DE2626350C2

DE2626350C2 - Impfstoff

Info

Publication number: DE2626350C2
Application number: DE2626350A
Authority: DE
Inventors: Stephen Howell Manton Heights Bedford Parry; Philip Bedford Porter
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1975-06-12
Filing date: 1976-06-11
Publication date: 1984-09-13
Also published as: FR2313942A1; JPS51151322A; IT1078623B; NL7606379A; DE2626350A1; ZA763370B; FR2313942B1; BE842814A; DK263076A; AU513801B2; GB1553664A; AU1470576A; IE43381L; DK146312C; ES448827A1; IE43381B1; CA1061252A; DK146312B

Description

Die Erfindung betrifft einen parenteral applizierbaren Impfstoff für das Mutterschwein zur Verminderung des Auftretens der Neugeborenen-Diarrhöe und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß bestimmte, nichtmodifizierte Erythrocyten selektive Rezeptorplätze auf ihrer Oberfläche besitzen und daher in der Lage sind. Komplexe mit bestimmten Proteinen zu bilden. Unter »nicht-modifizierten Erythrocyten« sind in der Beschreibung Erythrocyten zu verstehen, die die Eigenschaften ihrer natürlichen Oberfläche besitzen, im Gegensatz zu modifizierten Erythrocyten, z. B. Erythrocyten, deren Oberflächen chemisch durch Kontakt mit Stoffen wie Formaldehyd, Gerbsäure oder Glutaraldehyd, modifiziert wurden und die daher ihre natürliche Fähigkeit zur selektiven Bildung von Proteinkomplexen verloren haben. Für ein vorgegebenes Antigen können sehr wenige Arten von Erythrocyten gegebenenfalls nur eine Art, vorliegen, die in der Lage sind, dieses bestimmte Antigen selektiv zu adsorbieren. Für jedes vorgegebene Antigen können die geeigneten Erythrocyten durch Untersuchen der möglichen Erythrocytengruppen gefunden werden, um solche herauszufinden, welche durch eine wäßrige Lösung des Antigens agglutiniert werden, wobei eine Arbeitsweise, wie sie im folgenden noch beschrieben wird, angewandt werden kann.

Die Erfindung wird mit Bezug auf die enteropathogenen Stämme von E. coli beschrieben, welche speziell bei der Diarrhöe von neugeborenen Schweinen eine Rolle spielen. Die Infektion von neugeborenen Ferkeln mit diesen Stämmen kann rasch zu einer Wasserabgabe und zum Tod der Ferkel führen und daher stellt eine solche Erkrankung ein schwerwiegendes Problem bei der Züchtung von Schweinen für die Ernährung dar. Zu den Enterotoxin bildenden Stämmen, die am häufigsten bei der Diarrhöe von neugeborenen Schweinen auftreten, gehören die folgenden:

ξ internationale Serotyp-Klassifizierung

08:K87(B),K88a,b(L)

08:K87(B),K88a.c(L)

045a,c:K'E65',K88a,c(L)

0138:K81(B),K88a,c(L)

0141 :K85a,b (B), K88a.b (L)

0147:K89(B),K88a,c(L)

0149:K91(B),K88a,c(L)

0157:k'Vl7'.K88a,c(L)'

Bei der Diarrhöe von neugeborenen Schweiner, oder Ferkeln wird das vordere, kleine Intestinum von einem oder mehreren solcher Stämme bevölkert, und es wurde behauptet, daß ihre Widerstandsfähigkeit zur Entfernung aus dem kleinen Intestinum durch Peristaltik den Haftsubstanzen zuzuschreiben ist, die auf der Oberfläche des Bakteriums vorliegen. Weiterhin wurde festgestellt, daß alle diese Stämme das eine oder das andere von zwei sehr verwandten Proteinoberflächenantigenen synthetisieren, welche als K88a,b und K88a,c bezeichnet werden, welche im wesentlichen zwischen pH 3,5 und 5,5 unlöslich sind, ein hohes Molekulargewicht besitzen (Sedimentationskoeffizient von etwa 35S7), und die hitzelabil sind, wobei sie denaturiert werden, wenn sie auf über 70⁰C erhitzt werden. Es wurde bereits angenommen, daß es diese Substanzen sind, die für die Hafteigenschaften der enteropathogenen Stämme von E. coli im Darm verantwortlich sind.

Es gibt in der Literatur mehrere Hinweise auf die experimentelle Applikation von Impfstoffen (d. h. Antigenmitteln), welche K88-Antigen enthalten, bei trächtigen Schweinen, um möglicherweise zusätzliche Schutzantikörper in dem Kreislaufimmunsystem der Mutterschweine zu erzeugen, und beim Werfen des Muttertieres das Übertreten in das Colostrum (Vormilch oder erste Milch) zu ermöglichen, so daß sie an dem Platz der Kolonisierung von E. coli im Darm des säugenden Ferkels verfügbar sind. Jedoch wird anerkannt (siehe J. M.

Rutter »Escherichia coli infections in piglets, Pathogenesis, Virulence and vaccination« in »The Veterinary Record«, 22.2.1975, 96, S. 171 -175), daß unterschiedliche Ergebnisse mit solchen Impfstoffen erzielt wurden, nämlich Versuche, bei denen manchmal positive Ergebnisse erzielt wurden, manchmal jedoch auch nicht.

Die Erfindung schafft verbesserte, antigene Mittel zur Applikation bei trächtigen Mutterschweinen und beruht darauf, daß gefunden wurde, daß der K88a,b/Haftfaktor stark aus wäßrigen Medien auf bestimmten, nicht-modifizierten Erythrocyten (roten Blutzellen) adsorbiert wird, insbesondere auf denen von Hühnern, daß der so gebildete Komplex stark immunogen wirkt, und daß die bei der parenteralen Applikation des Komplexes gebildeten Antikörper die Haftung aller der zuvor angegebenen Stämme von E. coli im Ferkeldarm hemmt, gleichgültig ob das auf der Oberfläche vorhandene K88-Antigen dasjenige der Stämme K88a,b oder K88a,c ist.

Die Erfindung betrifft somit einen parenteral applizierbaren Impfstoff für das Mutterschwein zur Verminderung des Auftretens der Neugeborenen-Diarrhoe bei Schweinen, enthaltend neben üblichen wäßrigen Trägerstoffen, Adjuontein und/oder Konservierungsmitteln als Wirkstoff ein Antigen, das der K88a,b/Haftfaktor aus einem enteropathogenen Stamm von E. coli ist, wobei das Antigen selektiv an Hühner-Erythrocyten, die ihre natürlichen Oberflächeneigenschaften besitzen, adsorbiert worden ist, wobei das Verhältnis von adsorbiertem Antigen zum Volumen von vorhandenen Erythro-

cyten im Bereich von 125—800 Einheilen pro ml liegt

Das Verhältnis von adsorbiertem K88a,b/Haftfaktor zu dem Volumen der Erythrocyten in dem Mittel liegt im Bereich von 125—800 Einheiten pro ml, und ein Verhältnis im Bereich von 400—800 Einheiten pro ml ist besonders bevorzugt. Bei einem Verhältnis von oberhalb 800 Kinhcitcn pro ml wird der Überschuß zum größten Teil nicht auf den Erythrocyten adsorbiert und wird immunolgisch nicht so wirksam wie das adsorbierte Material ausgenutzt Die zuvor angegebenen »Einheiten« (Haemagglutinationseinheiten) werden nach einer Arbeitsweise gemessen, die von einer in der Immunologie konventionellen Arbeitsweise abgeleitet ist, und diese Arbeitsweise ist im folgenden Beispiel 1 näher erläutert

Die Hauptmerkmale der Erfindung können wie folgt zusammengesetzt werden:

1. Impfstoffe mit a,b-Haftfaktoren sind wirksam gegenüber zahlreichen a,c-Organismen sowie gegenüber a,b-Organismen.

2. Bestimmte Erythrocyten, die ihre natürlichen Oberflächeneigenschaften besitzen, können Bakteriena,b-Haftfaktoren selektiv adsorbieren, um spezilische Impfstoffe zu liefern.

3. Diese Impfstoffe sind bei Raumtemperatur stabil und rufen eine hochwirksame Immunreaktion nach Injektion in ein trächtiges Säugetier hervor.

Die Verwendung von Hühner-Erythrocyten als Träger für den K88a,b/Haftfaktor ist erfindungsgemäß von besonderer Bedeutung. Dieser besondere Impfstoffe findet spezielle Brauchbarkeit bei der Kontrolle von Diarrhöe neugeborener Schweine.

Es war bekannt, bakterielle Haftfaktoren in trächtige Tiere einzuspritzen, manchmal mit einer Zunahme des Wertes der Blut-Antikörper. Bisher jedoch ist niemand auf den Gedanken gekommen, für diesen Zweck an Erythrocyten gebundene Haftfaktoren zu verwenden.

Der am nächsten kommende Stand der Technik ist die Veröffentlichung von Jones und Rutter im Journal of General Microbiology (1974), 84, S. 135-144. Sie befaßt sich mit dem Mechanismus, nach dem sich enteropathogene Bakterien an die Darmwand heften. Sie befaßt sich nicht mit der Herstellung injizierbarer Impfstoffe an sich und es ist auch nicht erkannt worden, daß Haftfaktoren an Erythrocyten adsorbiert und als injizierbare Impfstoffe zur Förderung der Resistenz gegenüber Diarrhöe Neugeborener verwendet werden können.

Die Autoren arbeiteten mit einer großen Anzahl von E. coli-Stämmen und unterwarfen sie verschiedenen Testarbeitsweisen. Viele der verwendeten Bakterienstämme und der angewandten Testarbeitsweisen sind nicht ausreichend beschrieben, um sicher zu sein, ob eine Adsorption zellfreier wäßriger Lösung von K88a,b/ Haftfaktor an spezielle, nicht-modifizierte Erythrocyten tatsächlich stattfand. Aus Seite 136 der Veröffentlichung, wo die Stämme von E. coli beschrieben sind, ergibt sich, daß die größte Zahl der Stämme K88a,c-Stämme waren und daher keinen K88a,b/Haftfaktor beisteuern konnten. In der gegebenen Aufstellung sind nur die Stämme W3, W5 und D520 positiv als K88a,b-Stämme identifiziert. Der größte Teil der Veröffentlichung befaßt sich mit Tests am Stamm Wl, der eindeutig als K88a,c definiert ist.

Die meisten der durchgeführten Tests erfolgten mit »lebenden« oder «bakteriellen« Suspensionen, die daher keine /.ellfreien Haftfaktor-Lösungen waren. Speziell der Abschnitt der Veröffentlichung mit dem Titel »Ergebnisse«, von S. 138 auf 139 übergreifend, scheint ausschließlich »Kulturen« oder »bakterielle Suspensionen« zu betreffen. Die Verwendung zellfreier K88-Antigen-Extrakte ist auf den Seiten 139—140 beschrieben, aber nur in Verbindung mit dem Stamm Wl, der bereits als K88a,e identifiziert worden ist. I's ist riichl auszuschließen, daß Jones und Rutter möglicherweise talsächlich eine Kombination von zellfreiem K88a,b/Haftfaktor nit nicht-modifizierten Erythrocyten in irgendwelchen Versuchen erhalten haben mögen, die aber in der Veröffentlichung nicht beschrieben sind, doch in Ermangelung spezieller Ausführungen hierzu kann die Veröffentlichung der Allgemeinheit eine solche Anregung nicht gegeben haben.

Ein weiterer Hinweis darauf, daß Jones und Rutter sich nicht mit der Herstellung injizierbarer Impfstoffe beschäftigt haben, ergibt sich aus der Tatsache, daß sie auch keinen Zusatz von Konservierungsstoffen zum

Testmaterial, mit dem sie arbeiteten, erwähnen. Sie hatten offenbar nicht erkannt, daß so lagerfähige Impfstoffe hergestellt werden könnten, die in der beanspruchten Weise verwendbar sind. Sie verwendeten lediglich Erythrocyten als Mittel zum Nachweis des Vorliegens

und der Aktivität von bakteriellen Haftfaktoren. So war für sie eindeutig nicht offensichtlich, daß innerhalb ihres Bereichs eine Technik lag, die zur Herstellung hochwirksamer Impfstoffe modifiziert werden konnte. Dies wird noch durch die Tatsache unterstrichen, daß Rutter in der auf Seite 3 der oben erwähnten Veröffentlichung versuchte, K88-Antigene (nicht an Erythrocyten gebunden) als Impfstoffe für trächtige Sauen zu verwenden, um zusätzliche schützende Antikörper in den Kreislauf-Immunsystemen der Sau zu erzeugen.

Wie bereits bemerkt, ist ein Merkmal der Erfindung die spezielle Verwendung von Hühner-Erythrocyten als Träger für K88a,b/Haftfaktor in einem Impfstoff zur Kontrolle der Diarrhöe in neugeborenen Schweinen. Dieses spezielle Merkmal findet sich in keiner der genannten Linteraturstellen. Hühner-Erythrocyten bilden aber eine besonders starke und spezifische Bindung mit K88a,b/Haftfektor.

Chemical Abstracts, 1954,855 führt von der Erfindung weg, da hiernach E. coli-Antigene nicht an Erythrocyten

gebunden werden, wenn nicht bestimmte Elektrolyte zugegen sind. Dies mag vielleicht für eine Reihe von Antigenen zutreffen, nicht aber für K88-Haftfaktoren.

Der erfindungsgemäße Impfstoff kann ein einfaches wäßriges Mittel sein, oder kann eine Phase eines Hilfsöles wie eines Mineralöles oder Arachisöl (Erdnußöl) enthalten, dessen Anwesenheit ein verbessertes Antikörperansprechen ermöglicht (besser beim Vergleich mit demjenigen aus dem einfachen, wäßrigen Mittel) das bei der Applikation durch Injektion erreicht wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel eine Mehrfach-Öl-Wasser-Emulsion derart, wie sie ganz allgemein in der britischen Patentschrift 10 80 994 beschrieben ist. In dieser Form ist die kontinuierliche Phase eine wäßrige Phase (z. B. steriles Wasser, physiologischer Salz- oder Phosphatpuffer), und das antigene Material (im vorliegenden Fall der K88a,b/Haftfaktor — rote Blutzellenkomplex) liegt in einer weiteren (sekundären) wäßrigen Phase vor, welche selbst in einer primären, dispersen Phase von Öl dispergiert ist.

b5 Zur Herstellung des antigenen Mittels wird eine zell-Ireie, wäßrige Lösung, welche den K88a, b/Haftfaktor enthält, in Kontakt mit nicht-modifizicrtcn Erythrocyten, insbesondere nicht-modifi/.ierlcn Hühner-Erythro-

cyten, unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, daß der K88a,b/Haftfaktor durch die Erythrocyten adsorbiert wird. Die zellfreie, wäßrige Lösung kann selbst aus einem K88a,b-Stamm (üblicherweise den enterotoxischen Stämmen G7 oder G68 Typ 1, die im Handel erhältlich sind, z. B. von Central Veterinary Laboratory, Ministry of Agriculture and Fisheries, New Haw, Weybridge, Surrey, Großbritanien) unter Befolgung der von Stirm, Orskov, Orskov und Mansa in J. Bacteriology, 93, S. 731—739 beschriebenen Arbeitsweise im allgemeinen hergestellt werden. Diese Arbeitsweisen umfassen die Freisetzung des K88-Materials von den Oberflächen der Bakterien in Wasser, z. B. durch Erhitzen der lebenden Bakterien in einem wäßrigen Medium, das von pH 6 bis 9 gepuffert ist, auf 60 bis 65° C für 15 Minuten oder langer, oder durch Anwendung einer Reibeinwirkung auf die Oberfläche der Bakterien in einem wäßrigen Puffer, z. B. in einem Waring-Mischer. Die Bakterien werden dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren aus dem so erhaltenen, wäßrigen K88-Extrakten entfernt. Das in den zellfreien Extrakten vorhandene K88-Material kann gegebenenfalls (z. B. für Versuchszwecke) durch wiederholte, isoelektrische Ausfällung (pH etwa 5) und Wiederauflösung gereinigt werden. Im großen Maßstab kann ein K88a,b-Stamm von E. coli auf einem konventionellen Medium aus Kaseinhydrolysat/Saccharose, ergänzt durch die üblichen Zusatzstoffe wie Vitamine, unter Belüftung (z.B. 3 l/min/101 des Mediums) unter konstantem Rühren, Steuerung des pH-Wertes (etwa 7) und Steuerung der Temperatur (37°C) gezüchtet werden. Die erhaltene Kultur wird nach 24 Stunden abgeerntet und zur Absetzung der Bakterien zentrifugiert Diese werden dann in 0,15 M Salzlösung bei 3% des ursprünglichen Kulturvolumens suspendiert, und dann werden sie auf etwa 60⁰C zur Freisetzung des Haftfaktors (Adhäsionsfaktors) in das wäßrige Medium erhitzt. Die Zellrückstände werden durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wird auf ihren Gehalt an Haftfaktor untersucht, dann wird der Haftfaktor auf Hühner-Erythrocyten adsorbiert.

Bei der parenteralen Applikation des Impfstoffes in vollkommen üblicher Weise werden Antiseren erzeugt, die oral bei neugeborenen Ferkeln zur Bekämpfung der Neugeborenen- Diarrhöe appliziert werden können. Jedoch werden die erfindungsgemäßen Mittel am besten parenteral bei trächtigen Mutterschweinen etwa drei Wochen vor dem Werfen appliziert, d. h. etwa 95 Tage nach dem Decken durch den Eber, so daß die Vormilch oder das Colostrum bei dem Werfen eine wirksame Konzentration der Antikörper für den K88a,b/Haftfaktor von enterotoxischen E.-coli-Stämmen enthält.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

a) Herstellung und Ioslierung von
K88a,b/Haftfaktor

Eine Reinkultur von E. coli, Stamm G7, internationale Serotypen-Klassifikation 08:K87 (B), K88a,b (L) wurde in Nährbrühe eingeimpft und bei 37°C über Nacht inkubiert. Nähragarschrägplatten in Roux-Kolben wurden mit der Kultur stark beimpft und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das ineinanderwachsende Oberflächenmaterial wurde abgewaschen und aseptisch unter Verwendung einer sterilen 0,1 M Phosphatpufferlösung (Na₂HPO₄ZNaH₂PO₄) mit pH = 7,5 geerntet, und die erhaltene Bakteriensuspension wurde für 30 Minuten auf 60⁰C zur Freisetzung des K8Ba, b/Haftfaktors von den Zellenoberflächen erhitzt Das Zellenmaterial wurde durch Zentrifugieren (3000 g; 10 Minuten) entfernt und nach der Zugabe von Ni iriumazid (0,2%) zur Verhinderung des Bakterienwachstums wurde die überstehende Flüssigkeit drei Tage bei 4° C aufgewahrt Die abgelagerten Verunreinigungen wurden dann durch Zentrifugieren entfernt und es wurde verdünnte Essigsäure zu der kontinuierlich gerührten, überstehenden Flüssigkeit zur Herabsetzung des pH-Wertes auf 5 hinzugegeben. Der isoelektrische Punkt des K88a,b/Haftfaktor liegt zwischen 44 und 55. Das ausgefällte Material wurde 24 Stunden bei 4°C stehengelassen, dann wurde es durch Zentrifugieren gesammelt und zweimal mit 0,005 Mcllvaine-Puffer (Na₂HPO4/Zitronensäure) mit pH = 5,0 gewaschen. Es wurde durch wiederholtes Auflösen (unter Verwendung von phosphatgepufferter 0,15 M Salzlösung bei pH = 7,2) und durch Ausfällen (0,15 M Mcllvaine-Puffer, pH = 5,0) gereinigt Abschließend wurde das ausgefällte Material in einer phosphatgepufferten 0,15 M Salzlösung mit pH = 7,2 aufgelöst und bei -2O⁰C gelagert

b) Untersuchung von K88a,b/Haftfaktor

in Lösung unbekannter Konzentration

Diese Untersuchung kann als Auswähltest verwendet werden, um diejenigen nicht-modifizierten Erythrocyten zu identifizieren, die zur selektiven Adsorption eines vorgegebenen Antigens in der Lage sind. Ein Anteil (0,05 ml) der Lösung (Y), die untersucht werden soll, wird serienmäßig mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH = 7,1, in aufeinanderfolgenden Vertiefungen einer Tüpfelplatte verdünnt um eine Reihe von Lösungen mit Adhäsionsfaktorkonzentrationen V₂, V₄, V₈... V₂" derjenigen der Lösung Y zu erhalten. Zu jeder dieser Lösungen werden 0,025 ml einer dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung mit pH = 7,1 gewaschenen, 2°/oigen Suspension von Hühner-Erythrocyten in dem gleichen Puffer hinzugegeben. Die Platte wird mechanisch geschüttelt, und die Inhalte der Vertiefungen werden sich absetzen gelassen. Nach 0,5 Stunden wird die Platte inspiziert Eine Agglutinierung der Hühner-Erythrocyten tritt in den stärkeren Lösungen (d. h. in den zuerst gefüllten Vertiefungen) auf, jedoch nicht in den schwächeren Lösungen, und der Endpunkt der Titration (Untersuchung bei Zimmertemperatur) wird bei der Lösung angenommen, bei welcher gerade noch eine Haemagglutination auftritt. Bei einer typischen Arbeitsweise kann der Endpunkt in der 13. Vertiefung liegen, und der Titer der Lösung Y betrüge in diesem Fall 2¹³ = 8192, d. h. 8000 entsprechend 8000 Haeniagglutinationseinheiten (HA-Einheiten) pro ml.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eines einfachen, wäßrigen Hühner-Erythrocyten-impfstoffes.

Unter Befolgung der zuvor beschriebenen Arbeitsweise von Beispiel 1 b) wurde eine entsprechend a) hergestellte Lösung untersucht, wobei gefunden wurde, daß sie einen K88a,b-Haftfaktor-Titer von 8000 besaß. Aus dieser Lösung wurde ein Impfstoff hergestellt, in-

b5 dem zuerst 1 ml der Lösung auf 10 ml mit phosphatgepufferter Salzlösung von pH = 7,1 (PBS) verdünnt und dann die verdünnte Lösung (Z) für 9,5 Stunden bei 37°C mit 10 ml der dreimal mit PBS gewaschenen, gepackten

Hühner-Erythrocyten, welche durch Zentrifugieren (1000 g; 10 Minuten) erhalten worden waren, gerührt wurde. Diese Arbeitsweise führt zu einer praktischen Sättigung der Oberflächen der Hühner-Erythrocyten mit dem Haftfaktor, d. h. bei der Sättigung lagen 8000 HA-Einheiten des Haflfaktors pro 10 ml der rolen Hühner-Blutzellcn vor.

Es wurde 0,2 Gew.-°/o Natriumazid zu der erhaltenen Vaccine hinzugegeben, diese wurde bei 4° C bis zum Gebrauch gelagert.

Der so erhaltene Impfstoff wurde in geeigneter Weise bei trächtigen Mutterschweinen bei einem Dosiswert von 2 ml appliziert. Bei diesem Wert ist etwa der lOfache Antikörper erzeugende Effekt der (keine Erythrocyien enthaltenden) Lösung Z, aus welcher er hergestellt wurde, vorhanden.

Anstelle der Verwendung von Natriumazid als Konservierungsstoff, wie zuvor beschrieben, kann der Impfstoff auch mit Formalin (40%ige wäßrige Formaldehydlösung), vorteilhafterweise in einem Verhältnis von 1 Volumen Formalin zu 100-50 Volumina des Impfstoffs behandelt werden.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von einen ölzusatzstoff enthaltenden Impfstoffen.

i) 1 ml eines handelsüblichen Mannit-monooleatemulgators (Warenbezeichnung Arlacel A) wurde in 9 ml Mineralöl von Arzneimittelqualität aufgelöst Die Öllösung wurde dann zu einem gleichen Volumen des einfachen, wäßrigen Hühner-Erylhrocyten-Impfstoffs, der gemäß Beispiel 2 erhalten worden war, hinzugegeben. Das Vermischen wurde in einem Homogenisator durchgeführt, um eine cremeartige Wasser-in-öl-Emulsion herzustellen,
ii) 1 Volumenteil der Wasser-in-ÖI-vaccine von Stufe i) wurde zu einem gleichen Volumen einer 2%igen Lösung eines handelsüblichen Polyoxyäthylensorbitan-monooleat-emulgators (Warenbezeichnung Tween 80) in 0,15 M Salzlösung hinzugegeben. Das Vermischen wurde in einem Homogenisator durchgeführt

Der Wasser-in-öl-in-Wasser-Impfstoff mit geringer Viskosität die auf diese Weise gebildet wurde, wurde intramuskulär bei einem Dosiswert von 8 ml bei Mutterschweinen drei Wochen vor dem Werfen (d. h. etwa 95 Tage nach dem Decken durch den Eber) injiziert Die auf diese Weise gebildete Anti-Haftaktivität war mit drei Antikörperklassen assoziiert (IgG, IgM und IgA), wodurch ein breites Spektrum an Antikörperaktivität geliefert wurde. Im folgenden wird ein Vergleich mit der entsprechenden Aktivität bei einer Kontrollgruppe von nicht behandelten, trächtigen Mutterschweinen gegeben.

ten Mutterschweinen gesäugten Ferkeln betrug 128 Einheiten, während sie für das Serum von von den nicht behandelten Mutterschweinen gesäugten Ferkeln nur 32 Einheiten betrug. Die von den geimpften Mutlerschweinen gesäugten Ferkel waren gegenüber Infektion durch entcrotoxische K88a,b- und K88iU'-Stamme von I·;. coli weit resisienter als die von nichi-geimpften Mutterschweinen gesäugten Ferkel.

Antihaftaktivität

im Serum im Colostrum

Geimpfte
Mutterschweine
Nicht-geimpfte
Mutterschweine

256
4—8

512
32

Die Antihaftaktivität im Serum von von den geimpf-

Claims

Patentansprüche:

1. Parenteral applizierbarer Impfstoff für das Mutterschwein zur Verminderung des Auftretens der Neugeborenen-Diarrhöe bei Schweinen, enthaltend neben üblichen wäßrigen Trägerstoffen, Adjuvantien und/oder Konservierungsmitteln als Wirkstoff ein Antigen, das der K88a,b/Haftfaktor aus einem enteropathogenen Stamm von EL coil ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen selektiv an Hühner-Erythrocyten, die ihre natürlichen Oberflächeneigenschaften besitzen, adsorbiert worden ist, wobei das Verhältnis von adsorbiertem Antigen zum Volumen von vorhandenen Erythrocyten im Bereich von 125—800 Einheiten pro ml liegt

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von adsorbiertem Antigen zu dem Volumen der vorhandenen Erythrocyten im Bereich von 400 bis 800 Einheiten pro ml liegt.

3. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine von Zellen freie wäßrige Lösung von K88a,b/Haftfaktor mit Hühner-Erythrocyten, die ihre natürlichen Oberflächeneigenschaften besitzen, in Kontakt gebracht wird.