DE69131525T2

DE69131525T2 - Pasteurella multocida toxoid enthaltende impfstoffe

Info

Publication number: DE69131525T2
Application number: DE69131525T
Authority: DE
Inventors: Joseph Frantz; Richard Kemmy; David Roberts; Leroy Swearingin
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1990-06-13
Filing date: 1991-06-10
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2011-06-11
Also published as: EP0651609B1; US5536496A; DE69131525D1; GR3031487T3; EP0651609A4; DK0651609T3; ATE183202T1; ES2136064T3; WO1991019419A1; AU1362895A; EP0651609A1; AU8195391A; AU685569B2; JP3178720B2; JPH05508407A

Description

PASTEURELLA MULTOCIDA TOXOID ENTHALTENDE IMPFSTOFFE

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Veterinärimpfstoffe, Impfstoffzusammensetzung und Verfahren zur Herstellung derselben. Insbesondere betrifft die Erfindung Impfstoffzusammensetzung und Verfahren zum Schutz von Tieren gegen Erkrankungen, die mit der Infektion durch toxigene Stämme von Pasteurella multocida verbunden sind.

Hintergrund der Erfindung

Pasteurella multocida wird mit der Erkrankung vieler Arten von Tieren, einschließlich Menschen und Rind, Schaf und Schwein in Verbindung gebracht. Im allgemeinen werden die Nase-Schlund-Bereiche und Lungen von infizierten Tieren befallen. Beispielsweise verursachen toxigene Stämme von P. multocida, Kapseltyp A oder D, atrophischen Schnupfen beim Schwein. Atrophischer Schnupfen (AR) führt zu schwerer Nekrose der Epithelien des oberen Atmungstrakts sowie zur Verkrüppelung und Atrophie der Nasenmuschel und des Rüssels von Schweinen.
Die Pathogenität von P. multocida ist zum großen Teil auf die Erzeugung eines stark nekrotisierenden Toxins, auch dermonekrotisches Toxin (DNT) genannt, zurückzuführen, das nachstehend als "das Toxin" bezeichnet wird. Das Toxin wurde als ein Wärme-labiles Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 140000 bis 160000 charakterisiert.
P. multocida ist von anderen Arten von Pasteurella auf der Basis der Wachstumseigenschaften wie nachstehend zu unterscheiden: Hämolyse: negativ (90%); Wachstum auf MacConkey's-Agar: negativ; Indol-Erzeugung: positiv; Urease-Erzeugung: negativ und Mannitmetabolismus: positiv. Siehe Zinsser, Microbiology, herausgegeben von Joklik et al., Applenton-Century-Crofts, New York, 1980, Seiten 791-793.
Gegenwärtig verfügbare Impfstoffe zum Schutz von Tieren vor mit Infektion durch P. multocida verbundenen Erkrankungen schließen inaktivierte toxigene P. multocida-Zellen, inaktivierte Zubereitungen von teilweise gereinigtem P. multocida-Toxin und Kombinationen von P. multocida-zellfreien Zubereitungen mit anderen inaktivierten P. multocida-Stämmen oder B. bronchiseptica-Stämmen ein. [Siehe beispielsweise M. Kobisch et al., Vet. Record, 124: 57-61 (1989) und N. T. Foged et al., Vet. Record, 125: 7-11 (1989)]. Diese Impfstoffzubereitungen schützen jedoch nicht vollständig gegen Erkrankung, da sie keine wirksame Mengen an Antikörper hervorbringen können, die das Toxin neutralisieren, welche als "Antitoxin" bekannt sind.
Es gibt einen Bedarf auf dem Gebiet der Veterinärmedizin, für wirksame Impfstoffe gegen Infektion von Tieren durch toxigene P. multocida.

Kurzdarstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt neue Impfstoffzusammensetzungen und Komponenten bereit, die Tiere gegen eine Erkrankung schützen, die mit der Infektion durch toxigene Pasteurella multocida verbunden sind. Diese Impfstoffzusammensetzungen werden durch die Fähigkeit gekennzeichnet, signifikante Mengen an zirkulierendem Antitoxin hervorzubringen.
In einem ersten Aspekt stellt diese Erfindung einen Impfstoff bereit, der eine immunogene Menge eines stabilen, löslichen, zellfreien Toxoids von P. multocida und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Dieses neue P. multocida-Toxoid wird durch ein Verfahren hergestellt, das einen Schritt einschließt, bei dem das Toxin geändertem pH- Wert und geänderter Temperatur ausgesetzt wird, wobei das Verfahren ebenfalls einen neuen Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt. Der Begriff "Toxoid" beschreibt eine Zubereitung des Toxins, das durch das Verfahren inaktiviert ("toxoidiert") wurde, das seine Toxizität ohne Einbuße seiner Fähigkeit aufhebt, die Erzeugung des speziellen, neutralisierenden Antitoxins zu induzieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine neue Impfstoffzusammensetzung bereit, die eine immunogene Menge eines Pasteurella multocida-Ganz-Bakterins mit zellgebundenem Toxoid enthält. Diese Zusammensetzung kann bei einem vorher unbeimpften Tier eine starke Antitoxinreaktion, verglichen mit dem freien, löslichen Toxoid, induzieren. Diese Zusammensetzung ist ebenfalls vorzugsweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verbunden.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung außerdem eine neue Impfstoffzusammensetzung bereit, umfassend immunogene Mengen von (1) einem Pasteurella multocida-Ganz-Bakterin mit zellgebundenem Toxoid, das nach innerer Verabreichung an ein Tier eine Antitoxinreaktion induziert und (2) das freie Toxoid von P. multocida. Diese Impfstoffzusammensetzung erzeugt eine unerwartete, synergistische Antitoxinreaktion, die viel größer als die Summe der getrennten Wirkungen der zwei Komponenten ist. Ein Träger ist ebenfalls wünschenswerterweise mit dieser Zusammensetzung verbunden.
In einem weiteren Aspekt können die vorstehenden drei Impfstoffzusammensetzungen durch Kombination mit einer immunogenen Menge von einem oder mehreren zusätzlichen Antigenen variiert werden. Solche zusätzlichen Antigene können unter anderem B. bronchiseptica-Bakterin oder Erysipelothrix rhusiopathiae-Bakterin einschließen. Andere übliche Impfstoffkomponenten können auch zu den erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen gegeben werden.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung schließt eine Impfstoff-Dosierungseinheit von jeder der vorstehenden Impfstoffzusammensetzungen ein. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform schließt eine Impfstoff-Dosierungseinheit, umfassend 0,5 bis 3 ml einer sterilen Lösung, die eine immunogene Menge zwischen 80 bis 1000 relativen Toxoideinheiten (RU) eines P. multocida-Toxoids enthält, ein. Eine weitere Ausführungsform schließt eine Dosierungseinheit von 0,5 bis 3 ml einer sterilen Suspension einer immunogenen Menge zwischen 0,5 und 8 optischen Dichte-Einheiten (OD), gemessen bei 625 nm, eines P. multocida-Bakterins mit zellgebundenem Toxoid, das nach innerer Verabreichung an ein Tier eine Antitoxinre aktion induziert, ein. Eine weitere Ausführungsform ist eine Dosierungseinheit, umfassend 0,5 bis 3 ml eines sterilen Gemisches der freien und zellgebundenen Toxoide. Eine weitere Ausführungsform ist eine Dosierungseinheit, umfassend 0,5 bis 3 ml eines sterilen Gemisches von immunogenen Mengen der freien und zellgebundenen Toxoide und eine oder mehrere zusätzliche, antigene Komponente(n).
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung außerdem ein Verfahren zur Detoxifizierung des P. multocida-Toxins bereit, um ein freies, lösliches, immunogenes Toxoid herzustellen, das Inkubieren des Toxins bei einem pH-Wert größer als 9 für mindestens 12 Stunden umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Detoxifizierung einer gesamten P. multocida-Kultur bereit, wobei das Toxin in den bakteriellen Zellen zur Verwendung als Impfstoff vollständig zu einem stabilen Toxoid umgewandelt wird.
Dieses Verfahren beinhaltet Behandeln der Kultur mit einer geeigneten Konzentration an Formaldehyd bei einer geeigneten Temperatur und für eine ausreichende Zeit.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist außerdem ein Verfahren zum Impfen eines Tiers gegen P. multocida, das inneres Verabreichen an das Tier einer wirksamen Menge von einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Impfstoffzusammensetzung(en) umfaßt.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in der nachstehenden Beschreibung im Einzelnen von bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben.

Beschreibung der Erfindung im Einzelnen

Die vorliegende Erfindung stellt Impfstoffzusammensetzungen bereit, die bei der Prophylaxe von Erkrankungen, die sich aus Infektionen mit toxigenen P. multocida-, nichttoxischen P. multocida-Stämmen und anderen pathogenen Organismen ergeben, verwendbar sind. Solche Erkrankungen schließen unter anderem atrophischen Schnupfen (AR), pleuritische und pneumonische Pasteurellose und Erysipel ein.
Eine Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Impfstoff, der eine immunogene Menge eines freien, löslichen P. multocida-Toxoids in einem geeigneten Träger umfaßt. Das Toxoid dieser Erfindung wird im allgemeinen durch Extrahieren von Toxin aus den bakteriellen Zellen und Veranlassen einer teilweisen Denaturierung durch Inkubieren des zellfreien Toxins für etwa 12 bis 24 Stunden bei einem pH-Wert größer als 9, bei einer Inkubierungstemperatur von zwischen etwa 12ºC bis etwa 19ºC hergestellt.
Insbesondere wird das Toxoid dieser Erfindung wie nachstehend hergestellt: Ein ausgewählter, toxigener P. multocida-Stamm wird in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet. Am Ende des Wachstumszyklus wird das Toxin aus den Zellen durch übliche physikalische oder chemische Maßnahmen, beispielsweise French-Press oder Ultraschall-Spaltung, freigesetzt und Zelldebris wird durch Zentrifugation und Filtration entfernt. Das zellfreie, extrahierte Toxin wird dann inkubiert, vorzugsweise bei pH von etwa 10,5, bei Umgebungs- oder etwas kühlerer Temperatur, für vorzugsweise 18 Stunden. Nach der Inkubation wird der pH-Wert auf neutral eingestellt. Dieses Verfahren ergibt eine vollständige Detoxifizierung des Toxins, unter Bereitstellung eines Toxoids, das in wässerigen Lösungen löslich ist (beispielsweise Phosphat-gepufferter Salzlösung, tris-gepufferter Salzlösung).
Die lösliche P. multocida-Toxoidzubereitung dieser Erfindung ist sowohl antigen, als auch immunogen. Insbesondere kann das lösliche Toxoid Antikörper hervorbringen, die an das Toxin binden können und dessen Toxizität neutralisiert. Des weiteren ist das erfindungsgemäße, lösliche Toxoid charakteristisch bei 4ºC für mindestens 24 Monate stabil, was eine sehr vorteilhafte kommerzielle Eigenschaft darstellt und ausweist, daß dieser Impfstoff zur späteren Verwendung gelagert werden kann.
Als weitere Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Ganz-Bakterin-Toxoid von P. multocida bereitgestellt, das das Toxoid in der bakteriellen Zelle eingekapselt und stabilisiert enthält. Das Bakterin-Toxoid wird aus einer Kultur hergestellt, die noch exponentiell wächst und die noch nicht be gonnen hat, das Toxin in das Wachstumsmedium freizusetzen. Formalin (Formaldehydlösung USP) wird mit einer Konzentration von 0,5% Volumen/Volumen zugegeben und Inaktivierung wird bei etwa 37ºC 4 Tage fortgesetzt. Weitere Formalinkonzentrationen können in diesem Verfahren angewendet werden. Eine höhere Konzentration erfordert jedoch einen kürzeren Inaktivierungs- Inkubations-Zeitraum und eine niedrige Konzentration erfordert einen längeren Inaktivierungs-Inkubations-Zeitraum. Der Fachmann kann diese Parameter auf der Basis dieser Offenbarung leicht bestimmen. Das Toxoid wird dadurch mit der bakteriellen Zelle eingekapselt. Die toten bakteriellen Zellen mit dem darin sicher maskierten Toxoid sind ideale antigene Teilchen zur Darstellung jener Wirtszellen, die das Immunisierungsverfahren vermitteln. Dies ist insbesondere für Tiere, die vorher nicht dem Toxin oder Toxoid ausgesetzt waren und die einen vollständigen Mangel an Antitoxin aufweisen, von Bedeutung.
In dem P. multocida-Bakterin-Toxoid dieser Erfindung ist das zellgebundene Toxoid bemerkenswert stabil. Ein Verlust an antigener Stärke war nach Lagerung bei 4ºC für mehr als zwei Jahre nicht nachweisbar.
Für diese Erfindung kann ein beliebiger toxigener Stamm von P. multocida verwendet werden, um das freie Toxoid oder das Bakterin-Toxoid dieser Erfindung bereitzustellen. Die vorstehend beschriebenen freien oder zellgebundenen Toxoide können von einem beliebigen Stamm von P. multocida abgeleitet sein, der dermonekrotisches Toxin freisetzt. Verschiedene solcher Stämme sind verfügbar, beispielsweise aus der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, oder aus einer Vielzahl an Veterinär-Sammlungen oder -Laboratorien. Der nachstehend in den Beispielen verwendete Stamm ist P. multocida, Typ D, Stamm 8, der, auf Anfrage, von der Universität von Illinois erhältlich ist.
Geeignete Kulturmedien zur Verwendung zur Züchtung der P. multocida-Kulturen können vom Fachmann ausgewählt werden, schließen jedoch vorzugsweise, ohne Begrenzung, das von Herriott et al., "Defined Medium for Growth of Hemophilus In fluenzae", J. Bact., 101: 13-516 (1970), beschriebene Medium ein.
Das vorstehend beschriebene, neue, freie Toxoid und Ganz-Bakterin-Toxoid können getrennt in Impfstoffzusammensetzungen zur Induktion einer Antitoxinreaktion angewendet werden, die die durch toxigenes P. multocida verursachten pathologischen Änderungen, die für atrophischen Schnupfen charakteristisch sind, verhindert. In einer Impfstoffzusammensetzung wird eine immunogene Menge von freiem Toxoid oder dem Bakterin-Toxoid wünschenswerterweise mit geeigneten, üblichen Impfstoff-Adjuvantien und physiologischen Trägern zur Injektion an Säuger, insbesondere Schwein, vermischt.
Eine bevorzugtere Impfstoffzusammensetzung wird durch eine synergistische Kombination des freien Toxoids und des vorstehend beschriebenen, ganzen Bakterin-Toxoids bereitgestellt. Die Impfstoffkombination dieser Erfindung kombiniert das Ganz-Bakterin-Toxoid mit dem löslichen Toxoid, wobei beide Impfstoffkomponenten wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden. Keine anderen Toxoide oder Impfstoffe werden auf diese Weise hergestellt. Ein solcher Kombinationsimpfstoff wird durch Vermischen einer immunogenen Menge von freiem Toxoid und einer immunogenen Menge von Bakterin-Toxoid mit geeigneten Adjuvantien und physiologischen Trägern zur Injektion in den Säuger hergestellt. Bevorzugte Adjuvantien schließen Amphigen und Aluminiumhydroxidgel ein.
In Impfstoffversuchen mit Tieren, wie nachstehend in Beispielen 8 und 10 berichtet, wurde von diesen zwei Impfstoffkomponenten gefunden, daß sie synergistisch in einer einzigen Impfstoffzubereitung wirken. Der "Kombinationsimpfstoff" erzeugt in dem beimpften Tier eine überraschend größere Wirkung, als die durch einfaches Addieren der Wirkungen von jeder Toxoidkomponente, wenn getrennt verabreicht, zu erwarten wäre. Diese Impfstoffkombination stimuliert eine bemerkenswerte Erzeugung von Antitoxin in den getesteten Tieren. Diese vereinigte Wirkung kann ebenfalls durch Verabreichen des Bakterin-Toxoid-Impfstoffs nacheinander, gefolgt von einer Injektion des löslichen Toxoid-Impfstoffs, erzeugt werden.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, daß der Bakterin-Toxoid-Impfstoff die Tiere, insbesondere immunologisch natürliche Tiere, die nicht in der Lage sind, auf lösliches Toxoid zu reagieren, stimuliert. Eine zweite Dosis von dem Bakterin-gebundenen Toxoid induziert eine mittlere sekundäre Reaktion. Einmal stimuliert durch die Toxoid-reichen Zellen auf das Bakterin-Toxoid, sind die Tiere jedoch sehr reaktiv auf lösliches, freies Toxoid. So, wie das Bakterin-Toxoid ein starkes Stimulierungsmittel ist, wurde von dem löslichen Toxoid beobachtet, daß es ein ausgezeichnetes Auffrischungsmittel ist.
Bevorzugte Impfstoffzusammensetzungen dieser Erfindung entstehen außerdem aus der Kombination von freiem Toxoid und/oder dem Bakterin-Toxoid dieser Erfindung mit anderen Impfmitteln. Ein erläuterndes Beispiel ist eine Impfstoffzusammensetzung, die durch die Kombination eines Gesamtzell-B. bronchiseptica-Bakterins mit dem P. multocida-Bakterin-Toxoid gebildet wird. Alternativ wird das P. multocida-Bakterin-Toxoid in weiterer Kombination mit E. rhusiopathiae erläutert. Andere mögliche Impfmittel, die mit den Impfstoffkomponenten dieser Erfindung kombiniert werden können, schließen ein: Escherichia coli, Streptococcus suis, Mycoplasma hypopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Clostridium perfrigens, Typen C- und D-Toxoide, Pseudorabies-Virus-Impfstoff (modifizierter Lebendvirus und/oder nicht-Lebendvirus), Rotavirus-Impfstoff (modifizierter Lebendvirus), Coronavirus- Impfstoff (modifizierter Lebendvirus).
Erfindungsgemäße Impfstoffe können als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die eine wirksame immunogene Menge an dem freien Toxoid und/oder dem Ganz-Bakterin-Toxoid als Wirkstoffe in einem nichttoxischen und sterilen, pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Impfstoffes besteht aus einer wässerigen Suspension oder Lösung, die das freie Toxoid und/oder Bakterin-Toxoid, vorzugsweise gepuffert bei einem physiologischen pH-Wert, in einer zur Injektion bereiten Form enthalten.
Alternativ oder zusätzlich können das freie Toxoid und/oder Bakterin-Toxoid mit einem üblichen Adjuvans angemischt oder adsorbiert werden. Das Adjuvans wird in einem nichtspezifischen Reizstoff verwendet, um Leukozyten anzuziehen oder eine Immunreaktion zu steigern. Solche Adjuvantien schließen unter anderen Amphigen, Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptid und Saponine, wie Quil A, ein.
In einer weiteren, beispielhaften Alternative können das freie Toxoid und/oder Bakterin-Toxoid mit anderer immunostimulierender Zubereitung, wie B. bronchiseptica oder E. rhusiopathiae-Bakterinen, hergestellt durch bekannte Verfahren, verabreicht werden.
Für die erfindungsgemäßen Zwecke kann eine immunogene Menge an frei löslichem Toxoid, wenn als der einzige Wirkstoffbestandteil verabreicht, bezüglich der relativen Toxoideinheiten ("RU"), definiert werden. Der Wert von RU wurde empirisch auf der Basis einer Schätzung der Menge an Toxoid bestimmt, das, Mäusen inokuliert, eine Immunreaktion hervorrufen würde, so daß die Mäuse gegen die tödlichen Wirkungen der intraperitonealen Inokulation von ungefähr 30 LD&sub5;&sub0; an gereinigtem Toxin geschützt sind. In diesem System wurde eine Antigen-Extinktion-Untersuchung durchgeführt und ein PD&sub5;&sub0; bestimmt. Ein PD&sub5;&sub0;, das einen berechneten Wert darstellt, wird als die Menge an erforderlichem Toxoid definiert, um 50 Prozent der Mäuse vor der Exposition mit einer definierten Menge an Toxin zu schützen; dies ist beispielsweise 30 LD&sub5;&sub0; an gereinigtem Toxin. Somit ist ein RU ungefähr gleich einer Maus-PD&sub5;&sub0;. Somit liegt der Bereich von immunogenen Mengen an frei löslichem Toxoid zwischen 50 und 1000 RU. Bevorzugter liegt die immunogene Menge im Bereich zwischen 50 und 650 RU. Ein weiterer, bevorzugter Bereich liegt zwischen 80 bis 450 RU. Ein weiter bevorzugter Bereich liegt außerdem zwischen 80 bis 150 RU. Eine andere immunogene Menge des freien Toxoids, definiert auf das Gewicht, liegt im Bereich zwischen 16,2 und 32,4 ug Toxoid.
Für die Erfindung wird eine immunogene Menge an Bakterin-Toxoid, wenn als einziger Wirkstoffbestandteil verabreicht, als eine optische Dichte (O. D.) zwischen 0,5 und 8 pro ml, erwünschter 1 bis 4 pro ml, definiert. Ein weiter bevorzugter Bereich ist eine O. D. zwischen 1 bis 3 pro ml. Wie durch die gesamte Beschreibung verwendet, sind die Begriffe O. D., optische Einheit (OU) oder Absorptionseinheit untereinander austauschbar und werden bei 625 nm in einem Spectronic 20 Spektrophotometer, sofern nicht anders ausgewiesen, gemessen.
In einer Impfstoffzusammensetzung, die beide Komponenten enthält, können die gleichen immunogenen Mengen angewendet werden. Alternativ kann aufgrund der Synergie der Komponenten, falls vereinigt, die immunogene Menge des frei löslichen Toxoids im Bereich zwischen 100 bis 150 RU und bevorzugter zwischen 100 bis 120 RU liegen. Die immunogene Menge des Bakterin-Toxoids kann in Kombination mit dem freien Toxoid in den unteren O. D.-Bereichen 1 bis 3 und bevorzugter etwa 2 liegen. Bei einem solchen Kombinationsimpfstoff kann das Bakterin-Toxoid auf ungefähr 1,875 O. D. oder Absorptionseinheiten vermindert werden.
Andere geeignete, therapeutisch wirksame Dosen können leicht auf der Basis der vorstehenden immunogenen Mengen, den zu behandelnden Bedingungen und den physiologischen Eigenschaften des Tiers durch den Fachmann bestimmt werden. Es ist bevorzugt, daß der Impfstoff der Erfindung, wenn in einer pharmazeutischen Zubereitung, in Einheitsdosierungsformen vorliegt. Folglich stellt eine pharmazeutische Zubereitung eine Einheitsdosierung zwischen 0,5 und 3 ml einer sterilen Zubereitung, die eine immunogene Menge der Wirkstoffbestandteile enthält, ob der Wirkstoffbestandteil nur das freie Toxoid, nur das zellgebundene Bakterin-Toxoid oder eine Kombination davon ist, bereit. In Anwesenheit von weiteren Wirkstoffmitteln können diese Einheitsdosierungen durch den Fachmann leicht eingestellt werden.
Die gegenwärtig bevorzugte Formulierung, die maximale Synergie zu ergeben scheint, ist Bordetella bronchiseptica, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida Bakterin- Toxoid-Kombination, die ungefähr 100 RU freies Toxoid mit ungefähr 1,875 Absorptionseinheiten an zellgebundenem Toxoid enthält.
Eine günstige Dosierungsvorschrift beinhaltet die Verabreichung von zwei Dosen der gewünschten Impfstoffzusammensetzung, wenn der Antigenanteil (das heißt die immunogene Menge) von jeder Fraktion wünschenswerterweise wie vorstehend ausgewiesen ist. Die Verabreichungsart der erfindungsgemäßen Impfstoffe kann ein beliebiger, geeigneter Weg sein, der den Impfstoff an den Wirt freisetzt. Jedoch wird der Impfstoff vorzugsweise subkutan oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Andere Verabreichungsarten können auch, falls erwünscht, angewendet werden, wie intradermal und intravenös.
Gegenwärtige Untersuchungen mit Schweinen wenden die intramuskuläre Injektion von zwei Dosen Impfstoff an, die an das Tier mit mindestens zwei Wochen Abstand verabreicht wurden. Die Untersuchungen haben gezeigt, daß für jede der vorstehend beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen eine Primärimmunisierung von neugeborenen Tieren wünschenswerterweise etwa im Alter von einer Woche mit einer Auffrischungsdosis im Jungtieralter gestartet wird. Zur primären Immunisierung von trächtigen Muttertieren werden zwei Dosen mit der letzten Dosis, verabreicht zwei Wochen vor dem Werfen, empfohlen. Eine Auffrischungsdosis wird vor jedem anschließenden Werfen empfohlen. Eine halbjährliche Wiederimpfung wird für Eber empfohlen.
Es ist jedoch selbstverständlich, daß der spezielle Dosierungsspiegel für einen beliebigen besonderen Patienten von einer Vielzahl an Faktoren, einschließlich dem Alter, der allgemeinen Gesundheit, Geschlecht und Ernährung des Patienten, der Art des Patienten, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, den synergistischen Effekten mit anderen verabreichten Arzneimitteln und dem vorgesehenen Schutzgrad abhängen wird. Natürlich kann die Verabreichung in geeigneten Intervallen, falls notwendig oder erwünscht, wiederholt werden.
Der spezielle Schutzmechanismus, der durch die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen induziert wird, ist die Induktion von Toxin-neutralisierendem Antikörper (Antitoxin) bei beimpften Tieren, wie durch die nachstehend beschriebenen in-vivo-Tierversuche ausgewiesen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern bevorzugte Verfahren zur Herstellung des freilöslichen Toxoids und Bakterin-Toxoids der Erfindung und die Herstellung und das Testen einer Vielzahl von Impfstoffen, die diese neuen Komponenten enthalten. Diese Beispiele sind nur erläuternd und begrenzen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht.

BEISPIEL 1 - HERSTELLUNG VON PASTEURELLA MULTOCIDATOXOID

A. Züchten des P. multocida

P. multocida, Typ D (Stamm 8) [Dr. Ross Cowart, University of Illinois, Urbana, Illinois], wird in einem modifizierten, chemisch definierten, synthetischen Medium einen Tag subkultiviert. Das Medium wird von Herriott et al., J. Bact., 101: 513-516 (1970) beschrieben.
Der pH-Wert des gesammelten Mediums wird auf 7,3 ± 0,2 mit steriler NaOH eingestellt. Zellen aus dieser Kultur werden auf frisches synthetisches Medium überführt, und diese Kultur wird, wenn gezüchtet, mit einem Cryo-Konservierungsmittel vereinigt und bei -70ºC gelagert. Erzeugungskulturen werden nach Inokulierung während der Inkubation bei ungefähr 36º ± 1ºC für zwischen 3 und 24 Stunden zum Ernten gezüchtet. Der gelöste Sauerstoffgehalt der Kultur wird durch Belüftung mit steriler Luft und durch Bewegen beibehalten. Sterile Antischaum-Lösung wird zur Bekämpfung des Schaums verwendet. Der pH-Wert der Kultur wird bei 7,3 ± 0,2 gehalten.
Am Ende des Wachstumszyklus werden P. multocida-Kulturen geprüft und die Zelldichte wird durch Absorption bei 650 nm bestimmt. Das Rühren wird anschließend verstärkt und Belüftung und pH-Kontrolle werden fortgesetzt.
Der Toxingehalt des Lysats wird durch Maus-Lethalität (LD&sub5;&sub0;) und durch das Enzym-gebundene Immunosorbent-Assay (ELISA), nachstehend in Beispiel 4 beschrieben, gemessen.

B. Vor-Detoxifizierung-Behandlung

Nach der Züchtung des Organismus wird steriles Merthiolat zu der Kultur in einer Menge von weniger als oder gleich 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen gegeben. Kulturflüs sigkeiten können aseptisch durch geschlossene Verbindungen zu einem sterilen, geschlossenen Behälter überführt werden. Der Behälter wird durch geschlossene Rohrverbindungen an eine zur physikalischen Lysis der Zellen verwendeten Apparatur angeschlossen und der Zellinhalt freigesetzt, beispielsweise ein "GAULIN" Modell 15M Laborhomogenisator.
Bakterielle Zellen in der Kulturflüssigkeit werden durch kontinuierliches Durchleiten durch die Druckkammer des Homogenisators lysiert. Dies setzt die Zellen einem unmittelbaren Druckabfall von zwischen dem anfänglichen Druck von zwischen 2000 und 5000 psi bis Umgebungsdruck von 15 psi aus. Die lysierten Zellen werden in einem weiteren, geschlossenen Behälter aseptisch gelagert.
Das Lysat wird durch aufeinanderfolgende Schritte von Zentrifugierung und/oder mikroporöser Filtration geklärt. Die geklärten Lösungen können vor oder nach Filtersterilisation konzentriert werden. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Menge bis zu einer Endkonzentration von 5 mM und Glycerin in einer Menge bis zu einer Endkonzentration von 1,0% (Volumen/Volumen) werden vor dem Konzentrieren und Sterilfiltrieren zugesetzt, um Aggregation der konzentrierten Proteine zu verhindern.

C. Detoxifizierung

Sterile 5 N NaOH wird langsam und aseptisch zu sterilem Toxin gegeben, um den pH-Wert auf ungefähr 10,55 ± 0,10 pH-Einheiten zu erhöhen. Bei diesem pH-Wert tritt die Detoxifizierung auf, wenn das Gemisch bei ungefähr 15º ± 1ºC langsam für zwischen 15 und 24 Stunden gerührt wird. Der pH-Wert wird nicht eingestellt, nachdem die Detoxifizierung vollständig ist, oder aliquote Mengen werden genommen, um die Resttoxizität zu messen. Sterile 5 N HCl wird dann langsam und aseptisch zugesetzt, um den pH-Wert auf 6,80 ± 0,20 pH-Einheiten einzustellen.
In Zwei-Stunden-Intervallen, beginnend 16 Stunden, nachdem der pH-Wert auf 10,55 eingestellt wird, wird eine aliquote Menge genommen. Restliche Toxizität von jeder aliquoten Menge wird gemessen und in Maus-LD&sub5;&sub0; pro ml ausge drückt. Eine Zubereitung mit einem Anfangswert von nahezu 10000 LD&sub5;&sub0; pro ml wird gewöhnlich 18 Stunden nach dem Einstellen des pH-Werts auf 10,55 detoxifiziert, ohne nennenswerte Abnahme des bestimmbaren Antigengehalts. Anschließend wird der pH-Wert auf 6,80 ± 0,1 Einheiten mit 5N HCl eingestellt. Das Toxoid wird dann bis zur Vereinigung mit anderen. Komponenten und Zusammenfügen zu Impfstoffzusammensetzungen bei 2º bis 7ºC gelagert. Wenn die Injektion der Mäuse eine Resttoxizität zeigt, wird der pH-Wert der Zubereitung erneut auf 10,55 und die Temperatur auf 15ºC angehoben. Nach einigen Stunden wird, in Abhängigkeit vom nachgewiesenen Toxizitätsgrad, die Zubereitung neutralisiert, abgekühlt, gelagert und ein weiteres Mal getestet.

BEISPIEL 2 - IMPFSTOFF-FORMULIERUNG

Eine erläuternde, toxoide Impfstofformulierung gemäß der Erfindung wurde durch Zubereiten des wie vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen, löslichen, freien Toxoids hergestellt.
Der zur Herstellung der Impfstoffzusammensetzungen verwendete Puffer ist sterile Salzlösung mit einem neutralen pH-Wert. Steriles Aluminiumhydroxidgel wird als Adjuvans verwendet und in einer zum Adsorbieren von Toxoid, im allgemeinen 12% ± 1% (Volumen/Volumen), ausreichenden Menge zugesetzt. Die Impfstoffzusammensetzungen werden durch sorgfältiges Vermischen, dann Füllen der ausgewiesenen Menge Toxoid und Aluminiumhydroxidgel in ein 500 ml-Becherglas hergestellt. Sterile Salzlösung wird dann zugesetzt. Dieses Gemisch wird gerührt und bei 4ºC gelagert. Dosierungsmengen von 2 ml/Dosis sind erwünscht, die etwa 450 relative Toxoid-Einheiten pro Dosis bereitstellen.
Tabelle I erläutert die Formulierung von zwei freien Toxoid-Impfstoffen gemäß der Erfindung. Tabelle I
Diese freien Toxoid-Impfstofformulierungen sind als Hilfe bei der Verhinderung von atrophischem Schnupfen bei Schweinen, verursacht durch P. multocida-Infektionen, verwendbar. Ein beispielhafter Test des freien Toxoid-Impfstoffs wird durch Einspritzen der Formulierungen in Schwein (Ferkel und Muttertiere) wie nachstehend beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 3 - IMPFVERSUCHE

Unter Verwendung der Formulierungen vom Beispiel 2 wurden Impfungen intramuskulär an zufällig ausgewählte Ferkel und Muttertiere gemäß den nachstehenden Vorschriften verabreicht. Bei jedem Test nach der Impfung wurden die Tiere mit gereinigtem Toxin bei einer bekannten Dosis, um vollständig klinische Kennzeichen von atrophischem Schnupfen in Ferkeln zu induzieren, exponiert. Die Toxizität von DNT wurde in Mäusen vor und nach der Exposition bewertet. Die Gesamtdosis von Toxin, die jedes Ferkel erhielt, betrug 8,4 ug oder 50 Maus LD&sub5;&sub0;. Das Toxin wurde in drei gleichen Dosen über einen Zeitraum von drei Tagen, beginnend ungefähr zwei Wochen nach der Impfung, verabreicht.
Die Ergebnisse der Exposition wurden ungefähr 28 Tage nach der ersten Dosierung von Toxin bewertet. Die prozentuale Gewichtszunahme wurde durch die Anzahl an Pfund, die in 28 Tagen nach der Exposition zugenommen wurden, dividiert durch das Gewicht in Pfund bei der Exposition, berechnet. Nasenmuschelatrophie wurde durch Querschnitt der Schnauze am ersten premolaren Zahn wie nachstehend bewertet: Bewertung 0 normal, Bewertung 1 minimale Atrophie, Bewertung 2 mittlere Atrophie, Bewertung 3 wesentliche Atrophie, Bewertung 4 nahezu vollständige Atrophie und Bewertung 5 vollständige Atrophie.
Protokoll I: Vier Jungsäue wurden mit einer 2 ml Dosis von P. multocida freiem Toxoid (A), beschrieben vorstehend im Beispiel 2, beimpft. Zwei Jungsäue verwarfen aufgrund der Infektion von Schweine-Parvovirus und wurden aus der Anlage entfernt, sobald die Krankheit klar war. Durch die zwei verbleibenden Jungsäue geborene Ferkel wurden im Alter von 13 Tagen (Jungsau 637,7 Schweine) und im Alter von 9 Tagen (Jungsau 638,4 Schweine) mit einer Dosis von 2 ml P. multocida freiem Toxoid (B), beschrieben im Beispiel 2, beimpft. Zweite Impfungen wurden an alle Schweine zwei Wochen später verabreicht. Die Schweine wurden mit einer Dosis von Toxin zwei Wochen nach der zweiten Impfung exponiert. Die Jungsäue aus der gleichen Herde mit den Wurfdaten, die den beimpften Jungsäuen ähnlich sind, wurden gleichzeitig als unbeimpfte Kontrollschweine bereitgestellt.
Nach der Exposition wurden beimpfte und unbeimpfte Kontrollschweine vermischt, bis sie zur Endbewertung geschlachtet wurden. Tabelle II erläutert die Wirkungen der Exposition auf Schweine, die von mit zwei Dosen Impfstoff A beimpften Muttertieren geworfen wurden und die selbst (VX) mit zwei Dosen von freiem Toxoid-Impfstoff B beimpft wurden, verglichen mit unbeimpften (NonVX) Tieren. Diese Ergebnisse zeigen signifikant geringere Rüsselbewertungszahlen und signifikant bessere Gewichtszunahmen in den beimpften Gruppen. Tabelle II
Protokoll II: Vier Jungsäue wurden mit einer 2 ml Dosis Impfstoff A geimpft. Eine Jungsau verwarf aufgrund einer Infektion von Schweine-Parvovirus und wurde aus der Anlage entfernt, sobald die Krankheit klar war. Ferkel von den verbleibenden Jungsäuen wurden mit Toxin wie nachstehend exponiert: 9 Ferkel von einer Jungsau 10 Tage alt, 2 Ferkel von einer zweiten Jungsau 12 Tage alt und 6 Ferkel von einer dritten Jungsau 4 Tage alt. Die Jungsäue von der gleichen Herde mit Wurfdaten, ähnlich zu den geimpften Säuen, stellten gleichzeitig ungeimpfte Kontrollschweine dar.
Geimpfte und ungeimpfte Kontrollferkel wurden vor dem Entwöhnen exponiert und anschließend vermischt, bis sie zur Endbewertung geschlachtet wurden. Tabelle III faßt die Wirkungen der Exposition auf von den trächtigen Tieren geworfene Ferkel zusammen, die zwei Dosen Impfstoff A erhielten. Die Daten werden wiedergegeben (a) unabhängig vom Wurf und (b) gemittelter Wurf.
Diese Ergebnisse zeigen signifikant geringere Bewertungszahlen für den Rüssel und signifikant bessere Gewichtszunahmen in der geimpften Gruppe. Diese Beobachtungen weisen aus, daß zwei Dosen Impfstoff A, gegeben an trächtige Tiere, die Herstellung von Antitoxin induzierten, welches passiv an andere krankheitsempfängliche Ferkel übertragen wurde. Des weiteren war die Dauer des passiven Schutzes mindestens 10 bis 12 Tage. Tabelle III

BEISPIEL 4 - ELISA, UM ANTIKÖRPER QUANTITATIV ZU BESTIMMEN

Ferkelseren und Vormilchproben von den Versuchen von Beispiel 3 wurden auf Antikörper gegen das Toxin durch einen kinetischen ELISA getestet. Es wurde gereinigtes Toxin (250 ng/Vertiefung) in 0,1M Natriumborat, pH 9,1, an Flachboden 96-Vertiefungen-Nunc-Mikrotiterplatten über Nacht bei 4ºC adsorbiert. Die Platten wurden dann bei 37ºC 30 Minuten mit 10% nichtfetter Trinkmilch in PBS mit 0,05% Tween-20 (Blockierungspuffer) blockiert. Blockierungspuffer wurde von den Platten mit zwei-PBS/0,05% Tween-20 (PBS/Tween)-Spülungen gespült, gefolgt von einer PBS-Spülung. Die Seren wurden 1 : 100 in Blockierungspuffer verdünnt und 50 ul-Proben wurden zu jeder der vier Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 60 Minuten bei 37ºC inkubiert und anschließend wie vorstehend gespült.
Ziege-anti-Schwein IgG (schwere und leichte Kette spezifisch)-Meerrettich-Peroxidase [Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD] wurde mit 1 : 500 in Blockierpuffer verdünnt und zu jeder Vertiefung (50 ul) gegeben. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37ºC wurden die Platten wie vorstehend gespült. ABTS-Substrat (2,2'-Aminodi-3-ethylbenzthiazolinsulfonat) [Kirkegaard and Perry] wurde zugegeben und die Platten wurden sofort auf einem Vmax-ELISA-Reader bei 405 nm [Molecular Devices Corporation, Palo Alto, CA] gelesen. Jede Vertiefung wurde achtmal während eines ein-Minuten-Intervalls gelesen und die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion wurde berechnet.
Die Geschwindigkeiten wurden als die Veränderung in Milli-Einheiten an optischer Dichte (mOD) pro Minute berechnet. Somit würde ein Lesen von 100 mOD pro Minute gleich einer OD von 1,0 in 10 Minuten sein. Die Werte wurden dann für die Menge an pro Vertiefung verwendetem Serum korrigiert und als mOD/min/ml Serum aufgetragen. Beispielsweise, wenn 50 ul Serum eine Ablesung von 100 mOD/min erzeugten, würde der wiedergegebene Wert 2000 mOD-Einheiten/min/ml sein.
Die nachstehenden Kontrollen wurden auf jeder ELISA- Platte eingeschlossen. (1) Serumkontrolle: Jedes verdünnte Ferkelserum wurde in eine Vertiefung gegeben, die kein Antigen enthielt, dann allen anschließenden Reagenzien exponiert, um die nichtspezifische Adsorption zu der Platte zu überprüfen. Bei der Verdünnung des verwendeten Ferkelserums (1 : 100) wurde keine Farbe beobachtet, die stärker ist als jene in der negativen Serumkontrolle erhaltene. (2) Negative Ferkelserum kontrolle: Jede Platte schloß drei Vertiefungen eines bekannten negativen Ferkelserums, verdünnt 1 : 100 in Blockierpuffer ein. (3) Positive Ferkelserumkontrollen: Serum, enthaltend spezifische Antikörper auf das Toxin, wurden in negativem Schweineserum verdünnt, unter Gewinnung von Sera, die hohe, mittlere und geringe Konzentrationen an spezifischem Antikörper enthalten. Diese drei Sera wurden 1 : 100 in Blockierpuffer verdünnt und in dreifacher Ausführung auf jede Platte gegeben. Hintergrund oder nicht spezifische Reaktivität wurden in Vertiefungen bestimmt, die alle Reagenzien, außer Ferkelserum, enthielten.
Nachstehende Tabelle IV faßt die ELISA-Titer der Muttertiere und Ferkel, die mit Toxoid-Impfstoffen A bzw. B gemäß Protokoll II (Beispiel 4) beimpft wurden, zusammen. Die Tabelle gibt die geometrischen mittleren Titer von Sera, die vor den ersten und zweiten Muttertier-Impfungen der Vormilch genommen wurden und von Seren, die vor den ersten und zweiten Ferkel-Impfungen, Exposition und Schlachtung, verglichen mit unbeimpften Kontrollen (Non-Vx), genommen wurden. Tabelle IV Geometrische mittlere ELISA-Titer
Diese Ergebnisse weisen aus, daß zwei Dosen Impfstoff A, gegeben an Muttertiere, gefolgt von zwei Dosen an Impfstoff B, gegeben an ihre Ferkel, Immunität zu dem Toxin bei anderen krankheitsempfängliche Schweine induzierten.
Aus der gleichen Untersuchung (Protokoll II, Beispiel 4) faßt Tabelle V die ELISA-Titer von beimpften (Impfstoff A) und unbeimpften Muttertieren und deren unbeimpften Ferkel zusammen. Tabelle V Geometrischer Mittelwert der ELISA-Titer
Tabelle VI zeigt eine Zusammenfassung von Expositions-Immunitäts-Studien für Muttertier und Ferkel, beimpft mit verschiedenen Dosen (in relativ toxoiden Einheiten, RU) von freien Toxoid-Zubereitungen. Tabelle VI
Die Daten zeigen signifikanten Schutz von Schweinen, geworfen von Muttertieren, die mit zwei Dosen eines Impfstoffs, enthaltend 876 ± 32 RU an freiem Toxoid, beimpft wurden. Bei Ferkeln oder trächtigen Jungsäuen schienen zwei Dosen von experimentellen Mengen, die zwischen 300 und 400 RU/Dosis enthielten, keinen Schutz zu induzieren.

BEISPIEL 5 - HERSTELLUNG EINER BAKTERIN-TOXOID-IMPFSTOFFZUSAMMENSETZUNG

Eine Ausführungsform dieser Zusammensetzung schließt ein Bakterin-Toxoid von P. multocida ein, in dem das Toxoid innerhalb der bakteriellen Zelle stabilisiert war.
Eine Kultur von P. multocida, Typ D, Stamm 8, wird in dem nachstehenden Medium wachsen lassen: Tryptische Sojabohnenbrühe ohne Dextrose (Difco) 30 g, Hefeextrakt (Difco) 5 g, Dextrose 4 g, desionisiertes Wasser 1 l, pH-Wert ungefähr 7, sterilisiert durch Autoklavenbehandlung bei 121ºC.
Die Kultur wird mit Rühren, unter Halten der gelösten Sauerstoffkonzentration bei ungefähr 35% Sättigung, belüftet. Die Temperatur wird bei 37ºC und der pH-Wert bei 7 falls erforderlich durch die Zugabe von 10 N NaOH-Lösung gehalten. Gegen Ende des exponentiellen Wachstums wird die Belüftung unterbrochen und die Kultur wird durch die Zugabe von Formaldehydlösung (USP) zu einer Endkonzentration von 0,5% Volumen/Volumen inaktiviert. Die Kultur wird dann bei 37ºC vier Tage gehalten. Andere inaktivierende Mittel, wie beta-Propiolacton, Glutaraldehyd und binäres Ethylenamin, können anstelle von Formaldehyd verwendet werden.
Eine Probe wird gezogen, um zu untersuchen, ob Inaktivierung durch Verabreichen der Probe an Meerschweinchen vollständig ist. Die Meerschweinchen sollten am Leben sein und 7 Tage nach subkutaner Injektion mit 4 ml Volumen der Kultur gesund sein. An diesem Punkt wird das Toxin innerhalb der Zellen vollständig zu Toxoid umgewandelt, das sicher, sehr stabil und in der Lage ist, die Erzeugung von neutralisierenden Antitoxinen nach der Injektion an Tiere zu induzieren.
Die inaktivierte Kultur wird zentrifugiert. Die abgesetzten Bakterien werden in ausreichend Überstandsflüssigkeit gegeben, unter Herstellung einer Suspension mit einer OD von 4.2. Die Suspension wird dann mit Al(OH)&sub3;-Gel adsorbiert, 25% Volumen/Volumen, Thimerosol (0,01% Gewicht/Volumen) wird als Konservierungsmittel zugegeben und der pH-Wert auf 6,5 ± 0,2 eingestellt.
Das P. multocida Bakterin-Toxoid kann in Impfstoffen als einzelne Impfstoffkomponente verwendet werden. Alternativ kann das Bakterin-Toxoid in Impfstoffzusammensetzungen mit anderen Impfstoffkomponenten angewendet werden. Ob das Bakterin-Toxoid nun einzeln oder in Kombination angewendet wird, Saponin (0,5 mg/ml) kann jedenfalls als Adjuvans zugesetzt werden.
Ein Beispiel eines Kombinationsimpfstoffs enthält eine Suspension von adsorbiertem P. multocida (O. D. 7.5 vor Adsorption), gemischt mit gleichen Volumina von ähnlich adsorbierten und konservierten Kulturen von Bordetella bronchiseptica (O. D. 4.2 vor der Adsorption) und Erysipelothrix rhusiopathiae (O. D. 7.5 vor Adsorption). Dieser Bakterin-Toxoid- Impfstoff, bezeichnet als Atrobac 3 (Beecham Laboratories), weist ein Dosisvolumen von 2 ml auf.

BEISPIEL 6 - EIN KOMBINATIONSIMPFSTOFF

Kombinationsimpfstoffe können das Bakterin-Toxoid vom Beispiel 5 und/oder das lösliche Toxoid vom Beispiel 1 mit möglichen Komponenten, wie anderen inaktivierten Mikroorganismen, beispielsweise B. bronchiseptica, und anderen Stämmen von P. multocida (P. multocida Serotyp A zum Schutz gegen pleuritische und pneumonische Formen von Pasteurellose) enthalten.
Ein beispielhafter Kombinationsimpfstoff wendet das im Beispiel 5 beschriebene P. multocida Bakterin-Toxoid und das im Beispiel 1 beschriebene P. multocida freie Toxoid an. Anderer Kombinationsimpfstoff kann das freie Toxoid und Bakterin-Toxoid vom P. multocida-Typ D, vorstehend beschrieben, mit einer inaktivierten ganzen Kultur von B. bronchiseptica einschließen.
Eine weitere wirksame Impfstoffzusammensetzung gegen die Infektion durch P. multocida kann durch Vereinigen der Bakterin-Toxoid-Impfstoffzusammensetzung Atrobac 3, vorstehend im Beispiel 5 beschrieben, und des löslichen, freien Toxoids von P. multocida, hergestellt wie vorstehend im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt werden.
Eine beispielhafte Formulierung für einen Kombinationsimpfstoff besteht aus den nachstehenden Komponenten:
Zur Emulgierung wurden diese Komponenten vereinigt und als einzelne Charge für 2 Minuten emulgiert. Es wird vorweggenommen, daß im Produktionsmaßstab eine Dosierung im laufenden Verfahren eher erwünscht ist als chargenweise Vereinigung.
Andere Bestandteile können zugegeben werden oder können vorliegende Bestandteile in der vorstehenden, spezifischen Formulierung ersetzen. Beispielsweise kann Aluminiumhydroxidgel anstelle von Öl/Lecithin als Adjuvans angewendet werden.

BEISPIEL 7 - EIN KOMBINATIONSIMPFSTOFF

Ein weiterer Kombinationsimpfstoff wurde wie nachstehend hergestellt: B. bronchiseptica, Stamm 2-9 NADC [National Animal Disease Center, Ames, Iowa] wurde sechsmal subkultiviert. P. multocida, Typ A, Stamm 169, wurde in ähnlicher Weise zu jener für Stamm 8 in Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Beispielsweise werden am Ende für deren entsprechenden Wachstumsperioden Kulturen von B. bronchiseptica und P. multocida, Typ A, Stamm 169, durch die Zugabe von beta-Propiolacton (BPL) inaktiviert. Eine zweite Zugabe von BPL erfolgt 2 bis 18 Stunden, gefolgt von der ersten. Die Endkonzentration von BPL übersteigt 1 : 500 (0,2%) nicht. Jede Kultur wird mit weniger als 20ºC bei konstantem Rühren für mindestens 12 Stunden inkubiert.
Für inaktivierte Kulturen von B. bronchiseptica und P. multocida, Typ A, Stamm 169, wird steriles Mineralöl [Drakeol], enthaltend 3,3% bis 40 Gewichtsprozent Lecithin [Central Soya], als Adjuvans zugesetzt. In dem Endprodukt ist die Konzentration der Ölfraktion ungefähr 5 Volumen%. Tween 80 wird zu einer Endkonzentration von zwischen 0,7 und 2,8% zugesetzt. Ein Emulgator wird zu einer Endkonzentration von etwa 0,3 bis 1,2% (z. B. Span 80) zugesetzt. Ein ausgewähltes Paraben, z. B. p-Hydroxylbenzoesäuremethylester, p-Hydroxylbenzoesäurepropylester oder p-Hyroxylbenzoesäurebutylester, können als weitere Konservierungsmittel zugesetzt werden.
Das P. multocida freie Toxoid wird mit sterilem Aluminiumhydroxidgel (äquivalent 2% Al&sub2;O&sub3;) als Adjuvans zugesetzt. In dem Endprodukt ist die Konzentration an Aluminiumhydroxidgel 12 Volumen%.
Die Konzentration wird durch Ultrafiltration unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
In einem beispielhaften Kombinationsimpfstoff enthält die B. bronchiseptica-Fraktion mindestens 1500 nephelometrische Einheiten pro Impfstoffdosis. Die nephelometrischen Einheiten basieren auf dem mit der Zeit der Ernte gemessenen Wert. Die P. multocida, Typ A, Stamm 169-Fraktion enthält mindestens 3, 4 Absorptionseinheiten pro Dosis. Die Absorptionseinheiten basieren auf dem Wert, gemessen mit der Inaktivierungszeit. Die P. multocida freie Toxoidfraktion enthält mindestens 450 relative Toxoideinheiten pro 2,0 ml Dosis. Relative Toxoideinheiten werden vor der Endproduktzusammenstellung gemessen.
Eine oder mehrere vollständige oder teilweise Menge(n) von jeder Fraktion werden mit Adjuvans und Salzverdünnungsmittel vereinigt, unter Gewinnung der Standard-Antigenkonzentration.
Diese Fraktionen werden vor der letztlichen Zusammenstellung durch Kombinieren von B. bronchiseptica und P. multocida, Typ A, Stamm 169-Komponenten (Fraktion I), Herstellen der freien Toxoidformulierung (Fraktion II) und Vereinigen von Fraktionen I und II (Impfstoff) in den in nachstehender Tabelle VII gezeigten Verhältnissen formuliert. Tabelle VII

BEISPIEL 8 - IMPFSTOFFTESTS IN TIEREN

Die Impfstoffzusammensetzungen von Beispielen 2, 5, 6 und 7 sind bei der Verhinderung von atrophischem Schnupfen und Pneumonie in Schweinen, verursacht durch B. bronchiseptica und/oder P, multocida, verwendbar. Während der Impfstofftests wurde überraschenderweise bei der Bewertung der Antikörperreaktion im Schwein beobachtet, daß Vereinigen des P. multocida, Bakterin-Toxoids, und freien Toxoids mehr als eine additive Wirkung auf die Einführung von Antitoxin aufwies, verglichen mit der Verwendung des Bakterin-Toxoids allein oder des freien Toxoids allein.
In einem Versuch wurden Gruppen von Schweinen mit Atrobac 3, das das P. multocida-Bakterin-Toxoid enthielt und konservierte Kulturen von B. bronchiseptica und E. rhusiopelothrix (Beispiel 5) enthielt; oder mit dem freien löslichen P. multocida-Toxoid vom Beispiel 1 allein oder mit einer Kombination von Bakterin-Toxoid und löslichem Toxoid, wie im Beispiel 6 beschrieben, beimpft. Tabelle VIII zeigt Antikörperreaktion auf Impfstoff mit freiem Toxoid allein, mit Bakterin-Toxoid allein und mit einer Kombination dieser zwei Impfstoffkomponenten. Die ELISA-Titer weisen eine synergisti sche Wirkung dieses Kombinationsimpfstoffs aus. Von dieser Kombinationsimpfstoff-Zusammensetzung wird angenommen, daß sie die beste Immunität im Schwein induziert.
Die Nachimpfstoff-Seren wurden ebenfalls auf neutralisierendes Antitoxin, dem eigentlichen Schutzantikörper, durch das Verfahren von Roberts und Swearingin, Am. J. Vet. Res., 49: 2168 (1988) bewertet. Die Antitoxinwerte zeigen eine starke Synergie der freien und zellgebundenen Toxoide (Tabelle VIII).
Tabelle IX zeigt die Ergebnisse eines anderen Versuchs, worin ein Impfstoff, enthaltend Ganzzellen-inaktivierte Kulturen von P. multocida (PmD), lösliches Toxoid und B. bronchiseptica, inaktiviertes Ganzzellen (Bb), in Meerschweinchen und Serum-Antikörper-Anteile, gemessen durch EBL- Gewebskulturbestimmung [J. M. Rutter et al., Veterinary Record, 114: 393-396 (1984)], verwendet wurde. In diesem Versuch ist die Kombinationsimpfstoff-Dosierungseinheit 2 ml/Dosis. In diesem Versuch konnte 600 RU-Toxoid keine nennenswerte Anti-Toxin-Reaktion induzieren. Im Gegensatz dazu induzierten 600 RU Toxoid, vereinigt mit inaktivierten Kulturen von P. multocida (PmD), einen Anti-Toxin-Reaktionsspiegel von 128. Diese Erläuterung dient als ein weiteres Beispiel der immunologischen Synergie von löslichem Toxoid und inaktivierten Kulturen von toxigenem P. multocida. Tabelle VIII Tabelle IX

BEISPIEL 9 - EIN KOMBINATIONSIMPFSTOFF

Eine weitere Ausführungsform für eine Impfstoffzusammensetzung dieser Erfindung schließt einen Kombinationsimpfstoff, enthaltend ein B. bronchiseptica-Bakterin, ein P. multocida-Toxoid von Beispiel 1, ein P. multocida, Typ A, Stamm 169-Bakterin, beschrieben im Beispiel 7, und ein E. rhusiopathiae-Bakterin, ein. Dieser Impfstoff ist für die Impfung von gesundem Schwein als eine Hilfe bei der Verhinderung von atropischem Schnupfen, Erysipel und Lungenentzündung, verursacht durch B. bronchiseptica, Erysipelothrix rhusiopathiae und P. multocida verwendbar.
Kulturen von B. bronchiseptica und P. multocida, Typ A, Stamm 169, werden inaktiviert und einzeln zu Fraktionen, wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben, formuliert.
Kulturen von E. rhusiopathiae-Stamm SE-9 [Dellen Labs, Omaha, Nebraska] werden durch die Zugabe einer Formaldehydlösung (37 Prozent) zu einer Endkonzentration von 0,35 bis 0,45 Prozent inaktiviert. Die E. rhusiopathiae-Fraktion wird in Aluminiumhydroxidgel, wie für die freie Toxoidfraktion beschrieben, formuliert.
Das freie Toxoid wird hergestellt und formuliert wie vorstehend in Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Konzentration wird durch Ultrafiltration unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
Jede Fraktion wird mit Adjuvans und Salzlösungsverdünnungsmittel vereinigt, unter Gewinnung der Standard-Antigenkonzentration. Diese Fraktionen werden vor der Endvereinigung durch Kombinieren von B. bronchiseptica und P. multocida, Typ A, Stamm 169-Komponenten (Fraktion III), Herstellen des freien Toxoids und E. rhusiopathiae-Komponenten (Fraktion IV) und Vereinigen von Fraktionen III und IV (Impfstoff) in den in nachstehender Tabelle X gezeigten Verhältnissen formuliert. Tabelle X
Jede Dosis an Impfstoff enthält mindestens 1500 nephelometrische Einheiten B. bronchiseptica, mindestens 3.0 Absorptionseinheiten von E. rhusiopathiae, mindestens 3,4 Absorptionseinheiten bei 650 nm von P. multocida, Typ A, Stamm 169 und mindestens 450 relative Einheiten an P. multocida-Toxoid. Die Absorptionseinheiten basieren auf dem mit der Zeit der Ernte gemessenen Wert.

BEISPIEL 10 - IMPFSTOFF-WIRKSAMKEITSVERSUCHE

Fünf experimentelle Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung wurden auf ihre Wirksamkeit in Tieruntersuchungen unter Verwendung der pathogenen Exposition von beimpften und unbeimpften Tieren bewertet. Die experimentellen Impfstoffe werden im wesentlichen wie vorstehend beschrieben und ein schließlich der nachstehenden aktiven Komponenten, wie in nachstehender Tabelle XI ausgewiesen, formuliert. Tabelle XI

I. P. multocida Typ A-Exposition

Ein Versuch wurde wie nachstehend ausgeführt: Am Tag 1 und Tag 14 wurden zehn Ferkel mit einer 2 ml-Dosis von Impfstoff C und zehn Ferkel mit einer 2 ml-Dosis von Impfstoff D beimpft. Zwei Wochen nach der zweiten Inokulierung wurden diese Ferkel und zehn gleichalterige unbeimpften Kontrollen mit P. multocida Stamm 169 infiziert. Die Schwere der Erkrankung wurde durch klinische Bewertung bei Tod oder zwei Wochen nach Infektion (Tabelle XII) quantifiziert. Tabelle XII
Tabelle XIII faßt die Agglutinin-Reaktionen [geometrischer mittlerer Titer (GMT)], der drei Gruppen an P. multocida bei ersten und zweiten Impfungen, bei der Exposition und beim Tod oder bei der Schlachtung zusammen. Tabelle XIII
Nach der Exposition waren die klinischen Anzeichen bei den befallenen Ferkeln durchgehend schwer. Vorherrschende klinische Anzeichen schließen Tod (oder Morbidität), Lähmung und Pleuritis und Pericarditis mit fibrinösen Ablagerungen und Anhaftungen ein. Diese Anzeichen sind bei allen Ferkeln, mit Ausnahme jener, die mit Impfstoff C beimpft sind, reichlich vorhanden. Von den zehn Ferkeln, denen Impfstoff C gegeben wurde, wurde wesentlicher Schutz bei neun deutlich. Bezogen auf diese Beobachtungen induzierten zwei Dosen Impfstoff C, gegeben an befallene Schweine, Immunität gegen Exposition mit P. multocida Typ A.
II. Toxin-Exposition
Ein weiterer Versuch wurde wie nachstehend durchgeführt. Am Tag 1 und Tag 15 wurden fünf trächtige Muttertiere mit Impfstoff D (2 ml Dosis) und fünf mit Impfstoff E (2 ml Dosis) beimpft. Werfen begann etwa zwei Wochen danach. Fünf Ferkel von jedem der zehn beimpften Muttertiere und fünf Ferkel von unbeimpften Muttertieren wurde eine 2 ml Dosis Impfstoff E gegeben. Beim Entwöhnen wurden beimpfte Ferkel und unbeimpfte Ferkel (geworfene Tiere für zu beimpfende Schweine, geworfen von unbeimpften Muttertieren) Toxin exponiert. Einen Monat später wurden die Ferkel auf klinisches Anzeichen von atrophischem Schnupfen bewertet.
Eine Zusammenfassung von Gewichtszunahmen und Rüsselbewertungszahlen für jede Gruppe wird in nachstehender Tabelle XIV gezeigt. Tabelle XIV Gruppen-Mittelwerte
Gruppe 1: Beimpft: Muttertiere - Impfstoff D; Ferkel - Impfstoff E
Gruppe 2: Beimpft: Muttertiere - Impfstoff E; Ferkel - Impfstoff E
Gruppe 3: Beimpft: Muttertiere - Keines; Ferkel - Impfstoff E
Gruppe 4: Unbeimpft: Muttertiere und Ferkel
Gruppe 5: Kontrolle
Ferkel in Gruppen 3, 4 und 5 wurden von üblichen Muttertieren geworfen
** Werte berechnet unter Verwendung von nur Schweinen, die die Exposition überlebten
*** Werte berechnet einschließlich Schweinen, die nicht die Exposition überlebten.
Schweine in Gruppen 1 und 2 (Tabelle XIII) legten 37,72 und 37,52 Pfund pro Wurf oder 179,11 bzw. 191,80 Prozent zu. Befallene Schweine, Gruppen 3 und 4, nahmen 29,67 bzw. 31,00 Pfund oder 138,97 bzw. 144,91 Prozent zu. Die Differenz der Gewichtszunahmen für krankheitsempfängliche Schweine (Gruppen 3 und 4, n = 35) wurden mit Gewichtszunahmen für beimpfte und geschützte Ferkel (Gruppen 1 und 2, n = 50) durch Student "t"-Test verglichen. Der Unterschied war sehr stark signifikant (p < < 0,0005), was eine erhöhte Gewichtszunahme für Gruppen 1 und 2 (Tabelle XIII) zeigt. Die Rüsselbewertungen für befallene Schweine (Gruppen 3 und 4) wurden mit jenen für Schweine in Gruppen 1 und 2 verglichen. Es gibt eine deutliche Abnahme der Zerstörung von Nasenmuscheln in Gruppen 1 und 2. Der Unterschied war stark signifikant (Student "t" Test: p < 0,0005). Gemäß der Analyse der Gewichtszunahme und Nasenmuschelbewertungen wurden die Schweine in Gruppen 1 und 2 von der Exposition mit Toxin (Tabelle XIV) geschützt.
Serumproben wurden unmittelbar vor jeder Muttertier- und Ferkelbeimpfung von beim Werfen den Muttertieren entnommen, von Ferkeln, wenn mit Toxin (chal) exponiert und von Ferkeln, wenn Anzeichen von AR festgestellt wurde (Schlachten). Tabelle XV faßt die Antikörpertiter der Muttertiere und Ferkel in verschiedenen Behandlungsgruppen zusammen. N/A bedeutet, daß die Daten nicht verfügbar sind. Tabelle XV Geometrischer mittlerer Titer (GMT) für jede Fraktion für Seren, die vorher oder nachher genommen wurden:
In Tabelle XV bedeutet das Symbol Bb B. bronchiseptica, PmA bedeutet P. multocida Typ A, Stamm 169 und PmD be deutet P. multocida-Toxin. Die Impfstoffgruppierungen werden in Tabelle XIV definiert.
Diese Ergebnisse zeigen, daß zwei Dosen Impfstoff E Antikörper gegen Toxin nicht induzieren, wenn an Ferkel von nicht beimpften Muttertieren gegeben. Diese Ferkel verblieben krankheitsempfänglich bis zur Exposition mit Toxin. Im Gegensatz dazu induzierten zwei Dosen Impfstoff E Antikörper zu Toxin bei Ferkeln, die von beimpften Muttertieren geworfen wurden. Aus diesen Daten geht hervor, daß die Impfung von Muttertieren und Ferkeln mit Toxoid Schweine gegen das Toxin von P. multocida immunisiert.

III. Exposition von E. rhusiopathiae

Ein weiterer Versuch wurde wie nachstehend durchgeführt: Am Tag 1 und Tag 14 wurden acht Ferkel mit Impfstoffen F und G (siehe Tabelle XI) beimpft. An den gleichen Daten wurden acht Schweine mit zwei Dosen von Impfstoff E beimpft. Am Tag 1 wurden vier Ferkel mit einer einzelnen Dosis Erysipelothrix-Bakterin beimpft. Etwa am Tag 30 wurden die Ferkel mit virulentem E. rhusiopathiae exponiert.
Eine Zusammenfassung der Reaktion auf die Exposition wird in nachstehender Tabelle XVI wiedergegeben. Tabelle XVI Anzahl
¹ Beimpft: Einzeldosis eines Versuchs-Erysipelothrix rhusiopathiae-Bakterins. Ferkel in dieser Gruppe dienten als positive Kontrolle.
² Beimpft: 2 Dosen Impfstoff E (kein Erysipelothrix).
Ferkel in dieser Gruppe dienten als befallene Kontrollen für die Exposition mit virulentem E. rhusiopathiae und als Ver gleich von serologischer Reaktion von unreagierten Fraktionen.
³ Befriedigender Schutz von beimpften Tieren, wie in 9 CFR § 113.04(e) definiert.
&sup4; Befriedigende Erkrankung beim befallenen Schwein;
beispielsweise unbeimpfte Kontrollen, wie in der gleichen Regulierung definiert.
Die Ergebnisse in Tabelle XVI zeigen, daß mindestens 75% der befallenen Tiere klinische Symptome von Erysipel zeigten, was die Exposition bestätigt. Mindestens 75% der mit zwei Dosen Impfstoffen F oder G beimpften Tiere waren ohne klinische Symptome von Erysipel. Diese Ergebnisse zeigen, daß zwei Dosen an Impfstoffen F oder G wirksamen Schutz gegen Exposition mit virulentem E. rhusiopathiae bereitstellen.
Am Ende des Beobachtungszeitraums wurden alle überlebenden Ferkel mit Penicillin für 4 bis 5 Tage bei 1000 Einheiten pro Pfund behandelt. Nachdem die Symptome von Erysipel nicht mehr deutlich auftraten; wurden alle Schweine mit P. multocida-Toxin exponiert.
Eine Zusammenfassung der mittleren Gewichtszunahmen und Rüsselbewertungen für jede Gruppe wird in nachstehender Tabelle XVII gezeigt. Tabelle XVII
* Ferkel in dieser Gruppe dienten als befallene Kontrollen für Exposition mit DNT.
** Schutz nicht erwartet (siehe Tabelle XVI).
Basierend auf den Ergebnissen in Tabellen XIV und XV war nicht vorhersehbar, daß zwei Dosen von Impfstoff E (Tabelle XI) eine Schutz-Immunreaktion zur Exposition mit DNT induzieren. Jedoch waren zwei Dosen an Impfstoff E hinreichend, um befallene Schweine zu stimulieren, da die Sekundärreaktion auf Toxin nach der Toxinexposition klar war (Tabelle XVIII). Ähnlich reagierten Ferkel, die mit den zwei Impfstoffen ER und E beimpft waren, nicht so gut wie Ferkel, die von beimpften Muttertieren geworfen und gesäugt wurden (Tabelle XV). Jedoch, alle mit Impfstoffen F und G beimpften Ferkel zeigten eine Primärreaktion auf Impfstoff und eine Sekundärreaktion auf Toxininjektion gleich oder überlegen der mit Impfstoff E beimpften Gruppe. Des weiteren waren Ferkel, denen Impfstoff E gegeben wurde, nahezu geschützt vor der Exposition. Diese Daten zeigen eine Freiheit der immunologischen Wechselwirkung zwischen den Fraktionen in experimentellen Impfstoffen.
Serumproben wurden unmittelbar vor jeder Impfung gesammelt, wenn E. rhusiopathiae-Exposition verabreicht wurde (Erh Chal), wenn Toxinexposition gegeben wurde (PmD Chal) und geschlachtet wurde. Eine Zusammenfassung der serologischen Reaktionen der Fraktionen, die sich von E. rhusiopathiae unterscheiden, werden in nachstehender Tabelle XVIII wiedergegeben. Tabelle XVIII Geometrischer mittlerer Titer (GMT) zu jeder Fraktion für Seren, die bei oder davor genommen wurden:
Gruppe 6: Beimpft, Impfstoff F (siehe Tabelle XI)
Gruppe 7: Beimpft, Impfstoff G (siehe Tabelle XI)
Gruppe 8: Beimpft, Erysipelothrix rhusiopathiae Bakterin- Impfstoff
Gruppe 9: Beimpft, Impfstoff E (siehe Tabelle XI) Geworfene Ferkel von unbeimpften Muttertieren und beimpft mit Bordetella bronchiseptica-Pasteurella multocida- Bakterin-Toxoid experimentellem Impfstoff E, waren gegen Exposition mit P. multocida Typ A (Stamm 169) geschützt. Aus diesem Ergebnis kann geschlußfolgert werden, daß Muttertier- Impfung mit dieser Formulierung bei geschützten Ferkeln gegen Typ A nicht erforderlich ist.
Experimentelles Bordetella bronchiseptica-Erysipelothrix rhusiopathiae-Pasteurella multocida-Bakterin-Toxoid, gegeben an befallene Ferkel, schützte mindestens 75% gegen eine tatsächliche Exposition mit virulentem E. rhusiopathiae. Aus diesem Ergebnis kann geschlußfolgert werden, daß zwei Dosen dieses Bakterin-Toxoids, formuliert als entweder eine 3 ml-Dosis oder eine 2 ml-Dosis, wirksame Immunität gegen Erysipel induzierten.

BEISPIEL 11 - KOMBINATIONSIMPFSTOFF

Ferkel wurden mit zwei 2 ml-Dosen mit einem Kombinationsimpfstoff gemäß der Erfindung, enthaltend Bordetella bronchiseptica, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida-Bakterin-Toxoid und freies P. multocida Toxoid, immunisiert, der standardisiert wurde, so daß er ungefähr 100 RU freies lösliches Toxoid und 1,875 Absorptionseinheiten (AU) von zellgebundenem Toxoid enthielt.
Die einzelnen Komponenten des Impfstoffs wurden wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben hergestellt. Eine 2 ml-Dosis wurde wie nachstehend formuliert. Das Bordetella- Bakterin, enthaltend 4,13 Dosen (6195 NU) pro ml, wurde auf pH 6,5 eingestellt. Al(OH)&sub3;-Gel (23,85 ml) und 0,615 ml Thimerosal, 2,5% Volumen/Volumen mit EDTA, 2,5% Volumen/Volumen, wurden zu 930 ml Bordetella gegeben. Das Gemisch wurde erneut auf pH 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei ungefähr 25ºC auf ei nem Schüttler leicht vermischt. Ausreichend Salzlösung (581,9 ml) wurde zugesetzt, um ein Endvolumen von 1536,4 ml zu erreichen.
Das Erysipelothrix, enthaltend 4,7 Opazitätseinheiten (optische Dichte · Volumen in ml) pro ml, wie auf Spectronic 20D bei 625 nm bestimmt, wurde durch Zentrifugieren bei 8000 G für 30 Minuten geklärt. 1800 ml des Überstands wurden durch Ultrafiltration mit einer 10000 MW-Membran konzentriert zu einem berechneten Äquivalent von 12,5 Opazitätseinheiten pro ml zu einem Endvolumen von 677 ml. Dann wurden 222 ml Al(OH)&sub3;-Gel und 3,55 ml Thimerosal, 2,5% Volumen/Volumen, mit EDTA, 17,5% Volumen/Volumen zu 666 ml konzentriertem Überstand zugegeben. Das Gemisch wurde auf pH 6,6 eingestellt und 1 Stunde bei ungefähr 25ºC auf einem Schüttler leicht gemischt.
P. multocida Typ A (2518 ml), das BPL-inaktiviert war und 5,4 Opazitätseinheiten (OU) pro ml (Spectronic 70 bei 650 nm) enthielt, wurde zentrifugiert (4500 G für 1 Stunde) und die Zellen in Überstandsflüssigkeit auf 400 ml resuspendiert. Salzlösung (800 ml) wurde zugegeben, unter Gewinnung von berechneten 11,33 Opazitätseinheiten pro ml. Al(OH)&sub3;-Gel (400 ml) und 6,4 ml Thimerosal, 2,5% Volumen/Volumen, mit EDTA, 17,5% Volumen/Volumen, wurden zugegeben. Das Gemisch wurde auf pH 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei ungefähr 25ºC auf einem Schüttler leicht gemischt.
P. multocida Typ D Stamm 4677 [SmithKline Beecham] zellgebundenes Toxoid (3304 ml), enthaltend 2,1 OU pro ml (Spectronic 70 bei 625 nm), wurde zentrifugiert (4500 G für 1 Stunde) und die Zellen wurden in Überstandsflüssigkeit auf 222 ml resuspendiert. Salzlösung (333 ml) wurde zugegeben, um eine berechnete 12,5 OU pro ml zu erhalten. Al(OH)&sub3;-Gel (185 ml) und 2,96 ml Thimerosal, 2,5% Volumen/Volumen, mit EDTA, 17,5% Volumen/Volumen, wurden zugegeben. Das Gemisch wurde auf pH 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei ungefähr 25ºC auf einem Schüttler leicht gemischt.
Für P. multocida Typ D, Stamm 8, freies Toxoid, wurden 250 ml Al(OH)&sub3;-Gel und 4,0 ml Thimerosal (2,5% Volumen/Volumen) mit EDTA (17,5% Volumen/Volumen) zu 750 ml P. multocida Toxoid, enthaltend 540 relative Einheiten (RU), pro ml gegeben. Das Gemisch wurde auf pH 6,5 eingestellt und 1 Stunde bei ungefähr 25ºC auf einem Schüttler leicht vermischt.
Eine 2 ml-Dosis enthält die nachstehenden Mengen an Komponenten, hergestellt wie in dem vorangehenden Absatz beschrieben: 0,4 ml Bordetella-Bakterin, 0,8 ml Kulturgeklärtes Erysipelothrix, 0,4 ml P. multocida-Typ A, 0,2 ml P. multocida Typ D, zellgebundenes Toxoid, 0,2 ml P. multocida Typ D freies Toxoid. Diese Dosis wurde in den nachstehenden Expositionsversuchen verwendet.
Es wurden die Ferkel nach Immunisierung auf Immunität gegen E. rhusiopathiae mit 9 CFR § 113.104e oder gegen atropischen Schnupfen durch aufeinanderfolgende Infektion mit virulentem B. bronchiseptica und P. multocida gemäß dem Verfahren von Kobish und Pennings, Vet. Rec., 124: 57-61 (1989) reagieren lassen.
Die Ergebnisse dieser Expositionsuntersuchungen zeigten, daß die Größenordnung der Reaktion auf diese Formulierung größer war als eine additive Wirkung durch Vereinigen des freien P. multocida Toxoids und Bakterin-Toxoids und immunologische Synergie wiedergibt. Zusätzlich zeigte der solide Schutz, induziert gegen eine schwere Exposition mit Erysipelothrix, daß die Entfernung von Bakterien aus der E. rhusiopathiae-Fraktion keine negative Wirkung auf die Wirksamkeit dieser Fraktion hatte.

A. Exposition zur Immunität von E. rhusiopathiae

Achtundzwanzig gekreuzte Mastferkel, erworben von Sands, Inc., wurden zur Bewertung der Wirksamkeit von verminderten Antigenspiegeln auf Immunität von Bordetella bronchiseptica-Erysipelothrix rhusiopathiae-Pasteurella multocida- Bakterin-Toxoid eingesetzt. Drei Gruppen von acht Ferkeln (behandelte Gruppen A, B bzw. C) wurden intramuskulär an der linken Seite des Halses am Tag 0 mit 2 ml von entweder einer vollen Dosis, % Dosis oder 1/10 Dosis des vorstehend beschriebenen Impfstoffs beimpft. Die eine Hälfte und ein Zehntel Dosierungen wurden durch Verdünnen mit der vorstehen den Formulierung mit sterilem PBS ausgeführt. Am Tag 21 erhielten die Ferkel in behandelten Gruppen A, B und C eine zweite intramuskuläre Injektion für deren entsprechende Behandlung. Mit der zweiten Injektion wurden die Injektionsstellen an der rechten Seite des Nackens gewechselt. Am Tag 39 wurden alle Ferkel, behandelte Gruppen A, B, C und Kontrollgruppe D, mit E. rhusiopathiae durch eine 2 ml intramuskuläre Injektion in den hinteren Oberschenkel exponiert.
Ein Tier in der Gruppe, das eine 1/10 Dosis erhielt, starb aus Gründen, die sich nicht auf den Impfstoff oder die Reaktion beziehen und wurde aus dem Test entfernt. Einhundert Prozent der nicht beimpften Tiere zeigten charakteristische klinische Symptome oder Erysipel und 75% starben. Im Gegensatz dazu waren 100% der Schweine, die eine vollständige Dosis Impfstoff erhielten, geschützt. Aus diesen Daten kann geschlußfolgert werden, daß die Impfung mit dem Impfstoff für dieses Beispiel eine Immunität induzierte, die einer sehr starken Exposition mit virulentem E. rhusiopathiae widersteht.

B. Exposition zur Immunität für atrophischen Schnupfen

Sechs von acht natürlichen, gekreuzten, spätträchtigen Säuen (Eberly Farms, Bradshaw, NE) wurden intramuskulär ungefähr 3 und 5 Wochen vor dem Werfen in zwei Fällen mit 2,0 ml der Impfstofformulierung, wie vorstehend beschrieben, inokuliert. Nach dem Werfen wurden die Ferkel in jedem Wurf in zufälliger Weise den Behandlungsgruppen zugeordnet. Behandelte Gruppe A enthielt zwei 2,0 ml intramuskuläre Injektionen der Impfstofformulierung. Die erste Injektion wurde an die linke Seite des Nackens verabreicht, wenn die Ferkel eine Woche alt waren und die zweite wurde in die rechte Seite des Nackens im Alter der Entwöhnung verabreicht. Die behandelte Gruppe B erhielt keine Testsubstanz. Die Ferkel, die von zwei Kontroll-Säuen geboren wurden, dienten als Kontroll-Ferkel.
In einem Alter von vier Tagen wurden die Ferkel intranasal mit 1,0 ml B. bronchiseptica (Stamm 2-9, 2 · 10&sup8; Organismen/ml) exponiert und erneut intranasal mit 1,0 ml P. multocida Typ D (Stamm 4677, 8 · 10&sup9; Organismen/ml) in einem Alter von neun Tagen exponiert. Fünf Wochen nach Infektion mit P. multocida Typ D wurden die Ferkel geschlachtet und die Nasenmuschelatrophie gemessen.
Die nicht beimpften Gruppen nahmen signifikant weniger an Gewicht zu als Ferkel in. Gruppen, die durch Impfen behandelt wurden. Des weiteren war die Schädigung der Nasenmuscheln gleichmäßig schwer bei nicht beimpften Ferkeln, die von nicht beimpften Muttertieren geworfen wurden. Im Gegensatz nahmen Ferkel, die von beimpften Muttertieren geboren waren, mit einer entsprechenden Geschwindigkeit an Gewicht zu, zu einem gesunden Ferkel und hatten signifikant weniger Nasenmuschelatrophie. Die Ergebnisse der Exposition werden in nachstehender Tabelle XIX zusammengefaßt, worin Gruppe A beimpfte Muttertiere, beimpfte Ferkel, wiedergibt, Gruppe B beimpfte Muttertiere, nicht beimpfte Ferkel wiedergibt und Gruppe C nicht beimpfte Muttertiere, nicht beimpfte Ferkel wiedergibt. Tabelle XIX
Die serologische Reaktion zeigte, daß meßbare Antikörper auf B. bronchiseptica, P. multocida Typ A und P. multocida DNT in den Vormilchproben von beimpften Muttertieren vorlagen und nicht in den Vormilchproben von nicht beimpften Muttertieren vorlagen. Des weiteren zeigte die Bestimmung von Antikörpern für diese Fraktionen in Serum, genommen von Ferkeln im Alter von fünf Tagen (Bordetella-Exposition) Übertragung auf Mutter-Antikörper. Nachstehende Tabelle XX zeigt Antikörpertiter, die gegen schweren atrophischen Schnupfen, verursacht durch B. bronchiseptica- und P. multocida-Infektionen, schützend waren, ungeachtet, ob die Immunisierung ak tiv oder passiv erfolgte. In nicht beimpften Schweinen, die von beimpften Muttertieren geworfen wurden, zeigten die Ergebnisse jedoch deutlich, daß Antikörper mütterlicherseits nicht weiterbestanden und daß die Impfung von Ferkeln für eine Immunität erforderlich ist, die über die ersten Lebensmonate andauert. Tabelle XX Geometrischer mittlerer Titer (GMT) für Seren, die während oder davor genommen wurden:
Bb = Bordetella bronchiseptica
PmA = Pasteurella multocida Typ A
PmD = Pasteurella multocida DNT
Zahlreiche Modifizierungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in die vorstehend ausgewiesene Beschreibung eingeschlossen und sollten für den Fachmann erkennbar sein. Beispielsweise kann die Verwendung von anderen geeigneten, inaktivierten Pathogenen, die sich von B. bronchiseptica und E. rhusiopathiae unterscheiden, in den Kombinationsimpfstoffen dieser Erfindung angewendet werden. Ähnlich können andere übliche Adjuvantien und inaktive Impfstoffkomponenten in den Formulierungen angewendet werden und vom Fachmann ausgewählt werden. Die Dosierungen und Verabreichungsvorschriften zur Verwendung dieser Impfstoffzusammensetzungen können ebenfalls vom Fachmann, basierend auf dem zu beimpfenden Tier, der Erkrankung, für die der Schutz erwünscht ist, oder anderen damit verbundenen Faktoren, eingestellt werden. Solche Modifizierungen und Änderungen der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung sollten vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfaßt werden.

Claims

1. Impfstoffzusammensetzung, umfassend eine immunogene Menge eines Toxoids, hergestellt durch Inkubieren eines zellfreien Toxins aus Pasteurella multocida unter den Bedingungen eines pH-Werts größer 9, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Toxoid durch Inkubieren des zellfreien Toxins unter Bedingungen eines pH-Werts von etwa 10,5 hergestellt wird.

3. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, die zwischen 50 und 1000 relative Toxoideinheiten pro ml umfaßt.

4. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die außerdem eine immunogene Menge eines oder mehrerer weiterer Antigene umfaßt.

5. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die weiteren Antigene aus der Gruppe, bestehend aus einem Bordetella bronchiseptica-Antigen, einem Erysipelothrix rhusiopathiae-Antigen, einem Mycoplasma hyopneumoniae-Antigen, und einem Escherichia coli-Antigen, ausgewählt sind.

6. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die außerdem ein oder mehrere Adjuvantien umfaßt.

7. Verwendung der Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur inneren Verabreichung an ein gegen Pasteurella multocida zu schützendes Tier.

8. Verfahren zur Entgiftung eines zellfreien Pasteurella multocida-Toxins, umfassend Inkubieren des zellfreien Toxins unter den Bedingungen eines pH-Werts größer 9,0.

9. Verfahren nach Anspruch 8, umfassend Inkubieren des zellfreien Toxins unter den Bedingungen eines pH-Werts von etwa 10,5.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, das nach der Inkubation außerdem Einstellen des pH-Werts auf zwischen 6 und 8 umfaßt.

11. Impfstoffzusammensetzung, umfassend eine immunogene Menge eines durch Inkubieren von zellfreiem Toxin aus Pasteurella multocida unter den Bedingungen eines pH-Werts größer 9 hergestellten Toxoids, eine immunogene Menge eines zellgebundenes Toxoid umfassenden Pasteurella multocida-Bakterins und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

12. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das aus dem zellfreien Toxin hergestellte Toxoid durch Inkubieren des zellfreien Toxins unter den Bedingungen eines pH- Werts von etwa 10,5 hergestellt wird.

13. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, die zwischen 100 und 150 relative Toxoideinheiten pro ml umfaßt.

14. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Bakterin durch Behandeln von Toxin-enthaltenden Zellen aus einer Kultur von Pasteurella multocida in der exponentiellen Wachstumsphase mit Formaldehyd in einer zur Inaktivierung der Zellen und zur Umwandlung des Toxins zu einem zellgebundenen Toxoid ausreichenden Konzentration hergestellt wird.

15. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Pasteurella multocida-Bakterin, das das zellgebundene Toxoid umfaßt, durch Behandeln von Zellen aus der Kultur mit einer Endkonzentration von 0,5% Volumen/Volumen Formaldehyd hergestellt wird.

16. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei die Kultur von Pasteurella multocida-Zellen aus einem toxigenen Typ D-Stamm ausgewählt ist.

17. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, die eine optische Dichte bei 625 nm zwischen 1 und 3 zeigt.

18. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, die weiterhin eine immunogene Menge eines oder mehrerer weiterer Antigene umfaßt.

19. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die weiteren Antigene aus der Gruppe, bestehend aus einem Bordetella bronchiseptica-Antigen, einem Erysipelothrix rhusiopathiae-Antigen, einem Mycoplasma hyopneumoniae-Antigen und einem Escherichia coli-Antigen, ausgewählt sind.

20. Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, die außerdem ein oder mehrere Adjuvantien umfaßt.

21. Verwendung der Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 20 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur inneren Verabreichung an ein gegen Pasteurella multocida zu schützendes Tier.