JPH09505085A - パスツレラ科抗原および関連ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種により引き起こされる感染からの防御を提供する、宿主動物内での感染中および最小培地処方物中でアップ−レギュレートすることのできるこれらの種の抗原が開示される。細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種の抗原を含有するワクチン組成物も、また、これらの種による感染に対し動物を免疫にする方法と共に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 パスツレラ科抗原および関連ワクチン 発明の背景 バスツレラ科により引き起こされる肺炎から防御するように設計された動物ワ クチンは、一般的に、細菌培養物の不活性化細菌全体もしくは抽出物から製造さ れる。培養により成長させたパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida ）のチオシアン酸カリウム抽出物の防御能力が、マウス、ニワトリ、ウシおよび ラビットで調査されてきた。これらの抽出物は、蛋白質、ヒアルロン酸、リポ多 糖、ＤＮＡおよびＲＮＡを含有するので、防御成分の解釈を困難にしていた。い くらかの交叉防御が観察されたが、防御は、主として同種感染に対するものであ る。 培養により成長したパスツレラ・マルトシダのラビット分離物により発現され る免疫原性外層膜蛋白質も、調査されてきた。主要な抗体応答は、２７ｋＤ、３ ７．５ｋＤ、４９．５ｋＤ、５８．７ｋＤおよび６４．４ｋＤの分子量を有する 外層膜ポリペプチドに向けられると考えられる（Lu等（1988）Infect Immun 56: 1532-1537）。更なる研究は、感染に用いる分離物がモノクローナル抗体により 認識される抗原決定基を発現するならば、３７．５ｋＤ蛋白質に特異的なモノク ローナル抗体が、マウスおよびラビットを感染から受動的に防御することができ ることを示した。しかしながら、調べた全ての分離物が抗原決定基を発現したわ けではなかった（Lu等(1991)Infect Immun 59:172-180）。 パスツレラ・マルトシダＡ型の交叉防御能に関する多くの調査は、家禽に感染 するセロタイプおよび分離物を用いた。インビボで成長した不活性化細菌を接種 することにより七面鳥内で製造した交叉防御抗血清を、受動免疫に用い、結果は 、この抗血清が若年七面鳥を異種感染から受動的に防御することを示した(Rimle r RB(1987)Avian Diseases 31: 884-887)。パスツレラ・マルトシダのこれらの 交叉防御因子の性質を調べる試みにおいて、研究者等は、インビボで成長した細 菌の完全な溶解または部分的可溶化に続く勾配遠心分離が、同種および異種感染 から部分的防御を提供することができる画分に帰することを示した。約７４ｋＤ 、６５ｋＤ、３９ｋＤおよび３０ｋＤの分子量を有する４つの蛋白質のバンドが 、交叉防御に関与していることを示唆した(Rimler RB等（1989）Avian Diseases 33: 258-263)。更なる研究は、菌血症のトリから回収した生物体が同様の大き さの外層膜蛋白質を含む ことを示した。しかしながら、これらのポリペプチドは、標準栄養強化培地で培 養した同じ細菌の分離物中に検出されなかった。 洗剤不溶性である、インビボで生育した細菌から回収された約１５３ｋＤ、１ ７９ｋＤ、１９２ｋＤおよび２０４ｋＤのポリペプチドに特異的な抗体も、また 、家禽における異種感染に対する受動的交叉防御を提供することが示されてきた （Wang CL等 要約♯３２、８ページ、動物疾患における調査研究者等の会議、19 92年11月９−１０日、シカゴ、イリノイ州）。この抗血清は、培養生育細菌に吸 着させて培養生育調製物中の抗原と反応する抗体を取り出した。これらの研究は 、パスツレラ・マルトシダにおける蛋白質発現の制御が局部環境に依存する可能 性があること、重要な免疫原である可能性のある抗原がインビトロでの生育中に 発現しないかもしれないことを示唆した。これらの抗原は、生物体がその天然の 宿主を侵略する際、感染過程でアップ−レギュレートされるだけかもしれない。 インビボで発現した抗原生産のための最小培地の使用は、哺乳類宿主内で生育 した細菌は、栄養欠乏を体験するという考えに基づいている。病原菌種の特定の 栄養要求突然変異体が無発病性であることを多数の研究者等が報告している。サ ルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)(Brown，R.F．およびStocker B.A.D.(19 87)Infect．Immun．55: 892-898)、バチラス・アントラシス(Bacillus anthraci s)(Ivanovics等（1968）J．Gen．Microbiol．53: 147-162)、大腸菌(Escherichi a coli)(Kwaga等（1994）Infect．Immun．62: 3766-3772)、パスツレラ・マルト シダ(Pasteurella multocida)(Homchampa等（1992）Molec．Microbiol．6: 3585 -3593)およびエルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)(O'Gaor a等（1990）Microb．Pathogenesis 9: 105-116)のような異なる種における、プ リン類、アスパラギン酸、ｐ−アミノ安息香酸、芳香族アミノ酸、ジアミノピメ リン酸、アルギニンおよびピリミジン類の生合成における欠陥を有する突然変異 体が、無発病性であることがわかっている。これら全ての報告は、哺乳類宿主が 細菌に必須の栄養素の入手可能性を厳重に制限していることを示唆する。また、 これらの結果は、細菌が宿主内で複製し、疾病を引き起こすために多数の生合成 経路を活性化せねばならないということも示唆する。インビボ発現技術（ＩＶＥ Ｔ）、即ち宿主組織内で特異的に誘導される細菌遺伝子を選択する方法論 は、宿主内の栄養学的に過酷な環境の証拠を提供した(Mahan等（1993）Science 259: 686-688; Mahan等（1995）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92: 669-673)。Ｉ ＶＥＴ研究は、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium)carAB およびpheST遺伝子がインビボで特異的に誘導されることを示した。carABオペロ ンの発現は、アルギニンおよびピリミジン類の増加した生合成に帰する。（フェ ニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼの２つのサブユニットをコードする）pheS Tオペロンの誘導は、芳香族アミノ酸フェニルアラニンの窮乏を示す、荷電ｔＲ ＮＡの欠失に対する応答であると考えられている。 微生物生合成経路のインビボ活性化は、宿主から得ることのできない、細菌に 必須の栄養素を提供する。しかしながら、必須のミネラル要求は、生合成により 製造することができず、従って、宿主から得る必要がある。これらのミネラルに は、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガンおよびコバルトがある 。これらのミネラル要求を生合成できないことが、細菌を重大な栄養的危機に陥 らせる。金属イオン輸送は、鉄獲得において最もよく研究されてきた。細菌は、 自身の鉄を生合成することができないことから、鉄制限が細菌を重大な栄養的危 機に陥らせる。このような鉄欠乏下では、ほとんど全ての細菌種が、鉄獲得に関 連するいくつかの異なるシステムを誘導する（Cox，C.D.，“Importance of iro n in bacterial virulence”，T.J．BeveridgeおよびR.J．Doyle(eds.)，Metal lons and Bacteria，John Wiley & Sons，Inc.，New York，N.Y.，1989，207-24 6ページ）。これらの鉄獲得システムの多くは、鉄欠乏に応答して特異的に発現 する外層膜蛋白質を含む。細菌に自身に必須の成長因子の多くを無理やり生合成 させることに加え、哺乳類の鉄−保留防御システムは、細菌にインビボ環境から のこの必須栄養素の獲得のため多数のシステムを誘導することを要求する。 例えば、鉄キレート化剤を含有する培地で培養した七面鳥由来のPasteurella multocida分離物は、標準栄養強化培地では合成されない新規な外層膜蛋白質を 発現する。数人の研究者等は、これらの新規な蛋白質がインビボで生育した細菌 で観察される交叉防御因子であることを示唆した。この鉄によって制御された外 層膜蛋白質とインビボで生育した細菌の外層膜蛋白質間の関係は、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥによる蛋白質のプロフィールの比較により調査された。これらの分析は、鉄 キレート化 剤を含有する培地で生育した細菌から同定したいくつかの蛋白質が、七面鳥から 分離したインビボで生育した細菌により発現したものと類似しているが、標準栄 養強化培地で生育した細菌にはないことを示した。これらの蛋白質は、７６ｋＤ 、８９ｋＤ、および９４ｋＤの分子量を有する(Choi KH等（1989）Am J Vet Res 50: 676-683; Choi-Kim等（1991）Vet Microbiology 28: 75-92; Donachle，W. ，ＵＫ特許出願２２０２８５１Ａ）。 他の研究者等は、鉄を制限した培養物から得た無細胞培養濾液を調査した。こ れらの濾液は、膜に関連した抗原よりむしろ分泌した抗原を含有する。標準栄養 強化または鉄制限培地のいずれかから得た無細胞培養濾液は、七面鳥では同種感 染からは防御したが異種感染からは防御しなかった。 感染したブタの胸膜腔から又は最小培地処方物から直接分離したPasteurella multocidaおよびActinobacillus Pleuropneumoniaeから得た抗原が同定された。 これらの抗原は、宿主動物内で感染中にアップ−レギュレートされた、標準栄養 強化培地での培養中には観察されない蛋白質である。これらの抗原は、最小培地 処方物内でアップ−レギュレートされることが分かった。しかしながら、これら の抗原は、標準栄養強化培地でのインビトロ培養中には存在しないか又はわずか しか発現されない。これらの新規に同定された抗原に対する免疫応答は、異種感 染からの防御をもたらす。従って、これらの抗原は、同じ種の複数の分離物間の 交叉防御を提供する効果的なワクチンの製造に有用である。 発明の概要 本発明の目的は、それらの種により引き起こされる感染からの防御を提供する 、宿主動物内での感染中および最小培地処方物中でアップ−レギュレートするこ とのできる細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種の抗原を提 供することである。 本発明の他の目的は、それらの種により引き起こされる感染からの防御を提供 する、宿主動物内での感染中および最小培地処方物中でアップ−レギュレートす ることのできる細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種の抗原 を含んで成るワクチンを提供することである。 本発明の更に別の目的は、それらの種により引き起こされる感染からの防御を 提 供する、宿主動物内での感染中および最小培地処方物中でアップ−レギュレート することのできる細菌のPsteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種の抗 原を含んで成る効果的な量のワクチンを健康な動物に投与して成る、細菌のPast eurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種により引き起こされる感染に対し 健康な動物を免疫化する方法を提供することである。 図面の簡単な説明 図１は、マウスにおける受動免疫調査を表すグラフである。全てのマウスは、 腹腔内投与による０．５ｍｌの免疫血清続いて４時間後１００から２００ＣＦＵ の毒性Pasteurella multocida １６９２６を受領した。 図１Ａにおいて、免疫血清は、P．multocida分離物８２６１を用いた一次感染 後ブタから集めた。Ａ群（─）血清は、この免疫血清の１：１０希釈物であり； Ｂ群（−−−）血清は、洗剤可溶化標準栄養強化培地生育分離物８２６１に吸着 させたこの免疫血清の１:１０希釈物であり；Ｃ群（…）は、１：１０に希釈し たプレ免疫血清である。 図１Ｂにおいて、免疫血清は、分離物８２６１続いてP．multocida分離物１６ ９ の１:１０希釈物であり；Ｅ群（−・−・−）血清は、洗剤可溶化標準栄養強化培 地生育分離物８２６１に吸着させたこの免疫血清の１:１０希釈物であり；Ｃ群 （…）は、１：１０に希釈したプレ免疫血清である。 図２は、マウスにおける２回目の受動免疫調査を表すグラフである。全てのマ ウスは、腹腔内投与による０．５ｍｌの免疫血清続いて４時間後１００から２０ ０ＣＦＵの毒性P．multocida １６９２９を受領した。免疫血清は、P．multocid a分離物１６９２６への２次露出の７日後ブタから集めた。１群（−−）血清は 、１：１０に希釈したプレ免疫血清であり；２群（─）は、１：１０に希釈した 免疫であり；３群（─・・─）は、洗剤で処理し精製した１：１０に希釈した免疫 血清であり;4群（…）は、洗剤可溶化細菌に吸着させ精製した１:１０に希釈し た免疫血清であり；５群（─・─・）は、分離物１６９２６への２回目の露出の１ ８時間後に集めた肺洗浄液である。 発明の詳細な説明 細菌のPasteurellaceae科は、属Pasteurella、Actinobacillus、およびHaemop hilusの種を含む。Pasteurellaceae科の系統発生論に関する最近の研究は、これ らの３つの属のこの科への分類を確認した(Dewhirst等（1992）J．Bacteriol．1 74: 2002-2013)。Pasteurellaceae科内のさまざまの種は、４つの大きなクラス ターに分かれ、各クラスターは、３つの異なる属の種を含む。この科内の種の例 としては、動物病原体P．multocida、A．pleuropneumoniae、P．haemolytica、H ．somnus、およびA．suisが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。 動物におけるPasteurellaceae感染は、発病性敗血症性肺炎に起因するそれと 類似した症状に帰する。死は、通常、内毒素ショックおよび呼吸不全による。こ れらの感染の急性型では高死亡率になることもあるが、しかしながら、胸膜炎に 帰する亜急性および慢性型がより一般的である。野外感染の治療は、抗生物質抵 抗性が広いため困難であり、しばしば成功しない。従って、ワクチンの使用を介 して動物感染を防止することが好ましい。しかしながら、Pasteurellaceae科内 の細菌種の異なる分離物からの防御を提供するワクチンを達成するには困難があ る。 Pasteurellaceae科内の細菌種の異なる分離物からの交叉防御は、感染中に遭 遇した微小環境条件の影響下で排他的に発現した細菌蛋白質に対する免疫応答を 準備する宿主の能力に依存するようにみえる。これらの細菌により引き起こされ る肺炎からブタを防御するように設計された多数のワクチンは、不活性化細菌全 体から調製される。しかしながら、これらのワクチンは、同種の分離物またはセ ロタイプ（莢膜またはリポ多糖型に基づく血清型別）からの防御を提供するにす ぎない。対照的に、能動的感染から回復するブタは、通常、分離物またはセロタ イプに関わらず、再感染にかなり抵抗性があることが見い出された。更に、粗細 菌産物の組み合わせを用いた免疫に起因するかもしれない有害な全身性および部 位反応の可能性ゆえに、粗細菌産物を大きな組み合わせのワクチンに組み入れる ことは困難である。本発明は、宿主動物の感染中または最小培地処方物中でアッ プ−レギュレートされるが、標準栄養強化培地中での細菌のインビトロ培養中に は存在しないか又は弱々しくしか発現しない、細菌のPasteurella、Actinobacil lusおよびHaemophilus種由来の抗原を提供し、この抗原は、これらの細菌種によ る感染からの防御を提供することができる。これらの抗原は、細菌のPasteurell a、Actinobacillusおよび Haemophilus種の１つの複数の分離物による感染から動物を交叉防御するように 設計された効果的なワクチンの主剤を提供する。 これらの細菌の宿主動物の例としては、ブタ、ウシ、ヒツジ、トリおよびウマ 種が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。゛最小培地処方物゛とは、 明らかでない全ての成分を取り除いているが、宿主内のインビボでアップ−レギ ュレートされる抗原の合成を可能にする、細菌にとって十分な濃度の栄養素を提 供するように特別に設計された培養培地を意味する。対照的に、標準栄養強化研 究室培地は、細菌の最適の生育を可能にするように設計されており、従って、そ れぞれの種の最小生育要件と比較した場合、過剰な水準の栄養素を含んでいる。 完全Heamophilus Pleuropneumoniae(HP)培地は、標準栄養強化培地の例である。 酵母エキス、トリプトン、ペプトンまたはブレーンハートインフュージョンのよ うなこれらの培地中の未確定成分は、全て、卓越した窒素源および一般的栄養補 助物を提供する高水準の複合窒素、アミノ酸類、ビタミン類、鉄および他のミネ ラルを含有しているため、小さな代謝要求は、細菌にかかってくる。対照的に、 本発明で用いる培養培地は、生育を支えるのに必要な必須の栄養素の最低水準を 細菌に供給するように設計されており、従って細菌が宿主生体を侵略する場合遭 遇する環境に似せている。本発明に用いる最小培地の成分は、基礎塩類（元素要 件）、炭素源、Pasteurellaceaeの特別な栄養要求および非必須の最適化栄養補 助物から成る。基礎塩類の例としては、燐酸カリウム、硫酸カリウム、塩化マグ ネシウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムが挙げられ るがこれらに限定されるわけではない。元素要件の例としては、カリウム、硫黄 、燐、ナトリウム、塩化物およびカルシウムが挙げられるがこれらに限定される わけではない。炭素源の例としては、グリセロールおよび乳酸が挙げられるがこ れらに限定されるわけではない。グルコース、ガラクトース、フルクトース、マ ンノース、蔗糖、マンニトール、およびソルビトールも、Pasteurellaceaeによ り利用される。しかしながら、これらの生物体の代謝の発酵型ゆえに、糖の異化 作用中に培養物内の細菌細胞の低収率に帰する酸を産生することができる。従っ て、培養物に酸の蓄積をもたらさない非発酵炭水化物グリセロールおよび乳酸の 使用が好ましい。更に、Pasteurellaceaeの構成員は、単一の炭素源を含有する ミネラル塩培地で生育することができない原栄養菌ではないこと から、特別な栄養添加物を必要とする。例えば、これらの種は、有機窒素源を必 要とし、いくつかのアミノ酸、ビタミンＢ類、β−ニコチンアミド、アデニンヌ クレオチドまたはプロトポルフィリンおよびその共役物を必要とするかもしれな い。これらの要求を満たすために、最小培地は、アルギニン、アスパラギン酸、 シスチン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、リシン、メチオニン、セリン、 チロシン、イノシン、ウラシル、ヒポキサンチン、チアミン、パントテン酸、お よびニコチンアミドから成ってもよい。ActinobacillusおよびHaemophilus種の 増殖のため、β−ＮＡＤ、プロトポルフィリン又はその共役物も必要に応じて加 えることができる。いくつかの成分の添加も、P．muitocidaおよびA．pleuropne umoniaeの細胞収率を強化することが見い出された。これら非必須の最適化補助 物としては、緩衝能を増加するＨＥＰＥＳのような緩衝液、グルタミン酸および カザミノ酸（半完全カゼイン酸加水分解物、Difco Laboratories Ltd，West Mol esey，Surrey KT8 OSE U.K.）のような窒素源、およびＬ−システインのような 有機硫黄源が挙げられる。更に、これらの最小培地処方物は、鉄、亜鉛、銅、マ ンガンもしくはコバルト塩又はこれらのミネラル類を含有する複合生物学的材料 を含有しない。これらのミネラル類の唯一の源は、種々の他の確定成分または水 中に痕跡夾雑物として存在することのできる痕跡量である。これらの最小培地処 方物中の痕跡ミネラル類の研究室分析を、以下の表に提供する。 本発明の一つの態様において、Actinobacillus Pleuropneumoniae細菌の Pasteurella multocidaのような培養したPasteurellaceae種を、宿主動物、好ま しくはブタに、注射により胸膜腔に投与する。 約12から18時間後、宿主動物を安楽死させ、胸膜浸出液を集める。大きい細胞 破片を液から取り除き、インビボで生育した細菌を遠心分離により回収する。そ の結果できた細菌のペレットを緩衝液で数回洗浄し、遠心分離する。細菌のペレ ットを、次いで、緩衝液に再懸濁し、−７０℃で貯蔵する。 他の態様において、P．multocidaまたはA．pleuropneumoniaeのようなPasteur ellaceae細菌を、最小培地処方物中で生育させる。培養した細菌を遠心分離して 細菌を濃縮し培地成分を取り除く。細菌ペレットを約３．０の光学濃度になるよ うにＰＢＳに再懸濁し、分析するまで−７０℃で冷凍する。 インビボ生育細菌または最小培地処方物中で生育した細菌により発現した蛋白 質を、ゲル電気泳動により分離する。強力に発現されるそれらの蛋白質は、次い で、標準栄養強化培地中のインビトロ生育細菌に吸着された免疫血清、または感 染の局部部位から回収した抗体を用いたウェスタンブロット分析のため、ゲル部 分をニトロセルロースに移すことにより同定することができる。゛強力に発現し た゛とは、宿主動物内での感染中、又は、標準研究室培地での従来のインビトロ 培養中には存在しないかもしくは弱々しくしか発現されない最小培地処方物で生 育した細菌においてアップ−レギュレートされるもしくは発現される蛋白質を指 す。゛弱々しく発現した゛とは、量的に非常に少ないので抗原がPasteurellaceae 感染からの防御を提供することのできない発現を指す。従来のインビトロ培養と は、栄養補助物を含有する完全Heamophilus Pleuropneumoniae(HP)培地のような 標準栄養強化培地に接種した細菌を指す。接種物を、好ましくは振蕩インキュベ ーター内で３７℃で数時間インキュベートする。使用前に、細菌を１０，０００ ｘｇで遠心分離して培養培地を取り除き滅菌ＰＢＳ（１０ｍＭ燐酸塩、０．８７ ％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に再懸濁する。標準栄養強化培地を用いたインビトロ で生育したPasteurella multocidaに存在しない、少なくとも１１種の抗原を、 インビトロで生育したPasteurella multocida細菌のウェスタンブロット分析か ら同定した。最小培地処方物中でインビトロ生育した細菌のウェスタンブロット 分析は、この最小培地処方物中で産生した細菌の蛋白質の抗原のプロフィールが 、細菌により感染した宿主動物内で産生した 抗原のプロフィールと同一であることを示した。相当する蛋白質バンドは、約１ １５ｋＤ、１０９ｋＤ、９６ｋＤ、８９ｋＤ、７９ｋＤ、６２ｋＤ、５６ｋＤ、 ５３ｋＤ、４５ｋＤ、３４ｋＤおよび２９ｋＤの分子量を有した。 各抗原に相当する蛋白質バンドを、次いで、ゲルから切り取り、ゲル−電気泳 動により再−単離し、Ｎ´−末端アミノ酸配列決定用シーケンスメンブラン上に 移す。３４ｋＤ抗原のＮ´−末端アミノ酸配列は、以下の通りである： ２９ｋＤ抗原のＮ´−末端アミノ酸配列は、以下の通りである： ２番目の２９ｋＤ抗原のＮ´−末端アミノ酸配列は、以下の通りである： Pasteurellaceaeに対する防御免疫応答を引き起こすこれらの抗原の能力は、受 動トランスファー実験で確認した。細菌に対する抗体を、感染したブタから単離 した。吸着により本発明の抗原に特異的になったそれらの抗体をマウスに投与し た。これらのマウスは、次いで、Pasteurella multocidaの発病性異種分離物で 感染させた。抗体を受領していない対照のマウスは、感染の症状を現わしたが、 一方、抗体を受領しているものは、現わさなかった。従って、これらの抗原に対 する免疫応答として生じた抗体は、Pasteurella multocidaの異種分離物からの 交叉防御を提供した。 更なる実験において、酵母エキスを含有する標準栄養強化培地で培養したP．m ultocidaおよび最小培地処方物で培養した細菌からワクチンを調製した。標準栄 養強化培地で培養した細菌から調製したワクチンは、P．multocidaの同種または 異種感染のいずれからもマウスを防御することができなかった。対照的に、最小 培地処方物で培養した細菌から調製したワクチンで免疫をつけたマウスは、ずっ と良い生存率を示した。これらの実験は、栄養素および、鉄、銅、亜鉛、マンガ ンまたはコバルトのような微量元素の入手可能性を制限する条件下での細菌の生 育は、宿主 環境により通常アップ−レギュレートされた抗原の発現に帰し、それらは防御に 重要な役割を果たすことを示している。最小培地での生育によりこれらの抗原を 産生する能力は、現在入手可能であるものに比しより有効なワクチンを産生する 能力に帰する。 本発明において、Pasteurella感染からの防御を提供する、宿主動物内での感 染中および最小培地処方物内でアップ−レギュレートすることのできるPasteure lla multocida抗原を同定する。一つの態様において、Pasteurella multocida抗 原は、ゲル電気泳動により測定する場合、約１１５ｋＤの分子量を有する。他の 態様において、Pasteurella multocida抗原は、ゲル電気泳動により測定する場 合、約１０９キロダルトンの分子量を有する。更に別の態様において、Pasteure lla multocida抗原は、ゲル電気泳動により測定する場合、約９６キロダルトン の分子量を有する。更に別の態様において、Pasteurella multocida抗原は、ゲ ル電気泳動により測定する場合、約８９キロダルトンの分子量を有する。更に別 の態様において、Pasteurella multocida抗原は、ゲル電気泳動により測定する 場合、約７９キロダルトンの分子量を有する。更に別の態様において、Pasteure lla multocida抗原は、ゲル電気泳動により測定する場合、約６２キロダルトン の分子量を有する。更に別の態様において、Pasteurella multocida抗原は、ゲ ル電気泳動により測定する場合、約５６キロダルトンの分子量を有する。更に別 の態様において、Pasteurella multocida抗原は、ゲル電気泳動により測定する 場合、約５３キロダルトンの分子量を有する。更に別の態様において、Pasteure lla multocida抗原は、ゲル電気泳動により測定する場合、約４５キロダルトン の分子量を有する。一つの好ましい態様において、Pasteurella multocida抗原 は、ゲル電気泳動により測定する場合、約２９キロダルトンの分子量および配列 番号：２から成るＮ´−末端アミノ酸配列を有する。２番目に好ましい態様にお いて、Pasteurella multocida抗原は、ゲル電気泳動により測定する場合、約２ ９キロダルトンの分子量および配列番号：３から成るＮ´−末端アミノ酸配列を 有する。Pasteurella multocida抗原が、ゲル電気泳動により測定する場合、約 ３４キロダルトンの分子量および配列番号：１から成るＮ´−末端アミノ酸配列 を有することもやはり好ましい。 標準栄養強化培地中でインビトロで生育した細菌ではなく、宿主動物内での感 染 中および最小培地処方物中でアップ−レギュレートした抗原を、Actinobacillus pleuropneumoniaeの分離物についても同定した。A．Pleuropneumoniaeは、P．m ultocidaのそれと最も異なる系統発生クラスターに存在するPasteurellaceae科 の構成員である。インビボまたは最小培地細菌と標準栄養強化培地で培養した細 菌間の最も顕著な抗原性の相違は、インビボおよび最小培地調製物における約６ ０ｋＤから６５ｋＤの更なるバンドの存在であった。 宿主動物内でインビボでまたは最小培地処方物中で生育する細菌により産生す ることに加え、Pasteurellaceae抗原は、当業者等に周知の技法を用い組み替え により産生することもできるし又は、遺伝子操作を介して培養物に誘導すること もできる。 本発明の抗原は、ワクチンに含ませ、Pasteurellaceae科の細菌による感染か ら防御するのに効果的な量で健康な動物に投与することができる。投与により、 ワクチン中の抗原は、細菌に対し健康な動物が形成する抗体に帰する免疫応答を 引き起こす。゛効果的な量゛とは、抗原に対する抗体の産生に帰するのに十分な免 疫応答を動物にもたらすワクチン量を指す。次いで、動物は、その後のPasteure llaceaeの分離物へのいかなる露出からも防御される。 好ましい態様において、Pasteurellaceae細菌Pasteurella multocida用ワクチ ンは、３４ｋＤの分子量および配列番号：１から成るＮ´−末端アミノ酸配列又 は２９ｋＤの分子量および配列番号：２もしくは配列番号：３から成るＮ´−末 端アミノ酸配列を有する少なくとも一つの抗原を含んで成る。抗原は、薬学的に 許容されるいずれの担体にも溶解または懸濁することができる。薬学的に許容さ れる担体の例としては、等張正食塩水、水または好ましくはアジュバントを加え た水中の標準５％デキストロースが挙げられるが、これらに限定されるわけでは ない。アジュバントの例としては、Quil A、Alhydrogel、ならびに組織培養培地 中のQuil Aおよび５％Alhydrogelが挙げられるが、これらに限定されるわけでは ない。ワクチンは、約１から１００μｇ／投与量の範囲の量で、経皮下的に、経 筋肉内的に、経腹腔内的に、イントラビトリアリーにより、経口的に、経鼻的に または坐剤により投与することができる。 別の態様において、インビボでもしくは最小培地処方物中でインビトロで生育 し た細菌内で、組み替えもしくは遺伝子操作を介してまたは特殊化培養条件下で産 生した本発明の抗原は、全培養生育細菌に加えて効果的なワクチンを製造するこ とができる。これらの抗原の培養生育細菌への添加は、その結果できるワクチン の効能を増加させる。 以下の非制限的例により本発明を更に具体的に説明する。 実施例 実施例１:細菌分離物および生育条件 Pasteurella multocida分離物８２６１および１６９２６は、Iowa State Vete rinary Diagnostic研究所から受け取った野外分離物であった。両方の分離物と もセロタイプ３Ａであった。従来のインビトロ生育のためには、細菌を、栄養補 助物を含有するHeamophilus Pleuropneumoniae(HP)培地(Gibco，Grand Island， NY)に接種し、振蕩インキュベーター内で３７℃で６時間インキュベートした。 細菌を１０，０００ｘｇで遠心分離して培養培地を取り除き、滅菌ＰＢＳ（１０ ｍＭ燐酸塩、０．８７％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に再懸濁した。インビボ生育の ためには、２ｘ１０⁸ＣＦＵ／ｍｌの濃度の培養細菌１ｍｌを、横隔膜葉内への 経胸腔注射によりブタに投与した。１６時間後ブタを安楽死させ、インビボ−生 育細菌を胸膜浸出液から回収した。胸膜浸出液を２５０ｘｇで遠心分離して大き い細胞破片を取り除き、次いで、インビボ−生育細菌を４℃で４０分間の１０、 ０００ｘｇでの遠心分離により回収した。細菌のペレットを、上記のような遠心 分離により滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。細菌のペレットを、ＰＢＳに再懸濁し、 −７０℃で貯蔵した。インビボおよびインビトロで生育した両方の分離物から得 た蛋白質濃度を、製造元指示によりＢＣＡ蛋白質アッセイ(Pierce，Rockford，I L.)を用いて測定した。 実施例２:免疫ができた感染したブタから得た回復期の血清および抗体 ３つの群の６−８週齢のブタを、経胸腔による感染により５から１０ｘ１０⁶ コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌのＰｍＡ分離物１６９２６または８２６１に 感染させた。ブタを１０日間から１ヶ月間病後療養させ、次いで、抗生物質を用 いて治療して残っている感染を一掃した。更に１ヶ月から２ヶ月後、ブタを、経 胸腔によりＰｍＡの異種分離物（８２６１または１６９２６）（１．５−２．５ ｘ１０⁸ＣＦＵ／ｍｌ）に露出した。ブタを０、１、２、３、４または７日目に 安楽死させた。一 次感染時点、一次感染の１ヶ月後、および安楽死時点でブタから血清試料を集め た。 感染の局部部位から抗体を得るために、安楽死時点でブタから肺洗浄液を回収 した。抗体を回収するために、肺および気管を約１００ｍｌの滅菌ＰＢＳですす いだ。肺をもみほぐし、次いで、抗体を含有する液を滅菌試験管に注ぎいれた。 液を２５０ｘｇで２０分間４℃で遠心分離して大きい細胞破片および赤血球を取 り除いた。 実施例３:洗剤−可溶化または全Pasteurella multocidaを用いた抗体調製物の吸 着 インビトロ生育細菌抗原を認識する抗体を、全細菌または洗剤−可溶化抗原の いずれかに対する吸着により取り出した。新鮮な培養生育細菌（分離物８２６１ または１６９２６）を、全細菌吸着のために得た。約１０ｍｌの細菌（３ｘ１０⁹ ＣＦＵ／ｍｌ）を、４℃で４０分間の１１，０００ｘｇでの遠心分離(Beckman microfuge，Beckman Instruments，Palo Alto，CA)によりペレット状にした。上 澄を取り除き０．１ｍｌの抗血清を加えた。混合物を、穏やかに撹拌しながら４ ℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、吸着した物質を１１，０ ００ｘｇで４０分間遠心分離し、上澄を取り除き、新鮮な細菌ペレットに加えた 。最終上澄を集め、ウェスタンブロット分析のため−２０℃で貯蔵した。 洗剤可溶化のため、培養生育細菌を、０．０６２Ｍのトリス、０．０６９Ｍの ＳＤＳおよび１．０９Ｍのグリセロール、ｐＨ７．０を含有する溶液中で可溶化 した。抗原調製物を、次いで、１００℃で１０分間煮沸して細菌を可溶化した。 可溶化抗原を冷却した後、同じ容量の抗体と混合し、４℃で一晩インキュベート した。混合物を２０，０００ｘｇで４０分間遠心分離して沈殿した抗体−抗原複 合体をペレット状にした。最終上澄を集め、−２０℃で貯蔵した。 実施例４:硫酸アンモニウム沈殿を用いた抗体調製物の精製 マウスにおける受動免疫研究に用いる抗体調製物を、硫酸アンモニウムを用い て部分的に精製した。血清試料を滅菌ＰＢＳで１：３で希釈した。飽和硫酸アン モニウム溶液を９０％飽和になるように希釈し、次いで、希釈した血清に等容量 が添加されるまで、希釈した血清に滴下することにより、、抗体の４５％硫酸ア ンモニウム沈殿に帰した。この溶液を氷上で１時間インキュベートした。混合物 を４℃で４０分間１０，０００ｘｇで遠心分離して硫酸アンモニウム沈殿物をペ レット状にし た。上澄を捨て、ペレットを、滅菌ＰＢＳを用いて初めの血清容量に再懸濁した 。硫酸アンモニウム沈殿を繰り返して抗体を更に精製した。抗体の再懸濁後、溶 液を、１２，０００ＭＷカットオフのメンブランチューブを用いＰＢＳに対して ３回透析した。 実施例５:ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析 ＰｍＡから得た蛋白質を、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し続いて電気移動およびイムノ・ ブロッティングを行った。インビボおよびインビトロ生育細菌の両方から得た、 ＰｍＡ分離物８２６１および１６９２６から得た蛋白質を、５ｘ還元緩衝液(Pie rce，Rockford，IL)と共に１０分間煮沸した。蛋白質を、次いで、１０％ＳＤＳ ゲル上でレーン当たり１６μｇの濃度で分離した。電気泳動（２０ｍＡの定電流 ）後、蛋白質を４℃で一晩ブロッティングメンブラン(Immobilon，Millipore，B edford，MA)上に移動させた（３０ボルト、定電圧）。 メンブランを、１０ｍＭのトリス、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（トリス− 食塩水）中の１０％無脂肪乾燥乳で遮断し、ストリップを、吸着抗血清の適切な 希釈物と共に室温で１時間更にインキュベートした。次に、ストリップを、０． １％のTriton X-100を含有するトリス−食塩水で３回すすぎ、１：１０００希釈 のアルカリホスファターゼ結合ヤギα−ブタ１ｇＧ（H+L）(Kirkegaard and Per ry，Gaithersburg，MD)と共に更に１時間インキュベートした。１ｘトリス−食 塩水Triton−Xでの３回の洗浄（それぞれ５分間）後、ストリップを、有機塩基 ／トリス緩衝液(Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD)中の０．２１ｇ／ｌ 濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＩＣＰ）お よび０．４２ｇ／ｌ濃度のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）に１０分間浸 した。ストリップを、発色現像を停止するために蒸留水で洗浄した。 インビボ生育ＰｍＡ分離物８２６１および１６９２６により強力に発現した蛋 白質を、培養生育細菌に対して徹底的に吸着させた免疫血清を用い、ウェスタン ブロット分析により同定した。培養生育ＰｍＡでは存在しないか又はわずかしか 発現しない、約１１５ｋＤ、１０９ｋＤ、９６ｋＤ、８９ｋＤ、７９ｋＤ、６２ ｋＤ、５６ｋＤ、５３ｋＤ、４５ｋＤ、３４ｋＤおよび２９ｋＤの分子量を有す る少なくと も１１個の蛋白質バンドを、インビボ生育細菌から同定した。 非吸着血清を用いた、インビボおよび培養生育抗原間のバンドプロフィールに おける相違を見分けることができなかった。これは、Pasteurella multocidaの 感染に対して高まった抗体応答のほとんどが、細菌をインビトロで培養する場合 または細菌を天然の宿主から回収する場合のいずれかで発現する抗原に特異的で あることを示している。対照的に、培養した細菌を用いた吸着により除去されな い抗体のほとんどは、宿主から回収したインビボ細菌とのみ反応する。 実施例６:同定した蛋白質の分子量の決定 インビボ生育条件下で独特であるか又はアップ−レギュレートされる同定され た蛋白質の分子量を、BioImage Computer System(BioImage/Millipore，Ann Arb or，MI)を用いWhole Band Analysisにより算定した。既知の分子量マーカーに基 づき同定したバンドの重量を算定した。クマシーブルーで染色した虹色の蛋白質 分子量マーカー（Amersham Life Science，Arlington Heights，IL）およびBio- Rad ＳＤＳ−ＰＡＧＥ広範囲分子量標準（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA ）の両方を、比較標準として用いた。 実施例７:マウスにおける受動免疫 受動免疫実験に用いた全ての抗体調製物は、P．multocida分離物８２６１を用 いた一次感染、いくつかのケースでは続いて分離物１６９２６を用いた二次感染 に対してブタ内で生じさせた。一次感染前に集めた血清を、受動免疫実験の負の 対照として用いた。ブタ１０４由来の回復期の血清を、一次感染の３０日後また は二次露出の７日後のいずれかに集め、ブタ１０３から得た肺洗浄液を二次感染 の１８時間後に集めた。２番目の菌株での再露出後、２回目の抗体応答が予想さ れる。しかしながら、２回目の応答は、２つのPasteurella multocida分離物間 に共通である抗原に限定されるであろう。 血清抗体調製物を、洗剤可溶化細菌に吸着させ、実施例４で述べたように硫酸 アンモニウム沈殿物により精製した。部分的に精製した抗体調製物を、もとの血 清試料の１：１０希釈を示す容量により標定した。肺洗浄液は、吸着または精製 しなかった。 ０．５ｍｌの抗体調製物を腹腔内経路によりマウスに注射した。４時間後、１ ０ ０−２００ＣＦＵ／マウスの割合で分離物１６９２６をマウスに感染させた。感 染後１０日間臨床症状および死亡率についてマウスを観察した。 １回目の感染後に集めた抗血清および２回目の感染後集めた抗血清の両方が、 １６９２６感染からマウスを受動的に防御した（それぞれ１０匹のうち９匹、１ ０匹のうち８匹のマウスが、感染後少なくとも１０日生存した）。これらの抗血 清も、やはり洗剤処理した培養生育細菌（８２６１）に吸着させた。吸着後、抗 血清は、その防御能をいくぶん失したが、これらの群の死亡率は、プレ免疫血清 を受領した対照の群に比しまだ低かった。 吸着抗血清の防御能を確認するために、２回目の受動免疫研究を行った。２回 目の感染後に集めた血清をこの研究に用いた。免疫血清を与えられたマウスの全 群が、プレ免疫血清を受領した対照のマウスのそれより良好な生存率であった。 非処理免疫血清を与えられた群は、最も高い生存率を示した（１０匹のうち９匹 のマウスが、１０日の感染期間を生き延びた）。洗剤処理および精製した抗血清 は、中間の防御を提供した。これらの群のマウスは、感染後６日から１０日の間 に死に始めた。洗剤処理および精製した抗血清を受領したマウス対洗剤可溶化培 養生育細菌に吸着させ次いで精製した抗血清を受領したマウス間に、生存時間ま たは死亡率における相違は見られなかった。これらの群で生じた死亡は、特異的 抗体の全量が精製中に減少したか又は、抗体の半減期が洗剤処理または精製によ り短くなったかのいずれかであることを示唆している。いずれの場合も、損失が 非特異的であるように見える。これらの実験に用いた抗体調製物のウェスタンブ ロット分析は、吸着無しの精製が培養生育およびインビボ生育細菌に共通する抗 体を除去しないこと、培養生育細菌に対する大部分の反応性が吸着処理により除 去されることを示した。免疫血清の吸着は、分離物８２６１を用いて行った。し かしながら、ウェスタンブロット分析は、培養生育分離物１６９２６に対する反 応性の大部分がやはり除去されること、インビボバンドに対する残存する反応性 が８２６１および１６９２６の分離物の両方で見られることを示した。これらの 観察は、吸着後に残った抗体がインビボ生育細菌抗原に特異的であること、これ らの抗体が感染からの防御に大きく関与することを示唆する。 このモデルでは、プレ免疫血清は、いかなる受動防御も提供しなかった。この 群 の全マウスは、感染後１日から３日の間に死亡した。プレ免疫ブタ血清は、ウェ スタンブロット分析で若干の細菌蛋白質と反応したが、反応は弱かった（１：１ ０希釈）。これらの研究に用いたブタは特異的病原体が非含有ではなかったこと から、これは予想された。Pasteurella multocidaまたは、交叉又反応性抗原を 有する他の病原体に露出したかもしれないが、一次感染の時点ではPasteurella multocidaに感染しやすく、感染後臨床疾患をわずらった。 初めに分離物８２６１に感染し、次いでPasteurella multocidaの異種分離物 （分離物１６９２６）に露出した免疫ブタの肺から回収した抗体も、マウスを受 動的に防御するその能力を試験した。Pasteurella multocidaに対する２回目の 経胸腔露出の１８時間後、肺から抗体を回収した。露出の局部部位から回収した この抗体は、侵略している細菌と直接接触したであろう。肺の細胞外環境への特 異的抗体の循環系から血管漏出現象は、２回目の露出後の免疫ブタに見られる防 御に寄与する重要な免疫機構を示す。対照群と比較した場合、これらのマウスに 部分的防御が見られた。感染後初めの１から３日以内に５匹のマウスが死亡した が、残った５匹のマウスは更に４日から５日生存した。肺洗浄物質中に含まれる 蛋白質のクマシー染色は、大部分の蛋白質がイムノグロブリンであることを示唆 した。しかしながら、肺洗浄物質のウェスタンブロット試験は、肺洗浄物に見ら れた特異的抗体の濃度が、血清から回収したそれに比しかなり低いことを示した 。従って、これらのマウスで見られた減少した防御水準は、肺から回収された抗 体の減少した濃度により説明することができる。 実施例８:マウスにおけるP．multocidaからの能動防御 急性感染ブタの胸腔から回収した細菌P．multocida（分離物８２６１）を、実 施例１で述べたように分離した。分離物８２６１は、やはり、実施例１で述べた ように培養物中で生育した。両方の調製物を０．３％ホルマリンで不活性化し、 １ｘ１０⁹コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの濃度に調整した。各調製物に、 ５％水酸化アルミニウムゲルを含有する鉱油エマルジョンのアジュバントを加え た。２つのワクチンの５倍および２５培希釈物を、もとのワクチンをアジュバン トで希釈することにより調製した。全ワクチン調製物は、腹腔内注射によりＣＦ １マウスに投与した。３週間間隔で２回マウスに０．１ｍｌ投与量でワクチンを 投与した。 全マウスは、５０から１００ＣＦＵの発病性Pateurella multocida分離物８２ ６１または１６９２６で感染させ、１５日間観察した。下記の表２に示したよう に、最も高濃度のワクチンを用いた場合、両方の調製物が、同種および異種感染 の両方からマウスを防御した。しかしながら、低めの濃度のワクチンを用いた場 合、インビボ生育細菌から産生したワクチンのみが、発病性感染からマウスを防 御することができた。インビボ抗原の１ｘ１０⁷ＣＦＵ同等量のワクチンを投与 した１０匹のマウスのうち８匹が、同種感染から防御され、１０匹のマウスのう ち７匹が異種感染から防御された。対照的に、最も低濃度の培養細菌抗原のワク チンを投与した１０匹のマウスのうち０匹が同種感染を生き延び、培養細菌抗原 のワクチンを投与した１０匹のマウスのうちわずか３匹が異種感染を生き延びた 。分離物８２６１で感染させたワクチン投与していない１０匹のマウスのいずれ もが生存せず、分離物１９６２９で感染させたワクチン投与していない１０匹の マウスのうちわずかに１匹が生存した。 マウスにおけるこの能動免疫試験は、インビボ生育によりアップ−レギュレー トされる抗原の添加が、標準栄養強化培地で生育した細菌から製造したワクチン の５倍から２５倍効果的であるワクチンを製造したことを示した。 実施例９:蛋白質の部分的アミノ酸配列決定 インビボ生育細菌から同定した蛋白質のＮ´−末端アミノ酸配列を決定するた めに、インビボ生育細菌分離物８２６１から得た蛋白質を、１０％ＳＤＳゲル上 で分 離した。正しい蛋白質バンドを同定するために同時にウェスタンブロットを実施 した。次いで、蛋白質バンドを、ゲルから切り取り、電気溶出し、ＰＶＤＦ膜(P roBlott，Applied Biosystems)に移動させた。次いで、蛋白質バンド（それぞれ ４０−５０ρモル）を０．１％のクマシーブルーＲ−２５０（Bio-Rad，Hercule s，CA）で染色した。アミノ酸配列決定のため個々の蛋白質を膜から切り取った 。Riverside，CAにあるカリフォルニア大学のBiotechnology Instrumentation F acilityでApplied Biosystems Model A気相蛋白質シーケンサーにより配列決定 を行った。 実施例１０:抗原に特異的なモノクローナル抗体の製造 ＢａｌｂＣマウスを、実施例８で述べたようにインビボ生育P．multocidaで免 疫にし、次いで、ＳＤＳ中の可溶化インビボ細菌で再免疫にした。免疫にしたマ ウスから得た脾臓をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させて抗体を分泌するハイブリ ドーマを作製した。１０９ｋＤ蛋白質に特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ 細胞を限界希釈により２回クローンし、Ｍａｂ ＰＭＡ３−１と命名した。その 結果できたモノクローナル抗体は、インビボ生育細菌により産生された１０９ｋ Ｄ蛋白質に特異的であり、完全培地で生育した細菌と反応しなかった。 ２番目のモノクローナル抗体を、インビボ生育P．multocidaから得た２９ｋＤ 蛋白質と結合する能力に基づいて選択した。インビボ生育および培養した細菌の ウェスタンブロット分析は、インビボ生育細菌の２９ｋＤ蛋白質への強力な結合 、および培養生育細菌に対する非常にわずかな反応性を示した。このモノクロー ナル抗体を産生する細胞を、限界希釈によりクローンし、Ｍａｂ ＰＭＡ３−２ １と命名した。 実施例１１:最小培地処方物中での抗原の発現 生育を支持するのに必要な最小水準の必須栄養素をP．multocidaに供給するよ うに、従って、細菌が宿主生体を侵略する際に遭遇するかもしれない環境をまね て培養条件を設計した。最小培地の配合組成を、表３に示す。 この培地中でのP．multocidaの生育は、インビボで産生されるのと同じ抗原の産 生に帰した。ウェスタンブロット分析は、この最小培地処方物で産生した細菌蛋 白質の抗原のプロフィールが、実施例５で述べたようなインビボ生育細菌の抗原 のプロフィールと同一であることを示した。 実施例１２:最小培地処方物中で生育した細菌から製造したワクチンによるマウ スの能動防御 P．multocida分離物８２６１を、実施例１１で述べたように最小培地処方物中 で培養した。細菌を、やはり、実施例１で述べたように標準栄養強化培地中で培 養するか又は、実施例１で述べたように感染したブタの胸腔から直接回収した。 全調製物は、常に撹拌しながら３７℃で２４時間０．３％ホルマリンで不活性化 した。不活性化細菌を、不活性化前の細胞カウント１ｘ１０⁹ＣＦＵ／ｍｌに希 釈した。細菌懸濁液を、Quil ＡおよびＴＤＭを含有するスクァレンエマルジョ ンのアジュバントに加えた。マウス(メスＣＦ１、Charles River Laboratories) に、右下腹部１／４区に腹腔内経路により０．１ｍｌの投与量で予防接種した。 マウスは、３週間間隔で２回の予防接種を受領し、２回目の予防接種の２週間後 、３８０ＬＤ₅₀（５０％致死量）のP．multocida８２６１または２０９ＬＤ₅₀の 分離物１６９２６のいずれかで感染させた。 この実験で、酵母エキスを含有する標準栄養強化培地で培養したP．multocida から調製したワクチンは、同種（８２６１）または異種（１６９２６）のいずれ の感 染からもマウスを防御することができなかった。１０匹のマウスのうちわずかに １匹が８２６１の感染から生き延び、わずかに５匹のマウスが１６９２６の感染 から生き延びた。対照的に、インビボ生育細菌又はいずれかの最小培地処方物で 培養した細菌から調製したワクチンで免疫になったマウスは、ずっと良い生存率 であった。これらの生存率は、１０匹のうちの７匹から完全な防御（１０匹のマ ウスのうち１０匹）の範囲であった。 実施例１３:Actinobacillus pleuropneumoniaeの゛インビボ様゛抗原の誘導 Actinobacillus pleuropneumoniaeの急性感染後死亡または安楽死したブタの 胸膜浸出液から細菌を回収した。フィブリンクロットを除去するためにガラスビ ーズを入れた瓶に体液を集め、次いで、遠心分離瓶に移した。赤血球および他の 細胞破片を、９００ｘｇで４℃で１５分間遠心分離することにより除去した。次 いで、４℃で１５分間の１４，０００ｘｇでの遠心分離により上澄液から細菌を 回収した。細菌のペレットを、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、上記のよ うに遠心分離および再懸濁により３回洗浄した。最終細菌ペレットを、約３．０ の光学濃度になるようにＰＢＳに再懸濁し、分析するまで−７０℃で冷凍した。 Actinobacillus pleuropneumoniaeの同じ分離物を、合成培地♯１、合成培地 ♯３および完全ＨＰ培地（表３参照）でやはり培養した。全培地が、１０ｍＭの ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を含有した。培養した細菌を 上記のように遠心分離して細菌を濃縮し培地成分を除去した。細菌ペレットを、 約３．０の光学濃度になるようにＰＢＳに再懸濁し、分析するまで−７０℃で冷 凍した。 実施例５で述べたようにウェスタンブロット分析を実施した。８週間前にA．p leuropneumoniaeで実験的に感染させておいたブタから集めた回復期の抗血清を 用 いてイムノブロットを展開した。インビボまたは合成培地細菌と完全ＨＰで培養 した細菌間の最も顕著な抗原的差異は、インビボおよび最小培地調製物における 約６０ｋＤから６５ｋＤの更なるバンドの存在である。これらの差異を確認する ために、Actinobacillus Pleuropneumoniaeの３つの異なるセロタイプ（セロタ イプ１、５および７）を、合成培地および完全ＨＰ培地で生育した。それぞれの ケースで、ＨＰ生育抽出物に存在しなかったいくつかの更なるバンドが、合成培 地調製物中に存在した。それぞれのセロタイプ由来のこれらの抗原も、インビボ 調製物中で検出した。 セロタイプ５由来の同様の細菌調製物に、鉄キレート化によりアップ−レギュ レートされることが公知であり、インビボ生育中にキレート化した鉄の獲得に機 能すると考えられているトランスフェリン結合蛋白質に特異的である抗血清でプ ローブした(Deneer and Potter，Infection and Immunity（1989）57(3): 798-8 04)。インビボ細菌を含有するレーンおよび合成培地で生育した細菌を含有する レーンで約６０ｋＤの強いバンドを検出したが、完全ＨＰ培地で生育した細菌を 含有するレーンでは検出しなかった。この知見は、宿主内でのActinobacillus p leuropneumoniaeの生育中に見られる蛋白質のアップ−レギュレーションが、こ れらの細菌を合成培地で培養する場合にも起きることを確証する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイザックソン， ワンダ， カイ アメリカ合衆国68428ネブラスカ州レイモ ンド市ボックス・エージー 11、 ルート １ (72)発明者 カウフマン， トーマス， ジェイムズ アメリカ合衆国68523ネブラスカ州リンカ ーン市サドル・クリーク・トレイル 6100 (72)発明者 リー， ウーミン アメリカ合衆国68506ネブラスカ州リンカ ーン市ホールドリッジ・ストリート ＃８、3331 (72)発明者 ファイファー， ナンシー， エレン アメリカ合衆国68434ネブラスカ州ソード 市ボックス 20、ルート１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種によって引き起 こされる感染に対する防御を提供する、宿主動物内での感染中および最小培地処 方物中でアップ−レギュレートすることのできるこれらの種の抗原。 ２．Pasteurella multocida抗原を含んで成る請求項１の抗原。 ３．ゲル電気泳動により測定する場合、約１１５キロダルトンの分子量を有す る請求項２のPasteurella multocida抗原。 ４．ゲル電気泳動により測定する場合、約１０９キロダルトンの分子量を有す る請求項２のPasteurella multocida抗原。 ５．ゲル電気泳動により測定する場合、約９６キロダルトンの分子量を有する 請求項２のPasteurella multocida抗原。 ６．ゲル電気泳動により測定する場合、約８９キロダルトンの分子量を有する 請求項２のPasteurella multocida抗原。 ７．ゲル電気泳動により測定する場合、約７９キロダルトンの分子量を有する 請求項２のPasteurella multocida抗原。 ８．ゲル電気泳動により測定する場合、約６２キロダルトンの分子量を有する 請求項２のPasteurella multocida抗原。 ９．ゲル電気泳動により測定する場合、約５６キロダルトンの分子量を有する 請求項２のPasteurella multocida抗原。 １０．ゲル電気泳動により測定する場合、約５３キロダルトンの分子量を有す る請求項２のPasteurella multocida抗原。 １１．ゲル電気泳動により測定する場合、約４５キロダルトンの分子量を有す る請求項２のPasteurella multocida抗原。 １２．ゲル電気泳動により測定する場合に約２９キロダルトンの分子量および 配列番号：２を含んで成るＮ´−末端アミノ酸配列を有する請求項２のPasteure lla multocida抗原。 １３．ゲル電気泳動により測定する場合に約２９キロダルトンの分子量および 配列番号：３を含んで成るＮ´−末端アミノ酸配列を有する請求項２のPasteure lla multocida抗原。 １４．ゲル電気泳動により測定する場合に約３４キロダルトンの分子量および 配列番号：１を含んで成るＮ´−末端アミノ酸配列を有するPasteurella multoc ida抗原。 １５．Actinobacillus Pleuropneumoniae抗原を含んで成る請求項１のPasteur ellaceae抗原。 １６．細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種による感染予 防用ワクチンであって、宿主動物内での感染中および最小培地処方物中でアップ −レギュレートすることのできる細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHae mophilus種の抗原を含んで成ることを特徴とする前記ワクチン。 １７．抗原がPateurella multocida抗原を含んで成る請求項１６のワクチン。 １８．少なくとも１種のPasteurella multocida抗原が、約２９キロダルトン の分子量および配列番号：２を含んで成るＮ´−末端アミノ酸配列を有する請求 項１７のワクチン。 １９．少なくとも１種のPasteurella multocida抗原が、約１１５、１０９、 ９６、８９、７９、６２、５６、５３、および４５キロダルトンの分子量を有す る抗原から成る群から選ばれる請求項１７のワクチン。 ２０．少なくとも１種のPasteurella multocida抗原が、約３４キロダルトン の分子量および配列番号：１を含んで成るＮ´−末端アミノ酸配列を有するPast eurella multocida抗原を含んで成るPasteurella multocidaによる感染予防用ワ クチン。 ２１．Pasteurellaceae抗原がActinobacillus pleuropneumoniae抗原を含んで 成る請求項１６のワクチン。 ２２．細菌のPasteurella、ActinobacillusおよびHaemophilus種により引き起 こされる感染に対し健康な動物を免疫化する方法であって、これらの種により引 き起こされる感染からの防御を提供する、宿主動物内での感染中および最小培地 処方物中でアップ−レギュレートすることのできる細菌のPasteurella、Actinob acillusおよびHaemophilus種の抗原を含んで成る効果的な量のワクチンを健康な 動物に投与して成ることを特徴とする前記方法。 ２３．Pasteurellaceae感染がPasteurella multocida感染を含んで成り、動物 にPasteurella multocida 抗原を含んで成る効果的な量のワクチンを投与する、請 求項２２の方法。 ２４．ワクチンの少なくとも１種のPasteurella multocida抗原が、約２９キ ロダルトンの分子量および配列番号：２を含んで成るＮ´−末端アミノ酸配列を 有する請求項２３の方法。 ２５．ワクチンの少なくとも１種のPasteurella multocida抗原が、約２９キ ロダルトンの分子量および配列番号：３を含んで成るＮ´−末端アミノ酸配列を 有する請求項２３の方法。 ２６．ワクチンの少なくとも１種のPasteurella multocida抗原が、約１１５ 、１０９、９６、８９、７９、６２、５６、５３、および４５キロダルトンの分 子量を有する抗原から成る群から選ばれる請求項２３の方法。 ２７．細菌のPasteurella multocidaにより引き起こされる感染に対し健康な 動物を免疫化する方法であって、ワクチンの少なくとも１種のPasteurella mult ocida 抗原が、約３４キロダルトンの分子量および配列番号：１を含んで成るＮ ´−末端アミノ酸配列を有する、Pasteurella multocidaの抗原を含んで成る効 果的な量のワクチンを健康な動物に投与して成る前記方法。 ２８．Pasteurellaceae感染がActinobacillus pleuropneumoniae感染を含んで 成り、動物にActinobacillus pleuropneumoniae抗原を含んで成る効果的な量の ワクチンを投与する、請求項２２の方法。 ２９．通常は細菌の宿主内での生育中にアップ−レギュレートされる抗原が発 現するように、最小培地処方物中でPasteurellaceae科由来の細菌種を生育する 方法。