JP2020511426A - タンパク質、及びPasteurellaタンパク質を含有する免疫化組成物、ならびに使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年2月10日に出願された米国特許仮出願第62/457,599号の利益を主張するものであり、本文献は本明細書において参照により援用されている。
Glisson et al.(Avian Diseases 37:1074−1079,1993)は、P.multocida株X−73(血清型1)及びP−1059(血清型3)から鉄制限培養条件下でバクテリンを調製することにより、血清型をまたがって交差防御が誘導されるようにすることを試み、低鉄培地中で産生されたバクテリンが、非相同的な抗原曝露に対し一貫して有意な防御を誘発しなかったことを、見出した。
タンパク質
一態様において、本開示には、タンパク質、及びタンパク質を具備する組成物が提供されている。本明細書中に用いられている「タンパク質」とは、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸のポリマーを指す。それゆえ、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及び酵素という用語は、タンパク質の定義範囲内に包含される。また、この用語には、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような、タンパク質に対する1つ以上の発現後修飾を含み得るタンパク質も包含される。タンパク質という用語は、アミノ酸のポリマーの特定の長さは含意しない。タンパク質は、天然の供給源から直接的に単離可能な場合もあれば、または組み換え技法、酵素技法もしくは化学的技法を利用して調製される場合もある。天然に存在するタンパク質の事例において、そのようなタンパク質は単離されるのがごく一般的である。
2つのタンパク質の構造的類似性は、それらの配列の長さに沿って同一アミノ酸の数を最適化するために2つのタンパク質の残基(例えば、本明細書に記載の候補タンパク質及び任意の適切な参照タンパク質)を整列させて、同一アミノ酸の数をそれらの配列の長さに沿って最適化することによって算定できる。同一アミノ酸の数を最適化する目的で整列を行う際に、いずれか一方または両方の配列におけるギャップが許容されるが、にもかかわらず、各配列中のアミノ酸はそれらの適切な順序を維持していなければならない。基準タンパク質は、適宜に、本明細書に記載のタンパク質、または任意の公知の金属調節タンパク質であり得る。基準タンパク質の例としては、限定されるものではないが、アミノ酸25〜968配列番号2、アミノ酸27〜790配列番号4、アミノ酸23〜727配列番号6、アミノ酸25〜964配列番号8、アミノ酸26〜848配列番号10、アミノ酸27〜784配列番号12、アミノ酸25〜742配列番号14、及びアミノ酸26〜805配列番号44が挙げられる。候補タンパク質とは、基準タンパク質と比較されるタンパク質である。候補タンパク質は、例えば、微生物から単離される場合もあれば、あるいは組み換え技法を使用して製造される場合もあれば、あるいは化学的または酵素的に合成される場合もある。
本明細書中に記載されているようなタンパク質はまた、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドという点で同定可能である。それゆえ、本開示は、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、あるいは標準的なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
組成物は、本明細書に記載の単離された1つのタンパク質、本明細書に記載の少なくとも2つの単離されたタンパク質、または2を超える整数(例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個もしくは少なくとも20個など)であるいくつかのタンパク質が含まれる場合がある。一実施形態において、本明細書に記載の1つのタンパク質を含む組成物は、配列番号44と同一であるか、または構造的類似性を有するタンパク質もしくはそのフラグメントを含む。特定のレベルの配列類似性及び/または同一性が本明細書に明示的に指示されていない限り(例えば、少なくとも80%の配列類似性、少なくとも90%の配列同一性など)、同定された配列ID番号のアミノ酸配列に言及した場合、本明細書中の「タンパク質配列類似性及びタンパク質配列同一性」の節に記載される配列類似性のレベル、及び/または配列同一性のレベルを有する変異体を含む。
(配列番号2、4、6、8、10、12、14及び44もしくはそれらのフラグメントと同一または構造的類似性を有するタンパク質)を発現する2以上の微生物集団であり、且つ2つ以上の母集団は、全体として考えると7つのタンパク質を発現する。これらの実施形態のいくつかにおいて、全細胞は、野生型P.multocidaのようなP.multocidaであり得る。いくつかの実施形態において、組成物には、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの株からの全細胞調製物が含まれる場合がある。
また、本開示には、本明細書に記載のタンパク質及び全細胞を得るための方法も提供されている。本明細書に記載のタンパク質及び全細胞調製物は、本明細書に記載のタンパク質のうちの1種以上の発現を促進する条件下で、P.multocidaのような微生物をインキュベートすることによって得ることができる。本明細書に記載のタンパク質及び全細胞調製物は、タンパク質のうちの1種以上を組み換え的に発現するように操作された微生物から単離可能であり得る。一実施形態では、血清型2、5または血清型3,4のP.multocidaが使用される。加えて、そのような微生物は、当該技術分野において公知の常法の技法により、容易に入手可能である。微生物は、感染した動物から野外分離株として誘導されてから、本明細書中に記載されるようなタンパク質及び/または全細胞調製物を得るため使用される場合もあれば、あるいは将来の使用に備えて、例えば、20%グリセロール含有の細菌学的培地、及び他の同様の培地中に入れて、−20℃〜−95℃または−40℃〜−50℃の凍結貯蔵庫内で貯蔵される場合もある。
また、本明細書に記載の組成物を使用する方法も、提供されている。本方法は、動物に対し有効量の本明細書中に記載されている組成物を投与することを含む。本明細書に記載の組成物の「有効量」とは、本明細書中に用いられている場合、レシピエントにおいて所望の反応を誘発できる量である。組成物は、母系抗体が存在し得る時点で、例えば、早ければ生後1日目に投与される場合もあれば、または動物の生涯の後期に投与される場合もある。一実施形態において、本組成物が動物に投与されるのは、動物の離乳前、または動物の離乳した時点(動物が母親の母乳以外の食物に慣れ始めた頃)である。動物は、例えば、魚類、鳥類(例えば、ニワトリまたはシチメンチョウを含む)、ウシ類(例えば、畜牛を含む)、ヤギ類(例えば、ヤギを含む)、ヒツジ類(例えば、ヒツジを含む)、ブタ類(例えば、ブタを含む)、バイソン類(例えば、バッファローを含む)、ウマ類(例えば、ウマを含む)、伴侶動物(例えば、イヌまたはネコを含む)、Cervidae科のメンバー(例えば、シカ、エルク、ムース、カリブー、トナカイを含む)、またはヒトであり得る。伴侶動物の例としては、イヌ及びネコが挙げられる。一実施形態において、動物はマウスである。一実施形態において、動物は飼い慣らされた動物である。
また、キットも提供されている。一実施形態において、キットは、本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を検出することを目的としたものである。検出された抗体は、グラム陰性微生物に起因する感染症を有することが疑われる動物から得ることが可能である。別の実施形態において、キットは本明細書に記載のタンパク質を検出することを目的としたものである。更に別の実施形態において、キットは、例えば、本明細書に記載のタンパク質を用いて、抗体を産生すること、病態を治療すること、または感染症を治療することを目的としたものである。
また、パッケージされた抗体またはタンパク質の使用指示書も、付属しているのが一般的である。本明細書中に用いられている「パッケージング材料」という語句は、本キットの内容物を収容するために用いられる1つ以上の物理的構造を指す。パッケージング材料は、概して、汚染物フリーの無菌環境が提供されるように常法で作製されている。パッケージング材料には、本明細書に記載のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を検出する目的に、または本明細書に記載のタンパク質を使用する目的に、タンパク質を使用可能であることを指示するラベルを付けることができる。加えて、パッケージング材料には、本キット中の材料の使用法を指示する指示書も収録されており、抗体の検出、または動物に対するタンパク質投与が可能になっている。本明細書中に用いられている「パッケージ」という用語は、タンパク質及び他の試薬(例えば、二次抗体)を一定範囲内に保持できる、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどのような容器を指す。それゆえ、例えば、パッケージを、マイクログラム量のタンパク質が付着されたマイクロタイタープレートウェルとしてもよい。また、パッケージに、二次抗体も収録されている場合もある。「使用指示書」には通常、試薬濃度、または混合される試薬とサンプルの相対量、試薬/サンプル混合物の維持期間、温度、緩衝液条件などのような少なくとも1つのアッセイ方法パラメータを記述した、実体的な表現が含まれる。
型株の選択及び調製
Pasteurella multocida株X−73、P−1059及びP−1662は、それぞれ血清型A:1、A:3及びA:4に対する基準株である。また、血清型1、3、及び4は、それぞれ血清型1、3、及び4とも呼ばれる。これらの菌株をそれぞれ凍結乾燥培養物として、USDA National Veterinary Services Laboratory(NVSL)(Ames,IA)から入手した。培養液を滅菌食塩水中に再懸濁させ、単離用に、滅菌接種用ループを用いてトリプチカーゼ大豆寒天(TSA)+5%ヒツジ血液(Becton Dickenson,Sparks MD)上に画線し、37℃で一晩インキュベートした。無菌接種ループを用いて、プレートからいくつかの単離したコロニーを選び取り、凍結保存の目的で、ポリスチレンビーズ含有のクライオバンクチューブ(Copan diagnostics,Murrietta CA)に移した。その後、クライオバンクチューブを−60℃未満で貯蔵した。
Pasteurella multocida分離株の調製
Pasteurella multocidaの血清型3×4は当初に、パスツレラ症の臨床徴候を示した自然界条件下にて、44週齢のシチメンチョウ繁殖鶏の肝臓及び肺から単離されたものであった。分離株をトリプシン大豆寒天培地(TSA)+5%ヒツジ血液上に播種した。この生体を、初回分離後に、非動物由来のトリプチケースソイブロス(naTSB)(EM Science,Darmstatd,Germany)(18μg/mlの2,2’−ジピリジル(DP)(Sigma Aldrich,St.Lois,MO)及び酵母エキス6g/1(Becton Dicokenson,Sparks,MD)を補充したもの)に5回通した。概略説明すると、コロニーを採取し、500mlのnaTSB中に接種し、毎分105回転(RPM)に設定された卓上振盪機上で、培養物を37℃にて16時間25分間インキュベートした。翌朝、25mlの一晩培養物を500mlの新鮮なnaTSBに移し、同じ温度にて撹拌しながら8時間インキュベートした。5mlの培養物を500mlの新鮮なnaTSBに移し、上記と同じ条件下で15時間インキュベートした。この培養液50mlを500mlの新鮮なnaTSBに移し、同じ方法で4時間かけてインキュベートした。naTSB900mlをそれぞれ含有する4本のボトルに、それぞれ先行の培地を100mlずつ接種し、3時間45分かけてインキュベートした。培養物4リットルを無菌的に500mlのNalgeneジャーに分注し、BeckmanモデルJ2−21遠心分離機(Beckman Coulter,Brea CA)で3500rpmまたは約1350×gにて20分間遠心分離させて、細菌細胞をペレット化した。上清を吸引により無菌的に除去し、凍結保存剤として20%グリセロールを含有する総量500mlのnaTSB中に、細胞ペレットを再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液をバイアル243本に、1バイアル当たり2mlずつ分注して、−60℃未満で凍結させた。この冷凍マスターシードは、MS061130と命名された。
金属調節タンパク質の製造
Pasteurella multocida型株(X−73、P−1059、及びP−1662)及び実施例2のワクチン候補株(MS061130)を、差次的な膜タンパク質発現を呈するように、鉄制限条件及び鉄充足条件で成長させた。
SDS−PAGEによる金属調節タンパク質パターンカバレッジに対する試験、及びタンパク質結合の分析
鉄制限下で成長させた各単離物由来の細胞抽出物を、4%濃縮用ゲル及び10%分離用ゲルを用いて、SDS−PAGEゲル上でサイズ分画させた。4分間煮沸した30μlのSDS還元サンプル緩衝液(62.5mM Tris−HCl(pH6.8)、20%グリセロール、2%SDS、5%β−メルカプトエタノール)とサンプル30μgとを混合することによって、電気泳動用サンプルを調製した。標準的な方法に従い、各抽出物のサンプルを10%SDS−PAGEゲル上で分離させ、クマシーブルー染色により明視化した(図1)。ワクチン候補株(MS061130)を、SDS−PAGEゲル上の型株と比較した。66〜116kDaの間の領域における、バンディングパターンに特に注目した。ワクチン候補株は、図1に示すような、型株と重複するバンドを実証しており、更なる防御研究のための有力候補であると考えられた。
金属調節タンパク質の製造
抗原A及び抗原Bと命名された、Pasteurella multocidaの単一のMaster Seed MS061130株を用いて、2つの別々の抗原組成物を生産規模にて調製した。この調製を実施することにより、製造プロセスの一貫性を評価した。
実施例2の作業用種子の極低温バイアルを30〜35℃で10〜15分間解凍し、解凍した細胞懸濁液0.1mlを37℃のmTPB250mlに添加した。70rpmに設定された卓上振盪機上で、培養物を37℃にて6.5時間インキュベートした。インキュベーション後に、培養物25mlを300mlのmTPBと18μg/mlのDPに移して鉄を制限した。この第2の培養物を、70rpmで振盪させながら37℃で約2時間インキュベートした。培養物250mlを上記の培地3リットル中に移し、(540nmにて測定された)ODが1に達するまで70rpmで振盪させながら37℃で約3時間インキュベートした。全培養物を使用して、70リットルのmTPB+18μg/mlのDP及び0.5ml/消泡剤1個(MAZU DF 204 Chem/Serv,Minneapolis,MN)を充填した130リットルの発酵槽(Bio−Service,Easton,PA)に接種した。発酵のパラメータは以下の通り:自動撹拌制御及び気流スパージを、毎分60リットル(LPM)及び1平方インチ当たり5ポンド(PSI)の背圧に設定することによって、溶存酸素(DO)を20%(目標15〜30%)に維持した。溶存酸素を20%に制御することにより自動的に制御し、培養物を撹拌しながらインキュベートした。50%水酸化ナトリウムまたは10%塩酸を自動滴定することにより、pHを6.9〜7.1の間に自動的に制御した。温度を37℃に維持した。Beckman DU600分光光度計(Beckman Instruments,Fullerton,CA)で測定して540nmにて光学濃度が4.21に達するまで、このようにして培養物を約5時間成長させた。増殖培養物全体を、上記のように989lのmTPB+DP及び消泡剤を充填した1200リットルの発酵容器(New Brunswick Scientific,Edison,NJ)に移した。発酵条件は以下の通り:気流を300LPMに設定し、背圧を5PSIに設定した。まず撹拌を100RPMに設定し、次いで20%溶存酸素設定値(15〜30%の範囲)により制御した。培養物を更に5時間成長させる。遂には、1:100希釈で1.5時間かけて成長をプラトーに到達させることにより、光学密度測定により540nmにて約2.5と測定され、成長が安定となる。培養pHを8.7に調節し、温度を23℃に調節することによって、採取まで成長を中断させた。
接線流濾過によって、細菌細胞を収集した。2つの30ft2 Alpha 300−Kオープンチャンネルフィルター(カタログ番号AS300C5)装備のPall Filtron Tangential Flow Maxisette−25(Pall Filtron Corporation,Northboro,MA)、カタログ番号AS300C5(Pall Filtron)を、約44Hzに設定されたWaukesha Model U−60フィードポンプ(Wakesha Chemy−Burrell,Delevan,Wis.)に接続し、これを使用して、細菌発酵物を濃縮し、洗浄した。元の培養液量1078リットルを、フィルター入口圧力30psi及び残留物圧力12〜14psiを用い、プロセスタンク(Lee Industries,モデル2000LBDT)に注入して、約100リットルに減少させた。保持液(100リットル)を、7.26グラム/リットルのトリス塩基と0.93グラム/リットルのEDTAとを含有する無菌の浸透圧衝撃緩衝液(OMS)を用いて200リットルに調整し、pHを8.5に調整した。OMS中のEDTAは、細胞壁からLPSを除去するのに役立つ一方、pHを上昇させることで、凍結及び破砕後のタンパク質分解の多くを防止する。pHを上昇させる代わりに、またはそれに加えて、プロテアーゼ阻害剤を使用してもよい。保持液を濃縮して約65リットルに戻し、系を20リットルのOMSでフラッシュした。ボトムマウント磁気駆動ミキサーを使用して、200リットルタンク中で、保持液を完全に混合した。
凍結細菌細胞スラリーのOMS混液65リットル(ペレット塊3.7kg)を、4℃で解凍した。各容器からの液体培養懸濁液を、150リットルのジャケット付きプロセスタンク(Lee,Model Style U)の蒸気中に無菌的に吸引した。細胞懸濁液をホモジナイズして破砕した。概略説明すると、細菌懸濁液を含有する150リットルタンクを、AvestinモデルEF−C500Bホモジナイザー(Avestin,Inc.Ottawa,ON,Canada)に接続した。トップマウントミキサー(Eastern、Model TME−1/2、EMI Incorporated、Clinton、CT)装備の250リットルジャケット付きプロセスタンク(空)(Lee、モデル259LU)をホモジナイザーに接続し、プロセスタンク内の流体を、ホモジナイザーに通して空のタンク内に元通りに収容する。これにより、この流体を複数回にわたってホモジナイザーを通しながら、依然として閉鎖系を維持することが可能となる。均質化中の温度を4℃に維持した。通過開始時に、流体をホモジナイザー(500ガロン/時)に通し、Waukeshaモデル10DOポンプ(Waukesha)を介して60psiにて循環させ、元のタンクに戻した一方、ホモジナイザーの圧力を15,000psiに調整した。均質化に先立って、均質化前のサンプル2つをホモジナイザーから取り出し、破砕度を特定してpHモニター用にベースラインを確立した。破砕度を透過率(540nmにて1:100希釈時の%T)によりモニターし、均質化されていないサンプルと比較した。1:100希釈では、開始時の%Tが86.65であった。細胞スラリーをホモジナイザーに1回通した。結果として得られた%Tは、1:100希釈で89.9であった。
可溶化プロセス流体内の凝集した金属調節タンパク質を、T−1 SHARPLES(Alfa Laval Separations,Warminster,PA)を用い、遠心分離によって収集した。概略説明すると、可溶化ホモジネートのタンクを、11psiにて供給速度170ml/分で12台のSharplesに給送した。Sharplesのボウルに収集された、大型の細胞残屑と細胞壁材料とから成る、初回通過タンパク質を破棄した。流出液を閉鎖滅菌ループに通し、第2の250リットルジャケット付きプロセスタンク内に収集することによって、この流出液を遠心分離機に複数回通しながら、閉鎖系を維持することが可能になる。遠心分離中の温度を4℃に維持した。可溶化ホモジネートを、給送速度150ml/分及び圧力21PSIにて、更に7回遠心分離機に通し、通過させるたびにタンパク質を収集した。タンパク質を回収して再懸濁させ、トリス緩衝液(pH8.5)7.46リットル中に分取した。ホルムアルデヒド25ml(Sigma)を防腐剤として加え、0.3%濃度に到達させた。
タンパク質懸濁液を4℃での透析濾過により洗浄し、タンパク質に結合された可能性のあるあらゆる混入サルコシンを取り除いた。概略説明すると、タンパク質8640mlを、回転するボトムマウントDaytonミキサーモデル2Z846(Dayton Electric,Chicago,Ill.)を備えた無菌トリス緩衝液(pH8.5)50リットル含有の200リットルプロセスタンク内に無菌的に125回転/分にて吸引した。Waukesha Model U30フィードポンプに接続された25平方フィートのスクリーンチャンネルシリーズAlpha 10K Centrasetteフィルター(Pall Filtron)装備のMILLIPORE PELLICON TANGENTIAL FLOW FILTERアセンブリ(Millipore Corporation)に対し、プロセスタンクを無菌的に接続した。タンパク質溶液59リットルにTBWを添加して150リットルにし、35リットルに濃縮させて、110リットル容量のTBWとした後、最終抗原容量を10.4リットルに濃縮した。タンパク質濃縮物を、4リットルの滅菌NALGENE容器に無菌的に分取(3.5リットル)し、貯蔵用に−20℃の冷凍庫に入れた。
Pasteurella multocidaから得られた免疫化組成物の調製
同じ抗原からなる3つのワクチン系列を、実施例5のマスターシードMS061130から調製した。注記:2つの別々の発酵プロセスを表す2つの抗原調製物を用いて、抗原A及び抗原Bと命名された2つの抗原ロットを調製した。こうして、抗原Aと抗原Bの混合物を用いて第1のワクチン系列を調製し、抗原Aのみを用いて第2のワクチン系列を調製し、抗原Bのみを用いて第3のワクチン系列を調製した。
ニワトリのワクチン接種
レグホン型特異的病原体フリー(SPF)ニワトリ(Hy−Vac,Adel,IA)に実施例6の組成物をワクチン接種した。概略説明すると、11週齢の(WOA)特定病原体フリー(SPF)レグホンニワトリ74羽を入手し、1週間順応させた後で、ワクチン接種した。トリを抗原A+B(トリ21羽)、抗原A(トリ21羽)、抗原B(トリ21羽)、と称される3つの群及び非ワクチン接種対照群(トリ11羽)に分類した。トリは色付きの脚バンドで識別されていた。抗原A+B群、抗原A群、及び抗原B群における、12週齢の全てのトリの胸部に、適切なワクチンを0.25ml筋肉内接種した。ニワトリ11羽の群は、ワクチン非投与とし、対照群としての役目を果たした。15週齢の時点で、または第2のワクチン接種後21日目に、ワクチン接種を受けた全てのトリを対象として、第2のワクチン接種を施した。
抗原曝露生物の調製及び投与
抗原曝露の1日前に、実施例1のPasteurella multocidaのX−73株の極低温ビーズ1つを凍結ストックから無菌的に取り出し、5%のヒツジ血液を含有する2つのTSA IIプレート(Becton Dickenson)に広げた。次いで、これをコロニー分離用に画線した。プレートを37℃にて16〜19時間インキュベートした。第2のワクチン接種後14日目または14日を経た時点で、ヒツジ血液寒天プレートからのいくつかのコロニーを血液プレートから掻き取り、滅菌13×100試験管中に懸濁させた。コロニーを添加するか、または懸濁液をトリプトースブロスで希釈し、Spectronics 20D(ThermoFisher)分光光度計を使用して、630nmにおける透過率(%T)として71〜75%が得られた。懸濁液をトリプトースブロス中で1:100,000の希釈率になるまで連続希釈した。この希釈物を抗原曝露用に血清バイアルに分取した。
抗原曝露の結果
図2に示されている結果は、3回連続して実施された3通りの個別の抗原曝露研究の平均値である。抑制率(PF)という用語は、リスク比(RR)の補数であり、保護因子の予防的役割、または実施された介入プログラムの予防的奏功を示す表現として、疫学者に使用されてきて久しい(Miettinen,1974,Am J Epidemiol 99:325−332)(Field Epidemiology,Oxford University Press,2002,ppl47−7)。抑制率PF=1−p2/p1(式中、p2=ワクチン接種群における罹患率、及びp1=非ワクチン接種群またはプラセボ群における罹患率)。獣医用コレラワクチンは、PF53%以上、好ましくは62.5%以上を日常的に実証するものであると予期されている。ワクチンのPFが53%未満の場合、防御能を有することが実証されている。
公知のゲノム分析
現在公知のゲノムを対象に、有望な金属調節タンパク質に関する調査が実施された。Pasteurella multocidaのいくつかの株は、パブリックドメイン内で利用可能な完全または部分的ゲノム配列を有する。タンパク質配列及び注釈データのための包括的なリソースが、Universal Protein Resource(Uniprot)である。このデータベース内には、検索の時点で、血清型1の基準株X−73及び血清型3の基準株P−1059の全配列データまたは部分配列データが存在していた。これらの生物の各々について、分子量が50キロダルトン〜150キロダルトンの間で、鉄摂取に関する注釈リファレンスが付された全てのタンパク質を対象として、データベース検索を行った。同定されたタンパク質を、系統立てて表の形に編成した(図3)。表中、類似性が95%以上の異種株どうしが、一体的にグループ化されている。これらの株の間では、14通りの別個のタンパク質が同定された。
Pasteurella multocidaの野生株と型株における鉄制限タンパク質のバンディングパターンの比較
Pasteurella中の金属調節タンパク質に関してもっと徹底的な理解が得られるように、Pasteurella multocidaの33種の型株及び臨床野外株を鉄制限培地中で成長させ、実施例3の方法で膜結合タンパク質を処理し、精製した。結果として得られたタンパク質組成物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)ゲル上で、金属調節タンパク質のバンディングパターンについて分析した(Criterion TGX Stain−free gels,Bio−Rad laboratories,Hercules,CA)。個々のレーンを比較し、1次元ゲル分析プログラムであるPhoretix 1D(TotalLab,Newcastle upon Tyne,UK)を使用してグループ分けした。図5に例証するような、バンディングパターンの類似性を示す樹状図を、Phoretix 1Dソフトウェアで作成した。型株及び臨床野外分離株の分析によって、発現された金属調節タンパク質の2つの主要パターン、角括弧[]でマークされた4バンドパターン、及び中括弧{}で示された3バンドパターンが明らかにされた。他の株は、これらの2つのパターンにバリエーションがあり、1つまたは2つのタンパク質バンドが欠落しているように見える。
MALDI−TOFによるタンパク質の分析
図5で観察された様々なバンドパターンの代表として、実施例11から、分離株13個を選択した。これら実施例11の分離株13個からの、75,000〜115,000の分子量範囲の各タンパク質バンドを、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間スペクトロメトリー(MALDI−TOF MS)及びペプチドマスフィンガープリンティングを用い、タンパク質同定分析用に、SDS−PAGEゲルから切り出した。ペプチド質量を、ゲノムの公知のタンパク質配列が収録されているデータベース(この場合、Uniprot)と比較した。この比較は、コンピュータプログラムを使用して生物の既知のゲノムをタンパク質に変換し、次いで理論的にタンパク質をペプチドに切断し、各タンパク質からペプチドの絶対質量を計算することによって達成された。続いて、未知のタンパク質のペプチドの質量と、ゲノム内にコードされた各タンパク質の理論上のペプチド質量との比較を行う。結果を統計的に分析し、ベストマッチを見つけた。図6では、これらのタンパク質の同一性を、93%超の類似性でグループ化し、その結果を表に示してある。分離株13個からの合計38のバンドを分析し、7つのタンパク質のうちの1つであると同定した。図6には、それらのタンパク質の分子量が示されている。2つの分離株(図6に楕円で指し示めされている1121及び1135)を併用して、7通りの全てのタンパク質バンドを発現させた。これら2つの株は共に、図6では、残りの分離株11個の全てのタンパク質を発現し、また、図5では、同定された2つの主要バンディングパターンの代表であったことから、新規な混合ワクチン用に選択された。
Pasteurella培養種子の調製
実施例12及び図6からのPasteurella multocida株1121及び1135のマスターシードストックを調製した。株1121は血清型3×4として同定され、株1135は血清型2×5として同定された。これらの分離株は、トリパスツレラ症で死亡したシチメンチョウから単離されたものである。典型的には、肝臓及び肺の標本を綿棒で集めて、結果として得られたスワブを5%ヒツジ血液寒天プレートに画線し、37℃にて24時間インキュベートした。6g/lの酵母抽出物及び12ug/mlのDPを含有するpBHI中に分離株を接種することによって、マスターシードを調製した。次いで、培養物を18μg/mlのDP含有の上記培地に連続的に移し、更に5回通過させて、有機体を鉄制限環境に適応させ、目的タンパク質の成長及び発現を最大限に高めた。培養物を7,000rpm(Beckman Coultier,Brea,CA)で30分間遠心分離によって濃縮し、20%グリセロール(凍結防止剤として)を含有し但しDP不含の新鮮なpBHI中に再懸濁させた。結果として得られたマスターシードを、3mlのクライオバイアル中に2.2ml容量ずつ等分し、−60℃以下で貯蔵した。分離株に、識別番号PM1121、20140911及びPM1135、20140925を付与し、それぞれマスター種子MS1121及びMS1135として確立させた。その後、マスター種子を、金属規制タンパク質の生産に用いられる作業用種子に展開した。
金属調節タンパク質の製造
制御された発酵条件下でPasteurella multocidaを成長させることで、外膜と会合したタンパク質をはじめとするタンパク質を発現させることが可能である。その後、細菌を採取することにより、タンパク質を単離し、精製して、組成物中の免疫原として使用できる。
実施例13の1135株の作業用種子の極低温バイアル(109CFU/mlにて1ml)を使用して、酵母抽出物6g/1(BD)含有の37℃改良ブタ脳心臓注入培地(pBHI)300ml(BD Difco)に接種した。培養物を30〜400rpmで5時間振盪しながら35〜38℃でインキュベートし、その時点で22ug/mlのDP含有の修飾pBHI1500mlに移して、利用可能な鉄を制限する。培養物を、光学濃度が0.6以上に達するまで、37℃で2時間38分間インキュベートした。全培養物を、18リットルフラスコ中の修飾pBHI15リットル+22ug/mlのDPに移した。この培養物を約2時間30分インキュベートし、540nmで0.75の光学密度に達した。次いで、培養物を、鉄制限を維持するためDP22μgを有する修飾pBHI270リットルと、炭素源として1リットル当たり40mlの50%グルコース溶液とを含有する300リットルの発酵槽に移した。培養物を撹拌しながら35〜38℃でインキュベートし、溶存酸素含有率を30%以上に維持することにより制御した。培養物を、Beckmanシリーズ600分光光度計で測定して、光学密度約5.4まで成長させた。発酵の終了時に、培養物のpHを8.5以上に調整し、温度を15℃以下に調整した。
2つの30ft 2 Alpha 300−Kオープンチャンネルフィルター(カタログ番号AS300C5)装備のPall Filtron Tangential Flow Maxisette−25(Pall Filtron)を、約44Hzに設定されたWaukesha Model U−60フィードポンプ(Waukesha Chemy−Burrell,Delevan,Wis.)に接続し、接線流濾過により、全細胞細菌懸濁液を約1/10の体積に濃縮した。培養物をトリス緩衝食塩水で更に洗浄し、次いで全細胞懸濁液約45リットルに濃縮した。細胞懸濁液の副サンプルを乾燥させ、秤量して最終的な乾燥ペレット重量を得た。次いで、最終的な全細胞懸濁液を−20℃で凍結した。
全細胞懸濁液を5〜7℃で3日間解凍した。全細胞の個々の容器をプールし、40%に設定したミキサー付き滅菌タンク中で混合した。液体細胞懸濁液を均質化により破砕した。概略説明すると、懸濁した全細胞を、15,000〜18,000ポンド/平方インチ(PSI)の圧力で、Avestinホモジナイザー、モデルEmulsiflix C500B(Avestin,Inc.,Ottawa,Canada)に2回通し、遂には、Beckmanシリーズ600分光光度計(Beckman Instruments,Brea,CA)で、ホモジネートの1:100希釈率を80%透明度(540nmにおける%T)に到達させた。第2のプロセスタンクをホモジナイザーに接続し、閉鎖系を維持しながら、流体をホモジナイザーに複数回通して往復させてもよい。ラウロイルサルコシン酸ナトリウム(Hamposyl L−30,Chattem Chemicals,Chattanooga,TN)を、破砕した細胞ホモジネートに3%容量/容量で加えて、細胞膜及び非膜タンパク質を可溶化した。2〜7℃にて約72時間可溶化を続行した。11PSIに設定されたSharples T1連続遠心分離機を用いた遠心分離により、細胞残屑を取り除いた。
タンパク質懸濁液を、連続洗浄接線流濾過により、0.2%ホルマリン含有のトリス緩衝水(TBW)(pH7.4)800リットルで洗浄した(Maxisette 300kDa filter,Pall corp,NY,NY)。タンパク質を、ホルマリンと10%エタノールとを含有する100リットルのTBWで更に洗浄した。エタノール洗浄後、タンパク質懸濁液を200リットルのTBW+ホルマリン(0.2%)で更に洗浄して、エタノールを除去した。残存TBWを系から洗い流したとき、最終抗原容量が約20リットルになるまで、連続濾過によって容量を減少させた。次いで、最終抗原ロット1135−A0001を、33℃にて93時間連続混合しながら、0.2%ホルマリンで不活性化した。
ワクチンの調製
実施例14で調製された抗原を使用し、50%鉱油をアジュバントとして用い、実施例6に記載のTween/Spanを乳化剤として用いた、2つの20リットル水中油型ワクチンを調製した。
ワクチン接種及び抗原曝露モデル
実施例15で調製したワクチンを、ワクチン接種抗原曝露モデルにおいて、SPFニワトリの1型抗原曝露に対し使用した。概略説明すると、雄と雌の両方のSPFレグホンニワトリ60匹を、Valo BioMedia(Adel,IA)から入手した。ニワトリを雄雌別に分類し、メンドリとオンドリとからなり、それぞれ雌及び雄の数が等しい、トリ20羽ずつの3つの群に分けた。トリの翼帯に番号付けして識別する一方、各トリの左右の羽に同じ番号を付けて同一性を保持した。一方の群には、実施例14の200μgワクチンを0.25ml接種した。第2の群には、実施例14の100μgワクチンを0.25ml接種した。第3の群には、抗原の代わりにリン酸緩衝食塩水(PBS)中に油性アジュバントを含有するプラセボを、ワクチン接種した。12週齢及び15週齢の全てのトリの首の背後にワクチンを皮下接種し、実施例8の方法で調製された約6,000cfuの血清型1抗原曝露株X−73を、17週齢の全てのトリの乳房筋肉内に抗原曝露した。図7に、試験結果を示す。100μg及び200μgワクチン接種群に対し、それぞれ抑制率69%及び75%、ならびにp値0.001及び0.0004以下で、防御レベルが大幅に改善されることは明らかである。これらの結果から明らかに分かるように、ニワトリワクチン接種及び抗原曝露モデルにおいて、図6の7つ全てのタンパク質を発現する2つの抗原の組み合わせが、非相同抗原曝露に対して抑制率の増加に寄与する。
亜鉛及び呼吸器病原体
我々の以前の研究(データ不図示)において、我々はグラム陰性病原体の多くが、亜鉛制限下で新規なタンパク質を発現することを明らかにした。これらの細菌の多くは呼吸器病原体である。これらの病原体のいくつかとしては、Moraxella catarrhalis、Haemophilus parasuis、Mannheimia haemolytica、Acinetobacter baumannii、Pasteurella multocida、Bordetella pertussis、及びActinobacillus pleuropneumoniaが挙げられる(Stork et al.PLoS Pathogens,6(7),el 000969 2010)。これまでレポートされてきたように、この亜鉛獲得タンパク質は、細胞外壁に位置するZnuDとして現在同定されている膜貫通βバレルタンパク質であり、このZnuDは、2つのシステインを含む単一表面露出ループを利用し、ジスルフィド結合によって一体化されたとき、亜鉛イオンと相互作用し得るヒスチジンのクラスターを形成する(Stork et al.,PLoS Pathogens,6(7),el000969.2010)。それゆえ、ZnuDは、宿主生物によって隔離された亜鉛の獲得に用いられるスカベンジャータンパク質として作用する。
Pasteurella multocida P−1059のゲノム配列決定
本研究に用いられたPasteurella multocidaの分離株は、実施例1の基準株P−1059であった。Invitrogen by Life Technologies ChargeSwitch gDNA Mini Bacteria Kitを使用して、Pasteurella multocida分離株からゲノムDNAを単離した(Life Technologies,Carlsbad,CA,製品番号:CS11301)。ゲノムDNAの抽出に先立って、分離株の新鮮培養物を、5%ヒツジ血液含有トリプチケース・ソイ寒天培地II(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,製品コード:221261)中、37℃にて一晩成長させた。メーカーのプロトコールに従って手順を行った。最終収量33.7μgのゲノムDNAを、配列決定が為されるまで−20℃で貯蔵した。このゲノムDNAを、配列決定用にACGT,Inc.に送付した(Wheeling,IL)。Genbank基準配列CP004752及びCP004753を、分離株の全ゲノム配列のアセンブリに使用した。
想定し得る標的遺伝子
分離株の完全なゲノム配列を受け取った後、National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベースを用い、tBlastnアライメントを行い、ZnuDに対する相同性に基づいて目的の遺伝子を同定した(GenBank AAF62323.1)。tblastnアラインメントで見つかった相同遺伝子によって翻訳されたタンパク質を、blastx検索を用いて同定した。同定されたZnuDホモログ及びZnuD亜鉛親和性領域を対象に、EMBOSS Matcherを使用して対配列アラインメントを行った(Rice et al.,Trends in genetics,16(6)、pp276−277.2000)。
亜鉛獲得タンパク質の発現
Pasteurella multocidaの亜鉛獲得タンパク質を同定することを目的に、我々は、自身の実験室において以前に同定されたMannheimia haemolyticaの亜鉛獲得タンパク質の配列を用いた。概略説明すると、TPEN(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.,Portland,OR,Product code:T1487)を用いた細菌細胞成長に使用されたBacto Brain Heart Infusion,ブタ培養培地(BHI)(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,製品コード:256110)を補充することによって、標的タンパク質の発現を評価した。細菌成長中に、0〜100μMの範囲にわたってTPENの滴定を用いた。種々の濃度のTPENを含有するBHI培地中に、TPEN不含のBHI中の分離株のスターターカルチャーを接種した。この接種量は、最終培養物の全容量の1%であった。細菌が特定の濃度で成長できない場合を除き、激しく撹拌しながら、培養物を、OD540が1.0になるまで37℃で成長させた。
タンパク質の同定
外膜調製物からのバンディングプロファイルを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量スペクトロメトリー(MALDI)により分析し、目的のバンドのいずれかが、BLAST相同性により同定された遺伝子と一致するかどうかを判別した。メスを使用してバンドをゲルから切り出し、分析用にMayo Clinic Proteomics Core施設に送付した。
構造モデリング
Swiss Modelを用い、相同性シーケンシングに基づいて、Mannheimia haemolyticaの亜鉛獲得タンパク質の3D構造モデルを作成した(Arnold et al.Bioinformatics,(22)、pp195−201.2006).)。タンパク質モデルを作成する際に用いられたPDBテンプレートは、4epaAであった。細胞外ループ(ECL)配列位置を、Swiss Modelから入手された3D構造モデルを使用して同定した(Arnold et al.Bioinformatics,(22),pp195−201.2006).),Prediction of TransMembrane Beta−Barrel Proteins(Bagos et al.BMC Bioinformatics,5(29).2004).),Orientations of Proteins in Membranes (OMP) database and Positioning of Proteins inMembranes(PPM)server(Lomize et al.,Nucleic Acids Res,40(Database issue):D370−6.2012)。
ターゲット遺伝子の同定
いったん同定されたバンディングプロファイル内のタンパク質を、BLAST相同性により同定された目的タンパク質と比較した。バンディングプロファイル内の1つのタンパク質は、BLAST相同性により同定されたタンパク質と一致した。このタンパク質は、OMRファミリー外膜鉄受容体(GenBank:EDN73812.1)として同定された。この受容体は、本論文中では亜鉛獲得タンパク質とも呼ばれている。標的遺伝子は、ゲノム内のヌクレオチド1,160,319...1,162,691に位置していた。シグナルペプチドを、SignalP 4.1を用いて同定した(Petersen et al.,Nature methods,8(10),pp785−786.2011))。Pasteurella multocidaにおいて同定された亜鉛獲得タンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、図22に示す。
呼吸器病原体全体にわたる亜鉛獲得タンパク質の相同性
Mannheimia haemolyticaの獲得タンパク質の配列(データ不図示)を用いて、呼吸器病原体全体にわたる亜鉛獲得タンパク質の相同性、特に亜鉛親和性領域を、NCBIによって確立されたタンパク質ブラストサーチツールを用いて判別した。10通りの異なる種の細菌に、同一性が49%超である亜鉛獲得タンパク質ホモログが含有されていることが見出された。同定された種はいずれも、呼吸器系病原体である。Clustal Omegaを使用して、相同タンパク質をZAPの亜鉛親和性領域に整合させると、著しく類似したアミノ酸モチーフ同士が強調される。全ての同族体には、2つのシステイン、ならびに複数のヒスチジン及びアスパラギン酸が含有される。図25では、アミノ酸モチーフが、GLAM2を用いて強調されている。システイン、ヒスチジン、及びアスパラギン酸の空間配置は、相同体全体にわたって一定のまま維持されている。
亜鉛獲得タンパク質の発現及び識別
クローニング
Pasteurella multocida亜鉛遺伝子を、P−1059株のゲノムDNAからPCR増幅し、ギブソンアセンブリ法を用いてプラスミドベクターpQE−T7−2(Qiagen;Hilden,Germany)に挿入した。次いで、アセンブルされたプラスミドを、クローン選択及び発現用に、NEB T7 Express Competent E.coliに形質転換した(New England Biolabs;Ipswitch,MA;カタログ番号C2566H)。
50μg/mLのカナマイシンを含有するLBブロスのスターターカルチャーに、組み換えプラスミド含有のクローンを接種した。培養物を、OD540が0.6になるまで増殖させ、次いで新鮮なLBブロスに移した。新しい培養物を、OD540が0.6になるまで再び増殖させた。次いで、発現を1mM IPTGで誘導させ、更に16時間インキュベートした。細胞を遠心分離により収集し、処理を施すまで−80℃で貯蔵した。
細胞を解凍し、BugBuster Protein Extraction Reagent(Merck Millipore;Billerica,MA;カタログ番号70584−4)中に再懸濁させた。リゾナーゼバイオプロセシング試薬10μL(Merck Millipore;Billerica,MA;カタログ番号71230)を加えて、懸濁液を周囲温度で1時間インキュベートした。次いで、マイクロチップを用い、出力6、90%デューティサイクルにて、懸濁液を30秒間超音波処理した(Branson Sonifier,モデル102c;Branson Ultrasonics,Danbury,CT)。溶解物を16000×gで20分間遠心分離し、不溶性物質を収集した。ペレットを、3回(第一にBugBusterで、第二に1/10×BugBusterで、第三にトリス緩衝水で)洗浄した。8M尿素と1mMジチオトレイトールとを含有するpH8.0のトリス緩衝食塩水中に、封入体プレップを可溶化させて、組み換えタンパク質10mgを得た。図24は、300Vで10%Criterion Stain Free−TGXゲル(Bio−Rad,Hercules,CA)上で泳動させた亜鉛獲得タンパク質の様々な発現段階を示す。この泳動には、未誘導全細胞調製物、誘導全細胞調製物、溶解細胞上清、1×BugBuster洗浄液、1/10×BugBuster洗浄液、可溶化封入体及び可溶化後のペレットを含めた。
ニワトリ敗血症モデルにおけるPasteurella multocidaの新規組み換え亜鉛タンパク質のワクチン媒介防御
以下の実験的研究の目的は、ニワトリ敗血症モデルにおけるPasteurella multocidaの有毒な抗原曝露に対する組み換え亜鉛タンパク質(rZinc)の防御効力を評価することにあった。実施例14で非ワクチン接種対照と比較されたPasteurella multocidaのSRP抽出組成物の有効性を、実施例25のrZincタンパク質の有効性と比較した。概略説明すると、SPFレグホンニワトリ(雄)30匹を、Valo BioMedia(Adel,IA)から入手した。ニワトリをそれぞれ、トリ10羽ずつの3つのグループに分けた。トリは色付きの脚バンドで識別されていた。処置群を、A群(プラセボ)、B群(rZinc)及びC群(Pasteurella multocidaタンパク質抽出物)と命名した。この実験においてワクチンの有効性を評価する目的に使用された結果パラメータは、非ワクチン接種のプラセボ群と比較対照された、ワクチン接種群間の総死亡率であった。全てのニワトリに、食物及び水を自由に与えた。
免疫組成物の調製
8.0g/lのNaCl、0.2g/lのKCl、1.44g/lのNa2HPO4及び0.24g/lのKH2PO4(pH7.4)を含有するリン酸緩衝食塩水(PBS)中で抗原を希釈することにより、実施例14及び25のタンパク質組成物からワクチン(SRP抽出物及びrZinc)を調製した。以下の成分:44.44%水性タンパク質懸濁液を0.1%正規化食塩水中に溶かしたもの、50%Drakeol 6鉱油(VOPAK USA,Inc,Kirkland,WA)、3.0%Span85及び2.56%Tween(Ruger Chemicals,Hellside,NJ)を乳化することにより、各ワクチンを調製した。ワクチン組成物(亜鉛及びSRP抽出物)毎の最終的なトリの1回分用量は250μg及び400μgであった。この用量は、それぞれ0.5ml及び0.25ml容量で投与された。抗原を生理食塩水で置換し、上記製剤0.5ml用量で用いて懸濁液を乳化することにより、プラセボを調製した。14週齢及び17週齢(21日間隔)の全てのトリに、皮下接種した。
抗原曝露及び結果
実施例8に記載のように調製した5450コロニー形成単位(CFU)のPasteurella multocida(血清型1)株X−73を、19週齢の時点の全てのトリに乳房筋肉内に抗原曝露した。抗原曝露後の14日間にわたって、トリの死亡率を観察した。この結果から明らかに実証されるように、Pasteurella multocidaのSRP抽出物及びrZincワクチンは両方とも有効(両方の生存率はそれぞれ100%及び50%)であり、生存率ゼロの非ワクチン接種対照とは対照的であった(図23)。本研究における組み換え亜鉛タンパク質を単一濃度250μgで評価し、有毒抗原曝露に対して50%の生存率(p=0.0325)が示された。
Claims (27)
- 配列番号2のアミノ酸25〜968に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号4のアミノ酸27〜790に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号6のアミノ酸23〜727に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号8のアミノ酸25〜964に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号10のアミノ酸26〜848に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号12のアミノ酸27〜784に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号14のアミノ酸25〜742に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号44のアミノ酸26〜805に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、またはそれらの組み合わせを具備する組成物であって、Pasteurella multocidaを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。
- 配列番号2のアミノ酸25〜968に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号4のアミノ酸27〜790に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号6のアミノ酸23〜727に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号8のアミノ酸25〜964に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号10のアミノ酸26〜848に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、配列番号12のアミノ酸27〜784に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質、及び配列番号14のアミノ酸25〜742に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質を含む、請求項1に記載の組成物。
- 分子量が99kDa、81kDa、及び80kDaである単離されたタンパク質であって、前記タンパク質が、鉄キレート剤含有の培地中でインキュベートした場合にはPasteurella multocidaから単離可能である一方、前記鉄キレート剤不含の培地中で成長させた場合には単離不可能である前記タンパク質、
分子量が109kDa、89kDa、及び87kDaである単離されたタンパク質であって、前記タンパク質が、鉄キレート剤含有の培地中でインキュベートされた場合にPasteurella multocidaから単離可能であり、且つ前記タンパク質が、前記鉄キレート剤不含の培地中でインキュベートされた場合に前記P.multocidaによって発現し、鉄キレート剤含有の培地中での成長中には発現レベルが増強する前記タンパク質、Pasteurella multocidaを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。 - 配列番号44のアミノ酸26〜805に対して少なくとも80%の類似性を有する単離されたタンパク質を具備する組成物であって、Pasteurella multocidaを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。
- 分子量が249kDa、60kDa、42kDa、38kDa、27kDa、26kDaもしくは22kDaで少なくとも1つの単離されたタンパク質であって、P.multocidaから単離可能である前記タンパク質を更に含む、請求項1、3、または4に記載の組成物。
- 請求項1または2に記載の組成物のタンパク質または請求項4に記載の組成物のタンパク質のうちの少なくとも1種を含む単離された全細胞を具備する組成物であって、Pasteurella multocidaを用いた抗原曝露からニワトリを保護する、前記組成物。
- 前記全細胞が、前記タンパク質のうちの1種以上を発現するように操作された細胞である、請求項6に記載の組成物。
- 前記細胞がE.coliである、請求項6に記載の組成物。
- 医薬的に許容される担体を更に含む、請求項1、3または4に記載の組成物。
- アジュバントを更に含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記ニワトリが第1のニワトリであり、前記組成物によって前記第1のニワトリがP.multocida血清型2×5を用いた抗原曝露から保護され、前記組成物によって第2のニワトリがP.multocida血清型3×4を用いた抗原曝露から保護される、請求項1、3、または4に記載の組成物。
- 対象前記組成物の少なくとも1つのタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するように前記対象を誘導するのに有効な量の請求項1、3または4に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
- 対象における感染症を治療するための方法であって、前記方法が、P.multocidaに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の請求項1、3もしくは4に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 対象における症状を治療するための方法であって、前記方法が、P.multocidaに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の1、3もしくは4に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 対象におけるコロニー形成を低減させるための方法であって、前記方法が、P.multocidaによるコロニー形成を被った対象に対し有効量の1、3または4に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 対象における感染症を治療するための方法であって、前記方法が、P.multocidaに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、1、3もしくは4に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
- 対象における症状を治療するための方法であって、前記方法が、P.multocidaに起因する感染症を有するかまたはそのリスクに曝されている対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、1、3もしくは4に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
- 対象におけるコロニー形成を低減させるための方法であって、前記方法が、P.multocidaによるコロニー形成を被った対象に対し有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が1、3または4に記載の組成物のタンパク質に対し特異的に結合する抗体を含む、前記方法。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項12〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物がウシである、請求項19に記載の方法。
- 前記対象が鳥類である、請求項12〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鳥類がニワトリまたはシチメンチョウである、請求項21に記載の方法。
- 少なくとも700マイクログラム(μg)乃至1200μg以下のタンパク質が投与される、請求項12〜18のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質に特異的に結合する抗体を検出するためのキットであって、
請求項1、3または4に記載の組成物の単離されたタンパク質と、
前記タンパク質に特異的に結合する抗体を検出する試薬とが、別々の容器に収容されている、前記キット。 - タンパク質を検出するためのキットであって、
請求項1、3または4に記載の組成物の単離されたタンパク質に特異的に結合する抗体と、タンパク質に特異的に結合する第2の試薬と、
別々の容器に具備する、前記キット。 - 請求項1、3または4に記載の組成物のタンパク質に特異的に結合する単離された抗体を具備する組成物。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項26に記載の組成物。
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