CN107921114A - 包含克雷伯氏菌属蛋白的蛋白质和免疫组合物以及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供可从克雷伯氏菌属分离的分离蛋白。还提供包括所述蛋白质中的一种或多种的组合物以及用于制备所述蛋白质的方法和用于使用所述蛋白质的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月10日提交的美国临时申请序列号62/190,947的权益,所述申请以引用的方式并入本文。
背景
在美国细菌感染现在每年导致大约170万例医源性感染(每100例入院中有4.5例),其中总体死亡率在20%至60%范围内或99,000例死亡与医源性感染直接相关联。估计在美国由此类感染造成的经济影响每年花费50亿至100亿美元之间。
革兰氏阴性细菌感染和其后遗症通常是致命的。估计单独在美国每年超过700,000名患者变得易受细菌感染。在这些患者中,160,000名患者实际上发展败血病,导致每年50,000例死亡。这些中大多数为由革兰氏阴性杆菌诸如大肠杆菌(从具有革兰氏阴性脓毒症的患者中分离出的最常见致病菌),在频率上接着是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)造成的医源性感染。
由革兰氏阴性细菌(包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae))造成的感染在人医疗保健和畜牧业环境中均一直为显著问题。肠杆菌科中的细菌为天然生境为人和动物肠道的大型异质组。所述科包括许多属并且被细分成八个族,包括:埃希氏菌族(Escherichieae)、爱德华氏菌族(Edwardsielleae)、沙门氏菌族(Salmonelleae)、柠檬酸杆菌族(Citrobactereae)、克雷伯氏菌族(Klebsielleae)、变形菌族(Proteeae)、耶尔森氏菌族(Yersineae)和欧文氏菌族(Erwineae)。肠杆菌科的许多种常常为具有临床相关意义的机会致病菌,包括埃希氏菌属(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、变形杆菌属(Proteus spp.)、普罗威登斯菌属(Providenciaspp.)、沙雷氏菌属(Serratia spp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)、摩根氏菌属(Morganella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)和沙门氏菌属(Salmonella spp.),处于造成感染的前二十种生物体之中。当发生临床上重要的疾病时,这些疾病常常由大肠杆菌引起,但其他细菌也可以感染并且造成使人衰弱的疾病。在大多数情况下,当细菌在正常宿主防御不足时到达它们正常肠环境之外的组织时,这些细菌变成具有致病性。这在现今在年轻人或老年人中尤其明显;常常在由免疫学功能不全或免疫抑制造成的首发感染的终末阶段中;使生物体到达血流造成脓毒症从而导致死亡或继发性后遗症。
克雷伯氏菌属种为属于肠杆菌科的棒状革兰氏阴性兼性厌氧细菌。现今,已知7个种被证明在DNA同源性方面具有类似性:肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiellaozaenae)、鼻硬结克雷伯氏菌(Klebsiella rhinoscleromatis)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)和解鸟氨酸克雷伯氏菌(Klebsiella omithinolytica)。克雷伯氏菌属在自然界中无所不在。它们常见于多种环境中,诸如土壤、植被、水以及人和动物肠道。在人和动物中,克雷伯氏菌属可以定殖于皮肤或兽皮、咽部或胃肠道,并且常常被认为是结肠和肠道的许多部分中的正常菌群。肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌是动物和人群体中最为临床相关性的两个种。
克雷伯氏菌属的致病性可归因于多种毒力因子包括产生热稳定肠毒素、荚膜多糖(CPS)、脂多糖、粘附素(1型和3型性毛、KPF-28菌毛、CF29K和聚集性粘附素)和铁获取系统(Podschun等,Clin.Microbiol.Rev.11(4):589-603.1998;Yu等,Emerg.Inf.Dis.13:986-993,2007)。
动物中的克雷伯氏菌属是以下的重要原因:马的子宫炎和不孕症、牛物种的乳腺炎、黄牛的起源于肺部病变的血原性骨髓炎、马的脓胸的脓液积累、猫和狗的支气管肺炎以及在由药物疗法、营养不良、应激、内分泌病和其他感染包括犬细小病毒和猫免疫缺陷病毒感染引起的免疫抑制之后常出现的继发性感染的后遗症。
现今,农业对于人福利而言是关键的,因为其产生食物,这是全球生存的一种主要必需品。许多因素对动物群体的稳定性和健康造成不利影响,到目前为止,最重要的因素之一为可能造成成年动物和/或年幼动物的广泛死亡的感染性疾病。生产动物的细菌感染可能严重影响动物健康的所有方面,导致所有行业的巨大的经济损失。现今,动物传染性和新发感染性疾病对人健康造成威胁。所有人致病菌中有至少百分之六十一可在动物与人之间传播。动物传染病占新发感染性疾病的百分之七十五。生产动物的感染性疾病和动物传染性疾病的增加主要是由于农业集约化,尤其是在黄牛(牛肉和乳品)、猪和家禽行业中。
在人类中,克雷伯氏菌属的相互作用的范围从机会致病菌(主要在住院患者和社区获得性感染中)到频繁在肠道发生和较不频繁在鼻咽发生的无症状携带。作为医院感染,克雷伯氏菌属主要与尿道和呼吸道感染以及可能引起致命性败血病的伤口和软组织感染相关联。临床综合征的范围包括菌血症、肺炎、尿道感染(UTI)、血栓性静脉炎、上呼吸道感染、胆囊炎、伤口感染、骨髓炎、内源性眼内炎、眼内炎、心内膜炎和脑膜炎。据估计,克雷伯氏菌属占地方性医院感染的8%并且占流行病爆发的3-7%(Stamm等,Comparison ofendemic and epidemic nosocomial infections,第9-13页.R.E.Dixon(编),Nosocomialinfections.Yorke Medical Books,Atlanta,GA.1981)。克雷伯氏菌属造成多达14%的原发性菌血症病例,仅次于造成革兰氏阴性脓毒症的大肠杆菌。已从具有囊性纤维化的21%的患者的支气管肺泡灌洗样本中分离出克雷伯氏菌属(Lyczak等Clinical microbiologyreviews 15.2(2002):194-222)。
鼻硬结克雷伯氏菌和臭鼻克雷伯氏菌为较不常见的并且很少诱导临床感染。鼻硬结克雷伯氏菌可诱导涉及鼻咽的慢性炎性过程,而臭鼻克雷伯氏菌诱导特征在于鼻粘膜坏死和粘液脓性鼻涕的慢性萎缩性鼻咽。
产酸克雷伯氏菌牵涉到早产儿的新生儿菌血症和新生儿重症监护病房。
产生碳青霉烯酶的肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)的出现成为全球性健康问题,在动物和人健康行业中有重要的临床意义。已显示肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)赋予对多种抗微生物剂的耐药性,包括几乎所有β-内酰胺、氟喹诺酮和氨基糖苷。碳青霉烯类为具有广谱抗菌活性的一类β-内酰胺抗生素,用于治疗由产生超广谱β-内酰胺酶的革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌引起的感染。碳青霉烯酶为肺炎克雷伯氏菌产生的酶,其能够使碳青霉烯类并且有时使其他类的β-内酰胺灭活。碳青霉烯酶存在于属于肠杆菌科、假单胞菌属和不动杆菌属中。此类耐药性机制限制了可用于治疗肺炎克雷伯氏菌的药剂数。
在人群体中,肺炎克雷伯氏菌感染常见于医院,肺炎克雷伯氏菌感染在医院造成插入导管的患者的肺炎(特征在于出现血痰)和尿道感染。事实上,肺炎克雷伯氏菌作为尿道致病菌仅次于大肠杆菌。其占所有医院尿道感染(UTI)的百分之六至十七。克雷伯氏菌属感染现今比过去更常遇到,并且此类发生增加可能是由于细菌的抗生素耐药性性质。克雷伯氏菌属种可能含有抗性质粒(R质粒),其赋予对抗生素诸如氨苄青霉素和羧苄青霉素的耐药性(Wu等,Clin Microbial Infect,11∶893-897.2005)。更糟的是,R质粒能够转移到不一定为相同物种的其他肠道细菌。多药耐药性克雷伯氏菌属的医院爆发经常由作为ESBL产生者(超广谱β内酰胺酶)的新菌株类型引起。在过去若干年中,临床克雷伯氏菌属分离株中产ESBL菌株的发生率平稳增加。在某些区域中已报道多达40%的频率。为了治疗肺炎克雷伯氏菌感染,有为数不多的抗生素可供使用,如头孢吡肟(Cefepime)、多粘菌素B(Polymyxin B)、碳青霉烯、美罗培南(Meropenem)和亚胺培南(Imipenem)(Parchuri等,Heart lung,5∶360-363.2005;Ueda等,Antimicrob Agents Chemother,49:4185-4196.2005;Sanchez等Emerg InfectDis 19.1(2013):133-6)。
使用抗生素以用于控制肺炎克雷伯氏菌的替代方案是尝试通过疫苗接种来实现免疫学控制。针对克雷伯氏菌属的有效疫苗可大大缓解由这些细菌引起的显著的全球发病率和死亡率。已对针对克雷伯氏菌属的安全并且有效的疫苗进行了尝试,但成效有限。许多细菌组分已被评估为潜在的疫苗开发策略,并且包括粘附物和菌毛、荚膜多糖、脂多糖(LPS)和外膜蛋白质。已发现抗荚膜多糖抗体提供高度的针对对应的荚膜血清型的保护(Cryz等,J Infect Dis,150:817-822.1984;Cryz等J Clin Microbiol,23:687-690.1986)。在1期试验中评估了24价克雷伯氏菌属荚膜多糖疫苗,所述试验指示所述疫苗是安全的(Cryz等,Infect Immun,50:225-230.1985)。疫苗的进一步评估揭示,抗荚膜疫苗接种所面临的问题是天然克雷伯氏菌属群体中荚膜抗原的变化性。24价疫苗中疫苗血清型的选择是基于来源于见于欧洲和美国的菌血症患者的最普遍血清型。但是,疫苗中所包括的血清型仅占见于其他地理区域的菌株的29%,并且因为不包括这些血清型而导致缺乏功效。此外已显示,用含LPS疫苗的主动免疫可导致诱导不利的毒性反应,这些反应由内毒素含量引起(Yadav等,Folia Microbiologica,50:83-86.2005)。已利用细胞毒素类毒素、七价或一价细菌提取物(Libon等,Vaccine,20:2174-2180.2002)和/或外膜蛋白质诸如OmpA(Jeannin等,Vaccine 20,增刊4:A23-A27.2002)针对控制克雷伯氏菌属感染对其他候选疫苗进行了评估。
在哺乳动物中已显示,对组织损伤或细菌感染的应答导致急性炎性应答。此类应答增加毛细管渗透性和吞噬细胞浸润,导致被认为是炎症的临床征象;肿胀、发烧、疼痛和发红。如果不加以控制,这可能引起死亡。体液因子的激活和细胞因子的释放介导全身性事件,这些事件统称为急性期蛋白质应答,此类应答导致一系列的生理和生物化学事件。此类应答的持续时间与损伤的严重程度和全身性感染的量级正相关。已充分证明,在细菌性脓毒症、大手术、烧伤和其他身体创伤期间,血清中许多金属离子诸如铁、铜和锌的浓度改变。例如,在感染的急性期期间,铁和锌的血浆水平下降,并且铜的血浆水平增加。血清中这些痕量金属离子的改变可直接影响任何细菌感染的严重程度或进展。
已显示金属离子诸如铁由于其在电子传递中起作用而成为大多数生物体的必需营养物。因为铁在中性pH下的溶解度非常低,所以其必须通过与专门的蛋白质载剂(诸如血液中的转铁蛋白、分泌液中的乳铁蛋白、白蛋白中的卵转铁蛋白和细胞内的铁蛋白)缔合来保持在溶液中。已经认识到,哺乳动物宿主中通常存在的游离铁的浓度不足以支持细菌的生长。因此,宿主物种内铁的可用性低为微生物必须克服的首要感染屏障之一,并且细菌发展出从其宿主获得铁的策略也不足为奇。
针对铁获取研究最多的细菌系统之一为铁载体的细菌体统,铁载体为能够与宿主蛋白质载剂竞争结合三价铁的低分子量铁配体(Miethke等,Microbiol Mol Rev,71(3):413-451.2007)。当铁载体与细胞表面上的特异性受体蛋白相互作用时,螯合的铁被主动转运到细菌周质中。此类活性所需的能量似乎取决于蛋白质TonB、ExbB和ExbD(Miethke等,Microbiol Mol Rev,71(3):413-451.2007)。一旦铁已到达周质,就经由ATP结合盒(ABC)转运系统被转运到细胞质中(Budzikiewicz等,Siderophore from bacteria and fromfungi.Iron uptake and homeostasis in Microorganisms.第1版Caister AcademicPress.第1章,2010)。一旦铁载体-铁复合物进入细胞质,铁就被卸载并且铁载体被再循环或降解。
大多数克雷伯氏菌属菌株具有编码铁载体受体蛋白FepA、IroN、CirA、FhuA和FhuE的基因(Williams等,FEMS Microbiol Lett.44:407-412.1987)。一份最近的研究评估了fepA、IroN和CirA蛋白的单个、双重和三重突变体的作用以研究受体的特异性(Rabsch等,Infect Immun.12:6953-69612003)。结果表明,这些受体不是完全特异的;大多数可利用各种铁载体的铁,并且若干铁载体可被三种蛋白质中的任一种使用。此外,若干铁载体受体蛋白(铁调控蛋白)使用其他种类细菌或真菌所产生的铁载体,这种铁获取的机制被称为“铁载体袭夺(siderophore piracy)”(Pool等,Appl Environ Microbiol 58:119.1992)。克雷伯氏菌属的铁吸收系统的多样性和冗余性强调了细菌对于在各种条件下获得铁的重要性。有铁获取为克雷伯氏菌属发病机理的重要方面的有力证据(Brisse等,Prokaryotes,6:159-196.2006)。
目前市场上或者根据可公开获得的信息现行的临床前或临床开发中没有预防性克雷伯氏菌属疫苗。
申请概述
本文提供组合物。在一个实施方案中,组合物包括分子量为82kDa、78kDa、72kDa或68kDa的至少两种分离蛋白。所述蛋白质当在包含铁螯合剂的培养基中孵育时可从肺炎克雷伯氏菌分离并且当在不具有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离。所述组合物保护动物不受肺炎克雷伯氏菌感染。在一个实施方案中,动物为小鼠、奶牛或人。在一个实施方案中,所述蛋白质中的至少一种包括结构上类似于SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44或与其具有100%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中,组合物包括至少两种分离蛋白,所述蛋白质结构上类似于选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的蛋白质或与其具有100%同一性。
在一个实施方案中,组合物包括至少两种蛋白质,所述蛋白质结构上类似于选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:64的蛋白质或与其具有100%同一性。
在一个实施方案中,组合物还包括分子量为35kDa和33kDa的一种或两种蛋白质,所述蛋白质也可从肺炎克雷伯氏菌分离。在一个实施方案中,组合物还包括具有结构上类似于SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:64或与其具有100%同一性的氨基酸序列的蛋白质。在一个实施方案中,组合物还包括87kDa蛋白质,所述蛋白质当在包含铁螯合剂的培养基中孵育时可从肺炎克雷伯氏菌分离。在一个实施方案中,组合物还包含药学上可接受的载剂。在一个实施方案中,组合物还包括佐剂。
本文还提供方法。在一个实施方案中,一种方法包括向受试者施用一定量本文所述的组合物,所述量足以诱导所述受试者产生特异性地结合所述组合物的至少一种蛋白质的抗体。在一个实施方案中,一种方法包括向患有由革兰氏阴性微生物引起的感染或处于患有所述感染的风险的受试者施用有效量本文所述的组合物。在一个实施方案中,一种方法包括向患有由革兰氏阴性微生物引起的感染或处于患有所述感染的风险的受试者施用有效量本文所述的组合物。在一个实施方案中,一种方法包括向由革兰氏阴性微生物定殖的受试者施用有效量本文所述的组合物。革兰氏阴性微生物可选自肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、柠檬酸杆菌属或其组合。
在一个实施方案中,一种方法为用于治疗受试者的病状,并且包括向有需要的受试者施用有效量本文所述的组合物。在一个实施方案中,受试者患有由克雷伯氏菌属引起的感染或处于患有所述感染的风险。在一个实施方案中,病状由以下引起:肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、柠檬酸杆菌属或其组合。在不同的实施方案中,病状可包括乳腺炎、受试者乳汁中细胞计数高、乳汁产量低或其组合。
在一个实施方案中,受试者为动物,诸如人或牛。在一个实施方案中,克雷伯氏菌属为肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌。在一个实施方案中,施用至少700微克(μg)并且不大于1,200μg蛋白质。
本文还提供试剂盒。在一个实施方案中,试剂盒在单独的容器中包括本文所述的组合物的分离蛋白和检测特异性地结合所述蛋白质的抗体的试剂。在一个实施方案中,试剂盒在单独的容器中包括特异性地结合本文所述的组合物的分离蛋白的抗体和特异性地结合所述蛋白质的第二试剂。
本文还提供包括本文所述的组合物的蛋白质的分离全细胞和特异性地结合所述全细胞的分离抗体。
术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指本发明的在某些情况下可以提供某些益处的实施方案。然而,在相同或其他情况下,其他实施方案也可以是优选的。此外,一个或多个优选实施方案的表述并不意味着其他实施方案不可用,并且不旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变型形式在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制性意义。
除非另有指定,否则“一个/种(a/an)”、“所述”和“至少一个/种”可互换使用,并且意指一个/种或多于一个/种。
此外在本文中,通过端点表述的数值范围包括归入所述范围内的所有数字(例如,1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于包括不连续步骤的本文所公开的任何方法,可以任何可行的顺序进行所述步骤。并且,在适当时,可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
本发明的以上概述不旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实现方式。下面的描述更具体地例示了说明性实施方案。在整个申请的数个地方,通过实例的列表提供指导,这些实例可以各种组合使用。在每种情况下,所列举的列表仅用作代表性组,并且不应解释为排他性列表。
附图简述
图1.针对肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和大肠杆菌的身份确认的克雷伯氏菌属多重PCR。
图2.从具有乳腺炎的奶牛分离出的肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和肠杆菌的牛野生分离株以及肺炎克雷伯氏菌人分离株LM21的电泳概况,其显示金属调控蛋白概况的保守性。
图3.包括肺炎克雷伯氏菌1571的铁饱满和铁缺乏生长条件的外膜蛋白概况的差异,其显示如通过SDS-PAGE所检查在铁饱满条件下金属调控蛋白的表达。泳道1,分子量标记物;泳道2,铁缺乏;泳道3,铁饱满。
图4.肺炎克雷伯氏菌1571LC/MS/MS。肺炎克雷伯氏菌1571分离株,其显示通过LC/MS/MS鉴别的铁载体受体蛋白CirA、FecA、FepA和FhuA,连同孔蛋白蛋白OmpC和OmpA。
图5.不同属和种的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌LM21的电泳概况(图5A)和蛋白质印迹(图5B),显示金属调控蛋白概况的变化和交叉反应性。将来源于肺炎克雷伯氏菌1571的超免疫血清用于蛋白质印迹。
图6.小鼠中针对同源和异源攻击的肺炎克雷伯氏菌1571疫苗的交叉保护。
图7-21.肺炎克雷伯氏菌1571编码的蛋白质序列和编码对应蛋白质的核苷酸序列的实例。
图22.用肺炎克雷伯氏菌1571攻击之后小鼠的存活。
图23.通过ELISA测量的疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗的小母牛的血清学应答。
图24.用肺炎克雷伯氏菌攻击之后疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗的小母牛对比对照的乳汁评分。用肺炎克雷伯氏菌1571攻击之后累积乳汁评分。用肺炎克雷伯氏菌攻击之后肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种与对照之间累积乳汁评分的差异。
图25.同源攻击会后疫苗接种与对照之间肺炎克雷伯氏菌1571的定量清除的差异。
图26.疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗的奶牛相较于安慰剂对照奶牛的ELISA血清学应答。
图27.使用蛋白质简单毛细管电泳系统的蛋白质印迹。样本A,分子量标记物;样本B,用安慰剂血清印迹的肺炎克雷伯氏菌1571疫苗抗原;样本C,用肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种的奶牛的血清印迹的肺炎克雷伯氏菌1571疫苗抗原;样本D,分子量标记物;样本E,用安慰剂血清印迹的重组FecA;样本F,用肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种的奶牛的血清印迹的重组FecA。
图28.疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗之后大肠杆菌性乳腺炎的盛行。显示安慰剂疫苗接种组对肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种组中临床大肠杆菌性乳腺炎中在乳汁中1-90天奶牛数的图。数据提供预防分数0.4667(95%CI:0.0494to 0.7008);P=0.0305.
图29.疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗之后大肠杆菌性乳腺炎的发生率。显示安慰剂疫苗接种组对肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种组中临床大肠杆菌性乳腺炎的发生率的图。数据提供预防分数0.5478(95%CI:0.1953to 0.7549);P=0.0057.
图30.显示随时间推移不具有大肠杆菌性乳腺炎的奶牛比例的图。由大肠杆菌类引起的乳腺炎的危险比率的估计值为0.494,95%置信区间为0.269至0.906。这表明与由生物体引起的所有大肠杆菌性乳腺炎的乳腺炎风险降低大约50.6%,并且与产生的显著p值一致(p=0.02278)。每行代表尚未患有大肠杆菌性乳腺炎的个体的比例。每次行下降表示观察到乳腺炎事件。
图31.疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗之后克雷伯氏菌属乳腺炎的盛行。显示安慰剂疫苗接种组对肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种组中临床克雷伯氏菌属乳腺炎中在乳汁中1-90天奶牛数的图。
图32.疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗之后克雷伯氏菌属乳腺炎的发生率。图显示安慰剂疫苗接种组对肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种组中乳品中1-90天奶牛的临床克雷伯氏菌属乳腺炎病例数。
图33.显示随时间推移不具有克雷伯氏菌属乳腺炎的奶牛比例的图。此克雷伯氏菌属数据组的危险比率的估计值为0.272,95%置信区间为0.089至0.825。这表明与雷伯氏菌属的乳腺炎风险降低大约72.8%,并且与产生的显著p值一致(p=0.0215)。每行代表尚未患有合格乳腺炎的个体的比例。每次行下降表示观察到乳腺炎事件。
图34.乳汁(可销售乳汁)中8天开始至乳汁中90天每天乳汁产量的曲线(磅乳汁每只奶牛)。
图35.按月计的研究中疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗对安慰剂的奶牛的每只奶牛每日乳汁产量的平均。误差棒显示95%置信区间。
图36-38.大肠杆菌菌株CFT073编码的氨基酸序列可编码对应蛋白质的核苷酸序列的实例。
说明性实施方案的详述
蛋白质
本文提供蛋白质和包括蛋白质的组合物。如本文所用,“蛋白质”广义地指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。因此例如,术语肽、寡肽、蛋白质和酶都包括在蛋白质的定义内。此术语还包括蛋白质的表达后修饰,诸如糖基化、乙酰化、磷酸化等。术语蛋白质并不意味特定长度的氨基酸的聚合物。蛋白质可以直接从天然来源分离,或可以借助重组技术、酶技术或化学技术制备。就天然存在的蛋白质而言,此类蛋白质通常是分离的。
“分离”蛋白为已从其天然环境去除的蛋白质。例如,分离蛋白为已从细胞质或从细胞膜去除的蛋白质,并且许多蛋白质、核酸和其天然环境的其他细胞物质不再存在。
表征为可从具体来源“分离”的蛋白质为在适当的条件下通过已鉴别的来源产生的蛋白质,但是所述蛋白质可以使用本领域的技术人员熟知的例如重组技术、化学技术或酶技术从替代来源获得。因此,将蛋白质表征为可从具体来源“分离”并不意味必须获得蛋白质的任何特定来源或必须获得蛋白质的任何具体条件或过程。
“纯化的”蛋白质为至少60%、至少75%或至少90%不含与其天然相关联的其他组分的蛋白质。在天然存在蛋白质的生物体之外例如通过化学手段或重组手段生产的蛋白质通过定义被认为是分离的并且纯化的,因为这些蛋白质从不存在于天然环境中。
本文所述的蛋白质的特征可在于分子量、氨基酸序列、编码所述蛋白质的核酸、免疫学活性或两个或更多个这种特征的任何组合。蛋白质的分子量(通常以千道尔顿(kDa)表述)可以使用例行方法确定,例如,凝胶过滤、凝胶电泳包括十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、毛细管电泳、质谱法、液相色谱法(包括HPLC)和根据观察的或预测的氨基酸序列计算分子量。本文所述的蛋白质的分子量通过以下来确定:凝胶电泳;基质辅助激光解吸/电离飞行时间谱(MALDI-TOF MS,本文也称为MALDI);或确定推导的蛋白质序列的分子量(参见表1)。除非另外指示,否则分子量是指如通过在还原并且变性条件下使用具有约4%浓缩胶(stacking gel)和约10%分离胶(resolving gel)的SDS聚丙烯酰胺凝胶解析蛋白质所确定的分子量。在一个实施方案中,通过SDS-PAGE鉴别的蛋白质的分子量包括高于和低于所述值1、2、3、4或5kDa的分子量。在一个实施方案中,通过SDS-PAGE鉴别的蛋白质的分子量包括高于和低于所述值1、2、3、4或5kDa的分子量。
本发明的蛋白质可为金属调控蛋白。如本文所用,“金属调控蛋白”为当微生物在低金属条件下生长时相较于相同微生物在高金属条件下生长,微生物以较大水平天然表达的蛋白质。金属调控蛋白的实例包括铁载体受体蛋白。低金属条件和高金属条件在本文有所描述。例如,由克雷伯氏菌属产生的一类金属调控蛋白在微生物在高金属条件下生长期间未以可检测的水平表达,但在低金属条件下生长期间以可检测水平表达。
在低铁条件下生长之后可从肺炎克雷伯氏菌分离的金属调控蛋白的实例的分子量在100kDa与60kDa之间,诸如97kDa至66kDa。在低铁条件下生长之后可从肺炎克雷伯氏菌分离的金属调控蛋白的具体实例包括如通过SDS-PAGE确定的87kDa、82kDa、78kDa、72kDa和68kDa蛋白质(表1)。分子量为82kDa、78kDa、72kDa和68kDa的蛋白质的实例和编码所述蛋白质的核苷酸序列显示于图7-10中。
预期由肺炎克雷伯氏菌表达且可从肺炎克雷伯氏菌分离并且预期在金属的获取中起作用的其他金属调控蛋白包括分子量为83kDa、78kDa、78.4kDa、76.2kDa、74.7kDa和66.2kDa的蛋白质,其中根据推导的氨基酸序列确定分子量。这些蛋白质的实例和编码所述蛋白质的核苷酸序列显示于图11、12、15和17-19中。金属调控蛋白的另外的实例包括本文所述的蛋白质的重组产生的型式。重组产生的蛋白可包括可从mRNA转录物转译的整个氨基酸序列。可替代地,重组产生的金属调控蛋白可包括整个可转译氨基酸序列的片段。例如,重组产生的金属调控蛋白可在蛋白质的任一末端缺乏可裂解序列,例如,在蛋白质的氨基端缺乏可裂解序列。
其他金属调控蛋白包括在SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:64(图36-38)显示的蛋白质。因此,金属调控蛋白可为包括描绘于例如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:64中的氨基酸序列的蛋白质。
预期由肺炎克雷伯氏菌表达且可从肺炎克雷伯氏菌分离并且预期在金属的获取中起作用的其他金属调控蛋白包括有包括描绘于SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:20中的氨基酸序列的蛋白质。
本文还提供不是金属调控的蛋白质。这种蛋白质在金属离子存在下诸如像在氯化铁存在下表达,并且还在低铁条件下生长时表达。这种蛋白质的实例包括孔蛋白。可从克雷伯氏菌属包括肺炎克雷伯氏菌分离的这种蛋白质的实例的分子量在26kDa与45kDa之间。在一个实施方案中,如通过SDS-PAGE所确定,由克雷伯氏菌属产生的非金属调控蛋白为35kDa和33kDa。这些蛋白质的实例和编码所述蛋白质的核苷酸序列显示于图20和21中。
因此,不是金属调控的蛋白质可为包括描述于例如SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55(图20和21)中的氨基酸序列的蛋白质。
不管蛋白质是否为金属调控蛋白均可以通过可用于比较蛋白质存在的方法确定,包括例如凝胶过滤、凝胶电泳包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳、质谱法和液相色谱法包括HPLC。使微生物的单独培养物在高金属条件下和在低金属条件下生长,将本发明的蛋白质如本文所述进行分离,并且对各培养物中存在的蛋白质进行解析并且比较。通常,使用来自各培养物的等量蛋白质。优选地,在还原并且变性条件下使用具有约4%浓缩胶和约10%分离胶的SDS聚丙烯酰胺凝胶解析蛋白质所确定的分子量的SDS聚丙烯酰胺凝胶解析蛋白质。例如,可使用来自各培养物的30微克(μg)总蛋白质并且加载至凝胶的孔中。在跑胶并且用考马斯亮蓝(Coomasie Brilliant Blue)将蛋白质染色之后,比较两条泳道。在确定蛋白质是否以可检测水平表达时,将来自培养物的30μg总蛋白质在SDS-PAGE凝胶上进行解析并且使用本领域中已知的方法用考马斯亮蓝染色。可以通过眼睛目视检查的蛋白质被认为是以可检测水平表达,而不可以通过眼睛目视检查的蛋白质被认为是未以可检测水平表达。
可替代地,不管蛋白质是否是金属调控均可以使用基于微阵列的基因表达分析来确定。使微生物的单独培养物在高金属条件下和在低金属条件下生长,从每个培养物的细胞中提取出RNA,并且对在高金属条件下生长的细胞的RNA表达对在低金属条件下生长的细胞的RNA表达的差异进行检测并比较。例如,可以使用已知并且例行的方法由8-10μg细菌RNA制备标记eDNA。可将标记cDNA施加至肺炎克雷伯氏菌基因组的微阵列。这种微阵列是可商购获得的并且使用这种阵列的基因表达是例行的。
本文所述的蛋白质可具有免疫学活性。“免疫学活性”是指蛋白质引发动物的免疫学应答的能力。对蛋白质的免疫学应答为动物体内细胞和/或抗体介导的对蛋白质的免疫应答的发展。通常,免疫学应答包括但不限于以下效应中的一种或多种:产生抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞,涉及蛋白质的一个或多个表位。“表位”是指抗原上特异性B细胞和/或T细胞做出应答使得产生抗体的位点。免疫学活性可以是保护性的。“保护性免疫学活性”是指蛋白质引发动物体内防止或抑制克雷伯氏菌属例如肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌的感染的免疫学应答的能力。不管蛋白质是否具有保护性免疫学活性均可通过本领域中已知的方法诸如像实施例11-14中所述的方法确定。例如,本文所述的蛋白质或本文所述的蛋白质的组合保护动物不受用克雷伯氏菌属的攻击。本发明的蛋白质可具有血清活性的活性(seroactive activity)。“血清活性的活性”是指候选蛋白质与感染有克雷伯氏菌属例如肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌的动物的恢复期血清中存在的抗体反应的能力。在一些方面中,恢复期血清可以来自感染有肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌的动物。本发明的蛋白质可具有免疫调控活性。“免疫调控活性”是指蛋白质以非特异性方式起作用以增强对特定抗原的免疫应答的能力。用于确定蛋白质是否具有免疫调控活性的方法为本领域中已知的。
本文所述的蛋白质可具有参考蛋白质的特征。所述特征可包括例如分子量、氨基酸序列、活性或其任何组合。参考蛋白质可为由革兰氏阴性微生物表达的蛋白质,所述革兰氏阴性微生物诸如肠杆菌科成员,优选地克雷伯氏菌属,更优选地肺炎克雷伯氏菌。肺炎克雷伯氏菌菌株的实例为肺炎克雷伯氏菌1571。
本文所述的蛋白质可具有如下文所述结构上类似于氨基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54.SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在一个实施方案中,本文所述的蛋白质可包括如下文所述结构上类似于氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的区。
如本文所用,如果相较于参考蛋白质,蛋白质的氨基酸序列具有指定量的序列类似性和/或序列同一性,那么蛋白质可“结构上类似”于参考蛋白质。因此,如果相较于参考蛋白质,蛋白质具有足够的氨基酸序列同一性水平、氨基酸序列类似性水平或其组合,那么蛋白质可“结构上类似”于参考蛋白质。
蛋白质序列类似性和蛋白质序列同一性
两种蛋白质的结构类似性可以通过比对两种蛋白质(例如,候选蛋白质和本文所述的任何适当的参考蛋白质)的残基来确定以优化沿着蛋白质序列长度的相同氨基酸的数目;在进行比对时为了优化相同氨基酸的数目,任一或两条序列中的空位是允许的,但是每条序列中的氨基酸必须仍然保持其适当的顺序。适当时,参考蛋白质可为本文所述的蛋白质或任何已知的金属调控蛋白。候选蛋白质为与参考蛋白质进行比较的蛋白质。候选蛋白质可以例如从微生物中分离,或可以使用重组技术产生,或化学合成或酶促合成。
除非另外如本文所述做出修改,否则氨基酸序列的成对比较分析可以使用GCG程序包(10.2版,Madison WI)中的BESTFIT算法进行。可替代地,蛋白质可以使用如Tatiana等(FEMS MicrobiolLett,174,247-250(1999))所述并且可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上获得的BLAST 2搜索算法的Blastp程序进行比较。所有BLAST 2搜索参数可以使用默认值,包括矩阵=BLOSUM62;开放空位罚分=11,空位延伸罚分=1,空位x_下降=50,期望值=10,字长=3和打开过滤器。
在比较两条氨基酸序列时,结构类似性可以称为“同一性”百分比或可以称为“类似性”百分比。“同一性”是指存在相同氨基酸。“类似性”是指不仅存在相同氨基酸,还存在保守取代。蛋白质中氨基酸的保守取代可以选自所述氨基酸所属的类的其他成员。例如蛋白质生物化学领域中熟知,可以用属于具有特定尺寸或特征(诸如电荷、疏水性或亲水性)的氨基酸分组的氨基酸取代另一种氨基酸而不改变蛋白质的活性,尤其是在蛋白质的不与生物活性直接相关联的区中。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守取代包括例如用Lys取代Arg并且反之亦然,以维持正电荷;用Glu取代Asp并且反之亦然,以维持负电荷;用Ser取代Thr,使得维持游离的-OH;以及用Gln取代Asn,以维持游离的-NH2。同样,还可以想到蛋白质的生物活性类似物,所述类似物含有不会消除蛋白质的功能活性(诸如像免疫学活性)的一个或多个连续或不连续氨基酸的缺失或添加。
因此,如本文所用,对如本文所述的蛋白质的参考和/或对一条或多条SEQ ID NO的氨基酸序列的参考可包括与参考氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列类似性的蛋白质。
可替代地,如本文所用,对如本文所述的蛋白质的参考和/或对一条或多条SEQ IDNO的氨基酸序列的参考可包括与参考氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列同一性的蛋白质。
如实施例9中所述并且如表3中所示,本文所述的金属调控蛋白是保守的。表3显示肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中存在的不同蛋白质的高同一性百分比水平。普通技术人员可以使用易得的算法例如CLUSTALW容易地比对由不同微生物表达的金属调控蛋白的氨基酸序列,并且跨金属调控蛋白鉴别保守的氨基酸和区以及可变的氨基酸和区。本领域的普通技术人员可以根据这种数据推导出可以允许取代(尤其保守取代)而不会不当地影响修饰多肽的活性的蛋白质的区。
因此,本文所述的蛋白质可以包括某些变体,包括例如生物地或重组地起源于微生物物种、或除微生物物种之外的菌株或起初分离和/或鉴别多肽的菌株的同源蛋白。
如本文所述的蛋白质还可以设计成提供一条或多条另外的序列,诸如像针对添加的C端和/或N端氨基酸添加编码序列,从而可以通过捕获于管柱上或使用抗体来促进纯化。这种标签包括例如允许在镍管柱上纯化蛋白质的富组氨酸标签。这种基因修饰技术和合适的另外序列是分子生物学领域中熟知的。
如本文所述的蛋白质的“修饰”包括在一个或多个组成氨基酸处化学或酶促衍生的蛋白质(或其类似物,诸如像其片段)。此类修饰可包括例如侧链修饰、骨架修饰、N端修饰和/或C端修饰诸如像乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和连接碳水化合物和/或脂质部分、辅因子等以及其组合。如本文所述的修饰蛋白可保留未修饰蛋白的生物活性(诸如像免疫学活性)或可表现出相较于未修饰蛋白减小或增加的生物活性。
如本文所述的蛋白质(包括其生物活性类似物和/或其修饰)可包括天然(天然存在的)蛋白、重组蛋白、化学合成蛋白或酶促合成蛋白。例如,如本文所述的蛋白质可以通过从天然来源分离蛋白质来制备,或可以通过常规方法包括例如呈细菌或其他宿主细胞中的融合蛋白的制备来重组地制备。
由参考微生物表达的蛋白质可以通过使参考微生物在如本文所述的低金属条件下生长并且随后通过本文所公开的过程分离蛋白质来获得。可替代地,由参考微生物表达的蛋白质可以通过鉴别当使微生物在低金属条件下生长时(例如,金属调控)以较高水平表达的编码区来获得。金属调控编码区可以是克隆的并且表达的,并且表达的金属调控蛋白可以通过本文所述的过程进行鉴别。候选蛋白质可以从微生物分离或从微生物鉴别,所述微生物优选为革兰氏阴性微生物,更优选地为肠杆菌科成员,诸如克雷伯氏菌属,诸如像肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌。候选蛋白质还可以使用酶促技术或化学技术产生。
多核苷酸序列类似性和多核苷酸序列同一性
如本文所述的蛋白质还可以根据编码所述蛋白质的多核苷酸进行鉴别。因此,本公开提供编码如本文所述的蛋白质或在标准杂交条件下杂交成编码如本文所述的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸以及这种多核苷酸序列的补体。
如本文所用,对如本文所述的多核苷酸的参考和/或对一条或多条SEQ ID NO的核酸序列的参考可包括序列同一性为与鉴别的参考多核苷酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多核苷酸。
在此上下文中,“序列同一性”是指两条多核苷酸序列之间的同一性。序列同一性一般通过比对两种多核苷酸的碱基(例如,对候选序列的核苷酸序列和包括例如编码蛋白质或SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、49、51、52、53、54、55、58、61或64的核苷酸序列的核苷酸序列进行比对)来确定以优化沿着其序列长度的相同核苷酸的数目;在进行比对时为了优化共有核苷酸的数目,任一或两条序列中的空位是允许的,但是每条序列中的核苷酸必须仍然保持其适当的顺序。候选序列为与已知序列进行比较的序列,已知序列例如核苷酸序列,其包括选自例如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29的适当部分的适当核苷酸序列,所述序列在没有信号序列的情况下编码蛋白质。例如,两条多核苷酸序列可以使用如Tatiana等,FEMS Microbiol Lett.,1999;174∶247-250所述并且可在万维网上在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST 2搜索算法的Blasm程序进行比较。所有BLAST 2搜索参数可以使用默认值,包括匹配奖分=1,错配罚分=-2,开放空位罚分=5,空位延伸罚分=2,空位x_下降=50,期望值=10,字长=11和打开过滤器。
本公开还提供微生物的全细胞制剂,其中微生物表达如本文所述的一种或多种蛋白质。微生物可以天然地表达蛋白质,或可以被工程化成重组地表达本文所述的一种或多种蛋白质。全细胞制剂中存在的细胞可以是灭活的,使得细胞不可以复制但是维持由微生物表达的如本文所述的蛋白质的免疫学活性。通常,可以通过暴露于试剂诸如戊二醛、福尔马林或甲醛来杀死细胞。
组合物
如本文所述的组合物可包括至少一种本文所述的蛋白质,或许多(大于一的整数)种(例如,至少两种、至少三种、至少四种)蛋白质。除非本文明确地指示具体的序列类似性和/或同一性水平(例如,至少80%序列类似性、至少90%序列同一性等),否则对鉴别的SEQID NO的氨基酸序列的参考包括具有在标题为“蛋白质序列类似性和蛋白质序列同一性”的小节中的本文所述的序列类似性水平和/或序列同一性水平的变体。在一个实施方案中,包括本文所述的蛋白质的组合物为微生物诸如肺炎克雷伯氏菌在低金属条件(诸如低铁条件)下表达的蛋白质的亚组并且为不天然存在的蛋白质的组合。
重组产生的蛋白质可以从载体表达,当将载体引入到适当宿主细胞中时,所述载体允许蛋白质的表达。宿主细胞可以被构建成产生一种或多种如本文所述的重组产生的蛋白质,并且因此可以再包括一种载体,所述载体包括编码如本文所述的蛋白质的至少一种多核苷酸。因此,每种载体可包括一种或多种如本文所述的多核苷酸,即,编码如本文所述的蛋白质的多核苷酸。
某些组合物(诸如像包括重组产生的蛋白质的组合物)可包括最大数量的蛋白质。在一些实施方案中,最大数量的蛋白质可以指最大总数的蛋白质。某些组合物可包括例如不超过50种蛋白质,诸如像不超过40种蛋白质、不超过30种蛋白质、不超过25种蛋白质、不超过20种蛋白质、不超过15种蛋白质、不超过10种蛋白质、不超过9种蛋白质、不超过8种蛋白质、不超过7种蛋白质、不超过6种蛋白质、不超过5种蛋白质、不超过4种蛋白质、不超过3种蛋白质、不超过2种蛋白质或不超过1种蛋白质。在其他实施方案中,最大数量的重组产生的蛋白质可以以类似的方式指定。在再其他实施方案中,最大数量的非重组产生的蛋白质可以以类似的方式指定。
组合物可包括可从一种微生物分离的蛋白质,或可从两种或更多种微生物的组合分离的蛋白质。例如,组合物可包括可从两种或更多种克雷伯氏菌属或从克雷伯氏菌属和不是克雷伯氏菌属成员的不同微生物中分离的蛋白质。
在某些实施方案中,组合物可包括全细胞表达一种或多种如本文所述的蛋白质的全细胞制剂。在这些实施方案中的一些中,全细胞可为克雷伯氏菌属,在其他实施方案中,全细胞为被基因工程化成表达一种或多种蛋白质的全细胞。在一些实施方案中,组合物可包括来自两种、三种、四种、五种或六种菌株的全细胞制剂。
在一个实施方案中,组合物包括克雷伯氏菌属在低铁中生长期间表达的多肽和至少一种、至少两种、至少三种或更多种重组产生的蛋白质。例如,克雷伯氏菌属可被工程化成表达至少一种重组蛋白,或从克雷伯氏菌属分离的组合物可补充有由第二细胞表达的至少一种重组蛋白。在一个实施方案中,此类组合物不是天然存在的。
组合物的具体实例包括但不限于以下这些。在一个实施方案中,组合物包括如通过SDS-PAGE确定的分子量选自82kDa、78kDa、72kDa和68kDa的至少两种金属调控蛋白。例如,组合物可包括分子量为82kDa、78kDa、72kDa和68kDa;82kDa、78kDa和72kDa;82kDa、78kDa和68kDa;82kDa、72kDa和68kDa;78kDa、72kDa和68kDa;82kDa和78kDa;82kDa和68kDa;或72kDa和68kDa的蛋白质。任选地,组合物包括不是金属调控的一种或两种蛋白质,其中如通过SDS-PAGE确定,蛋白质的分子量为35kDa和33kDa。任选地,组合物包括如通过SDS-PAGE确定的分子量为87kDa的金属调控蛋白。任选地,组合物包括预期由肺炎克雷伯氏菌表达并且可从肺炎克雷伯氏菌分离的至少一种金属调控蛋白,诸如分子量为83kDa、78kDa、78.4kDa、76.2kDa、74.7kDa或66.2kDa的蛋白质,其中根据推导的氨基酸序列确定分子量。因此,在一个实施方案中,组合物包括:分子量为82kDa、78kDa、72kDa和68kDa的两种、三种或四种金属调控蛋白;不是金属调控的并且分子量为35kDa和33kDa的两种蛋白质;和分子量为87kDa的金属调控蛋白。
在一个实施方案中,组合物包括结构上类似于选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的蛋白质的至少两种蛋白质。例如,组合物可包括结构上类似于以下的蛋白质:SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44;SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44;SEQID NO:41、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44;SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44;SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42;SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:44;SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。任选地,组合物包括结构上类似于SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的另外两种蛋白质。任选地,组合物包括结构上类似于选自以下的蛋白质的至少一种蛋白质:SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQID NO:61和SEQ ID NO:64。任选地,组合物包括结构上类似于包括结构上类似于氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的氨基酸区的蛋白质的至少一种蛋白质。
在一个实施方案中,组合物包括结构上类似于选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:64的蛋白质的至少两种蛋白质。例如,组合物可包括结构上类似于以下的蛋白质:SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:64;SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:61;SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:64;SEQID NO:41、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:64;SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:64;SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:58;SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:64;或SEQ ID NO:61和SEQ IDNO:64。任选地,组合物包括结构上类似于SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的另外两种蛋白质。任选地,组合物包括结构上类似于选自以下的蛋白质的至少一种蛋白质:SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53。任选地,组合物包括结构上类似于包括结构上类似于氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的氨基酸区的蛋白质的至少一种蛋白质。
任选地,如本文所述的蛋白质可共价键合或缀合至载剂蛋白以改善蛋白质的免疫学性质。可用的载剂蛋白为本领域中已知的。如本文所述的蛋白质的化学偶联可使用已知并且例行的方法进行。例如,可以使用各种同型双功能和/或异型双功能交联剂,诸如双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、双(重氮基联苯胺)、己二亚氨酸二甲酯(dimethyladipimidate)、庚二亚氨酸二甲酯(dimethyl pimelimidate)、辛二亚氨酸二甲酯(dimethyl superimidate)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、戊二醛、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺、磺基-间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯、4-(对马来酰亚胺基-苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯和(1-乙基-3-(二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(参见例如,Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,概括地和第5章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York,NY(1988))。
本文所述的组合物可包括低浓度脂多糖(LPS)。LPS为大多数革兰氏阴性微生物外膜的组分(参见例如,Nikaido和Vaara,Outer Membrane,在Escherichia coli andSalmonella typhimurium,Cellular and Molecular Biology,Neidhardt等(编)AmericanSociety for Microbiology,Washington,D.C.,第7-22页(1987)中)并且通常包括多糖(O-特异性链,外核心和内核心)和脂质A区。LPS的脂质A组分为LPS结构的最具生物活性的组分,并且一起诱导动物体内广泛的病理生理效应。大多数显著效应为发烧、弥散性血管内凝血、补体激活、低血压休克和死亡。LPS的非特异性免疫刺激活性可增强施用包括LPS的组合物的部位处肉芽肿的形成。这种反应可导致动物的过度应激,动物可能由此拒绝饮食或饮水一段时间,并且使动物体内的感染病状加剧。此外,注射部位处肉芽肿的形成可增加胴体可能由于注射部位处组织的瘢痕或缺陷而降级的可能性。
LPS浓度可使用本领域中已知的例行方法确定。这种方法通常包括测量LPS的染料结合(参见例如,Keler和Nowotny,Analyt.Biochem.,156,189(1986))或使用鲎阿米巴样细胞溶解产物(LAL)测试(参见例如,Endotoxins and Their Detection With the LimulusAmebocyte Lystate Test,Alan R.Liss,Inc.,150Fifth Avenue,New York,NY(1982))。有四种基本的可商购获得的方法通常与LAL测试一起使用:凝胶(gel-clot)测试;浊度(分光光度)测试;比色测试;和显色测试。凝胶测定的实例可以商品名E-TOXATE(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO;参见Sigma技术报告第210号)和PYROTELL(Associates of Cape Cod,Inc.,East Falmouth,MA)获得。通常,测定条件包括将组合物与含有马蹄蟹(美洲鲎)的循环阿米巴样细胞的溶解产物的制剂接触。当暴露于LPS时,溶解产物的不透明度和粘度增加,并且可以胶凝。将约0.1毫升组合物加入到溶解产物中。通常,组合物的pH在6与8之间,优选地在6.8与7.5之间。在37℃下将组合物和溶解产物的混合物静置地孵育1小时。孵育之后,观察混合物以确定混合物是否胶凝。胶凝指示存在内毒素。为了确定组合物中存在的内毒素的量,制备内毒素标准溶液的稀释液并且在测试组合物的同时进行测试。内毒素标准溶液可从例如Sigma Chemical(目录号210-SE)、U.S.Pharmacopeia(Rockville,MD,目录号235503)和Associates of Cape Cod,Inc.,(目录号E0005)商购获得。一般来讲,当通过如本文所述的方法(例如,包括破坏和增溶细胞以及收集不溶性多肽的方法)从微生物分离多肽来制备本发明的组合物时,本发明的组合物中LPS的量小于在相同条件下破坏但不增溶的相同量相同微生物的混合物中存在的LPS的量。通常,本文所述的组合物中LPS的水平相对于通过破坏但不增溶相同微生物所制备的组合物中LPS的水平减小(以优选性增加的顺序)至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。在一个实施方案中,本文所述的组合物中LPS的水平相较于通过破坏但不增溶相同微生物所制备的组合物中LPS的水平减小大于90%、大于95%或大于99%。
如本文所述的组合物任选地还包括药学上可接受的载剂。“药学上可接受的”是指稀释剂、载剂、赋形剂、盐等与组合物的其他成分相容并且对其接受者无害。通常,当如本文所述使用组合物时,组合物包括药学上可接受的载剂。如本文所述的组合物可以适于选择的施用途径包括合适于刺激对抗原的免疫应答的多种形式配制于药物制剂中。因此,如本文所述的组合物可经由已知途径施用,包括例如口服;肠胃外,包括皮内、经皮和皮下;肌内、静脉内、腹膜内等和局部,诸如鼻内、肺内、乳房内、阴道内、子宫内、皮内、经皮和经直肠等。可以预见,组合物可以诸如通过施用到鼻粘膜或呼吸粘膜(例如,经由喷雾或气溶胶)施用到粘膜表面,以刺激遍布动物全身的粘膜免疫,诸如产生分泌型IgA抗体。
如本文所述的组合物还可以经由持续或延迟释放植入物施用。根据本发明适用的植入物是已知的并且包括例如Emery和Straub(WO 01/37810(2001))以及Emery等(WO 96/01620(1996))中所公开的植入物。植入物可以被生产成足以通过气溶胶或喷雾施用的尺寸。植入物还可以包括纳米球和微球。
如本文所述的组合物可以足以治疗如本文所述的某些病状的量施用。如本文所述的组合物中存在的蛋白质或全细胞的量可以是变化的。例如,蛋白质的剂量可在0.01微克(μg)与300mg之间,通常在0.1mg与10mg之间。在一个实施方案中,蛋白质的剂量可为至少700μg、至少900μg或至少1,000μg。在一个实施方案中,剂量可为不大于1,800μg、不大于1,600μg、不大于1,400μg或不大于1,200μg。当组合物为全细胞制剂时,细胞可以例如下列浓度存在:102个细菌/ml、103个细菌/ml、104个细菌/ml、105个细菌/ml、106个细菌/ml、107个细菌/ml、108个细菌/ml或109个细菌/ml。对于可注射组合物(例如皮下、肌内等),蛋白质可以使得施用的组合物的总体积为0.5ml至5.0ml,通常1.0至2.0ml的量存在于组合物中。当组合物为全细胞制剂时,细胞优选地以施用的组合物的总体积为0.5ml至5.0ml,通常1.0至2.0ml的量存在于组合物中。施用的量可以取决于各种因素而变化,包括但不限于选择的具体蛋白质、动物的体重、身体状况和年龄以及施用途径。因此,给定单位剂型中包括的蛋白质的绝对重量可以广泛变化并且取决于诸如动物的物种、年龄、体重和身体状况以及施用方法的因素。此类因素可由本领域的技术人员确定。合适于本发明的剂量的其他实例公开于Emery等(美国专利6,027,736)中。
配制品可以便利地以单位剂型呈现并且可以通过制药领域中熟知的方法来制备。制备具有药学上可接受的载剂的组合物的方法包括使活性化合物(例如,如本文所述的蛋白质或全细胞)与构成一种或多种辅助成分的载剂缔合的步骤。一般来讲,配制品通过使活性成分与液体载剂、细分的固体载剂或两者均匀并且紧密地缔合,然后必要时使产物成形为所需配制品来制备。
组合物还可以报包括佐剂。“佐剂”是指可以以非特异性方式起作用以增强对特定抗原的免疫应答,从而潜在地减小任何给定的免疫组合物中所必需的抗原量和/或产生对感兴趣的抗原的足够的免疫应答所必需的注射频率的药剂。佐剂可以包括例如IL-1、IL-2、乳化剂、胞壁酰二肽、二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)、阿夫立定(avridine)、氢氧化铝、油、皂草苷、α-生育酚、多糖、乳化石蜡(包括例如可以商品名EMULSIGEN购自MVPLaboratories,Ralston,Nebraska的乳化石蜡)、ISA-70、RIBI和本领域中已知的其他物质。预期如本文所述的蛋白质将具有免疫调控活性并且此类蛋白质可用作直接充当T细胞和/或B细胞激活物或作用于特定细胞型的佐剂,从而增强各种细胞因子的合成或激活细胞内信号传导通路。预期这种蛋白质增加免疫应答以增加现有组合物的保护指数。
在另一个实施方案中,包括药学上可接受的载剂的如本文所述的组合物可以包括生物学应答调节剂诸如像IL-2、IL-4和/或IL-6、TNF、IFN-α、IFN-γ以及实现免疫细胞的其他细胞因子。免疫组合物还可以包括本领域中已知的其他组分诸如抗生素、防腐剂、抗氧化剂或螯合剂。
制备方法
本发明还提供用于获得本文所述的蛋白质的方法。本发明的蛋白质和全细胞可以从肠杆菌科成员分离。可用于获得本发明的蛋白质并制备全细胞制剂的微生物可从贮藏所诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)商购获得。此外,这种微生物可通过本领域例行且已知的技术轻易获得。微生物可以呈野外分离株来源于感染动物,并且用于获得本发明的蛋白质和/或全细胞制剂,或例如在-20℃至-95℃或-40℃至-50℃的冷冻贮藏室中,在含有20%甘油的细菌学培养基和其他类似培养基中储存以供将来使用。
当要从微生物获得本发明的蛋白质时,可将微生物在低金属条件下孵育。如本文所用,短语“低金属条件”是指含有使微生物以可检测的水平表达金属调控蛋白质的量的游离金属的环境,通常是细菌学培养基。如本文所用,短语“高金属条件”是指含有使微生物不以可检测的水平表达本文所述的一种或多种金属调控蛋白或以相较于在低金属条件下的金属调控蛋白的表达降低的水平表达此类蛋白质的量的游离金属的环境。在一些情况下,“高金属条件”可以包括富金属天然环境和/或在不具有金属螯合剂的富金属培养基中的培养。与此相反,在一些情况下,“低金属条件”可以包括在包括金属螯合剂的培养基中的培养,如下文所详述。金属为元素周期表中在第1族至第17族(IUPAC表示法;在CAS表示法下分别也称为I-A族、II-A族、III-B族、IV-B族、V-B族、VI-B族、VII-B族、VIII族、I-B族、II-B族、III-A族、IV-A族、V-A族、VI-A族和VII-A族)下存在的金属。优选地,金属为第2族至第12族中的金属,更优选地为第3-12族中的金属。甚至更优选地,金属为铁、锌、铜、镁、镍、钴、锰、钼或硒,最优选地为铁。
低金属条件一般是由于向细菌学培养基中加入了金属螯合化合物、使用了含有少量金属的细菌学培养基或其组合。高金属条件一般当培养基中不存在螯合剂、向培养基中加入金属或其组合时存在。金属螯合剂的实例包括天然化合物和合成化合物。天然化合物的实例包括植物酚类化合物,诸如黄酮类。黄酮类的实例包括铜螯合剂儿茶素和柚皮素以及铁螯合剂杨梅黄酮和槲皮黄酮。合成铜螯合剂的实例包括例如四硫代钼酸盐,并且合成锌螯合剂的实例包括例如N,N,N′,N′-四(2-吡啶基甲基)-乙二胺。合成铁螯合剂的实例包括2,2′-二吡啶(本领域中也称为α,α′-联吡啶)、8-羟基喹啉、乙二胺-二-O-羟基苯基乙酸(EDDHA)、甲磺酸去铁胺(desferrioxamine methanesulphonate)(去铁敏(desferol))、转铁蛋白、乳铁蛋白、卵转铁蛋白、生物学铁载体诸如儿茶酚类(catecholates)和异羟肟酸类(hydroxamates)以及柠檬酸盐。一般二价阳离子螯合剂的实例为CHELEX树脂。优选地,将2,2′-二吡啶用于铁的螯合。通常,取决于微生物的生长特征,以至少0.0025微克/毫升(μg/ml)、至少0.25μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml或更高量的浓度将2,2′-二吡啶加入到培养基中。
预期具有fur基因突变的克雷伯氏菌属将产生本发明的许多(如果不是所有)金属调控蛋白的组成性表达。克雷伯氏菌属中fur突变的产生可使用例行方法产生,包括例如可用于在革兰氏阴性细菌中产生基因敲除突变的转座子诱变、化学诱变或定点诱变。
用于孵育微生物的培养基和用于孵育微生物的培养基的体积可以是变化的。当评估微生物的产生本文所述的一种或多种蛋白质的能力时,可使微生物在合适体积例如10毫升至1升培养基中生长。当使微生物生长以获得用于例如向动物施用的蛋白质时,可使微生物在发酵罐中生长以实现较大量蛋白质的分离。用于使微生物在发酵罐中生长的方法是本领域例行并且已知的。用于使微生物生长的条件优选地包括:金属螯合剂,更优选地铁螯合剂,例如2,2′-二吡啶;在6.5与7.5之间,优选地在6.9与7.1之间的pH;和37℃的温度。
在本发明的一些方面中,微生物可在生长之后被收获。收获包括将微生物浓缩至较小体积并且悬浮在与生长培养基不同的培养基中。用于浓缩微生物的方法为本领域中例行并且已知的,并且包括例如过滤或离心。通常,将浓缩的微生物悬浮在适当缓冲液中。可使用的缓冲液的实例含有pH为8.5的Tris碱(7.3克/升)。任选地,最终缓冲液还使蛋白水解降解最小化。这可以通过具有pH大于8.0,优选地至少8.5的最终缓冲液并且/或者包括一种或多种蛋白酶抑制剂(例如,苯甲磺酰氟)来实现。任选地并且优选地,将浓缩的微生物在-20℃或低于-20℃下冷冻直到被破坏。
当要将微生物用作全细胞制剂时,可以使用使细胞灭活的例行并且已知的方法对收获的细胞进行处理。可替代地,当要将微生物用于制备本文所述的蛋白质时,可以使用本领域中例行并且已知的化学方法、物理方法或机械方法破坏微生物,包括例如煮沸、弗氏压碎(French press)、超声处理、消化肽聚糖(例如,通过用溶菌酶消化)或均化。可用于均化的合适的装置的实例为C500-B型AVESTIN均化器(Avestin Inc,Ottawa Canada)。如本文所用,“破坏”是指使细胞破裂。微生物的破坏可以通过本领域例行并且已知的方法进行测量,包括例如光密度的变化。通常,当破坏之前微生物的1:100稀释液的透射百分比为40%-60%时,破坏之后透射百分比增加至80%(增加20%-40%)。当使用物理或机械方法时,通常使破坏期间的温度保持较低,优选保持在4℃,以进一步使蛋白水解降解最小化。当使用化学方法时,可以升高温度以优化细胞破坏。还可以使用化学方法、物理方法和机械方法的组合以增溶微生物的细胞壁。如本文所用,术语“增溶”是指将细胞物质(例如,蛋白质、核酸、碳水化合物)溶解到破坏细胞的缓冲液的水相中,并且形成不溶性细胞物质的聚集体。在不意图受到理论限制的情况下,据信增溶的条件使本发明的蛋白质聚集成足够大以允许通过例如离心来容易分离的不溶性聚集体。
包括本发明的一种或多种蛋白质的不溶性聚集体可以通过本领域例行并且已知的方法进行分离。在一个实施方案中,通过超滤分离不溶性聚集体。在一个实施方案中,通过离心分离不溶性聚集体。通常,蛋白质(诸如膜蛋白)的离心可以通过100,000×g的离心力来实现。使用这种离心力需要使用超速离心机,并且按比例扩大以处理大体积的样本常常是困难的并且在这些类型的离心机的情况下是不经济的。本文所述的方法提供产生足够大以允许使用可在流速为250ml/分钟的情况下、在17psi下、在46,000×g至60,000×g的离心力下使用的连续流动离心机例如T-1Sharpies(Alfa Laval Separations,Warminster,PA)的不溶性聚集体。可以使用其他大规模离心机,诸如管式(tubular bowl)、室式(chamber)和碟式(disc)构造。这种离心机为本领域中例行使用并且已知的,并且可以从诸如Pennwalt、Westfalia和Alpha Laval的制造商商购获得。
将最终收获的蛋白质洗涤并且/或者用适当缓冲液使用本领域中已知的方法例如渗滤、沉淀、疏水性色谱法、离子交换色谱法或亲和色谱法或超滤并且通过渗滤例如在醇中洗涤蛋白质进行透析。分离之后,将蛋白质悬浮在缓冲液中并且在低温例如-20℃或低于-20℃下储存。
在本发明的要制备全细胞制剂的方面中,在生长之后,可以在足以使培养物中的细胞灭活的浓度下加入试剂诸如戊二醛、福尔马林或甲醛的情况下杀死微生物。例如,可以在0.3%(体积:体积)的浓度下加入福尔马林。在足以使细胞灭活的一段时间之后,可以通过例如渗滤和/或离心收获细胞并且洗涤。
在其他方面中,可以重组地制备本发明的分离蛋白。当重组地制备时,可以鉴别出编码所述蛋白质的多核苷酸并且克隆到适当表达宿主中。可以使重组表达宿主生长在适当培养基中,将其破坏并且如上文所述分离出蛋白质。可替代地,当重组蛋白形成包涵体时,可以使用例行方法分离并且纯化重组蛋白。例如,可以从表达宿主提取出包涵体,并且如上文所述将包涵体中存在的蛋白质增溶。
使用方法
还提供了使用本文所述的组合物的方法。所述方法包括向动物施用有效量本文所述的组合物。动物可为例如鸟类(包括例如,小鸡或火鸡)、牛类(包括例如黄牛)、山羊类(包括例如山羊)、绵羊类(包括例如绵羊)、猪类(包括例如猪)、野牛类(包括例如野牛)、马类(包括例如马)、伴侣动物(包括例如狗或猫)、鹿科成员(包括例如梅花鹿、麋鹿、驼鹿、北美驯鹿和驯鹿)或人。
在一些方面中,所述方法可能还包括向动物再次施用(例如,一次或多次加强施用)组合物以增强或刺激继发性免疫应答。加强剂可以在第一次施用之后某一时间施用,例如,在第一次施用组合物之后一周至八周,优选地两周至四周。可施用后续加强剂每年一次、两次、三次、四次或更多次。在不意图受到理论限制的情况下,预期在本发明的一些方面中,每年的加强剂没有必要,因为动物在野外通过暴露于表达组合物中存在的蛋白质的微生物而受到攻击,所述蛋白质具有与向动物施用的组合物的蛋白质上存在的表位相同或结构上相关的表位。
在一个方面中,本发明涉及用于例如通过诱导动物体内产生抗体或通过重组技术来制备抗体的方法。所产生的抗体包括特异性地结合组合物中存在的至少一种蛋白质的抗体。在本发明的这个方面中,“有效量”为有效使动物体内产生抗体的量。用于确定动物是否产生特异性地结合本发明的组合物中存在的蛋白质的抗体的方法可以如本文所述加以确定。本发明还包括特异性地结合本发明的蛋白质的抗体和包括这种抗体的组合物。
所述方法可用于产生特异性地结合由除分离出组合物的蛋白质的微生物之外的微生物所表达的蛋白质的抗体。如本文所用,可“特异性地结合”蛋白质的抗体为与诱导合成抗体的抗原的表位相互作用或与结构上相关的表位相互作用的抗体。本发明的组合物中存在的至少一些蛋白质通常包括在不同种和不同属微生物的蛋白质中是保守的表位。因此,预期使用来源于一种微生物的组合物产生的抗体结合其他微生物所表达的蛋白质并且提供针对革兰氏阴性生物体的广谱保护。抗体可特异性地结合的革兰氏阴性微生物的实例为弧菌科成员(包括例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、弯曲杆菌属(包括例如空肠弯曲杆菌(C.jejuni))、肠杆菌科成员(包括例如克雷伯氏菌属、大肠杆菌、志贺氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属和耶尔森氏菌属)、巴斯德氏菌科成员优选地巴斯德氏菌属(Pasturella spp.)(包括例如多杀巴斯德氏菌(P.multocida)和溶血巴斯德氏菌(P.haemolytica))和假单胞菌科成员优选地假单胞菌属属(包括例如铜绿假单胞菌)。克雷伯氏菌属的实例包括肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌。沙门氏菌属的实例包括肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)血清变型、布雷登尼沙门氏菌(Bredeney)、都柏林沙门氏菌(Dublin)、安果勒沙门氏菌(Agona)、布洛克莱沙门氏菌(Blockley)、肠炎沙门氏菌(Enteriditis)、鼠伤寒沙门氏菌(Typhimurium)、哈达尔沙门氏菌(Hadar)、海德堡沙门氏菌(Heidelberg)、蒙德维多沙门氏菌(Montevideo)、明斯特沙门氏菌(Muenster)、纽波特沙门氏菌(Newport)、山夫登堡沙门氏菌(senftenberg)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerasuis)和伤寒沙门氏菌(S.typhi)。大肠杆菌的菌株的实例包括例如大肠杆菌血清型O1a、O2a、O78和O157;不同的O∶H血清型,包括0104、0111、026、0113、091;肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)的溶血性菌株,诸如K88+、F4+、F18ab+和F18ac+;以及大肠杆菌的尿道致病性菌株。因此,使用本文所述的蛋白质的组合物产生的抗体可用于鉴别并且表征蛋白质,与起源、来源和/或获得蛋白质的方式无关。
本发明还涉及使用此类抗体靶向表达本发明的蛋白质或具有与本发明的蛋白质上存在的表位结构上相关的表位的蛋白质的微生物。化合物可共价键合抗体,其中所述化合物可为例如毒素。同样,这种化合物可共价键合细菌铁载体以靶向微生物。本发明的抗体或其片段(诸如Fab片段)的化学偶合或缀合可以使用已知并且例行的方法进行。
在一个方面中,本发明还涉及靶向由革兰氏阴性微生物引起的动物(包括人)的感染。如本文所用,术语“感染”是指动物体内临床上明显地或临床上不明显地存在革兰氏阴性微生物。治疗感染可以为预防性的,或可替代地,可以在动物受到微生物感染之后开始。预防性(例如,在受试者受到微生物感染之前或在任何感染保持为亚临床时开始的)治疗在本文称为处于感染“风险”的受试者的治疗。如本文所用,术语“处于......风险”是指动物实际上可能具有或可能不具有所述的风险。因此通常,处于受到微生物感染“风险”的动物为其中动物已被鉴别为受到微生物感染并且/或者可能暴露于微生物的区域中存在的动物,即使动物尚未表现出任何可检测的受到微生物感染的指示并且不管动物是否可能潜伏亚临床量的微生物。因此,组合物的施用可以在动物首次与微生物接触之前、期间或之后。在动物首次与微生物接触之后开始的治疗可能引起受到微生物感染的症状和/或临床征象的严重程度降低、微生物完全去除和/或相较于未施用组合物的动物经历临床上明显的感染的可能性减小。所述方法包括向患有由革兰氏阴性微生物引起的感染或处于患有所述感染的风险的动物施用有效量本发明的组合物以及确定引起所述感染的微生物的数目是否减少。革兰氏阴性微生物可为例如弧菌科成员(包括例如霍乱弧菌)、弯曲杆菌属(包括例如空肠弯曲杆菌)、肠杆菌科成员(包括例如克雷伯氏菌属、大肠杆菌、志贺氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属)、巴斯德氏菌科成员优选地巴斯德氏菌属(包括例如多杀巴斯德氏菌和溶血巴斯德氏菌)或假单胞菌科成员。在一个实施方案中,动物患有由肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌引起的感染或处于患有所述感染的风险。在本发明的这个方面中,“有效量”为相较于未施用组合物的动物有效减少动物体内指定微生物的数目或减小动物经历临床上明显的感染的可能性的量。用于确定感染是否由革兰氏阴性微生物诸如肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌引起的方法为本领域中例行并且已知的,和用于确定感染是否减少的方法一样。
在另一个方面中,本发明涉及用于治疗动物的由受到革兰氏阴性微生物感染所引起的某些病状的一种或多种症状或临床征象的方法。所述方法包括向患有病状或处于患有病状或表现出病状的症状和/或临床征象的动物施用有效量本发明的组合物以及确定所述病状的至少一种症状和/或临床征象是否变化,优选地减少。革兰氏阴性微生物可为例如弧菌科成员(包括例如霍乱弧菌)、弯曲杆菌属(包括例如空肠弯曲杆菌)、肠杆菌科成员(包括例如克雷伯氏菌属、大肠杆菌、志贺氏菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属和耶尔森氏菌属)、巴斯德氏菌科成员优选地巴斯德氏菌属(包括例如多杀巴斯德氏菌和溶血巴斯德氏菌)或假单胞菌科成员。在一个实施方案中,动物患有由肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌引起的病状。在一个实施方案中,动物患有由尿道致病性大肠杆菌引起的病状。由革兰氏阴性微生物感染引起的症状和/或临床征象的实例为本领域的技术人员已知的。
与由革兰氏阴性感染引起的病状相关联的症状和/或临床征象的治疗可为预防性的,或可替代地,可在发展本文所述的病状之后开始。如本文所用,术语“症状”是指患者所经历的并且由微生物感染引起的疾病或病状的主观证据。如本文所用,术语“临床征象”或简单地说“征象”是指由微生物感染引起的疾病或病状的客观证据。与本文提及的病状相关联的症状和/或临床征象以及这种症状的评估为本领域中例行并且已知的。预防性(例如,在受试者表现出由微生物引起的病状的症状或征象之前开始的)治疗在本文称为处于发展所述病状“风险”的受试者的治疗。因此,通常,处于发展病状“风险”的动物为其中患有所述病状的动物已被诊断并且/或者可能暴露于引起所述病状的微生物的区域中存在的动物,即使动物尚未表现出由所述微生物引起的任何病状的症状或征象。因此,组合物的施用可以在发生本文所述的病状之前、期间或之后执行。在病状发展之后开始的治疗可能引起一种或多种病状的症状或征象的严重程度降低或症状或征象完全去除。在本发明的这个方面中,“有效量”为有效预防表现出疾病的症状或征象、降低疾病的症状或征象的严重程度和/或完全去除症状或征象的量。实例11-19中公开了动物的革兰氏阴性微生物感染的成功治疗,其说明了在小鼠模型中通过施用本文所述的组合物进行的针对由肺炎克雷伯氏菌引起的疾病的保护。这种小鼠模型为肺炎克雷伯氏菌引起的疾病的研究普遍接受的模型。
在一个实施方案中,病状为产奶动物诸如奶牛的乳腺炎。所述方法包括向患有乳腺炎或处于患有乳腺炎风险的产奶动物施用有效量本文所述的组合物以及确定乳腺炎的至少一种症状或征象是否减少。乳腺炎是指乳腺的炎症。乳汁的物理、化学和通常细菌学变化以及腺体组织的病理变化为乳腺炎的特征。这些腺体变化常常导致许多症状性病状,诸如,乳汁变色、存在凝块和存在大量白细胞。在临床上,乳腺炎表现为乳腺的肿胀、发热、疼痛和硬结,常常导致乳房变形。在许多情况下,亚临床感染的诊断很大程度上根据取决于乳汁的白细胞含量或体细胞计数(SCC)的间接测试。感染乳房的最常见的生物体为大肠杆菌群,诸如,肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属和柠檬酸杆菌属。较不频繁引起乳腺炎的其他生物体包括假单胞菌属、布氏杆菌属(Brucella spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、支原体属和巴斯德氏菌属。
在另一个实施方案中,病状为动物(诸如奶牛)乳汁中体细胞计数(SSC)高。所述方法包括向患有体细胞计数高或处于患有体细胞计数高的产奶动物施用有效量本文所述的组合物,以及确定获自所述动物的乳汁中的体细胞计数是否含有相较于接受所述组合物之前获自所述动物的乳品的减少的体细胞计数。在另一个实施方案中,本文提供一种用于减少动物乳汁中体细胞计数的方法。体细胞包括动物的白细胞,并且通常以低水平存在于正常乳汁中。乳汁中的高水平体细胞,例如,每毫升乳汁大于200,000个细胞毫升。乳汁中的体细胞水平高可能指示感染(乳腺炎),但也可能与感染不相关。SCC通常由乳品加工厂使用本领域例行的方法进行监测。SCC被减少到小于750,000个细胞/ml、小于400,000个细胞/ml或小于200,000个细胞/ml。
在另一个实施方案中,病状为治疗产奶动物诸如奶牛的乳汁产量低。所述方法包括向患有乳汁产量低或处于患有乳汁产量低的产奶动物施用有效量本发明的组合物,以及确定所述动物的乳汁产量是否相较于接受所述组合物之前动物的乳汁产量为增加的。另一个实施方案涉及一种用于增加产奶动物诸如奶牛的乳汁产量的方法。所述方法包括向产奶动物施用本文所述的组合物,以及确定所述动物的乳汁产量是否相较于接受所述组合物之前动物的乳汁产量为增加的。在施用本文所述的组合物之后产奶动物的乳汁产量增加至少0.1%、至少0.5%、至少1%或至少3%。在施用组合物之前以及在施用之后2周、8周或16周确定奶牛的乳汁产量。
本发明还提供用于减少革兰氏阴性微生物的定殖的方法,例如阻断革兰氏阴性微生物的附着位点,包括以下项的组织:骨骼系统(例如,骨头、软骨和韧带)、肌肉系统(例如,骨骼肌和平滑肌)、循环系统(例如,心脏、血管、毛细血管和血液)、神经系统(例如,大脑、脊髓和周围神经)、呼吸系统(例如,鼻子、气管、肺、支气管、细支气管、肺泡)、消化系统(例如,嘴、唾液腺、食道、肝、胃、大肠和小肠)、排泄系统(例如,肾、输尿管、膀胱和尿道)、内分泌系统(例如,下丘脑、脑垂体、甲状腺、胰腺和肾上腺)、生殖系统(例如,卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸和精囊)、淋巴/免疫系统(例如,淋巴、淋巴结和脉管、单核细胞或白血细胞诸如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞包括T细胞和B细胞)和特定细胞谱系(例如,前体细胞、上皮细胞、干细胞)等等。在一个实施方案中,革兰氏阴性微生物为肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌。
减少动物中的定殖可以预防性地执行,或可替代地,可在微生物定殖动物之后开始。预防性(例如,在微生物定殖受试者之前或在任何定殖保持未检测到时开始的)治疗在本文称为处于受到微生物定殖“风险”的受试者的治疗。因此通常,处于受到微生物定殖“风险”的动物为其中动物已被鉴别为受到微生物定殖并且/或者可能暴露于微生物的区域中存在的动物,即使动物尚未表现出任何可检测的受到微生物定殖的指示并且不管动物是否可能潜伏亚定殖量的微生物。因此,组合物的施用可以在动物首次与微生物接触之前、期间或之后。在动物首次与微生物接触之后开始的治疗可能引起受到微生物定殖的程度降低、微生物完全去除和/或相较于未施用组合物的动物微生物定殖动物的可能性减小。因此,所述方法包括向被革兰氏阴性微生物定殖或处于被革兰氏阴性微生物定殖风险的动物施用有效量本发明的组合物。在本发明的这个方面中,“有效量”为足以减少动物被微生物定殖的量,其中减少定殖是指以下项中的一种或多种:受到微生物定殖的程度降低、微生物完全去除和/或相较于未施用组合物的动物微生物定殖动物的可能性减小。用于评估动物被微生物定殖的方法为本领域中例行并且已知的。例如,可以通过测量动物排泄物中微生物的存在确定动物肠道被微生物定殖。预期减少动物被微生物定殖将减少微生物向相同或不同物种的其他动物的传播。
本发明的组合物可用于提供针对细菌感染的主动或被动免疫。一般来讲,可向动物施用组合物以提供主动免疫。但是,也可以将组合物用于诱导产生免疫产物,诸如抗体,可以从产生动物收集所述免疫产物并且施用给另一动物以提供被动免疫。可以从血清、血浆、血液、初乳等收集免疫组分(诸如抗体)以制备组合物(优选地含有抗体)以用于被动免疫疗法。包括单克隆抗体和/或抗独特型的抗体组合物也可以使用已知方法制备。嵌合抗体包括重链和轻链的人源恒定区以及抗原特异性的鼠源可变区(Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81(21):6851-5;LoBuglio等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86(11):4220-4;Boulianne等,Nature,1984,312(5995):643-6)。人源化抗体用人对应物替代鼠恒定区和(可变区的)框架(FR)(Jones等,Nature,1986,321(6069):522-5;Riechmann等,Nature,1988,332(6162):323-7;Verhoeyen等,Science,1988,239(4847):1534-6;Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86(24):10029-33;Daugherty等,Nucleic Acids Res.,1991,19(9):2471-6)。可替代地,可以使用某些小鼠菌株,将所述菌株基因工程化成产生几乎完全为人源的抗体;在免疫之后,将这些小鼠的B细胞收获并且永生化以用于产生人单克隆抗体(Bruggeman和Taussig,Curr.Opin.Biotechnol.,1997,8(4):455-8;Lonberg和Huszar,Int.Rev.Immunol.,1995;13(1):65-93;Lonberg等,Nature,1994,368∶856-9;Taylor等,Nucleic Acids Res.,1992,20∶6287-95)。可以将被动抗体组合物和其片段例如scFv、Fab、F(ab′)2或Fv或其其他修饰形式以血清、血浆、血液、初乳等等的形式施用给接受者。但是,也可以使用已知的方法从血清、血浆、血液、初乳等等分离出抗体以便稍后以浓缩形式或重构形式(诸如像灌洗液、浸渍敷料和/或局部药剂等等)的使用。被动免疫制剂可能对于治疗急性全身性不适或使无法通过母亲初乳接受足够水平被动免疫的年幼动物被动免疫为尤其有利的。可用于被动免疫的抗体还可以用于缀合各种药物或抗生素,所述药物或抗生素可以直接靶向在全身性感染或局部感染期间表达本发明的蛋白质或具有与本发明的蛋白质上存在的表位结构上相关的表位的蛋白质的细菌。
动物模型(特别是小鼠模型)可用于实验性评估本发明的组合物。这些小鼠模型(例如,Meno和Amako,1991,Microbiol.Immuniol.,35(10):841-848;Vered等,2014,BMCGenomics,15∶865;Kurupati等,Clinical Vaccine Immunol.,18(1):82-88;Lundberg等,2013,Human Vaccines Immunotherapeutics,9(3):497-505;和Toky等,2003,FoliaMicrobiol(Praha),48(5):665-669)为克雷伯氏菌属成员并且特别是肺炎克雷伯氏菌引起的疾病的研究普遍接受的模型。在克雷伯氏菌属成员引起动物(例如奶牛)的疾病的情况下,可以使用天然宿主实验性地评估本文所述的组合物。
但是,小鼠模型中的保护不是评定组合物是否可以赋予动物针对克雷伯氏菌属感染的保护的唯一方式。适应性免疫应答由两个主要部分组成:体液(抗体)应答和细胞(T细胞)应答。在受到细菌致病菌感染之后,感染部位处的树突细胞遇到微生物抗原并且响应于与特定细菌相关联的保守分子模式产生信号传导分子诸如像表面受体和细胞因子。这些信号由致病菌的性质成形并且理想地产生保护宿主免于疾病的适当抗体和T细胞应答。尽管一些细菌性疾病主要通过抗体功能来控制,但是其他疾病需要T细胞应答或抗体应答和T细胞应答以便实现保护。疫苗生物学的目标在于鉴别出提供保护的免疫应答然后设计出在人体内再现这些应答中的一个或多个的疫苗。
抗体可具有赋予针对感染的保护的许多不同的功能,诸如像补体固定、调理作用、中和作用和/或凝集作用。此外,一些亚型抗体的特定功能好于其他抗体;例如,就补体固定来说,人IgG亚型存在以下分级结构:IgG3>IgG1>IgG2>IgG4。
可以以多种方式研究抗体免疫学功能。例如,使用蛋白质印迹来基于分离的蛋白质的尺寸鉴别抗原特异性结合,同时使用标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来产生关于血清内抗体效价的定量信息。使用抗体表面结合研究确定血清中的抗体是否能够识别出完整细菌表面上的抗原,这是抗体在体内是否有可能起作用的重要指标。因此本领域的技术人员认识到,抗体结合测定诸如蛋白质印迹、ELISA(例如,使用人抗血清)和/或表面结合与提供针对免疫感染的免疫学活性的特异性结合的抗原正相关。但是本领域的技术人员还认识到,测定(诸如像蛋白质印迹、ELISA或表面结合测定)中缺乏抗体结合并不意指所测定的抗原无法提供针对微生物感染的免疫学活性。
抗体可以通过阻断营养物(例如铁)的获取或引发引起渗透性细胞溶解的补体介导的膜穿孔来介导细菌死亡。可以通过将血清与活培养物混合并且测量在本领域的技术人员已知的适当条件下有活力的细菌的存在来测定杀菌抗体。将抗体和补体结合细菌与人或小鼠吞噬细胞组合以确定细菌杀灭水平的技术诸如调理吞噬测定(OPA)可用于研究抗体功能。可以使用类似的氧化爆发(oxidative burst)测定来评估新鲜人或小鼠嗜中性粒细胞在与抗体和补体结合细菌相互作用以后的反应性氧物质(ROS)的水平。
在一些情况下,可以确定候选蛋白质具有细胞介导的免疫学活性,并且因此确定,候选蛋白质可以在不存在诱导产生抗体时表现出免疫学活性。细胞毒性或CD8T细胞主要通过各种效应机制直接杀死感染的细胞,而辅助CD4T细胞的功能是提供关于细胞因子的重要的信号传导。这些T细胞类别可以基于它们产生的细胞因子被进一步细分,并且不同亚类有效抵抗不同的细菌致病菌。常常通过以流式细胞术评定T细胞表型来研究T细胞,其中抗体用于使能够将T细胞分类为例如新近活化的CD4+T细胞、记忆CD8+T细胞等的特异性表面标记物的水平可视化。此外,可以通过从淋巴组织分离出T细胞并且用同源抗体刺激T细胞来研究细胞因子和T细胞的其他产物。在抗原刺激之后,T细胞产生细胞因子,细胞因子可以通过例如与流式细胞术联合的细胞内细胞因子染色,或收集细胞上清液并且使用Luminex珠粒技术同时测量15-25种细胞因子来可视化。
因此,除小鼠模型之外,本领域的普通技术人员认识到与本文所述的方法相称的免疫学活性可与以下项中的任何一种或多种相关:蛋白质印迹数据,其显示暴露于微生物致病菌的动物的血清含有特异性地结合候选蛋白质的抗体;细胞表面结合测定,其说明特异性地结合候选蛋白质的抗体特异性地结合微生物致病菌;调理吞噬数据;和细胞因子诱导。
本发明的另一个方面提供用于检测特异性地结合本文所述的蛋白质的抗体的方法。这些方法可用于例如检测动物是否具有特异性地结合本文所述的蛋白质的抗体,以及诊断动物是否可能患有由表达本文所述的蛋白质或表达与本文所述的蛋白质共有表位的蛋白质的微生物引起的病状。这种诊断系统可以以试剂盒形式。所述方法包括将抗体与包括本文所述的抗体的制剂接触以产生混合物。抗体可以存在于生物样本例如血液、乳汁或初乳中。所述方法还包括在使抗体特异性地结合蛋白质以形成蛋白质:抗体复合物的条件下孵育混合物。如本文所用,术语“蛋白质:抗体复合物”是指当抗体特异性地结合蛋白质时产生的复合物。包括本文所述的蛋白质的制剂还可以包括提供适合于形成蛋白质:抗体复合物的条件的试剂,例如缓冲液。然后对蛋白质:抗体复合物进行检测。抗体的检测为本领域中已知的并且可以包括例如免疫荧光或过氧化物酶。用于检测特异性地结合本文所述的蛋白质的抗体的存在的方法可以用于已经用于检测抗体的各种方式,包括放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法。
试剂盒
本发明还提供一种用于检测特异性地结合本文所述的蛋白质的抗体的试剂盒。所检测的抗体可以获自怀疑患有由革兰氏阴性微生物诸如肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌引起的感染的动物。在另一个实施方案中,本发明提供一种用于检测本文所述的蛋白质的试剂盒。
试剂盒在合适的包装材料中包括足够至少一种测定的量的本文所述的蛋白质中的至少一种(例如,一种、至少两种、至少三种等)或本文所述的抗体。任选地,还包括实践本发明需要的其他试剂诸如缓冲液和溶液。例如,试剂盒还可以包括允许检测特异性地结合本文所述的蛋白质的抗体的试剂,诸如设计成特异性地结合获自动物的抗体的可检测标记二级抗体。通常还包括所包装的蛋白质的使用说明书。如本文所用,短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物的一种或多种物理结构。包装材料是通过熟知的方法被构造成一般提供无菌、无污染物的环境。包装材料可具有指示蛋白质可以用于检测特异性地结合本发明的蛋白质的抗体的标识。此外,包装材料含有指示如何使用试剂盒内的物质检测抗体的说明书。如本文所用,术语“包装”是指能够在固定的限度内容纳蛋白质和其他试剂例如二级抗体的容器,诸如玻璃、塑料、纸、箔等等。因此,例如,包装可以是固定了微克量蛋白质的微量滴定板孔。包装还可以含有二级抗体。“使用说明书”通常包括描述试剂浓度或至少一个测定方法参数的明确表述,诸如待混合的试剂和样本的相对量、试剂/样本混合物的维持时间段、温度、缓冲液条件等等。
本发明通过以下实施例进行说明。应当理解,特定实施例、材料、量和程序将根据本文所阐述的本发明的范围和精神从广义上进行解释。
实施例1
肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和肠杆菌的临床分离株的分离
从如主治兽医所诊断显示大肠杆菌性乳腺炎的临床征象(即存在异常乳汁;水样稠度、凝块、血液、乳房炎、脓液、乳房肿胀和乳汁样本的细菌培养物鉴别)的商业乳牛群奶牛的感染乳房分离出肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和肠杆菌的分离株。通过将每种分离株接种到含有每毫升30微克(μg/ml)2,2-二吡啶(Sigma-Aldrich St.Louis,MO)的5000ml胰蛋白酶大豆肉汤(Difco Laboratories,Detroit,MI)中制备肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和肠杆菌的主种子原液(master seed stock)。在37℃下使培养物在200rpm下搅拌的同时生长6小时。通过在10,000×g下离心收集细菌。将每种分离株的细菌团块再悬浮到含有20%甘油的500ml胰蛋白酶大豆肉汤中,并且无菌地分配到2ml低温小瓶中(每个小瓶1ml)并在-90℃下储存。每种分离株给予指定其为主种子的鉴别编号。例如,对十七种肺炎克雷伯氏菌分离株进行鉴别并且指定为1101、1437、1438、1439、1440、1563、1565、1566、1567、1569、1570、1571、1572、1573、1574、1575和1576。将产酸克雷伯氏菌指定为1564并且将肠杆菌指定为1568。将肺炎克雷伯氏菌的牛主种子编号指定为1571,将产酸克雷伯氏菌的牛主种子编号指定为1564,将肠杆菌的牛主种子编号指定为1568。制备肺炎克雷伯氏菌的人分离株的主种子编号并且指定为LM21(在本文还称为1748)。人UTI大肠杆菌分离株用作参考菌株,指定为CFT073。将每种分离株的主种子扩大成工作种子(working seed),然后将其用于生产金属调控蛋白。开发出小型实验室规模过程以检查多种克雷伯氏菌属分离株的初始金属调控蛋白表达,同时开发出大规模生产过程,其涉及发酵、细菌收获、破坏、增溶、浓缩、渗滤和最终疫苗抗原的分离。当通过一维SDS-PAGE检查时,金属调控蛋白表达的小型和大型按比例扩大的过程产生相同的蛋白质概况。
实施例2
通过聚合酶链反应(PCR)的肺炎克雷伯氏菌与产酸克雷伯氏菌的鉴别和区分。
为了区分表现出疾病临床征象的人和牛物种的肺炎克雷伯氏菌1571与产酸克雷伯氏菌1564分离株,如Chander等(2011,Intern J Appl Res Vet Med.9:138-142)所述将多重聚合酶链反应(PCR)与种特异性引物一起使用。琼脂糖凝胶上谱带的位置(108bp为肺炎克雷伯氏菌1571并且343bp为产酸克雷伯氏菌1564)确认菌株身份(图1)。
引物和PCR扩增:将实施例1的工作种子一式两份铺板在血琼脂上。在35-40℃下将板孵育18-24小时。孵育之后,对板进行目视检查并且确定为纯的。将两份纯培养物板中的一份的单个良好分离的菌落悬浮在100μL无菌水中。将悬浮液煮沸10分钟以使细胞溶解,并且使其在室温下冷却。然后将悬浮液在桌面微型离心机中在13,000rpm下离心2分钟。将含有DNA模板的上清液转移到新的无菌微量离心管中并且在-20℃下储存直到使用。
将种特异性引物用于在单一反应混合物中扩增肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌(表2)。测定中包括产酸克雷伯氏菌和肺炎克雷伯氏菌的阳性对照。还包括大肠杆菌的无引物阴性对照。根据制造商的说明书,使用Qiagen多重PCR试剂盒建立PCR反应。反应混合物由以下组成:25μL 2×每种引物(正向和反向)的Qiagen多重PCR主混合物;5μL 10×引物混合物;15μL无RNA酶的水;5μL粗DNA模板;和50μL总体积。PCR的反应条件为如下:在95℃下初始变性15分钟;30个循环的在94℃下变性30秒;在55℃下退火1.5分钟;以及在72℃下延伸1.5分钟。
表2.用于鉴别并辨别肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌的引物的序列。
通过在0.5×Tris/硼酸/EDTA(TBE)中在1%琼脂糖凝胶(用溴化乙锭预染色)上进行电泳并且进行UV透射将PCR产物可视化。将100bp DNA梯带用作分子量标记物(图1)。
实施例3
用于筛选在金属离子限制的条件下生长的多种分离株的金属调控蛋白表达的过程
使用来源于源自患有疾病临床征象的牛物种的肺炎克雷伯氏菌的蛋白质制备金属调控蛋白的筛选以及以下实施例中所用的免疫组合物。
从显示乳腺炎临床征象的多个乳牛群收集肺炎克雷伯氏菌1563、1565、1566、1567、1569、1570、1571、1572、1573、1574、1575和1576的多种野生分离株以及产酸克雷伯氏菌1564和肠杆菌1568的单一分离株。还针对金属调控蛋白对肺炎克雷伯氏菌LM21的人分离株进行筛选。使每种分离株在铁限制的条件下生长,并且通过SDS-PAGE检查在铁限制下表达的蛋白质的外膜概况(图2)。简而言之,将待检查的每种分离株接种到含有300μM 2,2-二吡啶的TSB中并且在37℃下孵育。在孵育12小时之后,将培养物继代培养(1∶100)到500ml铁限制性培养基中并且在37℃下孵育。8小时之后,将每种培养物在10,000×g下离心20分钟,再悬浮于40ml pH 8.9渗透休克缓冲液(7.3g/l Tris碱;1.86g/l EDTA)中并且通过超声处理破坏,以得到悬浮液。将悬浮液在32,000×g下离心12分钟以净化或去除大细胞碎片。收集上清液并且通过在4℃下加入4%月桂酰肌氨酸钠持续24小时来增溶。通过在4℃下在32,000×g下离心2.5小时收集不溶于洗涤剂的外膜蛋白富集级分。将蛋白质团块再悬浮于200μl Tris缓冲液(pH 7.2)中。
使用4%浓缩胶和10%分离胶将来源于每种分离株的蛋白质富集提取物在SDS-PAGE凝胶上进行尺寸分级。通过将10μl样本与30μl SDS还原样本缓冲液(62.5mM Tris-HCLpH 6.8、20%甘油、2%SDS、5%β-巯基乙醇)合并且煮沸4分钟来制备电泳的样本。在4℃下使用Protein II xi电池电源(BioRad Laboratories,Richmond,CA,1000/500型)在18mA恒定电流下将样本电泳5小时。比较来源于牛和人源的肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、肠杆菌的多种分离株的蛋白质的电泳概况显示于图2中。
蛋白质富集提取物的SDS-PAGE图在所检查的所有分离株中均显示高度保守,金属调控蛋白的分子量的范围为97kDa至66kDa并且非金属调控蛋白(例如孔蛋白)的分子量的范围为35kDa至33kDa(表1)。使用Phoretix 1D Pro Gel软件(Total Lab;United Kingdom)分析电泳概况以评估显带图和每种菌株之间的分子量校正。
实施例4
通过一维SDS-PAGE分析在铁饱满和铁缺乏下的金属调控蛋白
为了获得肺炎克雷伯氏菌1571的金属调控蛋白上调的更好理解,使分离株在铁饱满和铁缺乏培养基条件中生长。简而言之,使生物体从冷冻主种子原液生长,事先通过继代培养到两个独立的500ml瓶中来制备。一个瓶内含含有300μM 2,2-二吡啶(Sigma-AldrichSt.Louis,MO)的200ml无菌TSB,而第二瓶内含含有200μM氯化铁(Sigma-AldrichSt.Louis,MO)的200ml胰蛋白酶大豆肉汤。在37℃在200rpm下连续搅拌的情况下将培养物孵育12小时。在12小时孵育期之后,将培养物继代培养(1∶100)到500ml铁饱满和/或铁缺乏培养基中并且在37℃下孵育8小时。8小时之后,将每种培养物在10,000×g下离心20分钟,并且再悬浮于40ml pH 8.9渗透休克缓冲液(7.3g/l Tris碱;1.86g/l EDTA)中。将悬浮液在32,000×g下离心12分钟以净化或去除大细胞碎片。收集上清液并且通过在4℃下加入4%月桂酰肌氨酸钠持续24小时来增溶。通过在4℃下在32,000×g下离心2.5小时收集不溶于洗涤剂的外膜蛋白富集级分。将蛋白质团块再悬浮于200μl Tris缓冲液(pH 7.2)中。
使用4%浓缩胶和10%分离胶将来源于每种分离株的蛋白质富集提取物在SDS-PAGE凝胶上进行尺寸分级。通过将10μl样本与30μl SDS还原样本缓冲液(62.5mM Tris-HCLpH 6.8、20%甘油、2%SDS、5%β-巯基乙醇)合并且煮沸4分钟来制备电泳的样本。在4℃下使用Protein II xi电池电源(BioRad Laboratories,Richmond,CA,1000/500型)在18mA恒定电流下将样本电泳5小时。比较来源于在铁饱满和铁缺乏生长培养基下生长的肺炎克雷伯氏菌的蛋白质概况的电泳概况显示于图3中。
实施例5
制造金属调控蛋白的大规模过程
发酵
将一个低温小瓶的工作种子(在109CFU/ml下1ml)用于接种含有34微克/升2,2-二吡啶(Sigma)、2.5克/升酵母提取物(Bacto)和甘油(3%体积/体积)的500ml 37℃不含右旋糖胰蛋白酶的大豆肉汤(TSB)(Bacto)。在37℃下将培养物在160rpm下搅拌的同时孵育16小时,然后分到上文培养基的两个1.5L瓶中。使这种第二培养物在37℃下再生长2.5小时。将这种培养物用于接种装有300升上文所述的培养基、加入Mazu DF 204消泡剂(150ml)的400L DCI-Biolafitte SIP发酵罐(DCI,St.Cloud,MN)。发酵参数如下:通过将搅拌增加到500转/分钟,在17-120升空气/分钟、0-60升空气/分钟的情况下鼓泡和5磅每平方英寸(psi)背压使溶解氧(DO)维持在60%+/-20%。通过用50%NaOH和25%H3PO4自动滴定使pH保持恒定在6.9与7.2之间。使温度维持在37℃。使发酵连续生长5.5小时,此时通过将发酵罐的温度降低至15℃并且用25%H3PO4将pH减小至5.0来使发酵终止(在540纳米下、在1∶20稀释下光密度为15)。在准备收获时,将培养物无菌地转移到200升罐(LEE ProcessSystems and Equipment 2000LDBT型)中。
收获
使用配备有连接到Waukesha 130U2型进料泵(Waukesha Cherry-Burrell,Delevan,WI)的四个30ft2 Alpha 0.1um开放型流道过滤器(Pall Filtron,目录号PSM10C52)的Pall Filtron切向流Maxisette-25(Pall Filtron Corporation,Northboro,MA)将细菌发酵浓缩并洗涤。使用30-40psi的过滤器入口压力和2-15psi的滞留物(retentate)压力将300升初始培养物体积减少至60升。然后使用由2.72克/升三水合乙酸钠构成的200升三水合乙酸钠溶液pH 5.0洗涤细菌滞留物。然后用含有14.52克/升Tris碱和1.86克/升EDTA、调整至pH 8.6的100升渗透休克缓冲液(OMS)洗涤60升细菌滞留物。OMS中的EDTA用于帮助去除细胞壁的大量LPS,同时升高的pH防止冷冻和破坏之后的大量蛋白水解降解。蛋白酶抑制剂可以用来代替或辅助升高的pH。然后将滞留物浓缩至40升以帮助去除任何污染外源性蛋白,然后加入200多升上文OMS以通过过滤器将所有细菌洗涤到收获罐中。使用底部安装的磁力驱动混合器在200升罐中充分混合滞留物。将滞留物无菌地分配(5升)到γ照射的5升InvitroTM容器中并且放置在-20℃冰箱中以用于储存。冷冻细菌团块用于弱化细胞壁结构,从而使下游破坏更有效。通过离心1ml发酵培养物样本并最终收获来计算团块质量。将预称重的1ml锥形管在Microfuge 18中在13,000rpm下离心10分钟。倒出上清液并将团块再悬浮于无菌水中。将此混合物在13,000rpm下再离心5分钟,之后将其再一次倾析。将此洗涤过的团块放置于125℃烘箱中75分钟,之后进行称重和外推以确定收获体积团块质量。此类发酵过程得到2.3千克干团块质量。
可以使用细菌收获的替代方法。可以通过使用中空纤维过滤器方法执行细菌收获。使用尺寸范围为0.2μM至5kDa的过滤器滤筒收获细菌培养物;优选地,以750kDa滤筒。将培养物的体积减小2-20X,并随后通过用缓冲液渗滤来洗涤1-5X,之后在4℃下储存或在-20℃下冷冻。这样,将不需要的培养基蛋白质、细菌蛋白质和LPS从培养物去除。在另一个替代方法中,可以通过使用工业规模离心(例如通过使用碟片离心机(disc-stackcentrifuge))执行细菌收获。
破坏(均化)
在4℃下将OMS中的冷冻细菌细胞浆液解冻(2.3kg团块质量)。将每个容器的液态培养物悬浮液无菌地抽吸到具有底部安装混合器(Lightnin混合器MBI610H55型)、含有13升OMS pH8.5的200升处理罐(200LDBT型)中。通过以下确定OMS体积:通过将团块质量乘以30.8L/Kg来计算均化体积并得到均化体积,并且减去发酵收获的细菌体积。在18Hz下连续搅拌18小时的情况下将本体细菌悬浮液在4℃下冷却,此时通过均化将其破坏。简而言之,将含有细菌悬浮液的200升罐连接到Avestin EF-C500B型均化器(Avestin,Rosemont,IL)。将第二200升处理罐(空的)连接到均化器,使得处理罐中的流体可以穿行通过均化器到空罐中并且再返回,从而允许在仍维持密闭系统的同时有多次均化穿行。将均化期间的温度保持在4℃。在每次穿行开始时,将流体在60psi下经由Waukesha 30U2型泵(Waukesha)以通过均化器(500升/小时)并返回到起始罐的方式循环,同时将均化器压力调整至11,000-30,000psi。在第一次穿行之前,将两种均化前样本从均化器抽出以建立基线从而确定破坏程度并且监测pH。破坏程度通过与非均化样本相比的透射率(%T,在540nm下,在1∶100稀释下)进行监测。基于细胞壁的完整性和破坏程度的变化将不同生物体的通过均化器的穿行数标准化,这与增溶效率和最终产物的量直接相关。例如,穿行通过均化器两次的沙门氏菌的破坏得到在1∶100稀释下在78-83%T之间的最终透射率百分比。具有相同团块质量及开始OD的大肠杆菌在第二次穿行之后得到80-86%的%T(在1∶100稀释下)。已观察到,在相同条件下细菌的细胞壁完整性不同并且其破坏容量有所不同。这种变化可能影响增溶程度和效率以及金属调控蛋白的回收。一般来讲,使细胞穿行通过均化器直到最少两次穿行之后达到至少80%的透射率。
均化之后,将月桂酰肌氨酸钠(Hamptosyl L-30,Chem/Serv)无菌地加入到均化过的细菌悬浮液中以用于增溶。加入的肌氨酸的量(30%)等于0.083乘以增溶体积(以升为单位)(增溶体积通过将发酵干团块质量乘以34.7L/Kg来确定)。将罐从均化器移除并放置于2-7℃冷却器中并且在18Hz下混合12-96小时。这个时间段有助于完成增溶。发现增加在升高pH(8.0-8.5)的OMS中的增溶时间,金属调控蛋白聚集在一起形成大的不溶性聚集体,所述聚集体容易通过离心去除。增溶之后的最佳OD通常为在540nm下在25-30%T之间。在收获之前12-24小时,将0.15%福尔马林加入到最终增溶体积中作为防腐剂。
蛋白质收获
通过使用T-1Sharples(Alfa Laval Seperations,Warminster,PA)离心来收集增溶处理流体内的聚集金属调控蛋白。简而言之,在11psi下、在30,000rpm离心速度下将所述罐增溶匀浆以200ml/分钟进料速率进料到十二个Sharples中。通过密闭无菌环将流出物收集到第二200升处理罐中,允许在维持密闭系统的同时多次穿行通过离心机。将离心期间的温度保持在4℃。在21psi下、在50,000rpm离心速度下将增溶匀浆以150ml/分钟的进料速率跨离心机穿行至多12次。在第一次穿行之后收集蛋白质并舍弃,此时将增溶流体浓缩至其初始体积的1/3。这种体积减少缩短第2-12次穿行的处理时间。简而言之,将增溶匀浆罐连接到配备有连接到Waukesha 130U2型进料泵的三个30.1ft2筛网-流道串联Omega 10kdMaxisette过滤器(Pall Filtron)的Pall Filtron AT25支架(Pall Filtron AT25Holder)以实现浓缩。浓缩之后,继续离心直到完成所述过程。在每次穿行之后收集蛋白质。将蛋白质收集、再悬浮并分配到含有Tris缓冲液pH8.5的两个8升容器中,所述缓冲液含有0.3%福尔马林(Sigma)作为防腐剂。将容器放置到Turbula T10B型混合器(M.O.Industries,Wippany,New Jersey)中并混合直到将蛋白质再悬浮于缓冲溶液中。
渗滤
通过在4℃下渗滤洗涤蛋白质悬浮液以去除可能结合蛋白质的任何污染肌氨酸。将两个容器的蛋白质抽吸到含有由含有0.3%福尔马林的Tris缓冲液pH8.5收获的40mlTBW/g蛋白质、配备有在20Hz下混合的底部安装Lightnin混合器MBI610H55型的200升罐中。将处理罐放置于33℃孵育器中最少12小时以实现蛋白质灭活。将处理罐无菌地连接到配备有连接到Waukesha 30U2型进料泵的两个26.9ft2筛网-流道串联Omega 10K Centrasette过滤器(Pall Filtron)的Millipore Pellicon切向流过滤器组件(MilliporeCorporation,Bedford,MA)。将溶液浓缩至大约35升并用含有0.1%福尔马林溶液的200升Tris缓冲液pH 7.4再悬浮。再次将溶液浓缩至大约35升并再次用含有0.1%福尔马林溶液的200升Tris缓冲液pH 7.4再悬浮。然后将溶液浓缩至大约35升并用含有0.1%福尔马林溶液的80升Tris缓冲液pH 7.4再悬浮。然后通过过滤将溶液浓缩至6.5倍蛋白质珠粒质量的目标体积。将蛋白质浓缩物无菌地分配到无菌20升Nalgene容器中并放置到33℃孵育器中12-24小时以实现最终的抗原灭活。
这个过程产生LPS的量减少并且肌氨酸残余物非常少至不存在的含有金属调控蛋白的组合物。通过SDS-PAGE检查蛋白质的纯度和显带概况,并且还检查细菌污染、残余肌氨酸和LPS。成品的显带概况显示与通过电泳检查一致的图。通过使用将绵羊红血细胞(5%)掺入到琼脂基质(1.5%)中的修改琼脂凝胶扩散测试来测试组合物的肌氨酸。在琼脂中切割出孔,将成品样本连同已知肌氨酸浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0和2.0%的对照样本放置到孔中。在25℃下将凝胶孵育24小时,并且与对照进行比较确定溶血程度。这个过程不包括低于0.05%的可检测肌氨酸水平,此浓度下的水平显示对照样本中的最小溶血。通过可以商品名PYROTELL(Associates ofCape Cod,Inc.,East Falmouth,MA)获得的鲎阿米巴样细胞溶解产物(LAL)测试检查LPS的浓度。
在通过冷冻和均化实现细胞溶解之后,可以通过中空纤维方法收获蛋白质。过滤细菌溶解产物以将全细胞和大碎片与小颗粒和可溶性蛋白分开。这可以使用0.2μM至5kDa的一系列尺寸的中空纤维滤筒来完成;优选地,具有0.65μM标称孔尺寸。这样,未溶解的全细胞和大碎片通过过滤器得以保留并且可能浓缩,而感兴趣的蛋白质和小颗粒则穿行通过过滤器并被收集。另外,可能需要用缓冲液洗涤滞留物1-20X以增加感兴趣的蛋白质的收获。
在上文的初级收获之后,如上文所述用肌氨酸将小颗粒的细菌膜增溶,接着通过中空纤维进行进一步分级或蛋白质收获和洗涤。此举提供三个功能:去除不需要的胞质蛋白,去除不需要的膜组分包括LPS和将需要的金属调控蛋白和孔蛋白蛋白质疏水性聚集成较高分子量形式。在增溶步骤之后,使用尺寸范围为0.2μM至5kDa的中空纤维滤筒过滤溶液;优选地,具有实验室和/或中试规模超滤滤筒(例如,(UFP-750-E-6A)尺寸6A超滤中空纤维滤筒(63.5cm L);聚砜膜,可选地具有750000NMWC孔尺寸,GE Healthcare Pittsburgh,PA)。这一步骤还可以包括浓缩步骤(2-20X)和用缓冲液和乙醇的渗滤洗涤步骤(1X-20X)以增强不需要的蛋白质、膜组分、DNA和肌氨酸的去除并因此增加收集的金属调控蛋白和孔蛋白蛋白质的纯度。
如上文所述制备的组合物中存在的蛋白质的实例显示于图4中。在SDS-PAGE凝胶上解析蛋白质之后观察到五种较高分子量蛋白质(其中四种在图4中鉴别为FepA、FecA、FhuA和CirA,并且迁移高于谱带的一种鉴别为FepA)和两种较低分子量谱带(在图4中鉴别为OmpC和OmpA)。
实施例6
肺炎克雷伯氏菌分离株1571的金属调控蛋白的表征
使用MALDI-TOF MS表征来自肺炎克雷伯氏菌菌株1571的如实施例5中所述制备的组合物的蛋白质。这些方法还可以用于产酸克雷伯氏菌和肠杆菌分离株。
使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间谱(MALDI-TOF MS)表征来自肺炎克雷伯氏菌菌株1571的如实施例5中所述制备的组合物的蛋白质。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶解析一部分组合物。在解析组合物的蛋白质之后,用考马斯亮蓝或银将凝胶染色以可视化蛋白质。这种方法还用于表征获自产酸克雷伯氏菌和肠杆菌分离株的组合物。
材料和方法
切除和洗涤。在使用SDS-PAGE解析蛋白质并染色以可视化蛋白质之后,用水两次洗涤凝胶10分钟。通过尽可能接近蛋白质谱带地切割来切除感兴趣的每个蛋白质谱带以减少样本中存在的凝胶的量。使用在图4中鉴别为FepA、FecA、FhuA、CirA、OmpC和OmpA的六个谱带制备六个凝胶片段。
将每个凝胶薄片切割成1×1mm立方体并放置于1.5ml管中。用水洗涤凝胶片15分钟。洗涤步骤中使用的所有溶剂体积大约等于凝胶薄片体积的两倍。接着用水/乙腈(1:1)洗涤凝胶薄片15分钟。当用银染色蛋白质时,去除水/乙腈混合物,将凝胶片在SpeedVac(ThermoSavant,Holbrook,NY)中干燥,然后如下文所述还原并且烷基化。当凝胶片不是银染色的时,去除水/乙腈混合物,并且加入乙腈以覆盖直到凝胶片变成粘稠的白色,此时去除乙腈。将凝胶片在100mM NH4HCO3中再水化,并且5分钟之后,加入体积等于两倍凝胶片体积的乙腈。将其孵育15分钟,去除液体,并且将凝胶片在SpeedVac中干燥。
还原和烷基化。将干燥的凝胶片在10mM DTT和100mM NH4HCO3中再水化,并且在56℃下孵育45分钟。在使管冷却至室温之后,去除液体并且立即加入相同体积的55mM碘乙酰胺和100mM NH4HCO3的混合物。将其在室温下、在黑暗中孵育30分钟。去除液体,加入乙腈以覆盖直到凝胶片变成粘稠的白色,此时去除乙腈。将凝胶片在100mM NH4HCO3中再水化,并且5分钟之后,加入体积等于两倍凝胶片体积的乙腈。将其孵育15分钟,去除液体,并且将凝胶片在Speed vac中干燥。如果用考马斯蓝染色凝胶并且仍然留下残余考马斯,那么重复用100mM NH4HCO3/乙腈洗涤。
凝胶内消化。将凝胶片在Speed Vac中完全干燥。在4℃下将这些片在消化缓冲液(50mM NH4HCO3、5mM CaCl2、12.5纳克每微升(ng/μl)胰蛋白酶)中再水化。加入足够的缓冲液以覆盖凝胶片,并且按需要加入更更多缓冲液。在冰上孵育凝胶45分钟,并且将上清液去除并用5-2μl不具有胰蛋白酶的相同缓冲液代替。将其在37℃下在空气孵育器中孵育过夜。
肽的提取。加入足够体积的25mM NH4HCO3以覆盖凝胶片,并且孵育15分钟(一般在浴式超声仪中)。加入相同体积的乙腈并且孵育15分钟(如果需要,在浴式超声仪中),并且回收上清液。使用5%甲酸代替NH4HCO3重复提取两次。加入足够体积的5%甲酸以覆盖凝胶片,并且孵育15分钟(一般在浴式超声仪中)。加入相同体积的乙腈并且孵育15分钟(通常在浴式超声仪中),并且回收上清液。将提取物汇集,并且加入10mM DTT至最终浓度为1mMDTT。在SpeedVac中将样本干燥至最终体积为大约5μl。
肽的脱盐。如制造商所建议,使用ZIPTIP移液管尖端(C18,Millipore,Billerica,MA)将样本脱盐。简而言之,将样本在重构溶液(5∶95乙腈∶H2O、0.1%-0.5%三氟乙酸)中重构、离心并且检查pH以验证pH小于3。通过抽吸10μl溶液1(50:50乙腈:H2O、0.1%三氟乙酸)并舍弃抽吸的等分试样将ZIPTIP水化。在这之后,抽吸10μl溶液2(0.1%三氟乙酸的去离子H2O溶液)并舍弃抽吸的等分试样。通过缓慢抽吸10μl样本到尖端中,将其排出到样本管中并重复这个过程5至6次来将样本加载到尖端中。将10微升溶液2抽吸到尖端中,通过排出将溶液舍弃,并且将这个过程重复5-7次以洗涤。通过抽吸2.5μl冰冷的溶液3(60∶40乙腈∶H2O、0.1%三氟乙酸),排出然后再抽吸相同等分试样进出尖端3次来洗脱肽。在将溶液从尖端排出之后,将管盖上盖子并且在冰上储存。
质谱肽作图。将肽悬浮于10μL至30μL 5%甲酸中,并且通过MALDI-TOF MS(BrukerDaltonics Inc.,Billerica,MA)进行分析。如制造商所建议确定肽片段的质谱。简而言之,将含有由胰蛋白酶消化产生的肽的样本与基质氰基-4-羟基肉桂酸混合,转移到目标并且将其干燥。将干燥的样本放置于质谱仪中,照射,并且检测每种离子的飞行之间并用于确定组合物中存在的每种蛋白质的肽质量指纹谱。使用已知多肽将机器标准化。
数据分析。使用Mascot搜索引擎的肽质量指纹谱搜索方法(Matrix ScienceLtd.,London,UK和www.matrixscience.com,参见Perkins等,1999,Electrophoresis 20,3551-3567)将实验上观察到的每个质谱中肽的质量与预期的蛋白质质量相比较。搜索参数包括:数据库,NCBInr;分类,细菌(真细菌);搜索类型,肽质量指纹谱;酶,胰蛋白酶;固定修饰,脲基甲基(C)或没有;可变修饰,氧化(M)、脲基甲基(C)、组合或没有;质量值,单一同位素;蛋白质质量,未限制;肽质量公差,在±100ppm与±300ppm或450ppm或±1Da之间;肽电荷状态,Mr;最大错误裂解,0或1;查询次数,25。
多肽的SDS-PAGE分析指示,在所使用的SDS-PAGE条件下,如通过SDS-PAGE所确定,蛋白质在82kDa、78kDa、72kDa、68kDa、35kDa和33kDa下迁移(表1)。另一种蛋白质为轻谱带并且在87kDa下迁移。MALDI分析和基于氨基酸序列的预测分子量显示如使用SDS-PAGE所估计的蛋白质分子量与如使用MALDI估计的蛋白质分子量之间完美一致(表1)。通过MALDI鉴别图4中的蛋白质。这些分析产生代表每个肽质量指纹谱的最佳蛋白质匹配的蛋白质序列。谱带标记FepA的最佳蛋白质匹配为NCBI参考序列WP_012068422.1;谱带标记FecA的最佳蛋白质匹配为NCBI参考序列NP_943400.1;谱带标记FhuA的最佳蛋白质匹配为NCBI参考序列WP_004178624.1;谱带标记CirA的最佳蛋白质匹配为NCBI参考序列WP_015958738.1;谱带标记OmpC的最佳蛋白质匹配为NCBI参考序列WP_015958749.1;谱带标记OmpA的最佳蛋白质匹配为NCBI参考序列WP_002898408.1。
基因组测序
使用ChargeSwitch gDNA微型细菌试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA,产品编号:CS11301)从肺炎克雷伯氏菌1571分离株分离出基因组DNA。在提取基因组DNA之前,在37℃下将新鲜的分离株培养物在具有5%绵羊血的大豆胰酶解酪蛋白琼脂II(Trypticase Soy Agar II)(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,产品代码:221261)上生长过夜。所述程序遵循制造商方案。最终产率为33.7μg基因组DNA,将其在-20℃下储存直到测序。将基因组DNA提交到ACGT公司以用于测序(Wheeling,IL)。
鉴别靶基因
在接收到分离株的完整基因组序列之后,用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库执行tblastn比对以鉴别可能的感兴趣的基因。肺炎克雷伯氏菌1571基因组序列的第一次分析使用MALDI的六个谱带的数据分析结果。此分析产生由存在于肺炎克雷伯氏菌1571基因组序列中的基因编码的以下蛋白质的鉴别:FepA、FecA、FhuA、CirA、OmpC和OmpA。这些蛋白质和编码它们的基因分别公开于图10、7、8、9、20和21。完整基因组序列的另一次分析是基于序列内的Ton B依赖性同源物。算法参数为矩阵:BLOSUM62及空位成本:存在:11延伸:1。使用blastx搜索鉴别用tblastn比对发现的同源基因所转译的蛋白质。算法参数为矩阵:BLOSUM62及空位成本:存在:11延伸:1。所鉴别的金属调控多肽同源物的成对序列比对。算法参数为矩阵:BLOSUM62,空位开放:14,空位延伸:4,替代匹配:1。
为了鉴别其他金属调控蛋白BtuB、YbiL、YncD、IroN、IutA、FitA、FcuA、铁肠杆菌素大肠杆菌素B/D受体FoxA的可能同源物,针对肺炎克雷伯氏菌分离株的测序基因组执行“tblastn”比对。通过考察分别在基因组内同一性最高的序列鉴别出九种可能的同源物,并且公开于图11-19。鉴别了三种可能的同源物的部分核苷酸序列和预测氨基酸序列(YncD、IroN和FitA,分别为图13、14和16)。
实施例7
霍斯坦小公牛的超免疫和多克隆抗体的制备
使用如实施例5和6中所述的肺炎克雷伯氏菌1571组合物以28天间隔对四月龄的两只霍斯坦小公牛皮下疫苗接种三次。免疫组合物包括如通过SDS-PAGE所确定分子量为87kDa、82kDa、78kDa、72kDa、68kDa、35kDa和33kDa的多肽。将蛋白质乳化到单一疫苗配制品中。简而言之,将320mg抗原(金属调控蛋白和孔蛋白)混合到355ml生理盐水中。将抗原溶液乳化到80ml EMULSIGEN中以得到在2ml可注射体积中在22.5%EMULSIGEN浓度下1500μg总蛋白质的最终剂量。在第三次疫苗接种之后28天,从每只小公牛汇集2.0升血液并使其在4℃下凝结24小时。通过在3000×g下离心30分钟将血清从全血中分离。将800ml血清在10,000×g下再次离心30分钟以去除任何污染细胞碎片,然后在无菌50ml圆锥管(FisherScientific)中等分成25ml体积并且在-80℃下冷冻直到使用。使用标准硫酸铵沉淀将25毫升超免疫血清纯化。简而言之,首先去除外源性血清蛋白,之后通过加入0.5体积饱和硫酸铵pH7.2进行抗体沉淀。在4℃下将溶液在100rpm下搅拌24小时。将溶液在3000×g下再次离心30分钟。收集上清液并且通过加入足够的饱和硫酸铵再次沉淀以得到55%饱和的最终浓度。在4℃下将溶液在100rpm下搅拌24小时。将沉淀在3000×g下离心30分钟。将每个样本的最终团块再悬浮到2ml PBS pH 7.2中。然后用改变三次的1升磷酸盐缓冲盐水,使用50,000分子截留透析管(Pierce,Rockford Ill.)将沉淀的抗体透析30小时以去除硫酸铵。前两升改变保留有0.02%叠氮化钠。最后1升缓冲液改变不含有防腐剂。收集透析液并在3000×g下再次离心30分钟以去除任何剩余的碎片。在使用之前将抗体溶液在4℃下储存小于48小时。将每个样本铺板于血琼脂上以验证无菌。
实施例8
肺炎克雷伯氏菌1571金属调控蛋白与克雷伯氏菌属、大肠杆菌和肠杆菌的其他菌株的交叉反应性。
检查针对实施例7的肺炎克雷伯氏菌1571的纯化金属调控蛋白产生的超免疫血清对不同属和种的细菌的交叉反应性。使实施例3的金属调控蛋白(克雷伯氏菌属1564、1569、1571、LM21、肠杆菌1568和大肠杆菌O157)经历电泳,接着用如实施例7中所述的肺炎克雷伯氏菌1571超免疫血清进行蛋白质印迹分析。还如实施例3中所述制备大肠杆菌O157的金属调控蛋白并且检查。
使大肠杆菌O157、牛和人源克雷伯氏菌属和肠杆菌的纯化金属调控蛋白经历电泳,接着用如实施例7中所述的肺炎克雷伯氏菌1571的超免疫血清进行蛋白质印迹分析。简而言之,使用4%浓缩胶和7.5%分离胶将外膜制剂在SDS-PAGE凝胶上尺寸分级。将10μl样本与10μl SDS还原样本缓冲液(62.5mM Tris-HCL ph 6.8、20%甘油、2%SDS、5%β-巯基乙醇)合并且煮沸4分钟。在4℃下使用Protein II xi电池和1000/500型电源(BioRadLaboratories,Richmond,CA)在18mA恒定电流下将样本电泳5小时。使用宽范围彩虹(kaleidoscope)标准品(BioRad)将谱带迁移可视化以帮助电印迹转移,同时将生物素酰化的宽范围标准品用作印迹上的分子量参考(参见图5A和5B)。对于蛋白质印迹分析,在4℃下、在Towbin缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、20%甲醇)中,使用BioRad Trans-Blot转移池和Pac 300电源(BioRad)以50V,将蛋白质从凝胶电印迹到trans-blot硝化纤维素膜(BioRad)上过夜。使用3%鱼胶(Sigma Chemical,St.Louis,Mo)的Tris缓冲盐水(TBS-20mMTris、500mM NaCl,pH7.5)溶液阻断硝化纤维素膜1小时,同时在37℃下振荡。将膜在37℃下干燥并且在含有3%鱼胶的TBS中阻断,并且重复这一过程。然后从如实施例7中所述的免疫小公牛收集的多克隆超免疫血清对膜进行探测。将一级抗体1/50稀释于含有1%鱼胶、0.05%Tween 20和0.2%叠氮化钠的TBS(抗体缓冲液)中。在室温下将膜与一级抗体溶液在振荡器上孵育过夜。然后将膜在含有0.05%Tween 20的TBS(TTBS)中洗涤两次并且转移到含有碱性磷酸酶缀合的小鼠抗牛IgG克隆BG-18(Sigma)的1/10,000稀释液和缀合碱性磷酸酶的抗生物素蛋白(BioRad)的1/3000稀释液的抗体缓冲液中。在37℃下将膜在振荡器上孵育2小时,然后在TTBS中洗涤四次以去除未结合的缀合物。在37℃下、在振荡器上,将印迹在含有碱性磷酸酶彩色试剂A和B的1x AP彩色显影缓冲液(BioRad)中解析30min。使用BioRadGS-800密度计记载所得蛋白质免疫印迹(参见图5A和5B)。
蛋白质印迹分析表明,针对实施例5的纯化金属调控蛋白制备的阳性抗血清与大肠杆菌O157(泳道2)、产酸克雷伯氏菌(泳道3)、肺炎克雷伯氏菌1569(泳道4)、肺炎克雷伯氏菌LM21(泳道5)、肺炎克雷伯氏菌1571、(泳道6)和肠杆菌1568(泳道7)的多种金属调控蛋白剧烈反应。这些结果显示,肺炎克雷伯氏菌的金属调控蛋白与克雷伯氏菌属和不同属和种的细菌的不同菌株具有高度抗原同源性。
实施例9
金属调控蛋白的序列同一性
为了进一步证实肺炎克雷伯氏菌1571与其他克雷伯氏菌属、大肠杆菌和肠杆菌分离株的各种金属调控蛋白的同源性,检查了多种肽(CirA、FcuA、FecA、FhuA和IutA)的氨基酸序列同一性以确定同源性百分比。还基于特定疾病病状对分离株进行选择,诸如牛物种的乳腺炎以及人的败血病、肺炎、新生儿脓毒症、肝脓肿、尿道感染、脑脊髓感染和ETEC腹泻。使用NCBI的蛋白质BLAST(blastp)的默认设置分析蛋白质序列。针对同源性考虑在e值等于0并且覆盖率>95%的情况下的匹配。表3显示在农业动物和人中诱导不同疾病病状的肺炎克雷伯氏菌1571与克雷伯氏菌属、大肠杆菌和肠杆菌的其他分离株之间共有的金属调控蛋白。并非所有分离株均含有所检查的每一种铁调控蛋白,但是如可从表3中看到大多数金属调控蛋白跨克雷伯氏菌属菌株达到99-100%同一性。此外,相较于大肠杆菌和肠杆菌的其他分离株,肺炎克雷伯氏菌1571疫苗菌株中见到的大多数金属调控蛋白显示大于60%并且高达99%的显著同一性。考虑到个别金属调控蛋白由多于600个氨基酸构成,并且免疫应答识别范围为5-20个氨基酸的表位,清楚地说明这些蛋白质为优异的靶抗原。因此,可以预期使用金属调控蛋白制备的疫苗提供针对造成人和动物群体的广谱的疾病病状的多种革兰氏阴性致病菌的广泛保护性疫苗。
实施例10
小鼠中肺炎克雷伯氏菌1571的连续传代以增强毒力
为了增强毒力,将肺炎克雷伯氏菌1571在新宿主物种小鼠中连续传代。简而言之,使用如上文实施例1中所述的培养物,将两只小鼠皮下注射0.1或0.2ml在1.0×109CFU/ml下的分离株。接种之后24小时,小鼠患病但未死亡。通过颈椎脱位将小鼠安乐死,并且将每个肝用火焰灭菌的环培养并铺板到血琼脂上。在37℃下将板孵育24小时。0.2剂量的许多菌落已生长在血琼脂板上,指示分离株已遍布全身。将这些菌落划线以实现分离,并且使用相同方案再次通过小鼠传代。最后一次小鼠传代导致所有小鼠在攻击后24小时死亡,清楚地说明分离株通过增强毒力适于生长于新宿主物种中,结果参数为死亡。将分离株从最终肝分离进行继代培养并且扩大成冷冻攻击种子。简而言之,将血板的单一菌落继代培养到含有32gm TSB、5gm酵母提取物和25μg/升2,2-二吡啶的20ml TSB中。使培养物在200rpm下搅拌2小时,此时在预升温至37℃的相同培养基中继代培养。在2小时时间段之后,将10ml培养物转移到如上文所述的100ml预升温的TSB中,除了2,2-二吡啶的浓度为25μg/l。使此培养物生长直到它们达到在540nm下OD 1.0,此时在8000rpm下离心10分钟并且再悬浮于如上文所述的90ml冷TSB中;除了其含有20%甘油。将1ml等分试样细菌悬浮液分配到2ml冷冻小瓶中;标记并且在-90℃下储存直到使用。
实施例11
来源于肺炎克雷伯氏菌1571的免疫组合物的制备
使用如实施例5中所述由肺炎克雷伯氏菌1571制成的蛋白质制备用于向小鼠施用的组合物以确定疫苗对活的毒性同源及异源攻击的功效。将重16-22克、获自HarlanBreeding Laboratories(Indianapolis,IN)的80只雌性CF-1小鼠相等地分成4个组(20只小鼠/组),两个疫苗接种组和2个安慰剂组。将小鼠饲养于聚碳酸酯小鼠笼(AncoreCorporation,Bellmore,NY)中。每个治疗组使用4个笼子(5只小鼠/笼子)以使每个笼子的小鼠数目最小。将组指定为1-4。组1指定为克雷伯氏菌属安慰剂,组2指定为大肠杆菌安慰剂,而组3和4均疫苗接种实施例5的肺炎克雷伯氏菌1571组合物。疫苗组合物含有图4中所说明的蛋白质。
实施例12
小鼠疫苗接种
通过将水性蛋白质悬浮液(1000μg总蛋白质/ml)乳化到商业佐剂EMULSIGEN(MVPLaboratories,Ralston,Nebraska)中以得到22.5%体积/体积佐剂浓度来制备疫苗原液。施用小鼠剂量以得到在0.1ml可注射体积中100μg总蛋白质的最终剂量。通过在上文配制品中用生理盐水代替抗原并且将悬浮液乳化到EMULSIGEN中以得到22.5%佐剂浓度来制备安慰剂。向所有小鼠随意供应食物和水。以21天间隔将小鼠皮下疫苗接种安慰剂和/或肺炎克雷伯氏菌疫苗两次。
实施例13
攻击生物体的制备
将如实施例10中所述的肺炎克雷伯氏菌分离株1571用于同源攻击组1和3,而用大肠杆菌CFT073攻击组2和4中的小鼠(异源攻击)。简而言之,将冷冻原液的攻击分离株划线到血琼脂板上并且在37℃下孵育18小时。将克雷伯氏菌属板或大肠杆菌板的单一菌落继代培养到含有25μg/ml 2,2′-二吡啶的胰蛋白酶大豆肉汤(Difco)的两个50ml瓶中的一个中。将培养物在37℃下孵育6小时,同时在200rpm下旋转,直到达到在540nm下OD为0.95-1.0,此时在4℃下以10,000×g离心10分钟以使细菌成团。通过在4℃下在生理盐水中离心来将细菌团块洗涤两次。将最终团块再悬浮回100ml生理盐水中并且用于攻击。就在攻击之前,将1ml上文细菌悬浮液连续稀释10倍以枚举CFU/小鼠剂量数。
实施例14
攻击
在第二次疫苗接种后28天攻击小鼠。将组1和3中的小鼠腹膜内攻击0.1ml体积的5.7×107CFU肺炎克雷伯氏菌1571,而将组2和4中的小鼠腹膜内攻击0.1ml体积的1.3×107CFU大肠杆菌CFT073。攻击后每天监测小鼠的死亡率持续10天。
当比较组1和3中攻击小鼠(同源攻击)的死亡率时,组3的疫苗接种小鼠显示高度保护(90%存活率),而其安慰剂对照显示仅25%存活。在比较中,疫苗接种克雷伯氏菌属1571组合物并且用大肠杆菌CFT073攻击(异源攻击)的小鼠显示60%存活率的高度保护,而其安慰剂对照在给定疫苗剂量下仅具有30%存活率。预期用较高剂量抗原(例如150ug-200ug)免疫将有较高程度保护。结果清楚地说明,肺炎克雷伯氏菌1571组合物能够针对图6的另一属细菌提供保护。
实施例15
表达克隆的构建和重组金属调控蛋白的纯化
将金属调控蛋白FecA(来自肺炎克雷伯氏菌菌株1571)(SEQ ID NO:41,其中第四个氨基酸为N)以及CirA、FepA和IutA(来自大肠杆菌菌株CFT073)的氨基酸序列(图36-38)提交到GeneArt(Life Technologies,Carlsbad,CA)以实现组装。将GeneOptimizer(LifeTechnologies)软件用于将蛋白质序列转译成DNA从而优化基因合成。将序列克隆到pQE30Xa表达载体(Qiagen,Valencia,CA)中,其增加N端6x组氨酸标签,并且将载体用于转化XL-1蓝色大肠杆菌菌株。将重组金属调控蛋白表达并使用标准方法纯化。使用冷冻细菌原液(100ul)孵育20ml Luria-Bertani肉汤(具有100ug/ml氨苄青霉素以用于质粒维持),并且在37℃下使细菌在振荡孵育器中生长(250rpm)。16个小时之后,将培养物1∶50稀释到具有100ug/ml氨苄青霉素的1L Luria-Bertani肉汤中,生长至光密度(600nm)为0.6,然后用1mM IPTG诱导4小时。通过在4℃下以4,000×g离心20分钟来收获细菌团块,在磷酸盐缓冲盐水中洗涤,然后再悬浮于具有100ug/ml溶菌酶的20mM Tris缓冲液中。然后通过在冰上以50%占空比和5输出进行超声处理(Branson Sonifier,Danbury,CT)持续8分钟将细胞破坏。在4℃下使溶解产物在40,000×g下经历离心10min以去除不溶性物质。通过以下处理可溶性上清液:进行固定金属亲和色谱法(HisTrap FF 5ml,GE Healthcare)以纯化组氨酸标记的重组蛋白,然后进行阴离子交换色谱法以增加纯度并去除内毒素。使用BCA方法(Pierce)估计蛋白质浓度,并且通过SDS-PAGE密度测定法测量蛋白质纯度大于百分之70。针对使用鲎阿米巴样细胞溶解产物的细菌内毒素,使用动态浊度法测试验证内毒素低于40EU/mg蛋白质。这些结果总结在表4中。
表4.重组金属调控蛋白的纯化的结果。
实施例16
小鼠物种模型中评估多种疫苗配制品的疫苗介导的保护
选择小鼠脓毒症模型评估以下疫苗组合物:肺炎克雷伯氏菌牛菌株1571、肺炎克雷伯氏菌人菌株LM21的提取金属调控蛋白(如实施例5中所述制备)和含有四种重组金属调控蛋白FecA、CirA、FepA和IutA的配制品(如实施例15中所述制备)。重16-22克的80只雌性CF-1小鼠购自Charles River Laboratory(Wilmington,MA)并且随机分成6个组(除组1之外每组15只小鼠,组1含有10只小鼠)。将组指定为1-6。组1、2和3指定为对照。组1为空白对照(未疫苗接种/攻击),组2为具有50%不完全弗氏佐剂、10μg CpG和2.5μg单磷酰脂质A(MPLA)的佐剂对照(疫苗接种/攻击),并且组3为具有50%不完全弗氏佐剂的佐剂对照(疫苗接种/攻击)。将组4、5和6疫苗接种其各自的与其适当佐剂对照组相关的疫苗配制品(表5)。将小鼠饲养于聚碳酸酯小鼠笼(Ancore Corporation,Bellmore,NY)中。每个治疗组使用3个笼子(5只小鼠/笼子)以使每个笼子的小鼠数目最小。在首次疫苗接种之前一周使所有小鼠适应。评估个别疫苗配制品的保护免遭小鼠物种模型中使用肺炎克雷伯氏菌1571作为攻击生物体而死亡的能力(实施例10)。
表5.实验设计。
实施例17
疫苗制备和疫苗接种
对于疫苗制备,将磷酸盐缓冲盐水中的来源于克雷伯氏菌属菌株1571和LM21中的每种的100微克蛋白质提取物或20微克每种重组蛋白与其适当测试佐剂一起配制(参见表5)。以14天间隔在肩胛下带中用0.1ml适当疫苗将小鼠皮下免疫三次。在第二次疫苗接种后42天攻击所有小鼠。
实施例18
攻击生物体的制备
由实施例10中所述的冷冻原液制备肺炎克雷伯氏菌1571细菌攻击分离株。简而言之,将冷冻原液的攻击分离株划线到血琼脂板上并且在37℃下孵育18小时。将单一菌落继代培养到含有25μg/ml 2,2′-二吡啶的100ml胰蛋白酶大豆肉汤(Difco)中。将培养物在37℃下孵育6小时,同时在200rpm下旋转,直到达到在540nm下OD为0.95-1.0,此时在4℃下以10,000×g离心10分钟以使细菌成团。通过在4℃下在生理盐水中离心来将细菌团块洗涤一次。将最终团块再悬浮回100ml生理盐水中并且用于攻击。将所有小鼠腹膜内攻击0.1ml体积的8.5×107个菌落形成单位的肺炎克雷伯氏菌1571。就在攻击之前,将1ml上文细菌悬浮液连续稀释10倍以枚举CFU/小鼠剂量数。
实施例19
攻击结果
在空白和安慰剂对照中,百分之八十(80%)组1空白小鼠在攻击之后死亡,相比之下,73%组2小鼠死亡并且80%组3小鼠死亡(表6)。这些结果说明,单独佐剂不能提供针对攻击的保护,说明佐剂没有诱导非特异性免疫。相比之下,使用来源于克雷伯氏菌属1571的疫苗组合物的组4(同源攻击)中仅3只小鼠死亡(80%存活)(表6,图22)。相比之下,使用来源于克雷伯氏菌属1748的疫苗组合物的组5(异源攻击)中仅4只小鼠死亡(74%存活)(表6,图22)。这些结果清楚地说明,由肺炎克雷伯氏菌1571制备的疫苗组合物可以提供针对同源和异源攻击的保护性免疫或针对克雷伯氏菌属的多种菌株的保护。
相比之下,最初通过MALDI鉴别然后克隆、表达并且从大肠杆菌纯化的重组蛋白(包括FecA、CirA、FepA和IutA)的疫苗组合物也诱导高度的针对攻击的保护。百分之五十三(53%)的免疫接种重组蛋白的小鼠(在20μg每种蛋白质的单一剂量下测试)在攻击中存活。预期较高浓度(例如,微克剂量)重组蛋白将产生相较于提取蛋白质组等效的保护。此外,此组合物中内毒素的量小于每剂量100EU。考虑到这一点可以说明,LPS并不基于体抗原的存在而提供保护,因为可能污染疫苗组合物的体抗原来源于大肠杆菌而不是克雷伯氏菌属。基于此信息和攻击菌株的异源性质可以推断,保护程度归因于疫苗组合物中的重组蛋白。
表6:雷伯氏菌属1571攻击之后的总死亡率和存活率百分比
实施例20
霍斯坦小母牛中来源于肺炎克雷伯氏菌1571的金属调控蛋白抵抗乳
房内攻击的功效
乳腺炎为乳腺和乳房组织的炎症,并且是乳牛的主要特有疾病。其通常作为对多种细菌种诸如克雷伯氏菌属的细菌侵入乳头管的免疫应答而发生。在此实验研究中,使用亚单位疫苗包括来源于肺炎克雷伯氏菌1571的金属调控蛋白评估针对霍斯坦小母牛中活乳房间攻击的功效。用于在此实验研究的疫苗接种与非疫苗接种安慰剂对照之间建立疫苗功效的研究参数为1)乳房间攻击之后的定量清除,2)体细胞计数,3)对疫苗接种的血清学应答,4)乳汁量,5)直肠温度和6)攻击后的乳房炎症。
实施例21
疫苗制备
如实施例5中所述的由肺炎克雷伯氏菌1571制成的疫苗组合物包括如通过SDS-PAGE所确定分子量为87kDa、82kDa、78kDa、72kDa、68kDa、35kDa和33kDa的多肽。通过以下将来源于菌株1571的免疫组合物用于制备实验疫苗,使用IKA Process Pilot 2000/4-DR(IKA,Cincinnati,Ohio)将提取蛋白质悬浮液(每毫升600μg总蛋白质)乳化到商业佐剂(EMULSIGEN,MVP Laboratories,Ralston Nebr.)中以得到佐剂浓度为22.5%体积/体积的在2.0ml可注射体积中1,200μg总蛋白质的最终剂量。通过用生理盐水代替上文方案中的水性蛋白质悬浮液来制备安慰剂疫苗。
实施例22
实验设计和牛群疫苗接种
将8只霍斯坦小母牛在生产前大约60天随机分派到两个组,每个组由4只小母牛组成。通过耳标鉴别小母牛并使其与大型商业牛奶厂的大约500只奶牛共同混合。组1中的小母牛用作安慰剂对照,而组2中的小母牛疫苗接种实施例21的肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组合物。以21天间隔将小母牛在右上肩皮下疫苗接种2ml安慰剂和/或肺炎克雷伯氏菌1571疫苗两次。将小母牛每天喂食适于其生产阶段的全混合日粮两次。在研究期间使所有小母牛随意饮水。
在第一次疫苗接种、第二次疫苗接种和第二次疫苗接种之后两周再次采血。将所有血液收集于无菌13×75毫米(mm)真空收集管(品牌SST号369783)(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)中。凝结之后,将血液管在800×g下离心30分钟并在-80℃下冷冻直到分析。在生产后大约三十天,将小母牛运输到单独的设施以用于乳房内攻击。
实施例23
肺炎克雷伯氏菌1571的萘啶酮酸耐性的选择
将实施例1的肺炎克雷伯氏菌1571制成萘啶酮酸耐性。在攻击菌株中诱导对已知抗生素的耐性有助于区分攻击菌株与其他克雷伯氏菌属菌株,其他克雷伯氏菌属菌株由于其在环境中的盛行可能污染攻击样本。为了诱导抗生素耐性,将克雷伯氏菌属1571菌株在增加浓度的萘啶酮酸中生长。简而言之,制备含有35gm胰蛋白酶大豆、5gm酵母提取物和25μg2,2-二吡啶基的两个1.0升TSB原液溶液并压煮30分钟,然后冷却至4℃。通过穿过0.2u过滤器的膜过滤将萘啶酮酸加入到其中一个1升TSB原液溶液中至最终浓度为150μg/ml。将现在含有150μg萘啶酮酸的TSB使用不具有萘啶酮酸的TSB作为稀释液稀释于20ml原液(50ml圆锥管)溶液中以获得以下浓度:0(无萘啶酮酸)、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml和非稀释150μg。
将实施例1的克雷伯氏菌属1571分离株从冷冻储存取出,铺板到血琼脂中并且在37℃下孵育24小时,此时挑出单一菌落并且无菌地接种到其中一个非萘啶酮酸TSB管中并在37℃下在200rpm搅拌的同时孵育3小时。接种后三小时,将2ml培养物转移到预升温至37℃的20ml 25μg萘啶酮酸管中。使培养物在37℃下在200rpm下快速搅拌3小时的同时生长。将整个过程重复两次,然后转移到下一浓度萘啶酮酸。如果不发生生长,那么在先前浓度中重复过程,然后转移到下一增加浓度。对每个浓度进行指导在最高浓度萘啶酮酸下建立生长。一旦在150μg/ml水平下建立生长,则将培养物铺板到含有150μg/ml萘啶酮酸的EMB上。选择分离株的单一菌落并转移到含有150μg/ml萘啶酮酸的100ml TSB中(如上文所述的培养基)。使培养物在37℃下生长4.5或直到实现在540nm下OD为1.0。然后将培养物在8000rpm下离心20分钟,此时将上清液舍弃,并将团块再悬浮于如上文所述但含有20%甘油和25μg/ml 2,2-二吡啶的90ml TSB培养基中。将1ml等分试样细菌悬浮液分配到2ml冷冻小瓶中并且在-90℃下储存直到使用。
实施例24
以肺炎克雷伯氏菌1571的乳房内攻击
在攻击之前,收集每只小母牛的所有四份乳汁样本并且进行细菌学分析以确定没有一份被感染。在攻击当天,将实施例23的冷冻原液的萘啶酮酸耐性克雷伯氏菌属1571菌株稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.2中至先前确定的水平以得到在1.0ml体积中100个菌落形成单位(CFU)的攻击剂量。使用乳头插管,通过每个乳房的乳头管一式四份地攻击所有小母牛。然后用手将攻击剂量挤入乳头并且进入乳房中。在每次挤奶时监测小母牛的直肠温度、乳汁量和乳房炎症的差异。此外,从攻击量的每只小母牛收集乳汁样本以用于确定体细胞计数并枚举攻击生物体。攻击后每天给小母牛挤奶两次持续7天,此时终止研究。
结果
对疫苗接种的血清学应答
通过ELISA监测对疫苗的血清学应答。使用肺炎克雷伯氏菌1571抗原作为捕获分子单独地实验每个血清样本。简而言之,将96孔板涂布有来自已用肺炎克雷伯氏菌1571抗原超免疫的火鸡的火鸡血清1∶1,000稀释液。涂布之后,将板用PVA/PBS阻断,并且将克雷伯氏菌属1571抗原的抗原加入到孔中并孵育。然后将抗原去除、铺板、洗涤并且将待估计的牛血清1∶1,000稀释液一式两份地加入到板中。将血清去除并且洗涤板。将绵羊抗牛缀合物以1∶20,000稀释液加入到板中并且孵育。将缀合物从板去除。洗涤板,并且加入底物以用于彩色显影,其随后用分光光度计读取。对于S/P计算,从所有OD值减去阴性对照血清的平均信号。对于评估的样本,将样本的平均OD除以平均阳性对照样本OD。
图23显示疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组合物的小母牛的血清学应答。疫苗接种过的所有小母牛显示与安慰剂对照形成对比,在首次疫苗接种之后21天的抗体应答。在这之后是在第二次疫苗接种之后21天抗体增加的回忆应答。
乳品业中由肺炎克雷伯氏菌引起的乳腺炎常常导致常表现为乳汁异常的乳汁品质损失。例如,具有乳腺炎的奶牛可能常常具有包括薄片、小块、大凝块或具有粘性水样稠度的乳汁。这些特征指示临床乳腺炎。图24显示在16天的时期内每只小母牛的乳汁评分。评分1为正常,2是指存在薄片,3指示存在小块,4是指存在大块或凝块,并且5是指粘性或水样稠度。结果说明,用肺炎克雷伯氏菌1571组合物疫苗接种改善乳汁品质的总体定量量度。疫苗接种统计学上改善优于非疫苗接种对照的乳汁品质(p=0.042)。这与乳腺炎的减少直接相关,因为所有四个非疫苗接种对照在攻击之后均发展临床乳腺炎,而仅两只疫苗接种小母牛满足乳腺炎的定义。在疫苗接种对对照中乳腺炎的存在显著减少(p=0.046)。
在生产后30天,用100CFU肺炎克雷伯氏菌1571通过乳头乳房内攻击小母牛。攻击后每天给小母牛挤奶两次持续连续的7天。收集攻击份的乳汁样本并且在-90℃下冷冻直到枚举。图25显示针对攻击前2次取样和攻击后14次连续取样(即,对于连续的7天每天两次取样),疫苗接种与安慰剂对照之间乳汁样品中攻击生物体的盛行的差异。相较于对照,来源于疫苗接种的小母牛的感染乳房的乳汁中得到的克雷伯氏菌属的量显著减少。跨研究期取平均,疫苗接种的小母牛在56个取样的样本中仅有15个阳性克雷伯氏菌属乳汁样本或为27%。相比之下,安慰剂对照中阳性克雷伯氏菌属乳汁样本数为64%或56个取样的样本中有36个阳性样本。
实施例25
来源于慢性感染的乳牛群中肺炎克雷伯氏菌的疫苗组合物的评估
选择具有由肺炎克雷伯氏菌引起的慢性乳腺炎病史的商业乳牛群以用于评估如实施例5中所述的疫苗组合物。建立此实验研究的疫苗功效的标准是基于以下的以95%置信区间的估计预防分数:1)在克雷伯氏菌属疫苗接种相较于安慰剂对照中由肺炎克雷伯氏菌引起的临床乳腺炎的盛行和发生率减小,2)在克雷伯氏菌属疫苗接种相较于安慰剂对照中大肠杆菌性乳腺炎的盛行和发生率减小,3)在克雷伯氏菌属疫苗接种相较于安慰剂对照中体细胞计数改善(即,减小)以及4)在克雷伯氏菌属疫苗接种相较于安慰剂对照中乳汁产量改善(即,增加)。
实施例26
疫苗制备
如实施例5中所述的由肺炎克雷伯氏菌1571制成的疫苗组合物包括如通过SDS-PAGE所确定分子量为87kDa、82kDa、78kDa、72kDa、68kDa、35kDa和33kDa的多肽。通过以下将来源于菌株1571的免疫组合物用于制备实验疫苗,使用IKA Process Pilot 2000/4-DR(IKA,Cincinnati,Ohio)将提取蛋白质悬浮液(每毫升600μg总蛋白质)乳化到商业佐剂(EMULSIGEN,MVP Laboratories,Ralston Nebr.)中以得到佐剂浓度为22.5%体积/体积的在2.0 ml可注射体积中1,200μg总蛋白质的最终剂量。通过用生理盐水代替上文方案中的水性蛋白质悬浮液来制备安慰剂疫苗。
实施例27
实验设计和牛群疫苗接种
呈确定的、随机化的、盲法的并且安慰剂对照的控制肺炎克雷伯氏菌的功效研究进行研究。将总计569头霍斯坦或娟珊牛和小母牛招募于研究中。将母牛饲养于单一散养牛舍中,它们在不泌乳期时除外。在不泌乳期期间,将它们移动到指定不泌乳奶牛牛舍。小母牛在小母牛牛舍中直到接近生产,此时将它们移动到散养牛舍中加入挤奶牛群。将奶牛随机接收肺炎克雷伯氏菌1571疫苗或仅含有佐剂的安慰剂疫苗。在招募当天,将奶牛和小母牛皮下注射2ml,3周后施用第二剂量。除了接近不泌乳的奶牛和接近生产的奶牛之外,进行全牛群疫苗接种方法以开始研究,3周后进行加强剂量。设置不泌乳奶牛方案,一旦所有奶牛和小母牛达到产后217天(DCC),便对其免疫接种2剂量疫苗,间隔3-4周。实验设计总结于表7中。.
表7:研究中动物概要
表格显示治疗组每个月招募和去除的动物数。A和B排显示每个月疫苗接种的原始奶牛和招募的另外奶牛/小母牛。C和D排显示每个月死亡或淘汰的奶牛数。E和F排显示每个月研究中动物总数(即,先前月的动物数减去每个月去除的动物数加每个月招募的新动物数)。
结果
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量每只奶牛对疫苗接种的血清学应答。从每个组中随机选择20只奶牛以评定相较于安慰剂对照疫苗接种后对肺炎克雷伯氏菌1571组合物的血清学应答。使奶牛出血并且在第一次疫苗接种时、第二次疫苗接种时和第二次疫苗接种后两周收获它们的血清。将血清冷冻并且储存直到通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析。
将九十六(96)孔聚苯乙烯板涂布作为靶抗原的肺炎克雷伯氏菌1571多肽。如通过SDS-PAGE所确定多肽的分子量为87kDa、82kDa、78kDa、72kDa、68kDa、35kDa和33kDa的多肽。将每个血清样本从1∶400至1∶409,600稀释4倍并且一式两份地测试。每个测试板含有两个孔的已知阳性对照血清(实施例7的超免疫血清)的目标稀释液(1∶400)。这些阳性对照孔用于以下目的:1)内板对照以确保有效的测试以及2)计算血清效价的方式。效价定义为样品稀释曲线截取板上阳性对照孔的50%平均OD值的点。使用计算机软件确定截距点以得到并报告板上测试的每个血清样本的计算效价值。
抗疫苗多肽的抗体在一次剂量疫苗之后在肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种中为可检测的并且在第二次剂量之后显著增加(图26)。值得注意的是,此乳牛慢性地感染肺炎克雷伯氏菌,从而通过自然暴露导致连续的死亡率。但是,这种暴露不诱导对金属调控蛋白的免疫,即使这些蛋白质在自然野生条件下并且在感染期间已在细菌表面表达亦如此。直到将奶牛免疫接种所制备的金属调控蛋白的疫苗组合物,才产生适应性免疫应答,产生靶免疫原。这可在图26中看到,其中非免疫接种动物显示即使它们连续暴露于肺炎克雷伯氏菌也没有抗体应答,而已免疫接种或准备识别疫苗组合物中靶免疫原的动物则相反。
通过蛋白质印迹分析实施例25的血清以确定疫苗配制品的蛋白质被识别。使用WES毛细管电泳系统(Protein Simple,San Jose,CA)进行蛋白质印迹分析。免疫接种纯化多肽的奶牛的血清与疫苗组合物中的金属调控蛋白反应,而免疫接种安慰剂的奶牛的血清不反应。此外,免疫接种纯化多肽的奶牛与重组蛋白质FecA反应,但安慰剂免疫接种奶牛的血清不反应(图27)。这些数据说明疫苗含有金属调控蛋白FecA。而且,这些数据说明自然感染肺炎克雷伯氏菌无法诱导强的对这些蛋白质的应答。
每天给实施例27的奶牛挤奶三次并且监测乳腺炎的临床征象,诸如乳房肿胀、乳汁颜色变化、薄片状或乳汁成块等。此外,牧场管理者向牧工提供乳汁产量与正常水平相比下降的奶牛的每日清单作为检查乳腺炎的额外警示。如果怀疑奶牛患有乳腺炎,根据美国乳腺炎委员会(National Mastitis Council)推荐的实践收集两份但独立的乳汁样本,以防第一份样本被污染(分离>2个生物体),可以测试第二份样本。
将乳汁样本提交到兽医诊断实验室以确定乳腺炎事件的致病物。通过将10μl铺板于血液和MacConkey琼脂板上来完成好氧培养,以确定乳腺炎致病菌的存在并鉴别,包括克雷伯氏菌属和其他大肠杆菌类包括大肠杆菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和沙雷氏菌属。由国家诊断实验室对所有分离株通过MALDI-TOF证明细菌鉴别来执行细菌鉴别程序。第二次疫苗接种后2周或更长时间发生的乳腺炎事件被视为此研究的合格事件。
针对此研究,在乳汁中,1-90天,奶牛中有53例临床乳腺炎,其被证实是由于大肠杆菌类,且有20例为克雷伯氏菌属乳腺炎。此发生率足以判断疫苗功效。
在乳汁中,在第一个90天期间,有46只患有大肠杆菌性乳腺炎的奶牛。通过临床感染的奶牛的培养物鉴别的大肠杆菌类包括大肠杆菌、克雷伯氏菌属、肠杆菌、沙雷氏菌和柠檬酸杆菌。这些奶牛中有三十(30)只在安慰剂组(225只)中,并且16只奶牛在肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组(225只)中。在疫苗接种奶牛中大肠杆菌性乳腺炎的盛行减小47%为统计学显著的(p=0.0305)(图28)。
在乳汁中,在1-90天,奶牛中有单独的53例大肠杆菌性乳腺炎。这些事件中的三十六(36)例来自安慰剂组的奶牛,并且17例来自肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组中的奶牛。在疫苗接种奶牛中临床乳腺炎的发生率减小55%为高度统计学显著的(p=0.0057)(图29)。
在正确的疫苗保护的情况下,可以期待乳牛场有高比例的不具有大肠杆菌性乳腺炎的奶牛。图30显示随时间推移不具有大肠杆菌性乳腺炎的奶牛的比例并且说明安慰剂组中的奶牛以比肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组中的奶牛快的速率下降(即,具有大肠杆菌性乳腺炎的奶牛多)(p=0.02278)。
引起大肠杆菌性乳腺炎的最普遍生物体为克雷伯氏菌属之后为大肠杆菌。意外地发现,在奶牛每次哺乳期时疫苗接种4次可商购获得的J5疫苗的牛群中这种大肠杆菌性乳腺炎多。将牛安置在干燥粪肥固体上可以部分解释这种高发生率。但是,即使是面对高攻击,疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗的奶牛也具有对比疫苗接种安慰剂的奶牛显著的保护(图28和29)。
乳品业中乳腺炎的另一主要问题为复发性感染。尽管单次乳腺炎事件的实际成本随牛和乳汁价格而变化,但是治疗成本、替换成本和可销售乳汁减少的经济损失是破坏性的。1991年进行的一项研究分为一次乳腺炎事件的成本为$107/牛(Hoblet等,1991,J.AmVet Med.Assoc.,199:190-196)。当单一奶牛有复发性感染时,这些成本当然被放大。在此研究中,相比于肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组中,复发性感染在安慰剂组中更常发生,其可见于表8。注意为何安慰剂组中有9只奶牛患有复发性乳腺炎时间,其中5只奶牛患有3或4次复发性感染。相比之下,疫苗接种组中仅4只奶牛在监测期间患有一次乳腺炎复发。
表8:乳汁中在第一个90天期间具有大肠杆菌性乳腺炎的奶牛数,所述奶牛数在奶牛其余哺乳期期间后续的大肠杆菌性乳腺炎病例的情况下重复。
克雷伯氏菌属乳腺炎为此牛群中最大的大肠杆菌性问题。在乳汁中,在第一个90天期间,有18只患有克雷伯氏菌属乳腺炎的奶牛。这些奶牛中有十四(14)只在安慰剂组(225只)中,并且4只奶牛在肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组(225只)中(图31)。在疫苗接种组中克雷伯氏菌属乳腺炎的盛行减小71%为高度统计学显著的(p=0.0171)。如先前所提及,ISU Dairy的经验为60-80%具有克雷伯氏菌属乳腺炎的奶牛在哺乳期内离开牛群。在肺炎克雷伯氏菌1571疫苗中仅4只奶牛诊断有临床克雷伯氏菌属乳腺炎对比安慰剂组中有14只奶牛,相比于疫苗接种组,安慰剂组中在哺乳期结束之前将有预测再6-8只奶牛淘汰或死亡。疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗降低乳腺炎事件的成本,包括减少淘汰。
在正确的疫苗保护的情况下,可以期待乳牛场有高比例的不具有克雷伯氏菌属乳腺炎的奶牛。图33显示随时间推移不具有克雷伯氏菌属乳腺炎的奶牛的比例并且说明安慰剂组中的奶牛以比肺炎克雷伯氏菌1571疫苗组中的奶牛快的速率下降(即,具有克雷伯氏菌属乳腺炎的奶牛多)(p=0.0215)。
在乳汁中,在1-90天,奶牛中有单独的20例克雷伯氏菌属乳腺炎。这些事件中有十六(16)例为安慰剂组的奶牛,其中在此短的观察期中有2只奶牛复发克雷伯氏菌属乳腺炎。在肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种组的奶牛中仅观察到4例克雷伯氏菌属乳腺炎,并且在观察期中这些动物中没有动物复发(图32)。在疫苗接种奶牛中克雷伯氏菌属乳腺炎的发生率减小75%为高度统计学显著的(p=0.0056)。.
在整个研究中一天给奶牛挤奶三次,并且经由软件在牛奶场电子地记录产生的牛奶的磅数。通过乳牛改良协会(Dairy Herd Improvement Association,DHIA)大约每月测试奶牛,并且在Dairy Comp软件中确定并记录每只奶牛乳汁中的体细胞计数。
奶牛所产生的奶量可用于总体健康的指标。乳品业中熟知临床乳腺炎减少受影响的奶牛的乳汁产量(等,2004,J.Dairy Sci.,87:3358-3374;Pinzon-Sanchez等,2011,J.Dairy Sci.,94:1873-1892)。在本研究中,肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种的奶牛在第一个90DIM期间比安慰剂奶牛每天多平均2.0磅乳汁。在预期奶牛为哺乳高峰期的期间,在90天期内,这总计为每只奶牛预测180磅额外乳汁。通常,在乳品业中,典型的305天哺乳期中,在产乳高峰期时每磅乳汁增加产生另外的200-250磅乳汁。因此,在产乳高峰期时疫苗接种奶牛中增加2磅的情况下,预测在典型的305天哺乳期中产生另外400-500磅牛奶。此研究中在多达90DIM下每只奶牛产生的乳汁的平均磅数的图显示于图34。
肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种的奶牛的乳汁产量的统计学显著的增加(P=0.0000)难以仅基于两个组之间的临床乳腺炎的差异进行解释。按月计的乳汁产量差异的更详细分析(图35)显示夏天月份中差异最大。有趣的是,夏天条件为大肠杆菌类在粪肥中存活提供理想的条件并且与大肠杆菌性感染增加相关联。
体细胞计数(SCC)例行地用于监测乳汁品质并且在临床乳腺炎期间通常增加。除本研究中分析的临床乳腺炎之外,SCC还是亚临床乳腺炎的良好指标。如乳汁结果中所提及,意外的是从单独临床乳腺炎看到乳汁产量的此类大幅增加。因此,将SCC用作研究动物中乳房健康的独立指标。在本研究中,肺炎克雷伯氏菌1571疫苗接种的奶牛的体细胞计数比安慰剂奶牛低。数据可以明确地并且以数字方式分析。在类别上,乳品业使用>200,000个细胞/ml的阈值作为乳腺炎的指示,即使是亚临床的情况下也是如此。疫苗接种安慰剂的奶牛的乳汁现高于200,000SCC/ml 25.4%,而疫苗接种肺炎克雷伯氏菌1571疫苗的奶牛的乳汁现高于此水平仅11.7%。在炎克雷伯氏菌1571疫苗组中亚临床显著SCC的盛行减小54%为高度统计学显著的(P=0.0000)。组之间SCC的定量比较显示在疫苗接种组中SCC总体减少42%,这也是高度显著的(P=0.0000;Appendix C)。在疫苗接种奶牛中SCC减少与临床乳腺炎降低一致,并且有助于解释乳汁产量增加可能不仅归因于临床大肠杆菌性乳腺炎,还归因于亚临床大肠杆菌性乳腺炎。
在此援引的全部专利、专利申请和出版物以及以电子方式可获得的材料(包括例如核苷酸序列提交,例如GenBank和RefSeq;和氨基酸序列提交,例如SwissProt、PIR、PRF、PDB;以及来自GenBank和RefSeq中注释的编码区的翻译)的完整公开内容以引用的方式整体并入。在出版物中参考的补充材料(诸如补充表格、补充附图、补充材料和方法和/或补充实验数据)同样以引用的方式整体并入。如果本申请的公开内容与以引用的方式并入本文的任何文件的公开内容之间存在任何不一致,则将以本申请的公开内容为准。前面的详述和实施例仅仅为了理解清楚而给出。不应从其中理解不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节,因为对本领域技术人员显而易见的变化将包括在由权利要求书所限定的本发明内。
除非另外指明,本说明书和权利要求书中所用的表达组分、分子量等的量的全部数字应当理解为在全部情况下受术语“约”修饰。因此,除非另有相反的指示,否则本说明书和权利要求书中所阐述的数值参数是近似值,其可根据由本发明寻求获得的所需性质而变化。在最低限度并且不试图限制权利要求书范围的等价范围的原则,每个数值参数均应至少根据报道的有效数字的数值并且通过应用普通四舍五入法来解释。
尽管阐述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值,但在具体实例中所阐述的数值尽可能精确地加以报告。然而,所有数值固有地含有必然地由它们相应的测试测量中出现的标准偏差所产生的范围。
全部标题旨在方便读者并且不应当用来限制该标题后续文本的意思,除非如此说明。
Claims (44)
1.一种组合物,其包含:
分子量为82kDa、78kDa、72kDa或68kDa的至少两种分离蛋白,其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来确定,其中所述蛋白质当在包含铁螯合剂的培养基中孵育时可从肺炎克雷伯氏菌分离并且当在不具有铁螯合剂的培养基中生长时不可分离,且其中所述组合物保护动物不受肺炎克雷伯氏菌感染;以及
药学上可接受的载剂。
2.如权利要求1所述的组合物,其还包含分子量为35kDa和33kDa的一种或两种蛋白质,其中分子量通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来确定。
3.如权利要求1所述的组合物,其中所述动物选自小鼠、牛诸如奶牛、和人。
4.如权利要求1所述的组合物,其中所述蛋白质中的至少一种包含结构上类似于SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44或与其具有100%同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的组合物,其还包含有包含结构上类似于SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:61或SEQ ID NO:64或与其具有100%同一性的氨基酸序列的蛋白质。
6.如权利要求1所述的组合物,其中所述组合物还包含87kDa蛋白质,所述蛋白质当在包含铁螯合剂的培养基中孵育时可从肺炎克雷伯氏菌分离。
7.一种组合物,其包含:
至少两种分离蛋白,所述蛋白质结构上类似于选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43和SEQ ID NO:44的蛋白质或与其具有100%同一性;以及
药学上可接受的载剂。
8.如权利要求7所述的组合物,其还包含有包含结构上类似于SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:61或SEQ ID NO:64或与其具有100%同一性的氨基酸序列的蛋白质。
9.一种组合物,其包含:
至少两种蛋白质,所述蛋白质结构上类似于选自SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:61和SEQ ID NO:64的蛋白质或与其具有100%同一性;以及
药学上可接受的载剂。
10.如权利要求9所述的组合物,其还包含有包含结构上类似于SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:61或SEQ ID NO:64或与其具有100%同一性的氨基酸序列的蛋白质。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物,其还包含佐剂。
12.一种方法,其包括:
向受试者施用一定量如权利要求1至11中任一项所述的组合物,所述量足以诱导所述受试者产生特异性地结合所述组合物的至少一种蛋白质的抗体。
13.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
向患有由革兰氏阴性微生物引起的感染或处于患有所述感染的风险的受试者施用有效量如权利要求1至11中任一项所述的组合物。
14.一种用于治疗受试者的症状的方法,所述方法包括:
向患有由革兰氏阴性微生物引起的感染或处于患有所述感染的风险的受试者施用有效量如权利要求1至11中任一项所述的组合物。
15.一种用于减少受试者中的定殖的方法,所述方法包括:
向由革兰氏阴性微生物定殖的受试者施用有效量如权利要求1至11中任一项所述的组合物。
16.如权利要求12至15中任一项所述的方法,其中所述革兰氏阴性微生物选自克雷伯氏菌属、大肠杆菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、柠檬酸杆菌属或其组合。
17.一种用于治疗受试者的病状的方法,所述方法包括:
向有需要的受试者施用有效量如权利要求1至11中任一项所述的组合物。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述受试者患有由克雷伯氏菌属引起的感染或处于患有所述感染的风险。
19.如权利要求17所述的方法,其中所述病状由以下引起:克雷伯氏菌属、大肠杆菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、柠檬酸杆菌属或其组合。
20.如权利要求17所述的方法,其中所述病状包括乳腺炎。
21.如权利要求17所述的方法,其中所述病状包括受试者乳汁中体细胞计数高。
22.如权利要求17所述的方法,其中所述病状包括乳汁产量低。
23.一种用于治疗受试者的感染的方法,所述方法包括:
向患有由革兰氏阴性微生物引起的感染或处于患有所述感染的受试者施用有效量组合物,其中所述组合物包含特异性地结合如权利要求1至11中任一项所述的组合物的蛋白质的抗体。
24.一种用于治疗受试者的症状的方法,其包括:
向患有由革兰氏阴性微生物引起的感染或处于患有所述感染的受试者施用有效量组合物,其中所述组合物包含特异性地结合如权利要求1至11中任一项所述的组合物的蛋白质的抗体。
25.一种用于减少受试者中的定殖的方法,所述方法包括:
向由革兰氏阴性微生物定殖的受试者施用有效量组合物,其中所述组合物包含特异性地结合如权利要求1至11中任一项所述的组合物的蛋白质的抗体。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法,其中所述革兰氏阴性微生物选自肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、柠檬酸杆菌属或其组合。
27.一种用于治疗受试者的病状的方法,所述方法包括:
向有需要的受试者施用有效量组合物,其中所述组合物包含特异性地结合如权利要求1至11中任一项所述的组合物的蛋白质的抗体。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述受试者患有由克雷伯氏菌属引起的感染或处于患有所述感染的风险。
29.如权利要求27所述的方法,其中所述病状由以下引起:肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、大肠杆菌、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、柠檬酸杆菌属或其组合。
30.如权利要求27所述的方法,其中所述病状包括乳腺炎。
31.如权利要求27所述的方法,其中所述病状包括受试者乳汁中体细胞计数高。
32.如权利要求27所述的方法,其中所述病状包括乳汁产量低。
33.如权利要求12至32中任一项所述的方法,其中所述受试者为哺乳动物。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述哺乳动物为人或牛。
35.如权利要求12至32中任一项所述的方法,其中所述克雷伯氏菌属为肺炎克雷伯氏菌或产酸克雷伯氏菌。
36.如权利要求12至32中任一项所述的方法,其中施用至少700微克(μg)并且不大于1,200μg蛋白质。
37.一种用于检测特异性地结合蛋白质的抗体的试剂盒,其在单独的容器中包括:
如权利要求1至11中任一项所述的组合物的分离蛋白;以及
检测特异性地结合所述蛋白质的抗体的试剂。
38.一种用于检测蛋白质的试剂盒,其在单独的容器中包括:
特异性地结合如权利要求1至11中任一项所述的组合物的分离蛋白的抗体;以及
特异性地结合所述蛋白质的第二试剂。
39.一种组合物,其包含:
特异性地结合如权利要求1至11中任一项所述的蛋白质的分离抗体。
40.一种组合物,其包含:
包含如权利要求1至11中任一项所述的组合物的蛋白质的分离全细胞。
41.一种组合物,其包含:
特异性地结合如权利要求40所述的全细胞的分离抗体。
42.一种用于制备组合物的方法,其包括:
从肺炎克雷伯氏菌分离如权利要求1所述的组合物;以及
用至少一种由第二细胞表达的重组蛋白补充所述组合物。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述第二细胞为大肠杆菌。
44.如权利要求42所述的方法,其中所述至少一种重组蛋白选自包含结构上类似于SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:58、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:64或与其具有100%同一性的氨基酸序列的蛋白质。
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