JP4363782B2 - Vi抗原を構成的に発現するSalmonellaの弱毒化した変異株 - Google Patents
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Description
本発明の開発は、University of Maryland、Baltimore、Marylandによって、ならびに契約番号第AI29471号、同第AI36525号、同第AI40261号、および同AI45251号のもとで国立衛生研究所の資金提供によって支持された。米国政府は、米国政府によって認められた上記の契約によって提供された、本明細書中の本発明を実施するか、あるいは、本発明を米国の代わりに実行させる、撤回不能な、払済みの、通常実施権を有する。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、Vi抗原を構成的に発現する、弱毒化されたSalmonella変異株、ならびにそれを含有する腸チフスに対するワクチン、それを含有する生のベクターワクチン、およびそれを含有するDNA−によって媒介されるワクチンに関する。
【0003】
(発明の背景)
(I.Vi抗原)
Vi抗原(夾膜ポリサッカライド)は、Felixら、Lancet、227:186−191(1934)によって最初に記載された。この夾膜ポリサッカライドは、Salmonella(例えば、S.typhi、S.paratyphi C、およびS.dublin)ならびにCitrobacter freundii中に存在する。構造的には、Vi抗原は、可変性のO−アセチル化を有するβ−4,2−デオキシ−2N−アセチルガラクツロン酸の直鎖状のポリマーである(Danielsら、Infect.Immun.,57:3159−3164(1989))。S.typhi中でのその存在は、インビトロにおいては、血清、補体活性化、および食作用による溶解における有意な低下と相関している(Looneyら、J.Lab.Clin.Med.,108:506−516(1986))。従って、Vi抗原は、免疫システムに対してS.typhiを防御する盾として作用し得る。
【0004】
(A.viaB染色体領域およびVi抗原の発現の領域)
3つの大きく分けられた染色体遺伝子座である、viaA、viaB、およびompBが、Vi抗原の発現に必要であると考えられている(Johnsonら、J.Bacteriol.,90:302−308(1965);およびSnellingsら、J.Bacteriol.,145:1010−1017(1981))。これらの中では、viaB遺伝子座が、通常はVi抗原−陽性株において見出されており、そしてViの合成のために必要な酵素をコードする遺伝子を含むと考えられている(Hashimotoら、J.Bacteriol.,175:4456−4465(1993);およびVirlogeuxら、Microbiol.,141:3039−3047(1995))。viaB遺伝子座は、11個のオープンリーディングフレーム(ORF)から構成され(図1A)、そのうちvipAおよびvipB遺伝子は、Viポリサッカライドのヌクレオチド糖を合成する酵素をコードする。そして5つのvex遺伝子(vexA−E)は、Vi抗原のトランスロケーションの原因であると考えられる(Hashimotoら、(1993)前出)。virB領域の第1ののORF(すなわち、vipR(図1A))は、それ自身の発現について、ならびにvipA、vipB、orf4、vipC、およびおそらくvipRの下流の他の遺伝子の発現についてのポジティブな転写調節因子である(Hashimotoら、J.Bacteriol.,178:1430−1436(1996))。さらに、VipRの上流のプロモーターもまた、(少なくとも)vipAおよびvipB(Vi抗原の構造的なユニットをコードする)の転写を制御し、それによってviaB領域中でオペロンを形成する。別の染色体領域である、ompBオペロンは、ompR−envZ遺伝子を含み、viaBの転写調節因子としてVi抗原の発現において役割を果たす(Pickardら、Infect.Immun.,62:3984−3993(1994))。ompR−envZ領域は、高い浸透圧条件に対するE.coliの適応性応答の一部を形成する。S.typhiにおいては、Vi抗原は、浸透圧によって調節され、そしてompRは、その発現に不可欠である(Pickardら、前出)。
【0005】
(B.Vi抗原の暴露と免疫防御との間の相関関係)
S.typhiのVi夾膜ポリサッカライドは、ヒトにおける毒性因子であり、そして防御抗原である(Felixら(1934)、前出)。精製されたViポリサッカライドは、単回の用量での接種後に中程度の防御免疫を誘発する、公認された非経口的な腸チフスワクチンである。そして防御は、血清IgG抗体によって媒介される(Acharyaら、New England Journal of Medicine,317:1101−1104(1987);およびKlugmanら、Lancet,2:1165−1169(1987))。対照的に、弱毒化されたS.typhi株であるTy21aは公認された生経口ワクチンであり、Vi抗原を発現せず、そして血清Vi抗体も誘発しないが;それにもかかわらず、Ty21aは、少なくとも中程度のレベルの防御を付与する(Wahdanら、J.Infect.Dis.,145:292−296(1982);およびLevineら、Lancet、1:1049−1052(1987a))。細胞によって媒介される免疫機構は、この状況において防御を媒介すると考えられている。S.typhiのいくつかの新しい弱毒化された株(これらは、インビトロでVi抗原を発現する)は、高力価のOおよびH抗体を誘発するにも関わらず経口ワクチンとして投与された場合には、血清Vi抗体を誘発できなかった。(Tacketら、J.Infect.Dis.,163:901−904(1991);Tacketら、Vaccine,10:443−446(1992a);およびTacketら、Infect.Immun.,65:452−456(1997))。この表現型についての可能性のある説明は、Vi抗原の発現が浸透圧の刺激と関連して高度に調節されていることである(Pickardら、前出)。この仮説は、Vi抗原の発現が、細菌が血液中または他の体液(例えば、胆汁)中で細胞外である場合を除いて、遮断されることである。
【0006】
Vi抗原の発現が構成的に行われる場合に、これは血清IgG Vi抗体の刺激を生じ、それによって腸チフスに対する全体的な防御を増強することが、本発明において仮定された。構成的な発現が弱毒化されたSalmonellaの生のベクターワクチンおよびDNAによって媒介されるワクチンによって発現される外来抗原に対する免疫応答を改善することもまた、本発明において仮定された。
【0007】
(II.腸チフスの標的集団)
腸チフスは、集団が、処理済みの、細菌学的にモニターされた水の供給へのアクセス、およびヒトの糞便排出物を除去する衛生設備を有する、近代的先進工業国においては著しく珍しい。対照的に、発展途上国においては、このような快適さを欠いている集団においては、腸チフスはしばしば地域流行性であり、そして公衆衛生の見通しによると、典型的には、就学年齢の子供の最も重大な腸疾患の問題となっている(Levineら、Pediatr.Infect.Dis.J.,8:374−381(1989a))。候補のワクチンの実地試験に関して、腸チフスの全身の臨床的、疫学的および細菌学的な監視により、多くの集団における腸チフスの発病率が、非常に正確に確証されている(Levineら、Lancet、336:891−894(1990);Blackら、Vaccine;8:81−84(1990);Levineら(1987a)、前出;Ferreccioら、J.Infect.Dis.,159:766−769(1989);およびSimunjuntakら、Lancet,338−1055−1059(1991))。明らかになった発病率は、非全身的な監視に基づいて推定されるよりも、はるかに高かった。全身的な監視はまた、乳児および幼児において腸の領域において、臨床的にはまだ穏やかな、驚くべき頻度の菌血症性の腸チフス感染を示した(Ferreccioら、J.Pediatr.,104:899−901(1984))。
【0008】
発展途上国における就学年齢の子供に加えて、腸チフスの増大した危険性を有する2つの他の集団は、旅行者および臨床微生物学者である。米国の旅行者においては、危険性は南アメリカの太平洋岸に連なる国、およびインド亜大陸において最も高い(Ryanら、Rev.Infet.Dis.,11:1−8(1989);およびMathieuら、Arch.Intern.Med.,154:1713−1718(1994))。さらに、臨床微生物学者(先進国の微生物学者を含む)は、作業環境中でSalmonella typhiに対する曝露が増大しており、従って、高い危険性のグループに含まれる(Blaserら、J.Clin.Microbiol.,13:855−858(1981))。
【0009】
(III.多剤耐性S.typhi株)
およそ1990年から、腸チフスの散発性の症例および局所的な大発生が、中東、北東アフリカ、ならびに南アジアおよび東南アジアで出現し始めている。これらの大発生は、トリメトプリム/スルファメトキサゾールに対するプラスミドによって媒介される耐性、およびクロラムフェニコールに対する耐性をコードするS.typhiの株によって引き起こされる(Guptaら、Pediatr.Infect.Dis.,13:124−140(1994);およびRoweら、Lancet,336:1065−1066(1990))。このような株に対する治療は、経口のシプロフロキサシンのようなキノロン抗生物質、または非経口のセフトリアキソンのような第3世代のセファロスポリンの使用を必要とする。これらの抗生物質は、発展途上国にとってはコストが高い。例えば、1972年から1973年までのメキシコ、(Olarteら、Antimicrob.Agents Chemother.,4:597−601(1973))、および1979年から1981年までのペルー(Goldsteinら、J.Infect.Dis.,2:261−266(1986)におけるような、散発性の症例または長期の流行を生じ、そして最終的に消滅して感受性の株によって再度取って代わられた、以前の抗生物質耐性株とは対照的に、およそ1990年に中東およびインド亜大陸で出現した多剤耐性のS.typhiがなお、これらの地域においては優勢な株である。さらに、これらの多剤耐性株は、広範に広がっており、そして北東アフリカにおいて(Mikhailら、Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.,83:120(1989))および東南アジアにおいて(Vinhら、Antimicrob.Agents Chemother.,40:958−961(1996))優勢である。
【0010】
以前に有用であった複数の抗生物質に対して耐性を示すS.typhiが、現在存在し得るようである。従って、腸チフスは、経口の抗生物質で簡単かつ安価に処置され得る疾患では、もはやない。さらに、健康の典拠(health authority)は、もはや疾患の初期の処置に対する腸チフスの制御プログラムに基き得ない。腸チフスの合併症および死亡は、不適切か、遅延したか、または不十分な抗生物質の治療が原因で増大している(Singh、Indian Pediatr.、28:329−332(1991);Bhutta,Ann.Trop.Paediatr.,16:299−306(1996);およびGupta、前出)。
【0011】
従って、これらの多剤耐性S.typhi株の普及は、多くの発展途上国において増大しつつある公衆衛生上の重大危機を構成し、そして改善された経口の腸チフスワクチンの開発における再燃した目的を有する。免疫予防もまた、高い発病率の地域(特に、S.typhi株が多剤耐性である地域)の子供について考えられ、そして旅行者および臨床微生物学者について考えられるべきである。
【0012】
(IV.腸チフスに対する初期のワクチン)
(A.不活化された非経口の全細胞ワクチン)
19世紀の終わりに開発された熱不活化された、フェノール保存された全細胞ワクチン(Wrightら、Br.Med.J.,1:256−258(1897);およびPfeifferら、Dtsch.Med.Wochescr.22:735−737(1986))は、1060年代に世界保健機構によって発起された無作為の制御された実地試験において、中程度のレベルの防御(51−67%のワクチン有効性)を与えることが示された。これは、7年間にわたって持続した(Ashcroftら、Am.J.Hyg.,79:196−206(1964):Ashcroftら、Lancet,2:1056−1060(1967);Yugoslav Typhoid Commission,Bull.WHO,30:623−630(1964);およびHejfec,Bull.WHO,34:321−339(1966))。しかし、これは、それが受容不可能な高い頻度で有害な反応を生じるので、明らかに不十分なワクチンであり、従って一般的な公衆衛生ツールには決してなっていない(Levine,Typhoid Fever Vaccines,Vaccines、第2版、Plotkinら編、Philadelphia,PA,W.B.Saunders(1994))。制御された治験においては、熱不活化されフェノール保存された全細胞ワクチンのレシピエントの約25%が、熱および全身的な反応を発症し、そして約15%が、ワクチン接種後の作業または学校を休む傾向にあった(Ashcroftら(1964)、前出;Yugoslav Typhoid Commission(1964)、前出;およびHejfec,前出)。この理由のために、このワクチンは、2つのより最近承認されたワクチン(生の経口ワクチン株Ty21a(VivotifR)および非経口的な精製されたVi夾膜ポリサッカライドワクチン(TyphiViMR)(Levineら(1989a)、前出)によって大きく取って代わられている。これらの2つのより新しいワクチンは、上記の全細胞ワクチンに匹敵する防御を付与するが、非常に良好に寛容化されている。
【0013】
(B.非経口的なViポリサッカライドワクチン)
上記のように、1930年代の中期に、Vi抗原(S.typhi上のポリサッカライド夾膜)が発見された(Felixら、(1934)、前出)。この抗原は、腸チフスの患者の血液から単離された株の大部分において存在し、マウスにおけるS.typhiの毒素因子であることがまた示された;その存在は、O抗血清による凝集からO抗原を保護する(Felixら、J.Hyg.Cambridge,49:92−109(1951);およびFelixら、J.Hyg.,35:421−427(1935))。Vi抗体が、腸チフスに対する防御において重要な役割を果たすことが提唱されて、そしてフェノール不活化した全細胞の非経口の腸チフスワクチンがアルコール不活化した全細胞の非経口ワクチンにより取って代わられることが、示唆された。この案の原理は、後者がVi抗原をより良好に保存し、そして動物およびヒトにおいてより高いVi抗体力価を生じたことであった(Felix、BMJ,1:391−395(1941))。しかし、ユーゴスラビアでの無作為の制御された実地試験においては、熱およびフェノール不活化した全細胞の非経口ワクチンは、アルコール不活化したワクチンよりも有意に防御的であった(Yugoslav Typhoid Commission,Bull.WHO,26:357−369(1962))。それにもかかわらず、同じ原理を使用して、アセトンで不活化した全細胞の非経口腸チフスワクチンが、報告されている(Landyら、Am.J.Public Health,44:1572−1579(1954))。1960年代にギアナおよびユーゴスラビアにおいて行われた2つの別々の実地試験においては、アセトンで不活化されたワクチンは、熱およびフェノールで不活化されたワクチンよりも優れた防御を付与した(Yugoslav Typhoid Commission(1962)、前出)。アセトンで不活化されたワクチンの優位性は、Vi抗原のより良好な保存に起因したこと(Wongら、J.Infect.Dis.,125:360−366(1972))、またはそのワクチンを用いて得られるH抗原に対するより高い抗体力価に起因したことが論じられている。
【0014】
決定的な進歩は、非変性技術によってVi抗原を精製することによる(Levineら、Infect.Immun.,12:1290−1294(1975);およびRobbinsら、J.Infect.Dis.,150:436−449(1984))。National Institute of Health(Bethesda、Maryland)およびInstitut Merieux(Lyon、France)で調製された2つの未変性のVi抗原ロットの免疫原性が、評価された(Tacket、Vaccine、6:307−308(1988))。両方の群が、約90%のレシピエントにおいて高力価のVi抗体を誘発した。さらに、このワクチンによって生成されたVi抗体が、少なくとも3年間持続したことが示された(Tacketら、(1988)、前出)。非経口的な精製されたViワクチンによって誘発されたものと同等のVi抗体のレベルは、慢性の腸チフスキャリアにおいてのみ、天然に見られる。対照的に、腸チフスの回復期のほとんどの患者は、高力価のVi抗体を生じない(Lanataら、Lancet、2:441−443(1983);およびLosonskyら、J.Clin.Microbiol.,25:2266−2269(1987))。
【0015】
2つの無作為の制御された実地試験が、Institut Merieuxで産生された候補のVi抗原ワクチンの安全性および効率を評価するために行われた。両方の試験において、ワクチンは、十分に寛容化された(Acharyaら、前出;およびKlugmanら、前出)。ネパールにおいては、単回の25μgの筋肉内用量のVi抗原ワクチンが、子供および成人の両方を含む研究において、培養して確認された腸チフスに対する少なくとも17ヶ月間の72%の防御を提供した(Klugmanら、前出)。同様の結果が、南アフリカの就学児童における実地試験において得られた。ここでは、同じ用量のVi抗原が、少なくとも21ヶ月間にわたって培養されて確認された腸チフスに対して、64%の防御を付与した(Klugmanら、前出)。
【0016】
就学児童および成人におけるその安全性および効率以上に、Vi抗原ワクチンの利点は、単回の用量のみを用いて中程度のレベルの防御を提供することである。しかし、弱毒化された腸チフスワクチンTy21aと比較して、Vi抗原ワクチンは、非経口的に(筋肉内で)投与されなければならないという欠点で不利である。
【0017】
(C.生の経口ワクチンとしての初期の弱毒化株)
(1.ストレプトマイシン依存性S.typhiワクチン株)
生の経口腸チフスワクチンとして見込みがあることが示された最初の弱毒化株は、1960年代の後期および1970年代の初期に開発された、ストレプトマイシン依存性株(SmD)であった(DuPontら、Antimicrob.Agents Chemother.,10:236−239(1970);およびLevineら、J.Infect.Dis.,133:424−429(1976))。用量あたり約1010個のコロニー形成単位(cfu)を含有する、複数回の間隔をあけた用量で送達される場合は、SmD株は十分に寛容化され、そして腸チフスのボランティアモデルにおける実験的なチャレンジに対しておよそ80%の防御を実証した(DuPontら、前出)。しかし、ボランティアが、ワクチン生物の液体の懸濁物を作製するように再構成された凍結乾燥調製物で免疫される場合には、防御は付与されなかった(Levineら、(1976)、前出)。このために、SmDワクチン株を用いるさらなる研究は、続けられなかった。
【0018】
(2.株Ty21a、公認された生の経口腸チフスワクチン)
生の経口ワクチンとして安全でありそして防御的である、S.typhiの弱毒化された株である、Ty21aが、病原性のS.typhi Ty2株の化学的な変異誘発によって1970年代の初期に開発された(Germanierら、J.Infect.Dis.,141:553−558(1975))。このワクチン株における特徴的な変異(これは、その弱毒化を担うと最初に推定された)として、galE(これは、リポポリサッカライドの合成に関与する酵素である、UDP−ガラクトース−4−エピメラーゼをコードする)の不活化およびViポリサッカライドを発現することの不能性が挙げられる。Ty21aは、プラシーボでコントロールした実地試験において著しく十分に寛容化されていることが証明された(Gilmanら、J.Infect.Dis.,136:717−723(1977);Wahdanら(1982)、前出;およびWahdanら、Bull,WHO、58:469−474(1980))にもかかわらず、どの変異がこのワクチンの安定な高度に弱毒化された表現型の原因であるかは正確には明らかではない。成人および子供におけるTy21aの反応原性(ractogenicity)を評価するために能動的な監視方法を利用する3つの二重盲プラシーボでコントロールした研究の結果は、有害な反応が任意の症状または徴候について、プラシーボの群よりもワクチンレシピエントにおいて有意により高い頻度では観察されなかったことを示した。同様に、チリでの約530,000人の就学児童、エジプトでの約32,000人の就学児童、ならびにインドネシアでの約20,000人の小児科および成人の被験体を含む大規模な効力の実施試験においては、受動的な監視によって、ワクチンに起因し得る有害な反応を同定することに失敗した(Ferreccioら、(1984)、前出;Levineら(1987a)、前出;Simunjuntakら、前出;Wahdanら(1982)、前出;およびWahdanら(1980)、前出)。
【0019】
Ty21aの制御された実地試験は、ワクチンの処方物、投与される用量の回数、および用量の間隔が、達成され得る防御のレベルに大きく影響を与えることを強調する(Blackら、前出;Ferreccioら(1984)、前出;Levineら(1987a)、前出;およびWahdanら(1980)、前出)。アレキサンドリア(エジプト)での最初の無作為化した、プラシーボでコントロールされたTy21aの実地試験においては、6−7歳の就学児童が、希釈物中に再懸濁された凍結乾燥ワクチンの3回の用量を受容した(それぞれの用量の間には1日おきの間隔)(Wahdanら(1980)、前出)。胃酸を中和するために、子供に、NaHCO3の1.0gの錠剤を、ワクチンまたはプラシーボの摂取の数分前に噛ませた。3年間の監視の間には、Ty21aは、確認された腸チフスに対して96%の防御効力を付与することを示した(Wahdanら(1982)、前出)。
【0020】
より最近の処方物(これは、1980年代の中期以来市販の製品となっている)は、腸コーティングされた、酸耐性のカプセル中の凍結乾燥ワクチンからなる。サンチエゴ(チリ)での無作為化された、プラシーボでコントロールされた実地試験においては、1週間で与えられたこの腸溶処方物の3回の用量が、その後の最初の3年間の間に67%の効力を提供し(Levineら(1987a)、前出)、そしてその後の7年間にわたって63%の防御を提供した。8日間で与えた腸溶カプセル中のTy21aの4回の用量は、2回または3回の用量よりもさらに有意に防御的であった(Ferreccioら(1984)、前出)。Ty21aは、1989年の後半に、米国のFood and Drug Administrationによって承認されたものによると、推奨されるスケジュールは、1日おきに与えられる4回の用量である;他の国は、3回用量の免疫スケジュールを使用している。
【0021】
しかし、Ty21aの認識された欠点として、その弱毒化のために分子的な基礎を欠くこと、その適度な免疫原性、そして最も重要なことに、防御を付与するために少なくとも3回、間隔を空けて投与することが必要とされることが挙げられる。Ty21aの別の欠点は、血清IgG抗−Vi抗体を刺激しないことである。
【0022】
(3.弱毒化されたワクチンと免疫後の防御との相関)
公認された生の経口腸チフスワクチン株Ty21aは中程度にのみ免疫原性であり、そして防御を誘発するために3回または4回の間隔を空けた用量を必要とするが、効力は、5−7年間の間の驚くべきほど長期間持続する。2つの免疫学的アッセイの結果は、異なる処方物によって付与される防御、および実地試験におけるTy21aの免疫スケジュールと相関することが見出された。これらは、血清IgG O抗体セロコンバーション(Levineら、Rev.Infect.Dis.,11(補遣3):S552−S567(1989b))、および末梢血単核細胞(PBMC)中で検出される腸由来IgA O抗体分泌細胞(ASC)を数え上げること(Kantele、Vaccine、8:321−326(1990);Tacketら、Infect.Immun.,60:536−541(1992b);およびVan de Vergら、Infect.Immun.,58:2002−2004(1990))を含む。防御の免疫学的な相関としてのこれらの測定値の同定は、新規の弱毒化されたS.typhi株を可能な生の経口ワクチンとして評価する場合に、初期の臨床試験における使用の非常に貴重なツールを提供する。
【0023】
(V.生の経口ワクチンとしての弱毒化されたS.typhiの新たな生成)
世界中の種々の研究室の研究者らは、単回の経口用量が防御免疫を誘発するような、Ty21aと同程度に十分に寛容化されているが、相当により免疫原性である、新規の候補のワクチンを操作する作業を行った。その終わりには、候補のワクチン株は、種々の生化学的な経路、全体的な調節システム、熱ショックタンパク質、他の調節遺伝子、および推定の病原性特性をコードする遺伝子を不活化させることによって、調製されている(Curtissら、Infect.Immun.,55:3035−3043(1987)、前出;Edwardsら、J.Bacteriol.,170:3991−3995(1984);Hohmannら、J.Infect.Dis.,173:1408−1414(1996a);Honeら、Infect.Immun.,56:1326−1333(1988);Honeら、Vaccine、9:810−816(1991);およびLevineら、J.Biotechnol.,44:193−196(1996))。1つの試みが、Vi抗原を発現するその能力を回復することによって、Ty21aの免疫原性を増大させるために行われた(Cryzら、Infect.Immun.,57:3863−3868(1989);およびTacketら(1991)、前出)。これらの変異の相対的な弱毒化能は、代表的には、マウスに対してこれらの変異を保有しているS.typhimurium株を摂取させること、および同種同系の野生型株によって誘発されるものと結果を比較することによって評価されている。種々の組換えS.typhi株中に導入された変異(これらは、臨床試験において生の経口ワクチンの候補としてヒトに摂取された)を、以下の表1にまとめる。
【0024】
【表1】
【0025】
生の経口腸チフスワクチンの開発において中心的な役割を果たす、最も重要な弱毒化されたS.typhi株を用いた臨床試験の突出した特徴および結果を、以下にまとめる。
【0026】
(A.Vi+ Ty21a株)
Ty21aの誘導体は、viaB(Viポリサッカライドの合成に必要とされる構造遺伝子をコードする)を野生型のTy2株からTy21aの染色体中に導入すること、およびVi莢膜ポリサッカライドの発現を実証することによって構築された(Cryzら、前出)。得られたVi+ Ty21a株を、5.0×105、5.0×107、および5.0×109のcfu、ならびに緩衝液を含有する液体の懸濁物の単回の用量中で、健常な北アメリカの成人に摂取させた;被験体のさらなる群には、3回の5×109cfuの用量および緩衝液(用量の間は1日の間隔)を受容させた(Tacketら(1991)、前出)。Vi+ Ty21a株は、十分に寛容化されており、そして3回の用量を受容したほとんどの被験体は、血清IgG抗体およびS.typhi O抗原に対するIgA ASCの上昇を生じた。しかし、血清IgG抗Vi抗体の上昇を生じたか、またはIgA抗Vi抗体を分泌するASCを示した被験体はなかった(Tacketら(1991)、前出)。
【0027】
(B.EX462)
化学的な変異誘発によって誘導されたTy21aにおける弱毒化変異を含む(当時そう考えられていた)、組換えDNA技術を使用するTy2の新規の誘導体を構築するための試みが、行われた(Honeら(1988)、前出)。詳細には、誘導体は、galEにおいて欠失変異を有し、そしてViポリサッカライドを発現し得なかったが、非特異的な化学的変異誘発を使用して得られるその結果としての、Ty21a中に存在する複数の他の変異は有さなかった。得られた株であるEX462は、それがいくつかのレシピエントにおいて腸チフス様症候群を生じたので、明らかに不十分に弱毒化されていた。これらの観察は、galEの変異とそれ自体がVi抗原を発現することができないこととの組合せが、Ty21a株の弱毒化の原因ではないことを、決定的に実証する。
【0028】
(C.541Ty株および543Ty株)
芳香族アミノ酸の生合成経路中の酵素をコードする遺伝子の不活化を伴う、Salmonellaの栄養要求性変異株を作製する概念が、普及している(Edwardsら、前出;およびHoisethら、Nature、292:238−239(1981))。これらの変異は、Salmonellaを、基質(パラ−アミノ安息香酸および2,3−ジヒドロキシベンゾエート)(これらは、哺乳動物組織中において十分な量では入手することができない)に対して栄養的に依存性にする;結果として、ワクチンは生存性のままであるが、その増殖能力においては厳しく阻害される。
【0029】
原型aroA-の541Ty株および543Ty株(541TyのVi-改変体)を、Centers for Disease Control(Edwardsら、前出)から得た野生型株CDC1080から構築した。CDC1080株の病原性は、ボランティアにおいては直接試験されていない。対照的に、ほとんどの他の研究者らは、新規の弱毒化された株を操作する彼らの試みにおいて、Ty21aの親である野生型のTy2株を用いて開始した(Germanierら、前出)。Ty2の病原性は、ボランティアの研究において確立されている(Hornickら、N.Engl.J.Med.,283:686−691、および739−746(1970))。
【0030】
541Ty株および543Ty株もまた、purAにおいて欠失変異を有し、これは、アデニン(または、アデノシンのような吸収可能な化合物)についての特異的な要求性を生じる(Edwardsら、前出)。ヒスチジン要求性に至るhisGにおける第3の変異は、病原性には影響を与えないが、このワクチン株を野生型のS.typhiと明らかに区別するさらなる生化学的マーカーを提供する。
【0031】
541Ty株および543Ty株は、第1期の研究において5.0×1010cfuまでの投与量においてきわめて十分に寛容化されていたが、体液性の抗体応答を刺激することにおいては、Ty21aよりも明らかに免疫原性が低かった(Levineら、J.Clin.Invest.,79:888−902(1987b))。例えば、11%の被験体のみが、血清IgG抗O抗体を生じた(Levineら(1987b)、前出)。
【0032】
(D.CVD908株)
新たに回収された生物体を用いるヒトにおける第1期の臨床試験において、単回の経口用量の投与後に十分に寛容化されておりそして高度に免疫原性であることが証明された1つのワクチンの株が、CDV908株である(Tacketら(1992b)、前出;およびTacketら(1992a)、前出)。これは、aroCおよびaroDに正確な欠失変異を有する(Honeら(1991)、前出)。実際、CVD908は、なお高度に免疫原性であり、十分に寛容化されており、それによって単回の用量の生の経口腸チフスワクチンを開発する可能性があり得る見通しがたてられた、最初の遺伝的に操作されたS.typhiワクチン候補であった。5.0×107cfuの十分に寛容化された用量では、CVD908のレシピエントの92%が、IgG O抗体セロコンバーションを実証し、そして腸の免疫系の感作の証拠(IgA ASC)を示した(Tacketら(1992a)、前出)。
【0033】
(1.弱毒化されたワクチンCVD908での免疫後の細胞によって媒介される免疫応答)
CVD908を用いる臨床試験は、細胞によって媒介される免疫(CMI)応答の集中的な研究によって特徴付けられている(Szteinら、J.Immunol.,155:3987−3993(1995);およびSzteinら、J.Infect.Dis.,170:1508−1517(1994))。健常な成人に投与された場合、CDV908は、S.typhi抗原に対するCMI応答を誘発し、これは、サイトカインの産生、ならびに熱およびフェノールで不活化された全細胞S.typhi粒子および精製された鞭毛に対する増殖応答を含む(Szteinら(1994)、前出)。
【0034】
S.typhiが細胞内病原体であるので、細胞毒性のリンパ球(CTL)応答がS.typhiを保有している宿主細胞を破壊することによって腸チフス感染の進行を制限することにおいて重要な役割を果たし得ることもまた、推測されている。従って、CTLアッセイが、弱毒化されたS.typhi CVD908を用いた成人のボランティアの免疫が、野生型のS.typhiで感染させたエプスタイン−バーウイルス(EBV)で形質転換された自己由来のBリンパ球を死滅させ得る血液中のCTLエフェクターを誘発するかどうかを評価するために、開発された(Szteinら(1995)、前出)。CTL活性は、最初の免疫の前、ならびに免疫の14日および29日後に単離されたPBMCを使用することによって評価された。PBMCは、CTLアッセイにおいてすぐに使用したか、またはCTL応答の測定の前にS.typhiに感染させた自己由来のEBVで形質転換された細胞の存在下で6〜8日間インビトロで増殖させられたかのいずれかであった。このシステムを使用すると、CTLエフェクターは、S.typhiに感染させた自己由来のEBVで形質転換した細胞を溶解させた。特異的なCTL活性は、免疫の14日後、およびS.typhiに感染させた自己由来のEBVで形質転換した細胞の存在下でのインビトロでの増殖の7〜8日後に得られたPMBC調製物中で観察された。免疫の29日後に得られたPBMCは、免疫の14日後に単離された細胞中で観察されたものに匹敵するか、またはそれよりも大きなCTL活性のレベルを示した。これらのPBMC培養物中のCTLエフェクター細胞の集団は、伝統的なCD8+、MHCクラスI制限、細胞毒性Tリンパ球集団であった(Szteinら(1995)、前出)。弱毒化されたS.typhiでの免疫が、自己由来のS.typhiで感染させた標的を死滅させ得る、循環しているCD8+、MHCクラスI制限CTLエフェクター細胞を誘発するという観察は、CTLが細菌を保有している宿主細胞を破壊することによって腸チフスの感染の進行を制限することにおいて重要な役割を果たすという主張を支持する。
【0035】
(2.弱毒化されたワクチン株CVD908の欠点)
CVD908を用いるフェーズ1の臨床試験において観察された可能性のある欠点は、このワクチン株を5.0×107cfuの用量で摂取した被験体の50%、および5.0×108cfuの用量で受容した被験体の100%が、サイレントなワクチネミア(ワクチネミアs)を実証したことである。ここで、ワクチン生物体は、ワクチン接種の4日後から8日後の間の1回以上の時点で採取された血液培養物から回収された。血液培養物は、彼らがワクチンを摂取した後の数時間以内に、そして次いで2日、4日、5日、7日、8日、10日、14日、20日、27日、および60日目でこれらの個体において全身的に採取された。いずれのワクチン接種を受けた人に由来する血液培養物も、4日目前および8日目後には陽性ではなかった。ワクチネミアは、臨床結果を示さないようであり(例えば、彼らは、発熱を伴わなかった)、そしてこれらは、短い間存続し、突然に抗生物質の使用を伴わずになくなった。しかし、弱毒化されたS.typhi株を用いたワクチネミアが、免疫無防備の個体がおそらく含まれる大きな集団中に有し得る可能性のある結果は未知である。CVD908の別の認知された欠点は、高用量のワクチンを受けるワクチン接種を受けた人の小さな集団における、発熱である(Tacketら(1992a)、前出)。
【0036】
あるいは、さらなる変異がCVD908中に導入されることが求められて、十分に寛容化されたままであり、そしてなお免疫原性であり、ワクチネミアまたは発熱を示さない誘導体を得た。
【0037】
(E.CVD908−htrA)
htrA(セリンプロテアーゼとしてもまた機能するストレスタンパク質をコードする遺伝子)の不活化が、マウスのモデルにおいて野生型のS.typhimuriumを弱毒化することが見出された(Chatfieldら、Microbiol.Pathogenesis,12:145−151(1992a))。さらに、htrA中に欠失変異を有するS.typhimuriumで経口的に免疫されたマウスは、野生型S.typhimuriumの致死用量での続くチャレンジに対して防御された(Chatfieldら(1992a)、前出)。従って、欠失変異が、CVD908のhtrA中に導入され、これによって株CVD908−htrAが得られた(Levineら(1996)、前出)。CVD908−htrAの単回の用量を、5.0×107(N=7)、5.0×108(N=8)、または、5.0×109(N=7)のcfuを摂取した被験体の3つの群に与えた(Tacketら、(1997)前出)。CVD908−htrA株はCVD908の親株と同様に十分に寛容化されていた。これらの22人の被験体の1人だけが、低い程度の発熱を生じ、これは、日常的な監視によって検出され、そして任意の倦怠感の苦情は伴わなかった。しかし、22人の被験体のうちの2人は、軟便を発症した(Tacketら(1997)、前出)。同様に、免疫応答は優れていた:22人の個体のうちの20人(91%)が、血清IgG O抗体において有意な上昇を実証し、そしてO抗原に対する抗体を作成する腸に由来するIgA ASCが、ワクチン接種を受けた人の100%において検出された。これらの免疫学的応答は、CVD908の匹敵する用量を用いて免疫した被験体におけるフェーズ1の臨床試験において観察されるものと実質的に同一である(Tacketら、(1992a)、前出)。1つの著しい相違は、ワクチネミアに関した。ワクチネミアが、CVD908の5.0×107または5.0×108のcfuの用量を受容した18人の被験体のうちの12人において検出されたが、十分に寛容化された高度に免疫原性の、CVD908−htrAの5.0×107-9のcfuの用量を摂取した22人の個体においてはワクチネミアは全く検出されなかった(p<0.001)(Levineら(1987b)、前出;Tacketら(1992a)、前出;およびTacketら(1997)、前出)。CVD908−htrAもまた、CVD908で記録されたものに強さにおいて匹敵する、ワクチン接種された人における強力な細胞によって媒介される免疫応答を誘発する(Tacketら(1992a)、前出;およびTacketら(1997)、前出)。これらの非常に有望なデータに基づいて、CVD908−htrAは、子供を含む多数の被験体におけるその臨床的な受容可能性および免疫原性を評価するためのフェーズ2の臨床試験に入った。
【0038】
(F.cya、crp、またはcya、crp、cdt中に変異を有する株) Sarmonellaにおいては、遺伝子cya(アデニル酸シクラーゼをコードする)およびcrp(サイクリックAMPレセプタータンパク質)は、多くの遺伝子およびオペロンに影響を与える全体的な調節システムを構成する(Curtissら、Dev.Biol.Stand.,82:23−33(1994))。S.typhimurium(cyaおよびcrpに欠失を有する)は、それらの野生型の親と比較して弱毒化されており、そして経口の免疫によって病原性のS.typhimuriumでのチャレンジに対してマウスを防御する(Curtissら(1987)、前出)。
【0039】
ワクチンの候補株である、χ3927(S.typhi Ty2株のcya-、crp-の二重変異株)が構築された(Curtissら(1994)、前出)。フェーズ1の臨床試験においては、χ3927株が、野生型株と比較して弱毒化されていたが、ヒトにおいて生の経口ワクチンとして作用するには不十分に弱毒化されており、その結果、被験体は時折、高熱および腸チフス様の症状を発症することが示された(Tacketら、(1992b)、前出)。いくつかの被験体はまた、ワクチネミアを示した(Tacketら、(1992b)、前出)。
【0040】
より大きな程度の弱毒化を達成するために、cdtにおける第3の欠失変異を、cya-、crp-変異株であるχ3927中に導入した(Curtissら(1994)、前出)。cdtは、肝臓、脾臓、および骨髄のような、細網内皮細胞系のより深い器官に対して、腸に関連するリンパ球様組織からのSalmonellaの汎発に影響を与える遺伝子である(Kellyら、Infect.Immun.,60:4881−4890(1992))。得られるcya-、crp-、cdt-の三重変異株であるχ4073を、北アメリカの健常な成人に、緩衝液とともに、5.0×105、5.0×106、5.0×107、または5.0×108のcfuを含有する単回の用量で、摂取させた(Tacketら、(1997)、前出)。この株は、下痢を発症した5.0×107のcfuの群における1人の個体を除いて、十分に寛容化されていた(Tacketら、(1997)、前出)。ワクチネミアを示した被験体はなかった。5.0×108のcfuを摂取した5人の被験体のうちの4人は、血清IgG O抗体において有意な上昇を示し、そしてIgA O抗体を作成するASCを有した(Tacketら、(1997)、前出)。
【0041】
(G.phoP/phoQ中に変異を有する株)
phoP/phoQ中に欠失を有する2つの候補のS.typhi株が構築された(Hohmannら、(1996a)、前出;およびHohmannら、Vaccine,14:19−24(1996b))。Ty445株(これはまた、aroA中にも欠失を有する)は、非常に弱毒化されており、そして最少にのみ免疫原性であることが見出された(Hohmannら(1996b)、前出)。対照的に、Ty800株(phoP、phoQ中のみに欠失を有するTy2の誘導体)は一般的に十分寛容化されており、そして11人の被験体を含むフェーズ1の小さい臨床試験において107から1010のcfuまでの投与量レベルで評価した場合には、免疫原性であった(Hohmannら(1996b)、前出)。最も高い投与量レベルでは、3人のワクチン接種を受けたヒトのうちの1人が、下痢を発症した(10回の軟便)。Ty800を受容した被験体の免疫応答と、CVD908−htrAおよびχ4073のレシピエント中で観察されるものとを比較することは、困難である。なぜなら、免疫学的なアッセイ技術のいくつかが異なり、そして同じアッセイが使用される場合(例えば、O抗体を作成するIgA ASC)でさえも、相当のバリエーションが、研究室間で生じることが知られているからである。
【0042】
(H.まとめ)
CVD908は十分に寛容化されているが、107のcfuの用量を摂取した被験体の約50%において、ワクチネミアを伴った。穏やかな、しかし明らかな下痢が、CVD908−htrA、Ty800、またはχ4073を摂取した被験体の約10%において観察されている。χ4073に対する免疫応答は、CVD908、CVD908−htrA、および明白には、Ty800で経口的に免疫した後に観察されるよりも、弱かった(上記の表1を参照のこと)。従って、フェーズ1の臨床試験を完了した4つの弱毒化されたS.typhi株が存在するが、それぞれは、さらなる候補の弱毒化されたS.typhiワクチン株の開発における目的が存在するという十分な関心を有する、少なくとも1つの欠点を有する。さらに、これらの4つの株のいずれもが、既知の防御免疫応答である、血清IgG抗Vi抗体を誘発することに成功していない。
【0043】
(VI.他の病原体に由来する防御抗原をコードする外来遺伝子を発現し、そして免疫システムに対してこれらの抗原を送達する、生のベクターワクチンとしての弱毒化されたSalmonella株の使用)
生のベクターワクチン(「キャリアワクチン」または「生の抗原送達システム」とも呼ばれる)は、ワクチン学の分野の刺激的かつ多目的な領域を含む(Levineら、Microecol.Ther.,19:23−32(1990);Morrisら、Gastroenterol.,103:699−702(1992);Barlettaら、Res.Microbiol.,141:931−940(1990);Douganら、Para.Immunol.,9:151−160(1987);およびCurtissら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.,146:35−49(1989))。このアプローチにおいては、生のウイルスまたは細菌ワクチンは、それが別の微生物の防御性の外来抗原を発現し、そしてその抗原を免疫系に送達し、それによって防御免疫応答を刺激するように改変される。公表されている生の細菌ベクターとして、とりわけ、弱毒化されたSalmonella(Levineら(1990)、前出;Morrisら、前出;Douganら、前出;およびCurtissら(1989)、前出)、Bacille Calmette Guerin(Barlettaら、前出)、Yersinia enterocolitica(Van Dammeら、Gastroenterol.,103:520−531(1992))、V.cholerae O1(Viretら、Mol.Microbiol.,7:239−252(1993))、およびE.coli(Hale、Res.Microbiol.,141:913−919(1990)が挙げられる。それぞれは、特定の利点およびいくつかの欠点を有する。
【0044】
弱毒化されたS.typhiは、ヒトについて生のベクターワクチンとしては特に魅力的である。なぜなら、それは経口的に投与され、腸に関連するリンパ球様組織および細網内皮細胞系にコロニー形成し、広範な免疫応答(血清抗体、粘膜のSIgA、広範な免疫応答(古典的なCTLを含む)、および抗体依存性の細胞性の細胞傷害性の形態を含む)を誘発するからである(Conryら、Gene Therapy、2:59−65(1995);Coxら、J.Virol.,67:5664−5667(1993);Davisら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、93:7213−7218(1996a);Davisら、Vaccines、96:111−116、Brownら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996b);Tacketら(1992a)、前出;Gonzalesら、J.Infect.Dis.,169:927−931(1994);およびSzteinら(1994)、前出)。さらに、Salmonellaは、遺伝的に容易に操作され、そして多くの外来抗原がすでにこれらの細菌中で発現されている。理論的には、種々の感染性の疾患に対する1回の用量の経口ワクチンが、十分に寛容化されたがなお高度に免疫原性であるS.typhiの生のベクター株中に、防御抗原をコードする外来遺伝子を安定に導入および発現させることによって、開発され得る(Levineら(1990)、前出)。
【0045】
(VII.プリンの代謝経路に変異を有するSalmonella)
(A.プリンの代謝経路に変異を有するSalmonella株の初期の報告)
SalmonellaにおけるpurAおよびpurB変異(アデニンヌクレオチドの新たな生合成を遮断する)(図2を参照のこと)は、十分に高度に弱毒化されている(McFarlandら、Microb.Pathogen.,3:129−141(1987))。これらの株は、動物においては非防御的であり(O’Callaghamら、Infect.Immun.,56:419−423(1988))、そしてヒトにおいては免疫原性が低い(Levineら、(1987b)、前出)。対照的に、一般的なプリン経路に関与する遺伝子のいくつか(すなわち、purF、purG、purC、purHD)における変異(これらは、両方のプリンヌクレオチドの生合成を妨害する(図2を参照のこと))、またはguaBもしくはguaAにおける変異(それらによって、グアニンヌクレオチドの生合成が遮断される(図2を参照のこと))は、はるかに少なく弱毒化されることが報告されている(McFarlandら、前出);実際、このような株は、102cfu程度の低い用量でマウス中で死を誘導した(McFarlandら、前出)。
【0046】
上記で検討した観察は以下のことを示唆する:
(i)一般的なプリン経路の酵素に影響を与える変異は、穏やかに弱毒化する(McFarlandら、前出);そして
(ii)一般的な経路に対して遠位でありそしてアデニンヌクレオチドの合成に影響を与える変異は、過度に弱毒化する(すなわち、purA、purB)(McFarlandら、前出;O’Callaghamら、前出;およびLevineら(1987b)、前出)が、グアニンヌクレオチドの合成に影響を与える遠位の変異は、最少に弱毒化するだけである(McFarlandら、前出)。
【0047】
(B.本発明における予想外でありそして特有の観察)
従って、上記に報告された公開された観察に基づけば、S.typhi中の特異的なgua栄養要求性が高度な弱毒化を提供することは、予想外の発見であった。この弱毒化は、低下した侵襲性(代謝経路中に弱毒化変異を有する他のSalmonella spp.においては以前には記載されていない特性)、およびΔguaB−A S.typhi変異株の低下した細胞内複製率に、一部起因すると考えられる。この知見は、グアニンヌクレオチドの合成に影響を与える挿入Tn5変異を保有するS.dublinおよびS.typhimuriumが、最少に弱毒化されるのみであると報告されたので、予想外であった(McFarlandら、前出)。さらに、別の予想外の知見は、この高度な弱毒化にもかかわらず、本明細書中に記載されているΔguaB−AであるS.typhi株CVD915は、マウスの動物モデルにおいて非常に免疫原性であった。この観察は、purAおよびpurBを不活化させる変異を有する高度に弱毒化された株が非常に免疫原性が低いという以前の報告からは予想できない(Edwardsら、前出)。また、別の予想できなかった観察は、CVD915株が、同じ弱毒化株において発現される組換え抗原に対する印象的な免疫応答を誘導することであった。この観察は、高度に弱毒化された株が組換え異種抗原についての乏しい生ベクターであるという、以前に報告された観察からは予想できない(Tacketら(1997)、前出)。
【0048】
さらに、CVD915株は、組換えの外来抗原(DNAによって媒介されるワクチン)をコードする真核生物発現ベクターを送達し、そしてびっくりするような免疫応答を誘発することが可能であった。真核生物の発現ベクタープラスミドを送達する特性は、弱毒化されたShigellaベクターを用いて(Sizemoreら、Science,270:299−302(1995));および弱毒化されたSalmonella typhimuriumベクターを用いて(Darjiら、Cell、91:765−775(1997))報告されている。Shigella ssp.は侵襲性の生物であり、そしてDNAワクチンを送達することにおけるそれらの成功は、それらが侵襲の直後に食胞を離れるという事実に対して二次的であると考えられる(Sansonettiら、Infect.Immun.,51:461−469(1986))。しかし、Salmonellaは、侵襲後に食胞を離れない。従って、本明細書中で提示される観察は、以前の概念からは予想できず、そして特有である。
【0049】
まとめると、本発明においては、特有の方法によって、Vi抗原の構成的でありそして安定な発現を達成するための、遺伝子操作された弱毒化されたSalmonellaを考案している。さらに、本発明のSalmonella変異株は、好ましくはまた、新たなグアニンの代謝経路における変異によって弱毒化させられる。
【0050】
(発明の要旨)
本発明の目的は、Vi抗原を構成的に発現するSalmonellaの弱毒化された株を提供することである。
【0051】
本発明の別の目的は、Vi抗原の構成的な発現を達成するための方法を提供することである。
【0052】
本発明のなお別の目的は、新たなグアニン代謝経路中での変異によってもまた弱毒化されるSalmonellaを提供することである。
【0053】
本発明のなお別の目的は、SalmonellaのguaBおよびguaA遺伝子中で欠失変異を達成するための方法を提供することである。
【0054】
本発明のさらなる目的は、腸チフスに対する経口または鼻腔内(すなわち、粘膜)ワクチンを提供することである。
【0055】
本発明のさらなる目的は、他の病原体からクローン化された外来遺伝子の生ベクターとして有用であり、そして発現および適切な免疫の際に、外来抗原が由来する病原体に対する防御免疫応答を惹起する、Salmonella株を提供することである。
【0056】
本発明のなおさらなる目的は、DNAによって媒介されるワクチンを送達するための生ベクターとして有用なSalmonella株を提供することである。
【0057】
本発明のこれらのおよび他の目的は、以下に提供される本発明の詳細な説明から明らかであり、1つの実施態様においては、弱毒化されたSalmonella変異株によって達成される。ここで、上記の変異株はVi抗原を構成的に発現する。
【0058】
(発明の詳細な説明)
本発明は、特に、腸チフスに対する経口ワクチンとして、ならびに外来抗原を発現する生ベクター、DNAによって媒介されるワクチンとしての使用のための、弱毒化Salmonllaを提供する。本明細書中で使用される場合は、「外来抗原」は、Salmonellaに対して外来である抗原を意味する。
【0059】
また、本発明においては、弱毒化Salmonella変異株が提供される。ここで、上記の変異株は、Vi抗原を構成的に発現する。
【0060】
本発明においては、Salmonellaの染色体ゲノムが、強力な構成的なプロモーターによって高度に調節されたvipRプロモーターを置きかえることによって改変され、従って、これによって、弱毒化Salmonella中でVi抗原の発現を構成的かつ安定に発現させることが好ましい。本発明において使用される特定の構成的なプロモーターは、従って重要ではない。このような構成的なプロモーターの例として、Ptac(de Boerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,80:21−25(1983))、Plac(De Boerら、前出)、Ptrc(De Sutterら、Gene、141:163−170(1994))、POlacおよびPlpp(De Sutterら、前出;およびGuisezら、Protein Expr.Purif.,2:249−258(1998))が挙げられる。
【0061】
本発明において出発物質として使用される特定のS.typhiは、従って、重要ではない。
【0062】
本明細書中の実施例においては、S.typhiワクチンは、野生型S.typhi Ty2株から構築された。
【0063】
S.typhi Ty2は、例えば以下のような種々の供給源から入手可能な周知の病原性のSalmonella株である:CVD、Centers for Disease Control(CDC)、Walter Reed Army Institute of Research、Uniformd Services University of the Health Sciences、Institut Pasteur(フランス)、Imperial College(英国)。
【0064】
他の野生型のS.typhi株(これらは、弱毒化ワクチン候補の開発において使用されており、そして本発明において出発物質として使用され得る)として、以下が挙げられる:CDC1080株(Levineら(1987b)、前出)(これは、スタンフォード大学またはCDCから入手され得る)、およびISP1820株(Honeら、(1991)、前出)(これは、Center for Vaccine Development、University of Marylandから入手され得る)。
【0065】
好ましくは、本発明においては、Salmonellaの染色体ゲノムが、guaB−Aオペロンを除去するかまたはそうでなければ改変することによって改変され、従って、グアニンヌクレオチドの新たな生合成をブロックする。より好ましくは、定義された、インフレームでの、guaB−Aオペロン中の非極性の変異が、プリンの代謝経路の酵素であるIMPデヒドロゲナーゼ(guaBによってコードされる)およびGMPシンテターゼ(guaAによってコードされる)を不活化する。これらの変異の結果として、Salmonellaは、新たにGMPを合成することができず、そして結果として、GDPおよびGTPヌクレオチドの合成ができない(図2を参照のこと)。これは、哺乳動物の組織においてその増殖を重篤に制限する。インビトロにおいては、本発明のΔguaB−A Salmonella変異株は、グアニンを補充していない最少培地では増殖することができない。組織培養物においては、本発明のΔguaB−A Salmonella変異株は、それらの侵襲能力において有意な低下を示すことが見出された。ΔguaB−A Salmonella変異株は、哺乳動物の宿主の組織からグアニンヌクレオチドを廃棄し得る。しかし、それらのSalmonellaへの同化作用が、グアニンの回収経路中にヌクレオチド前駆体として取りこまれるペリプラズムヌクレオチダーゼによる、ヌクレオシドへの脱リン酸化の前に、必要である。従って、ヌクレオチドが哺乳動物宿主の細胞内環境において容易に入手可能であるので、グアニンヌクレオチドの新たな合成に起因する弱毒化は、回収経路の不十分さ、または今日までの知見に対して曖昧である理由のいずれかに起因する。
【0066】
guaA遺伝子(これはGMPシンテターゼをコードする)は、1575bpの大きさである(図3A〜3Gを参照のこと)。従って、guaA変異体におけるシストロン内(intracistronic)不活化欠失の大きさは、1から1575bpの範囲であり得、好ましくは、欠失がインフレームである場合には、100から1575bpの範囲であり得る。guaA遺伝子を超える範囲におよぶ欠失もまた行われ得る。すなわち、guaAの下流の槽内欠失が、この遺伝子の転写に影響し得、従って、それを不活化し得る。しかし、後者は、好ましくはない。
【0067】
guaB遺伝子(これは、IMPデヒドロゲナーゼをコードする)は、1533bpの大きさである(図3A〜3Gを参照のこと)。従って、guaB変異体中のシストロン外(extracistronic)欠失の大きさは、1bpから1533bpの範囲であり得、好ましくは、欠失がインフレームである場合には、100から1533bpの範囲であり得る。guaB遺伝子を超える範囲におよぶ欠失もまた行われ得る。すなわち、guaBの下流のシストロン外欠失が、両方の遺伝子(guaBおよびguaA)の転写に影響し得、従って、それらを不活化し得る。しかし、後者は、好ましくはない。
【0068】
欠失は、guaA遺伝子中に配置された2つの便利な制限部位を使用して、guaA遺伝子中に作成され得る;これらの例は、ScaIまたはAccI、およびEcoRVまたはSalIまたはSmaIまたはSphIまたはXmaIである(図3A〜3G、および図4)か、あるいはオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発による(Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publication編(1989))。
【0069】
欠失は、guaB遺伝子中に配置された2つの便利な制限部位を使用して、guaB遺伝子中に作成され得る;これらの例は、BclI、およびBsmIまたはEcoRIまたはPvuIIまたはSacIIまたはSspIまたはXhoIIである(図3A〜3G、および図4)か、あるいはオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発による(Sambrookら、前出)。
【0070】
さらに、guaB遺伝子およびguaA遺伝子中に同時に配置された制限部位の任意の組み合わせが、本発明の欠失変異株を得るために使用され得る;この例として、AccIII、AflIII、AhaII、AlwI、AlwNI、AsuI、BanI、BcnI,Bsp1286、BspMII、およびDdeIが挙げられる(図3A〜3G)。
【0071】
guaA遺伝子および/またはguaB遺伝子の不活化はまた、guaBおよび/またはguaAの正確な転写を遮断するように、上記の制限部位の任意のものを使用する外来DNAの挿入によって、またはオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発によって(Sambrookら、前出)行われ得る。guaA遺伝子およびguaB遺伝子を不活化し得る挿入物の代表的な大きさは、1塩基対から100kbpであるが、100kbpよりも小さい挿入物が好ましい。挿入は、guaA遺伝子またはguaB遺伝子のコード領域の内部、またはコード領域とプロモーターの間のどこででも行われ得る。
【0072】
guaAおよび/またはguaB遺伝子の不活化のための他の方法として、他の腸内細菌のguaA遺伝子またはguaB遺伝子中に作成された欠失または挿入の、Salmonellaへの移入、トランスポゾンによって生成される欠失、およびDNAの挿入物の不正確な切除が挙げられる。後者の2つの方法は、guaA遺伝子またはguaB遺伝子を超える範囲にわたる欠失を作成する可能性がより高く、従って好ましくはない。
【0073】
本発明のgua変異体は、非反応原性(non−reactgenic)であるSalmonellaの候補の生の経口ワクチンの開発に有用である。
【0074】
例えば、他の弱毒化変異を含むことに加えて、aro遺伝子産物を発現しないSalmonellaワクチン候補が、構築され得る。これは、Salmonella染色体中の少なくとも1つのaro遺伝子(aroA、aroC、またはaroD)の一部を欠失させ、PABA(Salmonella typhi CVD908株のような哺乳動物細胞中では廃棄され得ない基質)について栄養要求性菌株にすることによって達成され得る(Honeら、(1991)、前出)。
【0075】
別の実施態様においては、本発明の上記の目的は、以下を含有する腸チフスに対するワクチンによって達成されている:
(A)薬学的有効量のSalmonella typhi変異株、ここで、上記の変異株はVi抗原を構成的に発現する;および
(B)薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。
【0076】
なお別の実施態様においては、本発明の上記の目的は、以下を含有する生のベクターワクチンによって達成されている:
(A)薬学的有効量のSalmonella変異株、ここで、上記の変異株はVi抗原を構成的に発現し、そしてここで、上記の変異株は原核生物のプロモーターの制御下で外来抗原をコードしそして発現する(すなわち、外来抗原の細菌性の発現);および
(B)薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。
【0077】
Salmonellaの生ベクター中で使用される特定の外来抗原は、本発明については重要ではない。本発明の弱毒化Salmonella株(単数または複数)は、腸の病原体(細菌、ウイルスなどのような定義された病原体)、性的に伝達される疾患の病原体、急性の気道疾患の病原体、または疾患(例えば、髄膜炎菌(meningococcal)疾患)の全身的な発現を生じることを導く粘膜に侵入する病原体に対する免疫のための生のベクター(単数または複数)として使用され得る。これらは、Plasmodium falciparum、Leishmania種、Entameba histolytica、およびCryptosporidiumのような、種々の型の寄生生物の感染症に対して防御するためにもまた、使用され得る。
【0078】
本発明のSalmonellaの生ベクター中で発現され得る腸病原体に由来する抗原の例として、以下が挙げられる:
(a)腸毒素産性E.coliの線毛の(fimbrial)コロニー形成因子、および熱不安定性の腸毒素または変異体熱不安定性腸毒素のBサブユニット(これは、腸管の分泌物を生じないが、中和抗毒素を誘発する)のいずれか;
(b)Shiga毒素1もしくは2(または変異体Shiga毒素1もしくは2)のBサブユニットとともに、腸出血性のE.coliの線毛の抗原および/または内膜(intimin);
(c)ShigellaのO抗原、およびShigellaの侵襲性プラスミド抗原またはVirG;
(d)ロタウイルスに由来する中和抗原;
(e)Helicobacter piloriに由来する、ウレアーゼ、コロニー形成抗原、および他の防御性の抗原;ならびに
(f)不活化Clostridium difficileの毒素、またはそれらに由来する抗原。
【0079】
本発明のSalmonellaの生ベクター中で発現され得る性的に伝達される病原体に由来する抗原の例として、以下が挙げられる:
(a)Neisseria gonorrhoaeのピリ線毛および外膜タンパク質;ならびに
(b)Chlamydia trachomatisのタンパク質。
【0080】
本発明のSalmonellaの生ベクター中で発現され得る急性の気道の病原体に由来する抗原の例として、以下が挙げられる:
(a)毒性の活性を欠いているが、なお中和抗毒素を誘発する、NAD結合ドメイン中に置換を有する、変異体ジフテリア毒素;
(b)破傷風毒素のフラグメントCに融合させられた百日咳毒素の短形のS1サブユニット、変異体百日咳毒素、繊維状血球凝集素、およびペルタクチン(pertactin)からなる融合タンパク質を含む、Bordetella pertussisの抗原;
(c)RSウイルスのF糖タンパク質およびG糖タンパク質;
(d)Haemphlus influenzae b型の夾膜のポリサッカライド;ならびに
(e)A群およびC群のNeisseria meningitidisの夾膜のポリサッカライド、ならびにB群のN.meningitidisの外膜タンパク質。
【0081】
本発明のSalmonellaの生ベクター中で発現され得る、寄生生物に由来する抗原の例として、以下が挙げられる:
(a)Plasmodium falciparumの、スポロゾイト周囲のタンパク質(circumsporozoite protein、CSP)、Liver Stage抗原1(LSA−1)、SSP−2(TRAPとしても知られている)、およびExp−1;
(b)P.falciparumの、無性の赤血球の世代の抗原(MSP−1、MSP−2、SERA、AMA−1、およびSREHPを含む);
(c)P.falciparumの、有性世代の抗原(Pfs25を含む)、およびLeishmania種のgp63;ならびに
(d)セリンリッチなEntameba histolyticaタンパク質(SREHP)。
【0082】
なお別の実施態様においては、本発明の上記の目的は、以下を含有するDNAによって媒介されるワクチンによって達成されている:
(A)薬学的有効量のSalmonella変異株、ここで、上記の変異株はVi抗原を構成的に発現し、そしてここで、上記の変異株は、真核生物細胞中で、真核生物のプロモーターを使用して、外来抗原をコードしそして発現するプラスミドを含む;および
(B)薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。
【0083】
DNAによって媒介されるワクチンの構築および使用についての詳細は、1995年5月3日に提出された、米国特許出願番号第08/433,790号において見出され得る。これは、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【0084】
DNAによって媒介されるワクチンにおいて使用される特定の外来抗原は、本発明については重要ではない。このような抗原の例として、以下のような病原体の多様性に由来するものが挙げられる:インフルエンザ(Justewiczら、J.Virol.,69:7712−7717(1995);およびFynanら、Int.J.Immunopharmacol.,17:79−83(1995))、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス(Zarozinskiら、J.Immunol.154:4010−4017(1995))、ヒト免疫不全ウイルス(Shiverら、Ann.NY.Acad.Sci.,772:198−208(1995))、B型肝炎ウイルス(Davisら、Vaccine、12:1503−1509(1994))、C型肝炎ウイルス(Laggingら、J.Virol.,69:5859−5863(1995))、狂犬病ウイルス(Xiangら、Virology、209:569−579(1995))、住血吸虫(Yangら、Biochem.Biophys.Res.Commun.,212:1029−1039(1995))、プラスモディウム(Sedegahら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、91:9866−9870(1994));ならびにマイコプラズマ(Barryら、Nature、377:632−635(1995))。
【0085】
Salmonella中で(生のベクターワクチン中で原核生物プロモーターを使用する)、またはSalmonellaによって侵入された細胞中で(DNAによって媒介されるワクチン中で原核生物プロモーターを使用する)外来抗原を発現するか否かの決定は、その特定の抗原のためのワクチン構築物が、動物研究または臨床試験において最良の免疫応答を生じること、および/または抗原のグリコシル化がその防御的な免疫原性に必須であるか否か、および/または抗原の正確な三次構造が、他よりも1つの発現の形態で良好に達成されるか否かに基づき得る。
【0086】
本発明のワクチンにおいては、投与される薬学的有効量の本発明の変異株は、被験体の年齢、体重、および性別、ならびに投与の形態に依存して変化し得る。一般的には、使用される投与量は、約102のcfuから約1010のcfuまでである。好ましくは、約106のcfuから約109のcfuまでが、ワクチンがカプセル中でまたは胃での酸性pHに対して弱毒化された細菌を保護するための緩衝液中に再懸濁されて与えられる経口投与に使用される;または、約102のcfuから約107のcfuまでが、細菌が錠剤またはエアゾールで与えられる鼻腔内投与のために使用される。
【0087】
使用される特定の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、本発明については重要ではなく、そして当該分野では従来のものである。希釈剤の例として、以下が挙げられる:胃の胃酸に対して緩衝化するための緩衝液(例えば、スクロースを含有するクエン酸緩衝液(pH7.0)、重炭酸緩衝液(pH7.0)のみ(Levineら、(1987b)、前出;およびBlackら、前出)、またはアスコルビン酸、ラクトース、および必要に応じてアスパルテームを含有する重炭酸緩衝液(pH7.0)(Levineら、Lancet,II:467−470(1988))。キャリアの例として、以下が挙げられる:タンパク質(例えば、スキムミルク中に見出されるもの);糖(例えば、スクロース);またはポリビニルピロリドン。
【0088】
本発明の変異株は、30%〜50%(v/v)のグリセロールを含有するLuriaブロス(DIFCO)中に懸濁させられる場合は、−70℃で保存され得る。
【0089】
以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、そして本発明の範囲を限定するようには決して意図されない。
【0090】
(実施例1)
(ΔguaB−A S.typhi株の構築)
(A.ΔguaB−A欠失カセットpJW101の構築)
guaB遺伝子の5’末端、およびguaA遺伝子の3’末端を含むDNAセグメントを、鋳型としてS.typhi Ty2株のゲノムDNAを使用するPCRによって増幅し、次いで、第2のPCR反応において融合させた。それによって、ΔguaB−A対立遺伝子を得た(図4)。ΔguaB−A対立遺伝子の構築において使用した方法は、ΔguaB−A S.flexneri 2a CVD1204株中のΔguaB−A対立遺伝子の構築において記載された方法と同様であった(Noriegaら、(1996)、前出;および1996年4月9日に出願された米国特許出願番号第08/629,600号(現在は認められている)(これは、本明細書中でその全体が参考として援用されている))。
【0091】
最初のPCR反応(図4)においては、guaB−A対立遺伝子の5’末端を増幅するために使用したプライマーは、以下のとおりであった:
【0092】
【化1】
【0093】
ならびに、ΔguaB−A対立遺伝子の3’末端を増幅するために使用したプライマーは、以下のとおりであった:
【0094】
【化2】
【0095】
内部プライマー(配列番号3および配列番号4)中には、染色体のΔguaB−A対立遺伝子中への外来遺伝子の導入のために付加した、2つの特有の制限部位(ApaIおよびBamHI)(下線)の上流に、インフレームで停止シグナルコドン(TGAおよびTCA)を導入した。停止シグナルは、ΔguaBのΔguaA産物との翻訳融合、またはΔguaB−A対立遺伝子の中央に挿入された外来遺伝子産物とのΔguaB産物の翻訳融合を避ける。さらに、これらの内部プライマーには、相同領域(太字)として作用する配列を導入した。これによって、5’および3’のPCR産物を、第2のPCR反応において融合させた(従って、ΔguaB−A対立遺伝子を形成する)(図4)。
【0096】
第2のPCR反応においては、5’および3’セグメントを、端のプライマー(配列番号2および5)を使用して融合させた。そして、得られた融合産物を、同じ反応において増幅させた。この反応においては、所定の相同領域(ApaI−BamHI)がアニーリングし、それによって5’および3’セグメントが効率的に融合し、これはこの時点で、DNAの鎖がそれにアニーリングすることに依存して、それら自身のプライマーおよび/またはTaqポリメラーゼの鋳型として作用し得た。この融合を促進するために、最初の15サイクルはアニーリング温度スロープ(40℃から50℃まで1℃/8秒、および50℃にて2分間)を有し、続く15サイクルは、新しいΔguaB−A対立遺伝子が増幅されるように55℃のアニーリング温度を有するように、PCR−プログラムを設計した。従って、増幅されなかったguaB−Aオペロンの900塩基対が存在し、これによってΔguaB−Aを生じた(図4)。
【0097】
端のプライマー(配列番号2および5)を、特有の制限部位(SstIおよびXbaI)(下線)を導入するように設計した。これらを、温度感受性のpSC101ベース(Blomfieldら、Mol.Microbiol.,5:1447−1457(1991))の自殺プラスミドpFM307A中の特有の制限部位中にΔguaB−A対立遺伝子をクローニングするために使用した。これによって、プラスミドpFM307::ΔguaB−AプラスミドFM307A(6.3Kbp)を得た。これは、pIB279(Blomfieldら、前出)に由来するSacB−Kanカセット(カナマイシンに対する耐性およびスクロースカウンター選択を提供する)を含有する3.8KbpのBamHI−BamHIフラグメント(クレノウポリメラーゼにより平滑末端化)で、pIB307(Blomfieldら、前出)中にcam遺伝子(クロラムフェニコール耐性)を含有する4.3KbpのNaeI−NaeIフラグメントを置換することによって、構築した。さらに、ΔguaB−A対立遺伝子の中央に非抗生物質の選択マーカーを挿入することが、以下のために利点であると考えられた:
(i)Ty2の完全なguaB−A対立遺伝子についての、ΔguaB−Aの交換を容易にする;および
(ii)培地中でのワクチン株の同定を可能にする選択マーカーを提供する。
【0098】
従って、次に、R因子R773の5.0Kbpのヒ素耐性(ars)オペロンを、pUM1(Chenら、J.Bacteriol.,161:758−763(1985))(Rosen博士、Wayne State University Detroit,MIから懇意によって提供された)からHindIIIフラグメントとして得、そしてpKK223−3(Pharmacia,Piscataway,NJ)中のPtacプロモーターの制御下にクローン化した。次いで、(平滑末端化した)Ptac−ars NaeI−DraIセグメントを得、そしてpFM307::ΔguaB−A中のΔguaB−A対立遺伝子のApaI部位(T4ポリメラーゼによって平滑末端化した)中にクローン化して、pJW101を得た(図4)。
【0099】
(B.自殺欠失カセットによって駆動される変異)
pJW101を、6.0μMの亜ヒ酸ナトリウム(SIGMA)が手順を通じて培地中に存在したことを除いて、Blomfieldら、前出;Noriegaら(1995)、前出、およびNoriegaら(1996)、前出によって記載されるように、相同組換えによって野生型のS.typhi Ty2株中にΔguaB−A::Ptac−ars対立遺伝子を導入するために使用した。
【0100】
(C.DNAプローブおよびPCRによる変異株のスクリーニング)
候補の細菌クローンを、6.0μMの亜ヒ酸ナトリウムを補充したLuria寒天プレート上の格子パターン中で、または最少培地中で、一晩37℃にて増殖させた。次いで、亜ヒ酸を補充したL寒天上では増殖しているが、最少培地中では増殖していないコロニーを、No.541フィルターペーパー(Whatman,Maidstone,England)に移し、そしてGicquelaisら、J.Clin.Microbiol.,28:2485−2490(1990)によって記載されているようにブロットし、そしてγP32−標識した40bpの以下のオリゴヌクレオチドを使用してプローブした:
5’−GGGCGGCCTGCGCTCCTGTATGGGTCTGACCGGCTGTGGT−3’(配列番号6)。このオリゴヌクレオチドは、guaB−A野生型対立遺伝子の欠失させられた部分に対応する(ネガティブなプローブ)。γP32−標識した40bpのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしなかったクローンを選択した。ΔguaB−A S.typhiクローンは、10mgのグアニン/lを補充しない限りは、最少倍地中では増殖し得なかった。
【0101】
guaB−Aオペロン中の欠失変異およびΔguaB−A対立遺伝子中のPtac−ars挿入物を、P32−標識したΔguaB−Aオペオン、arsオペロン、および上記のguaB−Aネガティブプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションによって確認した。1つのΔguaB−A S.typhiクローンを任意に選択し、そしてCVD915と命名した。CVD915株を、ATCC登録番号第202115号のもとで、1998年5月4日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。
【0102】
CVD915株は、培地中に6.0μMの亜ヒ酸ナトリウムを加えて慣用的に増殖させられるが、Ty2株を用いた場合、または試験したSalmonella、Shigella、もしくはE.coliの任意の他の株を用いた場合は、この亜ヒ酸濃度では増殖は得られない。
【0103】
(実施例2)
(組織培養物中での侵入および細胞内増殖)
侵入および細胞内増殖を、ゲンタマイシン防御アッセイを使用してアッセイした。アッセイは、Tarteraら、Infect.Immun.,61:3084−3089(1993)によって以前に記載された方法にわずかな改変を用いて行った。簡潔には、24ウェルプレート上のセミコンフルエントなHenle407細胞の単層を、野生型Ty2株;ΔguaB−A CVD915株;ΔaroC、ΔaroD CVD908株、またはΔaroC、ΔaroD、Δhtr CVD 908−htrAのいずれかを用いて、50:1の比で90分間、三連のウェルで感染させ、その後、細胞外の生物体を、100μg/mlのゲンタマイシンを用いて30分間で死滅させ、洗浄(0時間の時点)し、そしてその後、20μg/mlのゲンタマイシンとともにインキュベートした。その後の、0時間、4時間、および22時間で、三連で感染させた組織培養単層を、滅菌水を用いて溶解させ、そしてその懸濁物の段階希釈物を、37℃にて一晩、1リットル当たり10μgのグアニンを補充したLB寒天上で培養した。結果を、以下の表2に示す。
【0104】
【表2】
【0105】
上記の表2に示すように、CVD915株は、野生型のTy2株によって示されるよりも有意に低く、そしてCVD908−htrA株によって示されるものに匹敵する、侵入能力および細胞内増殖を有した。すなわち、上記の表2に示すように、2つの異なる実験において、野生型のS.typhi Ty2株は、Henle 407細胞に効率よく侵入し、そして22時間の期間で13倍以上にそれらを複製した。ΔaroC、ΔaroD CVD908株は、一貫してより少ない(すなわち、22時間で6倍)細胞内産生を有した。上記の表2に示すように、また、変異株ΔguaB−A CVD915株は、その野生型の親株またはCVD908株およびCVD908−htrA株よりもHenle細胞に対して明らかに侵入性が低かった。そしてその細胞内増殖(すなわち、0倍)は、CVD908−htrA変異株のものと同等であった。
【0106】
(実施例3)
(ワクチン候補のTy21A株、CVD908株、およびCVD915株の比較安全性)
ΔguaB−A S.typhi CVD915株の弱毒化を、野生型のTy2株、および他の弱毒化された株について、マウスのブタ−ムチンアッセイを使用して確認した(Powellら、J.Biolog.Standar.,8:79−85(1980))。簡潔には、マウスを、0.5mlの10%(w/v)のブタムチン中に懸濁した異なる株の種々の10倍希釈物を用いて腹腔内接種した。続いて、マウスを、接種の72時間後までに起こる死亡率について追跡した。そしてそれらの直線回帰の分析によって、異なる群のLD50を計算した。結果を、以下の表3に示す。
【0107】
【表3】
【0108】
上記の表3に示すように、CVD915株は、野生型Ty2株を用いて得られるものを5対数以上上回り、そしてΔaroC、ΔaroD CVD908変異株株によって得られるものと、化学的に変異誘発された非侵入性のTy21a株によって得られるものとの間である、概算されたLD50を有した。
【0109】
(実施例4)
(外来タンパク質の送達のための生ベクターとしてのCVD915株の使用、および真核生物細胞中の外来抗原を発現するためのDNAワクチンプラスミド)
破傷風毒素のフラグメントC(TTのフラグメントC)を保有している遺伝子操作されたS.typhi(CVD908)のΔaroC株、ΔaroD株での鼻腔内免疫のマウスモデルが、Galenら、Vaccine,15:700−708(1997)に記載されている。このモデルにおいてアッセイした構築物は、nirBまたは強力な構成的プロモーターであるlppに由来する嫌気的に活性化される原核生物プロモーターの制御下で融合されていないTTのフラグメントCをコードするCVD908保有プラスミドを含んだ。以下のことを観察した:
(i)これらの構築物を用いるマウスの鼻腔内免疫によって、高力価の中和抗TT血清IgG抗体を得た;
(ii)免疫したマウスは、コントロールマウスの全てを死滅させた致死用量の150%のTTを用いたチャレンジに対して防御された;ならびに
(iii)免疫の6週間後に鼻腔内免疫したマウスの脾臓および頚部の局所性リンパ節から得た細胞は、S.typhi(Hd鞭毛およびフェノールで不活化した全細胞S.typhi粒子)に応答して、ならびにTTのフラグメントCおよびTT抗原に応答して、有意な増殖応答を示した。
【0110】
これらの研究は、原核生物プロモーターまたは真核生物プロモーターの制御下、で外来抗原(すなわち、TTのフラグメントC)をコードする遺伝子を含有するプラスミドを保有しているS.typhiの新規の弱毒化された株の、マウスにおける免疫原性の研究によって以下に広げられている。
【0111】
(A.TTのフラグメントCをコードする原核生物および真核生物発現ベクターを保有しているS.typhiの弱毒化された株での免疫によって誘発される、免疫学的応答)
免疫応答がプラスミドDNAでの直接的な免疫によって誘発され得るという観察(Ulmerら、Science,259:1745−1749(1993))に従って、外来抗原をコードするいくつかの核酸ベクターが、ワクチンとして評価されている。DNAワクチン接種は、多くのウイルス抗原(インフルエンザAウイルスのNPを含む)をコードするプラスミドを使用する、高レベルの体液性免疫応答および細胞によって媒介される免疫応答の両方を誘発することが、示されている(Ulmerら、前出)。この初期の観察から、外来抗原をコードするいくつかの核酸ベクターが、ワクチンとして評価されている。特に、DNAワクチン接種は、インフルエンザウイルス抗原を使用して非常に広範に研究されている。防御免疫応答が、インフルエンザウイルス抗原をコードする真核生物発現ベクターでの筋肉内(i.m.)免疫または表皮(遺伝子銃(gene gun))免疫後に、マウスにおいて(Fynanら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、90:11478−11482(1993a);Justwiczら、(1995)、前出;およびJustewiczら、Virol.,224:10−17(1996))、クロアシイタチ(ferret)において(Websterら、Vaccine,12:1495−1498(1994))、ニワトリにおいて(Fynanら、DNA Cell Biol.,12:785−789(1993b);およびFynanら、(1993a)、前出)、ならびに非ヒト霊長類において(Donnellyら、Nat.Med.,1:583−587(1995))誘導されている。他のウイルス(Coxら、前出;Davisら、(1996a)、前出;Donnellyら、前出;Laggingら、前出;Wangら、Virol.,221:102−112(1995);およびZarozinskiら、前出);寄生生物(Doolanら、J.Exp.Med.,183:1739−1746(1996);Gardnerら、J.Pharm.Sci.,85:1294−1300(1996);Hoffmanら、Vaccine,12:1529−1533(1994);Sedegahら、前出;およびYangら、前出);細菌(Andersonら、Infect.Immun.,64:3168−3173(1996);Barryら、前出;Huygenら、Nat.Med.,2:893−898(1996);Lukeら、J.Infect.Dis.,175:91−97(1997);およびTasconら、Nat.Med.,2:888−892(1996));ならびに腫瘍細胞(Conryら、Cancer Res.,54:1164−1168(1994);Conryら、(1995)、前出;およびWangら、Human Gene Therapy、6:407−418(1995))に由来するいくつかの他の抗原に対する免疫応答もまた、種々の動物モデルにおいてDNAワクチン接種によって誘導されている。これらの研究は、DNAワクチンによって誘発される免疫応答の性質の理解を増大させた。例えば、強力な抗体応答が、この抗原をコードするプラスミドでの単回のi.m.(筋肉内)免疫後にB型肝炎の表面抗原(HBsAg)に対して、マウス中で誘発されている(Davisら、Hum.Mol.Genet.,2:1847−1851(1993);およびMichelら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,92:5307−5311(1995))。これらの研究においては、ピークのIgG力価は、免疫後の4〜8週間で観察された。これは、6ヶ月の間、高レベルで維持された。この抗原をコードするDNAワクチンもまた、精製されたHBsAgに対して応答性ではないマウスにおいて抗体およびMHCクラス1制限CTL応答を誘発することにおいて有効であることが示されている(Davisら、(1996b)、前出;およびSchirmbeckら、J.Virol.,69:5929−5934(1995))。従って、少なくともHBsAgの場合においては、DNAワクチン接種は、マウスにおける遺伝的な制限を克服し、そして精製されたタンパク質での非経口的な免疫よりもより持続的な免疫応答を誘導することが、示されている。
【0112】
破傷風毒素(TT)は、Clostridium tetaniによって合成される強力な神経毒である。ヒトおよび動物における破傷風に対する防御免疫性は、血清中のTT中和抗体の力価と相関する(Bizzini、Clostridium Tetani、Gylesら(編)、Iowa State University Press,Ames,IA、97−105頁(1993);およびHabigら、Vaccines and Immunotherapy,Cryz(編)、Pergamon、New York、13−19頁(1991))。従って、破傷風に対する良好な防御が、不活化させられたTTまたは非毒性の誘導体での非経口的な免疫によって誘導され得る。このようなワクチン調製物の能力の測定は、十分に確立された手順であり、そして欧州および英国の薬局方(European and British Phamacopoeias)(Costerら、Lancet,345:949−952(1995);およびSanchezら、Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.,89:542−545(1995))に記載されている。抗破傷風抗体のレベルは、マウスにおける毒素中和アッセイによって伝統的に決定される。最近は、敏感なELISAアッセイが開発されている。これは、あまり時間がかからず、そしてあまり高価ではないが、毒素中和試験と十分に相関する(Manghiら、J.Immunol.Methods,168:17−24(1994);およびMelville−Smith、DiptheriaおよびTetanus Antitoxins,Wreghittら(編)、ELISA in the Clinical Microbiology Laboratory,Public Health Laboratory Service,London、136−147頁(1990))。血清中の抗毒素抗体の力価は、通常は、国際的な標準の抗TT血清(WHO)との比較によって、IU/ml(ここで、ヒトの血清中の0.1IU/mlは、TTチャレンジに対する防御のために十分である)において決定される。従って、ワクチンの効力(IU/mlで表される)は、異なるTTワクチン調製物について比較され得る。現在では、破傷風に対するワクチン調製物が、C.tetaniに由来するTTのホルムアルデヒド不活化によって産生され、これは時間を必要とし、そして技術的に骨の折れる手順である。これは、ワクチンとしてのTTの代替の脱毒素化された調製物についての研究を促した。
【0113】
TTは、100kDaの重(H)鎖にジスルフィド結合した50kDaの軽(L)鎖を含有する150kDaのタンパク質からなる(Heltingら、J.Biol.Chem.,252:187−193(1977a);およびNiemannら、Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins,Alouf編、Sourcebook of Bacterial Protein Toxins,Academic Press,London(1991))。このタンパク質の毒性の活性は、L鎖、ジンク依存性プロテアーゼ中にある(Schiavoら、EMBO J.,11:3577−3583(1992))。これは、シナプトブレビンのタンパク質分解によるニューロンからのインヒビターの放出のブロックを媒介すると考えられている(Schiavoら、Nature(London)、359:832−835(1992))。H鎖は、シナプス前膜で毒素に結合し、その取りこみを開始すると考えられている(Heltingら、J.Biol.Chem.,252:194−197(1977b);およびMorrisら、J.Biol.Chem.,255:6071−6076(1980))。パパインでの毒素分子の消化によって、H鎖のC末端に対応する50kDaのポリペプチドおよび100kDaの分子を生じるH鎖のN末端に連結されたL鎖に対応する(Heltingら、(1997a)、前出)。50kDaのポリペプチド(TTフラグメントC(FC)と呼ばれる)は非毒性であるが、ガングリオシド(Halpernら、Infect.Immun.,58:1004−1009(1990);およびMorrisら、(1980)、前出)およびタンパク質結合活性を有する(Schiavoら、FEBS.Lett.、290:227−230(1991))。初期の研究においては、天然の毒素のタンパク質分解によって誘導されるFcでの動物のワクチン接種が、TTでの続く致死チャレンジに対してそれらを防御することが示された(Heltingら、(1977a)前出。さらに、モノクローナル抗体を用いた研究は、中和エピトープがこの分子内に存在することを実証した(Kenimerら、Infect.Immun.,42:942−948(1983))。従って、FCは、代替のTTワクチンの産生のための良好な候補分子として同定された。
【0114】
最近のデータは、CMVプロモーター/エンハンサー領域(pcDNA3/tetC)の制御下にTTのフラグメントCをコードするプラスミドでの筋肉内免疫が、高い抗フラグメントC血清抗体力価、増殖応答、およびインナーフェロン−γの産生を誘発したことを示した。さらに、これらのマウスが、TTでの致死チャレンジに対して防御されたことが示された(Andersonら、前出)。
【0115】
pcDNA3/tetの免疫原性および防御能力が最適化され得るかどうかをさらに調べるための努力において、S.typhiの弱毒化された株によって宿主にこの構築物を送達するための一連の研究を開始した。このアプローチは、細菌および他の感染性の疾患に対するDNA媒介ワクチンについての新たな送達系を提供する可能性を有する。
【0116】
これらの研究の記載(pcDNA3/tetCの構築を含む)を、以下に示す。
【0117】
(1.TTのフラグメントCをコードする遺伝子)
TTをコードする遺伝子の配列は、当該分野で記載されている(Eiselら、EMBO J.,5:2495−2502(1986);Fairweatherら、J.Bacteriol.,165:21−27(1986);およびFairweatherら、Nucleic.Acids Res.,14:7809−7812(1986))。Ptacの制御下で天然のフラグメントC配列をコードするプラスミドベクターは、E.coli中で低いレベル(3−4%のtcp)でFCを発現することが、以前に示された(Makoffら、Bio/Technology,7:1043−1046(1989))。発現レベルを増大させるために、天然のフラグメントC遺伝子(これは、A−Tリッチである)のコドン使用頻度を、E.coliについて最適化した。得られた99%の合成のフラグメントC遺伝子(tetC)は、E.coli中でより高いレベル(11−14%のtcp)での発現を指向した(Makoffら、Nucleic.Acids Res.,17:10191−10202(1989))。このことは、ワクチン接種のための大量のフラグメントCを産生する手段としての他の発現系の研究を促した。酵母細胞から精製された組換えフラグメントCの調製(Clareら、Biotechnology(N.Y.)、9:455−460(1991);およびRomanosら、Nucleic.Acids Res.,19:1461−1467(1991))、および培養された昆虫細胞(Charlesら、Infect.Immun.,59:1627−1632(1991))もまた、現在、非経口的な免疫後に破傷風毒素に対する防御的な免疫応答を誘導することが示されている。興味深いことに、E.coliを用いる場合と同様に、フラグメントCをコードする天然のC.tetani遺伝子は、Saccharomyces cerevisiae中では発現され得なかったのに対して、pTETtac115に由来するコドン最適化遺伝子は、この生物体によって発現された。従って、E.coli中での発現についてコドンが最適化されている合成のフラグメントC遺伝子は、真核生物中での発現について偶然に最適化されているようである。
【0118】
(2.pTETnir15の構築)
インビボでの外来抗原の構成的な高い発現レベルは、抗原をコードするプラスミドの欠失を生じ得、これは、免疫系に対して抗原を送達するキャリア株の能力を損なう。結果として、いくつかのアプローチが、インビボでのプラスミドの安定性を維持するために使用されている。1つのこのようなアプローチは、nirBプロモーターのようなインビボで誘導性であるプロモーターの使用である。このプロモーターは、E.coli中で最初に定義され、ここでこのプロモーターは、NADH依存性の硝酸レダクターゼ遺伝子であるnirBを含むオペロンの発現を制御する。これは、硝酸によって調節され、そして環境の酸素圧力において変化し、嫌気条件下でピーク活性を達成する。制限された酸素利用率の雰囲気下で細菌細胞が増殖する場合に誘導されるか、またはインビトロで真核生物細胞に侵入する、nirBプロモーターの改変されたバージョンが、構築されている。相同なCol−E1に基づくプラスミド(これは、nirBおよびtacプロモーターからそれぞれフラグメントCを発現する)が、構築されている。これらの株は、経口免疫後のTTでのチャレンジに対して防御を誘導することが示された。しかし、完全な防御を確実にするために、2用量のtacに基づく株が必要とされたのに対し、たった1用量の、nirBプロモーターを使用してフラグメントCを発現する株のみが、必要とされた。従って、nirB構築物は、tac構築物よりもインビボにおいてより持続的でありそして安定であることが、証明された(Chatfieldら、Biotechnology,10:888(1992b))。
【0119】
(3.pcDNA3/tetCの構築)
プラスミドpcDNA3/tetCの構築および特徴付けを、Andersonら、前出(これは、その全体が本明細書中で参考として援用されている)によって記載されているように行った(図5を参照のこと)。
【0120】
(4.pcDNA3/tetCまたはpTETnir15を保有しているS.typhi CVD915での免疫)
上記に議論するように、研究を、外来抗原(例えば、TTのフラグメントC)をコードする原核生物および真核生物発現ベクターを哺乳動物の免疫系に送達し、そして防御免疫応答を誘導する、S.typhiの弱毒化された株の能力を評価するために開始した。この系を伝統的な裸のDNA免疫と比較するために、裸のpcDNA3/tetCベクターによって誘発される応答をもまた、評価した。
【0121】
この目的のために、pcDNA3/tetCまたはpTETnir15プラスミドを、CVD915中にエレクトロポレーションした。精製されたプラスミドの構造を、アガロースゲル中でプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化産物:HindIIIおよびXbaIでのpcDNA3およびpcDNA3/tetC;ならびにEcoRIおよびBamHIでのpTETnir15を分離することによって確認した。フラグメントCの発現を、SDS−PAGEおよびイムノブロッティングによって確認した。細菌サンプルを、定常期まで増殖させ、そして1.0mlのアリコートを遠心分離によって回収し、200μlのSDS−サンプル緩衝液中に再懸濁した。次いで、これらのサンプルを、SDS−PAGEおよびウェスタンブロッティングに供した。抗プラグメントC mAbおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスを、一次および二次抗体としてそれぞれ使用した。各サンプルを、およそ1.0×108のcfu/ウェルでロードした。
【0122】
両プラスミドを保有している生きたベクター(living vector)(CVD915)(CVD 915(pcDNA3/tetC)およびCVD915(pTETnirB))については鼻腔内経路を使用し、そして裸のDNA免疫(pcDNA3/tetC)については筋肉内経路を使用した。Balb/cマウスを、以下の表4に示すプロトコールに従って免疫した:
【0123】
【表4】
【0124】
(5.抗体応答)
動物を、以下のスケジュールに従って眼窩の後ろの静脈から採血した:
(a)免疫前
(b)免疫の14日後
免疫の36日後
(c)追加免疫の14日後
追加免疫の28日後
追加免疫の42日後
追加免疫の56日後(屠殺)
全てのIgG抗フラグメントC血清抗体を、ELISAによって測定した。簡潔には、組換えフラグメントCを、4.0μg/mlの抗原でELISAプレートをコーティングするために使用した。血清を、8個の2倍希釈物中で滴定した。抗体レベルを、予め較正した標準血清との比較によって、国際単位(International Units)で示した。標準血清を、隔週の間隔で4回の吸着させた破傷風トキソイドを用いてマウスを免疫することによって調製した。血清をプールし、そして欧州薬局方(European Pharmacopoeia)に記載されている手順に従う、マウスにおけるインビボでの中和試験によって滴定した。国際的な中和単位の数を、破傷風抗毒素(Tetanus Antitoxin)の国際標準(International Standard)と並行して決定した。結果を図6に示す。
【0125】
図6に示すように、わずかにより高いレベルの抗体が、CVD 915(pcDNA3/tetC)構築物によって誘発されるようであるが、非常に高いレベルの抗フラグメントC血清抗体(ヒトにおいては1,000から2,000倍の防御抗TT抗体レベル)が、CVD 915(pTETnir15)またはCVD 915(pcDNA3/tetC)構築物の両方を用いる免疫および1回の追加免疫後に観察された。20IU/mlまでの観察された抗フラグメントC血清抗体レベルは、約1:50,000の最終希釈力価に対応した。対照的に、比較的に中程度のレベルの抗フラグメントC血清抗体(ヒトにおいては約50倍の防御抗TTレベル)が、裸のpcDNA3/tetCで免疫したマウスにおいて観察された。抗フラグメントC血清抗体レベルは、初回免疫の50日後に最高のレベルに到達し、そして初回免疫の92日後(研究の最終時点)まで同じレベルで維持された。CVD 915のみで免疫したマウスにおいては、応答は観察されなかった。
【0126】
(6.細胞によって媒介される免疫応答:増殖アッセイ)
免疫の92日後に、単細胞懸濁物のプールを、上記の群のそれぞれにおいて生存している5から7匹のマウスからの、頚部のリンパ節、腸間膜のリンパ節、および脾臓から調製した。細胞のプールをもまた、裸のpcDNA3/tetCを用いて筋肉内で免疫したマウスから得た鼠径部のリンパ節から調製した。以下の平均の細胞収量を得た:
頚部のリンパ節:6.6×106細胞/マウス
腸間膜のリンパ節:10.1×106細胞/マウス
鼠径部のリンパ節:1.6×106細胞/マウス
脾臓:52.5×106細胞/マウス
増殖アッセイを、完全なRPMI培地(10%(v/v)のウシの胎児の血清、グルタミン、および抗生物質を含有するRPMI)中に細胞を再懸濁することによって行い、そして抗原の非存在下または非存在下で96ウェルの丸底プレート中に三連で、2.0×105細胞/ウェルでインキュベートした。以下の可溶性の抗原を、これらの研究において使用した:0.02、0.2、および2.0μg/mlでの、ウシ血清アルブミン(BSA)、TTのフラグメントC、および高度に精製されたS.typhiの鞭毛。37℃にて5%のCO2での5日間のインキュベーション後、培養物を3H−チミジンでパルスし、そして培養を、自動的に回収することによって18時間後に停止させた。チミジンの取りこみを、液体シンチレーションカウンティングによって決定した。図7および図8に示す結果を、刺激指数(S.I.)として表す。
【0127】
図7に示すように、CVD 915(pTETnir15)およびCVD 915(pcDNA3/tetC)構築物、ならびにpcDNA3/tetC裸のDNAワクチンを用いる免疫は、TTのフラグメントCに応答して増殖した、感作されたリンパ球様細胞の出現を誘発した。これらの増殖応答は、頚部のリンパ節および脾臓から単離した細胞の集団において観察されたが、腸間膜のリンパ節から単離したものにおいては観察されなかった。特異的な増殖応答がまた、TTに対して観察された。TTのフラグメントCに対する有意な増殖応答(>3 S.I.)は、CVD 915またはPBSを用いて免疫したマウスから単離した細胞中では観察されなかった。
【0128】
図8に示すように、S.typhiの鞭毛に対する増殖応答は、CVD 915構築物、CVD 915(pTETnir15)構築物およびCVD 915(pcDNA3/tetC)構築物で免疫したマウスから単離した細胞の集団において観察された。また、図8に示すように、これらの応答は、CVD 915で免疫したマウスから単離された全ての集団において、ならびにCVD 915(pTETnir15)構築物およびCVD 915(pcDNA3/tetC)構築物で免疫したマウスに由来する頚部のリンパ節から単離したリンパ球様細胞において観察された。相当により低い増殖応答がまた、CVD 915(pTETnir15)構築物およびCVD 915(pcDNA3/tetC)構築物で免疫したマウスから単離した脾臓細胞および腸間膜のリンパ節の細胞において観察された。技術的困難性に起因して、pcDNA3/tetCの裸のDNAワクチンで免疫したマウスの、S.typhiの鞭毛に対する増殖応答についてのデータは利用可能でない。興味深いことに、裸のpcDNA3/tetCで筋肉内免疫したマウスに由来する鼠径部のリンパ節から単離された細胞は、試験した抗原のいずれに対しても、特異的な増殖応答を示さなかった。試験したいずれの群においても、BSAに対する増殖応答は観察されなかった。
【0129】
(7.CVD 915およびCVD908−htrAでの鼻腔内免疫によって誘導される、血清IgG抗Salmonella LPSと血清IgG抗S.typhiの鞭毛との比較)
新規候補のワクチンベクターの評価の間に取り組む1つの重要な課題は、それについてすでに大量のデータが入手可能であるリーディング候補(例えば、CVD908−htrA)のものに対して、新規の構築物(例えば、CVD 915)によって誘発される免疫応答を比較することである。この目的に関して、10匹のBalb/Cマウスの群を、弱毒化されているCVD 915株またはCVD908−htrA株のいずれかの1010cfuを用いて、36日の間隔を空けて2回鼻腔内免疫した。マウスを、免疫前(0日)、および35日目、55日目、および95日目(CVD 915のみ)で採血した。LPSおよび鞭毛抗原に対する抗体を、Tacketら(1977)(前出)に記載されているように、ELISAによって決定した。簡潔には、ELISAプレートを5.0μgの各抗原でコーティングし、血清サンプルを8個の2倍希釈物中で試験した。抗体力価を、492nmで0.5の吸光度値を生じる希釈の逆数として定義された、ELISA単位/mlで示した。結果を、図9および図10に示す。
【0130】
図9および図10に示すように、同様の抗Salmonellaの鞭毛および抗Salmonella LPS抗体レベルが、それぞれ、両方の動物の群において誘発された。
【0131】
(実施例5)
(Vi抗原を構成的に発現する弱毒化されたS.typhi株の構築)
(A.Vi抗原を構成的に発現するS.typhi株(CVD 916およびCVD 909)の構築)
Vi抗原の発現を、浸透圧による調節から構成的に変更するために、vipRのプロモーターに注目した(図1A)。vipR、およびompR−envZの産物は、vipRの上流の領域に結合することによってそれらの調節作用を行うと考えられている(Hashimotoら、(1996)、前出)。これを行うために、本発明においては、強力なプロモーター(例えば、Ptac)でvipRのプロモーターを置換することによって、vipRの下方調節および続くVi抗原の発現における制御を排除することを仮定した。プロモーターPtacは、これらの生物体がlaqIを欠いているので、Salmonella spp.において構成的である。従って、CVD 915およびCVD 908−htrAの構成的にVi抗原を発現する誘導体を、以下の様式で構築した。
【0132】
第1期においては、vipR中に欠失を導入し、そして並行して、選択/カウンター選択マーカー(すなわち、sacB−neoカセット)で、vipRのプロモーター領域を置換した(図1A)。
【0133】
詳細には、vipRの−35プロモーター領域のすぐ上流の601bpのセグメントを、以下のプライマーを使用して野生型S.typhi Ty2株のゲノムDNAから増幅した:
【0134】
【化3】
【0135】
この最初の601bpの増幅したセグメント(セグメントA)を、pGEM−Tベクターシステムキット(Promega,Madison,WI)を使用してクローン化して、pGEM−T::フラグメントAを得た。このシステムは、挿入部位に3’−T突出を有する開いたプラスミド(pGEM−T)を含む。これは、PCR産物の連結効率を改善する。次いで、pGEM−T::セグメントAを、SstIおよびBamHIで消化し、そしてpBS::Ptac(このプラスミドを、pBluescript(Stratagene)のBamHI−EcoRI部位中にプロモーターPtacをクローニングすることによって得た)中のPtacのすぐ上流のSstI部位およびBamHI部位にクローニングして、pBS::セグメントA−Ptacを得た。
【0136】
並行して、vipRの770bpのセグメント(vipRの開始コドンを含む)(セグメントB)を、以下のプライマーを使用して同じTy2株のゲノムDNAから増幅した:
【0137】
【化4】
【0138】
これらのプライマーを用いて、特有の制限部位SstI、EcoRI、BamHI、およびSmaIをクローニングの目的のために導入した(下線)。増幅したセグメントBを、pGEM−Tベクターシステムキットを使用してpGEM−T中に最初にクローン化して、pGEM−T::セグメントBを得た。次いで、このプラスミドを、EcoRVおよびSalIで消化し、そして得られたフラグメントを、Ptacのすぐ下流である、pBS::セグメントA−PtacのEcoRVおよびSalI部位にクローン化した。得られたプラスミド(pBS::Ptac−vipRと呼ぶ)は、セグメントA−Ptac−セグメントBを含み、そしてvipRプロモーターの−35、−10、およびリボソーム結合領域を含む167bpの欠失を有する。しかし、pBS::Ptac−vipRの構築においては、vipRプロモーターの欠失は、tacプロモーターの−35、−10、およびリボソーム結合領域を含有する257bpの挿入物で効率よく置きかえられた。
【0139】
並行して、他のカセットを、上記のセグメントAとセグメントBとの間へのsacB−neoの挿入によって構築した。最初に、フラグメントAおよびフラグメントBを、Noriegaら(1996)(前出)によって記載されるように、鋳型として両方のフラグメント、ならびにプライマーとしてオリゴヌクレオチド配列番号7および配列番号10を使用してPCRによって融合させた。得られた増幅されたフラグメントA−フラグメントB融合体を、pGEM−Tベクターシステムキットを使用してpGEM−T中にクローン化して、pGEM−T::フラグメントA−フラグメントBを得た。次いで、sacB−neoを、pIB729のSmaI消化によって得(Blomfieldら、前出)、そしてpGEM−T::セグメントA−セグメントBのSmaI部位に挿入した。得られたプラスミドを、pGEM−T::vipR::sacB−neoと命名した。このプラスミドをSstIで消化し、これによってvipR::sacB−neo対立遺伝子を効率よく取りだし、次いでこれを、自殺ベクターpJG14のSstI部位にクローン化してpJG14:vipR:sacB−neoを得た。pJG14は、温度感受性であり、pSC101の複製起点によって誘導されるクロラムフェニコールによって選択される自殺プラスミド(Galenら、96th General Meeting、American Society for Microbiology,Abstract,529−H260頁(1996))。さらに、SstIで消化したvipR::sacB−neo対立遺伝子を、自殺ベクターpKTN701(Honeら、(1991)、前出)のSstI部位にクローン化して、pKT::vipR::sacB−neoを得た。S.typhi CDV 915株を、pJG14::vipR::sacB−neoでエレクトロポレーションした。並行して、S.typhi CVD908−htrA株をpKT::vipR::sacB−neoでエレクトロポレーションした。相同組換えを、カナマイシン耐性のクロラムフェニコール感受性クローンの単離によって増強された二重交差変異株の選択が増強されたことを除いて、Noriegaら(1996)(前出)によって記載されている手順を使用して、pJG14::vipR::sacB−neoとS.typhi CVD 915中のvipR遺伝子との間で;そしてHoneら(1991)(前出)によって記載されている手順を使用して、pKT::vipR::sacB−neoとS.typhi CVD 908−htrA中のvipR遺伝子との間で行った。得られたS.typhi CVD 915誘導体株およびCVD 908−htrA誘導体株は、vipR対立遺伝子中での挿入/欠失に起因して、Vi抗原を発現しなかった。
【0140】
第2期においては、構成的なPtacプロモーターで、上記のS.typhi CVD 915誘導体株およびS.typhi CVD 908−htrA誘導体株のvipR遺伝子座におけるsacB−neo挿入物を置換した(図1B)。詳細には、pBS::Ptac−vipR中のPtac−vipRセグメントを、pJG14のBamHI−EcoRI部位中にクローン化して、pJG14::Ptac−vipRを得た。プラスミドpJG14::Ptac−vipRを、次いで、CVD 915誘導体株およびCVD 908−htrA誘導体株中のsacB−neoをPtacで、上記に記載するような相同組換えによって交換するために使用した。二重交差変異株の単離を、sacBによって付与されたスクロースに対する毒性、およびカナマイシン感受性に対する回復によって提供されるカウンター選択によって増強した。CVD 915から誘導された得られた株を、CVD 916と命名した。これを、ATCC番号202116の下で、1998年5月4日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。CVD908−htrAから誘導された得られた株を、CVD909と命名した。これを、ATCC番号202117の下で、1998年5月4日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。遺伝子型的には、両方の株におけるPtacの挿入を、PCRによって特徴付けた。このことは、適切な部位でのPtacの挿入を実証する。
【0141】
(B.CVD916株およびCVD 909株によるVi抗原の構成的な発現)
表現型的に構成的な、Vi抗原の発現を、市販の抗Vi抗血清(Difco)を使用して、種々の容量オスモル濃度で増殖させた細菌の凝集によって評価した。結果を以下の表5に示す。
【0142】
【表5】
【0143】
上記の表5に示すように、野生型のS.typhi Ty2株、ならびに弱毒化されたCVD 915株およびCVD 908−htrA株においては、Vi抗原の発現は、培地の容量オスモル濃度(NaCl濃度によって提供される)に高度に依存する。対照的に、CVD 916株およびCVD 909株中でのVi抗原の発現は強力で、構成的であり、そして容量オスモル濃度における変化によっては調節されない。
【0144】
(実施例6)
(構成的に発現されたVi抗原に対する免疫応答)
10匹の6週齢のBalb/cマウスの群を、CVD 915株またはCVD 916株のいずれかの1.0×1010cfuを用いて鼻腔内免疫した。マウスを、それらの免疫前および免疫の30日後に採血し、そしてそれらの血清を、使用するまで−20℃で保存した。S.typhi LPS、H(鞭毛)、およびVi抗原に対する血清中に存在する抗体を、Tacketら(1997)(前出)に記載されているようにELISAによって決定した。結果を以下の表6に示す。
【0145】
【表6】
【0146】
上記の表6に示すように、CVD 916株での免疫は、CVD 915株を用いて得られたものよりも有意に高い、Vi抗原に対する抗体レベルを誘発した。他のS.typhi抗原(LPSおよびH)に対する免疫応答は、両方の免疫した群の間では同様であった。結果は、Vi抗原の構成的な発現が、他の体細胞のS.typhi抗原に対する免疫応答を妨害することなく、この抗原に対する免疫応答を増強することを実証する。
【0147】
本発明は、詳細に、そしてその特定の実施態様を参照して記載されているが、種々の変更および改変が、その精神および範囲を逸脱することなくその中で行われ得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1Aは、viaBオペロンを示し、そしてsacB−Neoカセットによる、viaBオペロン中のvipRの野生型の浸透圧によって調節されるプロモーターの交換を概略的に示す。
【図1B】 図1Bは、viaBオペロンを示し、そしてVi抗原を構成的な発現を行うための、強力な構成的なプロモーターであるPtacによる、sacB−Neoカセット挿入物の交換を示す。
【図2】 図2は、プリンの新たな生合成経路、および芳香族代謝経路の寄与を示す。図2においては、途中で切れている矢印は経路を示す。ここで、個々の工程は示されない。酵素はそれらの遺伝子によって示される。上付き文字は、その反応に関与する遺伝子の変異を有する選択された株を示す。示される株は以下のとおりである:a:purF1741::Tn10 S.dublin SL5437(McFarlandら、前出);b:purG876::Tn10 S.dublin SL5436(McFarlandら、前出);c:purC882::Tn10 S.dublin SL5435(McFarlandら、前出);d:purH887::Tn10 S.dublin SL2975(McFarlandら、前出);e:ΔguaB−A S.flexneri 2a CVD 1204およびΔguaB−A、ΔvirG S.flexneri 2a CVD 1205(Noriegaら、Infect.Immun.,64:3055−3061(1996))およびΔguaB−A Salmonella typhi CVD 915(本発明);f:aroD25::Tn10 S.flexneri Y SFL114(Lindbergら、(1990)、前出)SFL124(Liら、前出)、S.flexneri 2a 1070(Karnellら、(1995)、前出);g:ΔaroC、ΔaroD S.typhi CVD908(Honeら(1991)、前出);h:hisG46 DEL407、aroA554::Tn10 S.typhimurium SL3261(Hoisethら、前出);i:ΔaroA S.flexneri 2a CVD 1201およびΔaroA、ΔvirG CVD 1203(Noriegaら、Infect.Immun.,62:5168−5172(1995);ならびにj:ΔaroA、ΔhisG、ΔpurA S.typhi 541Ty(Levineら、(1987b)、前出)。図2においては、略号を以下のように定義する:PRPP:5−ホスホリボシル−β−1−ピロホスフェート;PRA:5−ホスホリボシルアミン;GAR:5’−ホスホリボシル−1−グリシンアミド;FGAR:5’−ホスホリボシル−N−ホルミルグリシンアミド;FGAM:5’−ホスホリボシル−N−ホルミルグリシンアミジン;AIR:5’−ホスホリボシル−5−アミノイミダゾール;CAIR:5’−ホスホリボシル−5−アミノイミダゾール−4−カルボン酸;SAICAR:5’−ホスホリボシル−4−(N−スクシノカルボキサミド)−5−アミノイミダゾール;AICAR:5’−ホスホリボシル−4−カルボキサミド−5−アミノイミダゾール;FAICAR:5’−ホスホリボシル−4−カルボキサミド−5−ホルムアミドイミダゾール;IMP:イノシン酸;Hx:ヒポキサンチン;G:グアニン;およびA:アデニン。
【図3】 図3A〜3Gは、Escherichia coliのguaA遺伝子およびguaB遺伝子をコードするDNA配列を示す(配列番号1)(GenBank登録番号第M10101−M10102)(Thomasら、Gene、36:45−53(1985);Tiedemanら、J.Biol.Chem.,260:8676−8679(1985);およびTiedemanら、Nucleic Acids Res.、13:1303−1316(1985))。これは、Salmonella spp.のguaAおよびguaBと高度に相同であると考えられ、そしていくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位が、本発明の欠失変異株を作成することにおいて有用である。
【図4】 図4は、guaB−Aオペロンの方向、および本発明の欠失変異株を作成することにおいて有用であるいくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位の位置;PCRによって増幅されたguaB−Aオペロンのセグメント;そしてΔguaB−A対立遺伝子を構成するguaB−AオペロンセグメントのPCRによる融合を模式的に示す。また、ΔguaB−A対立遺伝子の中央部のアルセナイトオペロン(ars)のクローニングが示され、これによってΔguaB−A::Ptac−arsカセットが得られる。この欠失カセットは続いて、自殺プラスミド中にクローン化され、そしてS.typhi Ty2株中の野生型のguaB−A対立遺伝子を交換し、ΔguaB−A S.typhi CVD915株を得た。
【図5】 図5は、pcDNA3/tetC(ヒトのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下の破傷風毒素フラグメントCをコードするDNAワクチン)の構築の模式図である。
【図6】 図6は、破傷風毒素のフラグメントCを発現するか、または破傷風毒素のフラグメントCをコードする真核生物発現カセットを保有している、ΔguaB−A CVD915株での鼻腔内免疫後の、マウス中での抗フラグメントC抗体応答を示す。
【図7】 図7は、ΔguaB−A CVD915株のみでの、またはベクターとして、破傷風毒素のフラグメントCを発現するかもしくは破傷風毒素のフラグメントCをコードする真核生物発現カセットを保有しているΔguaB−A CVD915株での、鼻腔内免疫後の、破傷風毒素のフラグメントCに対するマウスのリンパ球増殖応答を示す。
【図8】 図8は、ΔguaB−A CVD915株のみでの、またはベクターとして、破傷風毒素のフラグメントCを発現するかもしくは破傷風毒素のフラグメントCをコードする真核生物発現カセットを保有しているΔguaB−A CVD915株での、鼻腔内免疫後の、S.typhiの鞭毛に対するマウスのリンパ球増殖応答を示す。
【図9】 図9は、ΔguaB−A S.typhi CVD915株、またはΔaroC、ΔaroD、ΔhtrA S.typhi CDV908−htrA株での鼻腔内免疫後の、マウスにおける抗S.typhi鞭毛抗体応答を示す。
【図10】 図10は、ΔguaB−A S.typhi CVD915株、またはΔaroC、ΔaroD、ΔhtrA S.typhi CDV908−htrA株での鼻腔内免疫後の、マウスにおける抗S.typhi LPS抗体応答を示す。
Claims (23)
- 弱毒化されたSalmonella変異株であって、ここで、該変異株は、Vi抗原を構成的に発現し、そしてここで該変異株において、vipRプロモーターは、viaBの構成的な発現を生じるように、構成的なプロモーターによって置きかえられている、弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記変異株が、Salmonella typhi変異株である、請求項1に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記変異株において、vipRプロモーターが、viaBの構成的な発現を生じるように、Ptac、Ptrc、POlac、およびPlppからなる群より選択されるプロモーターによって置きかえられている、請求項1または請求項2に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記変異株が、guaB−Aオペロン中での変異に起因して、新たなグアニンヌクレオチドを形成することができない、請求項1または請求項2に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記guaB−Aオペロン中の変異が欠失変異であり、そして該欠失変異がguaA遺伝子中、guaB遺伝子中、またはguaA遺伝子およびguaB遺伝子の両方中に存在する、請求項4に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記欠失変異が、guaA遺伝子およびguaB遺伝子の両方中に存在する、請求項5に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記変異株が、aro-表現型を有する、請求項6に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記Salmonella typhi変異株が、親のSalmonella typhi CVD915株(ATCC番号202115)に由来する、請求項2に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記Salmonella変異株が、Salmonella
CVD916株(ATCC番号202116)であるか、またはSalmonella typhi CVD909(ATCC番号202117)である、請求項1に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。 - 前記変異株が、外来抗原をコードし、そして発現する、請求項1に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 前記変異株が外来抗原をコードし、そして真核生物細胞中で発現するプラスミドを含有する、請求項1に記載の弱毒化されたSalmonella変異株。
- 以下を含有する、腸チフスに対するワクチン:
(A)薬学的有効量の弱毒化されたSalmonella typhi変異株であって、ここで、該変異株は、Vi抗原を構成的に発現し、そしてここで該変異株において、vipRプロモーターは、viaBの構成的な発現を生じるように、構成的なプロモーターによって置きかえられている;および
(B)薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。 - 前記変異株において、viaBの構成的な発現を生じるように、vipRプロモーターが、Ptac、Ptrc、POlac、およびPlppからなる群より選択されるプロモーターによって置きかえられている、請求項12に記載のワクチン。
- 前記変異株が、guaB−Aオペロン中での変異に起因して、新たなグアニンヌクレオチドを形成することができない、請求項12または請求項13に記載のワクチン。
- 前記guaB−Aオペロン中の変異が欠失変異であり、そして該欠失変異がguaA遺伝子中、guaB遺伝子中、またはguaA遺伝子およびguaB遺伝子の両方中に存在する、請求項14に記載のワクチン。
- 前記欠失変異が、guaA遺伝子およびguaB遺伝子の両方中に存在する、請求項15に記載のワクチン。
- 前記変異株が、aro-表現型を有する、請求項16に記載のワクチン。
- 前記Salmonella typhi変異株が、親のSalmonella typhi CVD915株(ATCC番号202115)に由来する、請求項12に記載のワクチン。
- 前記Salmonella typhi変異株が、Salmonella typhi CVD916株(ATCC番号202116)であるか、またはSalmonella typhi CVD909(ATCC番号202117)である、請求項12に記載のワクチン。
- 前記変異株が、外来抗原をコードし、そして発現する、請求項12に記載のワクチン。
- 前記変異株が外来抗原をコードし、そして真核生物細胞中で発現するプラスミドを含有する、請求項12に記載のワクチン。
- 前記薬学的有効量が、102cfuから1010cfuまでである、請求項12に記載のワクチン。
- 前記薬学的有効量が、106cfuから109cfuまでである、請求項22に記載のワクチン。
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ES2492468T3 (es) | 2007-01-25 | 2014-09-09 | Actogenix N.V. | Tratamiento de enfermedad inmunitaria por administración a través de la mucosa de antígenos usando Lactobacillus genéticamente modificado |
US20110020399A1 (en) * | 2007-04-16 | 2011-01-27 | University Of Maryland, Baltimore | Vaccines and Immunomodulatory Therapies for Tularemia |
EP2214840B1 (en) * | 2007-10-30 | 2015-05-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium |
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WO2010141143A2 (en) * | 2009-04-21 | 2010-12-09 | Vivocure, Inc. | Engineered avirulent bacteria strains and use in medical treatments |
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