KR0139950B1 - 무병원성 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

무병원성 미생물 및 이의 용도

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에드워드 알. 픽켄셔
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Abstract

내용 없음

Description

무병원성 미생물 및 이의 용도
본 발명은 무병원성 미생물, 이의 제조방법 및 백신으로의 이의 용도에 관한 것이다.
감염 질환에 대하여 이전에 사용되온 백신은 통상적으로 (I) 본래의 항원, 이의 단편, 또는 자연발생의 항원 또는 에피토프(epitopes)의 합성 유사체를 포함한, 병인체로부터 정제되는 특이 성분, (II) 항유전형(antiidiotypic)항체, (III) 완전히 사멸된 병인체, 또는 (IV) 생백신(live vaccine)으로서의 병인체의 무병원성 유도체를 특징으로 한다.
미합중국 특허 제 4,250,262호는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)로 부터의 글루코실트랜스퍼라제 효소의 정제방법 및 충치에 대한 국소 면역화에서 이의 정제된 효소, 타입 1 백신의 이용을 기술하고 있다. 에스. 뮤탄스(S. mutans)의 혈청형 a, c 또는 g에 대하여 세균 배양 방법, 효소 정제방법, 및 타액중의 IgA 항체를 자극시키기 위한 효소의 용도에 대한 상세한 설명이 제시되어 있다. 세균의 정제된 특이적 성분으로부터의 백신의 다른 예가 미합중국 특허 제 4,230,971호 및 제 3,239,749호에 기술되어 있으며, 여기에는 당단백질로 이루어진 나이제리아 고노리어(Neisseria gonnorrhoeae)에 의한 고노코커스(gonococci)의 외피(outer coat) 물질로부터의 감염에 대해 유용한 백신을 기술하고 있다. 당단백질의 주입은 살균성 항체를 자극한다.
치아 부식에 대하여 면역화하기 위하여 구강내 투여를 통한 죽은 에스. 뮤탄스의 용도(참조; 미합중국 특허 제 3,931,398호)는 타입 III 백신의 예이다. 본 발명가는 면역 글로빈 A(IgA) 항체가 생성되는 항체이고 이것이 플라크 형성을 감소시킨다는 것을 인지하였다.
에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 세균중의 선택된 균주를 함유하는 생 세균 백신(타입 IV)이 미합중국 특허 제 3,975,517호에 기술되어 있다. 세균을 암돼지의 유선내에 주입하기 전에 이들을 약화시키거나 부분적으로 불활성화시키기 위하여 희석된 포말린으로 처리한다. 이와같이 수행하여 생성된 항체는 나중에 모유에서 발견되어 새로이 탄생한 돼지를 이. 콜라이(E. coli) 감염에 대해 보호한다. 이. 콜라이를 불활성화하는 포말린 처리는 단지 일시적으로 세균을 약화시키므로 주입전에 세균의 회복을 억제하기 위해 주의를 기해야 한다. 이러한 회복은 보호보다는 오히려 심각한 감염을 초래한다.
균주가 숙주내에서 실질적으로 생존할 수 없도록 하는 돌연변이를 상기 균주내에 도입함으로써 무병원성 균주를 개발 할 수 있었다. 이들 균주는 유전학적으로 약화되었다고 말할 수 있다. 설명을 용이하게 하기 위하여, 유전학적 약화의 원리를 살모넬라 시스템을 참조로하여 설명할 것이나, 이 원리는 하기에 기술하는 바와 같이 널리 적용할 수 있다.
침입성의 살모넬라 티피뮤륨(salmonella typhimurim), 에스. 타이피(S. typhi)및 기타의 살모넬라 종은 경구 섭취후 장-관련 림프 조직(GALT; Peyer's Patches)의 세포에 부착하고, 침입한 후 증식함으로써 심 조직내에 들어간다[참조; Carter and Collins, J. Exp. Med. 139:1189-1203, (1974)]. 항원의 GALT로의 살모넬라-매개된 수송은 일반화된 분비성 면역 반응, 및 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하므로, GALT에 부착하고 침입하는 이들의 능력을 손상함이 없이 질병을 유발시키는 능력을 상실한 무병원성 살모넬라 돌연변이체를, 외인성 항원(예: 콜로니화 또는 병원성 항원)을 GALT에 전달하고, 항원이 유도되는 병원체에 대한 보호적 면역을 유발시키기 위한 유용한 벡터로서 사용할 수 있음직하다. 다른 미생물로부터의 항원을 발현시키는 무병원성 살모넬라 백신 균주의 작제는 통상의 유전자 전이 공정[참조; Formal et al., Infect. Immun. 34:746-750, (1981)] 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 수행하였다. 후자의 경우에서, 무병원성 살모넬라 균주는 통상적으로 살모넬라와 유전정보를 교환하는 유기체[참조; Stevenson and Manning, FEMS Microbial. Lett. 28:317-321 (1985); Clements et al., Infect. Imm. 53:685-692, (1986)], 및 통상의 유전자 전달 수단으로 유전정보를 살모넬라에 전달할 수 없는 미생물[참조: Curtiss, J. Dent, Res 65:1039-1045(1986)]로 부터 발현 유전자를 작제한다. 이러한 이가의 무병원성 살모넬라 균주은 발현된 항원에 대하여 항체 및 한 예에서는 세포성 면역반응[참조; Brown et al., J. Infect. Dis. 155:86-92 (1987)]을 유도하나, 콜로니화 또는 병원성 항원을 갖는 병원체에 대한 보호적 면역의 유도와 관계되는 자료는 아직 불충분하다.
바콘 등[참조; Bacon et al., Brit. J Exp. Pathol. 32:85-96 (1951)]은 첫번째로 에스. 타이피중 영양요구 돌연변이체의 무병원성을 조사하였다. 이들은 퓨린, P-아미노벤조산, 및 아스파테이트에 대한 요구를 갖는 돌연 변이체가 마우스(mouse)에 대하여 감소된 병원성을 갖는다는 것을 주목하였다. 게르마니어 및 퓨린[참조; Germanier 및 Furer, Infect. Immun. 4:663-673, (1971)]은 첫번째로 마우스에서 무병원성 및 면역 유전성에 대하여 에스. 티피 뮤륨의 galE 돌연변이체의 이용을 조사한 후 사람에게 장티프스성 발열에 대한 백신으로 에스. 타이피 galE 돌연변치에 Ty2la의 이용을 제안하였다[참조; J. Infect. Dis 131:553-558(1975)]. 스토커[참조; 미합중국 특허 제 4,550,081호]는 Tn10 및 인접한 DNA 서열의 결실을 유도하는 Tn10을 사용한 트랜스포존(trabsposon) 돌연변이 유발에 이어 푸사르산 내성을 선별하여 재생 불가능한 결실 돌연변이물을 수득하였으며, 이는 바콘 등에 의해 사용된 돌연변이체에서 분명한 문제이다.
스토커는 먼저 폴레이트 생합성에 필요한 P-아미노벤조산 및 엔테로켈린에 대한 전구체인 디하이드록시벤조산을 포함한 방향족 아미노산계의 화합물을 합성할 수 있는 능력이 결합된 aroA 결실(△) 돌연변이체를 분리하고 새로이 △aorA 돌연변이물을 아데닌 생합성을 폐지시킨 결실 돌연변이와 결합하였다. 디아미노피멜산에 대한 요구를 갖게 하는 Tn10-유도되고 푸사르산 내성-발생된 △asd 돌연변이물을, 에스. 티피뮤륨 무병원체가 능력을 손상함이 없이 일반화된 분비성 면역 반응을 유도하도록 하기 위해 사용하였다. 많은 살모넬라가 병원성을 갖는 플라스미드를 지니므로, 플라스미드-치유된 유도체를 조사하여 생백신으로서의 용도를 제안하였다[참조; Nakamura et al., Infect. Immun. 50:586-587 (1985)].
살모넬라 무병원체를 면역유전성을 손상시킴이 없도록 하는 상술된 방법은 각각 장점을 가지나, 각각 문제점을 갖는다. galE 돌연변이체는 갈락토스-민감하나 정상적인 LPS를 생성하기 위해 갈락토의 존재하에 배양시켜야 하는데 이는 비-면역유전적인 갈각토스-내성 변이체를 유도하므로 면역유전성을 유지시키면서 배양하기는 어렵다. △aroA 돌연변이체는 엔테로켈린 및 폴산 모두를 합성하지 못하나, 에스 티피뮤륨 병원성에 대한 엔테로켈린의 필요성은, 이온을 킬레이팅하고 전달하는 에스. 티피뮤륨의 능력을 방해하는 특정한 모든 돌연변이가 변원성에는 별 영향이 없다는 것을 증명하는 벤자민 등[참조; Infect. Immun. 50:392-97, (1985)]의 광범위한 결과에 의하여 이의가 제기되었다. 따라서 △aroA 돌연변이체의 무병원성은 단지 p-아미노벤조산(pABA) 및 결과적으로 폴산을 합성할 능력이 없기 때문임직하다. 바콘 등(상기 참조)은 pABA을 합성할 수 없는 돌연변이체로 감염된 마우스의 음식물에 p-아미노벤조산을 투여하면 병원성이 야생-형의 것 정도로 유도됨을 관찰하였으므로, 무병원성 돌연변이체에서 합성이 차단된 대상물의 식이 소모로 인한 백신 균주에서 무병원성의 표현형 반전으로 관심을 가져야 한다. △asd 돌연변이체 몇몇의 이러한 어려움은 갖지 않으나, 경구 섭취 및 GALT의 침입으로 즉시 죽으므로 단지 일반화된 점액성 면역의 유도에만 효과적이며 체액성 및 세포성 면역 유발에는 효과적이지 못하다.
본 발명은 무병원성을 유도한 결손이, 동물 숙주가 공급할 수 있는 음식물 또는 어떠한 것에 의해서도 복귀될 수 없는 트랜스포존-유발된 돌연변이체를 사용함으로써 선행기술의 백신의 많은 결함 제기한다.
본 발명은 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 실질적으로 생성할 수 없는 병원성(pathogenic) 미생물의 무병원성 유도체를 특징으로하여, 척추동물 또는 무척추동물을 면역화하기 위한 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 척추동물 또는 무척추동물의 병원체로부터의 재조합 유전자를 발현시켜 척추동물 또는 무척추동물의 상기 병원체에 대한 면역 반응은 유발시킬 수 있는 항원은 생성하나 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질은 생성할 수 없는 미생물의 무병원성 유도체를 특징으로하여, 척추동물 또는 무척추동물을 면역화하기 위한 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 생성할 수 없는 병원성 미생물의 무병원성 유도체를 특징으로하여 척추동물 또는 무척추동물을 면역화하기 위한 백신을 척추동물 또는 무척추동물에게 투여하는 단계를 특징으로하여, 척추동물 또는 무척추동물의 면역시스템은 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 척추동물 또는 무척추동물의 병원체로부터의 재조합 유전자를 발현시켜 척추동물 또는 무척추동물의 상기 병원체에 대한 면역 반응은 유발시킬 수 있는 항원은 생성하나 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질은 생성할 수 없는 미생물의 무병원성 유도체를 척추동물 또는 무척추동물에게 투여하는 단계를 특징으로하여, 척추동물 또는 무척추동물의 면역시스템을 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 척추동물 또는 무척추동물 숙주로부터의 제조합 유전자를 발현시켜 척추동물 또는 무척추동물의 면역 반응을 억제, 조절 또는 증대시킬 수 있는 생성물은 생성하나 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질은 생성할 수 없는 병원성 미생물의 무병원성 유도체를 특징으로하여, 척추동물 또는 무척추동물 숙주 단백질을 합성하기 위한 담체 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 척추동물 또는 무척추동물로부터의 재조합 유전자를 발현시켜 척추동물 또는 무척추동물의 면역반응을 억제, 조절, 또는 증대시킬 수 있는 유전자 생성물은 생성하나 작용성 아데닐레이드 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질은 생성할 수 없는 병원성 미생물의 무병원성 유도체를 척추동물내에 도입시킴을 특징으로하여, 척추동물 또는 무척추동물의 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 척추동물의 알레르겐에 대한 척추동물 또는 무척추동물의 민감성을 저하시킬 수 있는 항원을 생성하기 위하여, 척추동물 또는 무척추동물에 대하여 활성인 알레르겐을 생성하는 유기체로 부터의 재조합 유전자는 발현시키나 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질은 생성할 수 없는 병원성 미생물의 무병원성 유도체를 척추동물에 투여하는 단계를 특징으로하여,
알레르겐에 대한 척추동물 또는 무척추동물의 민감성을 저하시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질에 대한 각각의 유전자의 결실 돌연변이를 형성하기 위하여 트랜스포존 돌연변이유발 방법으로 병원성 미생물을 돌연변이시키고 상기 유도체를 분리시킴을 특징으로하여, 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 생성할 수 없는 병원성 미생물의 무병원성 유도체를 생성하는 방법을 제공한다. 동일한 목적을 또한 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질에 대한 유전자에 결실을 초래하여 재조합 DNA 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
제1도는 7.4 × 108cfu의 χ4064 및 4.0 × 108cfu의 χ3456의 경구 접종후 특정한 시간에 피어스 패치(Peyer's patches: 즉, GALT)로부터의 에스. 티피뮤륨 △cya △crp χ4064(○) 및 야생형 χ3456의 복귀를 나타낸다.
수직선은 표준 편차를 나타낸다.
제2도는 7.4 × 108cfu의 χ4064 및 4.0 × 108cfu의 χ3456의 경구 접종후 특정한 시간에 장간막 림프절로 부터의 에스. 티피뮤륨 △cya △crp χ4064(□△)및 야생-형 χ3456(□△)의 복귀를 나타낸다. 수직선은 표준편차를 나타낸다.
제3도는 특정한 에스 티피뮤륨 균주의 플라스미드 함량을 나타낸다. 플라스미드 DNA 빈보임[참조;Birnboim, Methods, Enzmol. 100:243-255, 1983] 방법으로 추출하고 0.5%(wt/vol) 아가로즈겔증에 분해시키고, 에티듐 브로마이드로 염색한다. χ3344 및 χ3337 용해질을 페놀/클로로포름/에테르를 사용하여 추출하고, 밀도구배 원심분리는 수행하지 (Poxvirus), 파보바이러스(Parvovirus), 레오바이러스(Reovirus), 피코나바이러스(Picornavirus), 믹소바이러스(Myxovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 또는 레트로바이러스(Retrovirus)로부터 제조될 수 있다. 병원성진균, 원생동물 및 기생충에 의한 감염에대해 보호하기 위한 백신도 또한 본 발명으로 설명될 수 있다.
추가의 태양에서, 백신의 면역원성 성분이 숙주의 알레르겐일 때 그러한 백신은 특이적으로 알레르겐성 숙주를 없애도록 고안된 노출 섭생에서 사용될 수 있다.
이의 하나의 태양에서, 본 발명은 병원성 미생물의 생 무병원체 유도체를 포함하여 척추동물 또는 무척추동물의 면역화를 위한 백신으로서 기술될 수 있으며, 본 유도체는 유기체의 병원균 또는 상기 동물의 알레르겐을 생성하는 유기체로부터 유도된 재조합 유전자를 발현시킬 수 있는 반면, 기능적 아데닐레이트 사이클라제 및 cAMP 수용기 단백질을 생성할 수 없다.
또다른 태양에서는, 본 발명의 무병원성 미생물은 여러가지 숙주 단백질의 합성을 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 본 발명의 무병원성 미생물은 숙주내로 도입된 후 CALT, 장간막 림프절 및 이자를 포함하여 다양한 면역적격 구조를 방해할 수 있으므로, 그러한 미생물은 다양한 면역조절 생성물을 타겟하는데 사용될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 유전자 암호화 면역조절 단백질 또는 펩타이드는 적합한 면역적격 조직중의 미생물 흡수 부위가 재조합 생성물을 발현시켜 숙주에서 면역 반응을 억제, 증가 또는 증식시킬 수 있다. 면역조절 분자의 예는 다음과 같으나 이들로만 제한되는 것을 아니다: 콜로니 자극 인자(대식세포, 과립구, 또는 혼합된), 대식세포 케모톡신, 대식세포 억제 인자, 백혈구, 블라스토젠성인자, 인터페론 및 인터루킨.
본 발명의 또다른 태양은 여러가지 생리적 작용(예: 성장률, 혈압 등)을 자극 또는 억제할 약리학적으로 활성인 생성물을 이동 및 생성하기 위해 본 명세서에서 기술한 무병원성 미생물의 용도이다.
본 발명의 이러한 태양에서 각 용어는 다음과 같이 설명된다.
백신은 이후의 손상에 대해 보호가 제공될 수 있도록 생유기물의 면역 시스템을 자극시키는데 사용되는 약제이다. 면역화는 유기체내에서 항체의 고농도의 유지를 유도하고/ 또는 세포 면역 반응을 유지하기 위해서, T-림포구가 병원체를 증식시키거나/ 또는 다른 세포(예: 식세포)를 활성화하는 항체의 고농도 유지의 유도 및/ 또는 세포 면역 반응의 과정을 의미하며, 이는 유도체가 먼저 노출된 병원체 또는 항원에 대한 것이다. 면역 시스템이란 용어는 외부 물질, 예를 들어 인터페론 생성의 존재에 대한 단세포 동물의 반응을 포함하나, 본 적용에서 그 용어는 해부학적 특성 및 다세포 동물이 유기체의 세포 또는 유기체의 초-세포액을 공격하는 항원물질에 대한 항체를 생성하는 기전에 제한한다. 그렇게 생성된 항체는 면역글로불빈 A, D , E, D 또는 M과 같은 면역학적 부유의 어떤 것에도 속할 것이다. 본 발명의 백신이 면역 글로불린 A IgA 생성을 자극하는 것으로만 제한되는 것은 아니나, IgA의 생성을 자극시키는 백신은 온혈동물의 분비 시스템에 의해 생성된 주요 면역글로불린이기 때문에 특히 중요하다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 천연 백신은 IgA 형성외에 광범위한 다른 반응, 예를 들면 세포 및 체액 면역성을 생성한다. 항원에 대한 면역 반응은 잘 연구되어 있으며 널리 보고되어 있다. 면역학의 개관이 교재[참조; Barrett, James, T., Textbook of Immunology; 4th Edition, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983)]에 나타나 있으며, 이의 전부분을 참고로 인용한다.
척추동물은 척추동물 아문, 어류, 양서류, 파충류, 조류 및 포유류를 포함하는 척삭동물의 제일 부문, 척추동물 아문의 모든 구성원이며, 이들은 모두 분절 경골 또는 연골성 척주로 특징지워진다. 모든 척추동물은 작용성 면역체계를 가지며 항체를 생성하여 항원에 반응한다. 따라서 모든 척추동물은 백신에 반응할 수 있다. 백신은 사람 또는 개 광견병 백신과 같은 포유류에 가장 일반적이나, 본 명세서에 기술된 특성이라면, 어류 및 조류와 같은 다른 부류의 대량 사육 척추동물에 대한 백신이 본 발명의 영역내에 든다.
무척추동물은 척추동물을 제외한 동물계의 모든 구성원이다. 이러한 동물은 무척추동물 부문으로 구성되며 척추 또는 척주를 가지지 않는다. 본 분류는 어류, 양서류, 파충류, 조류 및 포유류를 제외한 모든 동물을 포함한다. 많은 무척추동물이 항원 자극에 원시 면역 반응을 유도할 수 있으며 척추동물을 감염시키고 본 발명에 따라 본 명세서에 기술된 동일 미생물에 민감성이다. 그러한 무척추동물의 예로는 갑각류 및 연체동물 및 기타 관련 동물이다. 무척추동물의 보호에 있어 백신의 용도는 현재까지는 잘 알려져 있지 않으나, 본 본야의 숙련인들은 그들의 원시 면역 시스템의 이용에 의해 상기 무척추동물에의 본 발명의 적용성을 잘 알 것이다. 본 발명에 따라 예를 들면, 살모넬라종에 의한 감염에의 갑각류의 민감성은 무병원체의 도입을 가능케 할 것이며 이에 따라 반응에 원시 면역 시스템에 대한 포텐셜을 제공한다. 따라서, 항원에 대한 상기 무척추동물에 존재하는 면역체계로부터 반응을 자극하고 척추동물을 감염시킬 수 있는 병원성 미생물의 무병원성 유도체의 이용은 본 발명의 영역내에 든다.
본 발명의 한 태양은, 병원체 또는 알레르겐에 대해 항체 반응을 자극하는데 사용되는 유전자 생성물의 운반체로서 GALT 또는 BALT에 생존하는 병원성 미생물의 무병원성 유도체의 용도이다. 무병원성 균주는 속 또는 종이 병원체로서 좀처럼 작용할 수 없는 미생물을 의미하는 것이 아니라, 사용된 특정 미생물은 처리된 특정 동물에 대해 무병원체를 의미한다. 미생물은 통상 병원성인 하나의 속 또는 종에 속할 수 있으나 무병원체인 균주에 속해야 한다. 병원성이란 질환을 유발하거나 보통의 생리적 기능을 손상시킬 수 있는 것을 의미한다. 무병원성 균주는 발병성 병원체 대응부에 통상적으로 관련된 질병의 증후의 수행을 유도할 수 없는 것이다. 본 명에서에서 이용된 미생물은 박테리아, 원생동물, 및 단세포 진균을 포함한다.
제 1 유기체로부터 통상 제 1 유기체와 유전물질은 교환하지 않는 제 2 유기체로의 유전물질을 수송할 기술은 최근 재조합 DNA 기술의 급격한 발달의 결과로써 매우 유용하게 되었다. 본 적용에서, 제 2 유기체의 생성물이 동일한 유전물질을 함유한 자손이 될 수 있도록 제 1 유기체로부터 제 2 유기체내로 수송된 유전물질을 재조합 유전자로서 언급한다. 유전자란 용어는 여기서 유전의 모든 생물학적 단위를 나타내는 광범위한 의미이다. 재조합 유전자는 어버이 유기체에 존재하는 완전 유전자, 즉 예를 들어 작용 폴리펩타이드와 같이 거대분자의 생성을 조절 또는 형성할 수는 완전 유전자일 필요는 없다. 단지 유전자는 항원 생성물의 생성에 있어 유도체로서 사용되는 주형으로 작용할 수 있는 것이다. 생성물은 어버이 유기체의 정확한 형태로 발견되지 않은 것이다. 예를 들어, 100개 아미노산 잔기를 함유함 폴리펩타이드 항원의 작용 유전자 암호는 부분적으로 단지 75, 10개까지의 아미노산 잔기를 함유한 펩타이드가 숙주 세포의 세포 기전에 의해 형성되도록 운반체 미생물내로 수송한다. 그러나, 이 유전자 생성물이 어버이 유기체에 존재하는 유사한 항원에 대한 항체의 형성을 유발할 것이라면, 유전자는 본 발명에서 정의된 유전자의 범위에 포함될 수 있다. 이와는 달리, 특정 항원 또는 이의 단편의 아미노산 서열이 알려져 있다면, 자동화 유전자 합성기들을 사용해 DNA 단편 또는 이의 유도체를 화학적으로 합성할 수 있으며 상기 DNA 서열을 적합한 발현벡터내로 도입할 수 있다. 스펙트럼의 또 한쪽 말단에서 몇몇 유전자 생성물의 DNA 암호의 장형 부위이고, 이중 하나 또는 모든 것이 항원성이 될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 정의되고 청구된 유전자란 항원을 생성할 수 있는 모든 유전 단위이다. 유전자는 염색체, 플라스미드 또는 바이러스 기원의 것일 수 있다.
유전자가 면역 반응을 유도함에 있어 유효하도록 하기 위해서는, 유전자는 발현되어야 한다. 유전자의 발현이란 유전자 구조(DNA 염기 서열)에 있어 유전정보가 유전자가 위치한 세포의 생화학적 기전에 의해 RNA 분자, 폴리펩타이드 또는 다른 생물학적 분자의 형성에 있어 물질 생성물내로 형질 전환되는 것이다. 이렇게 생성된 생물학적 분자를 소위 유전자 생성물이라 한다. 유전자 생성물이란 용어는 유전자의 조절하에 발생하는 생화학적 반응의 결과로서 형성된 생물학적 산물 또는 생성물 모두를 의미한다. 유전자 생성물은 예를 들어 RNA 분자, 펩타이드, 또는 효소 또는 유전자의 초기 산물, 즉 분해대사 산물인 기타 분자의 제어하에 생성된, 산물일 것이다. 예를 들어, 유전자는 리보좀의 작용으로 번역된 RNA 분자를 유전자가 발견된 원 세포에 대해 환경적 외부에서 글리칸의 형성을 조절하는 효소내로의 합성을 일차로 제어한다. RNA 분자, 효소, 및 글리킨은 본 명세서에서 사용된 용어로서 모든 유전자 생성물이다. 이들중 어떤 것은 물론 당단백질 및 다당류와 같은 많은 기타 유형의 유전자 생성물도 동물의 면역 시스템에 도입되면 항원으로서 작용할 것이다. 당단백질 및 리포단백질을 포함한 단백질 유전자 생성물은 백신의 항원으로 사용하기 위한 바람직한 유전자 생성물이다.
백신이 항체를 생성함에 있어 효과적이기 위해서는, 항원성 물질이 백신처리된 동물의 항체-생성 기전이 실현될 수 있도록 방출되어야 한다. 따라서 유전자 산물의 미생물 운반체가 동물내로 도입되어야 한다. 상기에 언급한 GALT 또는 BALT 세포의 바람직한 반응을 자극하기 위하여는, 정맥주사, 근육주사, 피하주사 또는 유방내 투여 음경내 투여 또는 질내 투여와 같은 투여방법이 가능하지만, 경구 투여, 위 삽입에 의해 또는 분무제 형태로 장 또는 폐로 직접 투여함이 바람직하다.
운반체 미생물로서 무병원성 미생물이 이용된 경우, 일단 운반체 미생물이 동물내에 존재하면, 항원은 동물의 면역 시스템에 유용하게 되는 것이 필요하다. 이는 운반체 미생물이 죽어서 항원 분자가 방출될 때 달성된다. 물론, 용혈시키지 않고 내용물을 방출하는 누출성 무병원성 돌연변이체의 이용도 또한 가능하다. 이와는 달리, 세포의 죽음에 앞서 외부 환경으로 운반 세포에 의해 유용하게 될 항원의 생성을 조절하는 유전자를 선택한다. 이런식으로 백신 접종된 동물, 예를 들어 피어스 패치에 내성인 생존 미생물을 사용하고 계속 항원을 생성시킴으로써 연속적으로 항체 형성을 유도함이 가능하다. 이러한 조건하에 바람직한 유전자 생성물은 세포막을 통해 외부 환경으로 전달되는 생성물 또는 모든 유전자 생성물 또는 부분적 유전자 생성물이 환경에 노출되도록 외부막에 붙거나 삽입되는 생성물이다. 전형적인 후자의 유전자 생성물은 보호가 요구되는 유기체에 대한 유기체의 표면상에서 통상 발견되는 항원이다. 이들 항원이 통상의 방법으로 세포 표면에 운반되면 항원에 대한 항체의 형성은 증진될 것이다.
다른 병원체로부터 GALT 또는 BALT에 항원을 전달하는 병원체의 이용은 이러한 병원체가 피어스 패치 또는 BALT를 침입할 능력을 보유하면서 무병원성이 될 수 있는 것이 아니면 적절하지 못하다.
재조합 유전자가 유도되온 유기체는 백신 접종된 동물의 모든 항원이 될 수 있거나 동물의 알레르겐 또는 다른 항원을 생성하는 유기체일 수 있다. 알레르겐은 알레르기 반응을 유발시키는 물질이며, 이 경우에 동물에서 이들에 대해 백신 접종될 것이다. 상이한 많은 물질들이 동물의 비듬 및 화분과 같은 알레르겐일 수 있으며, 개별적 동물의 알레르기 반응은 모든 특정 알레르겐에 대해 변할 것이다. 통상 알레르기 반응을 나타내는 동물에 있어서 알레르겐에 내성을 유도하는 것이 가능하다. 내성 유도의 방법은 잘 공지되어 있으며 일반적으로 증량된 용량으로 동물에 알레르겐을 투여함을 포함한다. 상세한 내성 유도에 대한 논의가 앞서 언급한 교제(참조; Barrett textbook)에 기술되어 있다. 최근에 숙주 유기체 자체는 면역조절 유전자 또는 다른 약리학적으로 활성인 물질의 유전자가 벡터에 의해 발련될 때 유전 물질의 자원으로서 작용할 것이다.
상기에 기술한 유형의 생백신을 동물에 투여함은 모든 공지된 또는 표준 기술에 의해 할 수 있다. 이는 경구 투여, 위 삽관, 또는 기관지-비강 분무를 포함한다. 이들 방법 모두는 생 백신이 쉽게 GALT 또는 BALT 세포로 도달할 수 있게 하며 항체 형성을 유도하고 투여의 바람직한 방법이다. 다른 투여방법, 즉 운반 미생물을 동물의 혈액에 도달하게 하는 정맥 주사가 가능하다. 정맥 주사, 근육 주사 또는 유방 주사도 또한 하기에 기술되는 바와 같이 본 발명의 다른 태양으로 받아들여질만하다.
바람직한 투여방법이 경구 투여, 연무제 분무 및 위 삽관법이므로, 바람직한 운반 미생물은 백신 접종된 동물의 장 또는 기관지의 모든 림프상피 구조에 분별적으로 이동시키는 모든 종에 속한다. 이들 균주는 장내 병원성 균주의 유전조작에 의해 제조된 장내 병원성 균주의 무병원성 유도체가 되는 것이 바람직하다. 피어스 패치에 운반시키고 따라서 직접적으로 IgA의 생성을 자극시키는 균주가 바람직하다. 동물에서 이들은 살모넬라의 특이 균주 및 피어스 패치로 이동시키는 살모넬라-이. 콜라이 하이브리드를 포함한다.
재조합 DNA 기술은 이제 평범한 것으로 간주될 만큼 충분히 잘 밝혀져 있고 널리 보급되어 있다. 매우 일반적이고 광의의 의미에서, 본 방볍은 어떠한 유기체의 유전물질 또는 더욱 일반적으로 유전물질의 일부분을 전달된 유전물질이 이 물질은 전달받은 제 2 유기체의 제조 유전물질(로 제조합된)의 영구적인 일부분이 되도록 제 2 유기체내로 전달시킴을 포함한다. 이는 먼저 어버이 유기체로부터 플라스미드나 어버이 염색체의 DNA의 작은 조각을 수득하는 것을 포함한다. 플라스미드(또한 염색체의 성분이라 불림)은 세포의 염색체와는 물질적으로 분리되어 있는 것이다. DNA는 어떠한 크기도 가능하며 특이 염기상 부위에서 DNA 분자를 분열시키는 작용을 하는 제한 엔도뉴클레아제 효소의 작용으로 수득된다. 재조합 분자를 형성하기 위한 하기 플라스미드, 파아지 또는 코스미드 벡터에의 연결화에 따라 재조합 분자는 형질전환(칼슘 이온과 같은 다양한 화학제의 존재에 의해 인위적으로 유도될 수 있다)과 같은 여러 방법으로 숙주 세포내로 전달될 수 있다. 형질 도입과 같은 다른 방법도 또한 적합하며, 여기에서 재조합 DNA는 형질도입 파아지 또는 코스미드 벡터와 같은 파아지내에서 패키지된다. 일단 재조합 DNA가 운반 세포내에 존재하면, 이는 분리된 조각(일반적으로 진정 완전한 전달된 플라스미드)으로서 계속 존재할 수 있거나 숙주 세포 염색체내에 삽입할 수 있고 세포 분열시 염색체와 함께 재생된다.
전달 유전 물질이 비교적 간단하거나, 어떠한 전달체가 발현된 유전자인지를 예상하기는 아직 불가능하다. 그러나, 이 선택방법은 본 발명에 어떠한 어려움을 제시하는 것은 아니다. 주 미생물은 전달된 유전자를 발현하여야만 하고 이에 따라 항원을 생성하므로, 샷건(shotgun) 접근 방식이 좋다. 항체가 표준 기술에 의해 목적하는 항원, 예를 들어 병원성 미생물로부터 세포막의 단편에 대해 제일차로 생성된다. 항원의 근원인 유기체로부터의 DNA는 엔도뉴클레아제에 의해 다수의 단편들로 절단되며, 단편들은 무작위로 운반 미생물내로, 바람직하게는 클론화 벡터에 의해 삽입된다. 병원체로부터의 항원을 발현시키는 미생물은 병원성 항원에 대한 항체와의 반응에 의해 쉽게 동정될 수 있다. 항원-발현 미생물은 선택되고 클론화되어 목적하는 재조합 유기체를 제공한다. 샷건 클로닝은 잘 알려져 있고 문헌[참조; Ma'niatis, T., et al., Milecular Clonging Cold Spring Harbor Laboratories (1982)]에 상세히 기술되어 있으며, 본 명세서에서 참고로 인용하는 바이다. 세포 전달의 기술은 본 발명의 일부로 간조될 수 없으며, 무병원성 미생물중에서 발현되는 유기체로부터 유전자를 포함한 재조합 유기물을 생성할 수 있는 어떠한 것도 충분하다.
종들간에 통상 유전 정보를 교환하는 경우에 유전자 전달의 더욱 고전적 방법은 접합, 형질전환 또는 형질도입과 같은 방법으로 수행될 수 있다.
무병원성 미생물 유도체는 또한 본 발명의 영역내에서 주형된다. 유도체라 함은 유성생식 또는 무성생식으로 유도된 자손 또는 천연 발생 병원성 플라스미드와 함께 또는 이의 없이 기능적 아데닐레이트 사이클라제 및 cAMP 수용체 단백질을 생성할 능력이 없는 특성은 보유하는 단일이나 다중 염기 치환, 결실, 삽입 또는 역위를 포함하여 무병원성 균주의 돌연변이 유도체를 의미한다. 예를 들어, X4062 및 X4064와 같은 균주는 경구 접종후 균주에 따르는 편리한 마커로서 본 명세서에서 사용된 날리디스산 내성으로 부여하는 cyrA 돌연변이에 관여한다. 그러나, 약제 내성은 백신으로서 사용된 균주에 대한 목적하는 속성은 아니다. 따라서, gyrA+돌연변이는 gyrA+(날리디스산에 민감성 부여) 유전자를 밀접히 연결된 Tn10의 형질에 대해 선택한 후 푸사르산 내성에 대해 선택하여 균주내로 형질도입하여 쉽게 제거시킨다.
요구되는 용량은 유전자 생성물의 항원성에 따라 변하며 존재하는 백신의 전형적인 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이면 된다. 일상적 실험화로 요구되는 양을 쉽게 구할 수 있다. 전형적인 초기의 백신 용량은 체중kg당 항원 0.001 내지 1mg이며, 바람직한 수준의 보호를 제공하기에 필요에 따라 양을 증가하거나 다중 용량을 사용한다.
백신이 현탁되거나 용해된 약제학적 담체는 접종된 동물에 무독성이고 운반 유기체 또는 항원 유전자 생성물에 적합한 물질중에서 캅셀화되거나 모든 용매 또는 고체일 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 생리학적 농도 또는 이와 가까운 농도의 무독성 염 및 통상의 염수와 같은 액체 담체, 탈크 또는 자당과 같은 고체 담체를 포함하며, 이는 농장의 동물용 사료에 혼합시킬 수 있다. 필요에 따라 보조제를 가하여 항원성을 증가시킬 수 있다. 기관지를 통해 투여할 경우, 백신은 바람직하게는 연무제의 형태이다. 유전자 생성물로부터 유도된 항원에 의한 면역화는 또한 병원체로부터의 재조합 유전자에 의해 특이적으로된 유전자 생성물을 발현시키는 담체로서 작용하는 병원성 미생물의 무병원성 유도체에 의한 선 면역화와 혼합하여 이용할 수 있다. 이러한 비경구 면역화는 부스터로서 사용되어 일단 그 병원체 유도 유전자 생성물에 대한 분비 면역 시스템이 GALT 또는 BALT의 림프세포를 자극하는 발현시키는 운반 미생물로 면역화에 의해 자극되면 분비 면역반응의 발현을 증진시킨다. 증진된 반응은 이차, 부스터, 또는 마취 반응으로서 알려졌으나 숙주의 지연된 면역 보호를 한다. 부스터 면역화는 유리한 결과로 여러번 반복된다.
상기 설명은 일반적으로 본 발명을 기술한 것이다. 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전한 이해를 할 수 있다. 본 실시예는 단지 설명을 위하여 제시된 것이며 특별히 다른 언급이 없는한 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 수행에 이용된 균주의 기탁
생물학적으로 순수한 다음과 같은 균주의 배양물은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland)에 1987년 7월 15일자 기탁되어 지정된 수탁번호는 성공적인 생존력 테스트를 거친 후, 지정 받았으며, 기탁료를 지불하였다. 본 기탁은 부다페스트협약의 조항에 따라 이루어졌다. 상기 배양물은 샘플 공급에 대한 가장 최근 요구후 최소 5년기간 및 어떤 경우 기탁일로부터 30년까지 영속적으로 유용하게 남을 것이다.
배양물이 배생존적이라면 동일한 분류학적 기술의 생존가능 배양물(들)로 치환된 것이다.
균 주ATCC
X4062 53647
X4064 53648
실시예 1
본 실시예는 cAMP의 합성 및 이용에 영향을 주는 결실 돌연변이를 유도함으로써 무병원성 돌연변이를 유도함으로써 무병원성 미생물을 제조하는 방법을 설명한다.
세균 균주
사용된 살모넬라 티피뮤륨 균주를 표 1에 수록하였다. 이들을 5% 글리세롤을 함유하는 1% 박토-펩톤중에 현탁시키고 -70℃에서 복제 저장용으로 드라이아이스-에탄올중에 급냉시키며, 또한 일상적인 용도를 위하여 -20℃에서 저장하기 위하여 50% 글리세롤을 함유하는 1% 박토-펩톤중에 현탁시킨 동결배지로서 유지시킨다.
일상적인 배양용의 복합 배지는 L-육즙[참조문헌 : Lennox, Virology 1:190-206, (1965)] 및 루리아(Luria)육즙[참조문헌 : Luria and Burrous, J. Bacteriol. 74:
461-476(1997)]이다. 기초한천(base apar)용으로 사용하기 위하여 디프코 한천을 1.2% 농도로 루리아 육즙에 가하고, 연성 한천용으로 사용하기 위하여 0.65% 농도로 가한다. 펜어세이(penassay)한천은 세균의 통상적인 수의 측정에 사용된다. 발표는 맥콘기(Mac Conkey)기초 한천 또는 에오신 메틸렌 블루 한천[참조문헌 : Curtiss, Genetics 58:9-54(1968)]을 적절한 탄수화물로 최종농도가 1%가 되게 보충함으로써 측정된다.
합성 배지는 전술한 바와같이 최적농도로 영양분을 보충시킨 최소 액체(ML) 및 최소 한천(MA)이다 [참조문헌 : Curtiss, J. Bact. 89:28-40, (1965)]. 젤라틴을 함유하는 완충된 상리식염수(BSG) [참조문헌 : Curtiss, 1965 상기 문헌]는 희석제로서 일상적으로 사용된다.
형질도입
표준방법을 사용하여 형질도입을 하는 경우
박테리오파아지 p22 HT int가 통상적으로 사용된다 [참조문헌 : Davis et al., A Man. for Genet. Eng.-Adv. Bact. Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1979)]. 공여 균주의 철야 배양액을 예비가온한 루리아 육즙내로 1:20 비율로 희석하고, 37℃에서 진탕시키면서 60분간 성장시킨 후 0.01 증복도에서 p22 Ht int로 감염시킨다. 감염 혼합물을 약 15시간동안 밤새 진탕시키고, 클로로포름을 가하고 37℃에서 10분간 추가로 진탕시킨후에, 현탁액을 원심분리하여(Sorrall RC5C, SS-34rotor, 7.000rpm, 10분) 세균성 파편을 제거한다. 파아지를 함유하는 상등액(약, 1010/㎖)을 클로로포름상 4℃에서 저장한다.
Tn 10-유도된 돌연변이의 형질도입을 선별하기 위하여 ㎖당 12.5㎍의 농도의 테트라사이클린을 사용한다.
결실 돌연변이에 대한 푸사르산 선별
말로이(Maloy) 및 눈(Nunn) [참조문헌 : J. Bact. 145 : 1110-1112, (1981)]에 의해 기술된 배지 및 방법을 사용한다. Tn10-유도된 돌연변이를 갖는 균주를 37℃에서 12.5㎍ 테트라사이클린/㎖를 함유하는 L-육즙중에서 밤새 성장시켜 약 5×108cfu/ml가 되게한다. 이어서 배양액을 테트라사이클린을 함유하지 않은 예비가온한 L-육즙내로 1:40 비율로 희석하고 37℃에서 통기시켜 약 2×109cfu/ml의 역가가 되게한다. BSG중으로 희석시킨 세포의 적정수(즉, 107내지 108)를 배지를 함유하는 푸사르산상에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 푸사르산-내성 분리체를 동일 선별 배지 상에서 정제한다. 단일 분리체를 선택하여 성장시키고 12.5㎍ 테트라사이클린/㎖를 함유하는 펜어세이 한천과 함유하지 않는 한천상에서 테트라사이클린 감수성을 시험한다.
마우스
모든 감염성 및 면역화 실험에 BALA/c 마우스 암컷(Sasco, St. Louis, MO)을 사용한다. 3주 또는 7주 경과한 동물을 구입하여 실험에 사용하기에 앞서 검역실에 1주일간 수용한다. 실험용 마우스를 전선 바닥이 딸린 날젠(Nalgene)필터로 덮힌 우리에 넣는다. 음식과 물을 충분히 공급한다. 사육실을 12시간 조명하에 22 내지 23℃에서 유지한다.
동물감염
경구 또는 복강내 접종하여 살모넬라 티피뮤륨 균주의 병원성을 측정한다. 마우스 접종용 세균을 37℃에서 표준 배양으로서 C-육즙증에 밤새 성장시킨다. 이들 배양액을 예비 가온한 C-육즙내로 1:50비로 희석시키고 37℃에서 약 4시간 동안 OD600에서 약 0.8 내지 1.0이 되게 통기시킨다. 세포를 소르발(Sorvall) RCSC 원심분리기중 40℃에서 10분간 7,000rpm속도 에서 GSA로터(rotor) 중에서 원심분리하여 50배로 농축한후 이어서 BSG중에 현탁시킨다. 역가 측정을 위하여 펜어세이 한천상에 적합한 희석제를 접종하고 cya/crp 표현형을 증명하기 위하여 1% 말토스를 함유하는 맥콘키 한천상에 접종한다.
모든 경우 접종시, 감염전 4시간 동안 음식 및 물을 마우스로부터 제거한다. 피펫만(Pipetman) P20을 사용하여 BSG중에 현탁된 20㎕의 살모넬라 티피뮤륨을 경구투여하기 5분전에 피펫만 P200을 사용하여 10%(W/V)중탄산 나트륨 30㎕이상을 투여한다. 경구접종 30분후에 음식 및 물을 다시 공급한다. 마우스의 이환율 및 사망율을 30일에 걸쳐서 관찰한다.
절식하지 않은 마우스에 26-게이지 니들을 사용하여 BSG중에 희석시킨 세균 현탁액 300㎕를 복강내 접종한다. 마우스의 일환율 및 사망율을 30일간에 걸쳐서 관찰한다.
보호성 면역의 측정
초기 실험에서, 30일간 살모넬라 티피뮤륨 돌연변이체 균주의 감염으로부터 생존한 마우스를 31일째되는날 야생형 마우스-병원성 살모넬라 티피뮤륨 SR11 균주 χ 3306의 LD50용량으로 103내지 104번 경구투여한다. 이어서, 마우스 그룹을 무병원성 돌연변이체의 다양한 용량으로 경구적으로 면역화 시킨후 초기 면역화후 다양한 횟수에서 병원성 χ 3306세포의 다양한 용량을 투여한다. 실험 전반에 걸쳐서 및 χ 3306 세포로 투여한지 적어도 30일간 이환율 및 사망율을 관찰한다.
생채네 살모넬라 티피뮤륨 생세포수 측정
상기 기술된 방법에 따라 약 1×109세포를 마우스에 경구 접종하여 야생형 및 돌연변이 살모넬라 티피뮤륨 SR11균주의 콜로니화 및 존속을 측정한다. 경구 감염시킨지 4, 24, 437, 72 및 96시간 및 7일후 소장 및 결장의 내용물, 페이어 팻치, 페이어 팻치가 제거된 회장 말단 부위에 위치한 소장벽의 10cm 절단물, 및 결장벽의 균등질에서의 살모넬라 티피뮤륨 세포의 역가를 측정한다. 마우스를 CO2로 질식시켜 안락사시키고 장간막 임파선, 비장, 소장, 및 결장을 즉시 얼음상에 유지시킨 냉각된 ML+15% 자당 최소염(MLS)중에 넣는다. 페이어 팻치를 소형의 수술용 가위로 제거하면서 4.0㎖의 냉 MLS를 함유하는 페트리디쉬를 사용하여 소장을 유지시킨다. 페이어 팻치를 1㎖냉 MLS 및 글라스 비드를 함유하는 글라스 스크루우-캡 튜브(15×100mm)중에 넣기전에 1㎖ 냉 BSG로 각각 2회 세정한다. 이어서 소장을 종절단하여 내용물 및 벽을 50㎖ 1회용 원추상 튜브중에 넣고, 1분간 와동시키기전에 냉 MLS를 가하여 5.0㎖ 용적이 되게 한다. 소장을 10cm 절개하여 적출한후 5㎖ BSG로 2회 세정하고 2.5㎖ 냉 MLS 및 글라스 비드를 함유하는 글라스 스크루우-캡 튜브(15×100mm)중에 넣는다. 소장의 종 절개 및 세척동안 사용된 냉 MLS로부터 소장의 내용물을 회수하여 소장 내용물을 함유하는 50㎖ 1회용 원충상 튜브에 가한다. 맹장을 통하여 결장이 종 절단되는 동안 4.0㎖의 냉 MLS를 함유하는 페트리디쉬를 사용하여 결장을 유지시킨다. 결장의 내용물 및 결장벽을 1분간 와동시키기 전에 50㎖최종 용적중에 넣는다. 이어서, 결장벽을 적출하여, 2.5㎖ 냉 MIL 및 글라스 비드를 함유하는 글라스 스크루우-캡 튜브 (15×100mm)중에 넣기전에 5㎖ BSG중에서 2회 세정한다. 결장을 종절개하고 세척하는 동안 사용된 냉 MLS로부터 결장 내용물을 수집하여 결장 내용물을 함유하는 50㎖ 1회용 원충상 튜브에 가한다. 장간막 임파선 및 연결성 지방 조직을 1.0㎖ 냉 MLS 및 글라스 비드를 함유하는 글라스 스크루우-캡 튜브(15×100mm)중에 넣고 와동시킨다. 96시간 및 7일째에 수거한 비장을 다운스 펫슬(Dounce pestle)형 조직 마쇄기에 직접 넣고 2.5㎖ 냉 MLS로 분쇄함으로써 가공한다. 글라스 비드 및 조직을 함유한 각 튜브를 초(Super)-혼합기를 사용하여 고속도로 4 내지 5분간 와동시킨다. 현탁액을 BSG중에 희석 시키고 1% 유당 및 40㎍ 날리딕스산/㎖을 함유하는 맥콘키 한천상에 접종한다. 현탁액의 용적, 희석액, 및 평판의 수를 사용하여 총 생존 역가를 측정한다. 다양한 종류의 탄수화물을 1% 함유하는 맥콘키 한천을 사용하여 회수된 유기체가 예상된 표현형을 가졌음을 증명하였다.
cya 및 cro 돌연변이된 살모넬라 티피뮤륨 SR11
균주의 작제
BALB/c 마우스를 경구 감염시키는데 살모넬라 티피뮤륨 ST11 균주 χ 34041을 사용하였다. 5일후 확연히 질병에 걸린 동물을 참수시키고 페이어 팻치로부터 완전히 마우스-병원성인 분리체χ 3181이 회수됨이 증명되었다. P22 형질도입에 의해 χ 3181에 날리딕스샅 내성을 부여하는 gyrA 돌연변이를 도입하였으며, 모든 균주들에 대한 양친 균주를 본 명세서에 기술하였다(표 1).
100kb 병원성 플라스키드가 제거된 살모넬라 티피뮤륨 분리체는 페이어 팻치에 완전히 결합되고, 침투하여 지속될 수 있으나, 장간막 임파선 및 비장을 횡단하는 능력이 결여되어 있으므로, 플라스미드-함유 SR11 유도체 χ 3306 뿐만아니라 플라스미드-치유 살모넬라 티피뮤륨 ST11 균주 χ 3337내로 cya 및 crp 돌연변이를 도입시킬 수 있다. pStSR100 플라스미드가 χ 3337내로 재도입되면 이의 병원성이 완전히 회복되므로(실시예 3 참조), 병원성 플라스미드가 제거되는 동안 χ 3337 중에 2차 돌연변이가 일어나지 않도록 보장함을 주지하여야 한다.
Figure kpo00001
당의 발효 및 다양한 탄소원상의 상장에 대한 모든 돌연변이체 균주 및 이들의 양친 균주의 표현형 특성을 표 2에 수록하였다. 대사활성에 대한 사이클릭 AMP 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질 요구성에 대한 출간된 보고서를 토대로하여 관찰한 결과 표현형은 예상된 바와 같았다.(cya 단일 돌연변이 보다는 오히려 cya crp 2중 돌연변이와 같이 행동하는 χ 4060은 예외). 모든 cya/crp 돌연변이체 균주는 이전의 결과를 토대로 예상된 바와같이 핌브리애 및 편모가 결여 되었다[참고문헌 : Saier et al., J. Bact. 134 (1) : 356-358, (1978); Yokota and Gots, J. Bact. 103 : 513-16(1970) ; and Koneda et al., Mol. Gea'l Genet. 142 : 289-298, (1975)]. pStSR100 플라스미드의 존재가 이들 표현형에 전혀 영향을 주지 않음은 자명하다.
하기의 푸사르산-내성 테트라사이클린-감수성 유도체를 선별하는 과정의 각 단계에서, 테트라사이클린-내성 복귀 돌연변이체/돌연변이체가 양친 균주 χ 3306에 대하여 관찰될 수 있는 것보다 더 높은 빈도로 회수될 수 있는지의 여부를 조사한다. 모든 경우에는 이러한 테트라사이클린-내성 복귀 돌연변이체/돌연변이체는 관찰되지 않았다.
Figure kpo00002
몇몇 돌연변이체 균주 및 이들의 양친 균주의 0.5% 글르코스를 함유하는 ML중에서의 배양시간 및 1세대 시간의 함수로서 0.5% 글로코스를 함유하는 MA상의 콜로니 직경을 표 3에 나타내었다. Δcrp 돌연변이되거나 되지않았으며 pStSR100 플라스미드의 존재 여부에 대하여 독립적인 Δcya 균주는 양친 χ 3306 배양체 보다 훨씬 서서히 성장함이 분명하다.
Figure kpo00003
마우스에 대한 돌연변이체 균주의 병원성
돌연변이체 균주의 병원성에 대한 예비적인 정보는 각각의 마우스를 105돌연변이체 세포로 복강내 투여하거나 108돌연변이체 세포를 경구적으로 투여하고 이환율 및 사망율을 기록함으로써 수득된다. cya: :Tn10돌연변이된 χ 3395 및 crp: :Tn10돌연변이된 χ 3396은 명백히 무병원성이고 이들 둘중의 하나로 감염됨으로부터 생존하는 마우스는 야생형 χ 3306 세포의 감염에 대하여 면역되므로, χ 3395 및 χ 3396의 병원성에 대한 추가의 연구에 착수한다. cya: :Tn10돌연변이체 또는 crp: :Tn10돌연변이체의 LD50용량으로 약 103번 감염시키는 경우 마우스가 생존함을 보여주는 데이타를 표 4에 나타내었다. 이어서, Tn10및 이웃하는 DNA 서열이 결실된 균주를 사용하여 연구를 한다. 살모넬라 티피뮤륨 양생형, Δcya 및 Δcrp 균주로 경구 감염시킨 마우스의 이환율 및 사망율에 대한 데이타를 표 5에 나타내었다. 감염시기에 있어서 마우스의 연령에 무관하게 모든 마우스는 돌연변이체 균주의 양생형 LD50용량으로 1000 내지 4000번 감염시키는 경우에도 생존한다는 것은 자명하다. 표 5에 나타낸 pStSR100-치유된 유도체 χ 3337의 무병원성에 관련된 정보는 실시예 3에 제시된 더 자세한 연구 결과와 일치한다.
마우스가 감염되지 않은 경우뿐만 아니라 1×109세균으로 경구적으로 감염된 실질적으로 성장함을 실증하는, Δcya 및 Δcya Δcrp 균주 χ 4060 및 χ 4062(플라스미드-제거됨) 및 χ 4032 및 χ 4064(플라스미드-함유)로 감염시킨 경우에 대한 추가의 자료를 표 6에 나타냈다.
살모넬라 티피뮤륨의 복강내 접종에 대한 자료를 표 7에 나타내었다. 마우스는 다양한 돌연변이체 균주에 대한 야생형 LD50용량으로 102내지 103번 감염시키는 경우 생존한다. 더 높은 용량에서, 부분적으로 내독소의 효과에 기인하는 질환이 관찰되었다.
Figure kpo00004
Figure kpo00005
Figure kpo00006
(무병원성 돌연변이체에 의한 면역화 효율)
상이한 살모넬라 니피뮤륨 Δcya 및 Δcya Δcrp 돌연변이체를 완전 병원성인 살모넬라 디피뮤륨 SR11 χ 3306 세포의 LD50용량으로 104번 경구투여시 면역성에 대한 데이타를 표 8에 나타냈다.
이러한 감염 상태하에서, 건강하고 정상적으로 음식물을 섭취하고 성장하는 χ 4064로 면역화된 마우스를 제외하고는 다수의 마우스는 음식물 소비가 감소하면 온화한 증상을 나타낸다. 감염된지 30일후 모든 마우스(χ 4064로 면역화된 마우스도 포함)를 참수시킨 결과 거비증 및 χ 3306 야생형 균주의 감염에 대한 회복능을 나타내었지만 무병원성 Δcya 또는 Δcya Δcrp 백신 균주는 그렇지 않았다. 이와반대로, 약 1 × 109χ 406로 면역시킨 마우스를 완전히 병원성인 χ 3306 양친균주의 100 내지 1000 LD50용량만으로 감염시키는 경우 거비증 및 감염균주에 대한 회복이 관찰되지 않았다.
(생체내 무병원성 돌연변이체의 조직 영양성 및 존속)
시간과 경구 접종의 함수로서 날리딕스산-감수성 야생형 균주 χ 3456 (Tn minitet-표지됨 ; 표 1 참조)의 회복과 비교한 Δcya Δcrp 균주 χ 4064의 회복에 대한 데이타를 제 1 도 및 제 2 도에 나타냈다. Δcya 및 Δcrp 돌연변이는 적어도 보호성 면역을 유도하기 위한 충분한 시간동안 페이어 팻치에 대한 살모넬라 티피뮤륨의 침투능 존속능은 심각하게 감소시키지 않지만(제 1도) 비장 도달 또는 비장내 생존능을 감소시킨다(제 2도)는 것은 명백하다.
Figure kpo00007
(무병원성 돌연변이체의 유전학적 안정성)
생백신으로서 경구투여되는 균주는 이들의 무병원성 및 면역원성 모두에 대하여 완전한 안정성을 보유하여야 한다. 그러므로, 사용될 백신 균주 일부를 L-육즙중에서 통기시키면서 후기대수기 까지 성장시키고, 50배로 농축한후 양친 돌연변이체(표 2)의 성장을 지지하지 않는 탄소원을 함유하는 일련의 최소 한천상에 다양한 희석비로 접종한다. 팽판의 2중세트를 세포의 70%를 사멸시키는 강도의 자외선에 노출시킨다. 자연 복귀돌연변이체/돌연변이체는 Δcya 균주 χ 4032 중에서 낮지만 측적가능한 빈도(표 9)로, Δcya 균주 χ 4064중에서는 높은 빈도로 관찰되었으며 ; 이들 복귀돌연변이체의 다수는 대부분의 탄소원상에서 성장하였으므로 사이클릭 AMP의 부재하에 CRP가 전사를 활성화하도록 허용하는 crp [참조문헌 : Schalte and Postma, J. Bact. 141 : 751-57 (1980) : Garges and Adhya, Cell 41 : 745-51 (1985) 또는 csm [참조문헌 : Melton et al., Mol. Gen'l Genet. 182 : 480-89 (1981)] 돌연변이일 것으로 추측된다.
χ 4064와 같은 Δcya Δcrp 균주로부터의 복귀돌연변이/돌연변이체는 극히 희귀하여 (표 9) 비록 선택된 탄소원 (즉, 만니틀)상에서는 성장할 수 있지만, 원래의 균주가 사용하지 못하는 다른 어떠한 탄소원상에서도 성장하지 못한다. 이들 복귀돌연변이체/돌연변이체는 확실히 CRP와 독립적으로 특이적인 유전자/오페론의 전사를 유도하는, 프로모터 돌연변이를 가진다. 자외선 노출은 돌연변이/복귀돌연변이 빈도를 증가시키지 않는다.
6개의 복귀돌연변이체/돌연변이체의 병원성을 측정하였다. 각각의 복귀돌연변이체를 시험하는데 4마리의 마우스를 사용한다. 한마리는 105세포용량을 경구투여하고, 또 하나는 약 108세포 용량을 경구투여하며 다른 하나는 102세포용량을 복강내 투여하며, 마지막 하나는 105세포용량을 복강내 투여한다. 모든 경우에서, 마우스 32마리 모두는 눈에 띌만한 증상이 없이 건강한 상태로 존재하므로 Δcya 돌연변이체로부터의 4개의 복귀돌연변이체 및 Δcya Δcrp 균주의 두 복귀돌연변이체는 이들 양친균주의 무병원성을 보유한다. 그러므로 Δcya 균주의 무병원성은 탄수화물 대사의 결손에 기인하여서만 나타날 수는 없는 것으로 밝혀졌다.
Figure kpo00008
상기 결과로 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 합성시킬 능력이 부족하고 pStSR100 병원성 플라스미드를 가지거나 가지지 않는 일정수의 마우스 병원체 에스.티피뮤륨 SR11 균주 χ 3308 유도체를 작제할 수 있음이 입증된다. 모든 균주가 경구 접종경로에 의해 무병원성이고 병원체 에스.티피뮤륨 야생-형 세포의 계속되는 감염에 대하여 고수준의 보호 면역성을 유발한다 할지라도, Δcya 및 Δcrp 돌연변이가 발생하는 χ 4062 및 χ 4064가 바람직하다. crp 유전자가 결실된 이중변이체의 사용으로 사이클릭 AMP에 대한 어떠한 요구도 없는 상태에서 CRP 단백질에 의한 활성화를 필요로하는 유전자 및 오페론의 전사를 허용하는 crp*변이물의 회수가 불가능하다. 유사하게, crp 유전자의 부재하에서는 crp 유전자에 밀접하게 결합된 cms 억제인자 변이물의 회수가 불가능하고, 이는 또한 사이클릭 AMP에 대한 요구를 경감시킬 수 있다. 시험된 Δcya crp*또는 cms 복귀돌연변이 균주가 무병원체에 잔존할지라도, 병원성을 알아보는데 충분한 독립적인 복귀돌연변이체 분리물이 시험되지 않았기때문에 병원성을 보유하지 않는다고 결론지을 수 없다. 따라서, Δcrp 돌연변이는 상기 변화가 다르게 일어날지라도 상기 병원성의 보유는 배제해야만 한다. 덧붙여, Δcrp : Tn10 돌연변이는 에스.티피뮤륨의 병원성을 상당히 감소시키므로 (표 4) Δcya 돌연변이가 몇몇 형태의 유전자 전이에 의해 상실될 경우에, Δcrp 돌연변이는 지속적으로 균주 병원체를 제공할 것이다.
pStSR100 플라스미드를 지속적으로 가지는 백신 균주 χ 4064는 플라스미드를 갖지 않는 균주 χ 4062보다 고수준의 면역성을 유발시킨다(표 8). 이는 보다 높은 역가를 달성하고 장간막 림프노드 및 비장중에서 플라스미드를 갖지 않는 균주보다 더 오래 지속시키기 위한 χ 4064 (제 1도 및 2도) 및 일반적인 플라스미드-함유 균주의 증가된 능력으로 인한것임이 명백하다(실시예 3 참조). 연령이 적은 동물 또는 영양이 부족하거나 절충된 개개인에 있어서 χ 4064으로의 면역화는 χ 4062로의 면역화보다 훨씬 덜 허용된다. 이와같은 점을 고려하면, 두가지의 면역화 모두가 바람직할 경우, 먼저 χ 4062로 면역시킨 다음 χ 4064로 면역시킨다.
χ 4062 및 χ 4064와 같은 백신 균주의 바람직한 용도는 표적 콜로니화를 위한 담체 또는 바람직할 경우, 일반화된 분비성 면역반응 및 체액성 및 세포성 면역을 유도하도록 구트(gut)-연관된 임파 조직에 대한 다른 병원체로 부터의 유전자에 의해 발현된 병원성 항원으로서 공급되는 것이다. 따라서 다양한 콜로니화 벡터가 χ 4062 및 χ 4064내로 도입되었고 이들 플라스미드는 야생-형 양친규주와 같거나 그 이상의 안정성을 나타낸다. 실제로, χ 4062 및 χ 4064의 성장속도가 늦음으로 인해 자손세포가 플라스미드를 함유하는 것을 입증해주는 염색체 복제시킬 수 있는 플라스미드 복제 단위의 능력이 향상된다. 덧붙여, 다양한 재조합 유도체는 작제되었으며 타액 당단백질-피복된 치아 표면 [참조 : Curtiss, J. Dent. Res. 65 : 1034-1045 (1986) ] 에 대한 에스.뮤탄스 및 에스.소브리누스의 콜로니화에 필요한 클론화 항원 SpaA가 Δcya crp 돌연변이체 중에서 무병원성을 부여하는 다른 돌연변이가 일어난 에스.티피뮤륨 균주에서 보다 더 높은 수준으로 발현됨을 발견하였다.
(실시예 2)
본 실시예는 Δcya, Δcrp 돌연변이물을 다른 살모넬라 종내로 도입시켜 상기종의 무병원체로 만들어서 백신 성분으로서 유용한 것으로 만드는 방법을 예시하고 있다.
본 발명에 따른 본 양태를 실시하는데 유용한 살모넬라 종은 조류 살모넬라 균주인 에스.아리조나(S. arizona) 및 에스. 갈리나륨(S. gallinarum)을 포함한다. 돼지(porcine) 특이적 살모넬라인 에스.콜레아에수이드(S. Choleraesuis), 소-특이적 살모넬라인 에스.두블린(S. dublin) 및 병아리, 칠면조, 식용송아지, 돼지 및 말로부터 분리시킨 일정한 수의 에스.티피뮤륨 유도체도 포함된다. 이들 균주를 사용하여 변이성 플라스미드를 함유하거나 함유하지 않는 Δcya Δcrp 돌연변이체를 작제할 수 있고 이를 먼저 마우스를 대상으로 보호면역성에 관해 평가한 다음, 특히 동물 숙주종을 대상으로 보호면역성에 관해 평가한다. 이와같은 무병원체 살모넬라 유도체를 또한 사용하여 콜로니화에 대한 보호면역성을 자극하기위한 이가 생 백신 균주 및 다른 세균 병원체의 병원성 단백질을 작제할 수 있다. 특정하게, 가금(poultry)의 높은 이환률 및 사망률에 책임이 있는 두개의 호흡성 병원체인 비.아비윰(B. avium) 및 이.콜라이에 대한 백신 및 말의 선역(strangles)을 야기시키는 스트렙토코코스 에쿠이(streptococcus equi)에 대한 백신을 제조할 수 있다.
(무병원체 살모넬라 균주의 작제)
Δ[gal-uvrB] 1005 돌연변이가 일어나는 cya : : Tn10 또는 crp : :Tn10을 가지고 배양배지증의 갈락토오즈의 존재 또는 부재에 따라서 부드럽거나 거친 표현형으로되는 에스.티피뮤륨 LT-2 균주를 사용하여 Δcya Δcrp 유전자형을 생성할 수 있다. P22HT int으로의 형질도입을 이용하여 cya ii Tn10 및 crp ii Tn10 돌연변이물을 다양한 숙주로부터 수득된 에스.티피뮤륨의 균주, 및 에스.타이피, 에스.파라타이피 및 유사한 10항원을 갖는 다른 살모넬라내로 도입시킨다. 일반화된 거친-특이적 형질도입 파아지 P1L4를 이용하여 Tn10-유도된 변이물을 에스.아리조나, 에스 갈리나륨, 에스.두블린, 및 에스.콜레라에수이스 내로 도입시킨다. 상기 기술된 살모넬라종의 P1L4 형질도입은 거친 변이체의 분리를 요구한다. 2-데옥시갈락토오즈 내성에 대한 선택으로 galE돌연변이체가 생성된다. galE 결손은 결국 야생-형 gal 유전자를 함유한 거친 돌연변이체상에 번식된 P1L4과의 형질 도입에 의해 제거할 수 있다.
안정한 결손 돌연변이체는 cya ii Tn10 및/또는 crp ii Tn10 삽입 돌연변이물을 함유하는 균주의 푸사르산-내성 유도체를 선택함으로써 분리된다. 푸사르산-내성 유도체는 트랜스포존(transposon) 및 인접한 숙주 염색체 유전자의 부정확한 절단으로 인해 테트라사이클린 민감성이다. Tn10을 연속적으로 사용하는 것이 바람직할 경우, 푸사르산-내성 분리물이 예를 들면, 하이브리드화 탐침으로서 λ ii Tn10 벡터를 사용함으로써 완전히 Tn10을 상실하였는지를 확인할 필요가 있다.
에스.티피뮤륨에 관하여 개발된 방법 및 유전 수단(실시예 1 및 3 참조)을 사용하여 병원성 플라스미드가 치유된 살모넬라 균주를 작제한다. 문헌 [참조 : Way et al., Gene 32 : 369-79 (1984) ]에 기술된 Tn mini-tet를 상기 작제 단계시 이용한다. 트랜스포사제가 결핍되고 자발적으로 결손될 수 없는 상기 트랜스포존을 아마도 에스.두블린, 에스. 갈리나륨 및 에스. 콜레라에수이스의 병원성 플라스미드와 동종인 100kb 병원성 플라스미드의 병원성-연관된 영역내에 삽입시킨다 [참조 : Popoff et al., Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 135A : 389-398 (1984) . 트랜스포존 삽입물을 이들 다른 종의 galE 돌연변이체와 유사한 서열내로 형질도입시킨다. Tn mini-tet-표지된 병원성 플라스미드를 성장 세균에 의해 DNA 기라제 억제제인 노보바이오신(nobobiocin)으로 약 43℃의 승온하에서 치유한다. 병원성 플라스미드의 치유는 치유된 유도체를32P-표지된 천연 병원성 플라스미드와 하이브리드화시켜 확증할 수 있다.
작제된 모든 균주를 유전적 역할의 안정성에 관하여 평가하고 에스.티피뮤륨 돌연변이체중에 나타내어진 표현형이 다른 살모넬라종에 나타난지를 결정한다. 동물을 대상으로한 연구를 신속히 하기위한 마지막 단계는 동물 실험시 하기 살모넬라 균주로 보조하기 위하여 약제 내성 표식을 도입하는 것이다. 날리딕산 또는 리팜피신에 대한 통상의 내성을 사용하는 것은 이들 내성이 마우스, 병아리, 또는 칠면조의 표준상(flora) 내에서 유세하지 않기 때문이다.
트랜스포존-유도된 돌연변이물 일부를 형질도입에 의해 살모넬라종 일부내로 도입시키는 것은 불가능할 수 있다. 또다른 방법으로는, 접합법을 사용하는 것이 유리할 수 있는데 여기서는 삽입된 TncF 또는 TncP 플라스미드를 함유한 Hfr로부터 살모넬라로 이동될 수 있는 플라스미드상에 트랜스포존-유도된 돌연변이물을 클로닝한다. 그러나 형질전환은 추가의 대응물을 제공하는데, 이때 서열을 염색체 내에 재조합하기 위한 선택 공정, 플라스미드의 제거공정 및 정확한 유전적 장애의 확증 공정은 수행되지 않는다.
(면역원성, 콜로니화 및 지속성에 관한 평가)
상기 작제된 무병원성 살모넬라 균주는 경구접종, 위관삽입, 또는 복강내 주사를 사용하여 마우스중에서 평가할 수 있다.
방법은 살모넬라 균주를 대수기로 성장시키고 이들을 완충 염수중에서 젤라틴으로 약 1010세포수/㎖로 농축시킴으로써 시작한다. 경구 접종시키거나 위관 삽입될 동물에게 접종시키기전 4시간 동안 음식과 물을 주지않는다. 접종시키기 5분전에 증탄산 나트륨을 마우스에게 투여하여 위산도를 중화시킨다. 접종한지 30분후에 음식과 물을 마우스에게 공급한다. 마우스중에서 에스.티피뮤륨의 상기 돌연변이체 균주를 대상으로한 선행 실험을 근거로하여, 통상적으로 마우스가 반응을 나타내는 것은 103LD50용량에서이다. 이는 다양한 살모넬라종의 야생-형이 마우스-병원체 에스. 티피뮤륨에 대해 앞서 관찰된 바와같이 높은 LD50값을 수득하지 못한다면 실행되지 못할 것이다. 이러한 사실은 109이상의 유기체에 경구투여하는 것이 어렵기 때문에 경구 접종경로에 관한 심각한 문제점이 된다. 복강내 접종은 또한 내독성 쇽을 일으키는 수준이하의 용량으로 수행될 수 있다(약 107세포). 동물의 체중 및 건강상태를 한달간 기록한다.
30일간 생존하는 돌연변이체 살모넬라 균주가 접종된 마우스는 경구 또는 복강내 경로에 의해 병원체 살모넬라 양친균주의 103LD50값에서 반응을 나타낸다. 감염된 동물의 건강상태를 매일 주기적으로 기록하여 성장속도에 관해 평가한다. 반응을 나타내기에 앞서, 타액 샘플은 필로카르핀(pilocarpin) 자극시켜 취하고, 각각의 동물을 출혈시켜 혈청을 수집한다. 타액중의 분비성 IgA 및 IgG와 살모넬라 표면 항원에 대한 혈청중의 IgA 및 IgG의 정량적 역가를 측정한다. 항체 역가 및 면역성 지속상에서의 이차 면역의 효과를 또한 주지해야 한다.
고 수준의 면역성을 유도하고 중량이 증가하는 해로운 영향을 끼치지 않는 무병원체인 백신 균주를 사용하여 4, 24, 48, 72 및 96시간, 및 필요할 경우 그후 매주 간격으로, 소창자 및 결장의 벽에 부착되고 피어스 패치(Peyer's patches), 소장 및 결장성분, 장간막 림프 노드, 및 비장중에 존재하는 균주의 정략적 역가를 측정한다. 이러한 정보는 수득된 면역반응시의 데이타와 상관이 있다.
그다음 마우스중에서 무병원체이고 면역원성인 균주를 적합한 동물종, 예를들면 병아리 및 칠면조새끼중의 에스. 아리조나, 에스. 갈리나륨 및 조류 에스. 티피뮤륨 균주 중에서 시험한다. 조류 숙주중에서 무병원성 및 면역원성을 평가한뒤 파브리시우스(Fabricius)의 소낭, 맹장 및 점액낭중에서의 병원체 살모넬라의 역가를 마우스중에서 연구된 조직에 덧붙여 측정한다.
(보르테텔라 아비윰(Bordetella avium)에 대하여 면역화하기 위한 이가 백신 균주의 작제 및 시험)
비. 아비윰에 대한 백신을 콜로니화에 포함된 표면 구조 및 피부괴사 독성의 독성 결정기가 아닌 항원 구조를 발현해야 한다. 표면 단백질에 대한 백신은 피부괴사 독성에 대한 항체가 그의 해로운 효과를 중화시킬 동안 기관지(trachea)의 콜로니화를 차단시켜 면역성을 생성시켜야만 한다. 콜로니화에 포함된 비. 아비윰 표면 구조가 공지되어 있지 않을지라도, 발현 벡터중의 비.아비윰의 유전자 라이브러리 및 트랜스포존-유도된 비.아비윰 돌연변이체의 입수가 가능하므로 표면 단백질을 암호화하는 유전자를 분리시키고 동정할 수 있다. 표면 단백질 및/또는 피부괴사 독성 결정기에 대한 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 무병원체 살모넬라에 도입시킴으로써, 콜로니화를 억제하거나 (및 따라서 콜로니화에 포함된 유전자를 동정하고) 독성을 중화시켜 보호 면역성을 유도하는 이가 균주를 선택할 수 있다.
비. 아비윰 외부막 단백질 및/또는 피부괴사 독성에 대한 유전자를 문헌 [참조 : Curtiss, Manual of meth. in Bacteriol., ASM. Washington, D.C. (1981)]에 기술된 방법으로 형질전환시켜 적당한 무병원체 에스. 아리조나, 에스. 갈리나륨, 및/또는 에스. 티피뮤륨으로 전이시키고, 이들 단백질의 발현을 웨스턴 블럿 방법 [참조 : towbin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 76 : 4350-54 (1979)]을 사용하여 검사한다. 형질전횐시키기 전에 50℃에서 5분간 열속을 가하여 살모넬라 중에서 모든 제한 장벽을 극복할 것이다. 앞서의 보고는 보르데텔라 유전자가 이.콜라이 프로코터로부터 전사되지 않는한 이. 콜라이 중에서 유효하게 발현되지 못한다는 것을 지시하고 있다. 비.아비윰 유전자의 발현 및 단백질을 살모넬라의 외부막으로 자리이동(translocation)에 관한 상기 문제점들은 재조합 벡터를 사용하여 제거되며, 이때 유전자는 이. 콜라이 lamB 또는 ompA 유전자에 융합될 것이다. 덧붙여, 비. 아비윰 단백질은 살모넬라의 외부막으로 자리이동을 하고 이가 백신 균주가 피에스패치를 콜로니화 하면 강한 면역반응을 자극할 가능성이 증가될 것이다. 비. 아비윰 유전자가 살모넬라내로 삽입되면, 재조합 클론을 문헌[참조 : Chorbit et al., EMBO J. 5 : 3029-37 (1986)]에 기술된 바와 같이 면역표지된 살모넬라의 특이적 항체 및 전자현미경을 사용하여 콜로니 면역블럿에 의해 유전자의 발현에 관해 분석한다.
하루 내지 3일생 새끼를 이가 백신으로 경구적으로 면역시키고 혈청 및 호흡성 분비물을 기록하여 항체 반응의 형태 [IgY (IgG, 7S Ig), IgM, 및 IgA (IgB)] 및 양을 측정한다. 면역되고 면역되지 않은 새끼의 체중 감소를 비교하여 이가 백신으로 인해 생겨날 수 있는 부착용을 기록한다. 덧붙여, 칠면조 새끼는 109병원체 비. 아비윰으로 비내 접종시키거나 감염된 새에게 노출시킴으로써 반응을 나타낸다. 기관지 조직 상해에 관해 검시되고 연구된 질병 및 유기체의 역가에서의 변화에 관하여 알아보기 위해 반응을 나타낸 칠면조 새끼를 관찰하였다. 비. 아비윰에 대한 점액성 면역 반응이 매우 어린 병아리 및 칠면조를 보호하기에 부적당할 경우, 출혈하는 헨(han)은 비. 아비윰 콜로니를 발현하는 무병원체 살모넬라 및/또는 어머니 항체의 에그전이를 허용하는 병원성항원으로 면역시킬 수 있다. 상기 처리로 어린 병아리 또는 칠면조새끼가 성숙하는 동안 비. 아비윰에 대한 면역성이 증가될 것이다. 동일한 재조합 담체를 이용하는 보호 경구 면역화는 또한 성숙 과정 동안 투여될 수 있다.
[조류 이. 콜라이에 대하여 면역화하기 위한 이가 백신 균주의 작제 및 시험]
무병원체 이. 콜라이에게 증가된 병원성 또는 병아리의 공기 색(sac)을 콜로니화하는 능력을 부여하는 재조합 클론을 상기 기술된 방법으로 에스. 갈리나륨 및/또는 에스. 티피뮤륨의 무병원체 균주내에 도입시킨다. 살모넬라 세포 표면상에서 병원성 결정기의 발현은 형광성 항체 기술에 의해 측정하지만, 이. 콜라이 세포 표면 결정기가 살모넬라의 표면상에 발현될 수 있음을 인식해야만 한다.
병아리를 이가 백신 균주로 경구적으로 면역시키고 병원체 이. 콜라이를 꼬리(candal) 공기색내로 주사시켜 반응을 나타나게 한다. 폐혈증 현상이 나타나지 않는다면, 새를 검사하여 공기색을 콜로니화하는 능력이 영향을 미쳤는지에 관하여 결정한다. 이어서, 상기 기술된 바와 같이 칠면조 새끼에 대한 호흡성 분비물 및 혈청중에서 항체 반응의 형태, 양, 및 기관에 관한 광범위한 연구를 수행한다.
백신 투여 및 평가에 관한 방법은 비. 아비윰 백신에 관하여 앞서 기술된 바와 같다.
스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi)에 대하여 면역성을 부여하기 위한 이가 백신 균주의 작제 및 시험
에스. 에퀴 M 단백질을 발현하는 에스. 티피큐륨의 무병원체 유도체를 작제하였다.
DNase I 생성된 에스. 에퀴 M 단백질 유전자의 무작위 단편을 λgt1l 발현 벡터내에 클로닝시킨다. 보호 면역성을 유도하는 M 단백질 단편에 대한 항혈청 및 출혈성 자반병에 걸린 말(horse)의 면역 복합제 중에 존재하는 M 단백질 결정기에 대한 항혈청으로 라이브러리를 연속적으로 선별시킨다. 보호 결정기는 발현하지만, 자반원 결정기는 발현하지 않는 클론화된 유전자를 lamB 또는 ompA 유전자에 융합시키기 위해 선택한다. 상기 결정기들을 수반하는 무병원체 살모넬라에 대한 면역 반응은 먼저 마우스에서 그 다음 조랑말 또는 말 중에서 조사한다.
살모넬라 균주상에 에스. 에퀴의 M 단백질과 관련된 에피토프를 발현하는 기술된 살모넬라 균주의 입수가능성으로 말의 선역에 대한 점액성 비인두 보호 면역 반응을 자극하는 매우 효과적인 방법을 만들 수 있다. M 단백질의 자반원 결정기를 분석함으로써 백신의 안전성에 관해 공헌한다.
[실시예 3]
본 실시예는 면역원성에 대한 병원성-플라스미드 결실의 효과 및 몇몇 살모넬라 균주의 병원성을 예시한다.
[세균 균주]
본 실시예에 사용된 세균 균주는 플라스미드 기술과 함께 표 10에 기술된다. 에스. 티피뮤륨 균주의 3가지 주를 사용한다 : 마우스-통과된 병원체 균주 SR-11 및 Sl1344, 및 더적은 병원체 균주 LT2. 에스케리키아 콜라이 HB101 및 c600을 유전 조작에 사용한다.
[배양배지 및 성장조건]
달리 언급되지 않는한, 세균을 하기 농도의 적당한 항생제가 보충된 L육즙 중에서 또는 L한천 판 [참조 : Lennox, Virology 1 : 190-206 (1955)] 상에서 배양시킨다 : 앰피실린(Amp)-100 내지 200, 테트라사이클린(Tet)-12.5 내지 25, 클로람페니콜 (Chl)-30, 칸나마이신(Kan)-50, 스트렙토 마이신(Str)-50, 및 날리딕산(Nal)-50. 부착, 침입, 및 대식세포 감염에 대한 일부 배양물을 브레인 하트 인퓨존 육즙(Brain Heart Infusion broth : Difco, Detroit) 중에서 배양시키는데, 이는 이 배지가 사용된 포유동물 세포에 대한 세균부착을 증간시켰기 때문이다. 모든 배양물을 적당한 배지의 정적 육즙중에서 37℃이하 밤새 배양시키고 성장의 후기 대수기(OD600 은 약 0.4 내지 0.7이다)까지 진탕 육즙내로 아배양 시킨다.
[유전 교환]
바그다사리인 및 티미스(Bagdasarian and Timmis) [참조 : Curr. Top. Microbiol. Immunal. 96 : 47-67 (1981)]의 방법을 사용하여 형질전환을 수행한다. 파아지 P22 HT int -매개된 형질도입을 문헌 [참조 : Schmeiger, Mol. Gen'l Genet. 119 : 75-88 (1972)]에 기술된 바와 같이 수행한다. 판교배 또는 여과기 교배 [참조 : Willetts, Meth. in Microbiol. 17 : 33-58, (1984)]에 의해 접합시킨다.
Figure kpo00009
Figure kpo00010
DNA 조작
문헌[참조 : Birnboin, Meht Enzymol. 100 : 243-255 (1983)]의 방법을 사용하여 대규모이고 신속한 미니용해질 플라스미드 추출법을 수행한다. 표준 방법을 사용하여 염화세슘 밀도구배 원심분리, 서던블럿 하이브리드화, 콜로니 블럿 하이브리디화, 및 겔 전기영동을 수행한다. [r-32P]ATP (Amersham, Arlington Heights, Ill.; 특이적 활성도 = 1445 cir/mmol)으로 DNA를 니크-해독하는 것은 제조자의 지시에 따라서 키트[참조 : The Bethesda Research Laboraotries, Gaithersburg, Md. (BRL) 키트]를 사용한다. 제조자의 지시에 따라 BRL로부터의 효소를 이용하여 제한효소 분해를 수행한다.
에스. 티피뮤륨 100kb 플라스미드를 Tnmini-tet로 표지함
pStLT100을 함유하는 균주 χ 3000을 Tnmini-tet을 가지는 pNK861로 형질전환 시킨다 [참조 : Way et al., Gene 32 : 369-79 (1984)]. Tnmini-tet는 실제로 전환된 반복내에서 Tn10의 Tet.R유전자이다. Fii Tn5를 사용하여 χ 3000(pNK259, Fii Tn5)로부터 부적합한 플라스미드 pNK259 중에 이동시켜 pNK861을 AmpR, TetRχ 3000(pSTLT100, pNK861)의 라이브러리로 제외시킨다. F에 의해 이동되는 100kb 플라스미드내로의 Tnmini-tet 삽입물을 선택하기 위해, χ 3000 Tnmini-tet (pNK259, Fii In5)라이브러리를 TetR, KanR및 StrR에 대해 선택된 이. 콜라이 HB101과 교배시킨다. HB101중의 잠재적 Tn mini-tet-표지된 100kb 플라스미드를 TetR및 NalR에 대해 선택함으로써 에스. 티피뮤륨 균주 χ 3147내로 다시 이동시킨다. Fii Tn5를 갖지 않는 몇몇 NalR, TetR, KanS분리체를 뽑아낸다.
100kb 플라스미드중의 Tn mini-tet 삽입물을 각각의 100kb 플라스미드-함유 야생-형 에스. 티피뮤륨 균주내에 파아지 P22 Ht int-매개된 형질도입에 의해 형질도입시킨다. TetR형질도입체를 증가된 크기의 100kb 플라스미드 및 양친 플라스미드의 제한효소로 부터 이의 변화측면에 대하여 선별한다.
pStLT100 ii Inmini-tet 삽입물을 분리시키는 또 다른 방법은 TetR및 ChiR에 대해 선택하면서 3000 (pStLT100, pNK259)로부터 플라스미드 DNA를 수득하고 이. 콜라이 HB101(pNK259)을 형질전환시키는 것이다.
[Tnmini-tet-표지된 100kb 플라스미드의 에스. 티피뮤륨 치유]
100kb 플라스미드중의 Tnmini-tet 삽임물을 함유한 에스. 티피뮤륨 균주에게 두가지 치유법을 가한다. 즉, 43℃에서 성장시키거나 노보바이오신을 함유한 육즙 중에서 성장시킨다. Tnmini-tet-표지된 균주를 각각의 치유법의 경우에 대해 매일 저 접종물(103내지 104의 콜로니-형성단위[CFU])로 통과시킨다. 배양물이 정체기에 도달된 경우 (OD600은 약 0.9이다), 한 분획을 희석시키고 푸사르산을 함유한 L 한천상에 플레이팅한다. 푸사르산-내성 콜로니를 TetS및 푸사르산-내성체의 플라스미드 함량에 대해 선별시키고, TetS콜로니를 미니용해질 분석법을 이용하여 조사한다. 치유된 유도체를 미니용해질의 서던 블럿 하이브리드화 및32P-표지된 pStSR100과 세균세포와의 집락 블럿 하이브리드화에 의해 추가로 조사하여 염색체 삽입된 플라스미드의 치유 및 결핍을 확증한다.
[마우스 감염]
7주 내지 10주생 암컷 BALB/c 마우스 [Harlan Spragne/Dawley (Indianapolis) and Sasco (St. Louis)]를 모든 동물감염에 관하여 알아보기 위해 사용한다. 먼저 출생한 마우스를 이용하여 복막내 대식세포를 수득한다. 다양한 연령의 숫컷 마우스로부터 표준 마우스 혈청을 수득한다.
경구 접종시, 마우스에게 6시간 동안 음식과 물을 주지않고, 그 다음에 10% (wt/vol) 중탄산 나트륨 50㎕을 공급해주고, 이어서 0.1% (wt/vol) 젤라틴(BSG)을 함유한 완충 염수중에 현탁된 세균 20㎕을 공급해준다. 경구 접종은 경구 점막에 대한 상해를 피하기 위해 앞니(incisor)뒤에 직접 놓여진 미세피펜 팁으로한다. 접종한지 30분후에 마우스에게 음식과 물을 공급한다.
복강내 접종 및 측 꼬리 정맥내 접종시, 굶기지 않은 마우스에게 BSG중에 현탁된 세균 0.1 내지 0.2ml을 주사한다.
감염된 마우스의 기관(organ) 및 조직을 다음과 같이 살모넬라의 존재여부에 관해 조사한다. 마우스를 CO2로 질식시켜 죽인다. 비장을 무균적으로 제거시키고 미세컵(Dupon, Wilmington, Del.)이 부착된 oMNI-혼합기 또는 유리조직 균질기 내에서 2.5ml BSG중에 균질화한다. 피어스 패치를 소장으로부터 제거하고 2ml BSG중에서 와동시켜 2회 세척시킨다. 세정된 피어스패치를 oMNI-혼합기내 또는 유리 비드를 함유한 유리튜브내에서 와동시킴으로써 2.5ml BSG중에서 균질화한다. 장간막 림프 노드를 유리조직 균질기내에서 2.5ml BSG중에서 균질화한다. 조직 및 기관 균질체의 희석물을 적당한 항생제를 함유한 L 한천 판상에 플레이팅한다.
[통계적 방법]
야생형 또는 치유된 에스. 티피뮤륨으로 감염된 마우스의 조직내에서 CFU를 비교하기 위하여, 비례중항을 측정하고 치유된 균주의 CFU 보다 높은 값인 야생형의 CFU에 대하여 1-테일 스튜던츠 t 시험으로 비교한다. 혼합된 감염에 관한 분석의 경우, 각각의 마우스로부터의 야생형 대 플라스미드 치유된 DFU 비의 비례중항을 0 이상의 비의 log 10 평균 (1 이상의 비)에 대하여 1-테일 스튜던츠 t 시험으로 비교한다. 마우스 LD50값은 문헌 [참조 : Reed 및 muenck, Amer. J. Hyg. 27 : 493-497 (1938)]의 방법으로 결정한다. 조직 배양 및 대식세포 감염물중의 세균 CFU를 2-테일 시험에서 평균 CFU/웰의 스튜던츠 t시험으로 비교한다.
[에스. 티피뮤륨 균주중의 100kb 플라스미드 존재]
연구된 에스, 티피뮤륨의 3가지 균주 모든 100kb 플라스미드를 함유하였다(제3도). 덧붙여 χ 3339는 90kb 및 8kb의 두개의 다른 플라스미드를 가진다. 에스. 티피뮤륨의 100kb 플라스미드에 대한 하기 3부분 명칭 시스템을 본 연구에 이용한다. 에스. 티피뮤륨의 혈청형을 동정하기 위하여, 명칭 st가 포함된다. 균주 명칭(LT2에 대go LT, SR-11에 대해 SR 및 LS1344에 대해 SL)이 또한 포함된다. 수치 명칭은 최종적으로 야생형(100) 또는 유도체(특정한 Tmnini-tet 삽입물에 대해서는 101, 등)로서의 플라스미드를 동정한다. 따라서 균주 SR-11의 양생형 플라스미드는 pStSr100이다. 정제된 플라스미드 제형은 제한 효소 분해로 분석하고 Hind III(제4도) 및 Eco RI (데이타는 제시되지 않음)을 함유하는 세가지 균주 모두로부터의 100kb 플라스미드에 대한 동일 프로파일을 수득한다. 100kb 플라스미드-치유된 SL1344, χ 3340(제4도, 레인 f)의 제한효소 분해는 χ 3339(제4도, 레인 e)중에 존재하는 pStLT100 (제4도, 레인 b) 및 pStSR100 (제4도, 레인 c)로부터의 밴드와 상응하는 밴드의 상실을 나타내었다. 따라서, 이들 연구에서 조사된 3가지 에스. 티피뮤륨 균주 각각의 100kb 플라스미드는 매우 유사하지만 동일하지는 않다.
[균주 작제]
문헌 [참조 : Way et al., 상기 문헌]에 기술된 트랜스포존 Tnmini-tet를 사용하여 Tet-내성 포식으로 100kb 플라스미드를 표지시킨다. Tn10 유도체인 Tn mini-tet는 전환된 반복내에서 IS10 트랜스포사제 유전자를 갖지 않으므로 트랜스포사제 유전자는 공여 플라스미드, pNK861로부터의 위치 이동시 상실되고, 연속적으로 Inmini-tet의 위치이동 또는 결실을 매개할 수 없다. 따라서, Tnmini-tet 삽입물은 양친인 Tn10의 삽입물 보다 훨씬 더 안정하다.
Tnmini-tet를 균주 3000의 100kb 플라스미디내에 삽입시킨 결과 pStLT101이 생성되고, 이로써 χ 3344를 생성하는 노보바이오신 중에서의 성장 또는 43℃하에서의 성장을 수행하면서 10-6내지 10-7세포-1생성-1의 빈도를 갖는 100kb 플라스미드의 치유된 유도체를 선택할 수 있다. 그 다음 이와 동일한 Tnmini-tet 삽입물을 χ 3339 및 χ 3306 내에 형질도입 시키고 각각 χ 3340 및 χ 3337을 생성하는 그의 100kb 플라스미드의 상기 균주를 치유하기 위해 사용한다. χ 3340은 90kb 및 8kb 플라스미드를 보유한다(제3도, 레인 h). 맑은 용해질로부터 플라스미드 DNA를 겔-전기영동시키고 (제3도) 서던 블럿 중의 미니용해질을 하이브리드화시켜 100kb 플라스미드의 치유를 확증하고 세균을 콜로니 블럿 중에서32P-표지된 pStSR100 (데이타는 제시되지 않음)으로 유지시킨다. 치유된 유도체의 콜로니 블럿에서 하이브리드화가 일어나지 않는 것은 염색체 삽입된 플라스미드가 존재하지 않음을 지시하여 준다. 삽입된 플라스미드를 갖는 어떠한 플라스미드-치유된 유도체도 관찰되지 않았다.
χ 3000 및 χ 3306의 Tnmini-tet-표지된 플라스미드, pStLt101 및 pStSr101을 형질전환시켜 치료된 유도체내에 재도입하여 각각 χ 3347 및 χ 3338을 생성한다. pStSr101을 χ 3340내로 형질전환시켜 χ 3351을 생성한다(표3, 제3도, 레인 i).
[마우스-병원성]
야생형, 치유된 유도체 및 재형질 전환된 유도체 각각의 BALB/c 마우스 중에서의 경구 LD50값을 결정한다 (표11). 마우스-통과된 χ 3306 및 χ 3339의 경구 LD50값은 각각 3 × 105CFU 및 6 × 104CFU이고, χ 3000의 경구 LD50값은 108CFU 미만이다. 각각의 치유된 유도체의 경구 LD50값은 108CFU 미만이다. χ 3337 및 χ 3340이 감염된 마우스는 아프기 시작하고, 간헐적인 사망도 관찰되었다. 100kb 플라스미드-재형질전환된 유도체의 LD50값은 양친 야생-형 균주의 LD50값으로 되돌아왔다. 이로써 치유된 유도체의 유전장애는 사실상, 100kb 플라스미드의 상실로 인한 것이었음이 확증되었다.
Figure kpo00011
야생형 및 치유된 유도체의 복강내 LD50값은 경구 LD50값이 상이하지 않다 (표 11). X 3306 및 X 3339의 복강내 LD50값은 50 CFU미만이고, 이들 각각의 접종물이 접종된 경우 100% 사망율을 나타낸다. X 3306, X 3337의 치유된 유도체는 또한 50CFU 미만이 주사된 대부분의 마우스를 사망시켰다. 그러나 평균 사망기간은 X 3306의 평균 사망시간(7일)과 비교해서 X 3337의 경우가 더 길었다 (12, 3일). (p0.001, 1-테일 스튜던츠 시험). 이와는 달리, 100kb 플라스미드-치유된 LS1344, X 3340의 복강내 LD50값은 50미만 CFU에서 400CFU로 증가되었다. Tnmini-tet 표지된 100kb 플라스미드를 X 3340내에 재도입시켜 야생형 복강내 LD50값을 보유하였다. 야생형 및 치료된 LT 2 균주에 대한 복강내 LD50값은 약 2000CFU이다.
균주 SR-11과 LT2의 플라스미드 교환 효과
균주 LT2는 경구 경로서 균주 SR-11 보다 훨씬 덜한 병원체이다(표 11). 이들 두 균주의 100kb 플라스미드가 이와 같이 상이한 병원성을 나타내는 것에 있어서 역할을 했는지에 관해서 결정하기 위해, 100kb 플라스미드 각각의 Tnmini-tet 유도체를 이종 치유된 균주내에 형질전환시킨다. pStLT101 또는 pStSR101을 갖는 균주 SR-11 109CFU로 경구 감염된 마우스는 접종된지 7일만에 사망하였지만, 상기 두 플라스미드를 갖는 균주 LT2는 무병원체이다(109CFU 경구 접종). 따라서, 균주 LT2의 무병원성은 이의 100kb 플라스미드의 결손으로 인한 것이 아니다. 이 결과는, ST-11 플라스미드, pStSR101을 병원체 X 3351을 생성하는 균주 SL1344내에 도입시켜 수득된 결과에 덧붙여, 상기 세가지 균주의 100kb 플라스미드가 작용적으로 동일함을 입증해 준다.
경구 접종후의 병인론
복강내 경로에 대한 경구 경로에 의한 야생형과 치유된 유도체 사이의 병원성이 더욱 특히 상이한 것은 100kb 플라스미드가 침입성 질병의 후기 단계 과정 대신 구트의 병원성에 포함될 가능성을 증가시킨다. 이러한 가능성을 조사하기 위하여, 마우스를 야생형 SR-11, X 3306 또는 100kb 플라스미드-치료된 SR-11, X 3337으로 경구 감염시키고, 피어스 패치 및 비장을 감염-후 여러가지 시각에서 에스.티피뮤륨에 대해 조사한다. 세가지 실험에 관한 종합적인 결과를 제5도에 나타내었다. 감염된지 3시간후, 매우 적은 에스. 티피뮤륨이 피어스 패치에서 검출되었다(100CFU). 이러한 결과는 실질적으로 접종액의 100%가 내장, 주로 대장의 내용물로부터 접종후 2시간 내에 회수되었으므로 접종액이 구강으로부터 장으로 불충분하게 통과된 결과는 아니다. 추가로, 접종후 3일까지는 소장 내용물중의 야생형 및 치유된 SR-11간의 CFU는 동일하였다. 접종주 1일 및 2일째되는날, 피어스 팻치중의 CFU는 103내지 104개의 CFU로 점차 증가하였으며, 비장내 CFU는 낮은 상태로 존재한다. 접종후 3일째 되는날, 피어스 팻치 및 비장은 치유된 X 3337 보다 상당히 많은 야생형 X 3306을 함유하였다. 피어스 팻치에서 발견되는 CFU와의 차이점은 상이한 실험에서는 일관되게 관찰되지 않으며 다른 시간에 대한 데이타로 표시하는 경우 일시적이라는 점이다. 그러나, 비장내 CFU는 접종후 8일까지 사멸한 X 3306으로 마우스를 감염시킬때까지 양의 증가에 있어서 X 3306이 X 3337 보다 많음으로써 상당히 상이하게 존재한다. 비장내 X 3337은 104CFU상의 수준에 도달하며 비장내에서 접종한지 25일 정도 탐지가능하다. 즉, 경구 접종후 야생형과 병원성 플라스미드-치유된 살모넬라 티피뮤륨 SR-11간의 병원성에 있어서의 기본적인 차이는 비장에 도달하는 살모넬라 티피뮤륨의 수 및/또는 비장내 증식수이다.
야생형 및 플라스미드-치유된 SR-11의 상대적인 병원성을 더욱 정확히 비교하기 위하여, TetR, 야생형 SR-11, X 3456, 및 NalR, 플라스미드-치유된 SR-11, X 3337를 사용하여 혼합 감염 실험을 하였다. 각각의 마우스에 대한 야생형 CFU 대 플라스미드-치유된 CFU의 비를 측정하였다. 또한, 피어스 팻치로부터 비장으로의 침투 과정에 있어서의 중간 지역인 장간막 임파선에 대한 CFU의 비를 측정하였다. 비의 기하학적 분석법을 사용하여 CFU의 광범위한 범위 및 개개의 마우스간의 비를 측정하였다. 3가지 실험의 합성 결과를 제6도에 나타냈다. 야생형 또는 플라스미드-치유된 살모넬라 티피뮤륨으로 감염시킨 마우스를 사용한 실험에서 관찰된 바와 같이(제5도), 접종한지 3일후 피어스 팻치, 장간막 임파선, 및 비장내의 야생형 대 치유형의 비가 각각 11:1, 200:1, 및 79:1이 될 때까지 혼합 감염된 마우스의 피어스 팻치 또는 비장중의 CFU에 있어서 어떠한 심각한 차이점도 탐지되지 않는다. 접종후 4일째 되는 날에, 비장에 대한 비만이 1.0(비율 : 160:1) 이상으로 상당히 증가하는 반면, 피어스 팻치 및 장간막 임파선은 각각 1.5:1 및 13:1의 비였다. 개별 감염시킨 마우스에서 관찰되는 바와 같이, 접종후 3일째에 관찰되는 일시적인 차이후에 야생형 및 치유된 SR-11에 대한 피어스 팻치중의 CFU는 다시 거의 같아졌다. 접종후 5일째에, 장간막 임파선 및 비장은 각각 200:1 및 1600:1의 비였고, 피어스 팻치는 1.1:1의 비였다. 접종후 7일째에, 생존한 단일 마우스의 피어스 팻치, 장간막 임파선, 및 비장의 비는 각각 2.1:1, 290:1, 및 210:1이었다. 여러 기관중에서 발견되는 CFU에 있어서의 가장 큰 차이는 피어스 팻치에 상대적으로 비장 및 장간막 임파선에서 관찰된다. 접종후 3, 4, 및 5일째에서, 비장의 비는 피어스 팻치의 비보다 상당히 컸으며, 접종후 3 및 5일째에서 장간막 임파선 비는 피어스 팻치의 비보다 상당히 컸다(제6도).
야생형 SL1344, X 3339, 및 100kb 플라스미드-치유된 SL1344, X 3340의 병원성을 경구 감염시킨 마우스에서 검사하였다. 두 실험 결과를 제7도에 나타냈다. 접종후 3일째에서, 야생형 및 치유된 SL 1344간의 피어스 팻치, 장간막 임파선, 또는 비장내 CFU에 있어서 심각한 차이점은 관찰되지 않았다. 접종후 7일 및 8일에서, 세 기관 모두에서 야생형 X 3330가 치유된 X 3340보다 상당수 증가하였음이 탐지되었다. 더 큰 차이점은 피어스 팻치에서 보다는 장간막 임파선 및 비장에서 관찰되었다. 추가로, 실험중 하나에서, 피어스 팻치 내 CFU에 있어서의 차이는 별로 의미가 없었다. 즉, 장간막 임파선 및 비장의 감염은 야생형 및 100kb 플라스미드-치유된 SL 1344간의 병원성에 있어서의 주요한 차이점을 보여준다. 접종후 14일까지, 야생형 X 3339로 감염시킨 모든 마우스는 사망하는 반면에, 치유된 X 3340으로 감염된 마우스의 피어스 팻치 및 비장은 각각 2×103CFU 및 6.3×103CFU로 감염되었다. 접종후 31일째에서, 3340으로 감염된 마우스의 피어스 팻치 및 비장은 각각 400CFU 및 320CFU를 함유한다. 즉, 100kb 플라스미드-치유된 SL 1344는 경구 접종후 연장된 기간동안 피어스 팻치 및 비장 내에 생존한다.
정맥내 접종후 비장의 감염
상기 기술된 결과는 100kb 플라스미드가 피어스 팻치의 감염 또는 초기의 과정에 관여하는 대신, 경구 접종후 피어스 팻치로부터 장간막 임파선으로의 침투에 주로 관여함을 나타낸다. 비장내 살모넬라 티피뮤륨의 성장을 조사하기 위하여, 마우스를 야생형 SR-11, X 3456, 및 플라스미드 치유된 SR-11, X-3337의 혼합물로 정맥내 접종하고, 비장의 CFU를 모니터링 한다(표 12). 마우스를 X 3456 및 X 3337의 105CFU로 정맥내 접종하고, 균주를 접종한지 1시간 후 비장으로 균일하게 제거한다. 즉, 100kb 플라스미드의 존재는 혈액으로부터의 제거에 영향을 주지 않는다. 다른 마우스를 X 3456 및 X 3337의 혼합물의 1×103내지 4×103CFU로 정맥내 접종시킨다. 접종 4일후 비장내 CFU에서 어떠한 심각한 차이도 탐지되지 않았다(표 12). 그러나, 접종 6 및 7일, 비장으로부터 회수된 야생형 대 치유된 살모넬라 티피뮤륨의 비는 11.5:1이었다. 이때, 비장내 X 3456 및 X 3337의 평균 수준은 각각 2.7×106및 2.3×105CFU였다. 즉, 플라스미드-치유된 SR-11은 정맥내 접종후 연장된 기간동안 비장내에서 생존하고 복제하였다. 비장내 경구 접종 5일 및 7일후 수득한 1600:1 및 210:1과는 판이하게 ST-11에 대한 야생형 대 치유형의 비는 정맥내 주사 1주후 11.5:1이었다. 접종한지 5일후에, X 3337 단독의 2×103CFU 또는 동량의 X 3456과 혼합한 X 3337로 감염된 마우스는 X 3337에 대해서 2.3×105CFU의 평균 비장 수준이었으므로 혼합 정맥내 접종으로 수득한 낮은 비는 X 3456 및 X 3337 간의 상조 현상에 기인하는 것은 아니다.
Figure kpo00012
a : 마우스를 야생형 X 3456 및 100kb 플라스미드-치유된 3337의 동량 혼합물로 정맥내 접종시킴. n은 3 내지 5마리의 마우스이다.
b : 접종물은 각각 5×105CFU의 X 3456 및 X 3337이다.
c : 접종물은 각각 1×104내지 4×104CFU의 X 3456 및 X 3337이다(각각의 실험에서 동량의 접종물을 사용하였다).
d : 비장으로부터의 CFU의 비례중앙
e : 접종후 6일에, 2×103CFU의 X 3337로 감염시킨 마우스는 X 3337을 단지 2.3×105CFU의 비장 수준으로 지닌다.
f : X 3456 : X 3337의 비례중앙의 비(1-테일드 스튜던츠 t 시험에서 P값은 1:1의 비보다 크다).
g : 통계적 분석에 사용된 평균 log10비값 ±표준편차. 플라스미드-치유된 에쉬티피뮤륨은 P.O. 접종후 피어스 패치에서 증식하여 장간막 림프절 및 비장에 도달한다(제5도, 6도, 7도). 그러나, 장간막 림프절 및 비장을 침입하는 야생형 대 플라스미드-치유된 에스. 티피뮤륨의 능력차이는 일정하게 관측되었다. 또한 마우스의 P.O. 접종후 비장 감염의 효율은 야생형 에스. 티피뮤륨이 높다는 것이 관측되었다(야생형 대 치유된 것의 비 1600:1, 제6도). 그러나, 치유된 유도체는 104CFU의 높은 정도로 비장에 도달하며 감염후 31일 동안 비장에서 검정 가능하다(제5도). 야생형 및 치유된 SR-11의 혼합물로 접종 후, 야생형 대 치유된 SR-11의 상당한 높은 값의 비가 피어스 패치와 비교시 비장 및 장간막 림프절에서 관측되었다(제6도).
플라스미드-치유된 SR-11 및 LS1344의 복강내 LD는 각각 50CFU 초과 및 400CFU로서, 이는 100kb 플라스미드-치유된 에스.티피뮤륨이 이러한 경로의 접종에 의해 상당한 병원성을 지닌다는 것을 나타낸다(표 11). 치유된 균주는32P-표지된 병원성 플라스미드는 하이브드화하지 못하므로 병원성을 나타내게 할 수 있는 플라스미드의 염색체내 통합된 복제물의 존재를 배제시켜야 한다는 것을 주목해야 한다. 정맥내 접종 후 비장을 감염시키는 야생형 및 치유된 균주의 능력을 조사하여, 야생형 및 치유된 에스. 티피뮤륨의 혼합물(야생형 대 치유된 것의 평균 비 7.5:1 및 20:1)로 정맥내 접종시킨지 1주일 후에 비장의 CFU에 상당한 차이가 관측되었다. 정맥내 접종후 비장 CFU의 차이는 P.O. 접종후 5 내지 7일에 수득된 것과 같이 크지 않다(1600:1-배 및 210:1-배). 이들 실험은 또한 플라스미드-치유된 에스.티피뮤륨이 비장에 고수준으로 도달하여 증식할 수 있으며 병원성 유발에 있어 100kb 플라스미드의 효과는 P.O. 접종후에 가장 크다는 것을 증명한다. 본 발명가는 세균을 세포외적으로 즉시 증식하며 복강내에서 효과적으로 식균되지 않으므로 100kb 플라스미드-치유된 에스.티피뮤륨이 복강내 경로를 통해 병원성을 보유하며, 따라서 마우스를 대식 세포에 대한 세균의 제거로 감염을 체크할 수 있기 이전에 감염이 압도적으로 전개된다고 가정한다. P.O. 경로를 통하여 투여시, 침입하는 세균 모두 또는 대부분이 장간막 림프절에 도달시 세포내에 있을 것으로 추정된다.

Claims (15)

  1. 아데닐레이트 사이클라제를 암호화하는 유전자와 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 장내 병원성 세균의 무병원성 유도체가 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 생성할 수 없도록 상기 아데닐레이트 사이클라제를 암호화하는 유전자와 상기 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 암호화하는 유전자에 돌연변이를 갖는 상기 장내 병원성 세균의 살아있는 무병원성 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 장내 병원성 세균에 대한 척추동물 또는 무척추동물의 면역용 백신.
  2. 제1항에 있어서, 무병원성 유도체가, 척추동물 또는 무척추동물 체내에서 병원체에 대한 면역반응을 유도하는 항원을 생성하는 척추동물 또는 무척추동물의 병원체로부터 유도된 재조합 유전자를 발현하는 백신.
  3. 제2항에 있어서, 재조합 유전자가 약리학적 활성 생성물을 암호화하는 백신.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세균이 쉬겔라(Shigella), 어위니아(Erwinia), 예시니아(Yersinia), 파스터렐라(Pasteurella), 레기오넬라(Legionella) 또는 브루셀라(Brucella)인 백신.
  5. 제1항에 있어서, 세균이 척추동물의 림프상피 구조에 착지하거나 무척추동물을 감염시키는 종(species)인 백신.
  6. 제5항에 있어서, 세균이 살모넬라(Salmonella) 균주 또는 살모넬라-에세리키아(Salmonella-Escherichia) 하이브리드 균주인 백신.
  7. 제6항에 있어서, 세균이 에스. 티피뮤륨(S. typhimurium), 에스. 타이피(S. typhi), 에스, 파라타이피(S. paratyphi), 에스, 갈리나륨(S. gallinarum), 에스, 엔테리티디스(S. enteritidis), 에스. 두블린(S. dublin), 에스. 콜레래슈스(S. choleraesuis) 및 에스. 아리조나(S. arizona)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 백신.
  8. 제7항에 있어서, 세균이 X4062(ATCC 53647) 및 X4064(ATCC 53648) 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 유도체 균주인 백신.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 병원체가 비루스, 세균, 원생동물, 기생충 또는 진균인 백신.
  10. 제9항에 있어서, 병원체가 나이제리아 고로래애(Neisseria gonorrhoeae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 미코박테륨 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테륨 레프래(Mycobacterium leprae), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 파이오젠스(Streptococcus pyogenes), 트레폰마 팔라듐(Treponma palladium), 나이제리아 마닌기티디스(Neisseria maningitidis), 미코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔재(Hemophilus influenzae), 보데텔라 퍼튜시스(Bordetella pertussis), 보데텔라 아븀(Bordetella avium), 에세리키아 콜라이(Escher ichiacoli), 또는 스트렙토코커스 이퀴(Streptococcus equi)인 백신.
  11. 척추동물 또는 무척추동물 체내의 면역반응을 억제하거나, 조절하거나, 강화시키는 생성물을 생성하는, 척추동물 또는 무척추동물 숙주로부터 유도된 재조합 유전자를 발현하며 ; 아데닐레이트 사이클라제를 암호화하는 유전자 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 장내 병원성 세균의 무병원성 유도체가 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 생성할 수 없도록 상기 아데닐레이트 사이클라제를 암호화하는 유전자와 상기 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 암호화하는 유전자에 돌연변이를 갖는, 상기 장내 병원성 세균의 살아 있는 무병원성 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 척추동물 또는 무척추동물 숙주단백질을 합성하기 위한 담체 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 장내 병원성 세균이 척추동물의 림프 상피조직에 착지하며 살모넬라(Salmonella) 균주 또는 살모넬라-에세리키아(Salmonella-Escherichia) 하이브리드 균주인 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 장내 병원성 세균이 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella typhimurium)인 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 세균이 X4062(ATCC 53647) 또는 X4064(ATCC 53648) 및 이들의 유도체인 미생물.
  15. 재조합 DNA 기술 또는 트랜스포존 돌연변이 유발방법을 사용하여 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 암호화하는 각각의 유전자에 돌연변이가 형성되도록 장내 병원성 세균을 돌연변이시키고, 이 장내 병원성 세균의 무병원성 유도체를 분리함을 특징으로 하는, 작용성 아데닐레이트 사이클라제 및 사이클릭 AMP 수용체 단백질을 생성할 수 없는 장내 병원성 세균의 무병원성 유도체를 생성하는 방법.
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