DE69130953T2

DE69130953T2 - Immunverstärkung von impfstoffen, besonders von impfstoffen gegen schweinepleuropneumonie

Info

Publication number: DE69130953T2
Application number: DE69130953T
Authority: DE
Inventors: Krishnaswamy Iyengar Lincoln Nb 68506 Dayalu; Nathan West Chester Pa 19380 Zygraich
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 1999-07-08
Anticipated expiration: 2011-12-20
Also published as: AU9168591A; ATE177010T1; EP0563288B1; AU662116B2; WO1992011023A1; JPH06503351A; EP0563288A4; DE69130953D1; DK0563288T3; KR930703006A; EP0563288A1; KR100258772B1; CA2098719A1

Description

IMMUNVERSTÄRKUNG VON IMPFSTOFFEN, BESONDERS VON IMPFSTOFFEN GEGEN SCHWEINEPLEUROPNEUMONIE

Die Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet veterinärer Impfstoffe. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Impfstoffe und Verfahren zur Steigerung der Immunreaktion auf Impfstoffe, die gegen Erkrankungen gerichtet sind, die mit A. pleuropneumoniae infizierten Tieren verbunden sind.

Hintergrund der Erfindung

Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae ist ein Krankheitserreger bei Schweinen, der bei infizierten Tieren akute Pneumonie mit fibrinöser Pleuritis oder chronischen Lungenläsionen verursacht [T. N. Sebunya et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., 182: 1331-1337 (1983)].
Der Phänotyp von A, pleuropneumoniae wird, wie jener anderer Pathogene, von vielen Faktoren in der Wirtsumgebung während der Infektion beeinflußt. Ein gewöhnlicher Wirtsschutzmechanismus bezieht das Vorenthalten von wesentlichen Bakteriennährstoffen, beispielsweise Eisen, ein. Während das meiste Eisen intrazellulär in Körperflüssigkeiten lokalisiert ist, ist extrazelluläres Eisen mit eisenbindenden und transportierenden Proteinen, wie Transferrin und Lactoferrin, fest komplexiert. Die meisten pathogenen Bakterien haben stark affine Eisenaufnahmesysteme entwickelt, um dieses gebundene Eisen zu erhalten. Diese Aufnahmesysteme beziehen gewöhnlich zwei Komponenten, Siderophore niederen Molekulargewichts, die Eisen chelatisieren und Eisen-reprimierbare äußere Membranproteine (IROMP), die als Rezeptoren der Eisen-Siderophor- Komplexe wirken, ein [H. Deneer, Infection and Immunity, 57(3): 798-804 (1989): V. Braun, Trends Biochem. Sci, 10: 75-78 (1985); M. C. McIntosh et al., J. Bacteriol., 137: 653-657 (1979); J. B. Neilands et al., Annu. Rev. Microbiol., 36: 285- 310 (1982)].
Von den IROMP aus verschiedenen pathogenen Mikroorganismen wurde gezeigt, daß sie immunogen sind und in vielen Fällen einen signifikanten Grad an immunologischer Kreuzreaktivität zwischen den Serogruppen der einzelnen Spezies zeigen. Beispielsweise erwiesen sich mit Antikörpern zu E. coli IROMP passiv immunisierte Truthähne besonders gegen E. coli septicemia geschützt. [Siehe C. A. Bolin et al., Infect. Immun., 55: 1239-1242 (1987), siehe ebenfalls J. R. Black et al., Infect. Immun., 54: 710-713 (1986) und M. Fohn et al., Infect. Immun., 55: 3065-3069 (1987)].
H. Deneer et al., vorstehend zitiert, haben von der verbesserten in vitro-Synthese von zwei Proteinen berichtet, wobei eines 105K und das andere 75K ist, wenn virulenter A. pleuropneumoniae, Serotyp 1, unter eisenarmen Bedingungen gezüchtet wurde. Die Funktion dieser Proteine wurde nicht besonders ausgewiesen, jedoch wird festgestellt, daß eines oder beide dieser Proteine als Rezeptor für Siderophor-Eisen-Komplexe dienen können.
Die Prophylaxe von A. pleuropneumoniae-Infektion beruht gegenwärtig auf Impfstoffen, die aus Bakterien, die ganze Zellen enthalten, bestehen. Inaza et al., Inf. Immun., 56(8), 1880-89, 1988, offenbaren, daß Schutz gegen bakterielle Infektion von H. pleuropneumoniae nur induziert wird, wenn Tiere mit lebend eingekapselten oder nicht eingekapselten Bakterien immunisiert wurden. Diese Art von Impfstoff war beim Bekämpfen und Verhindern dieser Erkrankung nicht erfolgreich. Die Ganzzellenbakterienvakzine verhindern weder chronische Formen der Erkrankung, noch sind die Bakterienvakzine in der Lage, die Entwicklung des subklinischen Trägerstatus zu halten oder zu verhindern. Außerdem induzieren sie keine Immunität zu heterologen Serotypen von A. pleuropneumoniae [R. Higgins et al., Can. Vet. J., 26: 86-89 (1985), R. Nielsen et al., Acta Vet. Scand., 27: 453-455 (1987)].
Es besteht auf dem Fachgebiet der veterinären Praxis Bedarf für Impfstoffe, die gegen die Infektion von Tieren durch A. pleuropneumoniae wirksam sind.

Kurzdarstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt neue Impfstoffkomponenten und Zusammensetzungen und ein Verfahren zur Erhöhung der Immunreaktion auf bekannte Impfstoffe bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Impfstoff-Zusammensetzungen zum Schützen von Schweinen gegen die Infektion durch Actinobacillus pleuropneumoniae bereit, umfassend eine wirksame Menge eines Eisen-reprimierbaren äußeren Membranproteins (IROMP), das als Schutzantigen verwendbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieses IROMP-Protein aus A. pleuropneumoniae, Serotyp 5, isoliert und durch ein Molekulargewicht von ungefähr 105 kD charakterisiert.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung enthalten einen A. pleuropneumoniae-Kapselextrakt sowie das IROMP.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Erhöhung der Immunreaktion eines Tieres auf eine ausgewählte Impfstoff-Zusammensetzung gegen ein Pathogen bereit, das durch die Anwesenheit eines IROMP charakterisiert wird, durch Einarbeiten einer immunogenen Menge eines geeigneten Immun-verstärkenden Eisen-reprimierbaren äußeren Membranproteins in die Impfstoff-Zusammensetzung. Der Impfstoff wird dadurch mit erhöhten antigenen und immunogenen Eigenschaften versehen.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiterhin im einzelnen in der nachstehenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen

Die vorliegende Erfindung stellt Impfstoff-Zusammensetzungen für die Prophylaxe von Erkrankungen, die sich aus Infektionen von pathogenen Mikroorganismen ergeben, bereit, wobei die Impfstoffe ein Eisen-reprimierbares äußeres Membranprotein (IROMP) enthalten, das für die ausgewählten Mikroorganismen charakteristisch ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt:
a) ein oder mehrere Eisen-reprimierbare äußere Membranproteine (IROMP), erhalten aus einem ersten Serotyp eines Actinobacillus pleuropneumoniae-Stamms, wobei der Stamm unter eisenarmen Bedingungen in Anwesenheit eines Eisen-Chelators gezüchtet wird, wobei der Stamm dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein IROMP erzeugen kann, wenn er unter eisenarmen Bedingungen in Anwesenheit eines Eisen-Chelators gezüchtet wird, wodurch der Stamm die IROMP erzeugt; oder
einen Kapselextrakt der eisenarmen Kultur des ersten Serotyps des Actinobacillus pleuropneumoniae-Stamms, der diese IROMP enthält;
b) ein oder mehrere Kapselextrakte aus Kulturen, die ein oder mehrere Serotypen von einem oder mehreren Actinobacillus pleuropneumoniae-Stämmen umfassen, die gleich dem ersten Serotyp oder davon verschieden sein können, wobei die einen oder mehreren Serotypen nicht unter eisenarmen Bedingungen in Anwesenheit eines Eisen-Chelators gezüchtet wurden; und
c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Impfstoff-Zusammensetzung dieser Erfindung ist bei der Prophylaxe der Erkrankung, verursacht durch die Infektion des Schweins durch Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae, verwendbar, die eine akute Pneumonie mit fibröser Pleuritis oder chronischen Lungenläsionen verursacht. Obwohl die hierin im einzelnen beschriebene Ausführungsform A. pleuropneumoniae als das Pathogen anwendet, wird erwartet, daß die Lehren dieser Erfindung an die Impfstoff-Zusammensetzungen für weitere Pathogene durch den Fachmann leicht angepaßt werden können. Die Lehren der vorliegenden Erfindung sind nicht auf die beispielhaften Impfstoff-Zusammensetzungen allein begrenzt.
Das A. pleuropneumoniae-IROMP wurde durch ein Molekulargewicht von ungefähr 105 Kilo-Dalton (kD) gekennzeichnet [siehe beispielsweise H. Deneer, et al., Infect. Immun., 57: 798-804 (1989)]. Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise gefunden, daß, wenn das A. pleuropneumoniae-IROMP in Impfstoff-Zusammensetzungen eingesetzt wird, die andere Antigene des Pathogens enthalten, beispielsweise Ganzzellen A. pleuropneumoniae-Bakterienvakzine oder A. pleuropneumoniae-Kapselextraktantigene, die Impfstoffe bemer kenswerte Verbesserung beim Schutz gegen die Infektion mit homologen A. pleuropneumoniae-Serotypen und signifikante Verbesserung beim Kreuz-Schutz gegen heterologe Serotypen (beispielsweise Serotyp 1), zeigen.
Die hierin im einzelnen beschriebenen Ausführungsformen wenden das IROMP von A. pleuropneumoniae-Serotyp 5 an. Es wird jedoch erwartet, daß IROMP von anderen A. pleuropneumoniae-Serotypen und anderen Pathogenarten ebenfalls in entweder A. pleuropneumoniae-Impfstoffen bzw. anderen Pathogen- Impfstoffen, gemäß den Lehren dieser Erfindung, verwendbar sind. Die vorliegende Erfindung ist nicht nur auf das beispielhafte IROMP begrenzt. Die IROMP aus einem ausgewählten Mikroorganismus können in ähnlicher Weise mit Antigenen verwendet werden, die anders als jene vorstehend beschriebenen sind. Außerdem wird von dem IROMP aus einem Mikroorganismus erwartet, daß er als Impfstoff, der Antigene von einem davon verschiedenen Mikroorganismus enthält, verwendbar ist.
Ein in den vorliegenden Impfstoff-Zusammensetzungen verwendbarer IROMP kann isoliert und in einer Kultur des ausgewählten Pathogens identifiziert werden. Kurzgefaßt, es wird ein IROMP durch Züchten des ausgewählten Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, wie PPLO-Brühe oder den Medienformulierungen, die nachstehend in dem speziellen Beispiel 1 ausgewiesen sind, isoliert. Weil ein IROMP nur unter eisenarmen Bedingungen entsteht, wird ein ausgewählter Eisenchelator, wie 2,2-Dipyridyl, zu der Kultur gegeben. Die Anwesenheit des IROMP wird danach in der Kultur durch Zugabe eines ausgewählten Farbstoffes, wie Kongorot, und die Ausführung eines Farbstoff-bindenden Assays an einer Probe der Kultur untersucht. Diese Vorgehensweise wird im einzelnen nachstehend im Beispiel 1 beschrieben.
Wird das IROMP in der Kultur als vorliegend identifiziert, können anschließend unbehandelte Teile der Kultur für die Herstellung der Kapselextrakt-Antigenzubereitungen umfassenden Impfstofformulierung verwendet werden. Alternativ können weitere Isolierungsverfahren, wie jene, beschrieben von Deneer et al., wie vorstehend zitiert, angewendet werden und/oder das IROMP selbst kann aus dem Mikroorganismus iso liert und durch chemische Synthese oder rekombinante Verfahrenstechniken erhalten werden. Zusätzlich wird in Erwägung gezogen, daß ein IROMP-Protein, das aus der Kultur isoliert wurde, als getrennte Komponente, beispielsweise in einer Menge von etwa 0,1 bis 1,8 ml, zu einer Impfstoff-Zusammensetzung, die ein weiteres Antigen enthält, gegeben werden kann.
A. pleuropneumoniae-Impfstoffe der Erfindung können als pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge des IROMP mit 105 kD als Wirkstoff enthalten, hergestellt werden. Wenn das IROMP aus der Kultur isoliert wird, kann es in wirksamen Mengen zu weiteren Impfstofformulierungen in einem geeigneten pharmazeutischen Träger gegeben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das IROMP mit 105 kD eine Komponente in einer immunostimulatorischen Zubereitung mit A. pleuropneumoniae-Ganzzellen-Impfstoffen sein. Ein neuer Impfstoff, umfassend ein Ganzzellen A. pleuropneumoniae-Bakterienvakzin und ein A. pleuropneumoniae- IROMP mit 105 kD, kann wie nachstehend hergestellt werden. Ein ausgewählter A. pleuropneumoniae-Stamm, der identifiziert wurde, daß er die Fähigkeit besitzt, ein IROMP unter eisenarmen Bedingungen zu erzeugen, kann in üblicher Weise in geeigneten Medien in Anwesenheit eines Eisenchelators gezüchtet werden und mit einem üblichen Inaktivierungsmittel, wie Formalin (Formaldehydlösung USP) inaktiviert werden. Das Inaktivierungsmittel kann in einer Menge zwischen ungefähr 0,2% bis 1,0 Gewichtsprozent zugegeben werden. Vorzugsweise wird das Inaktivierungsmittel zu der Kultur bei einer Endkonzentration von 0,3% gegeben. Weitere bekannte Inaktivierungsmittel können ebenfalls verwendet werden, wie Glutaraldehyd oder β-Propiolacton (BPL). Wenn als Inaktivierungsmittel verwendet, wird Glutaraldehyd vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 0,05% bis 0,5 Gewichtsprozent zugegeben und BPL wird vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 0,1% und 0,3 Gewichtsprozent zugegeben. Jedoch kann der Fachmann leicht die Konzentration und Zeitparameter, die zur Inaktivierung mit einem ausgewählten Inaktivierungsmittel erforderlich sind, bestimmen.
Ist das Inaktivierungsmittel einmal zugegeben worden, wird die Kultur für einen geeigneten Zeitraum, beispielsweise etwa 18 bis 48 Stunden, bei etwa 37ºC inkubiert. Das Inaktivierungsmittel kann entfernt oder durch übliche Verfahren neutralisiert werden und die Kultur wird zur Vervollständigung der Neutralisation des Inaktivierungsmittels, beispielsweise mit Natriumbisulfat (37%), bis zu 24 Stunden bei 20- 25ºC erneut inkubiert.
Einmal inaktiviert kann die den IROMP enthaltende Kultur anschließend zu einem geeigneten Impfstoff formuliert werden.
Das IROMP mit 105 kD kann in weiterer immunostimulatorischer Zubereitung verabreicht werden, wie als ein A. pleuropneumoniae-Untereinheitsimpfstoff. Eine Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist ein neuer Impfstoff, der A. pleuropneumoniae-Kapselextraktproteine und ein A. pleuropneumoniae 105 kD IROMP umfaßt. Kapselextrakt wird durch Kultivieren von A. pleuropneumoniae, Inkubieren, Abkühlen der Kultur, Erhalten eines bakteriellen Zellpellets, das dann in PBS suspendiert wird, Erwärmen der bakteriellen Zellen, erneut Zentrifugieren, Sammeln des Überstands und Sterilisieren des extrahierten Produkts hergestellt. Die Bedingungen für dieses Verfahren werden im einzelnen in Beispiel 2 mitgeteilt.
Das IROMP kann gegebenenfalls in der immunostimulatorischen Zubereitung, in Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Chelator in der bakteriellen Kultur, aus der die Kapselextrakte hergestellt werden, vorliegen. Gemäß der Erfindung ist die Anwesenheit von IROMP jedoch bevorzugt. Es ist für einen solchen Impfstoff ebenfalls bevorzugt, daß Kapselextraktproteine aus mehreren als einem Stamm von Bakterien hergestellt werden. Das in den Kulturmedien vorliegende Protein wird konzentriert und die Proteinkonzentration mit IROMP und der gesamten Kohlenhydratkonzentration werden jeweils durch bekannte Verfahren berechnet. Die Berechnungen werden zur Bestimmung des Volumens von Extrakt-Antigen mit IROMP, das zur Herstellung einer bevorzugten Dosierung eines Kapselextraktimpfstoffs erforderlich ist, ausgeführt.
Ein Inaktivierungsmittel, beispielsweise 25% Glutaraldehyd, wird dann angewendet, um die Extraktantigene aus unterschiedlichen Serotypen (beispielsweise App. 1, 5 und 7) zu kuppeln unter Vernetzen der Proteinkomponenten, was zur Bildung eines Makromoleküls führt. Das Gemisch des Extrakts von Antigen mit IROMP und Glutaraldehyd wird dann vorzugsweise bei 20-25ºC zwischen ungefähr 30 Minuten und 180 Minuten inkubiert. Um überschüssigen Glutaraldehyd zu neutralisieren, wird eine Lysingrundlösung zu dieser Kombination gegeben und das Gemisch inkubiert.
Diese Formulierung kann dann zur Verabreichung durch Mischen mit einer freien Zellüberstandsfraktion aus der Kapselextrakt-Impfstoffzubereitung, wie nachstehend beschrieben, emulgiert werden. Diese Fraktion kann als ein Verdünnungsmittel verwendet werden, weil sie geringe Mengen an IROMP enthalten kann. Weitere Additive für diese Formulierung können einen ausgewählten Hilfsstoff und übliche Impfstoffkonservierungsmittel, Detergents und Emulgatoren, wie beispielsweise Merthiolat, Tween 80 und Span 80 einschließen. Eine genauere Beschreibung für einen solchen Impfstoff wird nachstehend in Beispiel 3, Teil B, gegeben.
Eine überdies bevorzugte Impfstoffausführungsform dieser Erfindung ist ein dreiwertiger Impfstoff, der ein IROMP, vorzugsweise von A. pleuropneumoniae, Serotyp 5, und Kapselextrakte von einem oder mehreren anderen Stämmen des gleichen Mikroorganismus enthält. Der weitere Stamm liefert keine IROMP. Beispiel 3, Teil C, ist eine genauere Beschreibung eines solchen Impfstoffs. Vorzugsweise wendet der dreiwertige Impfstoff ein IROMP von einem Stamm von Mikroorganismen und einen Kapselextrakt von mindestens einem zweiten und dritten Stamm an. Weitere Kapselextrakte aus weiteren Stämmen können auch angewendet werden. Dies versieht den Impfstoff mit der Fähigkeit, Schutz gegen alle drei Stämme des Mikroorganismus, beispielsweise A. pleuropneumoniae, zu verleihen.
Von dem IROMP der vorliegenden Erfindung wird auch erwartet, daß es in Impfstoffen, die mehr als zwei weitere Antigene enthalten, verwendbar ist. Andere Antigene, die A. pleuropneumoniae-Antigene darstellen, können auch in Impfstoffen dieser Erfindung vorliegen, beispielsweise Hämolysine und Cytotoxine, können auch in üblichen Dosierungen in diesen Impfstoffen verwendet werden, unter Bereitstellung von weiterer Immunogenizität.
Es ist bevorzugt, daß die Impfstoffe der Erfindung bei Verwendung in einer pharmazeutischen Zubereitung in Einheitsdosierungsformen vorliegen. Für diese Erfindung ist eine immunogene Menge des IROMP mit 105 kD eine Verminderung der optischen Dichte bei 488 nm (O. D. 488 nm) von 0,28 pro Milliliter von Flüssigkeitsmenge oder einem Zehntel bis neun Zehntel einer einzelnen Dosierung von Impfstoff. Ein Ganzzellenbakterienvakzin mit IROMP-Impfstoff enthält vorzugsweise zwischen 1 · 10&sup8; bis 1 · 10&sup9; Kolonie-bildende Einheiten (CFU), bevorzugter 5 · 10&sup8; CFU. Vorzugsweise gibt es in einem Impfstoff, der einen Kapselextrakt enthält, mindestens zwischen 25-50 ug/Serotyp Kapselextrakt pro Impfstoffdosis. Ein Kapselextrakt mit IROMP-Impfstoff enthält auch vorzugsweise zwischen 25-50 ug Gesamtkohlenhydrate pro Dosis.
Die geeignete, therapeutisch wirksame Dosis kann auf der Basis der vorstehenden immunogenen Mengen leicht durch den Fachmann bestimmt werden. Folglich stellt eine pharmazeutische Zubereitung eine Einheitsdosierung zwischen 0,1 bis 1,8 ml einer sterilen Lösung einer immunogenen Menge der Wirkstoffe bereit. Eine Ausführungsform der Erfindung schließt eine Impfstoffdosierungseinheit, umfassend 0,1 bis 1,8 ml einer sterilen Lösung einer immunogenen Menge eines A. pleuropneumoniae-IROMP mit 105 kD mit einem Ganzzellen- A. pleuropneumoniae-Bakterienvakzin, ein. Eine weitere Ausführungsform schließt eine Impfstoffdosierungseinheit von 0,1 bis 1,8 ml einer sterilen Lösung einer immunogenen Menge von A. pleuropneumoniae-IROMP mit 105 kD mit A. pleuropneumoniae- Kapselproteinen ein. Eine weitere Ausführungsform ist außerdem eine Dosierungseinheit, die 0,1 bis 1,8 ml einer sterilen Lösung einer immunogenen Menge von einer der vorstehenden zwei Impfstoffausführungen und einer oder mehreren weiteren Antigenkomponenten umfaßt.
Eine wünschenswerte Dosierungsvorschrift bezieht die Verabreichung von zwei Dosen der gewünschten Impfstoff-Zusammensetzung ein. Die Verabreichungsart der Impfstoffe kann ein geeigneter Weg sein, der den Impfstoff an den Wirt abgibt. Der Impfstoff wird jedoch vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Falls erwünscht, können auch andere Verabreichungsarten angewendet werden, wie oral, intranasal, intradermal oder intraperitoneal.
Die vorliegenden Untersuchungen an Schweinen wenden intramuskuläre Injektion von zwei Dosierungen Impfstoff, verabreicht an das betreffende Tier drei Wochen später, an. Es ist jedoch selbstverständlich, daß der spezielle Dosierungsspiegel für ein bestimmtes Tier von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich dem Alter, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht und dem Tierfutter, der Tierart, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, den Wechselwirkungen mit anderen, zu verabreichenden Arzneimitteln und dem gedachten Schutzgrad, abhängt. Natürlich kann die Verabreichung bei weiteren geeigneten Intervallen, falls erforderlich oder erwünscht, wiederholt werden. Somit werden Dosierungsmengen, Art und Weise der Verabreichung dieser Impfstoffe durch den Tierarzt bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe stellen erhöhten Schutz gegen die Infektion mit virulenten Organismen von A. pleuropneumoniae-Serotyp 5 bereit. Diese Impfstoffe können in einem Tier eine ausgezeichnete Immunreaktion gegen A. pleuropneumoniae induzieren und können zusätzlich Kreuzschutz zwischen heterologen Serotypen bereitstellen, unter Nachahmen des Immunstatus eines Tiers, das eine natürliche Infektion überlebt. Der spezielle, durch die erfindungsgemäßen Impfstoff-Zusammensetzungen induzierte Schutzmechanismus ist der erhöhte Schutz (niedere mittlere Lungenläsionszahl), verglichen mit Impfstoffen ohne IROMP-Protein mit 105 kD, wie bei den in Beispiel 4, Tabelle 3, ausgewiesenen in vivo-Tierversuchen.
Die nachstehenden Beispiele erläutern bevorzugte Verfahren zur Isolierung des A. pleuropneumoniae-IROMP mit 105 kD und zur Herstellung und Untersuchung einer Vielzahl von diese neue Komponente enthaltenden Impfstoffen. Diese Beispiele sind nur zur Erläuterung und nicht zur Begrenzung des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung vorgehen.

BEISPIEL 1 - ISOLIERUNG DES A. PLEUROPNEUMONIAE-PROTEINS MIT 105 kD

A. pleuropneumoniae, Serotyp 1 (Stamm Schelkopf) und Serotyp 5 (Stamm K-17) [beide verfügbar von SmithKline Beecham Animal Health, Norden Laboratories, Lincoln, Nebraska] wurden anfänglich auf ihr Potential geprüft, ein IROMP in ein definiertes synthetisches Medium (MIE), Bitek [Difco Laboratories, Detroit, Mich.] und PPLO [Difco]-Brühe, bei Zugabe von Eisenchelator 2,2'-Dipyridyl [Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.], zu einer Endkonzentration von 200 uM, wie nachstehend im einzelnen beschrieben, auszuscheiden.
MIE-Medium (20 Liter) wird durch Vereinigen eines Gemisches der drei nachstehend beschriebenen Grundlösungen, Einstellen des vereinigten Mediums auf einen neutralen pH- Wert und Filter-sterilisieren des vereinigten Mediums hergestellt.
Grundlösung Nr. 1 (17399,3 ml) wird durch Auflösen der nachstehenden Bestandteile in der Reihenfolge unter Rühren hergestellt: 1N HCl 280 ml, L-Cystein 4,0 g, Tyrosin 4,0 g, destilliertes Wasser 16319,3 ml, Leucin 6,0 g, Arginin 6,0 g, Glycin 0,6 g, Lysin 1,0 g, Methionin 2,0 g, Serin 2,0 g, Uracil 2,0 g, 1N NaOH 800 ml, Hypoxanthin 0,4 g, Inosin 40,0 g, K&sub2;HPO&sub4; 69,6 g, KH&sub2;PO&sub4; 54,4 g und Hefeextrakt 120,0 g.
Grundlösung Nr. 2 (2400,7 ml) wird durch Auflösen der nachstehenden Bestandteile in der Reihenfolge unter Rühren hergestellt: Destilliertes Wasser 2290 ml, Asparaginsäure 10,0 g, Glutaminsäure 26,0 g, Natriumchlorid 116,0 g, Kaliumsulfat 20,0 g, Magnesiumchlorid (6 H&sub2;O) 8,0 g, Calciumchlorid (wasserfrei) 0,444 g, EDTA 0,07 g, Ammoniumchlorid 4,4 g, 10N NaOH 23,6 ml. Die nachstehenden Bestandteile werden dann unter Rühren aufgelöst: Tween 80 0,4 ml, DL-Milchsäure (60%-ige Lösung) 26,6 ml und Glycerin 60,0 ml.
Grundlösung Nr. 3 (200 ml) wird durch Auflösen von 20,0 g löslicher Stärke in 200 ml destilliertem Wasser unter mildem Erhitzen und Rühren hergestellt.
Grundlösung Nr. 2 wird zu Grundlösung Nr. 1 gegeben. Grundlösung Nr. 3 wird dann zu dem Gemisch gegeben. Der pH- Wert des gesammelten Mediums wird auf 7,3 ± 0,1 pH-Einheiten eingestellt und das vollständige Medium wird Filtersterilisiert. Diese Lösung kann bei ungefähr 4ºC bis zu zwei Wochen gelagert werden.
Vor der Verwendung der MIE-Brühe werden 20 ml sterile NAD-Grundlösung zugegeben. Diese Lösung wird durch Auflösen in der Reihenfolge von 1,0 g Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD), 1,0 g Thiamin, 1,0 g Calciumpantothenat und 100 ml destilliertes Wasser unter Rühren hergestellt. Das Medium wird erneut Filter-sterilisiert und bei -20ºC gelagert.
PPLO-Brühe (ungefähr 1 Liter) wird durch Auflösen in der Reihenfolge von 21, 0 g PPLO-Brühe w/o CV [Difco], 5,0 g Glucose und 1000 ml destilliertes Wasser unter Rühren hergestellt. Das Medium wird auf einen pH-Wert von ungefähr 7,3 eingestellt und Filter-sterilisiert. Vor der Verwendung werden 1,0 ml einer sterilen NAD-Grundlösung zugegeben und 100 ml steril destilliertes Wasser, enthaltend 10,0 ml steriles Tween 80, werden zugegeben.
BiTek-Brühe (ungefähr 1 Liter) wird durch Auflösen von 29,2 g BiTek-Brühe [Difco] in 1000 ml destilliertem Wasser unter Rühren hergestellt. Das Medium wird auf einen pH-Wert von ungefähr 7,3 eingestellt und Filter-sterilisiert. Vor der Verwendung werden 1,0 ml einer sterilen NAD-Grundlösung zugegeben.
Alle drei der vorstehend beschriebenen Medien wurden auf ihr Potential, IROMP zu erzeugen, geprüft. Die nachstehend im einzelnen beschriebenen Ergebnisse lassen PPLO-Brühe als für die Herstellung von IROMP am besten geeignet erscheinen.
Die Anwesenheit von Protein mit 105 kD wurde durch Farbstoffbindungsassay (Kongorot), ausgeführt durch das nachstehende Verfahren, beschrieben von Deneer und Potter, vorstehend zitiert, bestimmt.

A. Serotyp 1

A. pleuropneumoniae, Serotyp 1 wurde direkt aus den gefrorenen Stammkeimen, 1%, in 100 ml PPLO-Brühe, ergänzt mit 0,5% Glucose und 0,1% NAD-Lösung [Sigma], inokuliert. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert. Danach wurden 500 ml PPLO-Brühe, ergänzt mit 0,5% Glucose und 0,1% NAD-Lösung, mit einer 2%-igen Bekeimung aus dieser Übernacht-Kultur von A. pleuropneumoniae, Serotyp 1 inokuliert und bei 37ºC inkubiert.
Eine Stammlösung von 2,2'-Dipyridyl (Endkonzentration 200 gM) wurde zu der 500 ml Kultur von A. pleuropneumoniae- Serotyp 1 gegeben, wenn die optische Dichte bei 650 nm 1,0 erreicht hatte. Nach einer Inkubation bei 37ºC von 90 Minuten wurden die Zellen durch Zentrifugierung (8000 · g, 10 Minuten) geerntet. Das Zellpellet wurde in 100 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert, bei 8000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert und in PBS zu einer OD650nm = 1,0 resuspendiert.
Ein ml Kongorot pro 100 ml A. pleuropneumoniae-Kultur wurde zugegeben und vermischt. Eine Probe wurde sofort genommen, 1,0 ml jeweils von 4 Mikrofugenröhrchen, und eine Minute in einer Mikrofuge geschleudert und der Überstand bei 488 nm (Bezug PBS) gelesen. PPLO-Brühe mit 0,1% NAD wurde als Kontrolle verwendet. Die Kultur wurde bei 37ºC unter Rühren gehalten. Eine Probe (4,0 ml) wurde bei 0, 20, 40 und 60 Minuten nach Zugabe von Kongorot geerntet.
Die Ergebnisse dieses Assays, erläutert in nachstehender Tabelle 1A, zeigen die Wirkungen von Eisenverarmung bei den äußeren Membranproteinen von A. pleuropneumoniae-Serotyp 1. Die Aufnahme von Kongorot wird als Erschöpfung von Kongorot aus der Lösung ausgedrückt. TABELLE 1A
Somit ist A. pleuropneumoniae, Serotyp 1 in der Lage, Kongorot unter eisenarmen Bedingungen zu binden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die IROMP-Zubereitung die Fähigkeit aufweist, Kongorot zu binden und es wird weiterhin vorgeschlagen, daß IROMP eine Rolle bei der Aufnahme von komplexem Eisen, wie Hämin, während des in vivo-Wachstums spielen.

B. Serotyp 5

A. pleuropneumoniae, Serotyp 5 wurde in 14 Liter-Fermentern, die 10 Liter PPLO-Brühe, ergänzt mit 0,5% Glucose, 0,02% Tween 80 und NAD (Endkonzentration 10 ug/ml), enthielt, wachsen lassen. Die Brühen wurden mit einem 2%-igen Keiminokulum von A. pleuropneumoniae, Serotyp 5 inokuliert. Wenn die Kultur eine OD650nm = 1,0 (4 Stunden nach Inokulation) aufwies, wurde der Chelator zu einer Endkonzentration von 200 uM zugegeben.
Neunzig Minuten später wurden 5 Liter Kultur von Kapselantigen-Zubereitung (siehe Beispiel 2) genommen. Davon wurden 200 ml zum Verarbeiten in dem Kongorot-Bindungsassay genommen. Die 200 ml Probe wurde zentrifugiert und das Zellpellet zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden in sterilem PBS zu einer OD650nm von 1,4 resuspendiert. Sterile Kongorot-Lösung wurde zu einer Endkonzentration von 30 ug/ml zugegeben und das Assay wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Die Probe wies eine OD488nm-Verminderung von 0,075 Einheiten pro ml Fermenterkultur auf. Die Ergebnisse dieses Assays, erläutert in nachstehender Tabelle 1B, zeigen die Wirkungen der Eisenverarmung auf die äußeren Membranproteine von A. pleuropneumoniae, Serotyp 5. TABELLE 1B
Dies erläutert die Fähigkeit von A. pleuropneumoniae, Serotyp 5, an Kongorot zu binden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die IROMP-Zubereitung die Fähigkeit aufweist, an Kongorot zu binden und läßt vermuten, daß IROMP eine Rolle bei der Aufnahme von komplexem Eisen, wie Hämin, während des in vivo- Wachstums spielen können.
Die verbleibenden 5 Liter Kultur, die weder in der Kapsel-Antigenzubereitung angewendet, noch in dem Kongorotassay verwendet wurden, wurden mit Formalin inaktiviert, das zu einer Endkonzentration von 0,3% zum Herstellen des Ganzzellen-inaktivierten Impfstoffs mit IROMP zugegeben wurde, im einzelnen in Beispiel 3 beschrieben.

BEISPIEL 2 - HERSTELLUNG VON KAPSELEXTRAKTANTIGENEN

Ein bakterielles Kapselextraktantigen wird im allgemeinen wie nachstehend hergestellt. MIE-Brühe wird mit einer 1%-igen Bekeimung von A. pleuropneumoniae inokuliert, die vorher bei -70ºC in bakteriellen Standard-Trocknungs-Menstrummedium gefroren waren. Die Kultur wurde dann bei 37ºC unter Rühren für 16-17 Stunden inkubiert. Ein 14 Liter-Fermenter, enthaltend 10 Liter MIE-Brühe, wird mit einer 1 bis 5 Bekeimung einer Kultur von A. pleuropneumoniae inokuliert. Die Fermentationsparameter für den 14 Liter-Fermenter sind wie nachstehend: Temperatur ist 37ºC ± 1ºC, pH 7,0-7,3 und wird mit 5N NaOH gesteuert, D. O. wird bei 30% unter steriler Hausluft unter Rühren, zwischen 100 bis 250 U/min gehalten. Die Kultur wird dann, bis sie die Mitte der Early-Late-Log- Growth-Phase (4 bis 16 Stunden) erreicht hatte, wachsen lassen, wie durch optische Dichte bei 650 nm bestimmt. Nachdem die Kultur die Mitte des Early-Late-Log-Growth erreicht hatte, wird die Kultur auf 20ºC oder niedriger abgekühlt und zentrifugiert oder Mikrofiltration unterzogen. Das bakterielle Zellpellet wird in PBS (ein Zehntel bis ein Tausendstel des ursprünglichen Kulturvolumens) unter Rühren für 1 bis 10 Stunden bei 4ºC resuspendiert. Nachdem die bakteriellen Zellen sorgfältig resuspendiert sind, wird die Suspension auf 56ºC ± 1ºC für 60 Minuten ± 30 Minuten erwärmt. Das Material wird dann zentrifugiert oder Mikrofiltration unterzogen und der Überstand gesammelt. Steriles 10%-iges Merthiolat und 10%-ige Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Dinatrium- oder Tetranatriumsalz) werden als Konservierungsmittel zugegeben. Die Endkonzentration sollte 0,01% bzw. 0,07% (Volumenprozent) nicht übersteigen. Das extrahierte Produkt wird durch ein 0,45 und ein 0,2 um-Filter in ein steriles Lagerungsgefäß filtriert und bei 2ºC-7ºC gesammelt. Falls erforderlich, wird das Produkt zunächst durch Filtration oder Zentrifugation geklärt und dann Filter-sterilisiert.
Da kein Eisenchelator zu dem Kulturmedium gegeben war, erzeugt das vorstehend beschriebene Verfahren Kapselextraktantigen ohne IROMP. Diese Kapselextraktantigene können als Kontrollen verwendet werden. Alternativ kann dem Verfahren gefolgt werden unter Bereitstellung von weiteren Antigenen aus bakteriellen Stämmen, die IROMP erzeugen können.
Der Kapselextrakt mit IROMP kann jedoch gemäß dem vorstehenden Verfahren, modifiziert durch die Zugabe eines ausgewählten Eisenchelators, wie 2,2'-Dipyridyl, zu dem Wachstumsmedium zur Erzeugung des IROMP hergestellt werden.

Dreiwertige Impfstoffe

Dreiwertige Impfstoffe, das heißt Impfstoffe, die das IROMP-Protein mit 105 kD, isoliert aus A. pleuropneumoniae, Serotyp 5, Serotyp 1-Kapselextrakt und Serotyp 7-Kapselextrakt enthalten, wurden auf die Wirksamkeit getestet. Serotyp 5 wurde, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Serotyp 1 wurde in MIE-Medium, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, wachsen lassen. Serotyp 7 [SmithKline Beecham Animal Health, Norden Laboratories, Lincoln, Nebraska] wurde, wie vorstehend für Serotyp 1 beschrieben, wachsen lassen.
500 Dosierungen dreiwertiges Kapselextrakt-Bakterienvakzin mit IROMP, bei 25 ug Kohlenhydrat pro Dosis, wurden wie nachstehend hergestellt. Zuerst wurde die Proteinkonzentration der Massemenge von jedem A. pleuropneumoniae, Serotyp (1, 5 + 105 kD und 7) Kapselextraktantigen durch das Lowry- Verfahren der Proteinbestimmung bestimmt [Herbert, Phipps und Strange, vorstehend zitiert, Seite 249-252]. Die Proteinkon zentration war 1 395 ug/ml für Serotyp 1, 1000 ug/ml für Serotyp 5 mit 105 kD Protein und 1 475 ug/ml für Serotyp 7.
Die Gesamtkohlenhydratkonzentration der Hauptmenge von A. pleuropneumoniae Serotyp (1, 5 + 105 kD und 7) Kapselextraktantigen, wie durch das Phenolverfahren der Gesamtkohlenhydratbestimmung bestimmt [Herbert, Phipps und Strange, vorstehend zitiert, Seite 272-277], wurde mit 1 561 ug/ml für Serotyp 1, 600 ug/ml für Serotyp 5 mit 105 kD IROMP und 1 250 ug/ml für Serotyp 7 gefunden.
Die Anzahl der Milliliter für jedes A. pleuropneumoniae Kapselextrahiertes Antigen, die benötigt werden, um 500 Dosierungen Bakterienvakzin herzustellen, die 25 ug Gesamtkohlenhydrat pro Serotyp pro Dosis enthalten, wird, wie in den nachstehenden, beispielhaften Gleichungen gezeigt, bestimmt.
Die 8,0 ml Serotyp 1, 21,0 ml Serotyp 5 mit 105 kD Protein und 10,0 ml Serotyp 7 Kapsel-extrahierten Antigene werden dann mit 25% Glutaraldehyd gekuppelt. 1,0 ml 25% Glutaraldehyd werden pro Gramm des in den 500 Dosierungen von Bakterienvakzin vorliegenden Proteins zugegeben.
Um die Menge von 25% Glutaraldehyd zu bestimmen, die erforderlich ist, um die dreiwertigen Kapsel-extrahierten Antigene zu kuppeln (Gesamtvolumen = 39,0 ml), wird die nachstehende Gleichung aufgestellt:
Deshalb sind 0,047 ml 25%-iger Glutaraldehyd zum Kuppeln erforderlich.
8,0 ml Serotyp 1 Kapselextrakt-Zubereitung, 21,0 ml Serotyp 5 Kapselextrakt-Zubereitung, die Protein mit 105 kD enthält, und 10,0 ml Serotyp 7 Kapselextrakt-Zubereitungen werden vereinigt. 0,047 ml 25%-iger Glutaraldehyd wird zu der vorstehenden Zubereitung gegeben. Das Gemisch wird anschließend bei Raumtemperatur 1 Stunde unter Rühren inkubiert. Nach 1 Stunde Inkubation werden 0,047 ml Lysin-Grundlösung (12,5 mg/ml) zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden unter Rühren inkubiert und anschließend bei 4ºC gelagert.
Das dreiwertige Bakterienvakzin, das 25 ug/Serotyp/ Dosis enthält, wird dann wie nachstehend emulgiert: 39,0 ml A. pleuropneumoniae, Serotyp 1, 5 und 7, Glutaraldehyd, gekuppelt mit Kapselextrakt-Antigen (vorstehend beschrieben) (0,088 ml Volumen/Dosis), werden mit 1,00 ml 10%-igem Merthiolat-EDTA (0,002 ml Volumen/Dosis), 0,6 ml 10%-igem EDTA (0,0012 ml Volumen/Dosis) und 889,4 ml Überstand von A. pleuropneumoniae, Serotyp 5 mit Chelator (1,7788 ml Volumen/Dosis), erhalten vor der Wärmeextraktion, vermischt. 14,00 ml Tween 80 (0,028 ml Volumen/Dosis) und 6,00 ml Span 80 (0,012 ml Volumen/Dosis) werden zu 50,00 ml Amphigen (0,10 ml Volumen/Dosis) unter Bildung der Ölfraktion zugegeben. Die Ölfraktion wird dann zu der Glutaraldehyd-gekuppelten Zubereitung gegeben, 10% Merthiolat-EDTA, 10% EDTA und Überstandsfraktion, während die Emulgiervorrichtung angestellt wird. Das Bakterienvakzin wird dann 2 Minuten emulgiert.

BEISPIEL 4 - IMPFSTOFFVERSUCHE

Jeder Impfstofftyp, Ganzzellenbakterienvakzin und Kapselextraktimpfstoff, der Protein mit 105 kD enthielt, wurde an Schweinen auf Schutzfähigkeiten mit einem Impfstoff- Reaktionsversuch untersucht. Ähnliche Impfstoffe wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Flüssigkeitsmenge kein Protein mit 105 kD enthielten. Geeignete Kontrollen, nicht beimpfte Schweine, wurden ähnlich untersucht.

A. Einwertige Impfstoffe

Unter Verwendung von Ganzzellenbakterienvakzinen und Kapselextraktimpfstoffen, hergestellt wie in Beispiel 3, Teile A und B beschrieben, mit und ohne das Protein mit 105 kD, isoliert aus A. pleuropneumoniae, Serotyp 5, wurden 2 ml Impfstoffdosierungen intramuskulär an die Seite des Nackens von Schweinen der Eberle-Farmen verabreicht. Die Impfstoffe sind:
Impfstoff XHPP-1: Gesamtzellenbakterienvakzin, enthaltend kein Protein mit 105 kD, wurde mit 5 · 10&sup8; CFU/Dosis verabreicht.
Impfstoff XHPP-2: Gesamtzellenbakterienvakzin, das das Protein mit 105 kD enthielt und das wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben, mit 5 · 10&sup8; CFU/Dosis verabreicht wurde.
Impfstoff XHPC-16: Kapselextraktimpfstoff, der kein Protein mit 105 kD enthielt, wurde mit 50 ug Kohlenhydrat/ Dosis verabreicht.
Impfstoff XHPC-18: Kapselextraktimpfstoff, der Protein mit 105 kD enthielt, wurde mit 50 ug Kohlenhydrat/Dosis verabreicht.
Die erste Impfung erfolgte, als die Schweine in einem Alter von 3-4 Wochen waren. Die zweite Impfung wurde 3 Wochen später nach der ersten Inokulierung verabreicht.
Eine Woche nach der zweiten Impfung wurde die Reaktion mit dem geeigneten Serotyp A. pleuropneumoniae 5 durch intranasale Instillation (0,5 ml pro Nostril) einer Lebendkultur ausgeführt. Die Zellzählung in dem Reaktionsinokulum betrug 1,19 · 10&sup9; CFU/ml. Eine Woche nach der Reaktion wurden die Tiere seziert. Die Tiere, die der Reaktion unterlagen, wurden bald nach dem Tod seziert.
Die Ergebnisse dieser Impfversuche werden in nachstehender Tabelle 2 erläutert. TABELLE 2
Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Senkung der mittleren Lungenschädigung und einen signifikanten Anstieg in Prozent Verminderung der Einbeziehung der Lungen für die Gruppen der Beimpften mit den Impfstoff-Zusammensetzungen, die das IROMP mit 105 kD (XHPP-2 und XHPC-18) enthielten.

B. Dreiwertipe Impfstoffe

Unter Verwendung der dreiwertigen Impfstoffe, die das Protein mit 105 kD, isoliert aus A. pleuropneumoniae-Serotyp 5, enthielten, mit 2 Stämmen Kapselextrakt, hergestellt wie in Beispiel 3, Teil C, beschrieben, und Impfstoffen ohne das IROMP wurden 2 ml Impfstoffdosierungen intramuskulär in die Seite des Nackens von Schweine der Eberle-Farmen verabreicht.
Die angewendeten Impfstoffe sind:
Impfstoff XHPC-19: Ein Kapselextraktimpfstoff, der 25 ug Gesamtkohlenhydrat/Serotyp/Dosis und kein Protein mit 105 kD enthielt.
Impfstoff XHPC-21: Ein Kapselextraktimpfstoff, der Protein mit 105 kD und 25 ug Gesamtkohlenhydrat/Serotyp/Dosis enthielt.
Impfstoff XHPC-20: Ein Kapselextraktimpfstoff, der 50 ug der Gesamtkohlenhydrat/Serotyp/Dosis und kein Protein mit 105 kD enthielt.
Impfstoff XHPC-22: Ein Kapselextraktimpfstoff, der das Protein mit 105 kD und 50 ug der Gesamtkohlenhydrat/Serotyp/Dosis enthielt.
Drei Kulturen, Serotyp 1, Serotyp 5 und Serotyp 7, wurden verwendet, um jedes Tier in einer Impfstoffgruppe und einer Tierkontrollgruppe zu infizieren. Diese Kulturen enthielten die nachstehenden Zellzählungen:
A. pleuropneumoniae, Serotyp 1 = 2,19 · 10&sup9; CFU/ml,
A. pleuropneumoniae, Serotyp 5 = 8,85 · 10&sup8; CFU/ml und
A. pleuropneumoniae, Serotyp 7 = 1,01 · 10&sup9; CFU/ml.
Die Schweine wurden, wie vorstehend für einwertige Impfstoffe in Teil A beschrieben, infiziert. Die Kontrollen bestanden aus einer Gruppe von Schweinen, die einen Plazebo- Impfstoff (PBS-Adjuvans-Amphigen) erhielten. Das Plazebo wurde mit dem gleichen Impfstoffplan (gleiche Dosis und Weg) verabreicht, wie die Schweine, die entweder XHPC-19, XHPC-20, XHPC-21 oder XHPC-22 erhielten. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 3 angeführt. TABELLE 3
Diese Ergebnisse zeigen, daß Tiere, die mit Impfstoffen beimpft wurden, die das Protein mit 105 kD (XHPP-21 und XHPP-22) enthielten, in den meisten Fällen eine größere pro zentuale Verminderung an Lungenschädigung aufwiesen, verglichen mit Tieren, die Impfstoff ohne das Protein mit 105 kD erhielten.
Der dreiwertige Impfstoff ist, verglichen mit dem einwertigen Impfstoff, besonders vorteilhaft, weil der dreiwertige Impfstoff Schutz gegen die drei Serotypen, die in dem Impfstoff enthalten sind, eröffnet. Im Gegensatz eröffnet der einwertige Impfstoff Schutz nur gegen den einen Serotyp, der in seiner Formulierung enthalten ist.
Zahlreiche Modifizierungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in der vorstehend ausgewiesenen Beschreibung eingeschlossen und werden vom Fachmann als plausibel erwartet. Andere übliche Hilfsstoffe und inaktive Impfstoffkomponenten können in den Formulierungen angewendet werden und vom Fachmann ausgewählt werden. Die Dosierungen und Verabreichungspläne zur Verwendung in diesen Impfstoff-Zusammensetzungen können in Abhängigkeit vom Fachmann auf dem Gebiet des Impfstoffs für Tiere, der Erkrankung, für die Schutz erwünscht ist und anderen verwandten Faktoren eingestellt werden. Von solchen Modifizierungen und Veränderungen wird angenommen, daß sie vom Schutzbereich der hierzu beigefügten Ansprüche umfaßt sind.

Claims

1. Impfstoff-Zusammensetzung, um Schweine vor Infektion durch Actinobacillus pleuropneumoniae zu schützen, umfassend:

a) ein oder mehrere Eisen-reprimierbare äußere Membranproteine (IROMP), erhalten aus einem ersten Serotyp eines Actinobacillus pleuropneumoniae-Stamms, wobei der Stamm unter eisenarmen Bedingungen in Anwesenheit eines Eisen-Chelators gezüchtet wird, wobei der Stamm dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein IROMP erzeugen kann, wenn er unter eisenarmen Bedingungen in Anwesenheit eines Eisen-Chelators gezüchtet wird, wodurch der Stamm die IROMP erzeugt; oder

einen Kapselextrakt der eisenarmen Kultur des ersten Serotyps des Actinobacillus pleuropneumoniae-Stamms, der diese IROMP enthält;

b) ein oder mehrere Kapselextrakte aus Kulturen, die ein oder mehrere Serotypen von einem oder mehreren Actinobacillus pleuropneumoniae-Stämmen umfassen, die gleich dem ersten Serotyp oder davon verschieden sein können, wobei die einen oder mehreren Serotypen nicht unter eisenarmen Bedingungen in Anwesenheit eines Eisen-Chelators gezüchtet wurden; und

c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der eine oder die mehreren Kapselextrakte aus Kulturen, die einen oder mehrere Serotypen umfassen, aus A. pleuropneumoniae-Serotypen 1, 5 und 7 oder aus Serotypen 1 und 7 oder aus Serotypen 1 und 5 hergestellt sind.

3. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Kapselextrakt aus dem ersten Serotyp aus A. pleuropneumoniae-Serotyp 5 hergestellt ist.

4. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Eisenchelator 2,2-Dipyridyl ist.

5. Verwendung einer Impfstoff-Zusammensetzung nach einem vorangehenden Anspruch bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Impfung von Schweinen gegen Infektion durch A. pleuropneumoniae.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Arzneimittel in einer immunostimulatorisch wirksamen Menge der Zusammensetzung zu verabreichen ist.