ES2945137T3 - Proteínas y composiciones inmunitarias que contienen proteínas de Pasteurella y métodos de uso - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona proteínas aisladas que se pueden aislar de Pasteurella spp. como P. multocida. La presente invención también proporciona composiciones que incluyen una o más de las proteínas y métodos para preparar y usar las proteínas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas y composiciones inmunitarias que contienen proteínas de Pasteurella y métodos de uso

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos N.° de Serie 62/457.599, presentada el viernes, 10 de febrero de 2017.

La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones y se refiere a composiciones que comprenden proteínas y usos de las mismas. Cualquier otro tema que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones que se establecen en el presente documento, se incluye a título informativo.

Antecedentes

Pasteurella spp. son bacterias gramnegativas facultativamente anaerobias y pleomórficamente en forma de bastón capaces de causar enfermedades en varios animales y humanos. Especies de Pasteurella en animales domésticos y salvajes han desarrollado un nicho particular para las membranas mucosas de las vías respiratorias superiores, mucosa de la cavidad oral y tracto genital inferior. En animales de granja, enfermedades se basan en los síntomas clínicos y en las particularidades Pasteurella especie asociada con la enfermedad. Hoy Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica son las dos especies más ampliamente reconocidas de la familia Pasteurellaceae asociadas con enfermedades clínicas en la cría de animales con especial referencia a las aves de corral, ganado bovino, cerdos y conejos. La familia Pasteurellaceae actualmente comprende cinco géneros; Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Haemophilus y Lonepinella y han sido objeto de una amplia reclasificación (Angen et al. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 67­ 86 (1999). Recientemente Pasteurella haemolytica ha sido reclasificada taxonómicamente como Mannheimia haemolytica en función de la secuenciación ribosomal y la hibridación ADN-ADN (Oystein et al. Int. J. Syst. Bacteriol.

49:6-86 (1999).

Pasteurella multocida es el agente etiológico de la pasteurelosis aviar, normalmente conocido como cólera aviar, una enfermedad ampliamente distribuida y económicamente importante de las aves de corral, que tiene una alta incidencia en pollos, pavos, gansos y patos (Rhoades et al. Fowl Cholera. En: Adlam, C. F. y Rutter, J. M. (Eds.), Pasteurella and Pasteurellosis. Academic Press, Londres, pág. 95-113. 1989). El organismo también es responsable de inducir enfermedades clínicas en aves silvestres, aves de caza y psitácidas criadas comercialmente (Rhoades y Rimler, 1989, Fowl cholera. En Pasteurella and Pasteurellosis, pág. 95-113. Editado por C. F. Adlam y J. M. Rutter. Londres: Academic Press). Todas las especies de aves son susceptibles en diversos grados. Las razas pesadas parecen más susceptibles que las razas ligeras y las aves adultas y las que se encuentran en la última fase de crecimiento parecen más susceptibles que las aves más jóvenes (Jordan et al. Poultry Diseases. Ballierre Tindall, Londres, pág 42-50.

1990.). Cuatro serogrupos capsulares (A, B, D y F) se reconocen entre las cepas aviares de Pasteurella multocida (Rhoades et al. Avian Dis. 31: 895-898 (1987). En las aves domésticas, las cepas pertenecientes al tipo A capsular son reconocidas como el principal agente de la pasteurelosis (Rhoades y Rimler, 1987, Avian Dis 31, 895-898; Rhoades et al. Fowl Cholera. En: Adlam, C. F. y Rutter, J. M. (Eds.), Pasteurella and Pasteurellosis. Academic Press, Londres, pág. 95-113. 1989; Wilson et al. J. Clin. Microbiol. 31: 255-259 1993)). Se ha demostrado que las cepas aviares de Pasteurella multocida son genéticamente diversos como lo demuestra la electroforesis enzimática multilocus y la hibridación ADN-ADN. Según estos hallazgos, P. multocida ahora se ha subdividido en tres subespecies, multocida, septica y gallicida.

La patogenia de P. multocida no se comprende bien, pero depende de factores específicos del huésped y del patógeno. Hasta la fecha, ningún factor de virulencia único se ha asociado con enfermedad entre las cepas. Los factores de virulencia que se han estudiado hasta la fecha incluyen; cápsula, endotoxina, proteínas de la membrana externa, resistencia sérica, sistemas de adquisición de hierro, proteína del choque térmico, producción de neuraminidasa, factores de adherencia, enzimas que escinden anticuerpos y la posible existencia de toxinas citopáticas.

La manifestación clínica de la enfermedad puede variar desde hiperaguda/aguda hasta infecciones crónicas y puede surgir inicialmente por la colonización del tracto respiratorio superior, seguida de invasión y septicemia. Durante las infecciones agudas, se observan pocos signos clínicos antes de la muerte, que generalmente está dominada por lesiones septicémicas. En formas crónicas de infecciones por P. multocida, las lesiones supurativas pueden estar ampliamente distribuidas involucrando las membranas mucosas del tracto respiratorio, la faringe, las fosas nasales, la conjuntiva y tejidos adyacentes de la cabeza.

Debido a la naturaleza ubicua de P. multocida y el potencial de grandes pérdidas económicas, se han desarrollado vacunas comerciales para proteger contra brotes de cólera aviar en operaciones de pollos ponedoras y reproductoras en los EE. UU. y en el extranjero. Las vacunas comerciales inactivadas contra el cólera aviar actualmente disponibles se basan en serotipos somáticos para ofrecer protección. La mayoría de las vacunas inactivadas contienen, como mínimo, las cepas de Pasteurella multocida del serotipo 1 (también conocido como A: 1), serotipo 3 (también conocido como A:3) y serotipo 4 (también conocido como A:4). Las vacunas contra el cólera aviar hechas con un serotipo no brindan protección cruzada contra otros serotipos, por ejemplo, una vacuna hecha con una cepa del serotipo 1 no protege contra los serotipos 3 o 4.

La habilidad de Pasteurella multocida para evadir los mecanismos naturales de defensa del huésped vertebrado depende en parte de su capacidad para obtener hierro del huésped, que, a su vez, influye directamente en la interacción huésped-patógeno. Debido a la naturaleza esencial del hierro, los huéspedes vertebrados han desarrollado mecanismos elaborados para unir el hierro en los fluidos corporales (por ejemplo, transferrina en la sangre y los fluidos linfáticos y lactoferrina en las secreciones externas). Estas proteínas de unión de hierro de alta afinidad crean un entorno restringido de hierro dentro del huésped, reduciendo el nivel de hierro a aproximadamente 10-18 molar, una concentración demasiado baja para soportar el crecimiento de casi todas las bacterias. Estos mecanismos de secuestro de hierro del huésped actúan como un mecanismo de defensa natural para combatir la invasión bacteriana. Para eludir estas condiciones restrictivas de hierro, muchas especies bacterianas han desarrollado mecanismos para obtener hierro. Los mecanismos más comunes incluyen la difusión de hierro soluble a través de porinas y sistemas de transporte especializados que median la captación de hierro por los sideróforos. Este último sistema es uno de los mecanismos más comunes y mejor estudiados para la adquisición de hierro e implica la quelación específica del hierro férrico por los sideróforos y la síntesis de sus sistemas de transporte afines, lo que permite que las bacterias continúen replicándose y superando los mecanismos de defensa no específicos del huésped. La replicación continua, y por lo tanto cada etapa en el proceso infeccioso, depende en última instancia de la capacidad del organismo para obtener hierro de su huésped.

Los iones metálicos divalentes, tal como hierro, cobalto, cobre, magnesio, manganeso, molibdeno, níquel, selenio y cinc son oligoelementos que a menudo se requieren para la supervivencia de las bacterias que infectan a los huéspedes animales y humanos. Estos oligoelementos metálicos son utilizados por bacterias como cofactores de enzimas que catalizan reacciones bioquímicas para diversas rutas metabólicas requeridas por el organismo. El impacto del hierro en la patogenia de las bacterias se ha estudiado ampliamente. El hierro es esencial para casi toda la vida y es necesario para las rutas enzimáticas y metabólicas de los organismos en todos los niveles filogenéticos. Ha sido bien documentado que durante la sepsis bacteriana hay una alteración en la concentración de una serie de iones metálicos en el suero, tales como, hierro, cobre y cinc. Por ejemplo, los niveles séricos de cinc disminuyen del 10 al 60 por ciento con el inicio de la infección. Tras el inicio de la infección, a continuación el cinc se redistribuye del plasma al hígado, donde se une a la metalotioneína. Se han descrito disminuciones en el hierro sérico de hasta un 50 por ciento durante enfermedades infecciosas, mientras que se ha demostrado que el cobre sérico aumenta en respuesta a estímulos inflamatorios. La alteración de estos iones de oligoelementos metálicos en el suero puede afectar directamente a la gravedad o la progresión de cualquier infección bacteriana.

Con tantas funciones básicas que dependen de la disponibilidad de hierro, las bacterias han desarrollado una compleja red reguladora para adquirir hierro en diversas condiciones fisiológicas. En condiciones anaeróbicas, el hierro está presente en forma ferrosa soluble (Fe II) y puede difundirse libremente a través de las porinas de la membrana externa hacia el periplasma. Por ejemplo, en E. coli, el sistema de transporte FeoAB presente en la membrana citoplasmática transportará las moléculas de hierro ferroso al citoplasma celular. En condiciones aeróbicas y pH neutro, el hierro está presente principalmente en forma férrica insoluble (Fe III) y no puede pasar a través de las porinas de la membrana externa por difusión pasiva. En cambio, las bacterias secretan moléculas llamadas sideróforos, que tienen una alta afinidad por el hierro férrico. Los complejos férrico-sideróforo son reconocidos por receptores en la membrana externa denominados colectivamente como receptores dependientes de TonB. Estos receptores, una vez unidos a sideróforos cargados, se cree que interactúan con TonB y sus proteínas asociadas localizadas en el periplasma y la membrana citoplasmática. Estas interacciones proteína-proteína, aunque poco conocidas, sirven para proporcionar la energía necesaria para transportar los complejos férrico-sideróforo a través de la membrana externa y a través del espacio periplásmico. Los sistemas de transporte ABC presentes en la membrana citoplasmática sirven para transportar los complejos sideróforo-hierro a través de la membrana citoplasmática. Las enzimas reductasas reducen el hierro férrico a su forma ferrosa, que lo disocia del sideróforo y libera hierro en la célula.

Varias especies de bacterias patógenas utilizan mecanismos adicionales para obtener hierro de huéspedes mamíferos, incluyendo la unión directa de transferrina, hemo y otros compuestos que contienen hemo. Las proteínas receptoras que se unen a estas moléculas que contienen hierro probablemente dependan del complejo TonB para obtener la energía necesaria para transportar el hemo a través de la membrana externa, similar a los complejos hierrosideróforo. Luego se utilizan transportadores ABC especializados para transportar el hemo a través de la membrana citoplasmática. Además, algunas bacterias secretan hemoforos, moléculas pequeñas que pueden unirse al hemo y presentarlo a los receptores en la superficie de la célula bacteriana. Varias especies patógenas también producen hemolisinas, que son toxinas que lisan los glóbulos rojos, liberando el gruopo hemo y la hemoglobina para su absorción por las bacterias.

Las proteínas de la membrana externa de las bacterias gramnegativas controlan la permeabilidad selectiva de muchos nutrientes esenciales críticos para la supervivencia de las bacterias, incluyendo todas las bacterias patógenas que causan enfermedades en los animales y el hombre. Esta permeabilidad selectiva de nutrientes está controlada por una clase de proteínas de membrana llamadas porinas. Ahora parece que la mayoría de las proteínas de la membrana externa en la superficie de las bacterias gramnegativas son porinas, identificadas como las porinas generales (por ejemplo, OmpF), porinas monoméricas (por ejemplo, OmpA), las porinas específicas (por ejemplo, la porina LamB específica de maltosa) y las porinas acotadas dependientes de TonB (por ejemplo, el receptor de sideróforo FepA).

La clase de proteínas de las porinas generalmente comparte características estructurales, incluyendo la presencia de barriles beta que atraviesan la membrana externa.

Más allá del papel del hierro como nutriente esencial para la supervivencia microbiana, ahora hay muchos otros metales de transición bien definidos que desempeñan un papel crítico en la supervivencia bacteriana, la homeostasis

y la patogenia, tales como hierro, manganeso, cobre, cinc, magnesio, cobalto y níquel (Waldron y Robinson y 2009;

Porcheron; 2013). El hierro, el cinc y el cobre son los tres iones metálicos divalentes más abundantes en los mamíferos

en orden descendente de concentración. La capacidad de una bacteria para utilizar estos metales de transición mediante sistemas de captación o adquisición finamente regulados contribuye significativamente a la virulencia de las bacterias patógenas. Es bien sabido que las bacterias dentro del mismo género/especie no tienen los mismos sistemas

de captación para la adquisición de metales de transición debido a la diferencia de patogenicidad de una cepa de bacterias a otra. Estas diferencias en la capacidad de las bacterias para usar diferentes metales de transición en

función de los sistemas de captación expresados pueden indicar específicamente qué órgano o tejido puede invadir un organismo.

Poco se sabe sobre la adquisición de hierro por Pasteurella multocida; no se ha estudiado casi hasta el punto de los sistemas de transporte de hierro de E. coli. Las proteínas reguladas por hierro de Pasteurella han sido investigados

como inmunógenos potenciales como antígenos diana para diferentes estrategias de vacunas en múltiples especies animales. Se ha demostrado que estas proteínas brindan eficacia protectora contra la exposición homólogo, pero los investigadores no han logrado una combinación de estas proteínas para brindar protección heteróloga.

Glisson et al. (Avian Diseases 37:1074-1079, 1993) intentaron inducir protección cruzada entre serotipos preparando bacterinas a partir de las cepas X-73 (serotipo 1) y P-1059 (serotipo 3) de P. multocida en condiciones de cultivo restringidas en hierro. Encontraron que las bacterinas producidas en medio bajo en hierro no inducían consistentemente una protección significativa contra la exposición heteróloga.

Sumario de la solicitud

La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones y se refiere a composiciones que comprenden proteínas y usos de las mismas. Cualquier otro tema que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones que se establecen en el presente documento, se incluye a título informativo.

Las referencias a cualquier método de tratamiento por terapia en esta descripción deben interpretarse como referencias a composiciones para usar en esos métodos.

Se observaron resultados similares a Glisson al cultivar dos cepas heterólogas, una de serotipo 3x4 y una de serotipo

1, en medio restringido en hierro e intentar un modelo de vacunación y desafío con una cepa como cepa de vacuna y

la otra como cepa de exposición (véanse los Ejemplos 6-9), es decir, se observó cierta protección cuando la vacuna y

la exposición eran serotipos diferentes. Sin embargo, cuando se compararon cepas de campo de Pasteurella multocida patogénica y, particularmente, cuando se compararon los patrones de proteínas reguladas por metales presentes en

estas cepas, se descubrieron dos patrones principales de proteínas reguladas por metales que predominan en estas

cepas patogénicas. Un patrón contiene 2 o 3 proteínas reguladas por metales principales, y el otro patrón contiene 4 proteínas reguladas por metales distintas. Cuando las proteínas reguladas por metales de estos dos tipos de patrones

se obtuvieron de dos cepas de P. multocida, una de serotipo 2,5 y una de serotipo 3,4, y combinadas y utilizadas para vacunar animales, se observó protección heteróloga entre los serotipos de P. multocida, incluida la protección contra

un P. multocida de otro serotipo no representado en las dos cepas utilizadas para hacer la vacuna. Este resultado fue inesperado y sorprendente. No se tuvo conocimiento de ningún informe de este tipo de protección heteróloga observado en vacunas que protegen contra la infección por P. multocida.

En el presente documento se proporcionan composiciones, incluyendo composiciones de la invención como se define

en las reivindicaciones. Por otro lado, se describe una composición que incluye una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de similitud con los aminoácidos 25-968 del SEQ ID NO:2, una proteína aislada que tiene al menos

un 80 % de similitud con los aminoácidos 27-790 del SEQ ID NO:4, una proteína aislada que tiene al menos un 80 %

de similitud con los aminoácidos 23-727 del SEQ ID NO:6, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de similitud

con los aminoácidos 25-964 del SEQ ID NO:8, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de similitud con los aminoácidos 26-848 del SEQ ID NO:10, una proteína aislada que tiene al menos un 80% de simili aminoácidos 27-784 del SEQ

NO:12, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de simili aminoácidos 25-742 del SEQ ID NO:14, una proteína aislada que tiene al menos un 80% de simili aminoácidos 26-805 del SEQ ID NO:44, o una combinación de los mismos. La composición protege a un animal, tal como un pollo, contra la exposición a Pasteurella multocida.

Por otro lado, se describe una composición que incluye proteínas aisladas que tienen pesos moleculares de 99 kDa,

81 kDa y 80 kDa donde las proteínas se pueden aislar de un Pasteurella multocida cuando se incuba en medios que

incluyen un quelante de hierro y no se puede aislar cuando se cultiva en medios sin el quelante de hierro, proteínas aisladas que tienen pesos moleculares de 109 kDa, 89 kDa y 87 kDa, en donde las proteínas se pueden aislar de un

P. multocida cuando se incuba en medios que contienen un quelante de hierro, donde las proteínas son expresadas

por P. multocida cuando se incuba en medios sin el quelante de hierro y se expresa a un nivel mejorado durante el crecimiento en medios que incluyen un quelante de hierro. La composición protege a un animal, tal como un pollo, contra la exposición a P. multocida.

Por otro lado, se describe una composición que incluye una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de similitud con los aminoácidos 26-805 del SEQ ID NO:44, en donde la composición protege a un pollo contra la exposición a P. multocida.

Una composición descrita en el presente documento puede incluir opcionalmente proteínas adicionales, tales como al menos una proteína aislada que tiene un peso molecular de 249 kDa, 60 kDa, 42 kDa, 38 kDa, 27 kDa, 26 kDa, o 22 kDa, en donde las proteínas se pueden aislar de P. multocida.

Por otro lado, se describe una composición que incluye una célula entera aislada que incluye al menos una de las proteínas de una composición descrita en el presente documento. La composición protege a un animal, tal como un pollo, contra la exposición a Pasteurella multocida. Se describe de otro modo que la célula entera es una célula diseñada para expresar una o más de las proteínas. La célula puede ser E. coli.

Además, se describe de otro modo una composición que incluye un anticuerpo aislado que se une específicamente a una proteína de una composición descrita en el presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal.

Una composición descrita en el presente documento puede incluir además un vehículo, un adyuvante farmacéuticamente aceptable o una combinación de los mismos.

También se proporcionan métodos. En una realización, un método incluye administrar a un sujeto una cantidad de una composición descrita en el presente documento eficaz para inducir al sujeto a producir un anticuerpo que se une específicamente a al menos una proteína de la composición. En una realización, un método es para tratar una infección en un sujeto e incluye administrar una cantidad efectiva de la composición descrita en el presente documento a un sujeto en riesgo de tener una infección causada por P. multocida. En una realización, un método es para tratar un síntoma en un sujeto e incluye administrar una cantidad efectiva de una composición descrita en el presente documento a un sujeto en riesgo de tener una infección causada por P. multocida. Se describe de otro modo un método para tratar una infección en un sujeto o tratar un síntoma en un sujeto, mediante la administración de una cantidad eficaz de la composición descrita en el presente documento a un sujeto que tiene una infección causada por P. multocida. En una realización, un método es para disminuir la colonización en un sujeto e incluye administrar una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento a un sujeto colonizado por P. multocida. Se describe de otro modo un método para tratar una infección en un sujeto e incluye administrar una cantidad eficaz de una composición a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una infección causada por P. multocida en donde la composición incluye un anticuerpo que se une específicamente a una proteína de una composición descrita en el presente documento. Se describe de otro modo un método para tratar un síntoma en un sujeto e incluye administrar una cantidad eficaz de una composición a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una infección causada por P. multocida, en donde la composición que incluye un anticuerpo que se une específicamente a una proteína de una composición descrita en el presente documento. Se describe de otro modo un método para disminuir la colonización en un sujeto e incluye administrar una cantidad eficaz de una composición a un sujeto colonizado por P. multocida, en donde la composición que incluye un anticuerpo que se une específicamente a una proteína es una composición descrita en el presente documento.

En una realización, el sujeto puede ser un mamífero, tal como un bovino o un ave, tal como un pollo o un pavo. En una realización, se administran al menos 700 microgramos (|jg) a no más de 1200 |jg de proteína.

Se describen de otro modo kits. En un caso, un kit es para detectar un anticuerpo que se une específicamente a una proteína e incluye en contenedores separados (i) una proteína aislada de la composición de la reivindicación 1 o 2 y (ii) un reactivo que detecta un anticuerpo que se une específicamente a la proteína. En un caso, un kit es para detectar una proteína e incluye en contenedores separados (i) un anticuerpo que se une específicamente a una proteína aislada de una composición descrita en el presente documento y un segundo reactivo que se une específicamente a la proteína.

El término "y/o" significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos o más de los elementos enumerados.

En el contexto de la invención reivindicada, los términos "preferente" y "preferentemente" se refieren a realizaciones de la invención que pueden proporcionar determinados beneficios, en determinadas circunstancias. Sin embargo, también pueden ser preferentes otras realizaciones, en las mismas circunstancias o en otras. Además, la mención de una o más realizaciones preferidas no implica que otras realizaciones no sean útiles y no pretende excluir otras realizaciones del alcance de la invención.

Los términos "comprende" y variaciones de los mismos no tienen un significado limitante cuando estos términos aparecen en la descripción y en las reivindicaciones.

En el contexto de la invención reivindicada, se entiende que siempre que se describan realizaciones en el presente documento con el lenguaje "incluyen", "incluye", o "que incluye", y similares, también se proporcionan realizaciones análogas descritas de otra manera en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Salvo que se especifique lo contrario, "un", "uno/una", "el", "la", y "al menos un/a" se usan indistintamente, y significa uno/a o más de uno/a.

También en el presente documento, las menciones de intervalos numéricos mediante los puntos finales incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

Para cualquier método divulgado en el presente documento que incluya etapas separadas, las etapas pueden realizarse en cualquier orden factible. Y, según sea adecuado, cualquier combinación de dos o más etapas puede llevarse a cabo simultáneamente.

No se pretende que el sumario anterior describa cada realización divulgada o toda implementación de la presente invención. La descripción que sigue ejemplifica más particularmente realizaciones ilustrativas. En varios lugares a lo largo de la solicitud, se proporciona orientación a través de listas de ejemplos, cuyos ejemplos pueden usarse en diversas combinaciones. En cada caso, la lista citada solo sirve como grupo representativo y no debe interpretarse como una lista excluyente.

Breve descripción de las figuras

FIG 1. Gel SDS-PAGE de extracto de bacterias cultivadas en condiciones limitantes de hierro y repletas de hierro. Carriles 1 y 10: Marcadores de peso molecular de amplio rango; Carril 2: Candidato vacunal MS061130 con restricción de hierro; Carril 3: Cepa candidata a vacuna en condiciones de repleción de hierro. Carril 4: cepa de referencia del serotipo 1 X-73 en condiciones limitadas de hierro. Carril 5: X-73 en condiciones de repleción de hierro. Carril 6: Serotipo 3 cepa de referencia P1059 en condiciones limitantes de hierro. Carril 7: P1059 en condiciones de repleción de hierro. Carril 8: cepa de referencia P-1662 en condiciones limitantes de hierro; carril 9: P-1662 en condiciones de repleción de hierro. Obsérvense los pesos moleculares similares de las proteínas reguladas por hierro como se muestra dentro del rectángulo.

FIG 2. Eficacia de tres series de vacuna de Pasteurella multocida producidas a partir de una sola cepa contra la exposición al serotipo 1 de Pasteurella heterólogo. Se prepararon tres series de vacunas que consisten en el mismo antígeno a partir de la Semilla Maestra MS061130. Observación: se usaron dos preparaciones de antígeno que representan dos procesos de fermentación separados para preparar dos lotes de antígeno designados como antígeno A y antígeno B. La primera serie de vacunas se preparó usando una mezcla de antígeno A y antígeno B, la segunda serie de vacunas se preparó solo con el antígeno A, y la tercera serie de vacunas se preparó con solo el antígeno B.

FIG 3. Tabla de proteínas que se sabe que están en las cepas de exposición de referencia para el serotipo A:1 y el serotipo A:3 en comparación con la cepa vacunal. Obsérvense las 8 proteínas presentes en al menos uno de los genomas de la cepa de referencia, pero ausentes de la cepa vacunal.

FIG 4. Diagrama de Venn que ilustra las proteínas de la membrana externa que faltan en la cepa vacunal (MS061130). Los números se correlacionan con los números de identificación de proteínas de la Figura 3.

FIG 5. Dendograma de patrones de bandas de proteínas reguladas por metales de 30+ aislados clínicos de campo y cepas de referencia de Pasteurella multocida. Obsérvese los dos patrones de bandas principales representados como un patrón de cuatro bandas entre corchetes [] y un patrón de tres bandas entre llaves {}. La mayoría de las otras cepas parecen ser variaciones de estos dos patrones.

FIG 6. Comparación de 38 proteínas reguladas por hierro expresadas de 13 aislados diferentes que representan los tipos de patrones de la figura 5. (+) indica que la proteína se expresa y (-) indica que la proteína no se expresa a niveles detectables. La elipse identifica dos objetivos potenciales de la vacuna que cubren la mayoría de las proteínas.

FIG 7. Eficacia de la vacuna utilizando una vacuna compuesta por dos cepas de semillas maestras desafiadas con el serotipo 1 de Pasteurella en pollos que muestran protección heteróloga.

FIG. 8-14. Las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14, y un ejemplo de una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13, respectivamente) que codifica cada secuencia de aminoácidos. FIG 15. Alineación de secuencias del SEQ ID NO:2 y otras cuatro secuencias. WP_053521090.1 (SEQ ID NO:15), 1121_HgbA_968aa (SEQ ID NO:2), WP_005756141.1 (SEQ ID NO:16), AAQ14873.1 (SEQ ID NO:17), WP_061405928.1 (SEQ ID NO: 18). Todas las secuencias son P. multocida, excepto WP_053521090.1 que es Haemophilus influenzae.

FIG 16. Alineación de secuencias del SEQ ID NO:4 y otras cuatro secuencias. ESQ71136.1 (SEQ ID NO:19), WP_014391205.1 (SEQ ID NO:20), WP_016534044.1 (SEQ ID NO:21), 1121 _FepA _790aa (SEQ ID NO:4), WP_005756883.1 (SEQ ID NO:22). Todas las secuencias son P. multocida.

FIG 17. Alineación de secuencias del SEQ ID NO:6 y otras cuatro secuencias. WP_071522773.1 (SEQ ID NO:23), WP_016534444.1 (SEQ ID NO:24), WP_005755819.1 (SEQ ID NO:25), 1121_PfhR_727aa (SEQ ID NO:6), EGP05580.1 (SEQ ID NO:26). Todas las secuencias son P. multocida.

FIG 18. Alineación de secuencias del SEQ ID NO:8 y otras cinco secuencias. 1135_PM0300_964aa (SEQ ID NO:8), WP_005753642.1 (SEQ ID NO:27), WP_016534557.1 (SEQ ID NO:28), WP_010906573.1 (SEQ ID NO:29), AAQ14873.1 (SEQ ID NO:30), 1121_HgbA_968aa (SEQ ID NO:2). Todas las secuencias son P. multocida. FIG 19. Alineación de secuencias del SEQ ID NO:10 y otras cuatro secuencias. WP_017861186.1 (SEQ ID NO:31), AAU29202.1 (SEQ ID NO:32), EGP04511.1 (SEQ ID NO:33), 1135_HasR_848aa (SEQ ID NO:10), WP_005752163.1 (SEQ ID NO:34). Todas las secuencias son P. multocida.

FIG 20. Alineación de secuencias del SEQ ID NO:12 y otras cuatro secuencias. WP_005751557.1 (SEQ ID NO:35), 1135_PM0741_784aa (SEQ ID NO:12), WP_016534554.1 (SEQ ID NO:36), WP_064972816.1 (SEQ ID NO:37), WP_074865020.1 (Se Q ID NO:38). Todas las secuencias son P. multocida.

FIG 21. Alineación de secuencias del SEQ ID NO:14 y otras cuatro secuencias. WP_050948957.1 (SEQ ID NO:39), WP_014391043.1 (SEQ ID NO:40), WP_016533738.1 (SEQ ID NO:41), 1135_P1062_0207600_742aa (SEQ ID NO:14), WP_025248456.1 (SEQ iD NO:42). Todas las secuencias son P. multocida, excepto WP_050948957.1 que es Haemophilus influenzae.

FIG. 22. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y un ejemplo de una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 43) que codifica la secuencia de aminoácidos. Se predice que los primeros 78 nucleótidos de SEQ ID NO: 43 codifican la secuencia señal de SEQ ID NO: 44 (aminoácidos 1-26).

FIG. 23. El porcentaje de supervivencia de los pollos expuestos a Pasteurella multocida comparando una proteína de cinc recombinante (rcinc) con un extracto de SRP. Los resultados muestran claramente la eficacia tanto del extracto SRP de Pasteurella multocida como de la proteína rcinc en comparación con controles de placebo no vacunados.

FIG. 24. Imagen de gel que muestra la preparación del cuerpo de inclusión de proteína de adquisición de cinc recombinante de Pasteurella multocida. Carril 1: Célula entera no inducida, carril 2: Célula entera inducida, Carril 3: Sobrenadante de células lisadas, Carril 4: 1X Lavado Bugbuster, Carril 5: 1/10X Lavado Bugbuster, Carril 6: Lavado TBW, Carril 7: Cuerpos de inclusión solubilizados y Carril 8: Sedimento tras la solubilización que muestra la proteína recombinante con un peso molecular de 90,85 kDa.

FIG. 25. Alineación de secuencia de la región de afinidad de cinc de proteínas de adquisición de cinc de Mannheimia haemolytica (ZAP, SEQ ID NO:45) y otros 10 patógenos respiratorios. AHG81836.1 (SEQ ID NO:46), WP_005612269.1 (SEQ ID NO:47),WP_027074597.1 (SEQ ID NO:48), AHG73391.1 (SEQ ID NO:49), WP_021114857.1 (SEQ ID NO:50), WP_026212957.1 (SEQ ID NO:51), WP_028858792.1 (SEQ ID NO:52), WP_016534590.1 (SEQ ID NO:53), KDN24548.1 (SEQ ID NO: 54) y WP_027021676.1 (SEQ ID NO: 55).

Descripción detallada

Proteínas

En un aspecto, esta divulgación proporciona proteínas y composiciones que incluyen proteínas. Como se utiliza en el presente documento, "proteína" se refiere a un polímero de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Por lo tanto, por ejemplo, los términos péptido, oligopéptido, el polipéptido y la enzima se incluyen dentro de la definición de proteína. Este término también incluye proteínas que pueden incluir una o más modificaciones posteriores a la expresión de la proteína, tales como, por ejemplo, una glicosilación, una acetilación, una fosforilación y similares. El término proteína no connota una longitud específica de un polímero de aminoácidos. Una proteína puede aislarse directamente de una fuente natural o puede prepararse con la ayuda de técnicas recombinantes, enzimáticas o químicas. En el caso de una proteína que se produce de forma natural, normalmente se aísla una proteína de este tipo.

Una proteína "aislada" es aquella que ha sido eliminada de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada es una proteína que se ha extraído del citoplasma o de la membrana de una célula, y muchas de las proteínas, los ácidos nucleicos y otro material celular de su entorno natural ya no están presentes.

Una proteína caracterizada como "que se puede aislar" de una fuente particular es una proteína que, en las condiciones adecuadas, es producida por la fuente identificada, aunque la proteína se puede obtener de fuentes alternativas usando, por ejemplo, técnicas recombinantes, químicas o enzimáticas convencionales. Por lo tanto, caracterizar una proteína como "que se puede aislar" de una fuente en particular no implica ninguna fuente específica de la cual deba obtenerse la proteína ni condiciones o procesos particulares bajo los cuales la proteína deba obtenerse.

Una proteína "purificada" es aquella que está exenta de al menos un 60 %, preferentemente exenta de al menos un 75 % y, lo más preferentemente, exenta de al menos un 90 % de otros componentes con los que están asociados de forma natural. Las proteínas que se producen fuera del organismo en el que ocurren naturalmente, por ejemplo, a través de medios químicos o recombinantes, se consideran aisladas y purificadas por definición, ya que nunca estuvieron presentes en un medio natural.

En general, una proteína puede caracterizarse por su peso molecular, secuencia de aminoácidos, impresión masiva, ácido nucleico que codifica la proteína, actividad inmunológica o cualquier combinación de dos o más de tales características. El peso molecular de una proteína, normalmente expresado en kilodaltons (kDa), puede determinarse usando métodos rutinarios, incluidos, por ejemplo, filtración en gel, electroforesis en gel, incluida la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato de sodio (SDS), electroforesis capilar, espectrometría de masas, cromatografía líquida (incluyendo HPLC) y cálculo del peso molecular a partir de una secuencia de aminoácidos observada o predicha. A menos que se indique de otro modo, la referencia al peso molecular se refiere al peso molecular determinado mediante la resolución de una proteína utilizando un gel de poliacrilamida SDS que tiene un gel de apilamiento de aproximadamente el 4 % y un gel de resolución de aproximadamente el 10 % en condiciones reductoras y desnaturalizantes. En una realización, el peso molecular de una proteína identificada por SDS-PAGE incluye pesos moleculares de 1, 2, 3, 4 o 5 kDa por encima y por debajo del valor establecido.

Las proteínas descritas en el presente documento pueden estar reguladas por metales. Como se utiliza en el presente documento, una "proteína regulada por metales" es una proteína que es expresada por un microbio a un nivel mayor cuando el microbio crece en condiciones de bajo contenido de metales en comparación con cuando el mismo microbio crece en condiciones de alto contenido de metales. En el presente documento se describen las condiciones de bajo contenido de metal y alto contenido de metal. Por ejemplo, ciertas proteínas reguladas por metales producidas por P. multocida no se expresan a niveles detectables durante el crecimiento del microbio en condiciones de alto contenido de metales, pero se expresan a niveles detectables durante el crecimiento en condiciones de bajo contenido de metales. En una realización, una proteína regulada por metales puede ser una proteína receptora de sideróforos. Ejemplos de proteínas reguladas por metales que se pueden aislar de un P. multocida después del crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro incluyen proteínas reguladas por metales que tienen pesos moleculares de 104 kDa a 75 kDa. Ejemplos específicos de proteínas reguladas por metales que se pueden aislar de P. multocida después del crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro incluyen proteínas de 99 kDa, 81 kDa y 80 kDa determinado mediante la resolución de una proteína utilizando un gel de poliacrilamida SDS que tiene un gel de apilamiento de aproximadamente el 4 % y un gel de resolución de aproximadamente el 10 % en condiciones reductoras y desnaturalizantes. En una realización, unas condiciones de hierro bajo es el crecimiento en presencia de 2,2'-dipiridilo. Ejemplos de proteínas reguladas por hierro que tienen pesos moleculares de 99 kDa, 81 kDa y 80 kDa, y secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas, se muestran en las figuras 10, 14 y 6, respectivamente. Un ejemplo específico de proteínas reguladas por metales que se pueden aislar de P. multocida después del crecimiento en condiciones bajas en cinc incluyen una proteína de 91 kDa determinada mediante la resolución de una proteína utilizando un gel de poliacrilamida SDS que tiene un gel de apilamiento de aproximadamente el 4 % y un gel de resolución de aproximadamente el 10% en condiciones reductoras y desnaturalizantes. En una realización, unas condiciones de cinc bajo es el crecimiento en presencia de N,N,N',N'-tetrakis(2-piridilmetil)etilendiamina (TPEN) (Sigma-Aldrich, St. Louis MO). Un ejemplo de proteína regulada por cinc que tiene un peso molecular de 91 kDa y secuencias de nucleótidos que codifican la proteína, se muestra en las figuras 22.

Las proteínas descritas en el presente documento pueden expresarse a niveles detectables durante el crecimiento del microbio en condiciones de alto contenido de metales, pero se expresan a niveles más altos durante el crecimiento en condiciones de bajo contenido de metales. La expresión de dichas proteínas se denomina aquí "mejorada" durante el crecimiento en condiciones de bajo contenido en metales. Normalmente, el aumento de la expresión de una proteína durante el crecimiento en condiciones de bajo contenido de metales es de entre un 50 % y un 500 % en comparación con la expresión de la proteína durante el crecimiento en condiciones de alto contenido de metales.

Ejemplos de proteínas reguladas por metales que tienen una expresión mejorada y que se pueden aislar de P. multocida después del crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro incluyen proteínas reguladas por metales que tienen pesos moleculares de 114 kDa a 82 kDa. Ejemplos específicos de proteínas reguladas por metales que se pueden aislar de P. multocida después del crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro incluyen proteínas de 109 kDa, 89 kDa y 87 kDa determinado mediante la resolución de una proteína utilizando un gel de poliacrilamida SDS que tiene un gel de apilamiento de aproximadamente el 4 % y un gel de resolución de aproximadamente el 10 % en condiciones reductoras y desnaturalizantes. En las Figuras 8 y 11 se muestran ejemplos de proteínas que tienen pesos moleculares de 109 kDa y secuencias de nucleótidos que las codifican. Ejemplos de proteínas que tienen pesos moleculares de 89 kDa y 87 kDa y secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas, se muestran en las figuras 13 y 9, respectivamente.

Esta divulgación también describe ciertas proteínas que no están reguladas por metales. Estas proteínas se expresan en presencia de un ion metálico, tal como, por ejemplo, en presencia de cloruro férrico y también se expresa cuando se cultiva en condiciones de hierro bajo. Ejemplos de este tipo de proteínas que se pueden aislar de P. multocida tienen pesos moleculares de 254 kDa a 244 kDa, de 65 kDa a 55 kDa y de 47 kDa a 17 kDa. Los ejemplos de pesos moleculares de este tipo de proteína incluyen 249 kDa, 60 kDa, 42 kDa, 38 kDa, 27 kDa, 26 kDa y 22 KDa. Los ejemplos adicionales de proteínas incluyen versiones de proteínas producidas de forma recombinante descritas en el presente documento. Una proteína producida de forma recombinante puede incluir la secuencia de aminoácidos completa traducible de un transcrito de ARNm. Como alternativa, una proteína producida de forma recombinante puede incluir un fragmento de la secuencia de aminoácidos traducible completa. Por ejemplo, una proteína producida de forma recombinante puede carecer de una secuencia escindible en cualquiera de los extremos de la proteína, por ejemplo, una secuencia de señal escindible en el extremo amino de la proteína.

En una realización, una proteína carece de uno o más aminoácidos del amino terminal de la proteína codificada por una secuencia de codificación obtenida de una célula de tipo salvaje, por ejemplo, la proteína carece de una secuencia señal. Por lo tanto, un fragmento puede carecer al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 33, al menos 34, al menos 35, al menos 36, al menos 37, al menos 38, al menos 39, al menos 40, al menos 41, al menos 42, al menos 43, al menos 44, al menos 45, al menos 46, al menos 47, al menos 48, al menos 49, al menos 50, al menos 51, al menos 52, al menos 53, al menos 54, al menos 55, al menos 56, al menos 57, al menos 58, al menos 59, al menos 60, al menos 61, al menos 62 o al menos 63 aminoácidos del extremo amino de la proteína. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:2 no incluye los aminoácidos 1-24. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:4 no incluye los aminoácidos 1-26. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:6 no incluye los aminoácidos 1-22. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:8 no incluye los aminoácidos 1-24. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:10 no incluye los aminoácidos 1-25. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:12 no incluye los aminoácidos 1-26. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:14 no incluye los aminoácidos 1-24. En una realización, un fragmento de la proteína representada en el SEQ ID NO:44 no incluye los aminoácidos 1-26.

Si una proteína es una proteína regulada por metales, una proteína mejorada o una proteína no regulada por metales puede determinarse mediante métodos útiles para comparar la presencia de proteínas, incluyendo, por ejemplo, filtración en gel, electroforesis en gel, incluida la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), electroforesis capilar, espectrometría de masas, etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) y cromatografía líquida, incluida HPLC. Se pueden cultivar cultivos separados de un microbio en condiciones de alto contenido de metales y en condiciones de bajo contenido de metales, las proteínas pueden aislarse como se describe en el presente documento y las proteínas presentes en cada cultivo pueden resolverse y compararse. Normalmente, se utiliza una cantidad igual de proteínas de cada cultivo. En una realización, las proteínas se pueden resolver utilizando un gel de poliacrilamida SDS que tiene un gel de apilamiento de alrededor del 4 % y un gel de resolución de alrededor del 10 % en condiciones reductoras y desnaturalizantes. Por ejemplo, se pueden utilizar 30 microgramos (|jg) de proteína total de cada cultivo y cargarlos en los pocillos de un gel. Después de pasar el gel y teñir las proteínas con azul brillante de Coomassie, los dos carriles se pueden comparar. Al determinar si una proteína se expresa o no a un nivel detectable, se resuelven 30 jg de proteína total de un cultivo en un gel SDS-PAGE y se tiñen con azul brillante de Coomassie utilizando métodos conocidos en la técnica. Se considera que una proteína que se puede visualizar a simple vista se expresa en un nivel detectable, mientras que una proteína que no se puede visualizar a simple vista se considera que no se expresa a un nivel detectable.

Como alternativa, si una proteína es una proteína regulada por metales o una proteína no regulada por metales se puede determinar mediante análisis de expresión génica basado en micromatrices. Se pueden cultivar cultivos separados de un microbio en condiciones de alto contenido de metales y en condiciones de bajo contenido de metales, El ARN se puede extraer de las células de cada cultivo, y se pueden detectar y comparar las diferencias en la expresión de ARN en células cultivadas en condiciones de alto contenido de metales frente a la expresión de ARN en células cultivadas en condiciones de bajo contenido de metales. Por ejemplo, el ADNc marcado se puede preparar a partir de 8-10 jg de ARN bacteriano usando protocolos establecidos. El ADNc marcado se puede aplicar a una micromatriz del genoma de un microbio. Dichas micromatrices están disponibles comercialmente y la evaluación de la expresión génica usando dichos arreglos es una rutina.

Las proteínas descritas en el presente documento pueden tener actividad inmunológica. "Actividad inmunológica" se refiere a la capacidad de una proteína para provocar una respuesta inmunológica en un animal. Una respuesta inmunológica a una proteína es el desarrollo en un animal de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a la proteína. Habitualmente, una respuesta inmunológica incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T colaboradores, linfocitos T supresores y/o linfocitos T citotóxicos, dirigidos a un epítopo o epítopos de la proteína. "Epítopo" se refiere al sitio en un antígeno al que responden los linfocitos B y/o los linfocitos T específicos para que se produzca el anticuerpo. La actividad inmunológica puede ser protectora. "Actividad inmunológica protectora" se refiere a la capacidad de una proteína para provocar una respuesta inmunológica en un animal que inhibe o limita la infección por P. multocida. Se puede determinar si una proteína tiene actividad inmunológica protectora mediante métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, métodos descritos en los Ejemplos 6-9 y 15-16. Una proteína puede tener actividad seroactiva.

Como se utiliza en el presente documento, "actividad seroactiva" se refiere a la capacidad de una proteína candidata para reaccionar con el anticuerpo presente en el suero convaleciente de un animal infectado con P. multocida.

Una proteína como se describe en el presente documento puede tener las características de una proteína de referencia. Las características pueden incluir, por ejemplo, peso molecular, impresión masiva, secuencia de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas. En una realización, una proteína se puede obtener a partir de un microbio. Un microbio puede expresar una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve de las proteínas descritas en el presente documento. La proteína de referencia se puede aislar a partir de un microbio gramnegativo, preferentemente un miembro de la familia Pasteurellaceae, incluyendo los géneros Pasteurella, Mannheimia o Haemophilus. Un miembro de los géneros Pasteurella Manheimia, y Haemophilus también se denomina en el presente documento Pasteurella spp., Manheimia spp. y Haemophilus spp., respectivamente. En una realización, la proteína de referencia es expresada a partir de P. multocida. En una realización, P. multocida puede ser el serotipo 2,5 o el serotipo 3,4.

Como se utiliza en el presente documento, una proteína puede ser "estructuralmente similar" a una proteína de referencia si la secuencia de aminoácidos de la proteína posee una cantidad específica de similitud de secuencia y/o identidad de secuencia en comparación con la proteína de referencia. Una proteína también puede ser "estructuralmente similar" a una proteína de referencia si la proteína muestra una impresión de masa que posee una cantidad específica de identidad en comparación con una impresión de masa comparable de la proteína de referencia. Por lo tanto, una proteína puede ser "estructuralmente similar" a una proteína de referencia si, en comparación con la proteína de referencia, posee un nivel suficiente de identidad de secuencia de aminoácidos, similitud de secuencia de aminoácidos o una combinación de los mismos. En una realización, una proteína descrita en el presente documento puede tener una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente similar, tal como se describe a continuación, a los aminoácidos 25-968 del SEQ ID NO:2, aminoácidos 27-790 del SEQ ID NO:4, aminoácidos 23-727 del SEQ ID NO:6, aminoácidos 25-964 del SEQ ID NO:8, aminoácidos 26-848 de SEQ ID NO: 10, aminoácidos 27-784 de SEQ ID NO: 12, los aminoácidos 25-742 del SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos 26-805 del SEQ ID NO:44.

Similitud de secuencia de proteínas e identidad de secuencia de proteínas

La similitud estructural de dos proteínas se puede determinar alineando los residuos de las dos proteínas (por ejemplo, una proteína candidata y cualquier proteína de referencia apropiada descrita en el presente documento) para optimizar el número de aminoácidos idénticos a lo largo de sus secuencias; se permiten huecos en una o ambas secuencias al realizar el alineamiento para optimizar el número de aminoácidos idénticos, aunque los aminoácidos en cada secuencia deben permanecer en su orden correcto. Una proteína de referencia puede ser una proteína descrita en el presente documento o cualquier proteína regulada por metales conocida, según sea apropiado. Los ejemplos de proteínas de referencia incluyen, pero sin limitación, aminoácidos 25-968 del SEQ ID NO:2, aminoácidos 27-790 del SEQ ID NO:4, aminoácidos 23-727 del SEQ ID NO:6, aminoácidos 25-964 del SEQ ID NO:8, aminoácidos 26-848 del SEQ ID NO:10, aminoácidos 27-784 del SEQ ID NO:12, los aminoácidos 25-742 del SEQ ID NO:14 y los aminoácidos 26-805 del SEQ ID NO:44. Una proteína candidata es la proteína que se compara con la proteína de referencia. Una proteína candidata se puede aislar, por ejemplo, a partir de un microbio o puede ser producido usando técnicas recombinantes, o sintetizado química o enzimáticamente.

A menos que se modifique como se describe de otro modo en el presente documento, se puede llevar a cabo un análisis de comparación por pares de secuencias de aminoácidos usando el algoritmo BESTFIT en el paquete GCG (versión 10.2, Madison WI). Como alternativa, las proteínas se pueden comparar usando el programa Blastp del algoritmo de búsqueda BLAST 2, como lo describe Tatiana et al. (FEMS Microbiol Lett, 174:247-250 (1999)), y disponible en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Se pueden usar los valores predeterminados para todos los parámetros de búsqueda de BLAST 2, incluyendo matriz = BLOSUM62; penalización por apertura de hueco = 11, penalización por extensión de espacio= 1, espacio x_dropoff = 50, expectativa = 10, tamaño de palabra = 3 y filtro activado.

En la comparación de dos secuencias de aminoácidos, la similitud estructural puede denominarse porcentaje de "identidad" o porcentaje de "similitud". "Identidad" se refiere a la presencia de aminoácidos idénticos. "Similitud" se refiere a la presencia no solo de aminoácidos idénticos sino también a la presencia de sustituciones conservadoras. Se puede seleccionar una sustitución conservadora de un aminoácido en una proteína se puede seleccionar entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica de la bioquímica de proteínas que un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular (tal como carga, hidrofobicidad o hidrofilicidad) puede sustituirse por otro aminoácido sin alterar la actividad de una proteína, particularmente en regiones de la proteína que no están directamente asociadas con la actividad. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones conservadoras incluyen, por ejemplo, Lys por Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu por Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser por Thr de modo que se mantenga un -OH libre; y Gln por Asn para mantener un -NH₂ libre. De manera análoga, también se contemplan análogos biológicamente activos de una proteína que contiene deleciones o adiciones de uno o más aminoácidos contiguos o no contiguos que no eliminan una actividad funcional, tales como, por ejemplo, la actividad inmunológica de la proteína.

Por lo tanto, como se utiliza en el presente documento, una proteína como se describe en el presente documento y/o la secuencia de aminoácidos de uno o más SEQ ID NO puede incluir una proteína con al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de similitud de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de referencia.

Como alternativa, como se utiliza en el presente documento, una proteína como se describe en el presente documento y/o la secuencia de aminoácidos de uno o más SEQ ID NO puede incluir una proteína con al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de referencia.

Las Figuras 15-21 muestran alineaciones Clustal Omega para proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14. Las alineaciones indican los aminoácidos que se conservan en las variantes de cada proteína a través de diferentes cepas de P. multocida y, para las figuras 15 y 21, Haemophilus influenzae. En las Figuras 15-21, un asterisco (*) indica las posiciones que tienen un solo resto totalmente conservado, dos puntos (:) indica la conservación entre grupos de propiedades muy similares como aproximadamente equivalente a una puntuación > 0,5 en la matriz Gonnet PAM 250, y un punto (.) indica la conservación entre grupos de propiedades débilmente similares como aproximadamente equivalente a una puntuación =< 0,5 y > 0 en la matriz Gonnet Matriz PAM 250. Un experto en la materia puede deducir a partir de dichos datos regiones de la proteína en las que las sustituciones, particularmente sustituciones conservadoras, puede permitirse sin afectar indebidamente a la actividad (actividad inmunológica, actividad inmunológica protectora o actividad seroactiva de la proteína modificada.

Por consiguiente, una proteína como se describe en el presente documento puede incluir ciertas variantes que incluyen, por ejemplo, proteínas homólogas que se originan biológica y/o recombinantemente a partir de especies o cepas microbianas distintas de la especie o cepa microbiana a partir de la cual se aisló y/o identificó originalmente la proteína.

Una proteína descrita en el presente documento también se puede diseñar para proporcionar una o más secuencias adicionales, tales como, por ejemplo, la adición de secuencias de codificación para aminoácidos C-terminal y/o N-terminal añadidos que pueden facilitar la purificación al capturar en columnas o usar anticuerpos. Tales etiquetas incluyen, por ejemplo, etiquetas ricas en histidina que permiten la purificación de proteínas en columnas de níquel. Tales técnicas de modificación de genes y secuencias adicionales adecuadas son bien conocidas en las técnicas de biología molecular. Una proteína como se describe en el presente documento también puede diseñarse de manera que se eliminen ciertos aminoácidos en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal.

Una proteína descrita en el presente documento puede incluir una "modificación". Una modificación se refiere a una derivatización química o enzimática en uno o más aminoácidos constituyentes. Tal modificación puede incluir, por ejemplo, una modificación de la cadena lateral, una modificación de la estructura principal, una modificación N-terminal y/o una modificación C-terminal tal como, por ejemplo, acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de un carbohidrato y/o resto lipídico, un cofactor y similares, y combinaciones de los mismos. Las proteínas modificadas como se describe en el presente documento pueden conservar la actividad biológica, tales como, por ejemplo, actividad inmunológica, de la proteína no modificada o puede presentar una actividad biológica reducida o aumentada en comparación con la proteína no modificada.

Una proteína como se describe en el presente documento (incluido un análogo biológicamente activo de la misma y/o una modificación de la misma) puede incluir una proteína nativa (de origen natural), recombinante, sintetizada químicamente o sintetizada enzimáticamente. Por ejemplo, una proteína como se describe en el presente documento se puede preparar aislando la proteína de una fuente natural o se puede preparar de forma recombinante mediante métodos convencionales que incluyen, por ejemplo, preparación como proteínas de fusión en bacterias u otras células huésped.

Similitud de secuencia de polinucleótidos e identidad de secuencia de polinucleótidos

Las proteínas tal como se describen en el presente documento también pueden identificarse en términos del polinucleótido que codifica la proteína. Por lo tanto, esta divulgación proporciona polinucleótidos que codifican una proteína como se describe en el presente documento o se hibridan, en condiciones estándar de hibridación, a un polinucleótido que codifica una proteína como se describe en el presente documento y las complementarias de tales secuencias de polinucleótidos.

Como se utiliza en el presente documento, un polinucleótido como se describe en el presente documento y/o la secuencia de ácido nucleico de una o más SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 43 o un fragmento del mismo, puede incluir polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia polinucleotídica de referencia identificada.

En este contexto, "identidad de secuencia" se refiere a la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos. La identidad de secuencia generalmente se determina alineando las bases de los dos polinucleótidos (por ejemplo, alineando la secuencia de nucleótidos de la secuencia candidata y una secuencia de nucleótidos que incluye, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento, tales como SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 43 o un fragmento de la misma) para optimizar el número de nucleótidos idénticos a lo largo de sus secuencias; se permiten huecos en una o ambas secuencias al hacer el alineamiento para optimizar el número de nucleótidos compartidos, aunque los nucleótidos de cada secuencia deben permanecer en el orden correcto. Una secuencia candidata es la secuencia que se compara con una secuencia conocida, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que incluye una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ó 13 o 43 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, se pueden comparar dos secuencias de polinucleótidos usando el programa Blastn del algoritmo de búsqueda BLAST 2, tal como lo describe Tatusova et al., (FEMS Microbiol Lett., 174:247-250 (1999)), y disponible en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Se pueden usar los valores predeterminados para todos los parámetros de búsqueda de BLAST 2, incluyendo recompensa por coincidencia = 1, penalización por falta de coincidencia = -2, penalización por apertura de hueco = 5, penalización por extensión de espacio= 2, espacio x_dropoff = 50, expectativa = 10, tamaño de palabra = 11 y filtro activado.

Finalmente, un polinucleótido como se describe en el presente documento puede incluir cualquier polinucleótido que codifique una proteína como se describe en el presente documento. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos del polinucleótido puede deducirse de la secuencia de aminoácidos que va a codificar el polinucleótido.

Esta divulgación también proporciona preparaciones de células enteras de microbios. En una realización, la preparación incluye un microbio que ha sido diseñado para expresar las proteínas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se puede diseñar un microbio para que exprese proteínas que tengan similitud estructural con el SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 44, o un fragmento de las mismas o cualquier subcombinación de esas ocho proteínas. El microbio puede ser cualquier célula microbiana susceptible de manipulación genética, incluyendo un microbio gramnegativo o grampositivo. Los ejemplos de microbios gramnegativos incluyen, pero sin limitación, E. coli, Salmonela spp., y Pasteurella spp., tales como P. multocida.

En una realización, la preparación incluye dos o más poblaciones de microbios. Cada una de las poblaciones no expresa todas las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14, o un fragmento de las mismas. Más bien, cada una de las poblaciones expresa un subconjunto de las siete proteínas, y las dos o más poblaciones cuando se consideran como un todo expresan las siete proteínas. Por ejemplo, en una realización, una población de microbios expresa las SEQ ID NO: 2, 4 y 6, y una segunda población de microbio expresa las SEQ ID NO: 8, 10, 12 y 14, o un fragmento de las mismas. Una población puede ser un microbio de tipo salvaje o un microbio modificado. Una preparación puede incluir uno o más microbios de tipo salvaje, uno o más microbios modificados o una combinación de microbios de tipo salvaje y modificados. Los ejemplos de células de tipo salvaje incluyen miembros del género Pasteurella, tales como P. multocida. En una realización, la célula es P. multocida atenuada. Los inventores han determinado que se espera que administrar ciertos tipos de cepas de Pasteurella como células enteras den como resultado propiedades inmunológicas que son diferentes al resultado de administrar las cepas individuales por separado. Las diferentes propiedades inmunológicas incluyen la capacidad de proteger contra cepas de P. multocida que tienen un serotipo diferente al de las células de P. multocida administradas al animal. En una realización, una célula entera es P. multocida de serotipo 2,5 y una segunda célula entera es P. multocida de serotipo 3,4 y uno expresa tres de las siete proteínas y el otro expresa cuatro de las siete proteínas. En una realización, una o más de las poblaciones de microbios pueden expresar el SEQ ID NO:44 o un fragmento de la misma.

Las células presentes en una preparación de células enteras pueden inactivarse de modo que las células no puedan replicarse, pero se mantiene la actividad inmunológica de las proteínas tal como se describe en el presente documento expresadas por el microbio. Normalmente, las células pueden morir por la exposición a agentes tales como glutaraldehído, formalina o formaldehído.

Composiciones

Las composiciones de la invención están definidas por las reivindicaciones. Se describe de otro modo una composición que puede incluir una proteína aislada descrita en el presente documento, al menos dos proteínas aisladas descritas en el presente documento, o un número de proteínas que es un número entero mayor que dos (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, en least15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20, y así sucesivamente). Por ejemplo, una composición que incluye una proteína descrita en el presente documento incluye una proteína idéntica o que tiene una similitud estructural con el SEQ ID NO: 44, o un fragmento de la misma. A menos que en el presente documento se indique expresamente un nivel específico de similitud de secuencia y/o identidad (por ejemplo, al menos un 80 % de similitud de secuencia, al menos un 90 % de identidad de secuencia, etc.), la referencia a la secuencia de aminoácidos de una SEQ ID NO identificada incluye variantes que tienen los niveles de similitud de secuencia y/o los niveles de identidad de secuencia descritos en el presente documento en la sección encabezada "Similitud de secuencia de proteínas e identidad de secuencia de proteínas".

Una proteína producida de forma recombinante puede expresarse a partir de un vector que permite la expresión de la proteína cuando el vector se introduce en una célula huésped apropiada. Se puede construir una célula huésped para producir una o más proteínas producidas de forma recombinante como se describe en el presente documento y, por lo tanto, puede incluir uno o más vectores que incluyen al menos un polinucleótido que codifica una proteína descrita en el presente documento. Por lo tanto, cada vector puede incluir uno o más polinucleótidos como se describe en el presente documento, es decir, un polinucleótido que codifica una proteína como se describe en el presente documento. Métodos para la manipulación genética de microbios, tales como P. multocida, son conocidos y habituales en la técnica.

Ciertas composiciones, tales como, por ejemplo, aquellas que incluyen proteínas producidas de forma recombinante, pueden incluir un número máximo de proteínas. En algunas realizaciones, el número máximo de proteínas puede referirse al número total máximo de proteínas. Ciertas composiciones pueden incluir, por ejemplo, no más de 50 proteínas, tales como, por ejemplo, no más de 40 proteínas, no más de 30 proteínas, no más de 25 proteínas, no más de 20 proteínas, no más de 17 proteínas, no más de 16 proteínas, no más de 15 proteínas, no más de 14 proteínas, no más de 13 proteínas, no más de 12 proteínas, no más de 11 proteínas, no más de 10 proteínas, no más de nueve proteínas, no más de ocho proteínas, no más de siete proteínas, no más de seis proteínas, no más de cinco proteínas, no más de cuatro proteínas, no más de tres proteínas, no más de dos proteínas o no más de una proteína. En otras realizaciones, de manera similar, se puede especificar un número máximo de proteínas producidas de forma recombinante. En aún otras realizaciones, de manera similar, se puede especificar un número máximo de proteínas producidas de forma no recombinante.

En una realización, una composición puede incluir proteínas que se pueden aislar de un microbio cuando el microbio está diseñado para expresar una o más proteínas idénticas o que tienen similitud estructural con una proteína descrita en el presente documento. En una realización, el microbio está diseñado para expresar proteínas idénticas o que tienen una similitud estructural con una o más de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 44, o un fragmento de las mismas. En una realización, el microbio expresa una proteína idéntica o que tiene una similitud estructural con el SEQ ID NO:44, o un fragmento de la misma. En una realización, una composición puede incluir proteínas que se pueden aislar de dos o más microbios. Por ejemplo, una composición puede incluir proteínas que se pueden aislar de dos o más de P. multocida de tipo salvaje.

En determinadas realizaciones, una composición puede incluir una preparación de células enteras. En una realización, la preparación es una célula entera que ha sido diseñada para expresar una o más proteínas idénticas o que tienen similitud estructural con una proteína descrita en el presente documento. En una realización, el microbio está diseñado para expresar proteínas idénticas o que tienen una similitud estructural con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14, o un fragmento de las mismas. En una realización, el microbio está diseñado para expresar proteínas que son idénticas o tienen una similitud estructural con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 44, o un fragmento de las mismas. En una realización, el microbio expresa una proteína idéntica o que tiene una similitud estructural con el SEQ ID NO: 44, o un fragmento de la misma. En una realización, la preparación es dos o más poblaciones de microbios donde cada una de las poblaciones expresa un subconjunto de las proteínas, por ejemplo, las siete proteínas (proteínas idénticas o que tienen similitud estructural con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14, o un fragmento de las mismas) o las ocho proteínas (proteínas idénticas o que tienen similitud estructural con las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 44, o un fragmento de las mismas) y las dos o más poblaciones cuando se consideran como un todo expresan las siete proteínas. En algunas de estas realizaciones, la célula entera puede ser P. multocida, tal como P. multocida de tipo salvaje. En algunas realizaciones, una composición puede incluir preparaciones de células enteras de dos, tres, cuatro, cinco o seis cepas.

Los ejemplos específicos de composiciones incluyen, pero sin limitación, los siguientes. En una realización, una composición incluye proteínas reguladas por metales y proteínas mejoradas. Las proteínas reguladas por metales se pueden aislar de P. multocida después del crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro y tienen pesos moleculares de 104 kDa a 75 kDa, tal como 99 kDa, 81 kDa y 80 KDa. Las proteínas pueden ser, o tener similitud estructural con, un fragmento de las SEQ ID NO: 6, 10 o 14. Las proteínas mejoradas se pueden aislar de P. multocida después del crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro y tienen pesos moleculares de 156 kDa a 146 kDa, tal como 151 kDa y de 114 kDa a 82 kDa, tal como 109 kDa, 89 kDa y 87 KDa. Las proteínas pueden ser, o tener similitud estructural con, un fragmento de las SEQ ID NO: 2, 4, 8 o 12. Opcionalmente, una composición puede incluir proteínas reguladas no metálicas que se pueden aislar de P. multocida. Las proteínas reguladas por no metales pueden tener pesos moleculares de 254 kDa a 244 kDa, tal como 249 kDa, de 65 kDa a 55 kDa, tal como 60 kDa y de 47 kDa a 17 kDa, tal como 42 kDa, 38 kDa, 27 kDa, 26 kDa y 22 KDa. Otro ejemplo específico de una composición es una que incluye una proteína que es, o tiene una similitud estructural con, un fragmento del SEQ ID NO:44 o un fragmento de la misma.

Opcionalmente, una proteína descrita en el presente documento puede unirse covalentemente a una proteína transportadora para mejorar las propiedades inmunológicas de la proteína. En la técnica se conocen proteínas portadoras útiles. El acoplamiento químico de una proteína descrito en el presente documento se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos y de rutina. Por ejemplo, se pueden usar varios reactivos reticulantes homobifuncionales y/o heterobifuncionales tales como suberato de bis(sulfosuccinimidilo), bis(diazobencidina), adipimidato de dimetilo, pimelimidato de dimetilo, superimidato de dimetilo, suberato de disuccinimidilo, glutaraldehído, m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, sulfo-m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, 4-(N-maleim¡domet¡l)c¡clohexano-1-carbox¡lato de sulfosuccinimidilo, 4-(p-maleimido-fenil)butirato de sulfosuccinimidilo y (1-etil-3-(dimetil-aminopropil)carbodiimida (Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, en general y el Capítulo 5, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, NY (1988)).

Las composiciones descritas en el presente documento pueden incluir bajas concentraciones de lipopolisacárido (LPS). LPS es un componente de la membrana externa de la mayoría de los microbios gramnegativos (véase, por ejemplo, Nikaido y Vaara, Outer Membrane, En: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Neidhardt et al., (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 7-22 (1987) y normalmente incluye polisacáridos (cadena O específica, el núcleo externo e interno) y la región del lípido A. El componente lípido A del LPS es el componente biológicamente más activo de la estructura del LPS y, en conjunto, induce un amplio espectro de efectos fisiopatológicos en los mamíferos. Los efectos más importantes son fiebre, coagulación intravascular diseminada, activación del complemento, shock hipotensor y muerte. La actividad inmunoestimuladora no específica de LPS puede potenciar la formación de un granuloma en el sitio de administración de composiciones que incluyen LPS. Tales reacciones pueden resultar en un estrés indebido en el animal por el cual el animal puede dejar de comer o beber durante un período de tiempo y agravar las afecciones infecciosas en el animal. Además, la formación de un granuloma en el lugar de la inyección puede aumentar la probabilidad de una posible degradación de la canal debido a cicatrices o manchas en el tejido del lugar de la inyección.

La concentración de LPS se puede determinar utilizando métodos de rutina conocidos en la técnica. Dichos métodos suelen incluir la medición de la unión del colorante por LPS (véase, por ejemplo, Keler y Nowotny, Analyt. Biochem., 156, 189 (1986)) o el uso de una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (véase, por ejemplo, Endotoxins and Their Detection With the Limulus Amebocyte Lystate Test, Alan R. Liss, Inc., 150 Fifth Avenue, Nueva York, NY (1982)). Hay cuatro métodos básicos disponibles comercialmente que se utilizan normalmente con una prueba LAL: la prueba del coágulo de gel; la prueba turbidimétrica (espectrofotométrica); la prueba colorimétrica; y la prueba cromogénica. Un ejemplo de un ensayo de coágulo de gel está disponible con el nombre comercial E-TOXATE (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; véase Sigma Technical Bulletin No. 210) y PYROTELL (Associates of Cape Cod, Inc., East Falmouth, MA). Normalmente, las condiciones del ensayo incluyen poner en contacto la composición con una preparación que contiene un lisado de los amebocitos circulantes del cangrejo herradura, Limulus polyphemus. Cuando se expone a LPS, el lisado aumenta tanto en opacidad como en viscosidad y puede gelificarse. Se añaden aproximadamente 0,1 mililitros de la composición al lisado. Normalmente, el pH de la composición está entre 6 y 8, preferentemente, entre 6,8 y 7,5. La mezcla de composición y lisado se incuba durante 1 hora sin perturbaciones a 37 °C. Después de la incubación, se observa la mezcla para determinar si hubo gelificación de la mezcla. La gelificación indica la presencia de endotoxina. Para determinar la cantidad de endotoxina presente en la composición, se hacen diluciones de una solución estandarizada de endotoxina y se prueban al mismo tiempo que se prueba la composición. Las soluciones estandarizadas de endotoxina están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Sigma Chemical (n.° de catálogo 210-SE), Farmacopea de Estados Unidos (Rockville, MD, N.° de catálogo 235503) y Associates of Cape Cod, Inc., (n.° de catálogo E0005). En general, cuando una composición de la presente invención se prepara aislando proteínas de un microbio, tales como P. multocida, mediante un método como se describe en el presente documento (por ejemplo, un método que incluye romper y solubilizar las células y recolectar las proteínas insolubles), la cantidad de LPS en una composición de la presente invención es menor que la cantidad de LPS presente en una mezcla de la misma cantidad del microbio que se ha disgregado en las mismas condiciones pero no solubilizado. Normalmente, el nivel de LPS en una composición de la presente invención se reduce en, en orden de preferencia creciente, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % en relación con el nivel de LPS en una composición preparada por disgregación, pero sin solubilizar, el mismo microbio.

Una composición descrita en el presente documento incluye opcionalmente además un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, vehículo, excipiente, sal, etc., que es compatible con los demás ingredientes de la composición y no perjudicial para el receptor de los mismos. Normalmente, la composición incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable cuando la composición se usa como se describe en el presente documento. Los vehículos de ejemplo farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones tampón y generalmente excluyen productos sanguíneos tales como, por ejemplo, sangre entera y/o plasma. Las composiciones que se describen en el presente documento pueden formularse en preparaciones farmacéuticas en diversas de formas adaptadas a la vía de administración elegida, incluyendo rutas adecuadas para estimular una respuesta inmunitaria a un antígeno. Por lo tanto, una composición como se describe en el presente documento se puede administrar a través de rutas conocidas que incluyen, por ejemplo, oral; parenteral, incluidas intradérmica, transcutánea y subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc. y tópicamente, tales como, intranasal, intrapulmonar, intramamaria, intravaginal, intrauterina, intradérmica, transcutánea y rectal, etc. Se prevé que una composición pueda administrarse a una superficie mucosa, tal como mediante administración a la mucosa nasal o respiratoria (por ejemplo, a través de un spray o aerosol), para estimular la inmunidad de las mucosas, tal como la producción de anticuerpos IgA secretores, en todo el cuerpo del animal.

Una composición como se describe en el presente documento también se puede administrar a través de un implante de liberación sostenida o retardada. Los implantes adecuados para su uso según la invención son conocidos e incluyen, por ejemplo, los descritos en la Publicación Internacional N.° WO 2001/037810 y/o la Publicación Internacional N.° WO 1996/001620. Los implantes se pueden producir en tamaños lo suficientemente pequeños para ser administrados por aerosol o spray. Los implantes también pueden incluir nanoesferas y microesferas.

Una composición de la presente invención se administra en una cantidad suficiente para proporcionar una respuesta inmunológica a las proteínas o células enteras descritas en el presente documento. La cantidad de proteína presente en una composición puede variar. Por ejemplo, la dosis de proteína puede estar entre 0,01 microgramos (|jg) y 3000 miligramos (mg), normalmente entre 100 μg y 2000 ug. Cuando la composición es una preparación de células enteras, las células pueden estar presentes en una concentración de 106 bacterias/ml, 107 bacterias/ml, 108 bacterias/ml o 109 bacterias/ml. Cuando se administra una mezcla de células enteras (por ejemplo, una población de células que expresa un subconjunto de proteínas y una segunda población que expresa otro subconjunto de proteínas), la proporción de poblaciones puede ser 1:1. Para una composición inyectable (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, etc.) la proteína está preferentemente presente en la composición en una cantidad tal que el volumen total de la composición administrada es de 0,5 ml a 5,0 ml, normalmente 1,0-3,0 ml. Cuando la composición es una preparación de células enteras, las células están preferentemente presentes en la composición en una cantidad en la que el volumen total de la composición administrada es de 0,5 ml a 5,0 ml, normalmente de 1,0-2,0ml. La cantidad administrada variará dependiendo de varios factores que incluyen, pero sin limitación, las proteínas o células específicas elegidas, el peso, el estado físico y la edad del animal, y la vía de administración. Por lo tanto, el peso absoluto de la proteína o el número de células incluidas en una forma de dosificación unitaria determinada puede variar y depende de factores como la especie, la edad, el peso y el estado físico del animal, así como el procedimiento de administración. Un experto en la materia puede determinar dichos factores. Otros ejemplos de dosis adecuadas para la invención se desvelan en Emery et al. (Patente de EE.UU. 6.027.736).

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos para preparar una composición que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen el paso de asociar el compuesto activo (por ejemplo, una proteína o célula entera descrita en el presente documento) con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el compuesto activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en las formulaciones deseadas.

Una composición que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable también puede incluir un adyuvante. Un "adyuvante" se refiere a un agente que puede actuar de manera no específica para mejorar una respuesta inmunitaria a un antígeno particular, reduciendo así potencialmente la cantidad de antígeno necesaria en cualquier composición inmunitaria dada y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmunitaria adecuada al antígeno de interés. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, IL-1, IL-2, emulsionantes, dipéptidos de muramilo, bromuro de dimetildiocradecilamonio (DDA), avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas, alfa-tocoferol, polisacáridos, parafinas emulsionadas (disponibles con el nombre comercial EMULSIGEN de MVP Laboratories, Ralston, Nebraska), ISA-70, RIBI y otras sustancias conocidas en la materia.

En otra realización, una composición que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir un modificador de la respuesta biológica, tales como, por ejemplo, IL-2, IL-4 y/o IL-6, TNF, IFN-alfa, IFN-gamma y otras citocinas que afectan a las células inmunitarias. Una composición también puede incluir un antibiótico, conservante, antioxidantes, agentes quelantes, etc. Dichos componentes son conocidos en la materia.

Métodos de elaboración

Esta divulgación también proporciona métodos para obtener las proteínas y las células enteras descritas en el presente documento. Las proteínas y las preparaciones de células enteras descritas en el presente documento se pueden obtener incubando un microbio, tales como P. multocida, en condiciones que promuevan la expresión de una o más de las proteínas descritas en el presente documento. Las proteínas y las células enteras, tal como se describen en el presente documento, pueden aislarse de un microbio diseñado para expresar de forma recombinante una o más de las proteínas. En una realización, se usa el serotipo 2,5 o el serotipo 3,4 de P. multocida. Además, dichos microbios se pueden obtener fácilmente mediante técnicas rutinarias y conocidas en la técnica. Los microbios pueden derivarse de un animal infectado como un aislado de campo y usarse para obtener las proteínas y/o las preparaciones de células enteras como se describe en el presente documento, o almacenarse para uso futuro, por ejemplo, en un depósito congelado entre -20 °C y -95 °C, o entre -40 °C y -50 °C, en medios bacteriológicos que contengan 20 % de glicerol y otros medios similares.

Las composiciones de la presente invención pueden prepararse mediante los procesos desvelados en el presente documento. Normalmente, tales condiciones son condiciones de bajo contenido de metales. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones de bajo contenido de metales" se refiere a un entorno, normalmente un medio bacteriológico que contiene cantidades de un metal libre que hacen que un microbio exprese una proteína regulada por metal a un nivel detectable. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones de alto contenido de metales" se refiere a un entorno que contiene una cantidad de un metal libre que hace que un microbio exprese una proteína regulada por metales a un nivel menor en comparación con la expresión de la proteína regulada por metales en condiciones de bajo contenido de metales. En algunos casos, "condiciones de alto contenido de metales" puede referirse a un entorno que provoca que una célula no exprese una o más de las proteínas reguladas por metales descritas en el presente documento a un nivel detectable.

En algunos casos, las "condiciones de alto contenido en metales" pueden incluir un entorno natural rico en metales y/o un cultivo en un medio rico en metales sin un quelante de metales. Por el contrario, en algunos casos, las "condiciones de bajo contenido de metales" pueden incluir el cultivo en un medio que incluye un quelante de metales, como se describe con más detalle a continuación. Los metales son los presentes en la tabla periódica en los Grupos 1 a 17 (notación IUPAC; también denominados Grupos I-A, II-A, III-B, IV-B, V-B, VI-B, VII-B, VIII, I-B, II-B, III-A, IV-A, V-A, VI-A y VII-A, respectivamente, como notación CAS). Preferentemente, los metales son los de los Grupos 2 a 12, más preferentemente, Grupos 3-12. Incluso más preferentemente, el metal es hierro, cinc, cobre, magnesio, níquel, cobalto, manganeso, molibdeno o selenio, lo más preferentemente, hierro, cobre o cinc.

Las condiciones de bajo contenido de metales son generalmente el resultado de la adición de un compuesto quelante de metales a un medio bacteriológico, el uso de un medio bacteriológico que contiene bajas cantidades de un metal o una combinación de los mismos. Las condiciones de alto contenido de metales generalmente están presentes cuando un quelante no está presente en el medio, cuando se añade un metal al medio o una combinación de los mismos. Los ejemplos de quelantes de metales incluyen compuestos naturales y sintéticos. Los ejemplos de compuestos naturales incluyen compuestos fenólicos de plantas, tales como flavonoides. Los ejemplos de flavonoides incluyen el quelante de hierro miricetina. Los ejemplos de quelantes de hierro sintéticos incluyen 2,2'-dipiridilo (también denominado en la técnica como 2,2'-bipiridilo), 8-hidroxiquinolina, ácido etilendiamino-di-O-hidroxifenilacético (EDDHA), desferrioxamina metanosulfonato (desferol), transferrina, lactoferrina, ovotransferrina, sideróforos biológicos, tales como los catecolatos e hidroxamatos, y citrato.

En una realización, se usa 2,2'-dipiridilo para la quelación del hierro. Normalmente, se añade 2,2'-dipiridilo al medio a una concentración de al menos 0,0025 microgramos/mililitro (μg/ml), al menos 0,025 μg/ml o al menos 0,25 μg/ml. Los niveles altos de 2,2'-dipiridilo pueden ser de 10 μg/ml, 20 μg/ml o 30 μg/ml.

Normalmente, se añade TPEN al medio a una concentración de al menos 25 micromolar (μM), al menos 50 μM o al menos 70 μM. En una realización, TPEN puede ser de 70 μM para la expresión del polipéptido descrito en el presente documento, y también se pueden usar niveles más altos.

Se espera que P. multocida con una mutación en un gen fur resultará en la expresión constitutiva de muchas, si no todas, de las proteínas reguladas por metales de la presente invención. La producción de una mutación fur en P. multocida puede realizarse usando métodos de rutina incluyendo, por ejemplo, electroporación y construcciones genéticas útiles para la desactivación de genes en bacterias gramnegativas.

En una realización, el microbio, tal como P. multocida, utilizado para elaborar una composición descrita en el presente documento, por ejemplo, una composición que incluye proteínas aisladas o una composición que incluye células enteras, puede producirse utilizando P. multocida que se ha diseñado para expresar de forma recombinante una o más de las proteínas descritas en el presente documento. En una realización, P. multocida que expresa una o más de las proteínas puede modificarse para expresar las otras. En una realización, tal P. multocida se incuba en presencia de condiciones de bajo contenido de hierro, y la una o más proteínas recombinantes se expresan durante la incubación en condiciones de bajo contenido de hierro. El resultado es P. multocida que expresa proteínas reguladas por hierro y la una o más proteínas recombinantes.

Muchas Pasteurella spp. son capaces de crecer en condiciones de bajo contenido de metales in vitro en medios artificiales sólo después de la adaptación. Por ejemplo, una Pasteurella spp. se puede adaptar a condiciones de bajo contenido de hierro in vitro por crecimiento en presencia de bajas concentraciones de un quelante de hierro y, después del crecimiento en un medio que contiene el quelante, aumentando gradualmente la concentración del quelante. Por ejemplo, una Pasteurella spp. puede adaptarse al crecimiento en condiciones de bajo contenido de hierro añadiendo 0,0025 μg/ml de 2,2'-dipiridilo a un medio y aumentando gradualmente la concentración del quelante hasta una concentración mayor, por ejemplo 25 μg/ml.

El medio utilizado para incubar el microbio no es crítico y las condiciones útiles para el cultivo de P. multocida son conocidos por el experto. El volumen de medio utilizado para incubar el microbio puede variar. Cuando el microbio P. multocida se está evaluando para determinar la capacidad de producir las proteínas descritas en el presente documento, el microbio se puede cultivar en un volumen adecuado, por ejemplo, 10 mililitros a 1 litro de medio. Cuando se cultiva un microbio para obtener proteínas para su uso en, por ejemplo, administración a animales, el microbio puede cultivarse en un biorreactor para permitir el aislamiento de mayores cantidades de proteínas. Los métodos para cultivar microbios en un biorreactor son rutinarios y conocidos en la técnica. Las condiciones utilizadas para el crecimiento de un microbio incluyen preferentemente un quelante de metales, más preferentemente un quelante de hierro, por ejemplo 2,2'-dipiridilo, TPEN o quercetina, un pH de entre 6,5 y 7,5, preferentemente entre 6,9 y 7,1, y una temperatura de 37 °C. Cuando se utiliza un fermentador, el cultivo se puede purgar con un gas apropiado para reducir el contenido de oxígeno disuelto. El nitrógeno es un ejemplo de tal gas. El oxígeno disuelto se puede regular automática o manualmente mediante agitación, la introducción de aire estéril u oxígeno puro al cultivo.

En algunos aspectos de la invención, P. multocida se puede cosechar después del crecimiento. La recolección incluye concentrar el microbio en un volumen más pequeño y suspenderlo en un medio diferente al medio de crecimiento. Los métodos para concentrar un microbio son rutinarios y conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, filtración y/o centrifugación. Normalmente, el microbio concentrado se suspende en cantidades decrecientes de tampón. Preferentemente, el tampón final incluye un quelante de metales, preferentemente, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés). Un ejemplo de tampón que se puede utilizar contiene Tris-base (7,3 gramos/litro) y EDTA (0,9 gramos/litro), a un pH de 8,5. Opcionalmente, el tampón final también minimiza la degradación proteolítica. Esto se puede lograr teniendo el tampón final a un pH superior a 8,0, preferentemente, al menos 8,5, y/o incluyendo uno o más inhibidores de proteinasa (por ejemplo, fluoruro de fenilmetanosulfonilo). Opcionalmente y preferentemente, el microbio concentrado se congela a -20 °C o menos hasta que se rompe. En una realización, las células bacterianas se pueden concentrar en un sedimento mediante, por ejemplo, centrifugación, y las células concentradas suspendidas en tampón de choque osmótico (OMS; 7,26 gramos/litro Tris-base y 0,93 gramos/litro EDTA ajustado a un pH de 8,5). La proporción de células a OMS puede ser de 50 gramos de sedimento celular, 60 gramos de sedimento celular o 70 gramos de sedimento celular por 1 litro de OMS. La suspensión de células en OMS se puede incubar a 2-8 °C durante al menos 24 horas, al menos 48 horas o al menos 60 horas para eliminar el exceso de endotoxina de las células. En una realización, la incubación es durante no más de 72 horas. Después de la incubación, la suspensión se centrifuga nuevamente y el sobrenadante se descarta para eliminar la endotoxina libre y cualquier material extracelular, por ejemplo, proteínas secretadas.

Cuando P. multocida se va a utilizar como una preparación de células enteras, las células recogidas pueden procesarse utilizando métodos habituales y conocidos para inactivar las células. Como alternativa, cuando P. multocida se va a utilizar para preparar proteínas de la presente invención, P. multocida puede romperse usando métodos químicos, físicos o mecánicos rutinarios y conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, prensa francesa, ultrasonidos u homogeneización. Preferentemente, se utiliza homogeneización. Como se utiliza en el presente documento, "perturbación" se refiere a la rotura de la célula. La rotura de un microbio se puede medir mediante métodos que son rutinarios y conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, cambios en la densidad óptica. Normalmente, un microbio se somete a alteración hasta que el porcentaje de transmitancia aumenta en un 20 % cuando se mide una dilución de 1:100. La temperatura durante la interrupción normalmente se mantiene a 4 °C, para minimizar aún más la degradación proteolítica.

El microbio alterado se solubiliza en un detergente, por ejemplo, un detergente aniónico, zwitteriónico, no iónico o catiónico. Preferentemente, el detergente es sarcosina, más preferentemente, lauroilsarcosinato de sodio. Como se utiliza en el presente documento, el término "solubilizar" se refiere a disolver materiales celulares (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos) en la fase acuosa del tampón en el que se rompió el microbio y la formación de agregados de materiales celulares insolubles. Las condiciones para la solubilización preferentemente dan como resultado la agregación de proteínas de la presente invención en agregados insolubles que son lo suficientemente grandes para permitir un fácil aislamiento mediante, por ejemplo, centrifugación.

Preferentemente, la sarcosina se añade de manera que la proporción final de sarcosina por gramo de peso del microbio alterado esté entre 1,0 gramos de sarcosina por 4,5 gramos de masa de sedimento y 6,0 gramos de sarcosina por 4,5 gramos de masa de sedimento, preferentemente, 4,5 gramos de sarcosina por 4,5 gramos de masa de sedimentos. La solubilización del microbio se puede medir por métodos que son rutinarios y conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, cambios en la densidad óptica. Normalmente, se permite que se produzca la solubilización durante al menos 24 horas, más preferentemente, al menos 48 horas, lo más preferentemente, al menos 60 horas. La temperatura durante la rotura generalmente se mantiene baja, preferentemente a 4 °C.

Los agregados insolubles que incluyen las proteínas descritas en el presente documento pueden aislarse mediante métodos que son rutinarios y conocidos en la técnica, tales como centrifugación, filtración o una combinación de las mismas. En una realización, los agregados insolubles se aíslan mediante filtración, tal como filtración tangencial o de flujo cruzado. Los ejemplos de un límite de peso molecular para su uso con filtración tangencial son 100 kDa o 300 kDa. En una realización, un sistema de filtración tangencial tiene un tamaño de poro de 0,2 micrómetros. La filtración tangencial puede ayudar a eliminar la sarcosina residual de la suspensión de proteínas. La filtración tangencial da como resultado la concentración de la suspensión de proteínas. Por lo tanto, los agregados insolubles se pueden aislar a un coste significativamente menor.

En una realización, la sarcosina se elimina de las proteínas aisladas. Los métodos para eliminar la sarcosina de las proteínas aisladas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diafiltración, precipitación, cromatografía hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y ultrafiltración y lavado de las proteínas en alcohol, tal como alcohol isopropílico, mediante diafiltración. Después del aislamiento, las proteínas suspendidas en tampón y almacenadas a baja temperatura, por ejemplo, -20 °C o menos.

En aquellos aspectos de la presente invención en los que se va a realizar una preparación de células enteras, después del crecimiento, el microbio se puede matar con la adición de un agente tal como glutaraldehído, formalina o formaldehído, a una concentración suficiente para inactivar las células en el cultivo. Por ejemplo, se puede añadir formalina a una concentración de 0,3 % (vol:vol). Tras un período de tiempo suficiente para inactivar las células, las células pueden ser recolectadas mediante, por ejemplo, diafiltración y/o centrifugación, y lavado.

En otros aspectos, una proteína aislada se puede preparar de forma recombinante. Cuando se prepara de forma recombinante, un polinucleótido que codifica la proteína puede identificarse y clonarse en un huésped de expresión apropiado. El huésped de expresión recombinante puede crecer en un medio apropiado, alterarse y aislarse las proteínas como se ha descrito anteriormente.

Métodos de uso

También se proporcionan métodos para usar las composiciones descritas en el presente documento. Los métodos incluyen la administración a un animal de una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, una "cantidad eficaz" de una composición descrita en el presente documento es la cantidad capaz de provocar la respuesta deseada en el receptor. La composición se puede administrar en un momento en que el anticuerpo materno puede estar presente, por ejemplo, tan pronto como al día de edad, o en un momento posterior durante la vida del animal. En una realización, la composición se administra antes del destete, o en el momento del destete del animal (cuando el animal empieza a acostumbrarse a alimentos distintos a la leche materna). El animal puede ser, por ejemplo, pescado, ave (incluyendo, por ejemplo, pollos o pavos), bóvidos (incluyendo, por ejemplo, ganado), cápridos (incluyendo, por ejemplo, cabras), óvidos (incluyendo, por ejemplo, ovejas), ganado porcino (incluyendo, por ejemplo, cerdos), bisontes (incluyendo, por ejemplo, búfalo), équidos (incluyendo, por ejemplo, caballos), un animal de compañía (incluyendo, por ejemplo, un perro o un gato), miembros de la familia Cervidae (incluyendo, por ejemplo, ciervos, alces europeos, alces americanos, caribú y reno) o un ser humano. Los ejemplos de animales de compañía incluyen perros y gatos. En una realización, un animal es un ratón. En una realización, un animal es un animal con pezuñas.

Los métodos descritos en el presente documento se refieren a microbios gramnegativos. La invención reivindicada se refiere a composiciones y composiciones para su uso en métodos relevantes para Pasteurella multocida. Se describe de otro modo en el presente documento que un microbio gramnegativo incluye, pero sin limitaciones, miembros de la familia Pasteurellaceae, tal como Pasteurella spp. (incluidos, por ejemplo, P. multocida y P. haemolytica), Photobacterium damsela subsp., piscicida anteriormente conocida como Pasteurella piscicida, Manheimia spp. y Haemophilus spp., miembros de la familia Vibrionaceae (incluyendo, por ejemplo, Vibrio cholerae), Campylobacter spp. (incluido, por ejemplo, C. jejuni), miembros de la familia Enterobacteriaceae (incluyendo, por ejemplo, Klebsiella spp., E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Proteo spp., Serratia spp. y Yersinia spp.), y miembros de la familia Pseudomonadaceae, preferentemente Pseudomonas spp., (incluyendo, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa). Los ejemplos de Klebsiella spp. incluyen K. pneumoniae y K. oxytoca. Los ejemplos de Salmonela spp. incluyen Salmonella enterica serovares., Bredeney, Dublín, Agona, Blockley, Enteriditis, Typhimurium, Hadar, Heidelberg, Montevideo, Muenster, Newport senftenberg, Salmonella cholerasuis y S. typhi. Los ejemplos de cepas de P. multocida incluyen, por ejemplo, los serotipos de P. multocida de 1 a 16 (serotipo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16) de masa de gránulos o combinaciones de los mismos (por ejemplo, 2,5, también denominado 2x5 [ambos serotipos 2 y 5 son expresados por aP. multocida) o 3, 4 también denominado 3x4 [ambos serotipos 3 y 4 son expresados por P. multocida]). Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen, por ejemplo, E. coli de serotipo O1a, O₂a, O78 y 0157; diferentes serotipos O:H, incluidos 0104, 0111, 026, 0113, 091; cepas hemolíticas de E. coli enterotoxigénica, tal como las cepas enterotoxigénicas de E. coli, tales como K88+, F4+, F18ab+ y F18ac+; enteropatogénicas (EPEC), enterohemorrágicas (ECEH), enteroinvasivas (EIEC) y enteroagregativas (EAEC) de E. coli; y E. coli capaz de causar infecciones extraintestinales, tales como cepas uropatógenas. El microbio gramnegativo puede ser un microbio patógeno. Patógenos respiratorios, tales como Bordetella, especies tales como B. bronchiseptica, B. tos ferina y B. parapertussis, y B. avium.

En algunas realizaciones, un método puede incluir además administraciones adicionales (por ejemplo, una o más administraciones de refuerzo) de la composición al animal para potenciar o estimular una respuesta inmunitaria secundaria. Se puede administrar un refuerzo en un momento posterior a la primera administración, por ejemplo, de una a ocho semanas, preferentemente de dos a cuatro semanas, después de la primera administración de la composición. Los refuerzos posteriores se pueden administrar una, dos, tres, cuatro o más veces al año. Sin pretender quedar limitados a teoría alguna, se espera que en algunas realizaciones no sean necesarios refuerzos anuales, como un animal será expuesto al campo por la exposición a microbios que expresan proteínas que tienen epítopos que están estructuralmente relacionados con epítopos presentes en proteínas de la composición administrada al animal.

En una realización, un método incluye producir anticuerpos contra una proteína descrita en el presente documento, por ejemplo, induciendo la producción de anticuerpos en un animal o mediante técnicas recombinantes. El anticuerpo producido incluye un anticuerpo que se une específicamente a al menos una proteína presente en la composición. En esta realización, una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz para dar como resultado la producción de anticuerpo en el animal. Los métodos para determinar si un animal ha producido anticuerpos que se unen específicamente a una proteína presente en una composición descrita en el presente documento pueden determinarse usando métodos de rutina. Se describe de otro modo un anticuerpo que se une específicamente a una proteína descrita en el presente documento y composiciones que incluyen dichos anticuerpos.

Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo que puede "unirse específicamente" a una proteína es un anticuerpo que interactúa con el epítopo del antígeno que indujo la síntesis del anticuerpo, o interactúa con un epítopo estructuralmente relacionado. Al menos algunos de los epítopos presentes en las proteínas descritas aquí son epítopos que se conservan en las proteínas de diferentes especies y diferentes géneros de microbios. Por consiguiente, se espera que el anticuerpo producido utilizando una proteína descrita en el presente documento se una a proteínas expresadas por más de una especie de microbio y proporcione protección de amplio espectro contra microbios gramnegativos.

Se desvela de otro modo un método que incluye el tratamiento de una infección en un animal, causada por un microbio gramnegativo. Como se utiliza en el presente documento, el término "infección" se refiere a la presencia de un microbio gramnegativo en el cuerpo de un animal, que pueden o no ser clínicamente evidentes. El tratamiento de una infección puede ser profiláctico, de acuerdo con la invención reivindicada, o, como alternativa, puede iniciarse después de que el animal esté infectado por el microbio. El tratamiento que es profiláctico, por ejemplo, iniciado antes de que un sujeto sea infectado por un microbio o mientras cualquier infección permanezca subclínica, se denomina en el presente documento tratamiento de un sujeto que está "en riesgo" de infección. Como se utiliza en el presente documento, el término "en riesgo" se refiere a un animal que puede o no poseer realmente el riesgo descrito. Por lo tanto, normalmente, un animal "en riesgo" de infección por un microbio es un animal presente en un área donde los animales han sido identificados como infectados por el microbio y/o es probable que estén expuestos al microbio incluso si el animal aún no ha manifestado ninguna indicación detectable de infección por el microbio e independientemente de si el animal puede albergar una cantidad subclínica del microbio. Por consiguiente, la administración de una composición se puede realizar antes, durante o después del primer contacto del animal con el microbio. El tratamiento iniciado después del primer contacto del animal con el microbio puede resultar en una disminución de la gravedad de los síntomas y/o signos clínicos de infección por el microbio, eliminando completamente el microbio y/o disminuyendo la probabilidad de experimentar una infección clínicamente evidente en comparación con un animal al que no se administra la composición. El método incluye administrar una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento a un animal que tiene, o corre el riesgo de tener, una infección causada por un microbio gramnegativo y determinar si el número de microbios que causan la infección ha disminuido. En este caso, una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz para reducir el número de microbios especificados en un animal o reducir la probabilidad de que el animal experimente una infección clínicamente evidente en comparación con un animal al que no se administra la composición. Los métodos para determinar si una infección es causada por un microbio gramnegativo son rutinarios y conocidos en la técnica, al igual que los métodos para determinar si la infección ha disminuido. El tratamiento exitoso de una infección microbiana gramnegativa en un animal se describe en los Ejemplos 15-16, lo que demuestra que una composición descrita en el presente documento elaborada a partir de dos cepas de P. multocida, un serotipo 2x5 y un serotipo 3x4, protegió a pollos de la exposición a P. multocida de serotipo 1.

Se desvela de otro modo un método que incluye el tratamiento de uno o más síntomas o signos clínicos de ciertas afecciones en un animal que pueden ser causados por una infección por un microbio gramnegativo. El método incluye administrar una cantidad efectiva de una composición descrita en el presente documento a un animal que tiene o está en riesgo de tener una afección o que presenta síntomas y/o signos clínicos de una afección y determinar si cambia al menos un síntoma y/o signo clínico de la afección, preferentemente, se reduce. En un caso, el animal tiene una afección causada por un miembro de la familia Pasteurellaceae, tal como Pasteurella spp. (incluidos, por ejemplo, P. multocida, P. haemolytica, y P. anatipestifer), Manheimia spp., o Haemophilus spp. Los ejemplos de afecciones incluyen, pero sin limitación, cólera aviar, enfermedad nueva del pato, complejo de enfermedades respiratorias bovinas (también conocida como neumonía por fiebre del transporte o simplemente neumonía), septicemia hemorrágica en ganado bovino, búfalos y bisontes en áreas tropicales y subtropicales; neumonía y rinitis atrófica en cerdos; catarros en conejos; y mastitis y neumonía en ovejas. Mannheimia haemolytica, también conocida como Pasteurella haemolytica, puede causar pleuroneumonía fibrinosa involucrada en el complejo de fiebre del transporte en bovinos, septicemia en neonatos y neumonía y mastitis en ovejas adultas. Haemophilus spp. puede causar la enfermedad de Glasser en cerdos, coriza aviar en pollos, metritis contagiosa equina. P. multocida puede causar cólera aviar que, en la forma peraguda, es una de las enfermedades más virulentas y altamente infecciosas de las aves de corral. P. anatipestífero puede causar la enfermedad nueva de los patos (también conocida como septicemia de los patos o serositis infecciosa).

El tratamiento de los síntomas y/o signos clínicos asociados con condiciones causadas por infección por un microbio gramnegativo puede ser profiláctico o, como alternativa, puede iniciarse después del desarrollo de una afección descrita en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, el término "síntoma" se refiere a la evidencia subjetiva de una enfermedad o condición experimentada por el paciente y causada por una infección por un microbio. Como se utiliza en el presente documento, el término "signo clínico" o, simplemente, "signo" se refiere a la evidencia objetiva de una enfermedad o condición causada por una infección por un microbio. Los síntomas y/o signos clínicos asociados con las condiciones a las que se hace referencia en el presente documento y las evaluaciones de dichos síntomas son rutinarios y conocidos en la técnica. El tratamiento que es profiláctico, por ejemplo, iniciado antes de que un sujeto manifieste síntomas o signos de una condición causada por un microbio, se denomina en el presente documento tratamiento de un sujeto que está "en riesgo" de desarrollar la afección. Por lo tanto, normalmente, un animal "en riesgo" de desarrollar una afección es un animal presente en un área donde los animales que padecen la afección han sido diagnosticados y/o es probable que estén expuestos a un microbio que causa la afección, incluso si el animal aún no ha manifestado síntomas o signos de cualquier condición causada por el microbio. Por consiguiente, la administración de una composición se puede realizar antes, durante o después de la aparición de las afecciones descritas en el presente documento. Los síntomas y/o signos clínicos provocados por una infección microbiana gramnegativa son conocidos por el experto en la materia. Los ejemplos de síntomas y/o signos clínicos incluyen, pero sin limitación, neumonía, depresión y toxemia, fiebre, secreción nasal grave a mucopurulenta, tos húmeda, una frecuencia respiratoria superficial y rápida, abscesos y lesiones en los pulmones de bovinos y porcinos; septicemia aguda, infecciones articulares y artritis en aves de corral y aves silvestres; atrofia de cornetes en cerdos; abscesos superficiales en gatos; infecciones de heridas por mordedura en humanos, generalmente por mordeduras de perros o gatos. El tratamiento iniciado después del desarrollo de una afección puede resultar en la disminución de la gravedad de los síntomas o signos de una de las afeccione o en la eliminación completa de los síntomas o signos. En este caso, una "cantidad efectiva" es una cantidad efectiva para prevenir la manifestación de síntomas o signos de una enfermedad, disminuir la gravedad de los síntomas o signos de una enfermedad y/o eliminar completamente los síntomas o signos.

Se describe de otro modo un método para disminuir la colonización por un microbio gramnegativo, por ejemplo, bloqueando los sitios de unión de un microbio gramnegativo, incluyendo tejidos del sistema esquelético (por ejemplo, huesos, cartílago, tendones y ligamentos), sistema muscular, (por ejemplo, músculos esqueléticos y lisos), sistema circulatorio (por ejemplo, corazón, vasos sanguíneos, capilares y sangre), sistema nervioso (por ejemplo, cerebro, médula espinal y nervios periféricos), sistema respiratorio (por ejemplo, nariz, pulmones traqueales, bronquios, bronquiolos, alvéolos), sistema digestivo (por ejemplo, boca, glándulas salivales, esófago, hígado, estómago, intestino grueso y delgado), sistema excretor (por ejemplo, riñón, uréter, vejiga y uretra), sistema endocrino (por ejemplo, hipotálamo, hipófisis, tiroides, páncreas y glándulas suprarrenales), aparato reproductor (por ejemplo, ovarios, oviducto, útero, la vagina, glándulas mamarias, testículos y vesículas seminales), sistema linfático/inmunitario (por ejemplo, linfa, ganglios linfáticos y vasos, glóbulos blancos o mononucleares, tales como los macrófagos, neutrófilos, monocitos, eosinófilos, basófilos y linfocitos, incluyendo linfocitos T y linfocitos B), y linajes celulares específicos (por ejemplo, células precursoras, células epiteliales, células madre), y similares.

La disminución de la colonización en un animal puede realizarse profilácticamente, de acuerdo con la invención reivindicada, o, como alternativa, puede iniciarse después de que el animal haya sido colonizado por el microbio. El tratamiento que es profiláctico, por ejemplo, iniciado antes de que un sujeto sea colonizado por un microbio o mientras no se detecte ninguna colonización, se denomina en el presente documento tratamiento de un sujeto que está "en riesgo" de ser colonizado por el microbio. Por lo tanto, normalmente, un animal "en riesgo" de colonización por un microbio es un animal presente en un área donde los animales han sido identificados como colonizados por el microbio y/o es probable que estén expuestos al microbio incluso si el animal aún no ha manifestado ninguna indicación detectable de colonización por el microbio e independientemente de que el animal pueda albergar un número de subcolonización del microbio. Por consiguiente, la administración de una composición se puede realizar antes, durante o después del primer contacto del animal con el microbio. El tratamiento iniciado después del primer contacto del animal con el microbio puede resultar en una disminución del grado de colonización por el microbio, eliminación completa del microbio y/o disminución de la probabilidad de que el animal sea colonizado por el microbio en comparación con un animal al que no se administra la composición. Por lo tanto, el método incluye administrar una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento a un animal colonizado por, o en riesgo de ser colonizado por, un microbio gramnegativo. En este caso, una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para disminuir la colonización del animal por el microbio, donde la disminución de la colonización se refiere a uno o más de: disminución del grado de colonización por el microbio, eliminación completa del microbio y/o disminución de la probabilidad de que el animal sea colonizado por el microbio en comparación con un animal al que no se administra la composición. Los métodos para evaluar la colonización de un animal por un microbio son habituales y conocidos en la técnica. Por ejemplo, la colonización de las vías respiratorias de un animal por un microbio puede determinarse midiendo la presencia del microbio en las muestras del animal de las vías respiratorias inferiores mediante un hisopo traqueal, lavado transtraqueal o lavado broncoalveolar. Se espera que la disminución de la colonización de un animal por un microbio reduzca la transmisión del microbio a otros animales de la misma o diferente especie.

Se describe de otro modo el uso de dicho anticuerpo para dirigirse a un microbio que expresa una proteína que tiene un epítopo relacionado estructuralmente con un epítopo presente en una proteína descrita en el presente documento. Una composición descrita en el presente documento se puede utilizar para proporcionar una inmunización activa o pasiva contra la infección bacteriana. En general, la composición se puede administrar a un animal para proporcionar una inmunización activa. Sin embargo, la composición también se puede usar para inducir la producción de productos inmunitarios, tales como anticuerpos, que puede recolectarse del animal productor y administrarse a otro animal para proporcionar inmunidad pasiva. Los componentes inmunitarios, tales como anticuerpos, pueden recolectarse para preparar composiciones (preferentemente que contengan anticuerpos) a partir de suero, plasma, sangre, calostro, etc. para terapias de inmunización pasiva. Las composiciones de anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales y/o antiidiotipos también se pueden preparar usando métodos conocidos. Los anticuerpos quiméricos incluyen regiones constantes derivadas de humanos de cadenas pesadas y ligeras y regiones variables derivadas de múridos que son específicas de antígeno (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81(21):6851-5; LoBuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86(11):4220-4; Boulianne et al., Nature, 1984, 312(5995):643-6.). Los anticuerpos humanizados sustituyen las regiones murinas constante y marco (FR) (de la región variable) con los homólogos humanos (Jones et al., Nature, 1986, 321(6069):522-5; Riechmann et al., Nature, 1988, 332(6162):323-7; Verhoeyen et al., Science, 1988, 239(4847):1534-6; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86(24):10029-33; Daugherty et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19(9): 2471-6.). Como alternativa, se pueden usar ciertas cepas de ratones que han sido manipuladas genéticamente para producir anticuerpos que son casi completamente de origen humano; después de la inmunización, las células B de estos ratones se recogen y se inmortalizan para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Bruggeman y Taussig, Curr. Opin. Biotechnol., 1997, 8(4):455-8; Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol., 1995;13(1):65-93; Lonberg et al., Nature, 1994, 368:856-9; Taylor et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20:6287-95.). Las composiciones de anticuerpos pasivos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, scFv, Fab, F(ab')₂ o Fv u otras formas modificadas de los mismos, pueden administrarse a un receptor en forma de suero, plasma, sangre, calostro y similares. Sin embargo, los anticuerpos también pueden aislarse del suero, plasma, sangre, calostro y similares, utilizando métodos conocidos para su uso posterior en forma concentrada o reconstituida como, por ejemplo, por ejemplo, soluciones de lavado, apósitos impregnados y/o agentes tópicos y similares. Las preparaciones de inmunización pasiva pueden ser particularmente ventajosas para el tratamiento de enfermedades sistémicas agudas o la inmunización pasiva de animales jóvenes que no recibieron niveles adecuados de inmunidad pasiva a través del calostro materno. Los anticuerpos útiles para la inmunización pasiva también pueden ser útiles para conjugar con varios fármacos o antibióticos que podrían dirigirse directamente a las bacterias que expresan durante una infección sistémica o localizada una proteína que tiene un epítopo relacionado estructuralmente con un epítopo presente en una proteína descrita en el presente documento.

Están disponibles modelos animales para evaluar experimentalmente las composiciones descritas en el presente documento. Estos modelos son modelos comúnmente aceptados para el estudio de enfermedades causadas por microbios gramnegativos. En aquellos casos en los que un microbio gramnegativo cause una enfermedad en un animal, por ejemplo una vaca o un pollo, el huésped natural puede usarse para evaluar experimentalmente las composiciones descritas en el presente documento.

Sin embargo, la protección en un modelo animal no es la única manera de evaluar si una composición puede conferir protección a un animal frente a la infección por un microbio gramnegativo. La respuesta inmunitaria adaptativa consiste en dos divisiones principales: la respuesta humoral (anticuerpos) y la respuesta celular (linfocitos T). Después de la infección por un patógeno bacteriano, las células dendríticas en el sitio de la infección se encuentran con antígenos microbianos y producen moléculas de señalización como, por ejemplo, receptores de superficie y citocinas en respuesta a patrones moleculares conservados asociados con la bacteria específica. Estas señales están moldeadas por la naturaleza del patógeno e idealmente conducen a las respuestas apropiadas de anticuerpos y linfocitos T que protegen al huésped de la enfermedad. Mientras que algunas enfermedades bacterianas se controlan principalmente a través de funciones de anticuerpos, otros requieren respuestas de linfocitos T o respuestas tanto de anticuerpos como de linfocitos T para la protección. El objetivo de la biología de las vacunas es identificar las respuestas inmunitarias que brindan protección y luego diseñar una vacuna para reproducir una o más de estas respuestas en seres humanos.

Los anticuerpos pueden tener muchas funciones diferentes para conferir protección contra infecciones, como por ejemplo, por ejemplo, la fijación del complemento, opsonización, neutralización y/o aglutinación. Por otra parte, algunas subclases de anticuerpos son mejores que otras en funciones específicas; por ejemplo, para la fijación del complemento existe la siguiente jerarquía para las subclases de IgG humana: IgG3>IgG1>IgG2>IgG4.

Las funciones inmunológicas de los anticuerpos se pueden estudiar de diversas formas. Por ejemplo, las transferencias Western se utilizan para identificar la unión específica de antígeno según el tamaño de las proteínas separadas, mientras que el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) estándar se usa para producir información cuantitativa sobre los títulos de anticuerpos en el suero. Los estudios de unión a la superficie de anticuerpos se utilizan para determinar si los anticuerpos en el suero pueden reconocer antígenos en la superficie de bacterias intactas, un indicador importante de si los anticuerpos tienen el potencial de funcionar in vivo. Por lo tanto, un experto en la técnica reconoce que los ensayos de unión de anticuerpos como una transferencia Western, ELISA (por ejemplo, utilizando antisueros humanos) y/o la unión a la superficie se correlacionan positivamente con los antígenos unidos específicamente que proporcionan actividad inmunológica contra la infección microbiana. Sin embargo, un experto en la técnica reconoce además que la falta de unión de anticuerpos en un ensayo tal como, por ejemplo, una transferencia de tipo Western, ELISA o ensayo de unión a superficie no significa que el antígeno ensayado no proporcione actividad inmunológica contra la infección microbiana.

Los anticuerpos pueden mediar la muerte bacteriana bloqueando la adquisición de nutrientes o iniciando la perforación de la membrana mediada por el complemento que conduce a la lisis osmótica. Los anticuerpos bactericidas se pueden ensayar mezclando suero con cultivos vivos y midiendo la presencia de bacterias viables en condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la técnica. Las técnicas como los ensayos de opsonofagocitosis (OPA), en las que el anticuerpo y las bacterias unidas al complemento se combinan con fagocitos humanos o de ratón para determinar los niveles de eliminación de bacterias, son útiles para estudiar la función de los anticuerpos. Se puede usar un ensayo de explosión oxidativa similar para evaluar el nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS) por neutrófilos humanos o de ratón frescos después de la interacción con el anticuerpo y las bacterias unidas al complemento.

En algunos casos, se puede determinar que una proteína descrita en el presente documento posee actividad inmunológica mediada por células contra un microbio gramnegativo y, por lo tanto, la proteína puede exhibir actividad inmunológica en ausencia de inducir la producción de anticuerpos. Los linfocitos T citotóxicos o CD8 matan principalmente a las células infectadas directamente a través de varios mecanismos efectores, mientras que los linfocitos T auxiliares CD4 funcionan para proporcionar una señalización importante en forma de citocinas. Estas clases de linfocitos T se pueden subdividir aún más en función de las citocinas que producen, y las diferentes subclases son eficaces contra diferentes patógenos bacterianos. Los linfocitos T a menudo se estudian evaluando sus fenotipos con citometría de flujo, donde los anticuerpos se utilizan para visualizar los niveles de marcadores de superficie específicos que permiten la clasificación de los linfocitos T como, por ejemplo, un linfocito T CD4+ activado recientemente, un linfocito T CD8+ de memoria, etc. Además, las citocinas y otros productos de los linfocitos T pueden estudiarse aislando los linfocitos T del tejido linfoide y reestimulándolas con un antígeno afín. Después de la estimulación del antígeno, los linfocitos T producen citocinas que pueden visualizarse mediante, por ejemplo, tinción de citocinas intracelulares junto con citometría de flujo, o recolección de los sobrenadantes celulares y uso de la tecnología de perlas Luminex para medir 15-25 citocinas simultáneamente.

Por lo tanto, además de los modelos animales, los expertos en la materia reconocen que la actividad inmunológica acorde con los métodos descritos en el presente documento puede correlacionarse con uno o más de los siguientes: datos de transferencia Western que muestran que el suero de animales expuestos a un patógeno microbiano contiene un anticuerpo que se une específicamente a una proteína descrita en el presente documento, datos de transferencia Western que muestran que el suero de animales expuestos a la proteína descrita en el presente documento contiene anticuerpos que se unen específicamente a un microbio gramnegativo, ensayos de unión a la superficie celular que demuestran que el anticuerpo que se une específicamente a una proteína descrita en el presente documento se une específicamente a un microbio gramnegativo, datos de opsonofagocitosis e inducción de citocinas.

Se describe de otro modo un método para detectar anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas descritas en el presente documento. Estos métodos son útiles para, por ejemplo, detectar si un animal tiene un anticuerpo que se une específicamente a una proteína descrita en el presente documento, y diagnosticar si un animal puede tener una condición causada por un microbio que expresa proteínas que comparten epítopos con las proteínas descritas en el presente documento. Dichos sistemas de diagnóstico pueden estar en forma de kit. Los métodos incluyen poner en contacto un anticuerpo con una preparación que incluye una proteína descrita en el presente documento para dar como resultado una mezcla. El anticuerpo puede estar presente en una muestra biológica, por ejemplo, sangre, leche o calostro. El método incluye además incubar la mezcla en condiciones que permitan que el anticuerpo se una específicamente a la proteína para formar una proteína: complejos de anticuerpos. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "complejo proteína:anticuerpo" se refiere al complejo que resulta cuando un anticuerpo se une específicamente a una proteína. La preparación que incluye las proteínas descritas en el presente documento también puede incluir reactivos, por ejemplo, un tampón, que proporcionen las condiciones apropiadas para la formación de la proteína: complejos de anticuerpos. La proteína: a continuación se detecta el complejo de anticuerpos. La detección de anticuerpos es conocida en la técnica y puede incluir, por ejemplo, inmunofluorescencia o peroxidasa. Los métodos para detectar la presencia de anticuerpos que se unen específicamente a proteínas descritos en el presente documento se pueden usar en varios formatos que se han usado para detectar anticuerpos, incluyendo radioinmunoensayo y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Kits

Se describen de otro modo kits. En un caso, un kit es para detectar anticuerpos que se unen específicamente a una proteína descrita en el presente documento. El anticuerpo detectado puede obtenerse de un animal sospechoso de tener una infección causada por un microbio gramnegativo. En otro caso, un kit es para detectar una proteína descrita en el presente documento. En otro caso más, un kit es para usar una proteína descrita en el presente documento, tal como el uso de una proteína para producir anticuerpos, tratar una afección o tratar una infección.

El kit incluye al menos una de las proteínas descritas en el presente documento (por ejemplo, uno, al menos dos, al menos tres, etc.) o un anticuerpo descrito en el presente documento en un material de embalaje adecuado en una cantidad suficiente para al menos un ensayo o uso. Opcionalmente, también se incluyen otros reactivos como tampones y soluciones. Por ejemplo, un kit también puede incluir un reactivo para permitir la detección de un anticuerpo que se une específicamente a una proteína descrita en el presente documento, tal como un anticuerpo secundario marcado detectable diseñado para unirse específicamente a un anticuerpo obtenido de un animal. Las instrucciones de uso del anticuerpo o proteína envasado normalmente también se incluyen. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "material de embalaje" se refiere a una o más estructuras físicas utilizadas para albergar el contenido del kit. El material de embalaje se construye mediante métodos rutinarios, generalmente para proporcionar un medio estéril libre de contaminantes. El material de embalaje puede tener una etiqueta que indique que las proteínas se pueden usar para detectar anticuerpos que se unen específicamente a una proteína descrita en el presente documento, o usando una proteína descrita en el presente documento. Además, el material de embalaje contiene instrucciones que indican cómo se emplean los materiales dentro del kit para detectar el anticuerpo o administrar una proteína a un animal. Como se utiliza en el presente documento, el término "embalaje" se refiere a un recipiente, tal como vidrio, plástico, papel, láminas y similares, capaz de contener dentro de límites fijos las proteínas y otros reactivos, por ejemplo, un anticuerpo secundario. Por lo tanto, por ejemplo, un embalaje puede ser una placa de microtitulación a la que se han fijado microgramos de proteínas. Un embalaje también puede contener un anticuerpo secundario. Las "instrucciones de uso" suelen incluir una expresión tangible que describe la concentración del reactivo o al menos un parámetro del método de ensayo, tales como las cantidades relativas del reactivo y la muestra a mezclar, períodos de tiempo de mantenimiento para mezclas de reactivo/muestra, temperatura, condiciones de tampón y similares.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1

SELECCIÓN Y PREPARACIÓN DE CEPAS TIPO

Las cepas X-73, P-1059 y P-1662 de Pasteurella multocida son cepas de referencia para el serotipo A: 1, A:3 y A:4, respectivamente. Los serotipos A: 1, A:3 y A:4 también se conocen como serotipos 1, 3 y 4, respectivamente. Cada una de estas cepas se obtuvo del Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (NVSL) del USD^a (Ames, IA) como un cultivo liofilizado. Los cultivos se resuspendieron en solución salina estéril, se sembraron en franjas para el aislamiento utilizando un asa de inoculación estéril en agar de tripticasa de soja(TSA) sangre de carnero al 5 % (Becton Dickenson, Sparks MD) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Varias colonias aisladas se recogieron de la placa con un asa de inoculación estéril y se transfirieron a un tubo criobanco (Copan diagnostics, Murrietta CA) que contenía perlas de poliestireno con el propósito de crioconservación. A continuación, los tubos del criobanco se almacenaron a < -60 °C.

EJEMPLO 2

PREPARACIÓN DE AISLADO DE PASTEURELLA MULTOCIDA

Se aisló un serotipo 3x4 de Pasteurella multocida originalmente del hígado y los pulmones de una gallina reproductora de pavos de 44 semanas de edad en condiciones de campo naturales que presentaban signos clínicos de pasteurelosis. El aislado se sembró en agar tríptico de soja (TSA) más sangre de carnero al 5 %. Después del aislamiento inicial, el organismo se pasó 5 veces en caldo de soja Tripticasa de origen no animal (naTSB) (EM Science, Darmstadt, Alemania) (complementado con 18 μg/ml de 2,2' dipiridilo (DP) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y 6 g/l de extracto de levadura (Becton Dickenson, Sparks, MD). Resumiendo, las colonias se recogieron y se inocularon en 500 ml de naTSB y el cultivo se incubó durante 16 horas y 25 minutos a 37 °C en un agitador de mesa ajustado a 105 revoluciones por minuto (RPM). A la mañana siguiente, se transfirieron 25 ml del cultivo de toda la noche a 500 ml de naTSB fresco y se incubaron durante 8 horas a la misma temperatura y agitación. Se transfirieron cinco ml del cultivo a 500 ml de naTSB fresco y se incubaron durante 15 horas en las mismas condiciones que antes. Cincuenta ml de este cultivo se transfirieron a 500 ml de naTSB fresco y se incubaron de la misma manera durante 4 horas. Cuatro botellas que contenían 900 ml de naTSB cada una se inocularon con 100 ml del medio anterior y se incubaron durante 3 horas y 45 minutos. Los cuatro litros de cultivo se dispensaron asépticamente en frascos Nalgene estériles de 500 ml y se centrifugaron en una centrífuga Beckman modelo J2-21 (Beckman Coulter, Brea CA) a 3500 rpm o aproximadamente 1350 * g durante 20 minutos para sedimentar las células bacterianas. El sobrenadante se eliminó asépticamente mediante aspiración y los sedimentos celulares se resuspendieron en un total de 500 ml de naTSB que contenía un 20 % de glicerol como crioconservante. Luego, la suspensión celular se dispensó en viales 243 a razón de 2 ml por vial y se congeló a <-60 °C. Esta Semilla Maestra congelada se designó MS061130.

Se preparó una semilla de trabajo a partir de la semilla maestra congelada anterior. Resumiendo, se inocularon 1-25 μl de la semilla congelada en 100 ml de caldo de fosfato de triptosa modificado (mTPB) que contenía 6 g/l de extracto de levadura. El cultivo se incubó durante 13 horas a 37 °C en un agitador de mesa hasta que alcanzó una densidad óptica (D.E.) de 0,6 a 0,8 en un espectrofotómetro Spectronic 20D (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, Ontario, Canadá) fijado en 540 o 630 nm. El cultivo se transfirió, 10 ml en 90 ml de mTPB con 18 μg/ml de 2, 2' dipiridilo y se incubó durante 2-3 horas a 37 °C con agitación. El cultivo se transfirió y se hizo crecer de la misma manera dos veces más que antes. Cuando el cultivo alcanzó la D.O. de 0,8, se centrifugaron las células a aproximadamente 3500 rpm durante 20 minutos, el sobrenadante se eliminó asépticamente mediante aspiración y el cultivo se resuspendió en el volumen original de mTPB fresco. Se añadió glicerol estéril hasta alcanzar una concentración final del 20 %. El cultivo se mezcló bien, se dispensó en viales criogénicos estériles a razón de 2 ml por vial y se almacenó congelado a <­ 60 °C.

EJEMPLO 3

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS REGULADAS POR METALES

Las cepas tipo de Pasteurella multocida (X-73, P-1059 y P-1662) y la cepa candidata a vacuna (MS061130) del ejemplo 2 se cultivaron en condiciones limitantes de hierro y repletas de hierro para mostrar la expresión diferencial de proteínas de membrana.

Cada uno de los cultivos de cepas congeladas del ejemplo 1 y el aislado de semilla de trabajo del ejemplo 2 se inocularon en 10 ml de caldo de infusión de cerebro y corazón porcino (BD-Difco, Sparks MD) 6 g de extracto de levadura (pBHI) y se incubó durante la noche a 37 °C con agitación. Dos de los cultivos no crecieron directamente en caldo, por lo que primero se inocularon en placas de TSA agar sangre y se incubaron durante la noche a 37 °C antes de transferir las colonias a pBHI. Se transfirieron cinco ml de cada cultivo durante la noche a 100 ml de pBHI fresco que contenía 20 μg/ml de FeCh o DP para condiciones de repleto de hierro o de agotamiento de hierro, respectivamente. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 7 horas y 30 minutos con agitación en un agitador de mesa (Barnstead, Dubuque IA). Las botellas mostraron turbidez, lo que indica un fuerte crecimiento después de la incubación, y luego se transfirieron los cultivos, 50 ml en 500 ml de pBHI fresco que contiene FeCh o DP e incubado durante 15 horas a 37 °C, con agitación.

Los cultivos se procesaron para aislar las proteínas de la membrana externa. Resumiendo, los cultivos se centrifugaron durante 20 minutos a aproximadamente 11000 * g en una centrífuga Beckman modelo de piso equipada con un rotor JA-10 (Beckman Coulter, Brea CA). El sobrenadante se decantó y se desechó. El sedimento celular se resuspendió en 35 ml de tampón de choque osmótico (OMS) que contenía 7,26 gramos/litro de Tris-base y 0,93 gramos/litro de EDTA ajustado a un pH de 8,5, y la suspensión celular se congeló a -80 °C durante 3 horas para ayudar a debilitar la estructura de la pared celular. A continuación, la suspensión celular se descongeló y se sometió a ultrasonidos (sonificador Branson, modelo 102c) (Branson Ultrasonics, Danbury, CT) durante 90 segundos en un baño de agua con hielo para evitar el calentamiento excesivo de la suspensión de células rotas. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a aproximadamente 37 000 * g durante 20 minutos. Se añadió lauroil sarcosilo de sodio al sobrenadante retenido para alcanzar una concentración del 3 % v/v y se dejó solubilizar la suspensión de proteína durante 18-24 horas a 4 °C con una ligera agitación. Las proteínas de membrana insolubles se recogieron por centrifugación a 37.000 * g durante al menos dos horas. El sedimento se resuspendió en agua tamponada con Tris y se midió el contenido de proteínas del antígeno resultante mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (ensayo de proteínas Pierce BCA, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 4

PRUEBA DE COBERTURA DE PATRÓN DE PROTEÍNAS REGULADA POR METALES POR SDS-PAGE Y ANÁLISIS DE BANDAS DE PROTEÍNAS

Los extractos celulares, derivados de cada aislado cultivado con restricción de hierro, se fraccionaron por tamaños en geles SDS-PAGE usando un gel de apilamiento al 4 % y un gel de resolución al 10 %. Las muestras para electroforesis se prepararon combinando 30 |jg de muestra con 30 j l de tampón de muestra reductor SDS (Tris-HCL 62,5 mM pH 6,8, 20 % de glicerol, SDS al 2 %, betamercaptoetanol al 5 %) hervido durante 4 minutos. Se resolvió una muestra de cada extracto en un gel SDS-PAGE al 10 % según los métodos estándar y se visualizó mediante tinción con azul de Coomassie (figura 1). La cepa candidata a vacuna (MS061130) se comparó con las cepas tipo en geles SDS-PAGE. Se prestó atención específica a los patrones de bandas en las regiones entre 66 y 116 kDa. La cepa candidata a vacuna mostró bandas superpuestas con las cepas tipo, como se muestra en la figura 1 y se consideró un fuerte candidato para futuros estudios de protección.

EJEMPLO 5

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS REGULADAS POR METALES

Se prepararon dos composiciones de antígeno separadas a escala de producción utilizando una única cepa de Semilla Maestra MS061130 de Pasteurella multocida designado como antígeno A y antígeno B. Esto se hizo para evaluar la consistencia del proceso de fabricación.

Fermentación

Se descongeló un vial criogénico de la semilla de trabajo del ejemplo 2 a 30-35 °C durante 10-15 minutos y se añadieron 0,1 ml de la suspensión celular descongelada a 250 ml de mTPB a 37 °C. El cultivo se incubó durante 6,5 horas a 37 °C en un agitador de mesa ajustado a 70 rpm. Después de la incubación, se transfirieron 25 ml del cultivo a 300 ml de mTPB más 18 jg /m l de DP para restringir el hierro. Este segundo cultivo se incubó durante aproximadamente 2 horas a 37 °C con agitación a 70 rpm. Se transfirieron 250 ml del cultivo a 3 litros de los medios anteriores y se incubó durante aproximadamente 3 horas a 37 °C con agitación a 70 rpm hasta que se alcanzó una DO de 1 (medida a 540 nm). Todo el cultivo se usó para inocular un fermentador de 130 litros (Bio-Service, Easton, PA) cargado con 70 litros de mTPB+ 18 mg/ml DP y 0,5 ml/l de antiespumante (MAZU DF 204 Chem/Serv, Mineápolis, MN). Los parámetros de la fermentación fueron los siguientes: El oxígeno disuelto (OD) se mantuvo al 20 % (objetivo 15-30 %) mediante control de agitación automático y rociado de flujo de aire ajustado a 60 litros por minuto (LPM) y 0,034 MPa (5 libras por pulgada cuadrada (PSI)) de contrapresión. El cultivo se incubó con agitación controlada automáticamente controlando el oxígeno disuelto al 20 %. El pH se controló automáticamente entre 6,9 y 7,1 mediante la titulación automática de hidróxido de sodio al 50 % o ácido clorhídrico al 10 %. La temperatura se mantuvo a 37 °C. El cultivo se dejó crecer de esta manera durante aproximadamente 5 horas hasta que se alcanzó una densidad óptica de 4,21 a 540 nm medida con un espectrofotómetro Beckman DU600 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Todo el cultivo de expansión se transfirió a un recipiente de fermentación de 1200 litros (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) cargada con 989 l de mTPB más DP y antiespumante como se indica arriba. Las condiciones de fermentación fueron las siguientes: El flujo de aire se fijó en 300 LPM y la contrapresión a 0,034 MPa (5 PSI). La agitación se ajustó inicialmente a 100 ^r P^m y luego se controló mediante un punto de ajuste de oxígeno disuelto del 20 % con un intervalo de 15 - 30 %. Se dejó crecer el cultivo durante otras 5 horas hasta que el crecimiento se estabilizó, según lo medido por las mediciones de densidad óptica siendo constante en aproximadamente 2,5 a 540 nm a una dilución de 1:100 durante 1,5 horas. El crecimiento se suspendió ajustando el pH del cultivo a 8,7 y la temperatura a 23 °C hasta la recolección.

RECOLECCIÓN

Las células bacterianas se recolectaron mediante filtración de flujo tangencial.

La fermentación bacteriana se concentró y se lavó usando un Pall Filtron Tangential Flow Maxisette-25 (Pall Filtron Corporation, Northboro, MA) equipado con dos filtros de 2,79 m2 (30 pies2) de canal abierto Alpha 300-K, n.° de cat. AS300C5, (Pall Filtron) conectados a una bomba de alimentación Waukesha Modelo U-60 (Waukesha Chemy-Burrell, Delevan, Wis.) establecido en aproximadamente 44 Hz. El volumen de cultivo original de 1078 litros se redujo a aproximadamente 100 litros en un tanque de proceso (Lee Industries, modelo 2000LBDT) usando una presión de entrada al filtro de 0,20 MPa (30 psi) y una presión de fracción retenida de 0,082-0,096 MPa (12-14 psi). La fracción retenida (100 litros) se ajustó a 200 litros usando tampón de choque osmótico (OMS) estéril que contenía 7,26 gramos/litro de Tris-base y 0,93 gramos/litro de EDTA ajustado a un pH de 8,5. El EDTA en el OMS sirve para eliminar el LPS de la pared celular, mientras que el pH elevado evita gran parte de la degradación proteolítica después de la congelación y la rotura. Los inhibidores de la proteasa se pueden usar en lugar de, o además de, un pH elevado. La fracción retenida se concentró nuevamente hasta aproximadamente 65 litros y el sistema se lavó con 20 litros de OMS. La fracción retenida se mezcló a fondo mientras estaba en el tanque de 200 litros utilizando un mezclador accionado magnéticamente de montaje inferior.

La fracción retenida se dispensó de forma estéril (3,5 litros) en recipientes NALGENE n.° 2122 estériles de 4 litros en una cabina de bioseguridad y se colocó en un congelador a -20 °C para almacenamiento. La congelación del sedimento bacteriano sirve para debilitar la estructura de la pared celular, lo que hace que la interrupción aguas abajo sea más eficiente. La masa del sedimento se calculó centrifugando muestras de 30 ml del cultivo fermentado y la cosecha final. Resumiendo, se centrifugaron tubos cónicos NALGENE de 50 ml previamente pesados a 39.000 xg durante 90 minutos en una centrífuga BECKMAN J2-21 usando un rotor JA-21 (Beckman Instruments, Palo Alto Calif.). Al final de la carrera, se vertió el sobrenadante y se pesaron nuevamente los tubos. Se calculó la masa de sedimentos para cada etapa. El proceso de fermentación produjo una masa de sedimentos húmedos de 3,7 kilogramos.

Se pueden utilizar métodos alternativos para la recolección de bacterias. La recolección de bacterias se puede realizar mediante el uso de métodos de filtro de fibra hueca. El cultivo bacteriano se cosecha utilizando cartuchos de filtro que varían en tamaño desde 0,6 μM hasta 750 kDa; preferentemente con un cartucho de 750 kDa. El volumen del cultivo se reduce de 2 a 20X y, posteriormente, se lava de 1 a 5X mediante diafiltración con tampón antes de almacenarlo a 4 °C o congelarlo a -20 °C. De esta forma, las proteínas de medios no deseadas, las proteínas bacterianas y el LPS se eliminan del cultivo. En otra alternativa, la recolección de bacterias se puede realizar mediante el uso de centrifugación a escala industrial, por ejemplo, mediante el uso de una centrífuga de discos.

ROTURA

Sesenta y cinco litros de suspensión de células bacterianas congeladas en OMS se descongelaron a 4 °C (3,7 kg de masa de sedimentos). La suspensión de cultivo líquido de cada recipiente se aspiró asépticamente en un tanque de proceso con camisa de 150 litros de vapor in situ (Lee, Modelo Estilo U). La suspensión celular se rompió por homogeneización. Resumiendo, el tanque de 150 litros que contenía la suspensión bacteriana se conectó a un Homogeneizador Avestin modelo EF-C500B (Avestin, Inc. Ottawa, ON, Canadá). Un tanque de proceso con camisa de 250 litros (vacío) (Lee, modelo 259LU) con un mezclador montado en la parte superior (Eastern, modelo TME-1/2, EMI Incorporated, Clinton, CT) se conectó al homogeneizador de manera que el fluido del tanque de proceso pudiera pasar a través del homogeneizador, en el tanque vacío y de regreso, permitiendo múltiples pases de homogeneización mientras se mantiene un sistema cerrado. La temperatura durante la homogeneización se mantuvo a 4 °C. Al comienzo del pase, el fluido se hizo circular a 0,41 MPa (60 psi) a través de una bomba Waukesha modelo 10DO (Waukesha) a través del homogeneizador (500 galones/hora) y de regreso al tanque de origen, mientras que la presión del homogeneizador se ajustó a 103,4 MPa (15.000 psi). Antes de la homogeneización, se extrajeron dos muestras de prehomogeneización del homogeneizador para establecer una línea de base para determinar el grado de interrupción y monitorizar el pH. El grado de rotura se controló por transmitancia (% T a 540 nm a una dilución 1:100) en comparación con la muestra no homogeneizada. El % T inicial fue 86,65 a una dilución 1:100. La suspensión de células se pasó una vez a través del homogeneizador y el % T resultante fue 89,9 a una dilución de 1:100.

Después de la homogeneización, 1 litro de lauroil sarcosinato de sodio (Hamposyl L-30, Chem Serv, Minneapolis, MN) se pasó asépticamente a los 81 litros de suspensión homogeneizada para la solubilización. El recipiente encamisado se retiró del homogeneizador y se mantuvo en un circuito de refrigeración a 5 °C y se mezcló al 30 % de la velocidad del mezclador. Después de 29 horas, se añadieron 121 ml de formaldehído como conservante, seguido de un lavado de 2 litros de OMS. La solubilización continuó durante un total de 46 horas y 16 minutos. Este período de tiempo fue importante para la solubilización completa. Se descubrió que al aumentar el tiempo de solubilización en OMS a un pH elevado (8,0-8,5), las proteínas reguladas por metales se agregaban formando grandes agregados insolubles que se eliminaban fácilmente mediante centrifugación.

RECOLECCIÓN DE PROTEÍNAS

Las proteínas reguladas por metales añadidas dentro del fluido de proceso solubilizado se recogieron por centrifugación usando T-1 SHARPLES, (Alfa Laval Separations, Warminster, Pa.). Resumiendo, el tanque de homogeneizado solubilizado se alimentó a doce Sharples con una velocidad de alimentación de 170ml/minuto a 0,075 MPa (11 psi). Se descartó la proteína del primer pase recogida en los tazones de los Sharpies. Esto consiste en restos celulares grandes y material de la pared celular. El efluente se recogió en un segundo tanque de proceso encamisado de 250 litros a través de un circuito estéril cerrado que permitía múltiples pases a través de las centrífugas mientras se mantenía un sistema cerrado. La temperatura durante la centrifugación se mantuvo a 4 °C. El homogeneizado solubilizado se pasó 7 veces más a través de las centrífugas, a una velocidad de alimentación de 150 ml/minuto y una presión de 0,14 MPa (21 PSI). La proteína se recogió después de cada paso. La proteína se recolectó, se resuspendió y se dispensó en 7,46 litros de tampón Tris pH 8,5. Se añadieron veinticinco ml de formaldehído (Sigma), para alcanzar una concentración del 0,3 %, como conservante.

Se pueden utilizar métodos alternativos para la recolección de proteínas. Por ejemplo, las proteínas deseadas se pueden recolectar mediante el uso de métodos de filtro de fibra hueca. Las proteínas se pueden recolectar utilizando cartuchos de filtro que varían en tamaño desde 5 kDa hasta 0,2 μM; preferentemente con un cartucho de 50 kDa a 750 kDa. El volumen del cultivo se reduce de 2 a 20X y, posteriormente, se lava de 1 a 5X mediante diafiltración con tampón antes de almacenarlo a 4 °C o congelarlo a -20 °C.

DIAFILTRACIÓN

La suspensión de proteínas se lavó mediante diafiltración a 4 °C para eliminar cualquier sarcosina contaminante que pudiera haberse unido a la proteína. Resumiendo, los 8640 ml de proteína se aspiraron de forma estéril en un tanque de proceso de 200 litros que contenía 50 litros de tampón Tris estéril, pH 8,5, equipado con un mezclador Dayton de montaje inferior, Modelo 2Z846 (Dayton Electric, Chicago, Ill.) girando a 125 rev/minuto. El tanque de proceso se conectó de forma estéril a un conjunto de FILTRO DE FLUJO TANGENCIAL MILLIPORE PELLICON (Millipore Corporation), equipado con un filtro Centrasette Alpha 10K de la serie de canal de pantalla de 2,32 m2 (25 pies2) (Pall Filtron) conectado a una bomba de alimentación Waukesha modelo U30. La solución de proteína de 59 litros se llevó a 150 litros añadiendo TBW, se concentró hasta 35 litros, se llevó hasta un volumen de 110 litros de TBW y luego se concentró hasta un volumen de antígeno final de 10,4 l. El concentrado de proteína se dispensó asépticamente (3,5 litros) en recipientes estériles de NALGENE de 4 litros y se colocó a -20 °C. congelador para almacenamiento.

Este proceso produjo una composición que contenía proteínas reguladas por metales con una disminución en la cantidad de LPS y muy poco o ningún residuo de sarcosina. La proteína se examinó mediante SDS-PAGE para determinar la pureza y el perfil de bandas, y también se examinó para detectar contaminación bacteriana, sarcosina residual y LPS. El perfil de bandas del producto terminado mostró patrones consistentes según se examinó por electroforesis. Se analizó la sarcosina en la composición mediante el uso de una prueba de difusión en gel de agar modificada en la que se incorporaron glóbulos rojos de oveja (5 %) en una base de agar (1,5 %). Se cortaron pocillos en el agar y se colocaron en los pocillos muestras del producto acabado junto con muestras de control de concentraciones conocidas de sarcosina al 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0 y 2,0 %. El gel se incubó a 25 °C durante 24 horas y se determinó el grado de hemólisis en comparación con los controles. El proceso elimina el nivel de sarcosina detectable por debajo del 0,05 %, que a esta concentración mostró una hemólisis mínima en las muestras de control. La concentración de LPS se examina mediante una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) disponible con el nombre comercial PYROTELL (Associates of Cape Cod, Inc., East Falmouth, Mass.).

EJEMPLO 6

PREPARACIÓN DE COMPOSICIONES INMUNIZANTES DERIVADAS DE PASTEURELLA MULTOCIDA

Se prepararon tres series de vacunas que consistían en el mismo antígeno a partir de la Semilla Maestra MS061130 del Ejemplo 5. Téngase en cuenta: se usaron dos preparaciones de antígeno que representan dos procesos de fermentación separados para preparar dos lotes de antígeno designados como antígeno A y antígeno B. Por lo tanto, La primera serie de vacunas se preparó utilizando una mezcla de antígeno A y antígeno B, la segunda serie de vacunas se preparó solo con el antígeno A, y la tercera serie de vacunas se preparó con solo el antígeno B.

Las composiciones de vacuna que consisten en antígeno A, B y A+B se prepararon en los siguientes constituyentes: suspensión acuosa de proteínas al 44,44% en solución salina formalizada al 0,1 %, (estandarizado a 150 μg de proteína por dosis de pollo) 50 % de aceite mineral Drakeol 6 (VOPAK USA, Inc, Kirkland, Washington), 3,0 % de Span 85 y 2,56 % de Tween 85 (Ruger Chemicals, Hillside, Nueva Jersey). Brevemente, el aceite mineral y Span 85 se combinaron y dispensaron en un recipiente equipado con un emulsionador de alta velocidad (IKA modelo Process pilot 2000/4 o equivalente). Antígeno, Se dispensó Tween 85 y solución salina formalizada al 0,1 % en un segundo recipiente. El emulsionante se ajustó a 60 hz y la solución acuosa se bombeó al aceite, que se enfrió previamente a 7 °C. La vacuna se agitó continuamente a medida que se bombeaba a botellas estériles.

EJEMPLO 7

VACUNACIÓN DE POLLOS

Se vacunaron pollos libres de patógenos específicos (SPF) tipo Leghorn (Hy-Vac, Adel, IA) con las composiciones del ejemplo 6. Resumiendo, se obtuvieron 74 pollos leghorn libres de patógenos específicos (SPF) a las 11 semanas de edad (WOA) y se les permitió aclimatarse durante una semana antes de la vacunación. Las aves se dividieron en 3 grupos designados como Antígeno A+B (21 aves), antígeno A (21 aves), antígeno B (21 aves y un grupo de controles no vacunados (11 aves). Las aves fueron identificadas por bandas de colores en las patas. A las 12 WOA, todas las aves en los grupos antígeno A+B, antígeno A y antígeno B se vacunaron con 0,25 ml de la vacuna adecuada por vía intramuscular en la mama. Un grupo de 11 pollos no recibió ninguna vacuna y sirvió como grupo de control. A las 15 semanas de edad o veintiún días después de la segunda vacunación, todas las aves vacunadas recibieron una segunda vacunación

EJEMPLO 8

PREPARACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DEL ORGANISMO DE EXPOSICIÓN

Un día antes de la exposición, una perla criogénica de Pasteurella multocida, cepa X-73 del ejemplo 1, se retiró asépticamente de la reserva congelada y se extendió sobre dos placas TSA II con sangre de carnero al 5 % (Becton Dickenson) que luego se sembraron para el aislamiento de las colonias. Las placas se incubaron durante 16-19 horas a 37 °C. El día 14 o 14 días después de la segunda vacunación, se rasparon varias colonias de la placa de agar con sangre de carnero de la placa de sangre y se suspendieron en un tubo de ensayo estéril de 13x100. Se añadieron colonias o la suspensión se diluyó con caldo de triptosa para obtener un % T de 71-75% a 630 nm utilizando un espectrofotómetro Spectronics 20D (ThermoFisher). La suspensión se diluyó en serie en caldo de triptosa a una dilución de 1:100.000. Esta dilución se distribuyó en viales de suero para la exposición.

Veinte pollos de cada grupo vacunado y 10 pollos del grupo de control se inocularon por vía intramuscular en la pechuga con 0,5 ml de la provocación diluida anterior. Los pollos adicionales del grupo vacunado y de control se retiraron en este momento.

EJEMPLO 9

RESULTADOS DE LA EXPOSICIÓN

Los resultados, mostrados en la figura 2, son un promedio de tres estudios de exposición separados realizados con las tres series. El término Fracción Prevenida (PF) es el complemento de la Razón de Riesgo (RR) y ha sido utilizado durante mucho tiempo por los epidemiólogos como una expresión del papel preventivo de un factor protector, o el éxito preventivo de un programa de intervención implementado (Miettinen, 1974, Am J Epidemiol 99: 325-332) (Field Epidemiology, Oxford University Press, 2002, pp147-7). Fracción Prevenida FP=1 - p2/p-i, donde p2 = fracción afectada en el grupo vacunado, y pi= fracción afectada en el grupo no vacunado o placebo. Se espera que las vacunas veterinarias contra el cólera aviar demuestren rutinariamente una FP del 53 % o más, preferentemente del 62,5 % o más. Las vacunas que demuestran una FP de menos del 53 % demuestran protección.

La Tabla 1 presenta los datos de mortalidad de la figura 2 y los cálculos de la Fracción Prevenida para el Antígeno B de la figura 2. La eficacia de la vacuna o fracción prevenida se calculó que era del 30 %, lo que indica que la vacunación previno el 30 % de los casos que de otro modo podrían haber ocurrido entre las aves vacunadas si no hubieran sido vacunadas. Estos cálculos se repitieron para los antígenos A y A+B para obtener la fracción prevenida para cada vacuna.

Tabla 1.

La diferencia entre vacunados y controles es significativa (p<0,05) para dos de los tres grupos vacunados, pero la fracción prevenida fue del 53 %, 30 % y 44 % para el antígeno 1, antígeno 2 y el antígeno combinado, respectivamente. Si bien la vacuna alcanzó el nivel de ^{F p} del 53 % en un caso, no se pudo demostrar de manera consistente y, por lo tanto, no es suficientemente eficaz para una vacuna comercial contra el cólera aviar. Sobre la base de los perfiles de bandas observados en el ejemplo 4, se esperaba muy buena protección. Desafortunadamente, la protección observada fue inferior a la esperada. Estos resultados inesperados sugieren que las bandas que parecen superponerse visualmente en un gel SDS-PAGE, como se muestra en la figura 1, no son suficientes para conferir el nivel de protección deseado.

EJEMPLO 10

ANÁLISIS DEL GENOMA CONOCIDO

Los genomas conocidos actuales se examinaron en busca de posibles proteínas reguladas por metales. Varias cepas de Pasteurella multocida tienen secuencias genómicas completas o parciales disponibles en el dominio público. Universal Protein Resource (Uniprot) es un recurso completo para secuencias de proteínas y datos de anotación. En el momento de la búsqueda, los datos de secuencias completas o parciales de la cepa de referencia X-73 del serotipo 1 y la cepa de referencia P-1059 del serotipo 3 estaban presentes en esta base de datos. Para cada uno de estos organismos, se buscó en la base de datos todas las proteínas que tenían pesos moleculares entre 50 kilodalton y 150 kilodalton que tenían alguna anotación que hiciera referencia a la absorción de hierro. Las proteínas identificadas se organizaron en una tabla (figura 3), donde se agruparon las de diferentes cepas que tenían una similitud mayor o igual al 95 %. Se identificaron catorce proteínas distintas entre estas cepas.

Las proteínas se compararon con las proteínas reguladas por metales expresadas del candidato a vacuna anterior (MS061130) identificadas mediante análisis MALDI-TOF. Había ocho proteínas que parecían estar ausentes en la vacuna candidata, pero fueron identificadas en genomas adicionales de otras cepas de Pasteurella multocida derivadas de especies aviares. (Véanse las figuras 3 y 4).

Estos resultados demostraron que a nuestra vacuna candidata (MS061130) le faltaban potencialmente 7 proteínas deseables que se identificaron mediante análisis genómico de cepas adicionales de Pasteurella. Esta misma observación se vio en el análisis del genoma de la cepa de exposición que se usó en el ejemplo 9 que también tenía el subconjunto de siete proteínas que no estaba presente en la vacuna candidata MS061130. Por lo tanto, a la cepa de vacuna descrita en los Ejemplos 6-9 le faltaban 7 proteínas que estaban presentes en la cepa de exposición (figura 3). El diagrama de Venn en la Figura 4 ilustra el número de proteínas presentes en las cepas de desafío P1059 y X73 relevantes que no están presentes en la cepa vacunal MS061130. Estas observaciones llevaron a plantear la hipótesis de que una combinación de dos o más cepas con una cobertura integral del receptor de sideróforo del subconjunto de siete proteínas proporcionaría un mayor grado de eficacia protectora y también mostraría protección cruzada independientemente del serotipo.

EJEMPLO 11

COMPARACIÓN DE PATRONES DE BANDAS DE PROTENAS RESTRINGIDAS CON HIERRO EN CEPAS SALVAJES Y TIPO DE PASTEURELLA MULTOCIDA

Para comprender mejor las proteínas reguladas por metales en Pasteurella, treinta y tres cepas tipo y cepas de campo clínico de Pasteurella multocida se cultivaron en medio restringido en hierro y se procesaron para purificar las proteínas unidas a la membrana de la manera del ejemplo 3. Las composiciones proteicas resultantes se analizaron en busca de patrones de bandas de proteínas reguladas por metales en geles de electroforesis en gel de poliacrilimidadodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) (geles Criterion TGX Stainfree, laboratorios Bio-Rad, Hercules, CA). Los carriles individuales se compararon y agruparon usando Phoretix 1D, un programa de análisis de gel unidimensional (TotalLab, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido). Se creó un dendograma con el software Phoretix 1D que muestra las similitudes del patrón de bandas, como se ilustra en la figura 5. El análisis de las cepas tipo y los aislados de campo clínico reveló dos patrones predominantes de proteínas reguladas por metales expresadas; un patrón de cuatro bandas como lo marcan los corchetes [], y un patrón de tres bandas como lo muestran las llaves{}. Otras cepas parecen tener variaciones en estos dos patrones, faltando una o dos bandas de proteínas.

EJEMPLO 12

ANÁLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE MALDI-TOF

Se eligieron trece aislados del ejemplo 11 como representativos de los diversos patrones de bandas observados en la figura 5. Cada banda de proteína en el rango de peso molecular de 75.000 a 115.000 de estos trece aislados del ejemplo 11 se escindió de los geles SDS-PAGE para el análisis de identificación de proteínas a través de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) e impresión de la masa peptídica. Las masas peptídicas se compararon con una base de datos (Uniprot, en este caso) que contenía secuencias de proteínas conocidas del genoma. Esto se logró mediante el uso de programas informáticos que traducen el genoma conocido del organismo en proteínas, luego, teóricamente, cortan las proteínas en péptidos y calculan las masas absolutas de los péptidos de cada proteína. Luego comparan las masas de los péptidos de la proteína desconocida con las masas peptídicas teóricas de cada proteína codificada en el genoma. Los resultados se analizan estadísticamente para encontrar la mejor coincidencia. Las identidades de estas proteínas se agruparon en una similitud superior al 93 por ciento y los resultados se muestran en la tabla de la figura 6. Se analizaron un total de 38 bandas de los 13 aislados y se identificaron como una de las siete proteínas, como se indica por su peso molecular en la figura 6. Dos de los aislados (1121 y 1135, indicados por la elipse en la figura 6), cuando se combinan, expresaron las siete bandas de proteínas. Estas dos cepas se eligieron para una nueva vacuna combinada porque juntas expresaban todas las proteínas de los once aislados restantes en la figura 6, y también eran representativas de los dos principales patrones de bandas identificados en la figura 5.

EJEMPLO 13

PREPARACIÓN DE SEMILLAS DE CULTIVO DE PASTEURELLA

Se prepararon reservas de la semilla maestra de las cepas 1121 y 1135 de Pasteurella multocida del ejemplo 12 y la figura 6. La cepa 1121 se identificó como el serotipo 3x4 y la cepa 1135 se identificó como el serotipo 2x5. Estos aislamientos se aislaron de pavos que habían muerto de pasteurelosis aviar. Normalmente, se tomó una muestra del hígado o del pulmón y la muestra resultante se sembró en una placa de agar con sangre de carnero al 5 % y se incubó a 37 °C durante 24 horas. Se preparó una semilla maestra inoculando el aislado en pBHI que contenía 6 g/l de extracto de levadura y 12 ug/ml de DP. A continuación, el cultivo se transfirió sucesivamente al medio anterior con 18 μg/ml de DP durante cinco pases más para adaptar los organismos a un entorno restringido en hierro y maximizar el crecimiento y la expresión de las proteínas deseadas. Los cultivos se concentraron por centrifugación durante 30 minutos a 7.000 rpm (Beckman Coultier, Brea, CA) y se resuspendieron en pBHI fresco que contenía 20% de glicerol (como crioprotector) pero sin DP. Las semillas maestras resultantes se dividieron en alícuotas en volúmenes de 2,2 ml en crioviales de 3 ml y se almacenaron a una temperatura igual o inferior a -60 °C. Los aislamientos recibieron los números de identificación PM1121 20140911 y PM1135 20140925 y se establecieron como Semillas Maestras MS1121 y MS1135, respectivamente. Las semillas maestras luego se expandieron en semillas de trabajo que se usaron para la producción de proteínas reguladas por metales.

EJEMPLO 14

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS REGULADAS POR METALES

Pasteurella multocida puede cultivarse en condiciones de fermentación controladas para expresar proteínas, incluyendo proteínas asociadas con la membrana externa. A continuación se pueden recolectar las bacterias y aislar las proteínas, purificar y usar como inmunógenos en una composición.

FERMENTACIÓN:

Un vial criogénico de la semilla de trabajo de la cepa 1135 (1 ml a 109 UFC/ml) del ejemplo 13 se usó para inocular 300 ml de medio de infusión de corazón y cerebro porcino modificado a 37 °C (pBHI) (BD Difco) que contenía 6 g/l de extracto de levadura (BD). El cultivo se incubó a 35-38 °C mientras se agitaba a 30-400 rpm durante 5 horas, momento en el que se transfirió a 1500 ml de pBHI modificado que contenía 22 ug/ml de DP para restringir el hierro disponible. El cultivo se incubó a 37 °C durante 2 horas y 38 minutos hasta alcanzar una densidad óptica mayor o igual a 0,6. El cultivo completo se transfirió a 15 litros de pBHI modificado más 22 ug/ml de DP en un matraz de 18 litros. Este cultivo se incubó durante aproximadamente 2 horas y 30 minutos y alcanzó una densidad óptica de 0,75 a 540 nm. Luego, el cultivo se transfirió a un fermentador de 300 litros que contenía 270 litros de pBHI modificado con 22 μg de DP para mantener la restricción de hierro y 40 ml por litro de una solución de glucosa al 50 % como fuente de carbono. El cultivo se incubó a 35-38 °C con agitación controlada por el contenido de oxígeno disuelto que se mantuvo en o por encima del 30 %. El cultivo se cultivó hasta una densidad óptica, medido por un espectrofotómetro Beckman serie 600, de aproximadamente 5,4. Al final de la fermentación, el pH del cultivo se ajustó por encima de 8,5 y la temperatura se ajustó a 15 °C o menos.

RECOLECCIÓN DE CÉLULAS ENTERAS:

La suspensión bacteriana de células enteras se concentró a aproximadamente 1/10 del volumen mediante filtración de flujo tangencial con un Pall Filtron Tangential Flow Maxisette-25 (Pall Filtron) equipado con dos filtros de 2,79 m2 (30 pies2) de canal abierto Alpha 300-K, n.° de cat. AS300C5, (Pall Filtron) conectados a una bomba de alimentación Waukesha Modelo U-60 (Waukesha Chemy-Burrell, Delevan, Wis.) establecido en aproximadamente 44 Hz.

El cultivo se lavó adicionalmente con solución salina tamponada con Tris y luego se concentró hasta ~45 litros de suspensión de células enteras. Se secó y pesó una submuestra de la suspensión de células para obtener el peso final del sedimento seco. A continuación, la suspensión final de células enteras se congeló a -20°.

ROTURA DE CÉLULAS ENTERAS:

La suspensión de células enteras se descongeló a 5-7 °C durante 3 días. Los recipientes individuales de células enteras se agruparon y mezclaron en un tanque estéril equipado con un mezclador ajustado al 40 %. La suspensión de células líquidas se rompió por homogeneización. Resumiendo, la célula entera suspendida se pasó dos veces a través de un homogeneizador Avestin, modelo Emulsiflix C500B, (Avestin, Inc., Ottawa, Canadá) a una presión de 103,4 a 124,1 MPa (15 000 a 18 000 libras por pulgada cuadrada (PSI)) hasta que una dilución 1:100 de homogeneizado alcanzó el 80 % de transparencia (% T a 540 nm) en un espectrofotómetro Beckman serie 600 (instrumentos Beckman, Brea, CA). Se conectó un segundo tanque de proceso al homogeneizador de modo que el fluido pudiera pasar de un lado a otro a través del homogeneizador en múltiples pasadas mientras se mantenía un sistema cerrado. Se añadió lauroilsarcosinato sódico (Hamposyl L-30, productos químicos chattem, Chattanooga, TN) al 3 % volumen/volumen al homogeneizado de células rotas para solubilizar las proteínas de la membrana celular y las que no son de membrana. La solubilización continuó durante aproximadamente 72 horas a 2-7 °C. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación utilizando una centrífuga continua Sharples T1 a 0,075 MPa (11 PSI).

RECOLECCIÓN DE PROTEÍNAS:

La suspensión de proteínas se lavó con 800 litros de agua tamponada con Tris (TBW) (pH 7,4) que contenía formalina al 0,2 % mediante filtración de flujo tangencial de lavado continuo (filtro Maxisette de 300 kDa, Pall corp, NY, NY). La proteína se lavó adicionalmente con 100 litros de TBW que contenía formalina y etanol al 10 %. Después del lavado con etanol, la suspensión de proteínas se lavó adicionalmente con 200 litros de TBW más formalina (0,2 %) para eliminar el etanol. Cuando el ^t B^w restante se lavó del sistema, el volumen se redujo mediante filtración continua hasta que el volumen de antígeno final fue de aproximadamente 20 litros. A continuación, el lote de antígeno final 1135-A0001 se inactivó con formalina al 0,2 % con mezcla continua a 33 °C durante 93 horas.

La semilla de trabajo de la cepa 1121 se usó para preparar el lote de antígeno 1121-A0001 de la misma manera que la cepa 1135.

EJEMPLO 15

PREPARACIÓN DE VACUNAS

Los antígenos preparados en el Ejemplo 14 se usaron para preparar dos vacunas de agua en aceite de 20 litros con un 50 % de aceite mineral como adyuvante y emulsionante tween/span como se describe en el ejemplo 6.

Resumiendo, 10.145 ml de aceite mineral Drakeol 6 y 609 ml Span 85, como emulsionante, se añadieron a un recipiente estéril equipado con un mezclador Silverson modelo 150UHSLS (Silverson Machines, East Longmeadow, MA). El mezclador se ajustó a 52 Hz y la recirculación de la fase adyuvante se ajustó a 2,5 litros por minuto. Los ingredientes de la fase acuosa se añadieron a un segundo recipiente: Tween 85 (517 ml), 540 ml de lote de antígeno 1121-A0001, 1420 ml de lote de antígeno 1135-A0001 y 7010 ml de solución salina tamponada con fosfato, se añadió lentamente pH 7,4 en el transcurso de 20 minutos. Las vacunas se formularon para contener 100 |jg de antígeno total (50 jg de cada cepa) por dosis de 0,25 ml y 200 jg de antígeno total (100 jg de cada cepa), respectivamente. Estos dos antígenos, combinados, representan las 7 proteínas, del ejemplo 12 y la figura 6, necesarias para aumentar la protección contra serotipos heterólogos.

EJEMPLO 16

MODELO DE VACUNACIÓN Y EXPOSICIÓN

Las vacunas preparadas en el ejemplo 15 se usaron en un modelo de desafío de vacunación contra la exposición de tipo 1 en pollos SPF. Resumiendo, Los pollos Leghorn SPF 60, tanto machos como hembras, se obtuvieron de Valo BioMedia (Adel, IA). Los pollos se clasificaron por sexo y se dividieron en tres grupos de 20 aves, mezcla de gallinas y gallos, cada grupo con el mismo número de machos y hembras. Las aves fueron identificadas por bandas de alas numeradas; cada ave recibió números idénticos en el ala izquierda y derecha para preservar la identidad. Un grupo fue vacunado con 0,25 ml de la vacuna de 200 jg del ejemplo 14. Un segundo grupo fue vacunado con 0,25 ml de la vacuna de 100 jg del ejemplo 14. Un tercer grupo fue vacunado con un placebo que contenía el adyuvante oleoso en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en lugar del antígeno. Todas las aves fueron vacunadas por vía subcutánea en la parte posterior del cuello a las 12 y 15 semanas de edad, y todas las aves fueron desafiadas por vía intramuscular en el pecho a las 17 semanas de edad con aproximadamente 6000 ufc de la cepa de exposición del serotipo 1 X-73 preparada de la manera del ejemplo 8. Los resultados del estudio se muestran en la Figura 7. Está claro que el nivel de protección mejora enormemente con una fracción preventiva de 69 y 75 por ciento y un valor de p de 0,001 y < 0,0004 para los grupos vacunados con 100 jg y 200 jg , respectivamente. Estos resultados muestran claramente que la combinación de dos antígenos, expresando las siete proteínas de la figura 6, confieren una mayor fracción prevenida contra la exposición heterólogo en un modelo de vacunación y exposición de pollos.

EJEMPLO 17

CINC Y PATÓGENOS RESPIRATORIOS

En nuestra investigación anterior (datos no mostrados), hemos demostrado que muchos patógenos gramnegativos expresan una nueva proteína bajo restricción de cinc. Una gran cantidad de estas bacterias son patógenos respiratorios. Algunos de estos patógenos incluyen Moraxella catarrhalis, Haemophilus parasuis, Mannheimia haemolytica, Acinetobacter baumannii, Pasteurella multocida, Bordetella pertussis, y Actinobacillus pleuroneumonía (Stork et al.PLoS Pathogens, 6(7), e10009692010). Se ha informado que esta proteína de adquisición de cinc es una proteína de barril beta transmembrana ahora identificada como ZnuD ubicada en la pared celular externa que utiliza un bucle expuesto de superficie única que contiene dos cisteínas que, cuando se unen mediante un enlace disulfuro, forman un grupo de histidinas que puede interaccionar con un ion de cinc (Stork et al., PLoS Pathogens, 6(7), e 1 000969. 2010). Por lo tanto, ZnuD actúa como una proteína secuestrante utilizada para la adquisición de cinc secuestrado por el organismo huésped.

Todos estos homólogos de ZnuD contienen regiones ricas en His y Asp que se han identificado en la unión de cinc.

Esto sugiere que los mecanismos de adquisición de zinc son importantes para las bacterias que residen en el tracto respiratorio. La explicación actual es que la concentración de zinc libre dentro del tracto mucoso es demasiado baja para permitir una difusión simple a través de la membrana bacteriana a través de proteínas de porina (Stork et al., PLoS Pathogens, 6(7), e10009692010). De este modo, se requieren proteínas como ZnuD para secuestrar cinc. Este secuestro no solo incluye cinc no ligado, sino también la extracción del cinc secuestrado de proteínas como la calprotectina (Liu et al., Cell host & microbe, 11(3), págs. 227-239. 2012). Esta teoría ha sido respaldada por la detección de anticuerpos convalecientes contra ZnuD de portadores sanos, lo que permite suponer que ZnuD es expresado por bacterias que residen en el tracto respiratorio (Stork et al., PLoS Pathogens, 6(7), e1000969. 2010). El objetivo de este experimento era identificar, clonar y evaluar la eficacia de una proteína de adquisición de cinc de Pasteurella multocida. Si un homólogo de ZnuD se expresa en Pasteurella multocida, ofrece otro posible objetivo para el desarrollo de vacunas actualmente inexplorado para controlar este patógeno respiratorio.

EJEMPLO 18

SECUENCIACIÓN GENÓMICA DE PASTEURELLA MULTOCIDA P-1059

El aislado de Pasteurella multocida utilizada para este estudio fue la cepa de referencia P-1059 del ejemplo 1. El ADN genómico se aisló del aislado de Pasteurella multocida usando el Invitrogen de Life Technologies ChargeSwitch gDNA Mini Bacteria Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, número de producto: CS11301). Antes de la extracción del ADN genómico, se cultivó un cultivo fresco del aislado en Agar de tripticasa de soja II con 5 % de sangre de carnero (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, código de producto: 221261) durante la noche a 37 °C. El procedimiento siguió el protocolo del fabricante. El rendimiento final fue de 33,7 |jg de ADN genómico, que se almacenó a -20 °C hasta la secuenciación. El ADN genómico se sometió a ACGt , Inc. para la secuenciación (Wheeling, IL). Las secuencias de referencia de Genbank CP004752 y CP004753 se utilizaron en el ensamblaje de la secuencia genómica completa del aislado.

EJEMPLO 19

POSIBLES GENES OBJETIVO

Después de recibir la secuencia genómica completa del aislado, las alineaciones de tblastn se realizaron con la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) para identificar los posibles genes de interés en función de la homología hacia ZnuD (GenBank AAF62323.1). Se utilizó una búsqueda blastx para identificar las proteínas traducidas por los genes homólogos encontrados con la alineación tblastn. Las alineaciones de secuencias por pares de los homólogos de ZnuD identificados y la región de afinidad de cinc de ZnuD se realizaron utilizando EMBOSS Matcher (Rice et al., Trends in genetics, 16(6), págs. 276-277. 2000).).

EJEMPLO 20

EXPRESIÓN DE UNA PROTEÍNA DE ADQUISICIÓN DE CINC

Para identificar la proteína de adquisición de zinc de Pasteurella multocida utilizamos la secuencia de la proteína de adquisición de zinc de Mannheimia haemolytica identificado previamente en nuestro laboratorio. Resumiendo, la expresión de la proteína diana se evaluó complementando Bacto Brain Heart Infusion, medio de cultivo porcino (BHI) (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, código de producto: 256110) utilizado para el crecimiento de células bacterianas con TPEN (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Portland, OR, código de producto: T1487). Se usó una titulación de TPEN en un intervalo de 0-100 jM durante el crecimiento bacteriano. Los medios BHI que contenían las diversas concentraciones de TPEN se inocularon con un cultivo iniciador del aislado en BHI que no contenía TPEN. El volumen de inóculo fue el 1 por ciento del volumen total del cultivo final. Se permitió que los cultivos crecieran con agitación enérgica a 37 °C hasta una DO540 de 1,0, a menos que las bacterias no pudieran crecer en ciertas concentraciones.

Una vez obtenida una DO de 1,0, las bacterias se sedimentaron por centrifugación a 7000 * g durante 10 minutos. Se realizó una preparación de la membrana externa en las bacterias sedimentadas para aislar las proteínas integrales de la membrana dentro de la membrana externa siguiendo un procedimiento descrito por (Molloy et al., European Journal of Biochemistry, 267(10), pág. 2871-2881.2000) con modificaciones. El precipitado de bacterias se resuspendió en 30 ml de Tris-HCl 60 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, código de producto: T3253) y EDTA 2,5 mM (EMD, Billerica, MA, código de producto: EX0539-3), pH 8,5. Luego, las bacterias se lisaron mediante sonicación utilizando un procesador ultrasónico analógico Sonifier S-450A con un Bio-Hom con punta de 1,27 cm (1/2") de diámetro conectado a un convertidor 102-C (Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT, código de producto: 101-063-198, 101-47-037 y 101-135-066 respectivamente) durante 1 minuto y 30 segundos en hielo con un ajuste de potencia de 9 y un ciclo de trabajo de 90. La muestra se aclaró mediante centrifugación a 39000 * g y 4 °C durante 20 minutos para eliminar los restos de células grandes. Para quitar la membrana interna, peptidoglicano y proteínas que no se encuentran dentro de la membrana externa, se añadió Hamposyl L-30 (Chattem Chemicals, Inc., Chattanooga, TN, código de producto: BD2099) al sobrenadante a una concentración final del 1 % y se incubó durante 16 horas a 4 °C mientras se agitaba de un extremo a otro. La membrana externa se sedimentó por centrifugación a 39000 * g y 4 °C durante 2 horas. El sedimento de la membrana externa se lavó y se resuspendió en agua tamponada con Tris-HCl 25 mM, pH 7,2.

Las proteínas integrales de membrana se visualizaron mediante SDS-PAGE. Antes de la electroforesis, se realizó un BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, código de producto: 23225) para cuantificar la proteína dentro de cada muestra para permitir cargas de proteína equivalentes de 30 |jg. Las muestras se llevaron hasta el mismo volumen antes de añadir el tampón de carga 3X (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA, número de producto: B7703S). Las muestras se compararon en el gel para buscar la expresión de la proteína diana.

EJEMPLO 21

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

El perfil de bandas de la preparación de la membrana externa se analizó mediante espectrometría de masas de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI) para determinar si alguna de las bandas de interés coincide con los genes identificados por homología BLAST. Las bandas se cortaron del gel con un bisturí y se enviaron a las instalaciones del núcleo de proteómica de Mayo Clinic para su análisis.

EJEMPLO 22

MODELO ESTRUCTURAL

Se utilizó el modelo Swiss para crear un modelo estructural tridimensional de la proteína de adquisición de cinc de Mannheimia haemolytica basado en la secuenciación por homología (Arnold et al., Bioinformatics, (22), pág. 195-201.

2006).). La plantilla PDB utilizada para crear el modelo de proteína fue 4epaA. Las posiciones de la secuencia del bucle extracelular (ECL) se identificaron utilizando el modelo estructural tridimensional obtenido del modelo Swiss (Arnold et al., Bioinformatics, (22), pág. 195-201. 2006).), Prediction of TransMembrane Beta-Barrel Proteins (Bagos et al., BMC Bioinformatics, 5(29). 2004).), Base de datos de orientaciones de proteínas en membranas (OMP) y servidor de posicionamiento de proteínas en membranas (PPM) (Lomize et al., Nucleic Acids Res, 40(Database issue):D370-6. 2012).

EJEMPLO 23

IDENTIFICACIÓN DEL GEN DIANA

Una vez que se identificaron las proteínas dentro del perfil de bandas, se compararon con las proteínas de interés identificadas por homología BLAST. Una proteína dentro del perfil de bandas coincidía con una proteína identificada por la homología BLAST. La proteína se identificó como receptor de hierro de la membrana externa de la familia OMR (GenBank: EDN73812.1), también denominada proteína de adquisición de cinc en el presente documento. El gen diana se localizó en los nucleótidos 1.160.319... 1.162.691 dentro del genoma. El péptido señal se identificó usando SignalP 4.1 (Petersen et al., Nature methods, 8(10), págs. 785-786. 2011)). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína de adquisición de cinc identificada en Pasteurella multocida se muestra en la Figura 22. EJEMPLO 24

LA HOMOLOGÍA DE LA PROTEÍNA DE ADQUISICIÓN DE CINC ENTRE PATÓGENOS RESPIRATORIOS

Utilizando la secuencia de la proteína de adquisición de Mannheimia haemolytica (datos no mostrados) la homología de la proteína de adquisición de cinc a través de patógenos respiratorios, particularmente la región de afinidad del zinc, se determinó con la herramienta de búsqueda de blastos de proteínas establecida por NCBI. Se encontró que diez especies diferentes de bacterias contenían un homólogo de proteína de adquisición de cinc con más del 49 % de identidad. Todas las especies identificadas son patógenos respiratorios. La alineación de las proteínas homólogas con la región de afinidad de zinc de ZAP utilizando Clustal Omega resalta motivos de aminoácidos sorprendentemente similares. Todos los homólogos contienen dos cisteínas y múltiples histidinas y ácidos aspárticos. Los motivos de aminoácidos se enfatizan en la Figura 25 usando GLAM2. La disposición espacial de las cisteínas, las histidinas y los ácidos aspárticos permanecen constantes entre los homólogos.

Tabla 2.

(continuación)

_

Los resultados muestran que múltiples patógenos respiratorios muestran cierto grado de homología con la proteína de adquisición de zinc de Mannheimia hemolítica que van del 49 al 98 por ciento de identidad.

EJEMPLO 25

EXPRESIÓN E IDENTIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA DE ADQUISICIÓN DE CINC

Clonación

El gen de cinc de Pasteurella multocida se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de la cepa P-1059 y se insertó en el vector plasmídico pQE-T7-2 (Qiagen; Hilden, Alemania) utilizando los métodos de montaje de Gibson. El plásmido ensamblado luego se transformó en NEB T7 Express Competent E. coli (New England Biolabs; Ipswitch, MA; n.° catálogo C2566H) para selección clonal y expresión.

Expresión

Se inoculó un cultivo iniciador de caldo LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina con un clon que contenía el plásmido recombinante. El cultivo se hizo crecer hasta una DO540 de 0,6 y luego se transfirió a caldo LB fresco. Se permitió que el nuevo cultivo creciera de nuevo hasta una DO540 de 0,6. Luego se indujo la expresión con IPTG 1 mM y se incubó 16 horas adicionales. Las células se recolectaron por centrifugación y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento.

Purificación de cuerpos de inclusión

Las células se descongelaron y se resuspendieron en reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Merck Millipore; Billerica, MA; n.° de catálogo 70584-4). se añadieron 10 μl de reactivo de bioprocesamiento Lysonase (Merck Millipore; Billerica, MA; n° de catálogo 71230) y la suspensión se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se sonicó la suspensión (Branson Sonifier, modelo 102c; Branson Ultrasonics, Danbury, CT) durante 30 segundos usando una punta micro, salida 6, en un ciclo de trabajo del 90 %. El lisado se centrifugó a 16000 * g durante 20 minutos para recoger el material insoluble. El sedimento se lavó tres veces: primero con BugBuster, segundo con 1/10x BugBuster y tercero con agua tamponada con tris. La preparación de cuerpos de inclusión se solubilizó en solución salina tamponada con Tris que contenía urea 8 M y ditiotreitol 1 mM a pH 8,0, produciendo 10 mg de proteína recombinante. La figura 24 muestra las diferentes etapas de expresión de la proteína de adquisición de cinc en un gel TGX libre de manchas Criterion al 10 % y 300 V (Bio-Rad, Hércules, CA) para incluir: la preparación de células enteras no inducidas, la preparación de células enteras inducidas, el sobrenadante de células lisadas, 1X lavado bugbuster, 1/10X lavado de bugbuster, los cuerpos de inclusión solubilizados y el sedimento después de la solubilización.

EJEMPLO 26

Protección mediada por vacuna de una nueva proteína de cinc recombinante de Pasteurella multocida en un modelo de pollo con sepsis

El propósito del siguiente estudio experimental fue evaluar la eficacia protectora de una proteína de cinc recombinante (rCinc) contra una exposición virulenta de Pasteurella multocida en un modelo de sepsis en pollo. La eficacia de la proteína rCinc del ejemplo 25 se comparó con la eficacia de la composición de extracto SRP de Pasteurella multocida del ejemplo 14 en comparación con controles no vacunados. Resumiendo, Los pollos Leghorn SPF 30, (machos), se obtuvieron de Valo BioMedia (Adel, IA). Los pollos se dividieron en tres grupos de 10 aves cada uno. Las aves fueron identificadas por bandas de colores en las patas. Los grupos de tratamiento se designaron Grupo-A (Placebo), Grupo-B (proteína rCinc) y Grupo C ("extracto proteico de Pasteurella multocida). El parámetro de resultado utilizado para evaluar la eficacia de la vacuna en este experimento fue la mortalidad total entre los vacunados en comparación con el grupo de placebo no vacunado. Se suministró agua y alimentos ad libitum a todos los pollos.

EJEMPLO 27

Preparación de las Composiciones Inmunizantes

Las vacunas (extracto de SRP y rCinc) se prepararon a partir de las composiciones proteicas de los ejemplos 14 y 25 diluyendo el antígeno en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 8,0 g/l de NaCl, 0,2 g/l de KCl, 1,44 g/l de Na₂HPO₄ y 0,24 g/l de KH₂PO₄ a pH 7,4. Cada vacuna se preparó emulsionando los siguientes ingredientes: suspensión acuosa de proteínas al 44,44 % en solución salina formalizada al 0,1 %, 50 % de aceite mineral Drakeol 6 (VOPAK EE.UU., Inc, Kirkland, Washington), 3,0% de Span 85 y 2,56% de Tween 85 (Ruger Chemicals, Hillside, Nueva Jersey). La dosis final para aves para cada composición de vacuna (rCinc y extracto de SRP) fue de 250 |jg y 400 jg administrados en un volumen de 0,5 ml y 0,25 ml respectivamente. El placebo se preparó reemplazando el antígeno con solución salina fisiológica y emulsionando la suspensión utilizando la formulación anterior en un volumen de dosis de 0,5 ml. Todas las aves fueron vacunadas por vía subcutánea a las 14 y 17 semanas de edad (intervalo de 21 días).

EJEMPLO 28

EXPOSICIÓN Y RESULTADOS

A las 19 semanas de edad, todas las aves fueron expuestas por vía intramuscular en la pechuga a 5450 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de Pasteurella Multocida (serotipo 1) cepa X-73 preparada como se describe en el ejemplo 8. Se observó la mortalidad de las aves durante 14 días después de la exposición. Los resultados demuestran claramente la eficacia tanto del extracto de SRP de Pasteurella multocida y las vacunas de rCinc que tienen un porcentaje de supervivencia del 100 % y 50 % respectivamente, en contraste con los controles no vacunados que no tienen supervivientes (Figura 23). La proteína de cinc recombinante en este estudio se evaluó en una concentración única de 250 jg , mostrando una tasa de supervivencia del 50 % (p = 0,0325) frente a una exposición virulenta.

La descripción detallada y los ejemplos anteriores se han proporcionado solo para claridad de comprensión. No deben entenderse limitaciones innecesarias a partir de ello.

A menos que se indique otra cosa, todos los números que expresan las cantidades de componentes, pesos moleculares y otros que se usan en la memoria descriptiva y reivindicaciones han de entenderse estando modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario de otro modo, los parámetros numéricos establecidos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que han de obtenerse mediante la presente invención. Como mínimo, y no en un intento de limitar la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos indicados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo habituales.

A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención sean aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se indican de la manera más precisa posible. Todos los valores numéricos, sin embargo, contiene de forma inherente un intervalo que resulta necesariamente de la desviación típica que se encuentra en sus respectivas mediciones de prueba.

Todos los títulos son para la conveniencia del lector y no deben usarse para limitar el significado del texto que sigue al título, a menos que así se especifique.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende:

una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 25-968 del SEQ ID NO:2, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 27-790 del SEQ ID NO:4, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 23-727 del SEQ ID NO:6, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 25-964 del SEQ ID NO:8, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 26-848 del SEQ ID NO:10, una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 27-784 del SEQ ID NO:12 y una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 25-742 del SEQ ID NO: 14, en donde la composición protege a un pollo contra la exposición con Pasteurella multocida.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición comprende además una proteína aislada que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 26-805 del SEQ iD NO:44.

3. Una composición que comprende:

proteínas aisladas que tienen pesos moleculares de 99 kDa, 81 kDa y 80 kDa según lo determinado por SDS-PAGE, en donde las proteínas se pueden aislar de Pasteurella multocida cuando se incuba en medios que contienen un quelante de hierro y no se pueden aislar cuando se cultiva en medios sin el quelante de hierro, y proteínas aisladas que tienen pesos moleculares de 109 kDa, 109 kDa, 89 kDa y 87 kDa según lo determinado por SDS-PAGE, en donde las proteínas se pueden aislar de una Pasteurella multocida cuando se incuba en medios que comprenden un quelante de hierro, y en donde las proteínas son expresadas por la P. multocida cuando se incuba en medios sin el quelante de hierro y se expresa a un nivel mejorado durante el crecimiento en medios que contienen un quelante de hierro, en donde la composición protege a un pollo contra la exposición con Pasteurella multocida.

4. La composición de las reivindicaciones 1, 2 o 3 que comprende además:

(i) al menos una proteína aislada con un peso molecular de 249 kDa, 60 kDa, 42 kDa, 38 kDa, 27 kDa, 26 kDa o 22 kDa según lo determinado por SDS-PAGE, en donde las proteínas se pueden aislar de P. multocida; o (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable; o

(iii) un adyuvante.

5. Una composición que comprende:

(i) una célula entera aislada es una célula diseñada para expresar siete proteínas, en donde las siete proteínas son una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 25-968 del SEQ ID NO: 2, una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 27-790 del SEQ ID NO:4, una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 23-727 del SEQ ID NO:6, que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 25-964 del SEQ ID NO:8, una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 26-848 del SEQ ID NO:10, una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 27-784 del SEQ ID NO: 12 y una proteína que tiene al menos un 80% de identidad con los aminoácidos 25-742 del SEQ ID NO:14,

opcionalmente en donde la celda es E. coli,

opcionalmente, en donde la célula entera aislada se modifica para expresar adicionalmente una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 26-805 del SEQ ID NO: 44; o

(ii) dos o más poblaciones de microbios donde cada una de las poblaciones expresa un subconjunto de las siete proteínas enumeradas en (i) y las dos o más poblaciones cuando se consideran como un todo expresan las siete proteínas,

opcionalmente donde las dos o más poblaciones de microbios expresan además una proteína que tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 26-805 del SEQ ID NO:44;

en donde la composición protege a un pollo contra la exposición con Pasteurella multocida.

6. La composición de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 5, en donde el pollo es un primer pollo, en donde la composición protege al primer pollo contra la exposición con un serotipo 2x5 de P. multocida y en donde la composición protege a un segundo pollo contra la exposición a un serotipo 3x4 de P. multocida.

7. Una composición de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 5, para su uso en la inducción en un sujeto para producir un anticuerpo que se une específicamente al menos a una proteína de la composición.

8. Una composición de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 5, para su uso en el tratamiento de una infección o el tratamiento de un síntoma en un sujeto con riesgo de tener una infección causada por P. multocida.

9. Una composición de las reivindicaciones 1, 2, 3 o 5, para su uso en la disminución de la colonización en un sujeto colonizado por P. multocida.

10. Una composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde (i) el sujeto es un mamífero, opcionalmente un bovino; o (ii) el sujeto es un ave, opcionalmente en donde el ave es un pollo o un pavo; o (iii) en donde se administran al menos 700 microgramos (|jg) y no más de 1.200 |jg de proteína.