JPH06503351A

JPH06503351A - ワクチン、特にブタ胸膜肺炎ワクチンの免疫強化

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Publication number: JPH06503351A
Application number: JP4503397A
Authority: JP
Inventors: ダヤル，クリシュナスウォーミー・イエンガー; ジグレッシュ，ナタン
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 1994-04-14
Also published as: EP0563288A1; DE69130953T2; CA2098719A1; AU662116B2; DK0563288T3; AU9168591A; KR930703006A; DE69130953D1; EP0563288A4; KR100258772B1; WO1992011023A1; ATE177010T1; EP0563288B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチン、特にブタ胸膜肺炎ワクチンの免疫強化本発明は、一般的には、獣医学ワクチンの分野に関する。さらに詳しくは、本を増強する方法とに関する。

慢性の肺損傷を伴う急性肺炎を起こすブタの病原体である［ティー・エヌ・セブニャ（Ｔ、Ｎ、　５ｅｂｕｎｙａ）ら、ジャーナル・オフ・アメリカン・ベテリナリー・メディカル・アソンエーション（Ｊ、＾ｍ、　Ｙｅｔ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、）、　１ｇ２　：　１３３１−１３３７（１９ｇ３）コ。

エイ・ブリ二一ロニューモニアエの抗原型は、他の病原体と同様に、感染の間の宿主環境における多くの因子によって影響を受ける。ある一般的な宿主の防御機構は、必須細菌栄養素、例えば鉄を与ないでおくことを伴う。体液中の大部分の鉄は細胞内に存在するが、細胞外の鉄はトランスフェリンやラクトフェリンなどの鉄−結合および輸送タンパクと強固な錯体を形成している。大部分の病原細菌は、発達した高親和性鉄摂取系を有しており、この結合鉄を得ている。これらの摂取系には、通常、２つの成分、すなわち鉄をキレート化する低分子量へモジゾリン賞食細胞と、鉄−ヘモジゾリン賞食細胞錯体のレセプターとして機能する鉄抑制外膜タンパク（ＩＲＱＭＰ）とが含まれる［エイチ・デニール（１，Ｄｅｎｅｅｒ）、インフェクション・アンド・イムニティ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍａ＋ｕｎｉｔｙ）、　５７（３）　：　７９８−８０４（１９１！１９）　；ヴイー・ブラウン（Ｖ、　Ｂｒａｕｎ）、トレンズ・イン・バイオケミカル・ら、アニュアル・レビュー・イン・マイクロバイオロジー（Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　１ｌｉｃｒｏｂｉており、多くの場合、単一種の血清群間における顕著な程度の免疫学的交差反応性を示す。例えば、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｉ　ＲＱＭＰに対する抗原で受動免疫されたシチメンチョウは、イー・コリ敗血症に対して部分的に防御されることが示されている［ノー・エイ・ボリン（Ｃ，Ａ、　Ｂｏｌｉｎ）ら、インフエクション・アン上記のエイチ・デニールらは、毒性エイ・プリューロニューモニアエ抗原型１を鉄制限条件下で増殖させると、一方が１０５にであり、他方が７５にである２つのタンパクのインビトロ合成が増加することを報告している。これらタンパクの機能は、詳しくは同定されていない；しかしながら、これらタンパクの一方または両方が、ヘモジブリン貧食細胞−鉄錆体のレセプターとして役立つと言われている。

エイ・ブリユーロ二二−モニアエ感染の予防は、現在のところ、全細胞を含むバクテリンからなるワクチンに頼っている。この種のワクチンは、この疾患を制御および予防するのに成功していない。全細胞バクテリンは、慢性型の疾患を予防しないだけでな（、無症状キャリアー状態の進展を停止または予防することができるバクテリンではない。さらに、それらは、エイ・ブリューロニューモニア工の異種抗原型に対する免疫を誘起しない［アール・ヒギンズ（Ｒ，■１ｇｇ１ｎｓ）ら、アール・ニールセン（Ｒ，Ｎ１ｅｌｓｅｎ）ら、アクタ・ベテリナリア・スカンジナビカ（Ａｃｔａ　Ｙｅｔ、　５ｃａｎｄ、　）、　２７　：　４５３−４５５（１９８７）］。

獣医学診療の分野では、依然として、エイ・プリューロニューモニアエによる動物の感染に対して有効なワクチンを必要としている。

発明の概要本発明は、新規なワクチン成分および組成物と、公知のワクチンに対する免疫応答を増強する方法とを提供する。

ある態様では、本発明は、防御抗原として有用な、有効量の鉄抑制外膜タンパク（ＩＲＱＭＰ）を含有する新規なワクチン組成物を提供する。好ましい具体例では、このＩＲＱＭＰタンパクは、エイ・プリ二−ロニューモニアエ抗原型５から単離され、ブタのエイ・ブリ二−ロニューモニアエ感染に対するワクチンに使用する約１０５ｋＤの分子量によって特徴付けられる。

別の態様では、本発明は、ＩＲＱＭＰだけでな（、付加的なエイ・ブリューロニューモニアエ抗原、例えば全細胞エイ・ブリューロニューモニアエ・バクテリアおよび／またはエイ・プリ二−ロ二二−モニアエ莢膜抽出物を含有するエイ・ブリューロニューモニアエに対する新規なワクチンを提供する。

さらなる態様では、上記のワクチン組成物は、免疫原性量の１種またはそれ以上の付加的なエイ・ブリ二−ロニューモニアエ抗原を含有させることによって変更してもよい。このような付加抗原としては、特に、溶血素または細胞毒を含有させればよい。また、アジュバントや賦形剤などの他の従来のワクチン成分を本発明のワクチン組成物に添加してもよい。

別の態様では、本発明には、上記ワクチン組成物の各々のワクチン投与量単位が包含される。

本発明のさらに別の態様は、動物に、有効量の１種またはそれ以上の上記ワクチン組成物を内部投与することからなる、エイ・ブリューロニューモニアエに対するワクチンを動物に摂取する方法である。

本発明は、さらに、ＩＲＱＭＰの存在によって特徴付けられる、ある病原体に対して向けられたいずれかの選択されたワクチン組成物に対する動物の免疫応答を、このワクチン組成物に免疫原性量の適当な免疫強化鉄抑制外膜タンパクを混入させることによって、増強する方法を提供する。それにより、このワクチンには、増大した抗原性および免疫原性が付与される。

本発明の他の態様および利点については、その好ましい具体例に関する以下の詳細な説明で、さらに説明する。

発明の詳細な説明本発明は、ワクチン組成物と、それらを病原微生物の感染により生じる疾患の予防に使用する方法とを提供する。なお、これらワクチンは、選択された微生物に特徴的な鉄抑制外膜タンパク（ＩＲＱＭＰ）を含有する。

本発明のワクチン組成物のある具体例は、線維素性胸膜炎や慢性の肺損傷を伴う急性肺炎を起こすアクチッパシラス（ヘモフィラス）ブリューロニューモニアエによるブタの感染によって引き起こされる疾患の予防に有用である。ここに詳しく説明されている具体例は、エイ・プリ二一ロニューモニアエを病原体として用いているが、本発明の教示内容は、当業者が容易に他の病原体に対するワクチン組成物に適用できると期待される。本発明の教示内容は、例示されたワクチン組成物だけに限定されない。

エイ・ブリューロニューモニアエＩＲＱＭＰは、約１０５キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有するとして特徴付けられている［例えば、エイチ・デニール、インフェクション・アンド・イムニティ、　５７（３）　：　７９８−８０４（１９８９）を参照］。本発明者らは、驚くべきことに、エイ・ブリューロニューモニアエＩＲＱＭＰを、その病原体の他の抗原、例えば全細胞エイ・ブリ二一ロニューモニアエ・バクテリアまたはエイ・プリ二−ロニューモニアエ莢膜抽出物抗原を含有するワクチン組成物に混入させると、これらワクチンが、同種エイ・ブリ二−ロ二二−モニアエ抗原型の攻撃に対する防御における著しい向上および異種抗原型（例えば、抗原型１）に対する交差防御における顕著な向上を示すことを見い出した。

ここに詳しく説明されている具体例は、エイ・ブリューロニューモニアエ抗原型５に由来するＩＲＱＭＰを用いている。しかしながら、本発明の教示内容に従えば、他のエイ・ブリユーロ二二−モニアエ抗原型および他の種の病原体のＩＲＯＭＰもまた、エイ・ブリ二一ロニューモニアエワクチンまたは他の病原体ワクチンに、それぞれ有用でありうる。本発明は、例示されているＩＲＱＭＰだけに限定されない。選択された微生物に由来するＩＲＱＭＰは、同様に、上記のもの以外の抗原と共に使用してもよい。さらに、ある微生物に由来するＩＲＱＭＰは、異なる微生物に由来する抗原を含有するワクチンに有用であると期待される。

本発明のワクチン組成物に有用なＩＲＱＭＰは、選択された病原体の培養物に単離および同定すればよい。簡単に説明すれば、ＩＲＱＭＰは、選択された微生物を、例えば、ＰＰＬＯブロスや、特に以下の実施例１で特定される培地処方物などの適当な培地中で培養することによって単離される。ＩＲＱＭＰは鉄制限条件下でだけ生産されるので、例えば、２−２ジピリジルなどの選択された鉄キレート剤を培地に添加する。それゆえ、ＩＲＱＭＰの存在は、コンゴーレッドなどの選択された色素を添加し、培養物の試料に対して色素結合アッセイを実施することによって、培地中に検出される。この方法論については、以下の実施例１で詳しく説明する。

ＩＲＱＭＰが培地中に存在すると同定されれば、次いで、培養物の未処理部分を、様々なワクチン組成物、例えば、不活性化全細胞バクテリアまたは莢膜抽出物抗原調製物の調製に使用すればよい。あるいは、上記のデニールらに記載のものなどの他の単離技術を用いるか、および／または、ＩＲＯＭＰ自体を微生物から単離したり、化学合成または遺伝子工学の組換え技術によって取得してもよい・さらに、培養物から単離されているＩＲＱＭＰタンパクは、別々の成分として、例えば、約０．１〜１．８ｍＬの量で、別の抗原を含有するワクチン組成物に添加することが考えられる。

本発明のエイ・ブリ二一ロニューモニアエ・ワクチンは、有効量の１０１０５ｋＤＩＲＯを活性成分として含有する薬剤組成物として調製すればよい。ＩＲＱＭＰを培養物から単離すれば、その有効量を、適当な薬学的賦形剤中における他のワクチン処方物に添加してもよい。

好ましい具体例では、１０５ｋＤ　ＩＲ，ＯＭＰは、エイ・ブリ二−ロニューモニアエ全細胞ワクチンと共に、免疫促進調製物の成分とすることができる０全細胞エイ・ブリユーロ二二一モニアエ・バクテリアおよびエイ・プリューロニューモニアエ１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含有する新規なワクチンは、以下のように調製すればよい。鉄制限条件下でＩＲＱＭＰを生成する能力を有すると同定されている選択されたエイ・プリ二−ロニューモニアエ株を、鉄キレート剤の存在下、適当な培地中で普通に培養し、ホルマリン（ホルムアルデヒド溶液ＵＳＰ）などの従来の不活性化剤を用いて不活性化すればよい。不活性化剤は、約０．２重量％〜１，０重量％の量で添加すればよい。好ましくは、不活性化剤は最終濃度０゜３％で培地に添加する。グルタルアルデヒドやβ−プロピオラクトン（Ｂ　Ｐ　Ｌ）などの他の公知の不活性化剤も使用してもよい。不活性化剤として利用する場合、グルタルアルデヒドは、好ましくは０．０５重量％〜０．５重量％の濃度で添加し、ＢＰＬは、好ましくは０．１重量％〜０．３重量％の濃度で添加する。しかしながら、当業者は、選択された不活性化剤で不活性化するのに必要な濃度および時間のパラメーターを容易に決定することができる。

不活性化剤を添加すれば、培養物を、適当な期間、例えば、約３７℃で約１８〜４８時間インキュベートする。不活性化剤は、従来の手段によって除去または中和すればよく、そして培養物を、例えば、硫酸水素ナトリウム（３７％）と共に、２０〜２５℃で２４時間まで再びインキュベートして、不活性化剤の中和を完結させる。

不活性化すれば、次いで、ＩＲＱＭＰを含有する培養物は、適当なワクチン中に処方すればよい。全細胞バクテリア・ワクチンは、上記のように不活性化された、ＩＲＱＭＰを含有する全細胞抗原液（すなわち、培養物）を使用して、無毒性および無菌の薬学的に許容される賦形剤中に調製すればよい。本発明の全細胞バクテリア・ワクチンの好ましい具体例は、１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含有する抗原液の水性懸濁液または水溶液であって、好ましくは生理学的ｐＨに緩衝された注射用形態の水性懸濁液または水溶液からなる。好ましくは、リン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を、このような水溶液の調製に使用する。

あるいは、または、さらに、１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含有するワクチン組成物は、従来のアジュバントを含有することもできる。アジュバントは、免疫応答を誘起または増強するための非特異的な刺激剤として使用する。このようなアジュバントとしては、特に、水酸化アルミニウム、ムラミルジベブタイド、アンフィゲン（＾ｍｐｈｉｇｅｎ）、鉱油およびレクチン、そしてタイル（Ｑｕｉｌ）　Ａなどのサポニンが挙げられる。

好ましい全細胞バクテリンおよびＩＲＱＭＰワクチン組成物については、実施例３のパートＡで詳しく説明する。

さらに別の例示的な代替物では、１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰは、エイ・プリューロニューモニアエ・サブユニット・ワクチンなどの別の免疫刺激調製物中にあって、投与することができる。本発明のこの態様のある具体例は、エイ・ブリ二−ロニューモニアエ莢膜抽出物タンパクおよびエイ・ブリューロニューモニアエ１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含有する新規なワクチンである。莢膜抽出物は、エイ・ブリ二一ロニューモニアエを培養し、インキュベートし、培養物を冷却し、菌体ペレットを得て、次いで、これをＰＢＳに懸濁し、菌体を加熱し、再び遠心分離し、上清を集め、そして抽出された生成物を滅菌することによって調製される。

この方法の条件については、実施例２で説明する。

ＩＲＱＭＰは、莢膜抽出物を調製する細菌培養物中にキレート剤が存在するか、しないかに依存して、必要に応じて、免疫刺激調製物中に存在していてもよい。

しかしながら、本発明によれば、ＩＲＱＭＰの存在が好ましい。また、このようなワクチンは、莢膜抽出物タンパクを上記細菌の１種またはそれ以上の株から調製することが好ましい。培養培地中に存在するタンパクは濃縮され、ＩＲＱＭＰを含むタンパク濃度および炭水化物濃度が、それぞれ、公知の方法によって計算される。好ましい投与量の莢膜抽出物ワクチンを調製するのに必要なＩＲＱＭＰを含む抽出物抗原の容量を決定するために計算を行う。

次いで、不活性化剤、例えば２５％グルタルアルデヒドを使用して、様々な抗原型（例えば、Ａｐｐｌ、５および７）に由来する抽出物抗原をカップリングさせ、タンパク成分を架橋させると、巨大分子が形成する。次いで、抽出物抗原とＩＲＱＭＰおよびグルタルアルデヒドとの混合物を、好ましくは２０〜２５℃で約３０分間〜１８０分間インキュベートする。過剰のグルタルアルデヒドを中和するために、この組合せにリジン原液を添加し、その混合物をインキュベートする。

次いで、この処方物を、下記の莢膜抽出物ワクチン調製物に由来する細胞非含有上清画分と混合することによって、投与用に乳化させればよい。この画分は、少量のＩＲＱＭＰを含有しつるから、希釈剤として使用してもよい。この処方物への添加物としては、選択されたアジュバント、ならびに従来のワクチン防腐剤、界面活性剤、そして、例えばメルチオレート、ツウイーン（Ｔｖｅｅｎ）　８０、およびスパン（Ｓｐａｎ）　８０などの乳化剤が挙げられる。このようなワクチンの詳細な説明については、実施例３のパートＢで詳しく説明する。

本発明のワクチンのさらに別の好ましい具体例は、ＩＲＱＭＰ、好ましくはエイ・プリ二−ロニューモニアエ抗原型５に由来するＩＲＱＭＰと、同じ微生物の１種またはそれ以上の他の株に由来する莢膜抽出物とを含有する三価のワクチンである。付加的な株はＩＲＱＭＰを与えない。実施例３のパートＣは、このようなワクチンに関する詳細な説明である。好ましくは、三価のワクチンは、微生物のある株に由来するＩＲＱＭＰと、少なくとも第２および第３の株に由来する莢膜抽出物とを用いる。付加的な株に由来する付加的な莢膜抽出物を用いてもよい。

これは、微生物、例えばエイ・ブリューロニューモニアエの３種の株すべてに対して防御を付与する能力を有するワクチンを与える。

本発明のＩＲＱＭＰは、２種より多くの他の抗原を含むワクチンにも有用であると期待される。エイ・プリ二−ロ二二−モニアエ抗原である他の抗原が、本発明のワクチン中に存在していてもよい。例えば、溶血素および細胞毒を、付加的な免疫原性を与えるために、従来の投与量で、これらワクチンに用いてもよい。

本発明のワクチンは、薬剤調製物中にある場合は、単位投与形態で存在することが好ましい。本発明の目的では、免疫原性量の１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰは、４８８ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、　４８８　ｎｍ）がバルク液１ｍＬあたり０．２８減少するか、あるいは単一用量のワクチンの１７１０〜９／１０である。ＩＲＱＭＰ含有全細胞バクテリン・ワクチンは、好ましくはｌＸｌ０”〜ｌＸｌ０’ ｌＸｌ０’コロ二−ＣＦＵ）、より好ましくは５Ｘ１０’ＣＦＵを含有する。好ましくは、莢膜抽出物を含有するワクチン中には、ワクチンの１用量あたり、少なくとも２５〜５０μｇ／抗原型の莢膜抽出物が存在する。ＩＲＱＭＰ含有莢膜抽出物ワクチンも、１用量あたり、好ましくは２５〜５０μｇの全炭水化物を含有する。

適当な治療上有効な用量は、上記の免疫原性量に基づいて、当業者が容易に決定することができる。従って、薬剤調製物は、免疫原性量の活性成分の滅菌溶液０．１〜１．８ｍＬからなる単位投与量を与える。本発明のある具体例には、全細胞エイ・ブリューロニューモニアエ・バクテリンと共に免疫原性量のエイ・プリューロニューモニアエ１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含む滅菌溶液０．１〜１．８ｍＬからなるワクチン投与量単位が包含される。別の具体例には、エイ・プリ二− ロニューモニアエ莢膜タンパクと共に免疫原性量のエイ・ブリューロニューモニアエ１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含む滅菌溶液０１〜１．８ｍＬからなるワクチン投与量単位が包含される。さらに別の具体例は、免疫原性量の上記２つのワクチン具体例の一方と、１種またはそれ以上の付加的な抗原成分との滅菌溶液０．１〜１．８ｍＬからなる投与量単位である。

望ましい投与計画は、２用量の所望ワクチン組成物を投与することを含む。ワクチンの投与形式は、ワクチンを宿主に送達するいずれの適当な経路であってもよい。しかしながら、ワクチンは、好ましくは筋肉中注射によって投与する。望ましい場合には、他の投与形式、例えば経口、鼻腔内、皮肉、または腹腔的投与を用いてもよい。

ブタを用いた本研究では、３週間間隔で被験動物に投与した２用量のワクチンの筋肉内注射を用いる。しかしながら、特定の動物に特異的な用量レベルが、年齢、全身の健康状態、性別、および動物の餌；動物の種：投与の時期：投与の経路；投与される他の薬剤との反応；およびめられる防御の程度などを含む様々な要因に依存することは理解される。もちろん、投与は、必要であるか、あるいは望ましければ、他の適当な間隔で繰り返すことができる。こうして、これらワクチンの投与の投与量、形式および様式は、獣医師によって決定される。

本発明のワクチンは、エイ・ブリューロニューモニアエ抗原型５の毒性体による攻撃に対する増大した防御を提供する。これらワクチンは、動物において、エイ・ブリューロニューモニアエに対する優れた免疫応答を誘起することができ、かつ、異種抗原型間の付加的に交差防御を与えることができ、こうして動物が自然感染を切り抜ける免疫状態を疑似的に作り出す。本発明のワクチン組成物によって誘起される防御の特異的な機構は、実施例４の表３に示すインビボでの動物試験によって明らかなように、１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰタンパクを含まないワクチンに比べて、増大した防御である（肺の平均損傷率が低い）。

以下の実施例は、エイ・ブリ二一ロニューモニアエ１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを単離する好ましい方法と、この新規な成分を含有する様々なワクチンを調製および試験する好ましい方法とについて例示する。これら実施例は、単なる例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１−エイ・プリ二−ロニューモニアエ１０５ｋＤタンパクの単離まず、エイ・ブリユーロ二二−モニアエ抗原型１（シェルコツ（Ｓｃｈｅｌｋｏｐｆ）株）および抗原型５（Ｋ−１７株）［いずれも、スミス・クライン・ビーチャム・アニマル・ヘルス（Ｓ＋１ｉｔｈＫ１ｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ　Ａｎｉｍａｌ　１ｌｅａｌｔｈ）のノーデン・ラボラトリーズ（Ｎｏｒｄｅｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（リンカーン、ネブラスカ）から入手可能コを、以下に詳しく説明するように、鉄キレート剤２−２°ジピリジル［シグマ・ケミカル・カンパニー　（Ｓｈｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）、セントルイス、ミーズリ− 州］を、最終濃度が２００μＭになるように添加することによって、所定の合成培地（ＭＩＥ）、すなわちバイチク（Ｂｉｔｅｋ）　［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト、ミシガン州］およびＰＰＬＯ［ディフココブロス中に、ＩＲＱＭＰを分泌する能力について試験した。

ＭＩＥ培地（２０リツトル）は、下記の３つの原液の混合物を組合せ、この混合培地を中性ｐＨに調節し、そして、この混合培地を濾過滅菌することによって調製する。

原液＃１は、以下の成分を順番に撹拌しながら溶解することによって調製する（１７３９９．３ｍＬ）：　ＩＮ　ＨＣＩ、２８０ｍＬ；Ｌ−システィン、４．０ｇ＋チロシン、４．０ｇ；蒸留水、１６３１９．３ｍＬ：ｏイシン、６．０ｇ；アルギニン、６．０ｇニゲリシン、０．６ｇ；リジン、１．０ｇ；メチオニン、２．０ｇ：セリン、２．０ｇ＋ウラシル、２．０ｇ；ＩＮ　ＮａＯＨ，８００ｍＬ；ヒポキサンチニ／、（Ｌ４ｇ；イノシ：ｚ、４０．０　ｇ　＋　Ｋ２ＨＰＯ４，６９，６ｇ　；ＫＨ２ＰＯ＜、５４．４ｇ：および酵母エキス、１２０．０　ｇ。

原液＃２　（２４００，７ｍＬ）は、以下の成分を順番に撹拌しながら溶解することによって調製する・蒸留水、２２９０ｍＬＨアスパラギン酸、１０．０ｇ：グルタミン酸、２６．０ｇ；塩化ナトリウム、１１６゜ｏｇ、硫酸カリウム、２ｏ。

Ｏｇ：塩化マグネシラＬ　（６Ｈ２０）、８．０ｇ；塩化カルシウム（無水）、０．４４４ｇ：ＥＤＴＡ、０．０７ｇ；塩化アンモニウム、４．４ｇ　；　ＩＯＮ　ＮａＯＨ１２３，６ｍＬ０次いで、以下の成分を撹拌しながら溶解する：ツウィーン８０．０．４ｍＬ：ＤＬ−乳Ｍ（６０％溶液）、２６．６ｍＬ　：およびグリセリン、６０゜ｍＬ０原液＃３　（２００ｍＬ）　は、可溶性デンプン２０．０　ｇを蒸留水２００ｍＬに、穏やかに加熱し、撹拌しながら溶解することによって調製する。

原液＃２を原液＃１に添加する。次いで、この混合物に原液＃３を添加する。

この混合培地のｐＨを７３±０．１ｐＨ単位に調節し、得られた完全培地を濾過滅菌する。この溶液は、約４℃で２週間まで保存してよい。

ＭＩＥブロスを使用する前に、２０ｍＬの滅菌ＮＡＤ原液を添加する。この溶液は、順番に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）１．０ｇ、チアミン１０ｇ、パントテン酸カルノ・ラム１．　Ｏｇ、および］、ＯＯｍＬの蒸留水を、撹拌しながら溶解することによって調製する。この培地を再び濾過滅菌し、−２０℃で保存する。

ＰＰＬＯブロス（約１リツトル）は、順番に、ＰＰＬＯブロスｗ１０　Ｃ■［ディ７）］　２２１．０ｇグルコース５．０　ｇ、および蒸留水１０１００Ｏを、撹拌しながら溶解することによって調製する。この培地は、ｐＨ約７．３に調節し、濾過滅菌する。使用する前に、１．ＯｍＬの滅菌ＮＡＤ原液を添加し、１０．ＯｍＬの滅菌ツウィーン８０を含有する１００ｍＬの滅菌蒸留水を添加する。

バイチク・ブロス（約１リツトル）は、撹拌しながら、バイチク・ブロス［ディフコ］２９．２ｇを蒸留水１０１００Ｏに溶解することによって調製する。この培地は、ｐＨ約７．３に調節し、濾過滅菌する。使用する前に、１．ＯｍＬの滅菌ＮＡＤ原液を添加する。

上記の培地の３つすべてを、ＩＲＱＭＰを生産する能力について試験した。以下により詳しく説明する結果は、ＩＲＱＭＰの生産にはＰＰＬＯブロスが最も適していることを示唆した。

１０５ｋＤタンパクの存在は、上記のデニールおよびボッターに記載の方法に従って実施した色素結合（コンゴーレッド）アッセイによって決定した。

Ａ、抗原型エエイ・ブリ二−ロニューモニアエ抗原型１は、凍結したマスターシード（１％）から、０．５％グルコースおよび０．１％ＮＡＤ　［シグマ］溶液を補足した１００ｍ１のＰＰＬＯブロスに直接接種した。この培養物を３７℃で一晩インキユベートした。その後、０．５％グルコースおよび０．１％ＮＡＤ溶液を補足した５００ｍ１のＰＰＬＯブロスに、エイ・ブリューロニューモニアエ抗原型１のこの一夜培養物からの２％シードを接種し、３７℃でインキュベートした。

６５０ｎｍでの光学密度が１．０に達したとき、２−２°ジピリジル（最終濃度２００μＭ）の原液をエイ・ブリューロニューモニアエ抗原型１の５００ｍ１培養物に添加した。３７℃で９０分間インキュベートした後、細胞を遠心分離（８０００ｘｇ、１０分間）によって採取した。細胞ベレットを１００ｍ１の滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、０Ｄ６５゜□＝１．０までＰＢＳに再懸濁した。

エイ・フリ二−ロニューモニアエ培養物１００ｍ１あたり１ｍｌのコンゴーレッドを添加し、混合した。直ちに、１．ＯｍＬの試料を、４つの微小遠心管の各々に取り、微小遠心管中で１分間遠心し、上清を４８８ｎｍで（ＰＢＳをブランクとして）読み取−った。０１％ＮＡＤを含むＰ　Ｐ　Ｌ　Ｏブロスを対照として使用した。培養物を撹拌しながら３７℃で維持した。コンゴーレッドを添加した後、０．２０．４０および６０分後に、試料（４，０ｍ１）を採取した。

このアッセイの結果は、以下の表ＩＡに示されているが、エイ・ブリ二−ロニュー七ニアエ抗原型１の外膜タンパクに及ぼす鉄制限の影響を示している。コンゴーレッドの摂取は、溶液からのコンゴーレッドの減少として表す。

表ＩＡ時間　４８８止での０Ｄ２０　０．１４　０．２７４０　０．１０　０．２０６０　０．０６　０．１８こうして、エイ・プリ二−ロニューモニアエ抗原型１は、鉄制限条件下でコンゴーレッドを結合することができる。これらの結果は、ＩＲＱＭＰ調製物がフンゴーレッドを結合する能力を有することを示し、さらに、ＩＲＱＭＰがインビボ増殖の間におけるヘミンなどの鉄錯体の獲得にある役割を果たすことを示唆している。

Ｂ、抗原型５エイ・プリ二−ロニューモニアエ抗原型５は、０．５％グルコース、０．０２％ツウィーン８０およびＮＡＤ　（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を補足した１０リツトルのＰＰＬＯブロスを入れた１４リツトルの発酵槽中で増殖させた。このブロスに、エイ・ブリューロニューモニアエ抗原型５０２％シード接種物を接種した。

、培養物がＯＤ、、。。、＝１．０になれば（接種してから４時間後）、キレート剤を最終濃度が２００ｇＭになるように添加した。

９０分後、５リツトルの培養物を莢膜抗原調製物（実施例２）用に採取した。

このうち、２００ｍ１をコンゴーレッド結合分析でのプロセシング用に採取した。

２００ｍ１の試料を遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄した。これら細胞をＯＤ、５．、、、が１．４になるまで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。滅菌コンゴーレッド溶液を最終濃度が３０ｇｇ／ｍｌになるまで添加し、アッセイを上記のように実施した。この試料は、発酵槽の培養物］、ｍｌあたり００７５単位の０Ｄ４ｓａ□減少を示した。このアッセイの結果は、以下の表ＩＢに示すが、エイ・ブリ二−ロニューモニアエ抗原型５の外膜タンパクに及ぼす鉄制限の影響を示している。

表ＩＢ時間　４８８ｎｍでの０Ｄ４０　０、０５５０　０、０４６０　０、０３これは、コンゴーレッドを結合するエイ・ブリューロニューモニアエ抗原型５の能力を示している。これらの結果は、ＩＲＱＭＰ調製物がコンゴーレッドを結合する能力を有することを示し、ＩＲＱＭＰがインビボ増殖の間におけるヘミンなどの錯体鉄の獲得にある役割を果たしうることを示唆している。

莢膜抗原調製物にも使用せず、コンゴーレッド・アッセイにも使用しなかった培養物の残り５リツトルは、実施例３で詳しく説明するように、ＩＲＱＭＰを含む全細胞不活性化ワクチンを調製するために、最終濃度が０．３％になるようにホルマリンを添加して不活性化した。

実施例２−莢膜抽出物抗原の調製細菌莢膜抽出物抗原は、一般的には、以下のように調製する。ＭＩｔブロスに、予め標準的な細菌乾燥溶媒培地中において一７０℃で凍結させたエイ・ブリューロニューモニアエの１％シードを接種する。次いで、この培養物を３７℃で撹拌しながら１６〜１７時間インキュベートする。１０リツトルのＭＩＥ７’ロスを入れた１４リツトルの発酵槽に、エイ・プリ二一ロニューモニアエの１６〜１７時間培養物からの１〜５シードを接種する。１４リツトルの発酵槽に対する発酵条件は以下のとおりである　温度は３７℃±１℃、ｐＨは７６０〜７．３で、５ＮＮａＯＨで調節し、Ｄ、０．は、１００〜２５Ｏｒｐｍで撹拌しながら、滅菌した室内空気で３０％に維持する。次いで、この培養物を、６５０゜７での光学密度によって決定される中期から後期初めの対数増殖期（４〜１６時間）まで増殖させる。培養物が中期から後期初めの対数増殖に達したら、この培養物を２０ ℃またはそれ以下に冷却し、遠心分離するか、あるいはミクロ濾過に付す。菌体ベレツトをＰＢＳ　（当初の培養物容量の１／１０〜１／１０００）に、撹拌しながら４℃で１〜１０時間再懸濁する。菌体を徹底的に再懸濁した後、懸濁液を５６℃±１℃に６０分±３０分間加熱する。次いで、この材料を遠心分離するか、あるＬ％はミクロ濾過に付し、上清を採取する。１０％メルチオレートおよび１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、二ナトリウム塩または四ナトリウム塩）を防腐剤として添加する。最終濃度は、それぞれ０．０１％および０．０７％（Ｗ／Ｖ）を越えない。抽出された生成物は、０．４５μｍおよび０．２μｍのフィルターを通して、滅菌保存容器中に滅菌濾過し、構築するまで２℃〜７℃ で保存する。必要であれば、この生成物は、まず濾過または遠心分離によって清澄化し、次いで濾過滅菌する。

鉄キレート剤を培養培地に添加しなかったから、上記の手順では、ＩＲＱＭＰを含有しない莢膜抽出物抗原が製造される。これらの莢膜抽出物抗原は、対照として使用しうる。あるいは、上記手順に従って、ＩＲＱＭＰを生産できなＬＮ細菌株から付加的な抗原を提供してもよい。

しかしながら、ＩＲＯＭＰ含有莢膜抽出物は、２−２′ジピリジルなどの選択された鉄キレート剤を増殖培地に添加し、ＩＲＱＭＰを生成させることによって修正した上記手順に従うことによって製造することができる。

実施例１で説明し７：、ホルマリンで不活性化された培養物（抗原型５）を、ＩＲＱＭＰ含有全細含有全細胞バクテリオるために、以下のように使用した。　・１．７８ｘｌＯ’ＣＦＵ／ｍＬのＩＲＱＭＰ含有エイ・ブリ、−ｏ二、−モニ７工抗原型５全細胞抗原液７０．２５ｍＬ　（０，２８１ｍＬ容量／用量）を、１０％メルチオレート０．５ｍＬ　（０，００２ｍＬ容量／用量）およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）３９４．２５ｍＬ　（１，５７７ｍＬ容量／用量）と共に混合する。ツウィーン８０７．ＯＯｍＬ　（０，０２８ｍＬ容量／用量）およびスバ：／８０３．ＯＯｍＬ　（０，０１２ｍＬ容量／用量）を、アンフイゲン２５．　ＯＯｍＬ　（０，１０ｍＬ容量／用量）に添加して、油性画分を形成する。

次いで、ンルバーソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）乳化器［ミクストロニクス・コーポレーション（Ｍｉｘｔｒｏｎｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、クリーブランド、オハイオ州］またはその等偏動を製造業者の説明書に従って使用して稼働させながら、この油性画分を、抗原液、１０％メルチオレート、およびＰＢＳ画分に添加する。次いで、バクテリンを２分間乳化させる。この結果、２５０用量のＩＲＱＭＰ含有全細含有全細胞バクテリオれる。なお、各用量は５Ｘ１０８コロニ一形成単位を含む。

Ｂ、ＩＲＱＭＰ含有莢膜抽出物ワクチン１用量あたり全炭水化物５０μｇである２５０用量のＩＲＯＭＰ含有莢膜抽出物バクテリンを、以下のようにして調製した。

まず、１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰ含有エイ・ブリ二−ロニューモニアエ抗原型５抽出物抗原のバルクロットを、実施例２で説明した手順に従って製造した。このバルクロットのタンパク濃度は、タンパク測定のローリ−（Ｌｏｖｒい法［ハーバ −ト（Ｈｅｒｂｅｒｔ）、フイブラス（Ｐｈｉｐｐｓ）およびストレンジ（Ｓｔｒａｎｇｅ）、メソッド・イン・マイクロバイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第５Ｂ巻、第３章、第２４９〜２５２頁、ンエイ・アール・ノリス（Ｊ、Ｒ，Ｎｏｒｒｉｓ）およびディー・ダブリュー・リボンズ（Ｄ、Ｗ、　Ｒｉｂｂｏｎｓ）編（１９７１年）（アカデミツク・プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク）］によって、２５５０μｇ／ｍＬであると決定された。

次に、１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰ含有エイ・プリューロニューモニアエ抗原型５抽出物抗原のバルクロットの全炭水化物濃度は、全炭水化物測定のフェノール法［）＼−バート、フイブラスおよびストレンジ、前出、第２７２〜２７７頁］によって、１３２０μｇ／ｍＬであると決定された。

次いで、１用量あたり５０ｇの全炭水化物を含有する２５０用量のハクテリンを調製するのに必要な１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰ含有エイ・ブリューロニューモニアエ抗原型５抽出物抗原のミリリットル数を決定する。以下は、計算例である１用量あたり５０ｇｇの全炭水化物／１０５ｋＤ　ＴＲＯＭＰ含有エイ・プリ二−ロニューモニアエ抗原型５抽出物抗原バルク液に対して１３２０μｇ／ｍＬの全炭水化物×２５０用量＝５０μｇ／用量の炭水化物を含有する２５０用量を調製するのに必要な材料の９．５ｍＬｏ次いで、９ｍＬの１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰ含有エイ・プリューロニューモニアエ抗原型５抽出物抗原を、２５％グルタルアルデヒドとカップリングさせる。

２５０用量のバクテリン中に存在するタンパク１ｇあたり１．ＯｍＬの２５％グルタルアルデヒドを添加する。９用量、の１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰ含有エイ・プリューロニ、−モニアエ抗原型５抽出物抗原をカップリングさせるのに必要な２５％グルタルアルデヒドの量を決定するために、以下の計算を行う・タンパク　Ｖｏｌ　必要　２５０用量に対する従って、カップリングには、０．０２４ｍＬの２５％グルタルアルデヒドが必要である。

０、０２４ｍＬの２５％グルタルアルデヒドを、９．５ｍＬの１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰ含有エイ・プリ二−ロニューモニアエ抗原型５抽出物抗原に添加する。次いで、この混合物を、撹拌しながら室温で１時間インキュベートする。１時間インキュベートした後、０．０２４ｍＬのリジン原液（１２，５ｍｇ／ｍＬ）を添加する。この混合物を、撹拌しながら室温で２時間インキュベートし、次いで４ ℃で保存する。

次いで、バクテリンを以下のようにして乳化する：１３２０μｇ／ｍＬの炭水化物である（グルタルアルデヒドとカップリングした）９．５ｍＬの１０１０５ｋＤＩＲＯ含有エイ・ブリューロニューモニアエ抗原型５抽出物抗原（０，０３８容量／用量）を、１０％メルチオレート０．５ｍＬ　（０，００２ｍＬ容量／用量）および４５５．ＯＯｍＬの上清（熱抽出前Ｘ１．８２０ｍＬ容量／用量）と共に混合する。ツウィーン８０　７．ＯＯｍＬ　（０，０２８ｍＬ容量／用量）およびスノ々ン８０　３、ＯＯｍＬ　（０，０１２ｍＬ容量／用量）を、アンフイゲン２５．０　ＯｍＬ（０，１０ｍＬ容量／用量）に添加し、油性画分を形成する。次いで、乳化器を稼働させながら、この油性画分を抗原液、１０％メルチオレート、および上清両分に添加する。次いで、バクテリンを２分間乳化させる。

Ｃ９三価のワクチン三価のワクチン、すなわち、エイ・ブリ二−ロニューモニアエ抗原型５、抗原型１莢膜抽出物、および抗原型７莢膜抽出物から単離した１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰタンパクを含有するワクチンを、効力について試験した。抗原型５は、上記の実施例１で説明したように調製した。抗原型１は、上記の実施例１で説明したようにＭＩｔ培地中で増殖させた。抗原型７［スミス・クライン・ビーチャム・アニマル・ヘルス、ノーデン・ラボラトリーズ、リンカーン、ネブラスカ州］は、抗原型１について上で説明したように増殖させた。

１用量あたり炭水化物２５μｇである５００用量のＩＲＱＭＰ含有三価莢膜抽出物バクテリンは、以下のようにして調製した。まず、各エイ・ブリ二−ロニューモニアエ抗原型（１，５＋１０５ｋｄ、および７）莢膜抽出物抗原のノくルクロ・ソトのタンパク濃度を、タンパク測定のローリ−法［）１−パート、フイ・ソブスおよびストレンジ、前出、第２４９〜２５２頁］によって決定した。タンパク濃度は、抗原型１については１．３９５μｇ／ｍＬ、１０５ｋＤタンパクを含む抗原型５につＬｌては１．０００μｇ／ｍＬ、および抗原型７については１，４７５μｇ／ｍＬであった。

全炭水化物測定のフェノール法［バーパート、フイブラスおよびストレンジ、前出、第２７２ル２７７型（１、５＋１０５ｋｄ，および７）莢膜抽出物抗原のバルクロットの全炭水化物濃度は、抗原型１にツイテは１．５６１μｇ／ｍＬ，１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含む抗原型５については６００μｇ／ｍＬ，および抗原型７については１２５０μｇ／ｍＬであることが見い出された。

１用量あたり１抗原型あたり２５μｇの全炭水化物を含有する５００用量のバクテリンをｗｌ製するのに必要な各エイ・ブリューロニューモニアエ莢膜抽出物抗原のミリリットル数は、以下の計算例に示すように決定される。

５＋１０５ｋＤ　２５μｇ／用量７６００μｇ／ｍＬ　Ｘ５００用量＝２１．ｈＬ７　２５　ｕ　ｇ／用量／１２５０μｇ／＋ＩＩＬｘ５００用量＝１０．ＯａＬ次いで、８．ＯａＬの抗原型１、２１．ＯａＬの１０５ｋＤタンパク含有抗原型５、および１０．ＯａＬの抗原型７莢膜抽出抗原を、２５％グルタルアルデヒドとカップリングさせる。５００用量のバクテリン中に存在するタンパク１グラムあたり１．ＯａＬの２５％グルタルアルデヒドを添加する。

三価の莢膜抽出抗原（全容量＝３９．０ｍＬ）をカップリングさせるのに必要な２５％グルタルアルデヒドの量を決定するために、以下の計算を行う：タンパク　ｖｏｌ　必要　２５０用量に対する抗原型５　１０００μｇ／ｍＬ　ｘ　２１．Ｏｎ＋Ｌ　＝　２１．０００μｇ＋１０５ｋＤ抗原型７　１４７５μｇ／＋ｎＬ　Ｘ　１０．ＯａＬ　＝　１４．７５０μｇ全タンパク＝　４６．９１０μｇ従って、カップリングには、０．　０　４　７ｍＬの２５％グルタルアルデヒドが必要である。

８、ＯａＬの抗原型１莢膜抽出物調製物、２１．ＯａＬの１０５ｋＤタンパク含有抗原型５莢膜抽出物調製物、および１０．ＯａＬの抗原型７莢膜抽出物調製物を組合せる。上記の調製物に０．　０　４　７ｍＬの２５％グルタルアルデヒドを添加する。次いで、この混合物を、撹拌しながら室温で１時間インキュベートする。

１時間インキニンベートした後、０．　０　４　７ｍＬのリジン原液（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を添加する。この混合物を、撹拌しながら室温で２時間インキュベートし、次いで４℃で保存する。

次いで、２５μｇ／抗原型／用量を含有する三価バクテリンは、以下のようにして乳化する＋３９．ＯａＬのエイ・プリ二ーロニューモニアエ抗原型１、５および７・グルタルアルデヒド・カップリング莢膜抽出抗原（上記Ｘ０．０８８ｍＬ容量／用量）を、１０％メルチオレート−ＥＤＴＡ　１．ＯＯｍＬ　（０．００２ｍＬ容量／用量）、１０％ＥＤＴＡ　０．６ｍＬ　（０．ＯＯ１２ｍＬ容量／用量）、および熱抽出前に得られたキレート剤含有エイ・ブリ二ーロニューモニアエ抗原型５の上清８８９、４ｍＬ　（１．７７８８ｍＬ容量／用量）と混合する。ツウィーン８０　１４。

ＯＯｍＬ　（０．０２８ｍＬ容量／用量）およびスパン８０　６．ＯＯｍＬ　（０．０１２ｍＬ容量／用量）を、アンフィゲン５　０．　０　ＯａＬ　（０．　１　０ｍＬ容量／用量）に添加して、油性画分を形成する。次いで、乳化器を稼働させながら、油性画分をグルタルアルデヒド・カップリング調製物、１０％メルチオレート−ＥＤＴＡ，１０％ＥＤＴＡおよび上清画分に添加する。次いで、バクテリンを２分間乳化する。

実施例４−ワクチン接種実験１０５ｋＤタンパクを含有する各ワクチン型、すなわち全細胞バクテリンおよび莢膜抽出物ワクチンを、ワクチン接種−抗原投与実験により、防御能力について、ブタで試験した。同様のワクチンを、バルク液が１０５ｋＤタンパクを含有しないこと以外は、上記のようにして調製した。適当な対照であるワクチン非接種のブタを同様に試験した。

実施例３のパートＡおよびＢで説明したように調製した全細胞バクテリンおよび莢膜抽出物ワクチンについて、エイ・ブリ二ーロニューモニアエ抗原型５から単離した１０５ｋＤタンパクを含有するものと、含有しないものを使用して、２ｍＬのワクチン接種投与量を、エベール（Ｅｂｅｒｌｅ）飼養場からのブタの首側部に筋肉内投与した。

ワクチンＸＨＰＰ−１　：　１０５ｋＤタンパクを含有しない全細胞バクテリンを、５Ｘ１０’ＣＦＵ／用量で投与した。

ワクチンＸＨＰＰ−２　：実施例２で説明した、１０５ｋＤタンパクを含有する全細胞バクテリンを、５ｘｌＯ”ＣＦＵ／用量で投与した。

ワクチンＸＨＰＣ−１６　＋　１０５ｋＤタンパクを含有しない莢膜抽出物ワクチンを、５０μｇ／炭水化物／用量で投与した。

ワクチンＸＨＰＣ−１８　：　１０５ｋＤタンパクを含有する莢膜抽出物ワクチンを、５０μｇ／炭水化物／用量で投与した。

第１回目のワクチン接種は、ブタが２〜４週齢のときであった。第２回目のワクチン接種は、第１回目の接種の３週間後に投与した。

第２回目の接種の１週間後、適当な抗原型エイ・プリューロニューモニアエ抗原型５による抗原投与を、毒性培養物を鼻腔内に点滴注入する（鼻孔あたり０。

５ｍ１）ことによって実施した。抗原投与接種物中における細胞数は、１．１９Ｘ１０’ＣＦＵ／ｍ］であった。抗原投与の１週間後、これら動物を死体解剖した。

抗原投与によって死亡した動物は、死亡直後に死体解剖した。

これらのワクチン接種実験の結果を、以下の表２に示す。

表２肺の平均　肺におけるワクチン　ブタの数　損傷率％　併発の減少率ＸＩＬＰＰ−１　１０　３２．　２４　３７．　５６ＸＨＰＰ−２　１０　１９．　１８　６２．　８５ＸＨＰＣ −１６　１０　４２．　３８　１７．　９２ＸＨＰＣ−１８　１０　１０．　３１　８０．　０３なし　１０　５１．６３　− これらの結果は、１０５ｋＤ　ＩＲＯＭＰを含有するワクチン組成物（ＸＨＰＰ −２およびＸＨＰＰ−１８）をワクチン接種したグループについて、肺の平均損傷率の著しい減少および肺１＝おける併発の減少率の著しい増加率を示している。

Ｂ．三価のワクチン実施例３のパートＣで説明したようにして調製した２株の莢膜抽出物と共に、エイ・ブリ二ーロニューモニアエ抗原型５から単離された１０５ｋＤタンパクを含有する三価のワクチン、およびＩＲＱＭＰを含有しないワクチンを使用して、２ｍＬのワクチン接種投与量を、エベール（Ｅｂｅｒｌｅ）飼養場からのブタの首側部に筋肉内投与した。

使用したワクチンは、以下のとおりである：ワクチンＸＨＰＣ−１９　：　２５ μｇの全炭水化物／抗原量／用量を含有するが、１０５ｋＤタンパクは含有しない莢膜抽出物ワクチン。

ワクチンＸＨＰＣ−２１　：　１０５ｋＤタンパクおよび２５μｇの全炭水化物／抗原量／用量を含有する莢膜抽出物ワクチン。

ワクチンＸＨＰＣ−２０　：　５０μｇの全炭水化物／抗原量／用量を含有するが、１０５ｋＤタンパクは含有しない莢膜抽出物ワクチン。

ワクチンＸＨＰＣ−２２　：　１０５ｋＤタンパクおよび５０μｇの全炭水化物／抗原量／用量を含有する莢膜抽出物ワクチン。

３つの培養物、すなわち抗原型１、抗原型５、および抗原型７を使用して、ワクチングループおよび対照動物グループにおける各動物を抗原投与した。これら培養物中には、以下の細胞数が含まれていた：エイ・ブリユーロ二二ーモニアエ抗原型１＝２．１９Ｘ１０＠ＣＦＵ／ｍｌ。

エイ・ブリ二ーロニューモニアエ抗原型５＝８．８５Ｘ１０”ＣＦＵ／ｍ＋，およびエイ・ブリユーロ二二ーモニアエ抗原型７＝１．０１ｘｌＯ’ＣＦＵ／ｍ＋。

パートＡで一価のワクチンについて説明したようにして、ブタに抗原投与した。

対照は、擬薬（ＰＢＳでアジュバントしたアンフィゲン）ワクチンを投与したブ夕のグループであった。擬薬は、ＸＨＰＣ−１９、ＸＨＰＣ−２０、ＸＨＰＣ− ２１、またはＸＨＰＣ−２２のいずれかを投与したブタと同じワクチンスケジュール（同じ用量および経路）で投与した。結果を以下の表３に示す。

表３抗原投与　肺の平均　肺におけるワクチン　ブタの数　抗原型　損傷率％　併発の減少率１９　１　１２．２７　７３．２１ＸＨＰＰ−１９１８５３０，０１５５，１０２０７２０，２０５９，６０１０１４，０９１，２７ＸＨＰＰ−２１１０５７，８９８８，２０１０７２０，２５５９，５４１９１２６，４３４２，３０ＸＩＮＰＣ−２０２０５２５，８０６１，４０２０７２１，０８５７，８８１０１８，９６８０，４４ＸＲＰＣ−２２１０５３５，５１４６，８８１０７１７，９３６４，１８９１４５，８０− なし　１０　５　６６．８５　− １０　７　５０、０５　− これらの結果は、１０５ｋＤタンパクを含有するワクチン（ＸＨＰＰ−２１およびＸＨＰＰ−２２）を接種した動物では、１０５ｋＤタンパクを含有しないワクチンを投与した動物に比べて、たいていの場合、肺の損傷率が非常に減少したことを示している。

三価のワクチンは、三価のワクチンがワクチンに含まれる３つの抗原型に対する防御を与えるので、−価のワクチンに比べて、特に有利である。これに対し、− 価のワクチンは、その処方物中に含まれる単一の抗原型に対する防御だけを与える。

本発明の数多くの変更および変形は、上記の明細書に含まれ、当業者に自明であると考えられる。例えば、エイ・ブリューロニューモニアエ以外の他の適当な不活性化病原体の使用を、本発明のワクチンに用いてもよい。同様に、他の従来のアジュバントや不活性なワクチン成分を、これら処方物に用いてもよ（、当業者が選択しつる。これらワクチン組成物を使用するための投与量や投与プロトコルについても、ワクチン接種される動物、防御が望まれる疾患および他の関連因子に基づいて、当業者が調整しうる。このような変更および変形は、ここに添付の請求の範囲に含まれると考えられる。

国際調査報告フロントページの続き（７２）発明者　ジグレッシュ、ナタンアメリカ合衆国ペンシルベニア州１９３８０、

Claims

【特許請求の範囲】１．エイ・プリューロニューモニアエ（Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の選択された株から単離され、約１０５ｋＤの分子量によって特徴付けられる有効な免疫原性量の鉄抑制外膜タンパクと、内部投与に適した賦形剤とを含有するエイ・プリューロニューモニアエ用のワクチン組成物。２．さらに、付加的なエイ・プリューロニューモニアエ抗原を含有する請求項１記載のワクチン。３．前記抗原が全細胞エイ・プリューロニューモニアエ・バクテリンである請求項２記載のワクチン。４．１用量あたり１０５ｋＤ鉄抑制外膜タンパクのＯＤ４８８ｎｍが少なくとも０．０１１の減少を示す請求項１記載のワクチン組成物。５．１用量あたり１×１０８〜１×１０９ＣＦＵ／抗原型を含有する請求項３記載のワクチン組成物。６．前記抗原がエイ・プリューロニューモニアエ莢膜タンパクである請求項２記載のワクチン。７．１用量あたり２５〜５０μｇ／抗原型の莢膜抽出物を含有する請求項６記載のワクチン組成物。８．前記付加抗原が溶血素および細胞毒からなる群から選択される請求項２記載のワクチン。９．さらに、選択されたアジュバントを含有する請求項１記載のワクチン。１０．免疫原性量のエイ・プリューロニューモニアエ１０５ｋＤＩＲＯＭＰの滅菌溶液０．１〜１．８ｍＬを含有するワクチン投与量単位。１１．さらに、免疫原性量の全細胞エイ・プリューロニューモニアエ・バクテリンを含有する請求項１０記載の投与量単位。１２．さらに、１×１０８〜１×１０９ＣＦＵ／抗原型の全細胞エイ・プリューロニューモニアエ・バクテリンを含有する請求項１１記載の投与量単位。１３．さらに、免疫原性量の選択されたエイ・プリューロニューモニアエ莢膜タンパクを含有する請求項２記載の投与量単位。１４．さらに、２５〜５０μｇ／抗原型のエイ・プリューロニューモニアエ莢膜タンパクを含有する請求項１３記載の投与量単位。１５．エイ・プリューロニューモニアエに対するワクチンを動物に接種する方法であって、該動物に、エイ・プリューロニューモニアエの選択された株から単離され、約１０５ｋＤの分子量によって特徴付けられる有効量の鉄抑制外膜タンパクを内部投与することからなる方法。１６．前記ワクチンがさらに免疫原性量の選択されたエイ・プリューロニューモニアエ莢膜タンパクを含有する請求項１５記載の方法。１７．前記ワクチンがさらに免疫原性量の全細胞エイ・プリューロニューモニアエ・バクテリンを含有する請求項１５記載の方法。１８．前記ワクチンがさらに免疫原性量の全細胞エイ・プリューロニューモニアエ・バクテリンを含有する請求項１６記載の方法。１９．選択されたワクチン組成物に対する動物の免疫応答を増強する方法であって、免疫原性量の適当な免疫強化鉄抑制外膜タンパクを該ワクチン組成物に混入させ、それにより該ワクチンに増大した抗原性および免疫原性を付与することからなる方法。２０．前記鉄抑制外膜タンパクがエイ・プリューロニューモニアエ１０５ｋＤ鉄抑制外膜タンパクである請求項１９記載の方法。２１．前記ワクチン組成物が全細胞エイ・プリューロニューモニアエ・バクテリンおよび内部投与に適する賦形剤を含有する請求項２０記載の方法。２２．前記ワクチン組成物がエイ・プリューロニューモニアエ莢膜抽出物および内部投与に適する賦形剤を含有する請求項２０記載の方法。