hensyn til fenol og en behandlings-varighet fra 3-5 dager. Etter inaktiveringen sentrifuger-es igjen suspensjonen f.eks. i 1 time ved 3000 omdr./min. for å befri det inaktiverte materialet for det til inaktivering anvendte middel, f.eks. overskudd av formaldehyd og fenol.

Det av hver enkelt stamme dannede materiale bringes igjen i suspensjon, fortrinnsvis i fysiologisk koksaltopp-løsning, og underkastes en undersøkelse på sterilitet samt en undersøkelse på nærvær av ennå levedyktige laktobakterier etter de nedenfor nærmere omtalte metoder. Når begge under-søkelser er negative, dvs. når materialet egner seg til fremstilling av vaksinen, bestemmes den ved hver stamme oppnådde tetthet av kulturen resp. antall mikroorganismer pr. ml kulturvæske.

Er det av en eller annen grunn ikke mulig å fore-ta sammenblanding av de enkelte biologiske materialer umiddelbart etter inaktiveringen, bør de tilsvarende suspensjoner i mellomtiden oppbevares ved en temperatur på 4°C. Man kan også lyofilisere de inaktiverte mikroorganismer av enhver stamme og oppbevare i denne tilstand ved 4°C. De lyofili-serte stammer kan uforandret lagres ved denne temperatur over et tidsrom på minst 3 år. Som beskyttelseskolloid for lyo-filiseringen egner det seg spesielt et medium av 5,6% gela-tin, 37,5% sakkarose og 0,5% kalsiumlaktobionat, hensiktsmessig lyofiliseres i løpet av 24 timer.

Endelig blir det fra de enkelte stammer hver gang dannede og inaktiverte materiale sammenblandet i slik mengde at det herav oppstår en med hensyn til antall mikroorganismer fra hver enkelt stamme pr. ml tilnærmet likeverdig vaksine. Den dannede vaksine fortynnes fordelaktig ved hjelp av fysiologisk koksaltoppløsning såvidt at den pr. ml inneholder ca.

9

14 x 10 mikroorganismer.

Vaksinen har et samlet nitrogeninnhold på 3,68 mg% av tørrstoffet (bestemmelse ifølge Kjeldahl). Det har vist seg hensiktsmessig å tilsette et konserveringsmiddel, eksem-pelvis formaldehyd eller fenol (konsentrasjon av formaldehyd resp. fenol f.eks. 0,25%) eller natriumetylmerkuritiosali-cylat ("Thiomersal") og å la vaksinen modne i løpet av ca. 30 dager ved en temperatur på 4°C før den fylles i ampuller. Fortrinnsvis inneholder en ampulle 0,5 ml av den omtalte vaksine. Selvsagt skal også disse siste forholdsregler gjen-nomføres under sterile betingelser og i pyrogenfritt glass-materiale.

Ampulleinnholdet kan også lyofiliseres og inntil an-vendelsestidspunktet lagres i form av en tørrampulle, fortrinnsvis ved ca. 4°C. Vaksinens holdbarhet, om den er i form av vanlige ampuller eller som tørrampuller utgjør minst 3 år fra fremstillingen når de oppbevares ved en temperatur fra 2 - 8°C (normal kjøleskapstemperatur); ved oppbevaring ved ca. 20°C er vaksinen holdbar ca. 6 måneder. Det skal dessuten nevnes at et tidsrom på 3 år er den av Verdens Helseorganisasjon for en inaktivert vaksine (dødpodnings-stoff) maksimalt tillatte anvendeIsesvarighet.

På vaksinen skal det, før den frigjøres for tera-peutiske anvendelser, gjennomføres følgende undersøkelser:

1. Undersøkelse på sterilitet (1. sterilitetsprøve)

2. Undersøkelse på toksisitet,

3. Undersøkelse på antigenvirkning, ■

4. Undersøkelse på nærvær av levedyktige laktobakterier

(2. sterilitetsprøve).

Derved går man fortrinnsvis frem etter forskriftene fra Verdens Helseorganisasjon (Erfordernisse fur biologische Substanzen, Technische Berichte der WGO nr. 323, 1966) og den europeiske Pharmakopoe II, 1971.

For undersøkelse av sterilitet ble hver gang 1 ml vaksine hatt i reagensglass med tioglykolat-næringsmedium og i slike med Saborauds buljong, reagensglassene ble deretter inkubert i 10 dager ved en temperatur på 37°C og en tilsvarende rekke av på samme måte behandlede reagensglass ble inkubert i samme tidsrom ved en temperatur på 2 5°C. Det viste seg at samtlige reagensglass i begge rekker var blitt sterile.

En undersøkelse på toksisitet foregikk på marsvin og hvite mus. Det ble på 5 marsvin med en gjennomsnittlig legemsvekt på 300 g hver gang administrert 5 ml vaksine

(dvs. 10 ganger mer enn den for mennesker foreskrevne enkelt-dose) intramuskulært - 2,5 ml i hvert bakben. Etter en iakttagelsestid på 14 dager var de 5 dyr fortsatt friske, heller ikke i de behandlede ben ble det fastslått noen reaksjon. På den annen side ble det på 10 hvite mus med en gjennomsnittlig legemsvekt på 20 g hver gang administrert 0,5 ml vaksine intramuskulært i et bakben, etter en iakttagelsestid på 14 dager var de 10 musene fortsatt friske.

Undersøkelser på antigenvirkning foregikk først in vivo pa marsvin. Av de i ovennevnte avsnitt nevnte dyr ble 3 etter 14 dager behandlet med hver gang 1 ml vaksine intra-kardialt, tross den forholdsvis høye dose ble det ikke iakttatt noen anafylaktisk reaksjon. Deretter ble vaksinen også undersøkt in vitro etter immunodiffusjonsmetoden av Ouchter-lony overfor prøver av normalt menneskelig serum, det ble ikke fastslått noen positiv reaksjon.

For undersøkelse på nærvær av ennå levedyktige laktobakterier ble prøver fra vaksinen dyrket på et for isoler-ing og identifisering av denne mikroorganisme egnet fast næringsmedium. Det egnet seg derfor et næringsmedium av føl-gende sammensetning:

Oppløselig stivelse, 0,5%

(i oppløst tilstand) 5 g Vann inntil 1000 ml

De ovennevnte, hver gang vandige oppløsninger, består av:

Oppløsning 1: 10% NaCl-oppløsning

Oppløsning 2: 2% KC1- og 5% Na2C03-oppløsning Oppløsning 3: 2% CaC^- og 1% MgCl2~oppløsning Oppløsning 4: 2,5% J^HPO^-oppløsning.

Den dannede sluttoppløsning tilsettes 25 g agar-agar, pH-verdien innstilles på 5,5 - 6,7, fortrinnsvis på

ca. 6,0, og mediet steriliseres i 20 minutter i autoklav ved en temperatur på 115°C. Derpå tilsettes en oppløsning av 3 g maltose, 10 g glukose og 10 g laktose i 100 ml vann og deretter 30 ml av en 1% cysteinhydrokloridoppløsning, hver av disse oppløsninger steriliseres på forhånd ved sterilfil-trering, f.eks. gjennom et glassfilter G^. Endelig tilsettes til dette medium dessuten 10% av defibrinert menneskelig blod. Det således fremstilte blodagarnæringsmedium podes med prøver av vaksinen og dyrkes ved en temperatur på 3 7°C. For kontroll innpodes prøver av Lactobacterium acidophilum under samme betingelser og dyrkes.

Det kunne derved i vaksinen ikke påvises levende mikroorganismer, hvilket viser den fullstendige inaktivering ved den foretrukne formaldehyd og fenol anvendte metode. Vaksinen ifølge oppfinnelsen er altså et såkalt dødpodnings-stoff. Da den på den annen side utfolder sin virkning mot en infeksjon og deres følgeforeteelser som forårsakes ved en artsfremmed mikroorganisme - Trichomonas vaginalis - hører den til klassen av heterovaksiner.

Vaksinen bevirker bl.a. dannelse av spesifikke antistoffer mot Lactobacterium acidophilum, spesielt mot dens abnorme og polymorfe former som er medansvarlige for den patologiske endring av pH-verdien i skjeden ved Trichomonas-syndromet. Denne immuniserende virkning lar seg såvel bevise i dyreforsøk som også ved klinisk undersøkelse på følgende måte.

I dyreforsøk ble det anvendt to kaniner med en legemsvekt på 2950 resp. 3200 g og podet i en avstand på 2 uker to ganger med hver gang 0,5 ml vaksine intravenøst. 1 måned etter annen behandling ble det fra dyrene tatt blod-prøver og herav fremstilt serum. Når det har dannet seg antistoffer, så skal serumet i en fortynning på minst 1:50 spesifikt la laktobakteriene av den stamme agglutinere hvor-av vaksinen ble fremstilt. Serumet har da i den undersøkte fortynning en positiv titer av agglutininer. Ved første resp. annen kanin var agglutinintiteren før podning negativ ved en serumfortynnelse på hver gang 1:10, en måned etter annen behandling var den positiv ved en fortynning på 1:160, resp. 1:80.

Den nye vaksine muliggjør en kurativ og profylaktisk behandling av Trichomonas-syndromet og den akutte, kron-iske og asymptomatiske trichomoniasis. Enten kurativ eller profylaktisk anbefales følgende posologi: Administrering av en dose på 0,5 ml (dvs. ca. 7 x 10 n mikroorganismer) intramuskulært 3 ganger med en avstand på hver gang 2 uker, fulgt av en rappelinjeksjon i samme dose (0,5 ml) ett år etter behandlingens begynnelse.

Tilsvarende den angitte posologi er det gjort kliniske undersøkelser og derved gjennomført fra 97 kvinnelige pasienter serologiske undersøkelser. Av de kvinnelige pasienter ble det etter en fastlagt tidsplan uttatt blodprøver og det fremstilte blodserum undersøkt på nærvær av laktobak-terie-antis i 21'i" er. Dertil ble serumet behandlet i geometrisk økende fortynning (fra 1:10 til 1:1280) med en vaksine av tilsvarende antigener eller av agglutinogener og iakttatt den eventuelt foregåtte agglutinasjon. Som agglutinogen anvendte man nyfremstilt, dvs. mindre enn 3 måneder gammel suspensjon av inaktiverte mikroorganismer av' Lactobacterium acidophilum av samme stamme, i samme mengdeforhold og i samme konsentrasjon (14 x 10 9 mikroorganismer pr. ml) som selve vaksinen,

til inaktivering benyttet man fenol i en konsentrasjon på 0,25% av suspensjonen. Opptreden og tidsmessig utvikling av agglutinene i serum som følge av podningen fremgår av verdiene

av titeren i følgende tabell.

Av den ovennevnte geometriske middelverdi av titeren lar det seg f.eks. 2 uker etter avslutning av podningen beregne en økning av titeren med en faktor på (gjennomsnittlig) 6,3. Ett år etter begynnelsen av podningen, dvs. til det tidspunkt for gjenoppfriskningsinjeksjon (rappelinjeksjon) er agglutinintiteren ennå 2,5 ganger høyere enn tidligere, hvorved delvis kan forklares det langvarige resultat av podningen .

Tar man hensyn til økningen av titeren under det til podningen umiddelbart følgende tidsrom, dvs. tiden mellom første og annen blodprøve, så fordeler den seg på de kvinnelige pasienter som følger:

Av behandlingsresultatet formår følgende sammenfat-tende kliniske beretning å gi et bilde. 200 damer i alderen fra 15 til 59 år som led av Trichomonas-syndromet er blitt behandlet ambulant med vaksinen (fremstilt av de åtte nevnte stammer). Kontrollene strekKer seg over et tidsrom på delvis mer enn 2 år (2 kvinnelige pasienter er ikke mer kommet til kontroll). 138 kvinnelige pasienter, dvs. 6<y>% av totalet, var på forhand gjentatt behandlet med orale eller vaginale preparater, spesielt "Metronidazoi", imidlertid uten lang-tidsresuitat pga. ny infeksjon. Før benandlingsbegynnelsen ble det hver gang vea siden av blod- og urinundersøkelser gjennomtørt en gynekologisk undersøkelse inklusive kolposkopi og pap-smear, parallelt dertil ble det foretatt avstryk av vulva, skjeden, cervix og urethra og nerav fremstilt et nativpreparat samt også et ifølge Gram og et ifølge Giemsa farget preparat og anlagt en kultur på Trichomonas vaginalis. Alle disse undersøkelser ble gjentatt 6 uker, 4 måneder og 12 måneder etter behandlingens begynnelse.

Før terapibegynnelsen var ved 145 av 200 kvinnelige pasienter (72,5%) å fastslå en utpreget symptomatikk av Trichomonas-syndromet med sterk kolpitis, pruritus, rikelig grønngul, vondtluktende fluor, dyspareuni, dysuri osv. Kolkoskopi viste ødem og røddannelse av vaginal- og portio-epitelet. Dessuten ble det ved 61 kvinnelige pasienter funnet en erytroplaki av portio, ved 13 andre en kronisk cerivi-citis. Ved de resterende 55 pasienter (27,5%) var symptom-ene mere diskret - lett kolpitis.

Behandlingen foregikk etter den ovenfor angitte posologi. Ved de lette kolpitistilfeller ble det ikke i tillegg anvendt terapi. Til å mildne akutte symptomer ble det foretatt en lokal applikasjon av antibiotika og ved tyngre tilstander i tillegg en lokal applikasjon av et preparat av mikroorganismer av overfor Moniliasis virksomme stammer av Lactobacterium acidophilum. "Metronidazol" eller lignende nitroimidazolderivater ble ikke gitt i noen tilfeller.

Man inndeler vaginalsekretet ifølge Jirovec

(W. Ritzerfeld, Der Gynakologe 2, 1, side 2-6, 1969) i følgende klasser, og så lar resultatet av behandlingen seg tydelig avlese av tabell 4:

Klasse I : Bilde for friske damer

Klasse II : ikke-materielignende bakteriell utflod

Klasse III : materielignende bakteriell utflod

Klasse IV : Gonorrhoe - herav ingen tilfeller innbefattet

i undersøkelsen

Klasse V : Trichomoniasis (positivt nativpreparat)

Klasse VI : Vaginalimykose (Candida albicans).

De 9 kvinnelige pasienter hvor ved annen kontroll 3 måneder etter avslutning av podningen ennå mikroskopisk var påvisbar Trichomonas vaginalis forble videre terapi-refraktær; heller ikke peroral behandling med en trichomon-azid hindret dette. Dessuten forble også etter 12 måneder i cervix forandringer i form av kronisk cervicitis eller massiv erytroplaki. Muligens er disse resultater å tilbake-føre på at disse damer på tross av korrekt podning ikke var istand til noen tilstrekkelig antilegemedannelse.

Av 198 behandlede kvinnelige pasienter viser etter 12 måneder 189 (95,5%) et vaginal sekret av klasse II og III, dvs. de var helbredet med hensyn til deres trichomoniasis. Denne helbredelsesgrad ble oppnådd ved 55 kvinnelige pasienter med lette kolpitider uten noen tilleggsterapi. De kvinnelige pasienter er delvis nu blitt videre iakttatt over 2 år, i løpet av denne tid er det ikke opptrådd noen tilbakefall eller reinfeksjoner, hvilket på dette område av medi-sinen danner et novum og skulle henvise til gjenopprettelse av et stabilt trichomonade-fiendtlig vaginalmiljø. Endelig synes vaksinen også å ha en positiv påvirkning på cervix-endringer og lesjoner av portio. Det samlede resultat synes desto mere påfallende når man tar i betraktning at en større del av tilfellene allerede var blitt behandlet med forskjellige kjemiske forbindelser lokalt og systemisk, imidlertid bare med forbigående resultat.

Bortsett fra en tilfeldig røddannelse eller en lettere svelling i området for injeksjonsstedet opptrådte det ikke ved noen av de kvinnelige pasienter under behandlingen eller umiddelbart deretter uønskede bivirkninger. Det ble heller ikke fastslått allergiske eller toksiske reaksjon-er .

Det skal ses bort fra podning eller vaksinering når det foreligger akutte febrile infeksjoner, sykdommer av det hematopoetiske system eller større nyreinsuffisiens.

En samtidig behandling av partneren er riktignok ønskelig ved damene behandlet med vaksinen, sett fra en kvinnelig pasients synspunkt, men er imidlertid ikke ube-tinget nødvendig da enhver immuniseres ved vaksineringen.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en heterovaksine til terapeutisk behandling av Trichomonas-syndromet, karakterisert ved at minst tre av de følgen-de stammer av Lactobacterium acidophilum, som er deponert ved "Centraalbureau voor Schimmelcultures" i Baarn (Holland) under betegnelsene CBS 465.77, CBS 466.77, CBS 467.77, CBS 468.77, CBS 469.77, CBS 470.77, CBS 471.77 og CBS 472.77, dyrkes hver for seg i et flytende næringsmedium under aerobe betingelser, etter avslutning av dyrkingen fraskilles det dannede biologiske materiale og inaktiveres etter kjente metoder, hvoretter de fra de enkelte stammer dannede og inaktiverte mikroorganismer blandes med hverandre i like store mengder i en fysiologisk tålbar oppløsning eller de enkelte, inaktiverte kulturer blandes med hverandre i volum-mengder som er omvendt proporsjonale med en etter avslutning av dyrkingen eller etter inaktivering fastslått tetthet av kulturene (antall mikroorganismer pr. ml kulturvæske).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes alle åtte nevnte stammer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at dyrkingen gjennomføres ved en pH-verdi på 6,1 - 6,8 og ved en temperatur på 32 - 4 5°C.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at inaktiveringen av det dannede biologiske materiale gjennomføres ved behandling med formaldehyd og fenol, fortrinnsvis i en med hensyn til formaldehyd 0,3% og med hensyn til fenol 0,5% oppløsning.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at man tilsetter de inaktiverte mikroorganismer i den fysiologisk tålbare oppløsning i en slik mengde eller fortynner den dannede vaksine med den fysiologisk tålbare oppløsning slik at der pr. ml foreligger ca. 9

14 x 10 inaktiverte mikroorganismer.