KR100258772B1 - 돼지의 흉막폐염 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지의 흉막폐염을 방어하는 백신에 대한 면역반응을 강화시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 신규의 백신 조성물 및 성분을 제공한다.
Description
[발명의 명칭]
돼지의 흉막폐염 백신 조성물
[기술분야]
본 발명은 일반적으로 가축용백신의 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 신규한 백신 및 악티노바실러스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae)에 의해 감염된 동물과 연관된 질병을 방어하는 백신에 대한 면역반응을 강화시키는 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
악티노바실러스(해모필러스) 플루로뉴모니아는 감염동물에 섬유소성 흉막염 및 만성폐병소와 함께 급성폐염을 일으키는 돼지병원균이다[T.N. Sebunya et al, J. Am. Vet. Med. Assoc., 182:1331-1337 (1983)].
다른 병원균의 표현형처럼, 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 표현형은 감염동안 숙주환경내에서 많은 요인에 의해 영향을 받는다. 한가지 공통된 숙주 방어 메카니즘은 박테리아의 필수영양소(예, 철)를 억제시키는 것이다. 체액중의 대부분의 철은 세포내에 존재하지만, 세포외 철분이 트랜스페린 및 락토페린과 같이 철-결합 및 수송 단백질과 단단한 복합체를 형성하고 있다. 대부분의 병원균은 이와같이 결합된 철을 얻기 위하여 고-친화성 철 흡수 시스템을 개발하여 왔다. 이들 흡수 시스템은 통상 두가지 성분, 즉 철을 킬레이트화하는 저분자량의 사이더로 포어 및 철-사이더로포어(siderophore) 복합체의 수용체로 작용하는 철 억제성 외막단백질(IROMPS)을 포함한다[H. Deneer, Infection and Immunity, 57(3): 798-804 (1989); V. Braun, Trends Biochem. Sci., 10: 75-78 (1985); M.C. McIntosh et al, J. Bacteriol., 137: 653-657 (1979); J.B. Neilands et al, Annu. Rev. Microbiol., 36: 285-310(1982)].
몇몇 병원성 미생물로부터의 IROMPS가 면역원성인 것으로 제시되어 왔으며 많은 사례를 통해 단일종의 혈청형 그룹간에 상당한 정도의 면역학적 교차반응을 보여준다. 예를들면, 이.콜라이 IROMPS에 대한 항체로 수동면역화된 칠면조는 이.콜라이 패혈증으로부터 부분적으로 보호된 것으로 나타났다[참조: C.A. Bolin et al, Infect. Immun., 55:1239-1242 (1987); J. R. Black et al, Infect. Immun., 54:710-713 (1986); 및 M. Fohn et al, Infect. Immun., 55: 3065-3069 (1987)].
상기 에이취.데니어의 문헌에서, 독성의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형을 철-제한된 조건하에서 성장시켰을때 105K와 75K의 두개 단백질이 시험관내에서 합성이 증가되었음이 보고되었다. 이들 단백질의 작용은 특정적으로 밝혀져 있지 않다; 그러나, 이들 단백질중 하나 또는 둘다는 사이더로포어-철 복합체에 대한 수용체로서 작용할 수 있다고 알려져 있다.
악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염의 예방은, 현재, 전(全)세포를 함유한 박테린으로 이루어진 백신에 달려있다. 이러한 유형의 백신은 이러한 질병을 억제 및 예방하는데 성공적이지 못해왔다. 전(全)세포 박테린은 만성상태의 질병을 억제하지 못할뿐만 아니라 아임상 보균상태의 발전을 정지시키거나 억제시킬 수 없다. 또한, 이들 유형의 백신은 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 이질성 혈청형에 대해 면역성을 유도하지 못한다[R. Higgins et al, Can. Vet. J., 26:86-89 (1985); R. Nielsen et al, Acta Vet. Scand., 27:453-455 (1987)].
따라서, 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 의한 동물의 감염에 대해 효과적인 백신이 수의학 분야에서 요구되고 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 신규한 백신성분 및 조성물, 및 공지 백신에 대한 면역반응을 강화시키는 방법을 제공한다.
한가지 관점으로, 본 발명은 보호항원으로서 유용한 철억제성 외막 단백질(IROMP)의 유효량을 함유한 신규의 백신 조성물을 제공한다. 바람직한 양태로서, 이러한 IROMP 단백질은 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형으로부터 분리되고 돼지의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 감염에 대한 백신에 사용하기위한 약 105kD의 분자량에 의해 특징지워진다.
본 발명의 다른 관점으로, 추가의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 항원, 예를들면 전세포 악티노바실러스 플루로뉴모니아 박테린 및/또는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 협막 추출물뿐만 아니라 IROMP를 함유하는 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 대한 신규의 백신이 제공된다.
또다른 관점에서, 상기의 본발명 백신 조성물은 면역원 양의 하나이상의 추가적인 악티노바실러스 플루로뉴모니아 항원을 함유함으로써 다양화 될 수 있다. 이러한 추가의 항원으로는 많은것들 가운데 용혈소 및 세포독소가 포함된다. 보강제(adjuvant) 및 담체와 같은 통상적인 백신성분이 본 발명의 백신 조성물에 첨가될 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 상기한 백신 조성물의 각각에 대한 백신용량 단위를 포함한다.
본 발명의 또다른 관점으로는 상기된 하나이상의 백신 조성물의 유효량을 동물에 체내투여하여 동물을 악티노바실러스 플루로뉴모니아로부터 면역화하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은 면역원량의 적절한 면역강화 철 억제성 외막 단백질을 백신 조성물에 혼입시킴으로써 IROMP의 존재에 의해 특징지워지는 항원을 방어하는 선택된 백신 조성물에 대한 동물의 면역반응을 강화시키는 방법을 제공한다. 그러므로써, 본 백신은 증가된 항원 특성과 면역원 특성을 갖고 있다.
본 발명의 기타 관점 및 이점은 본 발명의 바람직한 양태에 대한 하기의 상세한 설명에서 좀 더 기술된다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 선택된 미생물의 특징인 철 억제성 외막 단백질(IROMP)을 함유하는 백신 조성물 및 병원성 미생물의 감염으로부터 발생되는 질병을 예방하는데 그 백신 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물의 한가지 양태는 섬유소성흉막염 및 만성폐병소와 함께 급성폐염을 유발하는 악티노바실러스(해모필러스) 플루로뉴모니아에 의한 돼지의 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 유용하다. 본원에 상세히 기술된 양태는 병원균으로서 악티노바실러스 플루로뉴모니아를 사용하지만, 본 발명의 교시는 본 분야 전문가에 의해 다른 병원균에 대한 백신 조성물에 쉽게 응용될 수 있다. 본 발명의 교시는 예시된 백신 조성물로만 한정되는 것은 아니다.
악티노바실러스 플루로뉴모니아 IROMP는 약 105킬로달톤(kD)의 분자량을 갖는 것으로 특징지워져 왔다[참조: H. Deneer, et al., Infect. Immun., 57: 798-804(1989)]. 본 발명자들은 놀랍게도 악티노바실러스 플루로뉴모니아 IROMP를 악티노바실러스 플루로뉴모니아 병원균의 다른 항원, 예를들면 전세포 악티노바실러스 플루로뉴모니아 박테린 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 협막 추출물 항원을 함유한 백신 조성물내로 혼입시켰을때 이 백신이 상동성 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형에 대한 보호에서 현저한 증진을 보여주었을뿐만 아니라 이질성 혈청형(예, 제1혈청형)에 대한 교차-보호에서 상당한 증진을 보여주었음을 발견하였다.
본원에 상세히 기술된 양태는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형으로부터 IROMP를 사용한다. 그러나, 다른 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형 및 다른 종의 항원이, 또한, 각각 악티노바실러스 플루로뉴모니아 백신 또는 다른 병원균 백신에 본 발명의 교시에 따름으로써 유용할 수 있다. 본 발명은 예시된 IROMP만으로 한정되지 않는다. 선택된 미생물로부터의 IROMP가, 유사하게, 상술된 것외에 다른 항원과 함께 사용될 수 있다. 또한, 한 미생물로부터의 IROMP는 다른 미생물로부터의 항원을 함유한 백신에 유용한 것으로 기대된다.
본 발명의 백신 조성물에 유용한 IROMP는 선택된 항원의 배양물에서 분리하고 확인할 수 있다. 간단히 기술하면, PPLO 브로쓰 또는 하기 실시예 1에 특정적으로 기술된 배지제제와 같은 적합한 배지에서 선택된 미생물을 배양하여 IROMP를 분리한다. IROMP는 철 제한된 조건하에서만 만들어지기 때문에, 2-2디피리딜과 같은 선택된 철 킬레이트화제를 배양물에 첨가한다. 그런후, 콩고레드와 같은 선택된 염료를 첨가하고 배양물의 샘플에 대해 염료-결합검정을 수행하여 배양물중의 IROMP 존재를 검출한다. 이러한 방법은 하기 실시예 1에 상세히 기술되어 있다.
일단 IROMP가 배양물중에 존재하는 것으로 확인됐을때, 배양물의 비처리된 분획을 여러가지 백신제제, 예를들면 불활성화된 전세포 박테린 또는 협막 추출항원제제의 제조에 사용할 수 있다. 다른 방법으로서, 상기 데니어 등의 문헌에 기술된 것과 같은 다른 분리기술이 사용될 수 있으며/있거나, IROMP 자체를 미생물로부터 분리하고 화학적 합성법 또는 재조합 공학기술에 의해 수득할 수 있다. 또한, 배양물로부터 분리된 IROMP 단백질을 별개의 성분으로서, 예를들면, 약 0.1 내지 1.8mL의 양으로 다른 항원을 함유한 백신 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 백신은 활성성분으로서 유효량의 105kD IROMP를 함유한 약제학적 조성물로서 제조할 수 있다. 배양물로부터 IROMP를 분리한 경우 이를 유효량으로 적합한 약제학적 담체중의 다른 백신제제에 첨가할 수 있다.
바람직한 양태로서, 105kD IROMP는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 전세포 백신과 함께 면역자극제제에서 한 성분일 수 있다. 전세포 악티노바실러스 플루로뉴모니아 박테린과 악티노바실러스 플루로뉴모니아 105kD IROMP를 함유한 신규의 백신은 다음과 같이 제조할 수 있다. 철-제한된 조건하에 IROMP를 형성하는 능력을 소유하는 것으로서 확인된 악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주는 철 킬레이트화제의 존재하에 적합한 배지에서 통상적으로 배양하고 포르말린(포름알데하이드 용액 USP)과 같은 통상의 불활성화제로 불활성화시킬 수 있다. 불활성화제는 약 0.2중량% 내지 1.0중량%의 양으로 첨가할 수 있다. 불활성화제를 배양물 0.3%의 최종 농도로 첨가하는 것이 바람직하다. 글루타르알데하이드 또는 β-프로피오락톤(BPL)과 같은 다른 공지의 불활성화제도 사용할 수 있다. 불활성화제로서 글루타르알데하이드가 사용될때 이는 0.05중량% 내지 0.5중량%의 농도로 첨가하는 것이 바람직하며 BPL은 0.1중량% 내지 0.3중량%의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 분야 전문가는 선택된 불활성화제로 불활성화시키는데 필요한 농도 및 시간 파라미터를 쉽게 결정할 수 있다.
일단 불활성화제가 첨가됐으면, 배양물을 적합한 시간동안, 예를들면 37℃에서 약 18 내지 48시간동안 배양한다. 불활성화제는 통상의 수단에 의해 제거하고 중화시킬 수 있으며, 불활성화제를 완전히 중화시키기 위해 배양물을, 예를들면 중황산나트륨(37%)과 함께 20℃ 내지 25℃에서 24시간이하동안 재차 배양할 수 있다.
IROMP를 함유한 배양물은, 일단 불활성화됐을때, 적합한 백신으로 제형할 수 있다. 무독성이고 멸균된 약제학적으로 허용되는 담체중에 상기된 바와같이 불활성화된 IROMP를 함유한 전세포 항원액체(즉, 배양물)을 사용하여 전세포 박테린 백신을 제조할 수 있다. 본 발명의 전세포 박테린 백신의 바람직한 양태는, 주사제형으로, 생리학적 pH에서 완충된 105kD IROMP를 함유한 항원액체의 수성현탁액 또는 용액으로 구성된다. 수성용액의 제조시 인산염 완충염수(PBS)를 사용하는 것이 바람직하다.
다른 방도로서, 105kD IROMP를 함유한 백신 조성물은, 또한 통상의 보강제를 함유할 수 있다. 보강제는 면역반응을 유도하거나 강화시키는 비-특이적 자극제로서 사용된다. 이러한 보강제로서는, 많은것들 가운데, 수산화알루미늄, 뮤라밀 디펩타이드, 암피겐, 광유 및 렉시틴, 및 사포닌(예, QuilA)이 포함된다.
바람직한 전세포 박테린 및 IROMP 백신 조성물이 실시예 3의 A부에 상세히 기술된다.
또다른 예시로서, 105kD IROMP가 악티노바실러스 플루로뉴모니아 단위 백신과 같은 다른 면역자극제제에 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 관점의 한가지 양태는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 협막 추출 단백질과 악티노바실러스 플루로뉴모니아 105kD IROMP를 함유한 신규의 백신이다. 협막 추출물은 악티노바실러스 플루로뉴모니아를 배양하고, 배양물을 냉각시키고, 박테리아 세포 펠렛을 수득한다음, 이를 PBS중에 현탁시킨 후 박테리아 세포를 가열시키고, 재차 원심분리한 다음, 상등물을 수거하고 추출된 생성물을 멸균시켜 제조한다. 이 방법에 대한 조건은 실시예 2에 상세히 기술되어 있다.
IROMP는 협막 추출물이 제조되는 박테리아 배양물중에 킬레이트화제의 유무에 따라 면역자극제제에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면 IROMP의 존재가 바람직하다. 또한, 이러한 백신의 경우 협막 추출 단백질이 박테리아의 하나이상의 균주로부터 제조됨이 바람직하다. 배양배지에 존재하는 단백질을 농축시키고 IROMP를 함유한 단백질 농축물과 총 탄수화물 농축물을 공지방법에 의해 계산한다. 이러한 계산에 의해 협막 추출백신의 바람직한 용량을 제조하는데 필요한 IROMP를 함유한 추출항원의 용량을 측정한다.
그런다음, 25% 글루타르알데하이드와 같은 불활성화제를 사용하여 상이한 혈청형(예, App 1, 5 및 7)로부터의 추출항원을 연결시킨다. 이에 따라 단백질 성분들이 교차-연결되어 거대분자를 형성한다. 이어서, IROMP를 함유한 추출항원과 글루타르알데하이드의 혼합물을 바람직하게는 20℃ 내지 25℃에서 약 30분 내지 180분동안 배양시킨다. 과량의 글루타르알데하이드를 중화시키기위해, 이 결합물에 라이신 원액을 첨가하고 이 혼합물을 배양한다.
이어서, 이 제제를 하기된 협막 추출 백신제제로부터의 세포없는 상등분획과 혼합시켜 투여를 위해 유화시킬 수 있다. 이 분획은 소량의 IROMP를 함유할 수 있기 때문에 희석제로서 사용할 수 있다. 이 제제의 다른 첨가물로서는 선택된 보강제, 및 통상의 백신보존제, 세제 및 유화제(예, 메르티올레이트, 트윈 80, 및 스판 80)가 포함될 수 있다. 이러한 백신에 대한 상세한 설명은 하기의 실시예 3의 B부에 자세히 기술된다.
본 발명의 또다른 바람직한 백신양태는 바람직하게는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청으로부터의 IROMP 및 동일 미생물의 하나이상의 다른 균주로부터의 협막 추출물을 함유한 삼가백신이다. 추가의 균주는 IROMP를 제공하지 않는다. 실시예 3 C부는 이러한 백신 한가지를 상세히 기술하고 있다. 삼가백신은 미생물의 한가지 균주로부터의 IROMP와 적어도 제2 및 제3균주로부터의 협막 추출물을 사용함이 바람직하다. 또한, 추가의 균주로부터의 추가의 협막 추출물을 사용할 수 있다. 이것은 백신에 악티노바실러스 플루로뉴모니아와 같은 미생물의 세가지 모든 균주로부터의 방어능력을 제공한다.
또한, 본 발명의 IROMP는 두개이상의 다른 항원을 함유한 백신에 유용하다. 악티노바실러스 플루로뉴모니아인 다른 항원이, 또한, 본 발명의 백신에 존재할 수 있다. 예를들면, 용혈소 및 세포독소가 이들 백신중에 통상의 용량으로 사용되어 추가의 면역원성을 제공할 수 있다.
본 발명의 백신은, 약제로 제시될때, 단위용량형으로 존재함이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 105kD IROMP의 면역원양은 원액 ml당 0.28 흡광도 488nm(O.D. 488nm) 감소량 또는 백신의 단일용량의 1/10 내지 9/10이다. IROMP 백신을 함유한 전세포 박테린은 1×108내지 1×109콜로니 형성단위(CFU)를 함유함이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5×108CFU이다. 협막 추출물을 함유한 백신에는 백신 용량당 적어도 25 내지 50㎍/혈청형의 협막 추출물이 존재함이 바람직하다. 또한, 협막 추출물을 함유한 IROMP 백신은 용량당 25 내지 50㎍의 총 탄수화물을 함유함이 바람직하다.
적절한 치료 유효 용량은 상기 면역원량을 기준으로하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 따라서, 약제는 활성성분의 면역원량의 멸균용액 0.1 내지 1.8mL의 단위 용량을 제공한다. 본 발명의 한가지 양태는 전세포 악티노바실러스 플루로뉴모니아 박테린과 함께 악티노바실러스 플루로뉴모니아 105kD IROMP의 면역원량의 멸균용액 0.1 내지 1.8mL를 함유한 백신용량 단위를 포함한다. 다른 양태는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 협막 단백질과 함께 악티노바실러스 플루로뉴모니아 105kD IROMP의 면역원량의 멸균용액 0.1 내지 1.8mL의 백신 용량 단위를 포함한다. 또다른 양태는 상기 백신양태 두개중 한개의 면역원량의 멸균용액 0.1 내지 1.8mL와 하나이상의 추가적인 항원성분을 함유한 용량단위이다.
바람직한 용량섭생은 바람직한 백신 조성물의 2회 용량의 투여이다. 백신의 투여방식은 백신을 숙주로 전달하는 어떠한 경로도 적합할 수 있다. 그러나, 근육내 주사로 백신을 투여함이 바람직하다. 또한, 필요한경우, 경구, 비내, 경피 또는 복강내와 같은 다른 투여방식도 사용될 수 있다.
본 발명의 돼지연구에서는 3주간격으로 대상동물에 분할투여된 백신의 2회 용량의 근육내 주사를 사용한다. 그러나, 동물의 연령, 건강상태, 성별 및 식이법, 동물의 종별, 투여시간, 투여경로, 함께 투여되는 다른 약과의 상호작용, 및 방어정도 등을 포함한 여러 요인에 따라 특정동물에 대해 특정용량 수준이 결정된다는 것은 누구나 이해할 것이다. 물론, 필요하다면 적합한 다른 간격차를 두고 투여를 반복할 수 있다. 따라서, 이들 백신의 용량, 투여방식 및 방법은 수의사에 의해 결정되는 것이다.
본 발명의 백신은 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형의 독성 유기체로의 도전으로부터 증가된 방어를 제공한다. 이들 백신은 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 대한 우수한 면역반응을 동물체내에 유도할 수 있으며 이질성 혈청형 사이에 교차방어를 추가로 제공할 수 있다. 이에따라, 본 발명 백신은 천연감염을 극복한 동물의 면역상태를 모사케 한다. 본 발명의 백신 조성물에 의해 유도된 특정 방어기작은 실시예 4의 표 3에 기술된 생체내 동물시험에 의해 밝혀진 바와같이 105kD IROMP 단백질이 없는 백신과 비교했을때 증가된 방어(좀더적은 평균 폐병소수)를 제공한다.
하기 실시예는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 105kD IROMP를 분리하고, 이 신규성분을 함유한 여러 백신을 제조 및 시험하는 바람직한 방법을 예시한다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 예시하는 것이며 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
악티노바실러스 플루로뉴모니아 105kD 단백질의 분리
악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형(균주 Schelkopf) 및 제5혈청형(균주 K-17)[이들 두 균주는 네브라스카 링컨 노르덴 라보라토리즈에 소재한 스미스클라인 비참 애니멀 헬스로부터 입수가능하다]을 하기에 상세히 기술된 바와같이 철 킬레이트화제 2-2'디이리딜[미조리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니]을 200μM의 최종농도로 첨가했을때 특정 합성배지(MIE), 바이텍[미시간 디트로이트 소재의 디프코라보라토리즈] 및 PPLO[디프코] 브로쓰에서 IROMP를 분비하는 능력에 대해 시험하였다.
MIE배지(20ℓ)는 하기된 세가지 원액을 혼합하고, 혼합된 배지를 중성 pH로 조정한 다음, 혼합된 배지를 필터여과하여 제조한다.
1번 원액은 다음의 성분을 교반시키면서 차례로 용해시켜 제조한다(17399.3mL): 1N HCl 280mL; L-시스테인 4.0g; 티로신 4.0g; 증류수 16319.3mL; 루이신 6.0g; 아르기닌 6.0g; 글리신 0.6g; 라이신 1.0g; 메티오닌 2.0g; 세린 2.0g; 우라실 2.0g; 1N NaOH 800mL; 하이포크산틴 0.4g; 이노신 40.0g; K2HPO469.6g; KH2PO454.4g; 및 효모 추출물 120.0g.
2번 원액(2400.7mL)은 다음의 성분을 교반시키면서 차례로 용해시켜 제조한다: 증류수 2290mL; 아스파트산 10.0g; 글루탐산 26.0g; 염화나트륨 116.0g; 황산칼륨 20.0g; 염화마그네슘 (6H2O) 8.0g; 염화칼슘(무수) 0.444g; EDTA 0.07g; 염화암모늄 4.4g; 10N NaOH 23.6mL. 그런다음, 다음의 성분을 교반시키면서 용해시킨다; 트윈80 0.4mL; DL-락트산(60%용액) 26.6mL; 및 글리세롤 60.0mL.
3번 원액(200mL)은 20.0g 가용성 전분을 200mL 증류수중에, 약하게, 가열하고 교반시키면서, 용해시켜 제조한다.
2번 원액을 1번 원액에 첨가한다. 이어서, 이 혼합물에 3번 원액을 가한다. 혼합된 배지의 pH는 7.3±0.1pH로 조정하고 완정된 배지를 여과멸균시킨다. 이 용액은 약 4℃에서 2주까지 저장할 수 있다.
MIE브로쓰를 사용하기전에, 20mL의 멸균 NAD저장용액을 첨가한다. 이 용액은 1.0g 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD), 1.0g 티아민, 1.0g 칼슘 판토테네이트, 및 증류수 100mL를 교반시키면서 차례로 용해시켜 제조한다. 배지를 다시 필터 멸균시키고, -20℃에 저장한다.
PPLO 브로쓰(약 1ℓ)는 21.0g PPLO 브로쓰 w/o CV(디프코), 5.0g 글루코즈, 및 1000mL 증류수를 교반시키면서 차례로 용해시켜 제조한다. 이 배지를 약 7.3의 pH로 조절하고 필터여과시킨다. 사용하기전에 1.0mL의 멸균 NAD 저장용액을 첨가하고 멸균된 트윈80(10.0mL)를 함유한 멸균증류수 100mL를 가한다.
바이텍 브로쓰(약 1ℓ)는 29.2g 바이텍 브로쓰 [디프코]를 교반시키면서 증류수 1000mL에 용해시켜 제조한다. 이 배지를 약 7.3의 pH로 조절하고 필터멸균시킨다. 사용하기전에 1.0mL의 멸균 NAD 저장용액을 가한다.
상기된 모든 세가지 배지를 IROMP의 생성능력에 대해 시험하였다. 하기에 좀더 상세히 제시된 결과는 PPLO 브로쓰가 IROMPO의 생성에 최적임을 시사한다.
105kD 단백질의 존재는 상기한 데니어 및 포터의 문헌에 기술된 방법에 따라 수행된 염료결합(콩고레드) 검정법으로 측정하였다.
A. 제1혈청형
동결된 마스터 종균 1%로부터의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형을 0.5%글루코즈와 0.1% NAD [시그마] 용액이 보충된 PPLO 브로쓰 100ml에 접종시켰다. 배양물을 37℃에서 밤새 배양하였다. 그런후, 이와같은 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형의 밤새 배양물로부터의 2% 종균을 0.5% 글루코즈 및 0.1% NAD용액이 보충된 PPLO 브로쓰 500ml에 접종시키고 37℃에서 밤새 배양하였다.
흡광도가 650nm에서 1.0에 도달했을때 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형의 500ml 배양물에 2-2'디피리딜의 원액(200μM의 최종농도)을 첨가하였다. 37℃에서 90분간 배양한 후, 원심분리하여(8000×g, 10분) 세포를 수거하였다. 세포펠렛을 멸균된 인산염 완충염수(PBS) 100ml중에 재현탁시키고, 8000rpm으로 15분간 원심분리한 다음, PBS중에 OD650nm=1.0으로 재현탁시켰다.
악티노바실러스 플루로뉴모니아 배양물 100ml당 콩고레드 1ml를 첨가하고 혼합하였다. 샘플을 즉시 취하여 1.0ml를 4개의 원심분리 튜브 각각에 넣고 1분동안 원심분리기에서 회전시킨다음 상등물을 488nm에서 판독한다(PBS가 비원진 상태). 0.1% NAD를 함유한 PPLO 브로쓰를 대조군으로서 사용하였다. 배양물을 진탕시키면서 37℃에 유지시켰다. 샘플을 콩고-레드를 첨가한 후 0, 20, 40 및 60분지나 샘플(4.0ml)을 수거하였다.
하기의 표 1a에 도해된 상기 검정의 결과는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형의 외막 단백질에 미치는 철 제한의 효과를 보여준다. 콩고 레드의 흡수는 용액으로부터의 콩고 레드의 상실로서 나타난다.
따라서, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형은 철-제한된 조건하에서 콩고 레드와 결합할 수 있다. 이러한 결과는 IROMP 제제가 콩고 레드와 결합하는 능력을 가진다는 것을 입증하며, 또한 IROMP가 생체내 성장동안에 헤민과 같은 복합철의 획득에 한 역할을 한다는 것을 시사한다.
B. 제5혈청형
악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형을 0.5% 글루코즈, 0.02% 트윈80 및 NAD(10㎍/ml의 최종농도)로 보충된 PPLO 브로쓰 10ℓ가 함유된 14ℓ 발효기에서 성장시켰다. 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형의 2% 종균 접종물을 브로쓰에 접종시켰다. 배양물의 OD650nm가 1.0일때(접종후 4시간), 200μM의 최종농축물에 킬레이트화제를 첨가하였다.
90분후, 협막 항원제제를 위해 5ℓ의 배양물을 취했다(참조: 실시예 2). 이 가운데, 200ml를 콩고 레드 결합 검정에 사용하기 위해 취했다. 200ml 샘플을 원심분리하고 세포펠렛을 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 멸균 PBS중에 재현탁시켜 1.4의 OD650nm를 만들었다. 30㎍/ml의 최종농도에 멸균 콩고 레드 용액을 첨가하였고 상술한 바와같이 검정을 수행하였다. 샘플은 발효기 배양물 ml당 0.075의 OD488nm감소를 나타냈다. 하기표 1b에 도해된 이 검정의 결과는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형의 외막 단백질에 미치는 철 제한의 효과를 보여준다.
이것은 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형이 콩고 레드와 결합하는 능력을 예증한다. 이들 결과는 IROMP제제가 콩고 레드와 결합하는 능력을 가지고 있음을 입증하며 IROMP가 생체내 성장동안에 헤민과 같은 복합철의 획득에 한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
협막 항원제제 또는 콩고 레드 검정에 사용되지 않고 남은 5ℓ의 배양물은 포르말린으로 불활성시켰다. 이 포르말린은 하기 실시예 3에 상세히 설명된 바와 같이 IROMP를 함유한 전체 세포 불활성화 백신의 제조를 위해 0.3%의 최종농도로 첨가된 것이다.
[실시예 2]
협막 추출항원의 제조
박테리아의 협막 추출항원은 일반적으로 다음과 같이 제조한다. 표준 박테리아 건조 멘스트럼 배지에 -70℃로 동결시켜둔 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 1% 종균을 MIE브로쓰에 접종시킨다. 이어서, 배양물을 37℃에서 진탕시키면서 16-17시간동안 배양시킨다. MIE브로쓰의 10ℓ를 함유한 14ℓ발효기에 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 16-17시간 배양물로부터의 1 내지 5 종균을 접종한다. 14ℓ 발효기에 대한 발효 파라미터는 다음과 같다: 온도는 37℃±1℃이고, pH는 7.0-7.3(5N NaOH로 조절)이고, D.O.는 멸균 실내공기에 의해 30%로 유지되고, 100 내지 250rpm으로 진탕시킨다. 그런후, 배양물을 650nm에서의 흡광도 측정시 중반 내지 후반 초기 로그성장단계(4 내지 16시간)에 이르를때까지 계속 성장시킨다. 배양물이 중반 내지 후반초기 로그성장단계에 도달한 후, 배양물을 20℃이하로 냉각시키고 원심분리하거나 미세여과시킨다. 박테리아 세포 펠렛을 4℃에서 1 내지 10시간동안 진탕시키면서 PBS(처음 배양용량의 1/10 내지 1/1000)중에 재현탁시킨다. 박테리아 세포를 완전히 재현탁시킨 후, 현탁액을 60분±30분동안 56℃±1℃로 가열시킨다. 그런다음, 이물질을 원심분리하거나 미세여과하고 상등물을 수거한다. 멸균된 10% 메르티올레이트와 10% 에틸렌-디아민테트라아세트산(EDTA, 이나트륨 또는 사나트륨염)을 보존제로서 첨가한다. 최종농도는, 각각, 0.01%와 0.07%(용량당 중량)을 초과해서는 안된다. 추출된 생성물을 0.45 내지 0.2㎛ 필터를 통해 멸균여과시키고 멸균저장용기에 넣어 혼합될때까지 2℃ 내지 7℃에 저장해둔다. 필요한경우, 생성물을 여과 또는 원심분리하여 먼저 등명하게 만든다음 필터 멸균시킨다.
배양배지에 철 킬레이트화제는 첨가되지 않았기 때문에, 상술된 공정에서 IROMP가 없는 협막 추출항원이 생성된다. 이들 협막 추출항원은 대조군으로서 사용할 수 있다. 달리는, 상기 공정에 따라 IROMP를 생성할 수 없는 박테리아 균주로부터 추가의 항원이 제공된다.
그러나, IROMP를 형성하기위해 2-2'디피리딜과 같은 선택된 철 킬레이트화제를 성장배지에 첨가함으로써 변형된 상기 공정에 따라 IROMP를 함유한 협막 추출물을 제조할 수 있다.
[실시예 3]
백신제제
A. IROMP를 함유한 전세포 박테린 백신
실시예 1에 기술된 포르말린 불활성화된 배양물(제5혈청형)을 IROMP를 함유한 전체세포 박테린을 제조하기위해 다음과 같이 사용하였다.
1.78×109CFU/mL의 IROMP를 함유한 70.25mL 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 전세포항원액(0.281mL용량/투여용량)을 0.5mL 10% 메르티올레이트(0.002mL용량/투여용량) 및 394.25mL 인산염완충된 염수(PBS)(1.577mL 용량/투여용량)와 혼합한다. 7.00mL 트윈80(0.028mL용량/투여용량) 및 3.00mL 스판80(0.012mL 용량/투여용량)을 25.00mL 앰피겐(0.10mL 용량/투여용량에 첨가하여 오일분획을 형성한다. 그런다음, 항원액, 10% 메르티올레이트 및 PBS분획에 오일분획을 첨가하면서 유화제 실버손(오하이오 클리브랜드 소재의 믹스트로닉스 코포레이션] 또는 이의 균등물을 사용한다. 이어서, 박테린을 2분동안 유화시킨다. 이 결과 각회 투여용량이 5×108콜로니 형성단위를 함유하는 250회 투여용량의 IROMP 함유한 전세포 박테린을 얻는다.
B. IROMP를 함유한 협막 추출물 백신
투여용량당 50㎍ 총 탄수화물의 IROMP를 함유한 250회 투여용량의 협막 추출 박테린을 다음과 같이 제조하였다.
우선, 105kD IROMP을 함유한 다량의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 추출항원을 실시예 2에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 이 다량의 항원의 단백질 농도를 단백질 측정에 대한 로우리 방법에 의해 측정한 결과 2550㎍/mL이었다[Herbert, Phipps and Strange, Methods in Microbiology, Vol. 5B, Ch. 3, p. 249-252, ed. J. R. Norris and D. W. Ribbons (1971) (Academic Press, New York)]. 이어서, 105kD IROMP를 함유한 다량의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 추출항원의 총 탄수화물 농도를 총 탄수화물량 측정에 대한 페놀방법으로 측정한 결과 1320㎍/mL이었다.
이어서, 투여용량당 50g의 총 탄수화물을 함유한 박테린의 250회 투여용량을 제조하는데 필요한 105kD IROMP 함유 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 추출물 항원의 밀리리터 값을 측정한다. 한가지 계산을 예시하면 다음과 같다: 투여용량당 총 탄수화물 50㎍/105kD IROMP를 함유한 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 추출물 항원원액에 대한 총 탄수화물 1320㎍/mL×250회 투여용량=50㎍/투여용량의 탄수화물을 함유한 250회 투여용량을 제조하는데 필요한 물질 9.5mL. 이어서, 105kD IROMP를 함유한 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 추출물 9.5mL를 25% 글루타르알데하이드와 결합시킨다.
박테린의 250회 투여용량에 존재하는 단백질 g당 1.0mL의 25% 글루타르알데하이드를 첨가한다. 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청 추출항원 9.5mL를 105kD IROMP와 연결시키는데 필요한 25% 글루타르알데하이드의 양을 측정하기위해 계산은 다음과 같이 한다:
따라서, 0.024mL의 25% 글루타르알데하이드가 결합을 위해 필요하다.
0.024mL의 25% 글루타르알데하이드를 105kD IROMP를 함유한 9.5mL의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 추출항원에 첨가한다. 그런다음, 혼합물을 실온에서 1시간동안 진탕시키면서 실온에서 배양시킨다. 1시간의 배양후, 0.024mL의 라이신원액(12.5mg/mL)를 가한다. 혼합물을 실온에서 진탕시키면서 2시간동안 배양한 다음 4℃에 저장한다.
이어서, 박테린을 다음과 같이 유화시킨다. 1320㎍/ml의 탄수화물(결합된 글루타르알데하이드)(0.038mL용량/투여용량)의 105kD IROMP함유 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형 추출항원 9.5mL를 0.5mL 10% 메르티올레이트(0.002mL용량/투여용량) 및 455.00mL의 상등물(가열 추출하기전)(1.820mL용량/투여용량)과 혼합한다. 7.00mL 트윈80(0.028mL용량/투여용량)과 3.00mL 스판80(0.012mL용량/투여용량)을 25.00mL 앰피겐(0.10mL용량/투여용량)에 첨가하여 오일분획을 형성한다. 그런다음, 오일분획을 항원액, 10% 메르티올레이트 및 상등분획에 가하면서 유화제를 넣어준다. 이어서, 2분동안 박테린을 유화시킨다.
C. 삼가백신
삼가백신, 즉 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형으로부터 분리된 105kD IROMP단백질, 제1혈청형 협막 추출물, 및 제7혈청형 협막 추출물을 함유한 백신을 효능에 대해 시험하였다. 제5혈청형을 상기 실시예 5에 기술된 바와같이 제조하였다. 제1혈청형은 실시예1에서 상술한 바와같이 MIE배지에서 성장시켰다. 제7혈청형[네브라스카 링컨 노르덴 라보라토리즈 소재의 스미스클라인 비참 애니멀 헬스]은 제1혈청형에 대해 상술한 바와같이 성장시켰다.
투여용량당 탄수화물 25㎍의 IROMP 함유 삼가 협막 추출 박테린의 500회 투여용량은 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 다량의 개개 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형(1, 5+105kD 및 7) 협막 추출항원의 단백질 농도를 단백질 측정에 대한 루우리방법으로 측정하였다[상기 인용된 허버트, 필립 및 스트레인지 문헌 p 249-252]. 단백질 농도는 제1혈청형의 경우 1,395㎍/mL, 105kD 단백질을 함유한 제5혈청형의 경우 1,000㎍/mL 및 제7혈청형의 경우 1,475㎍/mL이었다.
총 탄수화물 측정에 대한 페놀방법[상기 인용된 허버트, 필립 및 스트레인지 문헌 p 272-277]에 의해 측정된 다량의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 혈청형(1, 5+105kD, 및 7)의 총 탄수화물 농도는 제1혈청형의 경우 1,561㎍/mL, 제5혈청형의 경우 1,600㎍/mL, 및 제7혈청형의 경우 1,250㎍/mL인 것으로 밝혀졌다.
투여용량당 혈청형당 총 탄수화물 25㎍을 함유한 500회 투여용량의 박테린을 제조하는데 필요한 각각의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 협막 추출항원의 밀리리터값은 하기 예시된 등식에서 입증된 바와같이 측정한다.
그런다음, 제1혈청형 8.0mL, 105kD 단백질을 함유한 제5혈청형 21.0mL, 및 제7혈청형 협막 추출항원 10.0mL를 25% 글루타르알데하이드와 결합시킨다. 박테린의 500회 투여용량에 존재하는 단백질 g당 1.0mL의 25% 글루타르알데하이드를 가한다.
삼가 협막 추출항원(총량=39.0mL)과 결합시키는데 필요한 25% 글루타르알데하이드의 양을 측정하는 계산은 다음과 같이 한다:
따라서, 결합을 위해 0.047mL의 25% 글루타르알데하이드가 필요하다.
8.0mL의 제1혈청형 협막 추출제제, 105kD 단백질을 함유한 21.0mL의 제5혈청형 협막 추출제제 및 10.0mL의 제7혈청형 협막 추출제제를 합한다. 이 제제에 0.047mL의 25% 글루타르알데하이드를 첨가한다. 그런다음, 혼합물을 진탕시키면서 1시간동안 실온에서 배양한다. 한시간 배양후, 0.047mL의 라이신원액(12.5mg/mL)을 첨가한다. 혼합물을 진탕시키면서 2시간동안 실온에서 배양한다음 4℃에 저장한다.
그런다음, 25㎍/혈청형/투여용량을 함유한 삼가 박테린을 다음과 같이 유화시킨다: 39.0mL의 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1혈청형, 제5혈청형 및 제7혈청형 글루타르알데하이드 결합된 협막 추출항원(상기됨)(0.088mL용량/투여용량)을 1.00mL 10% 메르티올레이트-EDTA(0.002mL용량/투여용량), 0.6mL 10% EDTA(0.0012mL 용량/투여용량) 및 가열추출전에 수득된 킬레이트화제(1.7788mL 용량/투여용량) 함유 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형의 상등물 889.4mL와 혼합시킨다. 14.00mL 트윈80(0.028mL 용량/투여용량) 및 6.00mL 스판80(0.012mL 용량/투여용량)을 50.00mL 앰피겐(0.10mL 용량/투여용량)에 첨가하여 오일분획을 형성한다. 그런다음, 이 오일분획을 글루타르알데하이드 연결된 제제, 10% 메르티올레이트-EDTA, 10% EDTA 및 상등물 분획에 가하면서 유화제를 넣는다. 이어서, 박테린을 2분간 유화시킨다.
[실시예 4]
면역화 실험
105kD 단백질을 함유한 각각의 백신형, 전세포박테린 및 협막 추출백신을 면역화-도전 실험에 의해 돼지에서의 방어능력에 대해 시험하였다. 원액에 105kD 단백질이 없다는 것을 제외하고 유사한 백신을 상술한 바와같이 제조하였다. 적당한 대조군으로서 비-면역화된 돼지를 유사하게 시험하였다.
A. 일가백신
악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형으로부터 분리된 105kD 단백질을 함유하고 함유하지 않은 실시예 3의 A부 및 B부에 기술됨에 따라 제조된 전세포 박테린 및 협막 추출백신을 사용하여 2mL 면역화용량을 에버를 농장에서 얻은 돼지의 목측면에 근육내주사하였다. 백신은 다음과 같다:
백신 XHPP-1 : 105kD 단백질을 함유하지 않은 전세포 박테린을 5×108CFU/투여용량으로 투여하였다.
백신 XHPP-2 : 105kD 단백질을 함유하고 실시예 2에 기술된 전세포 박테린을 5×108CFU/투여용량으로 투여하였다.
백신 XHPC-16 : 105kD 단백질을 함유하지 않은 협막 추출물백신을 50㎍ 탄수화물/투여용량으로 투여하였다.
백신 XHPC-18 : 105kD 단백질을 함유한 협막 추출물백신을 50㎍ 탄수화물/투여용량으로 투여하였다.
첫번째 백신접종은 생후3주때 이루어졌다. 이차백신접종은 일차접종후 3주경과하여 수행되었다.
이차접종후 1주경과하여, 독성 배양물의 비내흡입(0.5ml/비공)에 의해 적절한 혈청형인 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5형으로 도전시켰다. 도전 접종물에서 세포수는 1.19×109CUF/ml였다. 도전후 1주 지나서 동물을 부검하였다. 도전으로 치사된 동물은 죽은 후 곧 부검하였다.
이들 면역화 실험의 결과는 하기표 2에 제시된다.
이 결과는 105kD IROMP를 함유한 백신 조성물(XHPP-2 및 XHPP-18)로 면역화된 그룹의 경우 평균 폐손상율이 현저히 감소되었고 폐병발의 감소율이 상당히 증가하였음을 보여준다.
B. 삼가백신
실시예 3 C부에 기술된 바와같이 제조된 두 균주의 협막 추출물 및 IROMP가 없는 백신과 함께 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5혈청형으로부터 분리된 105kD 단백질을 함유한 삼가백신을 사용하여, 2mL 면역화 용량을 에버를 농장으로부터 얻은 돼지의 목측면에 근육내 주사하였다.
사용된 백신은 다음과 같다:
백신 XHPC-19 : 25㎍의 총 탄수화물/혈청형/투여용량을 함유하고 105kD 단백질을 함유하지 않은 협막 추출물 백신
백신 XHPC-21 : 105kD 단백질 및 25㎍의 총 탄수화물/혈청형/투여용량을 함유한 협막 추출물 백신
백신 XHPC-20 : 50㎍의 총 탄수화물/혈청형/투여용량을 함유하고 105kD 단백질을 함유하지 않은 협막 추출물 백신
백신 XHPC-22 : 105kD 단백질 및 50㎍의 총 탄수화물/혈청형/투여용량을 함유한 협막 추출물 백신
세가지 배양물, 즉 제1혈청형, 제5혈청형 및 제7혈청형을 사용하여 면역화그룹과 대조동물그룹의 각각을 도전시켰다. 이들 배양물들은 다음의 세포수를 함유했다:
악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1형=2.19×109CFU/ml,
악티노바실러스 플루로뉴모니아 제5형=8.85×108CFU/ml, 및
악티노바실러스 플루로뉴모니아 제7형=1.01×109CFU/ml.
A부에서 기술된 일가 면역화와 같이 돼지를 도전시켰다. 대조군은 플라세보(PBS 보강된 앰피겐) 백신이 접종된 돼지그룹으로 구성되었다. 플라세보는 XHPC-19, XHPC-20, XHPC-21 또는 XHPC-22가 접종된 돼지와 동일한 백신 스케쥴(동일한 투여용량 및 경로)로 투여되었다. 이 결과는 하기 표 3에 제시된다.
이들 결과는 105kD 단백질을 함유한 백신(XHPP-21 및 XHPP-22)으로 접종된 동물이 105kD 단백질이 없는 백신으로 접종된 동물에 비하여 대부분의 경우에서 폐손상율이 현저히 낮다는 것을 입증한다.
삼가백신은 이 백신에 함유된 세가지 혈청형으로부터 방어를 제공하기 때문에, 일가백신에 비하여 특히 유리하다. 대조적으로, 일가백신은 이 제제에 함유된 단일 혈청형으로부터만 방어를 제공한다.
본 발명의 많은 변형은 상기 명세서에 포함되며 당업자에게는 자명하다. 예를들면, 본 발명의 백신에 악티노바실러스 플루로뉴모니아가 아닌 다른 적절한 불활성화된 병원균이 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 통상적인 보강제 및 불활성 백신성분이 본 발명 제제에 사용될 수 있으며 당업자라면 간단히 선택할 수 있다. 또한, 이들 백신 조성물의 사용을 위한 기준으로하여 당업자에 의해 조절될 수 있다. 이러한 변형은 본원에 첨부된 특허청구의 범위에 포함된다.
Claims (8)
- 제1 성분으로서, 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 한 혈청형을 철-제한된 조건하에 철 킬레이트화제의 존재하에서 배양시켜 얻은 분자량 105kD의 철 억제성 외막 단백질(IROMP) 또는 이 IROMP를 함유한 상기 배양물의 협막 추출물, 제2 성분으로서, 상기 혈청형과 동일하거나 상이한 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 하나 이상의 혈청형을 철-제한된 조건하에 철 킬레이트화제의 존재하에서 배양시키지 않고 얻은 배양물의 협막 추출물, 및 제3 성분으로서, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하여, 돼지가 악티노바실러스 플루로뉴모니아에 감염되는 것을 예방하기 위한 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 제2 성분인 협막 추출물이 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1 혈청형, 제5 혈청형 및 제7 혈청형의 배양물, 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1 혈청형 및 제7 혈청형의 배양물, 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1 혈청형 및 제5 형청형의 배양물로부터 얻은 것인 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 제1 성분인 협막 추출물이 악티노바실러스 플루로뉴모니아 제1 혈청형의 배양물로부터 얻은 것인 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 철 킬레이트화제가 2-2 디피리딜인 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 단위용량이 면역원 양의 IROMP의 멸균 용액 0.1 내지 1.8ml를 포함하는 백신 조성물.
- 제5항에 있어서, 단위용량이 면역원 양의 전세포 악티노바실러스 플루로뉴모니아 박테린을 추가로 함유하는 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 단위용량이 1×108내지 1×109CFU/혈청형의 전 세포 악티노바실러스 플루로뉴모니아 박테린을 추가로 함유하는 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 단위용량에서 협막 추출물의 양이 25 내지 50㎍인 백신 조성물.
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