MXPA00011075A - Mutantes atenuados de salmonella que constitutivamente expresan el antigeno vi.. - Google Patents

Abstract

Se describen mutantes de Salmonella atenuados, los cuales constitutivamente expresan en antigeno Vi, asi como vacunas contra fiebre tifoidea que los contiene, vacunas de vector vivo que los contienen y vacunas medidas por ADN que los contiene.

Description

MUTANTES ATENUADOS DE SALMONELLA QUE CONSTITUTIVAMENTE EXPRESAN EL ANTIGENO Vi El desarrollo de la presente invención fue apoyado por la Universidad de Maryland, Baltimore, Maryland y fue respaldada por National Institutes of Health bajo los números de contrato AI29471, AI36525, AI40261, y AI45251. El gobierno de los Estados Unidos tiene una licencia pagada, irrevocable, no exclusiva para practicar o haber practicado o a favor de los Estados Unidos la invención de la presente según provista por los términos de los contratos anteriormente mencionados concedidos por el gobierno de Estados Unidos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a mutantes atenuados de Salmonella, los cuales constitutivamente expresan el antígeno Vi, así como vacunas como fiebre tifoidea que los contienen, vacunas de vector vivo conteniendo los mismos, y vacunas mediadas por ADN conteniendo los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN I. El Antiqeno Vi El antígeno Vi, un polisacárido capsular primero fue descrito por Félix y otros, Lancet, 227:186-191 (1934). Este polisacárido capsular está presente en Salmonella tal como S. typhi, S. paratyphi C, y S. dublin, así como en Critobacter freundii. Estructuralmente, el antígeno Vi es un polímero lineal de ácido ß-4,2-desoxi-2N-acetilgalacturónico con O-acetilación variable (Daniels y otros, Infect. Immun., 57:3159-3164 (1989)). Su presencia en S. typhi ha sido correlacionada, in vitro, con una reducción importante en lisis por suero, activación de complemento y fagocitosis (Looney y otros, J. Lab. Clin. Med., 108:506-516 )1986)). De esta manera, el antígeno Vi puede actuar como un escudo que protege S. typhi contra el sistema inmune.

A. La región cromosómica viaB y la regulación de la expresión del antígeno Vi. Para la expresión del antígeno Vi, se cree que son necesarios tres sitios cromosómicos ampliamente separados, viaA, viaB, y ompB, (Johnson y otros, J. Bacteriol., £0:302-308 (1965); y Snellings y otros, J. Bacteriol., 145:1010-1017 (1981). De estos, el sitio viaB siempre se encuentra en cepas positivas de antígeno Vi, y se cree que contiene los genes que codifican las enzimas necesarias para la síntesis de Vi (Hashimoto y otros, J. Bacteriol., 175:4456-4465 (1993); y Virlogeux y otros, Microbiol., 141:3039-3047 (1995). El sitio viaB consiste de 5 marcos de lectura abiertos (ORF) (Figura 1A), de los cuales los genes vipA y vipB codifican las enzimas que sintetizan el azúcar de nucleótido del polisacárido Vi, y los cinco genes vex (vexA-E) se cree que son responsables de la translocación del antígeno Vi (Hashimoto y otros (1993), supra). El primer ORF de la región viaB, es decir, vipR (Figura 1A), es un regulador transcripcional positivo para su propia expresión, así como para la expresión de vipA, vipB, orf4, vipC, y tal vez otros genes corriente abajo de vipR (Hashimoto y otros, J. Bacteriol., 178: 1430-1436 (1996)). Además, el promotor arriba de vipR también controla la transcripción de (por lo menos) vipA y vipB (que codifica unidades estructurales del antígeno Vi), formando un operón dentro de la región viaB. Otra región cromosómica, el operón ompB, que contiene los genes ompR-envZ, juega un papel importante en la expresión del antígeno Vi como un regulador transcripcional de viaB (Pickard y otros, Infect. Immun., 62_:3984-3993 (1994)). La región ompR-envZ forma parte de la respuesta adaptativa de E. coli a condiciones de alta osmolaridad. En S. typhi, el antígeno Vi es osmóticamente regulado y ompR es necesario para su expresión (Pickard y otros, supra).

B. Relación entre la exposición del antígeno Vi e inmunoprotección. El polisacárido capsular Vi de S. typhi es un factor de virulencia y un antígeno protector en seres humanos (Félix y otros (1934), supra). El polisacárido Vi purificado es una vacuna de tifoidea parenteral con licencia que produce un grado moderado de inmunidad protectora después de la inoculación después de la dosis, y la protección es mediada a través de anticuerpos IgG en el suero (Acharya y otros, New England Journal of Medicine, 317: 1101 -1104 (1987); y Klugman y otros, Lancet, 2: 1165-1169 (1987)). En contraste, mientras que la cepa Ty21a de S. typhi atenuada, una vacuna oral viva con licencia, no expresa el antígeno Vi, ni produce anticuerpo Vi en el cuerpo; sin embargo, Ty21a confiere por lo menos niveles moderados de protección (Wahdan y otros, J. Infect. Dis., 145:292-296 (1982); y Levine y otros, Lancet, 1:1049-1052 (1987a)). Se cree que los mecanismos inmunes mediados por células median la protección en esta situación. Varias nuevas cepas atenuadas de S. typhi que expresan el antígeno Vi in vitro han fallado para producir anticuerpos Vi en el suero cuando se administran como vacunas orales, aunque producen altas titulaciones de los anticuerpos O y H (Tacket y otros, J. Infecí. Dis., 163:901-904 (1991); Tacket y otros, Vaccine, 1_0:443-446 (1992a); y Tacket y otros, Infect. Immun., 65_:452-456 (1997)). Probablemente la explicación para este fenómeno es que la expresión del antígeno Vi es altamente regulada con relación a los estímulos osmóticos (Pickard y otros, supra). La suposición es que la expresión del antígeno Vi es interrumpida, excepto cuando las bacterias son extracelulares en la sangre u otros fluidos del cuerpo (por ejemplo, bilis). Se postuló en la presente invención que si la expresión del antígeno se hace constitutiva, esto podría dar como resultado la estimulación de anticuerpos Vi de IgG en el suero, mejorando así toda la protección contra la fiebre tifoidea. También se postuló en la presente invención, que la expresión constitutiva podría mejorar las respuestas inmunes a antígenos extraños expresados por vacunas de vector vivas de Salmonella atenuadas y vacunas mediadas por ADN. ll. Poblaciones Objetivo De Fiebre Tifoidea. La fiebre tifoidea es extremadamente no común en países industrializados modernos, en donde las poblaciones tienen acceso a suministros de agua bacteriológicamente verificados, tratados, y saneamiento que remueve el desperdicio fecal humano. En contraste, en países menos desarrollados, entre poblaciones que carecen de dichas comodidades, la fiebre tifoidea por lo general es endémica, y desde el punto de vista de salud pública, típicamente constituye el problema de enfermedad entérica más importante de niños en edad escolar (Levine y otros, Pediatr. Infect. Dis. J., 8:374-381 (1989a)). La supervisión clínica sistemática epidemiológica y bacteriológica para fiebre tifoidea con relación a ensayos de campo de vacunas candidato ha establecido, con gran exactitud, la incidencia de fiebre tifoidea en muchas poblaciones (Levine y otros, Lancet, 336:891-894 (1990); Black y otros, Vaccine, 8_:81-84 (1990); Levine y otros (1987a), supra; Ferreccio y otros, J. Infect. Dis., 159:776-769 (1989); y Simunjuntak y otros, Lancet, 338:1055-1059 (1991)). Las escalas de incidencia reveladas fueron mucho mayores que las pronosticadas, con base a la supervisión no sistemática. Las observaciones sistemáticas también demostraron una frecuencia sorprendente de infección tifoidea bacterémica aún clínicamente moderada entre niños y bebés en áreas endémicas (Ferreccio y otros, J. Pediatr., 104:899-901 (1984)). Además de los niños en edad escolar en países menos desarrollados, dos poblaciones en riesgo incrementado en fiebre tifoidea son los viajeros y microbiólogos clínicos. Entre los viajeros de Estados Unidos, el riesgo es más alto en países a lo largo de la costa Sur del Pacífico, y en el subcontinente de la India (Ryan y otros, Rev. Infect. Dis., 1_1_:1-8 (1989); y Mathieu y otros, Arch. Intern. Med., 154:1713-1718 (1994)). Además. Los microbiólogos clínicos, incluyendo aquellos en países industrializados, tienen una exposición incrementada a Salmonella typhi en el ambiente de trabajo, y , por lo tanto, constituyen un grupo de alto riesgo (Blaser y otros, J. Clin. Microbiol., 13:855-858 (1981)). lll. Cepas de S. tvphi multi-resistentes. Desde aproximadamente 1990, empezaron a aparecer en el Este Medio, África del Norte y el Sur y Sureste de Asia casos esporádicos y brotes localizados de fiebre tifoidea. Estos brotes son causados por cepas de S. typhi que codifican resistencia mediada por plásmido para piretroprima/sulfametoxasol, así como resistencia a cloranfenicol/Gupta y otros, Pediatr. Infect. Dis., 13: 124-140 (1990)). La terapia contradicha cepas requiere el uso de antibióticos de quinolona, tales como ciprofloxasina oral, o cefalosporinas de tercera generación tales como ceftriaxona parenteral. Estos antibióticos son muy costosos para países en desarrollo. En contraste con cepas resistentes a antibióticos previas que causaron casos esporádicos o epidemias extendidas, como en México de 1972-1973 (Olarte y otros, Antimicrob. Agents Chemoter., 4:597-601 (1973)); y en Perú desde 1979-1981 (Goldstein y otros, J. Infect. Dis., 2_:261-266 (1986)), y que finalmente desaparecieron por ser reemplazadas una vez más por cepas sensibles, las cepas S. typhi resistentes a antibióticos múltiples que aparecieron en el Este Medio y en Subcontinente de la India en 1990 siguen siendo las cepas dominantes en aquellas áreas. Además. Estas cepas resistentes a antibióticos múltiples se han extendido ampliamente, y prevalecen en el Noreste de África (Mikhail y otros, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 8.3:120 (1989)), y Sureste de Asia (Vinh y otros, Antimicrob. Agents Chemoter., 40.:958-961 (1996)). Parece que S. typhi manifiesta resistencia a múltiples antibióticos previamente útiles aquí puede permanecer. De esta manera, la fiebre tifoidea ya no es más una enfermedad que pueda ser simplemente y no costosamente tratada con antibióticos orales. Además, las autoridades de la salud ya no basan más los programas de control de tifoidea en tratamiento temprano de la enfermedad. Las complicaciones de fiebre tifoidea y las muertes se encuentran en incremento, debido a la terapia antibiótica retrasada o inadecuada, inapropiada (Singh, Indian Pediatr., 28_:329-332 (1991); Bhutta, Ann. Trop'. Pediatr., 1_6:299-306 (1996); y Gupta, supra). De esta manera, la diseminación de estas cepas de S. typhi resistentes a antibióticos, múltiples constituye una crisis creciente de la salud pública en muchos países menos desarrollados, y tiene un interés pronunciado en el interés de vacunas mejoradas para tifoidea orales. También se deben considerar las inmunoprofilaxis para niños de alta incidencia, particularmente en donde las cepas de S. typhi son resistentes a los antibióticos múltiples, así como para viajeros y para microbiólogos clínicos.

IV. Primeras vacunas contra fiebre tifoidea. A. Vacunas de célula entera parenterales, inactivadas. La vacuna de célula entera, conservada con fenol, inactivada con calor desarrollada a finales del siglo 19 (Wright y otros, Br. Med. J., 1:256-258 (1897); y Pfeiffer y otros, Dtsch. Med. Wochescr. 22_:735-737 (1896)) fue mostrada, en ensayos de campo controlados, aleatorizados patrocinados por World Health Organization en 1960, para conferir niveles moderados de protección (eficacia de la vacuna 51-67%) que perduraron hasta siete años (Ashcroft y otros, Am. J. Hyg., 7 :196-206 (1964); Ashcroft y otros, Lancet, 2:1056-1060 (1967); Yugoslav Typhoid Commission, Bull. WHO, 30:623-630 (1964); y Hejfec, Bull. WHO, 34:321-339 (1966)). Sin embargo, esta es una vacuna claramente no satisfactoria ya que ocasiona reacciones adversas a una frecuencia inaceptablemente alta, y, por lo tanto, nunca se volvió una herramienta de salud pública popular (Levine, Typhoid Fever Vaccines, In: Vaccines, 2n . De., Plotkin y otros, Philadelphia, PA, W.B. Saunders (1994)). En ensayos controlados, aproximadamente 25% de los receptores de la vacuna de célula entera conservada con fenol, inactivada con calor desarrollan fiebre y reacciones sistémicas, y aproximadamente el 15% tienden a ausentarse del trabajo o la escuela después de la vacunación (Ashcroft y otros (1964), supra; Yugoslav Typhoid Commission (1964); supra; y Hejfec, supra). Por esta razón, esta vacuna enormemente ha sido reemplazada por dos vacunas recientemente autorizadas, la cepa Ty21a de vacuna oral viva (VivotifR), y la vacuna de polisacárido Vi purificada, parenteral (TyphiViM ) (Levine y otros (1989a), supra. Estas dos vacunas más nuevas confieren protección comparable con la vacuna de célula entera antes mencionada, pero son muy bien toleradas.

B. Vacuna de Polisacárido Vi Parenteral. Como se discutió anteriormente, a mediados de 1930, el antígeno Vi, una cápsula de polisacárido sobre S. typhi, fue descubierto (Félix y otros (1934), supra). También se mostró que este antígeno está presente en la gran mayoría de cepas aisladas de la sangre de pacientes con fiebre tifoidea y es un factor de virulencia de S. typhi en ratones; su presencia protege al antígeno O de aglutinación por el antisuero O (Félix y otros, J. Hyg. Cambridge, 49.:92-109 (1951); y Félix y otros, J. Hyg., 35.:421-427 (1935)). Se propuso que el anticuerpo Vi jugaba un papel importante en la protección contra fiebre tifoidea y se sugirió que la vacuna de tifoidea parenteral de célula entera, inactivada con fenol fuera reemplazada con vacunas parenterales de célula entera inactivadas con alcohol. La racionalidad de esta propuesta fue que el último antígeno Vi conservado mejor, y dio titulaciones más altas del anticuerpo Vi en animales y en seres humanos (Félix, BMJ; 1:391-395 (1941)). Sin embargo, en un ensayo de campo controlado aleatorizado en Yugoslavia, la vacuna parenteral de célula entera, inactivada con fenol y con calor fue significativamente más protectora que una vacuna inactivada con alcohol (Yugoslav Typhoid Commission, Bull. WHO, 26.:357-369 (1962)). Sin embargo, utilizando la misma racionalidad, se propuso una vacuna de tifoidea parenteral de célula entera inactivada con acetona (Landy y otros, Am. J. Public Health, 4_4:1572-1579 (1954)). En dos ensayos de campo independientes realizados en la década de 1960 en Guyana y Yugoslavia, la vacuna inactivada con acetona confirió protección superior que la vacuna ¡nactivada con calor y fenol (Yugoslav Typhoid Commission (1962), supra). Se argumentó que la superioridad de la vacuna inactivada con acetona se debió a una mejor conservación del antígeno Vi (Wong y otros, J. Infect. Dis., 125:360-366 (1972)), o a titulaciones más altas del anticuerpo contra el antígeno H obtenidas con esa vacuna. Se realizó un avance crucial purificando el antígeno Vi a través de una técnica sin desnaturalización (Levine y otros, Infecí. Immun., 12:1290-1294 (1975); y Robbins y otros, J. Infecí. Dis., 150:436-449 (1984)). La ¡nmunogenicidad de dos loíes de aníígeno Vi no desnaluralizados preparados en el Naíional Insíiíuíes of Healíh (Befhesda, Maryland) y en el Insíiíule Merieux, (Lyon, Francia) fue evaluada (Tackeí, Vaccine, 6_:307-308 (1988)). Ambos loíes produjeron alias íiíulaciones del aníicuerpo Vi en aproximadameníe 90% de los receplores. Además, se moslró que los aníicuerpos Vi generados por las vacunas persisíieron durante por los menos tres años (Tackeí y oíros (1988), supra). Se mostraron niveles del anticuerpo Vi ¡guales a aquellos producidos por la vacuna Vi purificada parenteral por naturaleza solameníe en porladores de íifoidea crónica. En conírasíe, la mayoría de los pacieníes convalecieníes de fiebre lifoidea no desarrollaron alias íiíulaciones del anlicuerpo Vi (Lanaía y oíros, Lancef, 2.:441-443 (1983); y Losonsky y oíros, J. Clin. Microbiol., 2_5:2266-2269 (1987)). Se realizaron dos ensayos de campo confrolado aleaíorizados para deíerminar la seguridad y eficacia de la vacuna de anfígeno Vi candidaía producida en Insíiíuíe Merieux. En ambos ensayos, la vacuna fue bien íolerada (Acharya y oíros, supra; y Klugman y oíros, supra). En Nepal, una dosis iníramuscular individual de 25µg de la vacuna de anfígeno Vi proporcionó un 72% de proíección duranfe por lo menos 17 meses coníra fiebre íifoidea confirmada por culfivo en un esíudio involucrando fanto a niños como adulíos (Klugman y otros, supra). Se obtuvieron resulíados similares en un esíudio de campo en niños en edad escolar de Sudáfrica en quienes la misma dosis de aníígeno Vi confirió un 64% de prolección coníra fiebre í?foidea confirmada por culfivo duranle por lo menos 21 meses (Klugman y otros, supra). Más allá de su seguridad y eficacia en niños en edad escolar y en adultos, una ventaja de la vacuna del anfígeno Vi es que proporciona un nivel moderado de prolección jusío con una sola dosis. Sin embargo, comparado con la vacuna tifoidea atenuada Ty21a, una vacuna de aníígeno Vi es desveníajosa ya que puede ser pareníeralmeníe (iníramuscularmenle) adminisírada.

C. Cepas atenuadas anteriormente como vacunas orales vivas. 1. Cepas de vacuna S. typhi dependientes de estreptomicina. Las primeras cepas alenuadas para mosírar una promesa como vacunas fifoideas orales vivas fueron las cepas dependieníes de esírepíomicina (SmD) desarrolladas en la úllima parte de la década de 1960 y al principio de la década de 1970 (DuPoní y oíros, Antimicrob. Agenís Chemofer., 10:236-239 (1970); y Levine y oíros, J. Infecí. Dis., 133:424-429 (1976)). Cuando se suminisíraban en dosis separadas múlliples conleniendo aproximadamenfe 1010 unidades formadoras de colonia (cfu) por dosis, las cepas SmD eran bien íoleradas, y demosfraron aproxímadameníe un 80% de prolección conlra el ataque experimental en un modelo de volunfario de fiebre lifoidea (DuPont y otros, supra). Sin embargo, cuando los voluntarios fueron inmunizados con preparaciones liofilizadas que fueron reconsíifuidas para formar suspensiones líquidas de organismos de vacuna, la protección no fue conferida (Levine y oíros (1976), supra). Debido a eslo, se desconfinuaron esíudios adicionales con las cepas de vacuna SmD. 2. Cepa Ty21a. una vacuna de tifoidea oral viva con licencia. Una cepa aíenuada de Ty21a que es segura y proíecíora como una vacuna oral viva, fue desarrollada a principios de la década de 1970 a través de mutagénesis química de la cepa Ty2 de Sfyphi patogénica (Germanier y otros, J. Infecí. Dis., 141 :553-558 (1975)). Las muíaciones caraclerísíicas en esfa cepa de vacuna que fueron inicialmeníe resumidas como responsables de su aíenuación, incluyen una inacíivación de galE (la cual codifica UDP-galacfosa-4-epimerasa, una enzima involucrada en la sínfesis de 3 lipopolisacárido), y una inhabilidad para expresar el polisacárido Vi. Mientras que Ty21a ha probado ser notablemeníe bien folerada en ensayos clínicos conírolados con placebo (Gilman y oíros, J. Infecí. Dis., 136:717-723 (1977); Wahdan y oíros (1982), supra; y Wahdan y otros, Bull. WHO, 5_8:469-474 (1980)), no es precisamente claro que muíaciones son responsables del fenoíipo alfamenfe atenuado, estable de esta vacuna. Los resulíados de tres esíudios controlados por placebo, doblemente ciegos que utilizaron métodos de observación activa para determinar la reactogenicidad de Ty21a en adulíos y niños mosfraron que no se observaron reacciones adversas significalivameníe con más frecuencia en los receplores de vacuna que el grupo de placebo para cualquier sínfoma o signo. Similarmeníe, en ensayos de campo de eficacia a gran escala que involucran a aproximadamenle 530,000 niños en edad escolar en Chile, 32,000 niños en edad escolar en Egiplo y aproximadamenfe 20,000 sujeíos pediáíricos y adulfos en Indonesia, la observación pasiva falló para ideníificar reacciones adversas aíribuibles a la vacuna (Ferreccio y oíros (1984), supra; Levine y oíros (1987a), supra; Simunjuníak y oíros, supra; Wahdan y otros (1982), supra; y Wahdan y otros (1980), supra). Los ensayos de campo controlados de Ty21a enfatizan que la formulación de la vacuna, el número de dosis adminislradas, y la separación de las dosis, marcadamenle lienen influencia en el nivel de proíección que puede ser logrado (Black y oíros, supra; Ferreccio y oíros (1984), supra; Levine y oíros (1987a), supra; y Wahdan y oíros (1980), supra). En el primer ensayo de campo conírolado con placebo, aleaíorizado de Ty21a en Alexandria, Egipfo, niños en edad escolar de 6-7 años recibieron íres dosis de vacuna liofilizada que fue resuspendida en un diluyeníe (en iníervalos de un día sí y un día no enlre las dosis) (Wahdan y oíros (19809, supra). Para neufralizar el ácido gásfrico, los niños masíicaron una íablela de 1.0 g de NaHCO3 varios minuíos aníes de ingerir la vacuna o placebo. Duraníe los tres años de la observación, Ty21a mostró conferir un 96% de eficacia proíecíora contra fiebre tifoidea confirmada (Wahdan y otros (1982), supra). Una formulación más recieníe que ha consíifuido el producío comercial desde mediados de 1980 consisfe de una vacuna liofilizada en cápsulas resisíeníes al ácido, con revesíimienío eníérico. En un ensayo de campo confrolado con placebo aleaíorizado en Sanliago, Chile, se proporcionaron íres dosis de esfa formulación revesíida en forma eníérica en una semana que proporcionó un 67% de eficacia duranle los primeros fres años del desarrollo (Levin y oíros (1987a); supra), y un 63% de prolección duraníe 7 años del desarrollo. Cuatro dosis de Ty21a en cápsulas revestidas en forma entérica dadas en ocho días, son significativamente más protectoras que dos o tres dosis (Fereccio y oíros (1984), supra). Cuando Ty21a fue oforgada por U.S. Food and Drug Adminisfralion a finales de 1989, el programa recomendado fue de cuaíro dosis dadas un día sí y un día no; oíros países uíilizaron un programa de inmunización de íres dosis. Sin embargo, las desventajas reconocidas de Ty21a incluyen la falta de una base molecular para su aíenuación, su inmunogenicidad modesfa y, en forma más imporlanfe, la necesidad de adminisfrar íres dosis separadas con el fin de conferir profección. Ofra desveníaja de Ty21a es que no esfimula el anficuerpo eníi-V¡ de IgG en el suero. 3. Correlaciones de protección después de inmunización con vacunas atenuadas. Aunque la cepa Ty21a de vacuna fifoidea oral viva olorgada es solamenfe, modeslamenfe inmunogénica, y requiere de íres o cuaíro dosis separadas para producir proíección, la eficacia es sorprendeníemente de larga duración, presentándose durante 5-7 días. Se encontró que los resulfados de dos ensayos inmunológicos se correlacionan con la prolección conferida por formulaciones difereníes y programas de' inmunización de Ty21a en ensayos de campo. Estos incluyen cero conversiones de anticuerpo O de IgG en el suero (Levine y oíros, Rev. Infecí. Dis., 11 (suppl 3): S552-S567 (1989b)), y enumeración de células de secreción de anlicuerpo O de IgA derivadas de iníesíinos (ASCs) deíecíadas eníre células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (Kanfele, Vaccine, 8:321-326 (1990); Tackeí y oíros, Infecí. Im un., 60:536-541 (1992b); y Van de Verg y oíros, Infecí. Immun., 58:2002-2004 (1990)). La ideníificación de esías mediciones como correlaciones inmunológicas de profección provee una herramienta invaluable para uíilizarse en los primeros ensayos clínicos cuando se evalúan nuevas cepas de S.íyphi aíenuadas como posibles vacunas orales vivas.

V. Nuevas generaciones de S. tvphi atenuada como vacunas orales vivas. Los invesíigadores en varios laboraíorios en el mundo realizaron la farea de diseñar por ingeniería nuevas cepas de vacuna candidaío que serán también loleradas como Ty21a,pero, considerablemenfe más inmunogénicas, de manera que una sola dosis oral producirá inmunidad proíeclora. Hasía esíe punió, se han preparado cepas de vacuna candidatas inactivando genes que codifican varias frayeclorias bioquímicas, sislemas reguladores globales, profeínas de choque fórmico, oíros genes reguladores, y propiedades de virulencia puíativas (Curtiss y oíros, Infecí. Immun., 55:3035-3043 (1987), supra; Edwards y oíros, J. Bacíeriol., 170:3991-3995 (1984); Hohmann y oíros, J. Infecí. Dis., 173:1408-1414 (1996a); Hone y oíros, Infecí. Immun., 66.: 1326-1333 (1988); Hone y oíros, Vaccine, 9_:810-816 (1991); y Levine y oíros, J. Bioíechnol., 44:193-196 (1996)). También se realizó un infenlo para incremeníar la inmunogenicidad de Ty21a resfaurando su habilidad para expresar el aníígeno Vi (Cryz y oíros, Infecí. Immun., 57:3863-3868 (1989); y Tacket y otros (1991), supra). El potencial aienuanfe relativo de estas mufaciones íípicamente ha sido determinado alimentando cepas S. fyp/7 murium que alojan estas mulaciones en ratones, y comparando el resulfado con aquel producido por cepas de fípo silvesfre ¡sogenéicas. Las mufaciones infroducidas en varias cepas S. typhi recombinaníes que fueron dadas como alimenlo a seres humanos como candidalos de vacuna oral viva en ensayos clínicos se resume en el Cuadro 1 a coníinuación.

CUADRO 1 Los aspecfos y resulíados dominaníes de ensayos clínicos con las cepas afenuadas más imporíaníes de S. typhi que han jugado un papel imporíanfe en el desarrollo de vacuna fifoidea oral viva se resumen a coníinuación.

A. Cepa Ty21a de Vi*. Un derivado de Ty21a se consíruyó iníroduciendo viaB (que codifican los genes estrucíurales requeridos para la sínlesis del pol?sacárido Vi) de la cepa de íipo silvesíre Ty2 en el cromosoma de Ty21a, y demosírando la expresión del polisacárido capsular Vi (Cryz y oíros, supra). La cepa Ty21a de Vi+ resulfaníe fue alimeníada a adulfos noríeamericanos saludables en dosis individuales de suspensiones líquidas conleniendo 5.0 x 105, 5.0 x 107 y 5.0 x 109 cfu y regulador de pH; un grupo adicional de sujetos recibieron tres dosis de 5.0 x 109 cfu y regulador de pH (a un infervalo de un día sí y un día no enfre las dosis) (Tackeí y oíros (1991), supra). La cepa Ty21a de Vi+ fue bien folerada, y la mayoría de los sujeíos quienes recibieron íres dosis desarrollaron elevaciones de aníicuerpos de IgG en el suero y IgA ASCs confra el anlígeno O de S. typhi. Sin embargo, ningún sujefo manifesíó elevaciones den anlicuerpo aníi-Vi de IgG en el suero, o exhibió ASCs que secreía el anficuerpo anfi-V¡ de IgA (Tackeí y oíros (1991), supra).

B. EX462. Se hizo un iníenío para consíruir un nuevo derivado de Ty2 uíilizando íécnicas de ADN recombinaníe que podrían confener, lo que se creyó en un momenío que era, las muíaciones de afenuación en Ty21a que fueron inducidas por muíagénesis química (Hone y oíros (1988), supra). Específicamenfe, el derivado alojaba una mufación de eliminación en galE, y fue incapaz de expresar el polisacárido Vi, pero no íuvo las ofras múlfiples mufaciones présenles en Ty21a como resulfado de su obíención ufilizando muíagénesis química no específica. La cepa resulíanie EX462, fue clara e insuficientemente atenuada, ya que ocasionó un síndrome de tipo de fiebre tifoidea en varios receptores. Esfas observaciones demueslran en forma de conclusión que la combinación de la muíación de galE y la incapacidad de expresar el aníígeno Vi por sí mismo no son responsables de la afenuación de la cepa Ty21a.

C. Cepas 541Tv v 543Tv. El concepfo de hacer muíaníes auxofrópicos de Salmonella con inacíívación de genes que codifican enzimas en la írayecloria de biosínfesis de aminoácido aromático ha sido popularizado (Edwards y otros, supra; y Hoiseth y oíros, Nafure, 292:238-239 (1981)). Eslas mufaciones hacen que la Salmonella sea nuíricionalmeníe dependieníe de subsfralos (ácido para-aminobenzoico y 2,3-dihidroxibenzoaío) que no esíán disponibles en una cantidad suficiente en los tejidos de mamíferos; como una consecuencia, la vacuna permanece viable pero, es severamente inhibida en su habilidad para proliferar. Las cepas 541Ty y 543Ty de aroA- de protoíípo (una varianle de Vi" de 541Ty) fueron consíruidas a parlir de CDC1080, una cepa de íipo silvesíre obíenida de Ceníers for Disease Confrol (Edwards y oíros, supra). La paíogenicidad de la cepa CDC1080 nunca ha sido direcíameníe probada en voluníarios. En coníraste, la mayoría de oíros invesíigadores ha comenzado con la cepa Ty2 de íipo silvesíre, el origen de Ty21a (Germanier y oíros, supra), en sus míenlos para diseñar nuevas cepas afenuadas. La paíogenicidad de Ty2 ha sido establecida en estudio con volunlarios (Hornick y otros, N. Engl. J.

Med., 283:686-691 y 739-746 (1970)). Las cepas 541Ty y 543Ty también alojan una mutación de eliminación en purA, lo cual da como resultado un requerimiento específico para adenina (o un compuesto asimilable, tal como adenosina), (Edwards y otros, supra). Una tercera muíación en hisG, conduciendo a un requerimienlo de hisíidina, no aféela la virulencia pero, proporciona un marcador bioquímico adicional para diferenciar clarameníe la cepa de vacuna de S. typhi de tipo silvestre. Las cepas 541Ty y 543Ty fueron absolutamente bien toleradas en dosis de hasla 5.0 x 1010 cfu en esíudios de fase 1 pero, fueron noíablemeníe menos inmunogénicas que Ty21a para esíimular respueslas de anticuerpo humorales (Levine y oíros, J. Clin. Invesí., 79.:888-902 (1987b)). Por ejemplo, solamenfe el 11% de los sujeíos desarrollaron anticuerpos anfi-O de IgG en el suero (Levine y oíros (1987b), supra).

D. Cepa CVD 908. Una cepa de vacuna que ha probado ser bien íolerada y altamenfe inmunogénica después de la adminislracíón de una sola dosis oral de ensayos clínicos de fase 1 en seres humanos con organismos recienfemeníe cosechados es la cepa CVD 908 (Tackef y oíros (1992b), supra; y Tackel y oíros (1992a), supra), la cual aloja muíaciones de eliminación precisas en aroC y aroD (Hone y oíros (1991), supra). En realidad, CVD 908 fue el primer candidafo de vacuna de S. typhi genéíicamenle diseñado por ingeniería que mosfró ser alíameníe inmunogénico aún más, bien íolerado, generando así opíimismo de que puede ser posible desarrollar una vacuna de íifoidea oral viva de una sola dosis. A una dosis bien íolerada de 5.0 x 107, el 92% de los receptores de CVD 908 manifestaron seroconversiones del anticuerpo O de IgG, y mostraron evidencia de iniciación del sistema inmune iníesfinal (IgA ASCs) (Tackef y otros (1992a), supra). 1. Respuesta inmune mediada por células después de inmunización con la vacuna atenuada CVD 908. Los ensayos clínicos con CVD 908 han sido caracferizados por grandes invesíigaciones de respuesías inmunes mediadas por células (CMI) (Sztein y oíros, J. Immunol., 155:3987-3993 (1995); y Sztein y otros, J. Infecí. Dis., 170:1508-1517 (1994)). Cuando se adminisíra a adullos saludables, CVD 908 acliva las respuesfas CMI a los aníígenos S. typhi incluyendo la producción de cilosina y respueslas proliferaíivas a paríículas de S. typhi de célula eníera inacíivadas con calor y fenol y flagelos purificados (Szfein y oíros (1994), supra). Ya que S. typhi son pafógenos infracelulares, fambién se ha presumido que las respuesfas de linfocifos cifolóxicas (CTL) pueden jugar un papel imporíaníe para limifar la progresión de la infección íifoidea destruyendo las células huésped que alojan S. typhi. De esta manera, se desarrolló un ensayo de CTL para evaluar si la inmunización de voluníarios adulíos con CVD 908 de S. typhi aíenuada produce efecfores CTL en la sangre capaces de aniquilar el virus de Epsíein-Barr (EBV)-linfocilos B autólogos íransformados infecfados con S. typhi de íipo silvesíre (Szíein y oíros (1995), supra. La acíividad de CTL fue evaluada ufilizando PBMC aislada anfes y a 14 y 29 días después de la primera inmunización. Se uíilizaron PBMC ya sea inmediafameníe en los ensayos de CTL o se expandieron in viíro duranle 6-8 días en presencia de células íransformadas con EBV auíólogas infecfadas con S. typhi aníes de medir las respuesfas de CTL. Utilizando este sistema, los efecfores CTL Usaron las células fransformadas EBV auíólogas, infecíadas con S. typhi. La acíividad de CTL específica se observó en preparaciones de PBMC oblenidas 14 días después de la inmunización y después de 7 a 8 días de expansión in viíro en presencia de células fransformadas EBV auíólogas ínfecfadas con S. typhi. PBMC se obluvo 29 días después de la inmunización y exhibió niveles de acíividad de CTL comparables o mayores que aquellos observados en células aisladas 14 días después de la inmunización. La población de célula efecfora CTL en esfos culíivos de PBMC fue una población de linfocito T citofóxica restringida con MHC de clase I de CD8+ clásicas (Szlein y oíros (1995), supra). La observación que la inmunización con S. typhi atenuada produce células efecforas de CTL resfringidas en la clase I de MHC, CD8 + , en circulación, capaces de aniquilar soporíes objefivo infecíados con S. typhi auíólogos soporta la contención que CTL juega un papel crucial para limifar la progresión de infección íifoidea deslruyendo células huésped que alojan bacterias. 2. Desventajas de la cepa de vacuna atenuada CVD 908. Una posible desvenfaja observada en los ensayos clínicos de fase 1 con CVD 908 es que le 50% de los sujefos quienes ingieren esía cepa de vacuna a una dosis de 5.0 x 107 cfu, y 100% de los sujelos quienes recibieron una dosis de 5.0 x 107 cfu, manifesíaron vacunanemias silenciosas, en donde se recuperaron organismos de vacuna de culfivos de sangre recogida en uno o más punios de íiempo eníre el día 4 y el día 8 después de la vacunación. Los cullivos de sangre fueron recolectados sistemálicamente en estos individuos en horas después que ingirieron la vacuna, y después en los días 2,4,5,7,8,10,14,20,27 y 60. Ningún cultivo de sangre de cualquier vacuna fue posiíivo anles del día 4 ni después del día 8. Las vacunanemias no parecieron íener ninguna consecuencia clínica (por ejemplo, no esíuvieron asociadas con fiebre), y fueron de vida corla, desapareciendo esponíáneamente sin el uso de antibiólicos. Sin embargo, las posibles consecuencias que la vacunanemia con una cepa de S. typhi atenuada pueda tener en una gran población en donde individuos inmunocomprometidos probablemente van a ser incluidos, son desconocidas. Otra desventaja percibida de CVD 908 es la producción de fiebre en una pequeña proporción de los vacunados quienes reciben una alta dosis de vacuna (Tacket y otros, (1992a), supra). Como una alternativa, se buscaron mutaciones adicionales para ser introducidas en CVD 908 para producir un derivado que permanece bien tolerado y aún más inmunogénico, que no puede manifestar vacunanemias o fiebre.

E. CVD 908-htrA.

Se encontró que la inactivación de htrA, un gen que codifica una proleína de íensión que íambién funciona como una proíeasa de serina, atenúa S. fyp?/murium de tipo silveslre en un modelo de rafón (Chaífield y oíros, Microbial. Phaíogenesis, 12:145-151 (1992a)). Además, los raíones inmunizados oralmente con S. fyp ?/murium que alojan una mutación de eliminación en htrA fueron protegidos coníra el alaque subsecueníe con una dosis leíal de S. fyp?/murium de íipo silvestre (Chatfield y otros (1992a), supra). Por lo tanlo, se inírodujo una mufación de eliminación en hfrA de CVD 908, dando como resullado la cepa CVD 908-hírA (Levine y oíros (1996), supra). Una dosis individual de CVD908-htrA fue alimenfada a íres grupos de sujelos quienes ingirieron 5.0 x 107 (N = 7), 5.0 x 108 (N = 8) o 5.0 x 109 (N = 7) cfu (Tackeí y oíros (1997); supra). La cepa CVD 908-hfrA fue íambién iolerada como la de origen CVD 908. Solameníe uno de esíos 22 sujelos desarrolló fiebre a bajo grado, la cual fue delectada a través de observación de rutina, y no fue asociada con ninguna queja de malestar. Sin embargo, 2 de los 22 sujetos desarrollaron evacuaciones aguadas (Tacket y otros (1997); supra). Similarmente. La respuesta inmune fue excelente: 20 de los 22 individuos (91%) manifestó incrementos importantes en el suero del anticuerpo O IgG, y IgA ASCs derivado de intesíino que hizo el anlicuerpo al anfígeno O y fueron delectados en 100% de las vacunas. Esías respuestas inmunológicas son virtualmente idénticas a aquellas observadas en ensayos clínicos de fase 1 en sujetos inmunizados con dosis incomparables de CVD 908 (Tacket y otros (1992a), supra). La única enorme diferencia fue con respeclo a vacunanemias. Mientras que la vacunanemías fueron detectadas en 12 de 18 sujetos quienes recibieron una dosis de 5.0 x107 o 5.0 x 108 cfu de CVD 908, ninguna vacunanemia fue delectada en ninguno de los 22 individuos quienes ingirieron 5.0 x 107"9 cfu de dosis de CVD 908-htrA altamente inmunogénicas, bien toleradas, (p<0.001) (Levine y otros (1987b), supra; Tacket y otros (1992a), supra; y Tacket y otros, (1997), supra). La CVD 908-htrA también produce fuertes respuestas inmunes mediadas por célula en vacunas comparable con la resistencia a aquellas regisfradas con CVD 908 (Tackeí y oíros (1992a), supra; y Tackel y oíros (1997), supra). Con base en esíos dalos alfamente fomentadores, CVD 908-htrA ha entrado a ensayos clínicos de fase 2 para determinar su aceptabilidad clínica e inmunogenicidad en números más grandes de sujetos, incluyendo niños.

F. Cepas con mutaciones en cva. crp. o cva, crp, cdt. En Salmonella, los genes cya que codifican ciclasa de adenilato) y crp (proteína del receptor AMP cíclica) constituyen un sistema regulador global que afecta muchos genes y operones (Curtiss y otros, Dev. Biol. Stand., 82.:23-33 (1944). El S. fypft murium que aloja eliminaciones en cya y crp son atenuados comparado con su origen de tipo silvestre, y la inmunización oral protege a los ratones contra el ataque con S. fyphimurium virulenfo (Curíiss y oíros (1987), supra). La cepa candidafo de vacuna ?3927, un mufaníe doble de cya", crp" de la cepa Ty2 de S. typhi fue conslruida (Curíiss y oíros (1994, supra). En ensayos clínicos de fase 1, se demosíró que la cepa ?3927- fue aíenuada comparada con la cepa de íipo silvesíre pero, insuficieníemeníe afenuada para servir como una vacuna oral viva en seres humanos, ya que ocasionalmeníe los sujeíos desarrollaron alia fiebre y síníomas de íipo íifoidea (Tacket y otros (1992b), supra). Varios sujetos iambién manifestaron vacunanemias (Tacket y otros (1992b), supra. Con el fin de lograr un grado mayor de atenuación, se introdujo una lercera mutación de eliminación en cdt en el muíante ?3927 de cya", crp", (Curiiss y otros (1994), supra). El cdt es un gen que afecta la diseminación de la Salmonella del tejido linfoide asociado con intesíinos a órganos más profundos del sisiema reticuloendoíelial, tales como el hígado, bazo y médula espinal /Kelly y otros, Infect. Immun., 60.:4881-4890 (1992)). La cepa mufaníe íriple de cya", crp", cdf" resulíaníe, ?4073, fue alimenlada a noríeamericanos adulfos saludables, con regulador de pH en dosis individuales coníeniendo 5.0 x 105, 5.0 x 106. 5.0 x 107 o 5.0 x 108 cfu (Tackel y oíros (1997), supra. La cepa fue bien íolerada, excepío para un individuo en el grupo de 5.0 x 107 cfu quien desarrolló diarrea (Tackef y oíros (1997), supra). Ningún sujefo manifesfó vacunanemia. Cuaíro de cinco sujelos quienes ingirieron 5.0 x 108 cfu, exhibieron incrementos ¡mportanles del anlicuerpo O IgG en el suero, y luvieron ASCs que hicieron el anticuerpo O IgA (Tacket y otros (1997), supra).

G. Cepas con mutaciones en phoP/phoQ. Dos cepas candidatas S. typhi que alojan eliminaciones en phoP/phoQ han sido construidas (Hohmann y otros (1996a), supra; y Hohmann y otros, Vaccine, 1_4:19-24 (1996b). la cepa Ty445, la cual íambién aloja una eliminación en aroA, se enconíró que esíá íoíalmenfe atenuada y solo mínimamente es inmunogénica (Hohmann y otros (1996b), supra). En conlrasfe la cepa Ty800, un derivado de Ty2 feniendo eliminaciones solamenfe en phoP, phoQ generalmeníe fue bien íolerada e inmunogénica cuando se evaluó a niveles de dosis de 107 a 1010 cfu en un ensayo clínico de fase 1 pequeño involucrando 11 sujeíos (Hohmann y oíros (1996b), supra). Al nivel de dosis más alio, una de íres vacunas desarrollaron diarrea (10 evacuaciones suelías). Es difícil comparar las respueslas inmunes de sujelos quienes recibieron TydOO con aquellas observadas en recepíores de CVD 908-htrA y ?4073, ya que algunas de las técnicas de ensayo inmunológico fueron diferentes, y más aún en donde se utilizó el mismo ensayo (por ejemplo, IgA ASCs que forma el anticuerpo O), se sabe que ocurre una considerable variación entre los laboratorios.

H. Resumen. CVD 908 es bien tolerada pero, está asociada con vacunanemias en aproximadamente 50% de los sujeíos quienes ingieren una dosis de 107 cfu. Se observó una diarrea moderada, pero definitiva, en aproximadamente 10% de los sujetos quienes ingirieron CVD 908-htrA, TydOO o ?4073. La respuesta inmune a ?4073 fue menos potente que aquella observada después de la inmunización oral con CVD 908, CVD 908-htrA y, aparenfemente, TydOO (ver Cuadro 1 aníerior). De esía manera, aunque exisfen 4 cepas de S. typhi afenuadas que han compleíado los ensayos clínicos de fase 1, cada una esíá asociada con por lo menos una desveníaja de preocupación diferenfe que exisíe inferes en el desarrollo de cepas de vacuna S. typhi aíenuadas candidaías adicionales. Además, ninguna de estas cuatro cepas ha tenido éxifo en la producción de aníicuerpo anti-Vi IgG en el suero, una respuesla inmune proíeclora conocida.

VI. Uso de cepas de Salmonella atenuada como vacunas de vector vivas para expresar genes extraños gue codifican antígenos protectores de otros patógenos y suministran aquellos antígenos al sistema inmune. Las vacunas de veclor vivas, íambién denominadas como "vacunas porfadoras" o "sistemas de suministro de antígenos vivos", comprenden un área exciíaníe y versáfil de vacunología (Levine y oíos, Microecol. Ther., 1_9:23-32 (1990), Morris y oíros, Gasíroenterol., 103:699-702 (1992); Barlefía y oíros, Res. Microbiol., 141:931-940 (1990); Dougan y oíros, Para. Immunol., 9:151-160 (1987); y Curíiss y oíros, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 146:35-49 (1989). En este aspecto, una vacuna viral o bacleriana viva es modificada de manera que expresa aníígenos exfraños proíecíores de olro microorganismo, y suminisfra aquellos anfígenos al sistema inmune, estimulando así una respuesta inmune prolecíora. Los vecíores bacíerianos vivos que van a ser promulgados incluyen, entre otros, Salmonella atenuada (Levine y otros (1990), supra; Morris y otros , supra; Dougan y otros, supra; y Curtís y otros (1989), supra), Bacille Calmetíe Guerin (Barleffa y oíros, supra), Yersinis eníerocolífica (Van Damme y oíros, Gasíroenferol., 103:520-531 (1992)), V. cholerae 01 (Vireí y oíros, Mol. Microbiol., 7:239-252 (1993)), y E. coli (Hale, Res. Microbiol., 141:913-919 (1990)). Cada una íiene cierfas veníajas y algunas desvenfajas. S. typhi aíenuada es parficularmeníe afracfiva como una vacuna de vecfor viva para seres humanos, ya que es adminislrada oralmenfe, coloniza el íejido linfoide asociado con intesíino así como el sisfema reíiculoendoíelial, produce una amplia respuesía inmune (que incluye anlicuerpos en el suero, SlgA de mucosa, diversas respuesías inmunes mediadas por célula incluyendo CTL clásica, y una forma de citofoxicidad dependiente de anticuerpo), (Conry y oíros, Gene Therapy, 2_:59-65 (1995); Cox y oíros, J. Virol., 67:5664-5667 (1993); Davis y oíros, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 93:7213-7218 (1996a); Davis y otros, Vaccines, 96.: 111-116, Brown y otros, Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996b); Tackeí y oíros (1992a), supra; González y oíros, J. Infecí. Dis., 169:927-931 (1994); y Szíein y oíros (1994), supra). Además, la Salmonella es fácilmeníe manipulada en forma genéíica, y muchos aníígenos exíraños ya han sido expresados en esías bacferias. En íeoría, vacunas orales de una dosis coníra una variedad de enfermedades infecciosas pueden ser desarrolladas iníroduciendo esfablemenfe y expresando genes extraños que codifican antígenos proíecíores en una cepa de vecíor vivo de S. typhi altameníe inmunogénica, aún bien lolerada (Levine y oíros (1990), supra).

Vil. Salmonella con mutaciones en la trayectoria metabólica de purina. A. Primeros reportes de cepas de Salmonella con mutaciones en la trayectoria metabólica de purina. Las muíaciones purA y purB en Salmonella (iníerrumpiendo de nuevo la biosíníesis de nucleófidos de adenina), (ver Figura 2) son así alíameníe aíenuadas (McFarland y oíros, Microb. Palhogen., 3.:129-141 (1987)) que esías cepas son no proíecforas en animales (O'Caalagham y oíros, Infecí. Immun., 56.:419-423 (1988)), y son pobremeníe ínmunogénicas en seres humanos (Levine y oíros (1987b), supra). En conírasíe, las mufaciones en varios de los genes involucrados en la írayecíoria común de purina (es decir, purF, purG, purC, purHD) que interrumpen la biosíntesis tanto de nucleótidos de purina (ver Figura 2), como en guaB y guaA, interrumpiendo así la biosíníesis de nucleólídos de guanina (ver Figura 2), han sido reporíados como menos afenuaníes (McFarland y oíros, supra); en realidad, dichas cepas indujeron la mueríe en ralones a dosis ían bajas como 102 cfu (McFarland y oíros, supra). Las observaciones revisadas aníeriores sugieren que: (i) las muíaciones que afectan enzimas de la trayectoria común de purina son moderadamenfe aíenuadas (McFarland y oíros, supra); y (ii) las mufaciones lejanas a la írayecloria común y que afecían la síntesis de nucleótidos de adenina son sobreaíenuadas (es decir, purA, purB) (McFarland y otros, supra; O'Callagham y otros, supra; y Levine y otros, (1987b) supra), pero las muíaciones lejanas que afectan la síntesis de nucleóíido de guanina son solameníe en forma mínima aíenuadas (McFarland y oíros, supra).

B. Observaciones inesperadas y únicas de la presente invención. Con base a las observaciones publicadas reporíadas anteriormeníe, se descubrió, por lo tanto, en forma inesperada, que una auxotrofia específica gua en S. typhi proporcionó un alto grado de atenuación. Se cree que esta atenuación se debe, en parte, a la invasión reducida (una propiedad que no ha sido previamente descrita en otra Salmonella spp. con mutaciones de atenuación en trayectorias metabólicas) así como la velocidad de replicación ?niracelular reducida de muíaníes ?guaB-A S. typhi. Este hallazgo fue inesperado, ya que S. dublin y S. fyp?/mupum que alojan mutaciones Tn5 de inserción que afectan la síntesis de nucleótido de guanina fueron reportadas como solameníe en forma mínima atenuadas (McFarland y otros, supra). Además, oíro hallazgo inesperado fue que a pesar de esíe alio grado de aíenuación, la cepa ?guaB-A S. typhi CVD 915, descrifa en la presenfe, fue muy inmunogénica en un modelo de animal de murino. Esía observación es inesperada de los reporíes previos en donde cepas alíameníe atenuadas, con mutaciones que inactivan purA y purB, han sido muy pobremente inmunogénicas (Edwards y otros, supra). También, otra observación inesperada fue que la cepa CVD 915 indujo una respuesta inmune impresiva a un antígeno recombinante expresado en la misma cepa atenuada. Esta observación es inesperada a partir de las observaciones previamente reporíadas, en donde las cepas altameníe afenuadas han sido vecfores vivos pobres para anfígenos heíerólogos recombinaníes (Tackef y oíros (1997), supra). Además, la cepa CVD 915 fue capaz de suminislrar un vecíor de expresión eucarióíico que codifica un aníígeno exíraño recombinaníe (vacuna mediada por ADN) y produce una respuesta inmune sorprendente. La propiedad de suminisírar plásmido de expresión eucaríótico ha sido reporfada con vecíores de Shigella aíenuados (Sizemore y oíros, Science, 270:299-302 (1995)); y con vectores Salmonella typhimurium atenuados (Darji y otros, Cell, 91:765-775 (1997)). Las Shigella spp. son organismos invasivos y su éxito para suministrar vacunas de ADN se cree que es secundario al hecho de que dejan al fagosoma inmediaíameníe después de la invasión (Sansoneííi y oíros, Infecí. Immun., 5 _:461-469 (1986)). Sin embargo, la Salmonella no deja el fagosoma después de la invasión. Por lo fanío, la observación aquí preseníada es inesperada a paríir del concepto previo y es única. En resumen, en la presenfe invención, se aconseja un solo méíodo para diseñar por ingeniería en forma genéíica Salmonella aíenuada para obíener la expresión consfifuíiva y esíable del aníígeno Vi. Además, los muíanles de Salmonella de la présenle invención preferiblemente también son atenuados por mutaciones en la nueva trayectoria metabólica de guanina.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es proporcionar cepas atenuadas de Salmonella que expresan constitutivamente el antígeno Vi. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una método para lograr la expresión conslitutiva del antígeno Vi. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar Salmonella, la cual también es atenuada a través de mutaciones en la nueva trayectoria metabólica de guanina. Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para lograr una mulación de eliminación en los genes guaB y guaA de Salmonella. Un objeío adicional de la présenle invención es proporcionar una vacuna oral o inlranasal (es decir, de mucosa) contra fiebre tifoidea. Un objeto más de la presente invención es proporcionar cepas de Salmonella, las cuales sean útiles como vectores vivos de genes exíraños clonados de oíros paíógenos, y que después de expresión e inmunización apropiada, darán surgimienfo a respuesfas inmunes proíecforas confra los pafógenos a parfir de los cuales se derivaron los aníígenos extraños. Oíro objeío más de la présenle invención es proporcionar cepas de Salmonella, las cuales sean útiles como vectores vivos para suministrar vacunas mediadas por ADN. Estos y otros objefos de la preseníe invención, los cuales serán evidenfes a partir de la descripción detallada de la presente invención provista más adelante, han sido saíisfechos, en una modalidad, por un muíaníe de Salmonella aíenuada, en donde dicho muíaníe consíiíufivameníe expresa el anfígeno Vi.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1B muesíran el operón viaB; y esquemáíicameníe represenían el inlercambio del promolor osmóíicameníe regulado, de tipo silvestre de vipR en el operón viaB a través del cassetíe sacB-Neo (Figura 1A); y el infercambio de la inserción del casselíe sacB-Neo por el promoíor consfifuíivo poderoso Ptac, con el fin de formar la expresión del antígeno Vi constituíiva (Figura 1B). La Figura 2 muesfra la nueva frayecloria de biosínlesis de purina y la coníribución de la írayecloria meíabólica aromáíica. En la Figura 2, las flechas inlerrumpidas iluslran írayecíorias en donde los pasos individuales no esfán represeníados. Las enzimas están representadas por sus genes. Las leíras con índice subescrilo represenfan cepas seleccionadas con una mulación del gen involucrado en esa reacción. Las cepas represenfadas son: a: purF1741 :Tn10 S. dublin SL5437 (McFarland y otros, supra); b: purG876::Tn10 S. dublin SL5436 (McFarland y otros, supra); c: purC882::Tn10 S. dublin SL5435 (McFarland y oíros, supra); d: purH887::Tn10 S. dublin SL2975 (McFarland y oíros, supra); e: ?guaB-A S. flexneri 2a CVD 1204 y ?guaB-A, ?virG S. flexneri 2a CVD1205 (Noriega y oíros, Infecí, Immun., 61:3055-3061 (1996)) y ?guaB-A Salmonella íyphi CVD 915 (preseníe invención); f: aroD25::Tn10 S. flexneri y SFL114 (Lindberg y oíros, (1990) supra), SFL124 (li y oíros, supra), g:?aroC, ?aroD S. typhi CVD 908 (Hone y oíros (1991), supra); h: hisG46 DEL407, aroA554::Tn10 S. fyp?/'murium SL3261 (Hoisefh y oíros, supra); i: ?aroA S. flexneri 2a CVD 1201 y ?aroA, ?virG CVD 1203 (Noriega y oíros, Infecí. Immun., 62_:5168-5172 (1995); y j:?aroA, ?hisG, ?purA S. typhi 541Ty (Levine y oíros (1987b), supra. En la Figura 2, las abreviafuras se definen como sigue: PRPP. 5-fosforibosil-ß-1-pirofosfaío; PARA: 5-fosforibosilamina; GAR: 5'-fosforibosil-1 -glicinamida; FGAR: 5'-fosforibosil-N-formilglicinamida; FGAM:5'-fosforibocil-N-formilglicinamidina; AIR: 5'-fosforibocil-5-aminoimidazol; cair: 5'-fosforibocil-5-aminoimidazol-4-carboxílíco; SAI CAR: 5'-fosforibosil-4-(N-succinocarboxamida)-5-aminoimidazol; Al CAR: 5'-fosforibosil-4-carboxamida-5-aminoimidazol; FAICAR: 5'-fosforibosil-4-carboxamida-5-formamidoimidazol; IMP: ácido inosínico; Hx: hipoxanfina; G: guanina; y A: adenina. Las Figuras 3A-3G muesíran la secuencia de ADN que codifica los genes guaA y guaB de Escherichia coli (SEC ID NO:1) (GenBank Nos. de Acceso M 10101 -M10102) (Thomas y oíros, Gene, 36:45-53 (1985); Tiedeman y oíros, J. Biol. Chem., 260:8676-8679 (1985); y Tiedeman y oíros, Nucleic Acids Res., 13:1303-1316 (1985)), la cual se considera que es altamente homologa con guaA y guaB de Salmonella spp., así como algunos sitios de endonucleasa de resíricción úfiles para crear los mulaníes de eliminación de la preseníe invención. La Figura 4 muesíra esquemáíicamenfe la orieníación del operón guaB-A, así como la ubicación de algunos siíios de endonucleasa de reslricción úfiles para crear los mufanfes de eliminación de la présenle invención; los segmeníos del operón guaB-A amplificados por PCR; y la fusión medíanle PCR de los segmentos de operón guaB-A constituyendo el alelo ?guaB-A. también, se muestra la clonación de operón de arsenita (ars) a la mitad del alelo ?guaB-A dando como resultado el cassette ?guaB-A::Ptac-ars. Este cassette de eliminación fue subsecuentemente clonado en un plásmido suicida e intercambiado para el alelo guaB-A de tipo silvesíre en la cepa de S. typhi Ty2, dando como resullado la cepa ?guaB-A S. typhi CVD 915. La Figura 5 es una representación esquemática de la construcción de pcDNA3/tetC (una vacuna de ADN que codifica el fragmento de toxina de tétanos C bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (CMV)). La Figura 6 muestra la respuesta del anticuerpo del antifragmento C en ratones después de la inmunización intranasal con la cepa ?guaB-A CVD 915 expresando el fragmento C de la toxina de tétano, o realizando un cassette de expresión eucariótico codificando el fragmento C de la toxina de tétano. La Figura 7 muestra la respuesta proliferativa de línfocito de murino contra el fragmento C de la toxina de tétanos después de la inmunización intranasal con la cepa ?guaB-A CVD 915 sola, o como un vector que expresa el fragmenlo C de la íoxina de tétanos o llevando un cassette de expresión eucariótico que codifica el fragmento C de la íoxina de leíanos. La Figura 8 mueslra la respuesta proliferativa de linfocito de murino contra los flagelos de S. typhi después de la inmunización intranasal con la cepa ?guaB-A CVD 915 sola, o como un vector que expresa el fragmenlo C de la foxina de tétano o que lleva un cassette de expresión eucariótico codificando el fragmento C de la toxina de tétanos. La Figura 9 muestra la respuesta de anlicuerpo de los flagelos aníi-S. typhi en raíones después de la inmunización infranasal con la cepa ?guaB-A S. typhi CVD 915 o la cepa ?aroC, ?aroD, ?htrA S. typhi CVD 908-htrA. La Figura 10 muesfra la respuesta del anticuerpo LPS anti-S. typhi en raíones después de la inmunización inlranasal con la cepa ?guaB-A S. typhi CVD 915 o la cepa ?aroC, ?aroD, ?hírA S. typhi CVD 908-hírA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La preseníe invención proporciona Salmonella aíenuada para uíilizarse, eníre ofras cosas, como vacuna oral coníra fiebre lifoidea, y como vecíor vivo y como vacunas mediadas por ADN expresando anfígenos exfraños. Como se utiliza en la presente, un "antígeno exíraño" represenía un aníígeno exíraño a Salmonella. También, en la preseníe invención, se proporciona un muíante de Salmonella atenuada, en donde dicho mutante constiíuíivamenfe expresa el anfígeno Vi. Se prefiere en la présenle invención que el genoma cromosómica de Salmonella sea ideníificado substituyendo el promotor vipR altamente regulado por un promotor constitutivo fuerte, haciendo así la expresión del antígeno Vi en la Salmonella aíenuada, conslifuíiva y esíable. El promoíor consliíuíivo paríicular empleado en la preseníe invención no es crífico a la misma. Ejemplos de dichos promoíores consfiíuíivos incluyen Ptrc (de Boer y oíros, Proc. Naíl. Acad. Sci., 80:21-25 (1983)), P|ac (de Boer y oíros, supra), Ptrc (de Suííer y oíros, Gene, 141:163-170 (1994)), P0iac y P1pp (de Sufíer y otros, supra; y Guisez y otros, Profein Expr. Purif., 2:249-258 (1998). La S. typhi particular empleada como un material de partida de la presente invención no es críííca a la misma. En los ejemplos de la preseníe la vacuna S. typhi fue consíruida a parlir de la cepa de S. typhi de íipo silvesíre Ty2. S. typhi Ty2 es una cepa de Salmonella virulenía bien conocida disponible de una variedad de fueníes, íales como CVD, los Ceñiros para Conlrol de Enfermedades (CDC), el Walter Reed Army Instiíuíe of Research, Uniformed Services Universify of the Heallh Sciences, el Instituto Pasteur (Francia), el Colegio Imperial (Inglaierra). Otras cepas de S. typhi de tipo silvesíre que han sido utilizadas en el desarrollo de candidatos de vacunas atenuadas, y las cuales pueden ser empleadas como maíeriales de parlida en la preseníe invención, incluyen: la cepa CDC 1080 (Levine y oíros (1987b), supra), la cual puede ser obfenida de la Universidad de Síanford o de CDC, y la cepa ISP1820 (Hone y oíros (1991), supra), la cual puede ser obíenida del Ceníro para el Desarrollo de Vacunas, Universidad de Maryland. Preferiblemeníe, en la présenle invención, el genoma cromosómica de Salmonella es modificado removiendo o de olra manera modificando el operón guaB-a, y bloqueando así la nueva síntesis de nucleótidos de guanina. Muy preferiblemente, una mutación definida, no polar, en marco, en el operón guaB-A inactiva las enzimas de trayectoria metabólica de purina, deshidrogenasa IMP (codificada por guaB) y sinfasa GMP (codificada por guaA). Como una consecuencia de estas mutaciones, la Salmonella es incapaz de siníetizar de nuevo GMP, y consecuentemente los nucleótidos GDP y GTP (ver Figura 2), lo cual severameníe limita su desarrollo en tejidos de mamífero. In vitro, los mutantes de Salmonella ?guaB-A de la presente invención son incapaces de desarrollarse en un medio mínimo a menos que se suplemente con guanina. En cultivos de fejido, los muíanfes de Salmonella ?guaB-A de la presenfe invención se mostró que muestran una reducción importaníe en su capacidad para invasión. Los muíanles de Salmonella ?guaB-A pueden barrer nucleótidos de guanina desde los tejidos del huésped mamífero. Sin embargo, su asimilación en Salmonella requiere de una desfosforilación anterior a nucleósidos a través de nucleotidasas periplásmicas que serán incorporadas como precursores de nucleótido en la trayectoria salvaje de guanina. Por lo tanfo, ya que los nucleóíidos son fácilmenfe disponibles en el ambieníe infracelular del huésped mamífero, la atenuación de vida a la síntesis novedosa de nucleóíidos de guanina se debe ya sea a la ineficiencia de la trayectoria salvaje o a razones que son obscurecidas en el conocimiento actual. El gen guaA, el cual codifica sintasa GMP, tiene un tamaño de 1575 bp (ver Figuras 3A-3G). de esta manera, el tamaño de una eliminación de inactivación infracistrónica en el mufanfe guaA puede variar de 1 a 1575 bp, preferiblemeníe, de 100 a 1575 bp si la eliminación eslá en marco. También se pueden hacer eliminaciones que se exliendan mas allá del gen guaA, es decir, eliminaciones extracisfrónicas corrieníe abajo del gen guaA pueden afecíar la íranscripción de esíe gen, y por lo lanío, inacíivarlo. Sin embargo, esto último no se prefiere. El gen guaB, el cual codifica deshidrogenasa IMP, tiene un tamaño de 1533 bp (ver Figuras 3A-3G). De esta manera, el tamaño de una eliminación intracistrónica en el mutaníe guaB puede variar de 1 bp a 1533 bp, preferiblemenfe de 100 a 1533 bp si la eliminación esíá en marco. También se pueden hacer eliminaciones que se exliendan más allá del gen guaB, es decir, eliminaciones exíracisírónicas corrienle abajo del gen guaB que pueden afeclar la íranscripción de ambos genes (guaB y guaA), y por lo tanto, inactivarlos. Sin embargo, esfo úlíimo no se prefiere. Las eliminaciones pueden hacerse en el gen guaA utilizando 2 sitios de restricción conveníenfes localizados en el gen guaA; ejemplos de esíos son Seal o Accl y EcoRV o Salí o Smal o Sphl o Xmal (Figuras 3A-3G y Figura 4), o a íravés de muíagénesis dirigida en el silio con oligonucleólidos (Sambrook y otros, In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Eds., Cold Spring Harbor Publications (1989)). Se pueden hacer eliminaciones en el gen guaB utilizando dos sitios de restricción convenientes localizados en el gen guaB; ejemplos de estos son Bell y Bsml o EcoRI o Pvull o Sacll o Sspl o Xholl (Figuras 3A-3G y Figura 4), o a través de mutagénesis dirigida en el sitio con oligonucleólidos (Sambrook y oíros, supra). Además, cualquier combinación de siíios de restricción localizados simultáneamente en los genes guaB y guaA puede ser uí?lizada para obfener los muíanles de eliminación de la preseníe invención; ejemplos de los cuales incluyen Acclll, Afllll, Ahall, AlwL, AlwNI, Asul, Banl, Bcnl, Bsp1286, BspMII, y Ddel (Figuras 3A-3G). La inacíivación del gen guaA y/o del gen guaB lambién puede ser realizada a íravés de una inserción de ADN extraño utilizando cualquiera de los sitios de resfricción anteriormeníe mencionados, o a íravés de mufagénesis dirigida en el sitio con oligonucleótidos (Sambrook y oíros, supra) con el fin de iníerrumpir la íranscripción correcía de guaB y/o guaA. El íamaño íípico de una inserción que puede inacíivar el gen guaA y el gen guaB es de un par de base a 100 kbp aunque se prefieren inserciones más pequeñas que 100 kbp. La inserción puede hacerse en cualquier lugar deníro de la región de codificación del gen guaA o del gen guaB, o eníre la región de codificación y el promofor. Oíros méíodos para la inaclivación del gen guaA y/o de gen guaB incluyen la fransferencia hacia Salmonella de eliminaciones o inserciones hechas en oíros genes de guaA o guaB de enterobacterias, eliminaciones generadas por íransposones, y escisión imprecisa de inserciones de ADN. Los dos úllimos métodos son probablemente los mejores ara hacer eliminaciones que se exíienden mas allá del gen guaA o guaB y, por lo íanto, no se prefieren. Los muíanles de gua de la preseníe invención son úíiles para el desarrollo de una vacuna oral viva candidata de Salmonella no reactogénica. Los candidatos de la vacuna de Salmonella pueden ser construidos, los cuales, por ejemplo, además de contener otras mutaciones de atenuación, fallan al expresar los productos de gen aro. Eslo puede ser logrado eliminando la porción de por lo menos uno de los genes aro (aroA, aroC, o aroD) en el cromosoma de Salmonella, haciendo que la cepa sea auxotrófica para PABA, un substrato que no puede ser barrido en la célula de mamífero, tal como Salmonella typhi cepa CVD 908 (Hone y otros (1991), supra. En otra modalidad, los objetos anteriormente descritos de la presente invención se satisfacen a íravés de una vacuna de fiebre íifoidea que comprende: (A) una canfidad farmacéuticamente efecíiva del mufaníe Salmonella typhi, en donde dicho mutanfe consíiluíivamente expresa el antígeno Vi; y (B) un vehículo o diluyente farmacéuticamenle. En oíra modalidad más, los objelos aníeriormenfe descrifos de la presente invención se satisfacen por una vacuna de vector vivo que comprende: (A) una cantidad farmacéuticameníe efecíiva del mutante de Salmonella, en donde dicho mutaníe consíifufivamenfe expresa el aníígeno Vi, y en donde dicho muíaníe codifica y expresa un aníígeno extraño bajo el confrol de un promolor procarióíico (es decir, expresión bacíeríana del anfígeno exfraño); y (B) un vehículo o diluyenle farmacéulicameníe aceplable. El aníígeno exíraño parlicular empleado en el vecfor vivo de Salmonella no es crílico para la présenle invención. La cepa(s) de Salmonella aíenuada de la présenle invención puede ser utilizada como un vector(s) vivo para la inmunización contra patógenos entéricos (paíógeno definido como bacíeriano, viral, efe), paíógenos de enfermedad sexualmeníe fransmifida, pafógenos de enfermedad del tracfo respiraíorio aguda, o paíógenos con una enfrada de mucosa que conducen a manifesfaciones sistémicas graves de enfermedad (por ejemplo, enfermedad meningococal). También se puede utilizar para proteger contra diferentes lipos de infecciones parásiías, íales como la especie Plasmodium falciparum, Leishimania, Entameba histolytica y Cryptosporidium.

Ejemplos de anfígenos de palógenos enféricos que pueden ser expresados en los vectores vivos de Salmonella de presente invención incluyen: (a) factores de colonización fimbriales de E. coli enteroloxigénico, y ya sea la subunidad B de enleroíoxina lábil con calor o una enleroíoxina lábil con calor muíanle (que no ocasiona secreción intestinal, pero produce antitoxina neutralizante); (b) antígenos fimbriales y/o intimina de E. coli enterohemorrágica, junto con la subunidad B de la toxina 1 o 2 de Shiga (o toxina mutante 1 o 2 de Shiga); (c) antígenos O de Shigella y antígenos de plásmido de invasión o Virg de Shigella; (d) antígenos de neutralización a partir de rotavirus; (e) ureasa, aníígenos de colonización y oíros aníígenos proíeclores de Helicobacter pilori; y (f) foxinas ¡naclivadas de Clostridium difficile o anfígenos derivados de las mismas. Ejemplos de aníígenos de paíógenos sexualmeníe fransmifidos que pueden ser expresados en los vecfores vivos de Salmonella de la preseníe invención incluyen: (a) Pili y oirás proíeínas de membrana de Neisseria gonorrhoae; y (b) Proíeínas de Chalamydia trachomati. Ejemplos de aníígenos de paíógenos del fracío respiraforio agudos que pueden ser expresados en los vecíores vivos de Salmonella de la preseníe invención: (a) una foxica de difteria muíanle con subsfituciones en el dominio de unión NAD que carece de actividad tóxica y aún más, produce antitoxina neutralizanle; (b) anfígenos de Bordetella pertussis, incluyendo una profeína de fusión que consiste de la subunidad S1 truncada de la toxina pertusis fusionada al fragmenío C de la toxina de télano, loxina de perlusis mutante, hemaglutinina filameníosa y perfacfina; (c) glicoproleínas F y G del virus sinciíial respiraíorio; (d) polisacárido capsular de Haemphlus influenzae íipo b; y (e) polisacáridos capsulares del grupo A y C de Neisseria meningitidis, y proíeínas de membrana exíerna del grupo B N. meningitidis. Ejemplos de anfígenos de parásifos que pueden ser expresados en los vecíores vivos de Salmonella de la présenle invención incluyen: (a) la proteína circunsporozoita (CSP), antígeno-1 de tapa de hígado (LSA-1), SSP-2 (también conocido como TRAP) y Exp-1 de Plasmodium falciparum; (b) antígenos de tapa eritrocílica asexuales de P. falciparum, incluyendo MSP-1, MSP-2, SERA, AMA-1 y SEP; (c) anlígenos de fapa sexual de P. falciparum, incluyendo pfs25, y gp63 de la especia Leishmania; y (d) la proteína Entameba histolytica rica en serina (SREHP).

En otra modalidad más, los objetos anteriormenle descriíos de la presente invención han sido satisfechos a través de una vacuna mediada por ADN, que comprende: (A) una cantidad terapéuíicameníe efecfiva de un mufaníe de Salmonella, en donde dicho muíaníe consliíuíivameníe expresa el anlígeno Vi, y en donde dicho mulanfe confiene un plásmido que codifica y expresa, ufilizando un promolor Eucarióíico, en una célula eucarióíica, un anfígeno exíraño; y (B) un vehículo o diluyeníe farmacéuticameníe aceplable. Los detalles de la construcción y el uso de vacunas mediadas por ADN se pueden encontrar en la solicitud de patente de E. U. A. serie No. 08/433,790, presentada el 3 de mayo de 1995, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad. El aníígeno exíraño particular empleado en la vacuna mediada por ADN no es crííico a la preseníe invención. Ejemplos de dichos anfígenos incluyen aquellos a paríir de una diversidad de paíógenos, íales como influenza (Jusíewicz y oíros, J. Virol., 69:7712-7717 (1995); y Fynan y oíros, Iní. J. Immunopharmacol., 171:79-83 (1995)), virus de coriomeningitis linfocítica (Zarozinski y oíros, J. Immunol., 154:4010-4017 (1995)). Virus de inmunodeficiencia humana (Shiver y otros, Ann. NY. Acad. Sci., 772:198-208 (1995)), virus de hepatifis B (Davis y oíros, Vaccine, 12:1503-1509 (1994)), virus de hepatitis C (Lagging y otros, J. Virol., 69.: 5859-5863 (1995)), virus de rabia (Xiang y oíros, Virology, 209:569-579 (1995)), Schistosoma (Yang y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:1020-1039 (1995)), Plasmodio (Sedegah y oíros, Proc. Naíl. Acad. Sci., USA, 91.9866- 9870 (1994)); y micoplasma (Barry y otros, Nature, 377:632-635 (1995)). La decisión de sí expresar el antígeno extraño en Salmonella y utilizando un promotor procariótico en una vacuna de vector vivo) o en las células invadidas por Salmonella (utilizando un promoíor eucarióíico en una vacuna mediada por ADN) puede basarse en que construcción de vacuna para ese antígeno paríicular proporciona la mejor respuesla inmune en estudios animales o ensayos clínicos, y/o, si la glicosilación de un antígeno es esencial para su inmunogen?cidad protecíora, y/o, si la conformación lerciaria corréela de un anfígeno se logra mejor con una forma de expresión que la otra. En las vacunas de la presente invención, la cantidad farmacéuticamente efectiva de los mutantes de la presente invención que serán administrados, puede variar dependiendo de la edad, peso y el sexo del sujeto, y el modo de administración. En general, la dosis empleada será de aproximadamente 102 cfu a 1010 cfu. De preferencia, se utiliza alrededor de 106 cfu a 109 cfu para una administración oral en donde la vacuna es dada en cápsulas o es resuspendida en una solución de regulador de pH para proteger a la bacteria aíenuada confra el pH ácido en el esíómago; o de aproximadamente 102 cfu a 107 cfu se uíiliza para adminisíración ¡níranasal, en donde Ja bacleria es dada en gofas o en aerosol. El vehículo o diluyeníe farmacéuficameníe acepíable, parficular empleado, no es orifico a la preseníe invención, y son convencionales en la íécnica. Los ejemplos de diluyenles incluyen: reguladores de pH para regular el pH contra el ácido gástrico en el esíómago, íales como regulador de pH de cifraío (pH 7.0) confen?endo sacarosa, regulador de pH de bicarbonaío (pH 7.0) solo (Levine y oíros, (1987b) supra; y Black y oíros, supra), o regulador de pH de bicarbonaío (pH 7.0) coníiendo ácido ascórbico, lacíosa y opcionalmenfe asparíame (Levine y oíros, Lanceí, J1467-470 (1988). Ejemplos de vehículos incluyen: proíeínas, por ejemplo, como las que se encuenfran en la leche descremada, azúcares, por ejemplo, sacarosa; o polivinilpirrolidona. Los mulaníes de la preseníe invención pueden ser almacenados a -70°C, mieníras se suspenden en caldo de Luria (DIFCO) coníeniendo 30%-50% (v/v) de glicerol. Se proporcionan los siguienfes ejemplos solamenfe para propósifos ilustraíívos, y de ninguna manera preíenden I i mitar el alcance de la preseníe invención.

EJEMPLO 1 Construcción de la Cepas ?qt/aB-A S. typhi A. Consfrucción del cásele de eliminación AguaB-A, pJW101 Los segmeníos de ADN que incluyen el término 5' del gen guaB, y el término 3' del gen guaA fueron amplificados mediante PCR utilizando ADN genómico de cepa Ty2 de S. typhi como plantilla, y después se fusionaron en una segunda reacción de PCR, dando así surgimiento al alelo (Figura 4). Los métodos utilizados en la construcción del alelo AguaB-A fueron análogos a aquellos descritos en la consfrucción del alelo AguaB-A en la segunda cepa de AguaB-A S. flexneri, CVD 1204 (Noriega y oíros (1996), supra; y solicifud de pateníe de E. U. A. serie No. 08/629,600, presenfada el 9 de abril de 1996 (no concedida), la cual se incorpora aquí por referencia en su tolalidad). En la primera reacción de PCR (Figura 4), los iniciadores uíilizados para amplificar el íérmino 5' del alelo guaB fueron: 5'- CGAGCTCGCAGCTCGGTAAAGTACCAGTGACCGGAAGCTGGTTGCGT-3' (SEC ID NO:2); y 5'- GGGCCCGGGGGATCCTCAACCGACGCGCAGTCACGATACGAGTTGTA CAGAT-3* (SEC ID NO:3); y los iniciadores ufilizados para amplificar el término 3' del alelo AguaB-A fueron: 5'- TGAGGATCCCCCGGGCCCGGCTACGCGCAGGTTGAAGTCGTAAACGA CAGC-3' (SEC ID NO:4); y 5'- GCTCTAGAGCTTCTAGAGCTCATTCCCACTCAATGGTAGTGGCGGCTT -3' (SEC ID NO:5) Dentro de los iniciadores internos (SEC ID NOS:3 y 4) se inírodujeron un codón de señal de defención en marco (TGA y TCA) corriente arriba de dos sitios únicos de restricción (Apal y BamHI) (subrayados) que fueron agregados para la introducción de genes exfraños en el alelo cromosomal AguaB-A. La señal de deíención evita las fusiones de traducción de AguaB con productos de AguaA o del producto AguaB con los productos de genes extraños insertados a la mifad del alelo AguaB-A. Además, estos iniciadores internos introdujeron secuencias que sirvieron como la región homologa (en negr?ías) con las cual los producios de PCR 5' y 3' fueron fusionados en la segunda reacción de PCR (formando así el alelo ?guaB-A), (Figura 4). En la segunda reacción de PCR, se fusionaron los segmenlos 5' y 3' utilizando los iniciadores extremos (SEC ID NOS:2 y 5), y el producto de fusión resultante fue amplificado en la misma reacción. En esta reacción, la región homologa dada (Apal-BamHI) se calentó y se enfrió rápidamente, efectivamenfe fusionando los segmeníos 5' y 3', los cuales en ese momento pudieron ser activados como sus propios iniciadores y/o plantilla para la polimerasa TAQ, dependiendo de cual de las cepas de ADN fue calentada y enfriada rápidamente. Para facilitar esta fusión, se diseñó un programa de PCR, en donde los primeros 15 ciclos tuvieron una inclinación de temperatura de calentamiento-enfriamiento (1°C/8 seg de 40°C a 50°C + 50°C durante 2 min), seguido por 15 ciclos con una temperafura de calenlamienío-enfriamiento de 55°C, en donde el nuevo alelo AguaB-A fue amplificado. De esía manera, exisíieron 900 pares de bases del operón guaB-A que no fueron amplificados, dando surgimíenío a AguaB-A (Figura 4). Los iniciadores exfremos (SEC ID NOS:2 y.5) fueron diseñados para inlroducir siíios de restricción únicos (Sstl y Xbal) (subrayado) que fueron utilizados para clonar el alelo ?guaB-A a sitios de restricción únicos en el plásmido de suicidio sensible a la temperafura, a base de pSC101 (Blomfield y otros, Mol. Microbiol., 5_:1447-1457 (1991)), pFM307A, dando surgimiento al plásmido pFM307::?guaB-A. El plásmido FM307A (6.3 Kbp) fue conslruido subsfiíuyendo un fragmenío de Nael-Nael de 4.3 kbp, confeniendo el gen cam (res?síencia a cloramfenicol) en plB307 (Blomfield y otros, supra) con un fragmento de BamHI-BamHI de 3.8 kbp (de extremos rasurados mediante polimerasa Klenow) conleniendo el caseíe SacB-Kan (proporcionando resisfencia a canamicina y contra selección de sacarosa) a partir de plB279 (Blomfield y oíros, supra). Además, se consideró venfajoso inseríar un marcador de selección que no es un aníibióíico a la miíad del alelo AguaB-A con el fin de: (i) faciliíar el iníercambio de AguaB-A para el alelo guaB-A experío en Ty2; y (ii) proporcionar un marcador de selección que podría permitir la ideníificación de la cepa de vacuna en el campo. De esía manera, enseguida, se obluvo el operón de resisíencia a arsénico de 5.0 kbp (ars) del facíor R, R773, como el fragmento Hindlll de pUM1 (Chen y otros, J. Bacteriol., 161:758-763 (1985)) (amistosamente provisto por el Dr. Rosen, Wayne Staíe Universily, Deíroií, Ml), y clonado bajo la regulación del promoíor P ac en pKK223-3 (Pharmacia, Piscaíaway, NJ). Después, se obíuvo un segmenío de Ptac-ars Nael-Dral (de exíremo rasurado), y se clonó en el siíio Apal (de exfremo rasurado medianíe polimerasa T4) del alelo AguaB-A en pFM307:: AguaB-A, produciendo pJW101 (Figura 4).

B. Muíaciones Acíivadas por el Caseíe de Eliminación Suicida Se ulilízó pJW101 para inlroducir el alelo AguaB-A. Ptac-ars en el mismo en la cepa de S. typhi de fipo silvesfre, Ty2 a íravés de recombinación homologa, como se describe por Blomfield y oíros, supra; Noriega y oíros (1995), supra, y Noriega y oíros (1996), supra, con la excepción de que esíuvieron preseníes 6.0 µM de arsenita de sodio (SIGMA) en el medio a íravés del procedimienío.

C. Clasificación de Mutaníes a Través de Sondas de ADN y PCR Se desarrollaron clones candidaíos a 37°C duraníe la noche en un paírón de rejilla sobre placas de agar de Luria suplemenfadas con 6.0 µM de arseniía de sodio o en un medio mínimo. Las colonias que crecieron en el agar L suplemeníado con arseniía, pero no crecieron en el medio mínimo, después fueron transferidas a un papel filtro No. 541 (Whaíman, Maidsfone, Inglaíerra) y se tiñeron como se describió por Gicquelais y otros, J. Clin. Microbiol., 28.:2485-2490 (1990), y se aplicaron sondas uíilizando un oligonucleólido de 40 bp marcado con ?P32: 5'-GGGCGGCTGCGCTCCTGTATGGGTCTGACCGGCTGTGGT-3' (SEC ID NO:6), correspondiendo a una porción eliminada del alelo de íipo silveslre guaB-A (sonda negaíiva). Los clones que fallaron para hibridizar con la sonda de oligonucleóíido de 40 bp marcada con ?P32, fueron seleccionados. Los clones de AguaB-A S. typhi no fueron capaces de crecer en un medio mínimo a menos que se suplemeníará con 10 mg de guanina/l. La mutación de eliminación en el operón guaB-A y la inserción de Ptac-ai"s en el alelo AguaB-A fue confirmada a íravés de hibridación de unción Soulhern con un operón ?guaB-A marcado con P32, operón ars, y la sonda negaliva guaB-A anferiormeníe descriía. Arbilrariamenfe se seleccionó un clon AguaB-A S. Typhi y se denominó como CVD 915. La cepa CVD 915 fue deposifada en American Type Culíure Collecfion el 4 de mayo de 1998, bajo ATCC No. 202115. La cepa CVD 915 por ruíína se desarrolló con 6.0 µM de arsenita de sodio en el medio pero, no se obfuvo ningún desarrollo a esía concentración de arsenita con la cepa Ty2, o con cualquier oíra cepa de Salmonella, Shigella o E. coli, probada.

EJEMPLO 2 Invasión y Crecimiento Intracelular en Cultivos de Tejido La invasión y el crecimienío infracelular fueron analizados utilizando ensayos de protección de gentamicina, los cuales se realizaron con ligeras modificaciones a los métodos previamente descritos por Tartera y otros, Infecí. Immun., 61:3084-3089 (1993).

En resumen, se infectaron monocapas de célula de Henle 407 semiconfluentes en placas de 24 cavidades, en cavidades por fríplícado ya sea con la cepa de íipo silveslre Ty2; AguaB-A CVD 915; AaroC, AaroD CVD 908 o AaroC, AaroD, Ahtr CVD 908-htrA a una relación de 50:1, durante 90 minutos, después de lo cual, se aniquilaron los organismos exíracelulares con 100 µg/ml de genfamicina duraníe 30 minutos, se lavaron (punto de tiempo 0 horas), y después se incubaron con 20 µg/ml de gentamicina. En la hora 0, la hora 4 y la hora 22 posteriormeníe, se usaron las monocapas de culíivo de lejido infeclado por íriplicado con agua esíéril y diluciones en serie de esa suspensión culíivada duranle la noche, a 37°C, en agar LB suplemeníado con 10 µg de guanina por liíro. Los resulíados se mueslran en el Cuadro 2 a conlinuación.

CUADRO 2 Invasión y Crecimiento Intracelular de Células Henle 407 cfua Iníracelular Cepa Genotipo 0 horas 4 horas 22 horas Ty2 íipo silvesfre 6.7x103 3.1x104 8.8x104 CVD 915 ?guaB-A 3.3x102 2.9x102 2.5x102 CVD 908 AaroC, AaroD 5.8x10' 1.3x10¿ 3.5x10c CVD 909-hírA AaroC, AaroD, Ahtr A 1.3x10l 3.4x103 1.3x10: Unidades de formación de colonia.

Como se muesíra en el Cuadro 2 anferior, la cepa CVD 915 luvo una capacidad de invasión y un crecimienío inlracelular que fue significativameníe más bajo que aquel exhibido por la cepa Ty2 de lipo silveslre, y comparable con aquella exhibida por la cepa CVD 908-hírA. Es decir, como se muestra en el Cuadro 2 anterior, en dos diferenles experimeníos, la cepa de S. typhi, de íipo silvesíre Ty2 eficieníemenfe invadió células Henle 407, y se replicaron 13 veces en un período de 22 horas. La cepa AaroC, AaroD de CVD 908 consisfenlemeníe fuvo menos generaciones ¡nlracelulares, es decir, 6 veces, 22 horas. También como se muesíra en el Cuadro 2 anterior, la cepa mutaníe ?guaB-A CVD 915 fue significativameníe menos invasiva para las células Henle que su origen de íipo silvesíre o las cepas CVD 908 y CVD 908-htrA, y su crecimienlo iníracelular, es decir, 0 veces, fue equivalenle a aquel del muíanle CVD 908-htrA.

EJEMPLO 3 Seguridad Comparativa de Cepas Candidatas de Vacuna Ty21A, CVD 908 v CVD 915 La aíenuación de la cepa AguaB-A S. typhi, CVD 915, se averiguó con respeclo a la cepa de tipo silvestre Ty2 y ofra cepas aíenuadas, utilizando en ensayo de hog-mucina de murino (Powell y otros, J. Biolog. Estándar., ¡8:79-85 (1980)). En resumen, los ratones fueron inoculados intraperiíonealmenfe con varias diluciones de 10 veces de las diferentes cepas suspendidas en O 5 ml de hog-mucina al 10% (p/v) Subsecuentemeníe, los ratones fueron seguidos por mortalidad ocurriendo a las 72 horas después de la inoculación, y se calcularon los LD5o de los diferentes grupos a través del análisis de su regresión lineal. Los resudados se mueslran en el Cuadro 3 a coníinuación.

CUADRO 3 Ty2 1.4 x 102 CVD 908 4.4 x 106 CVD 915 7.7 x 107 Ty21a 1.9 x 108 Como se muestra en el Cuadro 3 anterior, la cepa CVD 915 tuvo un LD50 esíimado que fue de más de 5 registros por arriba de aquel oblenido de la cepa de íipo silvestre Ty2, y entre aquel obíenido por la cepa mutante AaroC, AaroD de CVD 908 y la cepa no invasiva, químicamente mutagenizada, Ty21a.

EJEMPLO 4 Uso de la Cepa CVD 915 como un Vector Vivo para Suministrar Proteínas Extrañas y Plásmidos de Vacuna de ADN para Expresar Antígenos Extraños en Células Eucarióticas Un modelo de raíón de inmunización intranasal con cepas AaroC, AaroD genéticameníe diseñadas por ingeniería de S. typhi (CVD 908) llevando el fragmenlo C de íoxina de íétano (fragmento C de TT) ha sido descrito por Galen y otros, Vaccine, 15:700-708 (1997). Las construcciones que fueron analizadas en este modelo incluyeron plásmidos llevando CVD 908 que codifican el fragmento C no fusionado de TT bajo el control de un promotor procarióíico anaeróbicamente acfivado derivado de NirB o el promoíor consíifuíivo poderoso Lpp. Se observó que: (i) inmunización infranasal de rafones con estas construcciones dio como resultado alias litulaciones de anticuerpos IgG en el suero anti-TT; (ii) los ratones inmunizados fueron prolegidos contra un ataque con 150% de dosis letales de TT que aniquilaron todos los ratones de conírol; (?íi) que las células obfenidas de los bazos y nodos linfáíicos regionales cervicales de raíones inlranasalmente inmunizados 6 semanas después de la inmunización mostraron respuestas proliferaíivas imporíanfes a S. typhi (flagelo Hd y parlículas de S. typhi de célula eníera inacíivadas con fenol), así como al fragmenío C de TT y anlígenos TT. Eslas invesligaciones han sido exlendidas esfudiando la inmunogenicidad en ralones de cepas aíenuadas novedosas de S. typhi llevando plásmidos que confienen genes que codifican antígenos extraños (es decir, el fragmento C de TT) bajo el control de promotores procarióticos o eucarióticos.

A. Respuestas Inmunológicas Producidas por Inmunización con Cepas Atenuadas de S. tvohi Llevando Vecíores de Expresión Procarióíicos y Eucarióíicos gue Codifican el Fragmento C de TT Después de la observación de que respuestas inmunes pueden ser producidas mediante inmunización directa con ADN de plásmido (Ul'mer y otros, Science, 259:1745-1749 (1993)), varios vectores de ácido nucleico que codifican anfígenos exíraños han sido evaluados como vacunas. La vacunación de ADN ha mosírado producir allos niveles de respuesías inmunes fanlo humorales como medidas por célula ufilizando plásmidos que codifican muchos anlígenos virales, incluyendo NP de virus de influenza A (Ulmer y oíros, supra). Desde esía observación íemprana, varios vecíores de ácido nucleico que codifican antígenos extraños han sido evaluados como vacuna. En paríicular, la vacunación de ADN ha sido muy extensamenfe estudiada utilizando aníígenos de virus de influenza. Las respueslas inmunoproíecíoras han sido inducidas en raíones (Finan y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., U. S. A., 90: 11478-11482 (1993a); Justwicz y otros (1995), supra; y Justewicz y otros, Virol., 224:10-47 (1996)), hurones (Webster y oíros, Vaccine, 12.: 1495-1498 (1994)), pollos (Finan y oíros, DNA Cell Biol., 1_2:785-789 (1883b); and Finan y oíros (1993a), supra) y primales que no son seres humanos (Donnelly y otros, Nat. Med., 1:583-587 (1995)), siguiendo inmunización intramuscular (i. m.) o epidérmica (pistola de gen) con vectores de expresión eucarióticos que codifican antígenos del virus de influenza. Las respuesta inmunes contra varios otros antígenos de otros virus (Cox y otros, supra; Davis y otros (1886a), supra; Sonnelly y otros, supra; Lagging y oíros, supra; Wang y oíros, Virol., 211:102-112 (1995); y Zarpzinski y oíros, supra; parásilos (Doolan y oíros, J. Exp. Med., 183:1739-1746 (1996); Gardner y oíros, J. 'Pharm. Sci., 85:1249-1300 (1996); Hoffman y otros, Vaccine, 12.: 1529-1533 (1994); Sedegah y otros, supra; y Yang y otros, supra); bacterias (Anderson y otros, Infecí. Immun., 61:3168-3173 (1996); Barry y oíros, supra; Huygen y oíros, Nal. Med., 2:893-898 (1996); Luke y oíros, J. Infecí. Dis., 175:91 -97 (1997); y Tascon y oíros, Nat. Med., 2:888-892 (1996)); y células tumorales (Conry y oíros (1995), supra; y Wang y otros, Human Gene Therapy, 6:407-418 (1995)) también han sido inducidas por vacunación de ADN en varios modelos de animal. Estos estudios han incremenfado el enfendimiento de la naíuraleza de la respuesía inmune producida por vacunas de ADN. Por ejemplo, se han producido fuerles respuesfas de aníicuerpo en raíones coníra el aníígeno de superficie de hepaíitis B (HBsAg) después de una inmunización i. m. Individual con un plásmido que codifica este antígeno (Davis y otros, Hum. Mol. Gener., 2:1847-1851 (1993); y Michel y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., U. S. A., 9_2:5307-5311 (1995)). En esíos esíudios, se observaron tiíulaciones pico de IgG 4-8 semanas después de la inmunización, las cuales persislieron a alfós niveles duraníe 6 meses. Las vacunas de ADN que codifican esíe anfígeno íambién han mosírado ser efectivas para producir anticuerpo y respuestas CTL resíringidas de clase 1 de MHC en ratones que no son sensibles a HBsAg purificado (Davis y otros, (1996b), supra; y Schirmbeck y otros, J. Virol., 6_9: 5929-5934 (1995)). De esta manera, por lo menos en el caso de HBsAg, la vacunación de ADN ha mostrado superar la restricción genélica en raíones, e inducir una respuesta inmune más persistenfe que la inmunización pareníeral con proíeínas purificadas. La toxina de tétanos (TT) es una potenfe neurotoxina sinfelizada por Clostridium tetan. La inmunidad protecíora coníra tétanos en el hombre y animales está correlacionada con la titulación de anticuerpos neutralizantes TT en el suero (Bizzini, In: Clostridium Tetan, Gyles y otros (Eds.), lowa Stafe Universify Press, Ames, IA, págs. 97-105 (1993); y Habig y oíros, Bacines and Immunolherapy, Cryz (Ed.), Pergamon, New York, págs. 13-19 (1991)). De esla manera, una buen prolección coníra létanos puede ser inducida por inmunización parenteral con TT inactivado o derivados no tóxicos. La medición de la potencia de dichas preparaciones de vacuna es un procedimiento bien establecido, y se describe por European and British Pharmacopeias (Coster y oíros, Lancet, 345:949-952 (1995); y Sánchez y oíros, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 89:542-545 (1995)). El nivel de anticuerpo anti-tétanos es tradicionalmeníe deíerminado por ensayos de neutralización de toxina en ratones. Recientemente, se han desarrollado ensayos sensibles de ELISA, los cuales son menos consumidores de tiempo y cosfosos pero, se correlacionan bien con la prueba de neuíralización de íoxina (Manghi y otros, J. Immunol. Methods, 168:17-24 (1994); and Melville-Smith, In: Diptheria and Tetanus Antitoxins, Wreghiff y otros (Eds.), ELISA ¡n the Clinical Microbiology Laboratory, Public Health Laborafory Service, Londres, págs. 136-147 (1990)). Las lulaciones del aníicuerpo aníi-toxina en el suero son normalmente determinadas en lU/ml (en donde 0.1 lU/ml en el suero humano es suficiente para proteger contra el ataque de TT) a través de comparación con un suero ant?-TT esfándar iníernacional (WHO). De esía manera, la poíencia de la vacuna (expresada en lU/ml) puede ser comparada para diferentes preparaciones de vacuna TT. En la actualidad, las preparaciones de vacuna contra tétanos son producidas por inactivación de formaldehído de TT a partir de C. tetani, el cual es un procedimienfo técnícamenfe demandante, consumidor de tiempo. Esto ha promovido una búsqueda para preparación destoxificadas alfernaíivas de TT como vacunas. TT consiste de una proteína de 150 kDa conteniendo un disulfuro de cadena ligera (L) de 50 kDa unido a una cadena pesada (H) de 100 kDa (Helíing y oíros, J. Biol. Chem., 252:187-193 (1977a); y Niemann y oíros, Molecular Biology of Closíridial Neurofoxins, Alouf Ed., Sourcebook of Bacíerial Proíein Toxins, Academic Press, Londres (1991)). La aclividad íóxica de esía proteína yace dentro de la cadena L, una proteasa dependiente de zinc (Schiavo y otros, EMBO J., 11:3577-3583 (1992)), la cual se cree que media el bloqueo de la liberación del inhibidor de neuronas a través de proteólisis de sinapíobrevina (Schiavo y otros, Nature (Londres), 359:832-835 (1992)). La cadena H se cree que inicia la unión y el consumo de la toxina en membranas presinápticas (Helíing y oíros, J. Biol. Chem., 252:194-197 (1977b); y Morris y otros, J. Biol. Chem., 255:6071-6076 (1980)). La digestión de la molécula de íoxina con papaína produce un polipéplido de 50 kDa, el cual corresponde a la terminal C de la cadena H y una molécula de 100 kDa que corresponde a la cadena L enlazada al término N de la cadena H (Healíing y oíros (1977a), supra). El polipépfido de 50 kDa, denominado fragmento C de TT (FC), es no tóxico pero posee gangliosida (Halpern y otros, Infecí. Immun., 58.:1004-1009 (1990); y Morris y otros (1980), supra) y acfividades de unión de proteína (Schíavo y oíros, FEBS. Lett., 290:227-230 (1991)). En esíudios anteriores, la vacunación de animales con FC derivado por proleólisis de loxina nafíva se mosíró que los proíege contra el ataque letal subsecueníe con TT (Healting y oíros (1977a), supra). Además, los esíudios con anticuerpos monoclonales demostraron que existen epiíopos de neutralización dentro de esta molécula (Kenimer y oíros, Infecí. Immun., 42.:942-948 (1983)). De esfa manera, FC fue identificado como una buena molécula candidato para la producción de vacunas TT alternaíivas. Datos recientes han indicado que la inmunización intramuscular con un plásmido que codifica el fragmento CC de TT bajo el control del promotor CMV del promotor CMV/región mejoradora (pcDNA3/tetC) produjo alias íitulaciones de anticuerpo en el suero anti-fragmento C, respuesías proliferativas y producción de interferón-?. Además, se mostró que estos ratones fueron protegidos contra un aíaque leíal con TT (Anderson y otros, supra).

Un esfuerzo para explorar adicionalmente si la inmunogenicidad y capacidad protectora de pcDNA3/tet pueden ser oplimizadas, se inició una serie de esfudios para suminisírar esla consírucción al huésped a través de cepas atenuadas de S. fyphi. Esfe aspecío tiene el potencial de proporcionar un nuevo sisíema de suminislro para vacunas mediadas por ADN conlra enfermedades baclerianas y oirás enfermedades infecciosas. Una descripción de eslos estudios, incluyendo la construcción de pcDNA3/feíC, se eslablece a coníinuación. 1. Gen gue Codifica el Fragmenío C de TT La secuencia del gen que codifica TT ha sido descriía en la íécnica (Eisel y otros, EMBO J. , 5:2495-2502 (1986); Fairmeather y otros, J. Bacteriol., 165:21-27 (1986); y Fairmeather y oíros, Nucleic. Acids Res., 14:7809-7812 (1986)). Los veclores de plásmido que codifican una secuencia nativa del fragmento C bajo el control de Ptac previamente se mosíró que expresan FC en E. coli a un bajo nivel (3-4% tcp) (Makoff y otros, Bio/Technology, 7.:1043-1046 (1989)). Con el fin de incrementar el nivel de expresión, el uso de codón del fragmento C nativo, (el cual es íico en A-T) fue optimizado para E. coli. El 99% resultante del gen del fragmento G sintélico (tetC) dirigió la expresión a niveles más altos (11-14% tcp) en E. coli (Makoff y otros, Nucleic. Acids Tes., 17:10191-10202 (1989)). Esto inciló la inveslígación de oíros sistemas de expresión como un medio para producir grandes cantidades del fragmento C para la vacunación. Las preparaciones del fragmento C recombinante purificadas a partir de células de levadura (Clare y oíros, Biotechnology (N. Y.), 9_:455-460 (1991); y Romanos y otros, Nucleic. Acids Res., 19.: 1461 -1467 (1991)), y células de insecto cultivadas (Charles y oíros, Infect. Immun., 59_:1627-1632 (1991)), ahora también han mostrado inducir respuestas inmunes protectoras contra toxina de tétanos después de la inmunización parenteral. En forma interesante, como en el caso con E. coli, el gen C. tetan nativo que codifica el fragmento C no puede ser expresado en Saccharomyces cerevisíae, mientras que el gen optimizado con codón de pTETtac115 fue expresado por este organismo. El gen del fragmento C sintéfico que ha sido opfimizado en el codón para la expresión en E. coli, por Jo tanto, pareció haber sido fortuitameníe optimizado por la expresión en eucariotes. 2. Consírucción de pTETnir15 El alio nivel de expresión conslitutiva de antígenos extraños in vivo puede dar como resultado la pérdida del plásmido que codifica al antígeno, dañando la habilidad de la cepa portadora para suministrar el antígeno al sistema inmune. Consecuentemente, se han utilizado varios aspectos para mantener la estabilidad del plásmido in vivo. Uno de estos aspectos es el uso de promotores de inducción in vivo, íales como el promoíor nirB. Esíe promoíor fue originalmente definido en E. coli, en donde controla la expresión de un operón que incluye el gen de reductasa de nitraío dependieníe de NADH, nirB. Es regulado por nifratos, y cambia en la tensión de oxígeno del ambieníe, la actividad pico siendo obtenida bajo condiciones anaeróbicas. Una versión modificada del promotor nirB ha sido construida, la cual es inducida cuando células bacterianas se desarrollan en una atmósfera de disponibilidad limitada de oxígeno o entran a células eucarióticas in vitro. Los plásmidos homólogos a base de Col-E1, los cuales expresan el fragmento C de los promotores NirB y tac, respectivameníe, han sido construidos. Se mostró que estas cepas inducen protección contra el ataque con TT después de inmunización oral. Sin embargo, se requieren de dos dosis de la cepa a base de tac para asegurar una protección completa, mientras que solamente una dosis de la cepa que expresa el fragmento C utilizando el promotor nirB fue requerida. De esta manera, la construcción nirB probó ser más resisfeníe y esfable in vivo que la construcción tac (Chaífield y otros, Biotechnology, 10:888 (1992b)). 3. Construcción de pcDNA3/tetC La consírucción y caracterización del plásmido pcDNA3/íeíC se realizó como se describió por Anderson y oíros, supra, la cual se incorpora aquí por referencia en su tolalidad (Figura 5). 4. Inmunización con S. fyphi CVD 915 que Aloja pcDNA3/íeíC o pTETnir15 Como se discuíió aníeriormeníe, se iniciaron estudios para evaluar la capacidad de cepas atenuadas de S. fyphi para suministrar vectores de expresión procarióíicos y eucarióficos que codifican anlígenos exíraños, por ejemplo, el fragmenfo C de TT, al sisíema inmune de mamíferos e inducen respuestas inmunes protecforas. Para comparar esle sisíema con la inmunización de ADN natural tradicional, la respuesta producida por el veclor pcDNA3/teíC natural también fue evaluada. Hasta este punto, los plásmidos pcDNA3/tetC o pTETnir15 fueron electroforeados en CVD 915. La estructura de los plásmidos purificados fue confirmada separando productos de digesíión de endonucleasa de resíricción de los plásmidos en genes de agarosa: pcDNA3 y pcDNA3/íeíC con Hindlll y Xbal; y pTETnír15 con EcoRI y BamHI. La expresión del fragmento C se confirmó a través de SDS-PAGE, e inmunotinción. Se desarrollaron muesíras bacterianas en la fase fija y se cosecharon alícuotas de 1.0 ml a través de cenírífugación, y se volvieron en 200 µl del regulador de pH de SDS-muesíra. Esías muesíras después se somefieron a SDS-PAGE y tinción Western. Se utilizaron mAB de anti-fragmento C y anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano como primero y segundo anlicuerpos, respeclivamenfe. Cada muestra se cargó a aproximadamente 1.0 x 108 cfu/cavidad. Se utilizó la ruta iníranasal para el vecíor vivo (CVD 915 llevando ambos plásmidos (pcDNA3/íeíC) y CVD 915 (pTETniM 5)), y se utilizó la ruta inlramuscular para inmunización de ADN nafural (pcDNA3/tetC). Se inmunizaron ratones Balb/c de acuerdo con el protocolo mostrado en el Cuadro 4 a coníinuación.

CUADRO 4 . Respuesías de Aníicuerpo Los animales fueron sangradas de la vena reíroorbiíal de acuerdo con el siguiente programa: (a) Antes de la inmunización (b) 14 días después de la inmunización, 35 días después de la inmunización, (c) 14 días después del refuerzo, 28 días después del refuerzo, 42 días después del refuerzo, 56 días después del refuerzo (sacrificio). Se midió el toíal de aníicuerpos en el suero del anti-fragmento C de IgG a íravés de ELISA. En resumen, se uíilizó el fragmenfo C recombinante para cubrir las placas de ELISA con antígeno a 4 0 µg/ml. Los sueros fueron íilulados en 8 diluciones dobles. Los niveles de aníicuerpo se expresaron en unidades iníernacionales medíanle comparación con un suero esfándar calibrado previamente. El suero estándar fue preparado inmunizando raíones con íoxoide de tétanos adsorbido 4 veces a intervalos de 2 semanas. Los sueros fueron combinados y titulados a través de una prueba de neutralización in vivo en ratones de acuerdo con el procedimiento descrilo en European Pharmacopeia. El número de unidades de neuíralización iníernacionales fue deíerminado en paralelo con el eslándar internacional de antiíoxina de íéfanos. Los resultados son como se muestran en la Figura 6. Como se muesíra en la Figura 6, aunque niveles ligerameníe más alfós de anticuerpos parecieron ser producidos por la construcción CVD 915 (pcDNA3/teíC), niveles muy altos de anticuerpos en el suero anli-fragmentos C (1,000 a 2,000 veces el nivel de aníicuerpo anfi-TT protecfor en seres humanos) fueron observados después de inmunización y un refuerzo individual tanío con las consírucciones CVD 915 (pTETnir15) como CVD 915 (pcDNA3/íeíC). Los niveles de anlicuerpo en el suero anli-fragmenío C observados de hasía 20 lU/ml correspondieron a íilulaciones de dilución finales de aproximadamenle 1:50,000. En confraste, niveles relafivameníe modesíos de anticuerpos en el suero aníi-fragmenío C (aproximadamenle 50 veces los niveles anfi-TT protecfores en seres humanos) fueron observados en ratones inmunizados con PcDNA3/íetC natural. Los niveles de anticuerpo en el suero antifragmento C alcanzaron niveles máximos 50 días después de la inmunización primaria, y permanecieron a los mismos niveles hasta 92 días después de la inmunización primaria, el último punto del punto estudiado. No se observó ninguna respuesta en ratones inmunizados solamente con CVD 915. 6. Respuestas Inmunes Mediadas por Célula. Ensayos de Proliferación Noventa y dos días después de la inmunización, se prepararon combinaciones de suspensiones de célula individuales a partir de nodos linfáticos cervicales, nodos linfáticos mesentéricos y bazos de 5 a 6 raíones que permanecen en cada uno de los grupos aníer?ormeníe discutidos. Una combinación de células también se preparó a partir de nodos linfáticos y quinales obíenidos de los ratones inmunizados i. m. con PcDNA3/tefC naíural. Se obfuvíeron los siguientes rendimientos de célula promedio: Nodos linfáticos cervicales: 6.6 x 106 células/ratón Nodos linfálicos mesenléricos: 10.1 x 106 células/raíón Nodos linfáticos inguinales: 1.6 x 106 células/ratón Bazos: 52.5 x 1 O6 células/raíón Se realizaron ensayos de proliferación volviendo a suspender las células en un medio RPMI completo (RPMI conteniendo suero de bovino fefal al 10% (v/v), glulamina y aníibiólicos), y se incubaron a 2.0 x 105 células/cavidad por friplicado en placas con fondo redondo con 96 cavidades en ausencia o presencia de anlígeno. Se uíilizaron los siguientes antígenos solubles en estos estudios: albúmina de suero de bovino (BSA), fragmento C de TT y flagelos de S. íyphi altameníe purificados, a 0.02, 0.2 y 2.0 µg/ml. Después de 5 días de incubación a 37°C, CO2 al 5%, a los cultivos se les aplicaron pulsos con 3H-timidina, y los culíivos íerminaron 18 horas después a fravés de cosecha aufomáíica. Se deíerminó la incorporación de fimidina a íravés de conleo de ciníilación de líquido. Los resulíados, los cuales se muestran en las Figuras 7 y 8, son expresados como índice de estimulación (S. I.). Como se muestra en la Figura 7, la inmunización con las conslrucciones CVD 915 (pTETnirld) y CVD 915 (pcDNA3/leíC), así como la vacuna de ADN naíural PcDNA3/telC, produjo la aparición de células linfoides sensibilizadas que proliferaron en respuesía al fragmenío C de TT. Esías respuesía proliferalivas fueron observadas en poblaciones de célula aisladas de nodos linfálicos cervicales y bazos, pero no en aquellas aisladas de nodos linfáticos mesentéricos. También se observaron respuestas proliferativas específicas para TT. No se observó ninguna respuesta proliferativa importanfe para el fragmento C de TT (> 3 S. I.) en células aisladas de ratones inmunizados con CVD 915 o PBS. Como se muestra en la Figura 8, se observaron respuestas proliferativas para flagelos S. Typhi en poblaciones de célula aisladas de ratones inmunizados con las construcciones CVD 015, CVD 915 (pTETnirld) y CVD 915 (pcDNA3/tetC). También como se muestra en la Figura 8, estas respuestas fueron observadas en todas las poblaciones aisladas de ratones inmunizados con CVD 915 y en células linfoides aisladas de nodos linfáticos cervicales de ratones inmunizados con las construcciones CVD 915 (pTETnirld) y CVD 915 (pcDNA3/telC). También se observaron respuestas proliferativas considerablemente más bajas en esplenociíos y células de nodo linfático mesentéricas aisladas de ratones inmunizados con las construcciones CVD 915 (pTETnirld) y CVD 916 (pcDNA3/teíC). Debido a dificulíades íécnicas, no esíá disponible ningún daío sobre las respuestas proliferativas de raíones inmunizados con la vacuna de ADN naíural PcDNA3/íeíC para flagelos S. fyphi. En forma interesaníe, las células aisladas de nodos linfáíicos inguinales de raíones inmunizados i. m. con PcDNA3/íelC nalural no mosíraron respuesta proliferativas específicas para ninguno de los antígenos probados. No se observaron respuesfas proliferativas para BSA en ninguno de los grupos probados. 7. Comparación de Flagelos LPS y S. íyphi An -Salmonella de IgG Inducida a íravés de Inmunización Intranasal con CVD 915 y CVD 908-hírA Uno de los aspeólos imporíantes para dirigir durante la evaluación de nuevos vectores de vacuna candidatos es comparar las respuestas inmunes producidas por las nuevas construcciones (por ejemplo, CVD 915) con aquellas de los candidatos principales (por ejemplo, CVD 908. htrA) para los cuales ya está disponible un cuerpo grande de datos. Con esíe objetivo, se inmunizaron grupos de 10 ratones Balb/C intranasalmeníe con 1010 cfu ya sea de la cepa CVD 915 atenuada o CVD 908-htrA, dos veces, con separación de 36 días. Los raíones fueron sangrados antes de la inmunización (día 0) y en los días 35, 55 y 95 (solamente CVD 915). Se determinaron los anticuerpos contra LPS y antígenos de flagelos a fravés de ELISA según descriío por Tacket y otros (1977), supra. En resumen, las placas de ELISA fueron cubiertas con 5.0 µg de cada antígeno, se probaron las muestras de suero en 8 diluciones de dos veces, se expresaron las ululaciones de anlicuerpo como unidades de ELISA/ml definidas como la forma inversa de la dilución que produce una absprbancia de O.d con valores a 492 nm. Los resulfados se muestran en las Figuras 9 y 10. Como se muestra en las Figuras 9 y 10, se produjeron niveles similares de flagelos anti-Salmonella y del anficuerpo LPS aníi-Salmonella en ambos grupos de animales.

EJEMPLO 5 Construcción de Cepas de S. typhi Atenuadas que Constitutivamente Expresan el Antígeno Vi A. Consírucción de Cepas de S. typhi (CVD 916 v CVD 909) que Constiíuíivameníe Expresan el Aníígeno Vi Con el fin de cambiar la expresión del antígeno Vi de osmóticamenfe regulada a constífutiva, el promotor de vipR fue enfocado (Figura 1A). Se cree que los productos de vipR y ompR-envZ realizan su acción reguladora uniendo la región corrieníe arriba de vipR (Hashimoío y oíros /1996), supra). Para esle efeclo, se posíuló en la presente invención que substiíuyendo el promoíor de vipR con un promoíor fuerte, por ejemplo, Ptac> la baja regulación de vipR, y subsecuentemeníe el conírol en la expresión del antígeno Vi, podría ser eliminada. El promotor Ptac es consfiíufivo en Salmonella spp., ya que eslos organismos carecen de lacl. Por consiguieníe, los derivados de la expresión del aníígeno Vi consíilulivo de CVD 91d y CVD 908-hirA fueron construidos de la siguiente manera. En la primera fase, se introdujo una eliminación en vipR, y en paralelo, una selección/contador-marcador de selección, es decir, el cassette sacB-neo, se substituyó para la región promotora de vipR (Figura 1A). Específicamente, un segmento de 601 bp inmediatameníe corriente arriba de la región promotora -35 de vipR se amplificó a partir de ADN genómico de Ty2 de la cepa S. typhi de íipo silvestre, utilizando los iniciadores: d'-GGGGGAGCTAATTCTGCAAACCAGCCCTGTACCATCAAGTTCATA-3', (SEC ID NO: 7) y 5'- CCTCATCCCGGGCCCGGATCCACCTGCACAATTCATTGTTTGTACCTA TC-3' (SEC ID NO: 8). Este primer segmento amplificado de 601 bp (segmento A) fue clonado utilizando el equipo pGEM-T Vector Sysíem (Promega, Madison, Wl) dando surgimiento a pGEM-T::fragmento A. Este sistema incluye un plásmido abierto (pGEM-T) con colgantes de 3'-T en el siíio de inserción, los cuales mejoran la eficiencia de ligación de productos de PCR. Después, pGEM-T::segmento A fue ligado con Sstl y BamHI, y fue clonado en los silios Ssll y BamHI inmediatamenle corrieníe arriba de Ptac en pBS::Ptac (esle plásmido fue obíenido clonando el promofor Ptac en los siíios BamHI-EcoRI de pBluescripl (Síraíagene)), produciendo pBS::segmenfo A-Ptac- En paralelo, un segmenío de 770 bp de vipR (incluyendo el codón de iniciación de vipR) (segmento B) fue amplificado a partir del mismo ADN genómico de a cepa Ty2, ulilizando los iniciadores: d'-GCAGGTGGATCCGGGCCGGGATGAGGTTTCATTTCTGGCCTCCGA ATGATATC-3' (SEC ID NO: 9) y 5'-ATCCTTGAATTCGGGGGATCCTACTAAAATTTTATATTTACAAAGTT AATTCTAGGT-3' (SEC ID NO: 10). Con esíos iniciadores, los únicos siíios de restricción Sstl, EcoRI, BamHI y Smal fueron introducidos para propósitos de clonación (subrayado). El Segmenfo B amplificado primero fue clonado en pGEM-T, utilizando el equipo pGEM-T Vector System, produciendo pGEM-T::segmento B. Este plásmido después fue digerido con EcoRV y Salí, y el fragmento resultaníe se clonó en los silios EcoRV y Salí de pBS::segmenlo A-Ptac, inmediatamente corriente debajo de Ptac- El plásmido resultaníe, denominado pBS::Ptac-vipR, confiene el segmento A-Ptac-segmento B, y tiene una eliminación de 167 bp, incluyendo las -35, -10, y regiones de unión ribosomales del promotor vipR. Sin embargo, en la construcción de pBS::Ptac-vipR, la eliminación del promotor vipR fue efectivameníe reemplazada con una inserción de 257 bp, confeniendo las -35, -10 y las regiones de unión ribosomales del promotor tac. En paralelo, se construyeron oíros casselíes a íravés de la inserción de sacB-neo eníre el segmenlo A y el segmenfo B denominados anferiormente. Inicialmente, el fragmento A y el fragmento B fueron fusionados a través de PCR utilizando ambos fragmeníos como planíillas y los oligonucleótidos SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 10 como iniciadores, como se describió por Noriega y otros (1996, supra). La fusión del fragmento A-fragmento B amplificada resultante fue clonada en pGEM-T, utilizando el equipo pGEM-T Vector System, produciendo pGEM-T::fragmento A-fragmento B. Después, sacB-neo fue obíenido medíanle digeslión Smal de plB729 (Blomfield y otros, supra), y fue insertado en el sitio Smal de pGEM-T::segmento A-segmento B. El plásmido resultante fue nombrado como pGEM-T::vipR::sacB-neo. Este plásmido fue digerido con Ssíl, efectivamente removiendo el alelo vipR::sacB-neo, el cual después se clonó en el sitio Ssíl del vecíor suicida pJG14, produciendo pJG14::vipR::sacB-neo. pJG14 es un origen de pSC101 sensible a la íemperatura de un plásmido derivado de replicacíón, seleccionado por cloranfenicol, suicida (Galen y otros, 96lh General Meeting, American Socieíy for Microbiology, Abstrací, pág. 529-H260 (1996)). Además, el alelo vipR::sacB-neo digerido con Ssíl fue clonado en el silio Ssll del vector suicida pKTN701 (Hone y otros (1991), supra), produciendo pKT::vipR::sacB-neo. La cepa CVD 91d de S. .typhi fue electroforeada con pJG14::vipR::sacB-neo. En paralelo, la cepa CVD 908-htrA de S. typhi fue electroforeada con pKT::vipR::sacB-neo. Se realizó la recombinación homologa entre pJG14::vipR::sacB-neo y el gen vipR en CVD 91d de S. typhi, utilizando los procedimiento descritos por Noriega y oíros (1996); y entre pKT::vipR::sacB-neo y el gen vipR en CVD 908-htrA de S. lyphi, utilizando los procedimiento descriíos por Hone y oíros (1991), supra, con la excepción de que la selección mutante de cruce doble fue mejorada aislando clones resisteníes a canamicina y sensibles a cloranfenicol. Las cepas del derivado de CVD 915 de S. íyphi y del derivado CVD 908-hlrA no expresaron el antígeno Vi debido a la inserción/eliminación en el alelo vipR. En la segunda fase, el promotor Ptac constiíuíivo fue consíifuido para la inserción de SacB-neo en el sitio VipR de la cepas derivadas de S. fyphi CVD 915 y derivada de S. íyphi CVD 908-htrA observadas aníeriormenfe (Figura 1B). Específicamente, el segmento Ptac-v¡pR en PBS::Ptac-vipR fue clonado en el sitio BamHI-EcoRI de pJG14, produciendo pJG14::P ac-vipR. Después, el plásmido pJG14::Ptac-vipR fue uíilizado para iníercambiar PtaC? para sacB-neo en las cepas de derivado CVD 915- y CVD 908-htrA- a íravés de recombinación homologa, como se describió anleriormenfe. El aislamienío de muíanles de cruce doble fue mejorado a través de la contraselección provisía por la toxicidad a sacarosa conferida por sacB, y la reversión a la sensibilidad de canamicina. La cepa resultante derivada de CVD 916 fue denominada CVD 916, la cual fue depositada en American Type Culture Collection el 4 de mayo de 1998 bajo ATCC No. 202116. La cepa resultanie derivada de CVD 908-htrA fue denominada CVD 909, la cual fue deposilada en American Type Culíure Collecfion, el 4 de mayo de mayo de 1998, bajo ATCC No. 202117. Genof ípicamenfe, la inserción de P ac en ambas cepas fue caraclerizada por PCR, demosírando la inserción de Ptac en el sitio apropiado B. Expresión Constitutiva del Aníígeno Vi a través de las Cepas CVD 916 y CVD 909 Fenotípicameníe, la expresión constiíuliva del antígeno Vi fue analizada a través de aglutinación de bacterias desarrolladas a diferentes osmolaridades ufilizando antisuero anti-Vi comercial (Difco). Los resultados se muestran en el Cuadro d a confinuación.

CUADRO 5 Aglutinación con Antisuero Vi-Específico Como se muestra en el Cuadro 5 anterior, en la cepa S. typhi de tipo silvesíre, Ty2 y las cepas aíenuadas CVD 915 y CVD 908- htrA, la expresión del aníígeno Vi es allamenfe dependienle en la osmolaridad (provísía por la conceníración de NaCI) del medio. En Coníraste, la expresión del aníígeno Vi en las cepas CVD 916 y CVD 909 es fuerte, constitutiva, y no regulada por cambios en la osmolaridad.

EJEMPLO 6 Respuesta Inmune Contra un Antígeno Vi Constitutivamente Expresado Grupos de 10 ratones Balb/c de 6 semanas de edad fueron inmunizados intranasalmente con 1.0 x 1010 cfu ya sea de la cepa CVD 915 o CVD 916. Los ratones fueron sangrados antes y 30 días después de su inmunización, y su suero se almacenó a -20°C hasta utilizarse. Los anticuerpos presenfes en el suero confra S. typhi LPS, H (flagelo) y aníígenos Vi fueron deferminados a fravés de ELISA como se describe por Tacket y otros (1997), supra. Los resultados se muestran en el Cuadro 6 a continuación.

CUADRO 6 Titulaciones Medias Geométricas de Anticuerpos IgG en el Suero contra Antígenos S. typhi CVD 915 o CVD 916 Después de una sola Inmunización con las Cepas P = 0.033 P = No importanfe Como se muestra en el Cuadro 6 anterior, la inmunización con la cepa CVD 916 produjo niveles de anticuerpo contra el antígeno Vi, los cuales fueron significativameníe más alfós que aquellos obíenidos con la cepa CVD 915. Las respuesía inmunes contra otros antígenos S. typhi (LPS y H) fueron similares entre ambos grupos inmunizados. Los resultados demuestran que la expresión constitutiva del antígeno Vi mejora la respuesía inmune coníra esíe aníígeno sin interferir con la respuesta inmune coníra oíros aníígenos somáticos S. typhi. Aunque la invención ha sido descrita con detalle y haciendo referencia a modalidades específicas de la misma, será evidenle para aquellos experíos en al íécnica que se pueden hacer varios cambios y modificaciones a la misma sin aparíarse del espíriíu y alcance de la invención.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un mutante de Salmonella atenuada, en donde dicho mutaníe constifutivameníe expresa el aníígeno Vi.
2. 2.- El mulante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el mutaníe es un mulante Salmonella typhi.
3. 3.- El mutante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho mutante, el promotor vipR es reemplazado por un promotor seleccionado del grupo que consiste de Ptac, Ptre, Poiac V Pipp. con el fin de ocasionar la expresión constitutiva de v?aB.
4. 4.- El mutante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho mutante es incapaz de formar nuevos nucleótidos de guanina, debido a la mutación en el operón guaB-A.
5. 5.- El mutante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha mutación en el operón guaB-A es una mutación de eliminación, y la mutación de eliminación está en el gen guaA, el gen guaB, o en tanto el gen guaA como en el gen guaB.
6. 6.- El mutanfe de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la mutación de eliminación está fanto en el gen guaA como en el gen guaB.
7. 7.- El mutanfe de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho mutaníe fiene un fenotipo aro.
8. 8.- El mutante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho mulante Salmonella fyphi se deriva de la cepa Salmonella íyphi CVD 915 de origen (ATCC No. 202115).
9. 9.- El mutante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho mutante Salmonella íyphi es Salmonella fyphi CVD 916 (ATCC No. 202116) o Salmonella fyphi CVD 909 (ATCC No. 202117).
10. 10.- El mutante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho mutante codifica y expresa un antígeno extraño.
11. 11.- El muíante de Salmonella atenuado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho mutante contiene un plásmido que codifica y expresa, en una célula eucariótica, un antígeno exlraño.
12. 12.- Una vacuna confra fiebre lifoidea que comprende' (A) una cantidad farmacéuticamente efectiva de un muíaníe Salmonella íyphi atenuado, en donde dicho mutanfe constilutivameníe expresa el antígeno Vi; y (B) un vehículo diluyente farmacéuíicameníe aceptable.
13. 13.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho muíanle, el promoíor vipR es reemplazado por un promotor seleccionado del grupo que consiste de Ptac, Ptre, Poiac y P?PP, con el fin de ocasionar la expresión constiluliva de viaB.
14. 14.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde dicho mutante es incapaz de formar nuevos nucleótidos de guanina, debido a la mutación en el operón guaB-A.
15. 15.- Lá vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha mutapión en el operón guaB-A es una mutación de eliminación, y dicha mutación de eliminación está en el gen guaA, el gen guaB, o tanto en el gen guaA como en el gen guaB
16. 16.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha mutación de eliminación está tanío en el gen guaA como en el gen guaB.
17. 17.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicho muíante tiene un fenoíipo aro.
18. 18.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho muíanle Salmonella íyphi se deriva de la cepa de origen Salmonella íyphi CVD 915 (ATCC No. 202115).
19. 19.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho muíanle de Salmonella íyphi es Salmonella fyphi CVD 916 (ATCC No. 202116) o Salmonella íyphi CVD 909 (ATCC No. 202117).
20. 20.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho mutante codifica y expresa un antígeno extraño.
21. 21.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho mutante contiene un plásmido que codifica y expresa, en una célula eucariótica, un antígeno exfraño.
22. 22.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha caníídad lerapéuticamente efectiva es de aproximadamente 102 cfu a 1010 cfu.
23. 23.- La vacuna de acuerdo con la reivindicación 22, en dicha cantidad farmacéuticamente efectiva es de aproximadamente 106 cfu a 109 cfu.