DK175512B1 - Avirulente mikrober og anvendelser derfor - Google Patents

Description

DK 175512 B1 I

I Den foreliggende opfindelse angår avirulente mikrober, frem- I

I gangsmåde til fremstilling deraf samt deres anvendelse i vac- I

I ciner. I

I 5 Tidligere anvendte vacciner mod infektiøse sygdomme har gene- I

I relt omfattet (I) specifikke bestanddele, som er oprenset ud I

I fra de ætiologiske midler omfattende intakte antigener, frag- I

I menter deraf eller syntetiske analoger af naturligt forekom- I

I mende antigener eller epitoper, (II) antiidiotype antistoffer, I

I 10 (III) det hele aflivede ætiologiske middel, eller (IV) et avi- I

I rulent derivat af det ætiologiske middel som en levende vacci- I

I ne. Adskillige typer af disse vacciner eksisterer, hvoraf de I

I følgende er udvalgte eksempler: I

I 15 I US patentskrift nr. 4.250.262 beskrives fremgangsmåder til I

I udvinding af enzymet glucosyltransferase ud fra Streptococcus I

I mutans og anvendelsen af dette oprensede enzym ved lokal immu- I

I nisering over for dental caries, en type I vaccine. Detaljer I

I med hensyn til dyrkning af bakterierne, oprensning af enzymet I

I 20 og anvendelse af enzymet til stimulering af IgA-antistoffet i I

I saliva er vist for serotype a, c eller g af S. mutans. Andre I

I eksempler på vacciner fra oprensede specifikke bestanddele af I

I bakterier kan ses i US patentskrifterne nr. 4.203.971 og nr. I

I 3.239.749, hvori der beskrives en vaccine, som er egnet over I 25 for infektion af Neisseria gonnorrhoeae, som består af et gly- I coprotein fra gonokokkers ydre overtræksmateriale. Injektion I af glycoproteinet stimulerer et baktericidt antistof.

I Anvendelsen af døde S. mutans-celler til immunisering over for

I 30 tandcaries via administration i munden, som er beskrevet i US

I patentskrift nr. 3.931.398, er et eksempel på en type III-vac- I cine. Opfinderne fandt, at immunoglobulin A-antistoffer (IgA) I var de antistoffer, som blev produceret og at de resulterede i I et fald i plaquedannelse.

I 35 I En levende bakteriel vaccine (type IV), som indeholder udvalg-

I te stammer af Escherichia col i-bakterier, er beskrevet i US

I patentskrift nr. 3.975.517. Bakterierne blev behandlet med I DK 175512 B1

I I

fortyndet formalin for at svække eller delvis inaktivere dem I

I før injektion i en sos brystkirtel. Derved fremstillet anti- I

I stof blev senere fundet i mælken og beskyttede nyfødte svin I

I mod E. coli - i nfektioner. Formalinbehandlingen, som forårsagede I

I 5 E. coli-inaktiveringen var kun en midlertidig svækkelse af I

I bakterierne, og der måtte drages omsorg for at forhindre bak- I

I teriel restitution før injektion. En sådan restitution ville I

I have resulteret i alvorlig infektion snarere end beskyttelse. I

10 Det har været muligt at udvikle avirulente stammer ved intro- I

I duktionen af mutationer i stammerne, hvilket resulterede i, at I

I stammerne i alt væsentligt blev ude af stand til at overleve I

I hos en vært. Disse stammer kan siges at være genetisk svække- I

I de. For at lette beskrivelsen vil principperne ved genetisk I

I 15 svækkelse blive illustreret med henvisning til Salmonella-sy- I

I stemet, imidlertid er principperne bredt anvendelige, som det I

I vil blive diskuteret nedenfor. I

Salmonella typhimurium, S. typhi og andre Salmonella-arter med I

20 invaderende egenskaber trænger ind i dybt væv efter oral ind- I

tagelse ved at binde sig til, invadere og formere sig i cel- I

lerne i det tarm-associerede lymfoide væv (GALT; Peyerske pla- I

ques) (Carter and Collins, J. Exp. Med. 139: 1189-1203, I

(1974)). Da Salmonella-formidlet levering af et antigen til I

25 GALT fremkalder en generaliseret sekretionsimmunreaktion såvel I

som humorale og cellulære immunreaktioner, er det sandsynligt I

at avirulente Salmonella-mutanter, som har mistet evnen til at I

forårsage sygdom uden forringelse af deres evne til at forbin- I

de sig til og invadere GALT kan tjene som effektive vektorer I

30 til at levere fremmede antigener, såsom koloniseringsantigener I

eller virulensantigener til GALT og til at inducere beskytten- I

de immunitet over for det patogen, hvorfra sådanne antigener I

var afledt. Konstruktionen af avirulente Sa1 monel!a-vaccine- I

stammer, som udtrykker antigener fra andre mikroorganismer, er I

35 blevet gennemført via klassiske genoverførselsprocedurer (For- I

mal et al., Infect. Immun. 34: 746-750 (1981)) såvel som ved I

anvendelse af rekombinant DNA-teknologi. I det sidstnævnte I

tilfælde er avirulente Salmonella-stammer blevet konstrueret I

DK 175512 B1 I

I 3 I

I udtrykkende gener fra organismer, som normalt udveksler gene- I

I tisk information med Salmonella (Stevenson and Manning, FEMS I

I Microbiol. Lett. 38:317-321 (1985); Clements et al., Infect. I

I Imm. 53:885-692 (1986)), såvel som fra mikroorganismer, som er I

I 5 ude af stand til at overføre genetisk information til Salmo- I

I nella via klassiske gentransmissionsmetoder (Curtiss, J. Dent. I

I Res. 65:1039-1045 (1986)). Sådanne bivalente avirulente Salmo- I

I nel 1a-stammer har været vist at fremkalde antistoffer og i et I

I tilfælde en cellulær immunreaktion (Brown et al., J. Infect. I

I 10 Dis. 155-.86-92 (1987)) over for det udtrykte antigen, men data I

I vedrørende fremkaldelse af beskyttende immunitet over for pa- I

I togenet, som leverer koloniseringsantigenet eller virulensan- I

I tigenet er stadigt knapt. I

I 15 Bacon et al. (Brit. J Exp. Pathol. 32:85-96, (1951)) var først I

I til at undersøge avirulensen af auxotrofe mutanter af S. I

I typhi. De bemærkede, at mutanter med behov for puriner, p-arai- I

I nobenzoesyre og aspartat havde reduceret virulens for mus. I

I Germanier og Furer, (Infect. Immun. 4:663-673, (1971)) under- I

I 20 søgte først anvendelse af ga1E-mutanter af S. typhimurim for I

I avirulens og immunogenicitet hos mus og foreslog derefter an- I

I vendelse af S. typhi galE-mutant Ty21a som en vaccine over for I typhoid feber hos mennesker (J. Infect. Dis. 131:553-558 I (1975)). Stocker (US patentskrift nr. 4,550.081) anvendte I 25 transposonmutagenese med TnlO efterfulgt af udvælgelse for fu- I sarsyreres i stens, som fører til deletionelt tab af TnlO og nærliggende DNA-sekvenser til opnåelse af deletionsmutationer, som er ude af stand til at vende tilbage, et problem som sås I hos de mutanter, som blev anvendt af Bacon et al. Stocker iso- 30 lerede indledningsvis aroA-de1 et ion(A)-mutanter, som var svæk- I kede med hensyn til evnen til at syntetisere forbindelserne I fra den aromatiske aminosyrefami 1ie omfattende p-amino-benzoe- syre, som er nødvendig for folatbiosyntese og dihydroxybenzoe- I syre, et forstadie for enterochelin, og kombinerede senere I 35 AaroA-mutationen med en deletionsmutation, som ophæver adenin- I biosyntese. TnlO-inducerede og fusarsyreresistens-genererede I Aasd-mutationer, som pålægger et behov for diaminopimelinsyre I har været anvendt til at gøre $. typhimurium avirulent uden at I DK 175512 B1

forringe dens evne til at inducere en generaliseret sekreti- I

onsimmunreaktion. Oa mange Salmonella indeholder et plasmid, I

som bidrager til virulens, har plasmid-helbredte derivater I

været undersøgt og foreslået til anvendelse som levende vac- I

I 5 ciner (Nakamura et al., Infect. Immun. 50:586-587 (1985)). I

Selvom hvert af de ovenfor beskrevne midler til at gøre Salmo- I

nella avirulent uden at svække immunogeniciteten giver fordele I

I giver hvert problemer, galE-mutanter er vanskelige at dyrke I

I 10 under bevarelse af immunogenicitet, da de er ga1actosesensiti - I

ve, men skal dyrkes i nærværelse af galactose for at fremstil- I

le normalt LPS, hvilket imidlertid selektivt fører til galac- I

toseresistente varianter, som er ikke-immunogene. Selvom I

AaroA-mutanter ophæver syntesen af både enterochelin og folin- I

15 syre, er nødvendigheden af enterochelin for S. typhimurium- I

I virulens blevet draget i tvivl af de omfattende resultater fra I

I Benjamin et al. (Infect. Immun. 50:392-397 (1985)), som viser I

I at enhver og alle mutationer, som griber forstyrrende ind i S. I

I typhimuriums evne til at chelatere og transportere jern er I

I 20 uden signifikant virkning på virulens. Derfor skyldes aviru- I

I lensen af AaroA-mutanter mest sandsynligt udelukkende den I

I manglende evne til at syntetisere p-aminobenzoesyre (pABA) og I

derfor folinsyre. Då Bacon et al. (supra) iagttog, at admini- I

I stration af p-aminobenzoesyre i diæten til mus, som var infi- I

25 ceret med mutanter, der var ude af stand til at syntetisere I

I pABA, førte til viIdtypeniveauer af virulens, må man være be- I

I kymret for phenotyp avirulensomslag hos vaccinestammer på I

I grund af diætindtagelse af metabolitter, hvis syntese er bio- I

I keret hos de avirulente mutanter. Aasd-mutanter, selvom de I

30 ikke har nogen af disse andre problemer, dør hurtigt efter I

I oral indtagelse og invasion af GALT og er således kun effek- I

I tive til at fremkalde en generaliseret mucosal immunitet og er I

I ikke effektive til at fremkalde humoral og cellulær immunitet. I

I 35 I

I 5 DK 175512 B1

I I WO-A-8603123 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af ikke-reverterende I

I levende Salmonella-vaccine. Denne fremgangsmåde omfatter transducering af celler ved I

I en immunreaktion, hvilket frembringer stammer således, at genomet deraf er ude af stand I

I til at udtrykke metabolitter, som normalt ikke er til stede i værten. De resulterende I

I 5 mutationer kan ikke repareres ved et enkelt trin, såsom ved polynukleotidtilføjelse eller I

I -inversion. Mutanten med disse metalioner har reduceret virulens, men bibeholder den I

I ønskede immunogenicitet. I

I Agricultural and Biological Chemistry, bind 48, nr. 8, 1984, side 2129-2130, beskriver I

I en fremgangsmåde til konstruktion af adenylat-cyclase- eller c-AMP-receptorproteinde- I

I 10 fekte mutationer af E. coli K-12 I

Den foreliggende opfindelse retter sig mod mange af ulemperne ved de kendte vacciner I

I ved anvendelse af transposon-inducerede mutanter, hvor svækkelsen, som fører til aviru- I

I lens, ikke kan genoprettes ved diæt eller ved hjælp af noget som helst, som dyreværten I

I kunne levere. Disse deletioner kunne selvsagt introduceres ved hjælp af rekombinante I 15 DNA-teknikker.

I Den foreliggende opfindelse angår en vaccine til immunisering af et hvirveldyr (verte- I brat) eller et hvirvelløst dyr (invertebrat), hvilken vaccine omfatter et avirulent derivat I af en patogen mikrobe, idet derivatet i alt væsentligt er ude af stand til at fremstille I funktionelt adenylatcyklase og cyklisk AMP-receptorprotein.

I DK 175512 B1 I 6

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også en vaccine til immuniseringen af et hvirveldyr eller hvirvelløst dyr, hvilken vaccine omfatter et avirulent derivat af en mikro- be, idet derivatet er ude af stand til at fremstille funktionelt adenylatcyklase og cyklisk AMP-receptorprotein, mens det er i stand til at udtrykke et rekombinant gen hidrørende H 5 fra et patogen for nævnte hvirveldyr eller hvirvelløse dyr til fremstilling af et antigen, som er i stand til at inducere en immunreaktion hos hvirveldyret eller det hvirvelløse dyr H over for patogenet.

Ifølge denne opfindelse anvises også en anvendelse af et avirulent derivat af en patogen I

mikrobe, idet nævnte derivat i alt væsentligt er ude af stand til at fremstille funktionel I

I 10 adenylatcyklase og cyklisk AMP-receptorprotein, til fremstilling af en vaccine til stimu- I

H lering af immunsystemet hos et hvirveldyr eller hvirvelløst dyr. I

Ifølge denne opfindelse anvises også en anvendelse af et avirulent derivat af en patogen I

mikrobe, idet derivatet i alt væsentligt er ude af stand til at fremstille funktionel adenylat- I

I cyklase og cyklisk AMP-receptorprotein, til fremstilling af en vaccine til stimulering, I

I 15 regulering eller desensibilisering af immunsystemet hos et hvirveldyr eller hvirvelløst I

I dyr. I

DK 175512 B1 I

Den foreliggende opfindelse anviser også en fremgangsmåde til I

5 fremstilling af et avirulent derivat af en patogen mikrobe, I

idet derivatet er ude af stand til at fremst i Ile funkti onelt I

adeny1atcyklase og cyklisk AMP-receptorprotein, hvilken frem- I

gangsmåde omfatter mutering af den patogene mikrobe ved hjælp I

af transposon-mutagenese til dannelse af deletionsmutationer i I

10 hver af generne for adenylatcyklase og cyklisk AMP-receptor- I

protein og isolering af derivaterne. Det samme mål kan også I

opnås ved anvendelse af rekombinante DNA-teknikker til frem- I

bringelse af deletioner i generne for adenylatcyklase og de I

cykliske AMP-receptorproteiner. I

15 I

I Fig. 1 illustrerer udvindingen af S. typhimuriura Acya Acrp I

I X4064 (0) og vildtype χ3456 (0) fra Peyerske plaques (dvs. I

I GALT) på specificerede tidspunkter efter peroral indpodning I

I med 7,4 x 10® cfu af χ4064 og 4,0 x 10® cfu af χ3456. De lod- I

I 20 rette linier viser standardafvigelserne. I

I Fig. 2 illustrerer udvindingen af S. typhimuriura Acya Acrp I

I X4064 (0^} og vildtype χ3456 (DA) fra mesenteriske lyrafe- kirtler (DD) og milt (Δ A) på specificerede tidspunkter efter 25 peroral podning med 7,4 x 10® cfu χ4064 og 4,0 x 10® cfu X3456. De lodrette linier viser standardafvigelserne.

I Fig. 3 illustrerer plasmidindholdet i bestemte S. typhimurium- I stammer. Plasmid-DNA blev ekstraheret ved hjælp af den af I 30 Birnboim beskrevne metode (Methods Enzmol. 100:243-255, 1983) I opløst i 0,5% vægt/vol. agarosegel og farvet med ethidiumbro- I mid. x3344- og χ3337-lysater blev ekstraheret med phenol/chlo- I roform/ether og ikke underkastet densitetsgradientcentrifuge- ring. Stamme (100 kb plasmid) i baner: a, χ3000(pStLTlOO); b, I 35 X33 44(-); c, X3347 (pStLTlOl); d, χ3306(pStSRIOO); e. X3337(-); I f, X3338(pStSRIOl) ; g, χ3339(pStSL100); 90 kb, 8 kb); h I X3340(90 kb, 8 kb); i, χ3351(pStSRIOl). Markørplasroider var I Rldrd (100 kb) og dimer pACYC184 (8 kb) (ikke vist).

I DK 175512 B1

Fig. 4 illustrerer restriktionsenzymfordøjelsesprofilerne af

100 kb plasmider. Plasmid-DNA blev fordøjet med Hindlll, op- I

løst i en 0,6% (vægt/vol) agarosegel og plettet med ethidium- I

bromid. Bane a indeholder fag XONA fordøjet med Hindlll. De I

5 følgende stammer (og tilsvarende plasmidindhold) er vist i ba- I

I ner: b, X3000(pStLTlOO); c, χ3306 (pStSRIOO);, d, χ3338 I

I (pStSRIOl); e, 3339(pStSLIOO, 90 kb, 8kb); og f, χ3340 (90 kb, I

8kb). I

10 Fig. 5 illustrerer det samlede CFU i (A) Peyerske plaques og I

(B) milte efter p.o.-indpodning af mus med S. typhimurium I

SR-1'1. x3306 (OD), χ3337 (OP). Geometrisk gennemsni tt stan- I

I dardafvigelse n = 2 til 7 mus. P-værdier i 1-halet Student's I

I t-test for CFU X3306 større end χ3337; a<0,0125, b<0,0005. I

I 15 I

I Fig. 6 illustrerer resultaterne af en blandet p.o.-i nfekti on I

I af mus med vildtype og 100 kb piasmid-helbredt SR-11. Geome- I

I trisk gennemsnit±SD af forhold mellem vildtype χ3456 og hel- I

I bredt x3337 udvundet fra Peyerske plaques (0), mesenteriske I

I 20 lymfekirtler (A) , og milte (Q). n = 3 til 7 mus, η » 1 for 7 I

I dage efter indpodning. P-værdier i 1-halet Student's t-test I

I for geometrisk gennemsnit af forhold større end 1: a<0,05, I

I b<0,0125, c<0,0025, d<0,0005. I

25 Miltforhold var større end Peyerske p1auqesforho 1d efter 3 da- I

I ge (P<0,0125), 4 dage (P<0,0005), og 5 dage (P<0,0025) efter I

I infektion. Mesenteriske lymfekirtelforhold var større end Pey- I

I erske plaquesforhold efter 3 dage (P<0,05) og 5 dage (P<0,005) I

I efter infektion. I

I 30 I

I Fig. 7 illustrerer CFU i musevæv efter p.o.-indpodning af mus I

I med SL1344. χ3339 (åbne symboler), χ3340 (fyldte symboler). I

I Peyerske plaques (C7,fi), mesentriske lymfekirtler (A,A), mil- I

I te (o,·). Geometrisk gennemsnit± SD, n = 2 til 7 mus. P-værdier I

I 35 i 1-halet Student's t-test for CFU χ3339 større end χ3340: I

I a <0,025, b<0,0125, c<0,0005. I 1

Den foreliggende opfindelse er baseret på den opdagelse, at I

I visse mutationer kan gøre en mikrobe avirulent uden i alt I

9 I

DK 175512 B1 I

væsentligt at påvirke dens immunogenicitet. Nærmere bestemt I

angår den foreliggende opfindelse mikrobielle vacciner, hvor I

mikroben bærer de 1 et i on-(A)-mutati onerne Acya og Acrp, som I

eliminerer evnen til at syntetisere henholdsvis adeny1atcykla- I

5 se (AJP-pyrophosphatlyase {cykl i serende) EC 4.6.1.1) og det I

cykliske AMP-receptorprotein (CRP). I

Cykl isk-315'-AMP (cAMP) og det cykliske AMP-receptorprotein er I

nødvendige for transkriptionen af et stort antal gener og ope- I

10 roner, som er impliceret i transporten og nedbrydningen af et I

stort antal katabolitter. Der er blevet tilvejebragt indika- I

tioner, som viser, at systemer, der anvendes til transport af I

brændstof/carbon-kiIder alle er under positiv kontrol af cAMP, I

hvilket også flere aminosyrepermeaser er. Udover dets meget I

15 vigtige rolle i katabolisme påvirker cAMP-koncentrationen i I

celler også 1ysogeni ser ing af tempererede fager, syntese af I

fimbriaer, syntese af flagella og syntese af i det mindste et I

ydre membranprotein. Selvom cAMP er til stede i mammale celler I

er koncentrationerne, som forekommer i makrofager og andre I

20 celler, hvori Salmonella kan invadere og forøge, sig under I

koncentrationen på 0,1 til 1,0 mM cAMP, som er nødvendig for I

at muliggøre at Acya-mutanter udviser en viIdtype-fenotype in I

vitro. Endvidere ville indbefatningen af Acrp-mutationen i alt I

I væsentligt ophæve enhver fordel, som kunne opstå ved optagelse I

I 25 af cAMP in vivo af sådanne Acya-mutanter. I

Når mikroberne først er gjort avirulente ved introduktionen af

Acya Acrp-mutationerne, kan de tjene som den immunogene be- I standdel i en vaccine til fremkaldelse af immunitet over for I 30 mikroben. Således er anvendelsen af en hvilken som helst mi- I krobe, som har generne for adenylatcyklase og cAMP-receptor- I proteiner omfattet af denne opfindelse, omfattende men ikke I begrænset til Salmonella E. coli - S. typhimurium-hybrider, I Shigella, Erwinia, Yersinia, Pasteurella, Legionella eller I 35 Brucella. Foretrukne mikrober er medlemmer af slægten Salmo- I nella, såsom S. typhimurium, S. typhi, S. paratyphi, S. galli- narum, S. enteritidis, S. choleraesui s, S. arizona eller S.

I dublin.

I DK 175512 B1 Η I en anden udførelsesform ifølge opfindeIsen kan det avirulen- te derivat af en patogen mikrobe, som der også henvises til H heri som en bærerbakterie, anvendes til at levere udvalgte antigener til GALT, f.eks. tilde Peyerske plaques i ileumet.

H 5 Nogle bakterieslægter, såsom Salmonella, kendes for at høre hjemme i de Peyerske plaques (Carter P.B, og F.M. Collins, J.

Exp. Med. 139: 1189 (1974)). S. typhi mur ium-E. coli-hybrider H har også været vist at kolonisere Peyerske plaques hos mus (Hohmahn, A.W. et al.. Infect, and Immun. 22:763 (1978)). Hvis 10 disse bærerbakterier indeholder og udtrykker et rekombinant H gen fra en patogen organisme, vil antistoffer over for det an- tigene genprodukt, som er produceret af patogenet, blive indu- H ceret. Sammen med fremkomsten af rekombinante DNA-teknikker bliver det nu muligt at udvikle fuldstændigt enestående vacci- 15 ner, hvor specifikke antigener fremstilles, ikke af det æthio- logiske middel, men af en anden bakterieværtstamme, som er i stand til at udtrykke genet for det antigen. Det er også mu- ligt, når der er mulighed for, at antigener krydsreagerer med et antigen fra pattedyrsværten og således forstærker induktio- 20 nen af autoimmunitet, at anvende rekombinante DNA-teknikker til at ændre genet således, at den bevirkede krydsreagerende antigene determinant ikke fremstilles. Således kan rekombinan- te DNA-teknikker anvendes til at udvikle vacciner, som ikke I har noget materiale, der er i stand til at krydsreagere med I 25 hvirveldyrværtsantigener eller i stand til at fremkalde en au- toimmun tilstand. 1

Det ses, at den omhandlede opfindelse har stor anvendelighed I inden for udviklingen af effektive vacciner over for bakte- I 30 rie-, svampe-, parasit- eller virussygdomsmidler, hvor lokal I immunitet er vigtig og muligvis kan være en første forsvarsli- I nie. Nogle eksempler er vacciner til reguleringen af pneumo- I nialidelse forårsaget af Yersinia pestis, af gonorre forårsa- I get af Neisseria gonorrhoeae, af syfilis forårsaget af Trepo- I 35 nema pallidum, og af veneriske sygdomme såvel som øjeninfek- I tioner forårsaget af Chlamydia trachomatis. Streptococci-arter I fra både gruppe A og gruppe B, såsom de arter, som forårsager I øm hals eller hjertesygdomme, arterne Neisseria meningitidis, DK 175512 B1

π I

Mycoplasma pneumoniae, Hemophilus influenzae, Bordetella per- I

tussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae. Bor- I

detella avium, Escherichia coli. Streptococcus equi, Stepto- I

coccus pneumoniae, Brucella abortus, Pasteurella hemolytica, I

5 Vibrio cholera. Shigella og Legionella pneumophila er yderli- I

I gere eksempler på bakterier inden for omfanget af den forelig- I

I gende opfindelse, hvorfra gener kunne opnås. Virale vacciner, I

I såsom de der fremstilles mod influenzaviruser, er også omfat- I

I tet ifølge opfindelsen. Virale vacciner kan også fremstilles I

I 10 over for andre viruser, enten DNA- eller RNA-viruser, f.eks. I

I fra klasserne papovirus, adenovirus, herpesvirus, poxvirus, I

I parvovirus, reovirus, picornavirus, myxovirus, paramyxovirus I

I eller retrovirus. Vacciner til beskyttelse over for infektion I

I af patogene svampe, protozoer og parasitter er også omfattet I 15 ifølge opfindelsen.

I I en yderligere udførelsesform, når den immunogene bestanddel I ’ af vaccinen er et allergen for værten, kan en sådan vaccine I anvendes i et udsættelsessystem, som er udformet til specifikt I 20 at desensibi1 i sere en allergisk vært.

I I en af dens udførelsesformer kan opfindelsen beskrives som en I vaccine til immuniseringen af et hvirveldyr eller et hvirvel- I løst dyr omfattende et levende avirulent derivat af en patogen I 25 mikrobe, idet derivatet er ude af stand til at producere funk- tionelt adenylatcyklase og cAMP-receptorprotein, mens det er i I stand til at udtrykke et rekombinant gen hidrørerende fra en I organisme, som er et patogen for eller som producerer et al- lergen for dyret.

I 30 I I endnu en anden udførelsesform kan de avirulente mikrober I ifølge opfindelsen anvendes som vektorer for syntesen af for- I skellige værtsproteiner. På grund af at de avirulente mikrober ifølge opfindelsen er i stand til at krydse en række immuno- I 35 kompetente strukturer omfattende GALT, mesenteriske lyrofekirt- I ler og milt efter indføring i værten, kan sådanne mikrober an- | vendes til at målrette en række immunoregulatoriske produkter.

I Således kan et eller flere gener, som koder for immunoregula- I DK 175512 B1 toriske proteiner eller peptider rekombinant introduceres i de avirulente mikrober, således at når mikroberne tager ophold i

det passende immunokompetente væv er i stand til at udtrykke I

det rekombinante produkt til undertrykkelse, forstærkning el- I

I 5 ler modifikation af værtens immunreaktion. Eksempler på immu- I

I noregulatoriske molekyler omfatter, men er ikke begrænset til: I

H kolonistimulerende faktorer (makrofag, granulocyt eller bian- I

det), makrofagchemotoxin, makrofaginhiberingsfaktor, leukocyt- I

inhiberende faktorer, lymfotoxiner, biastogen faktor, inter- I

10 feron og inter1eukiner. I

I Endnu en anden udførelsesform ifølge den foreliggende opfin- I

delse er anvendelsen af de avirulente mikrober, som er omfat- I

tet heri, til udlevering og fremstilling af farmakologisk ak- I

15 tive produkter, som muligvis kan stimulere eller undertrykke I

I forskellige fysiologiske funktioner (dvs. væksthastighed, I

I blodtryk, osv. ) . I

I Hver af udtrykkene i disse udførelsesformer ifølge opfindelsen I

I 20 analyseres i den følgende diskussion. I

I Ved vaccine menes et middel, som anvendes til at stimulere en I

I levende organismes immunsystem således, at der tilvejebringes I

I beskyttelse over for fremtidig skade. Immunisering refererer I

I 25 til processen, hvor der induceres et fortsat højt niveau af I

I antistof og/eller cellulær immunreaktion, hvor T-lymfocytter I

enten kan dræbe patogenet og/eller aktivere andre celler I

I (f.eks. fagocytter) til at gøre således i en organisme, som er I

I rettet mod et patogen eller antigen, over for hvilket organis- I

I 30 men tidligere er blevet udsat. Selvom udtrykket "immunsystem" I

I kan omfatte reaktioner hos unicellulære organismer over for I

I tilstedeværelsen af fremmede stoffer, f.eks. interferonproduk- I

I tion, er udtrykket i denne ansøgning begrænset til de anato- I

I miske træk og mekanismer, ved hvilke en multicel1ulær organis- I

I 35 me fremstiller antistoffer over for et antigent materiale, som I

I invaderer organismens celler eller organismens ekstracellulære I

I fluidum. Det således fremstillede antistof kan høre til en I

I hvilken som helst af de immunologiske klasser, såsom immuno- I

13 I

DK 175512 B1 I

globuliner A, D, E, G eller M. Af særlig interesse er vacci- I

ner, som stimulerer fremstillingen af immunoglobulin A (IgA), I

da dette er det væsentligste immunoglobulin, som fremstilles I

af sekretionssystemet hos varmblodede dyr, selvom vacciner i- I

5 følge opfindelsen ikke er begrænset til sådanne, som stimule- I

rer IgA-produkti on. F.eks. er det sandsynligt, at vacciner af I

den heri beskrevne natur frembringer en lang række andre im- I

munreakti oner ud over IgA-dannelse, f.eks. cellulær og humoral I

immunitet. Immunreaktion over for antigener er ve 1 undersøgt, I

10 og i stor udstrækning beskrevet. Der er givet et overblik over I

immunologi af Barrett, James, T. i Textbook of Immunology: I

Fjerde udgave, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983), hvis hele I

indhold er inkorporeret heri ved henv i sni ng. I

15 Et hvirveldyr er ethvert medlem af subphylum Vertebrata, en I

primær division af phylum Chordata, som omfatter fiskene, am- I

fibierne, krybdyr, fugle og pattedyr, som alle er karakterise- I

ret ved en leddelt ben- eller bruskagtig hvirvelsøjle. Alle I

hvirveldyr har et funktionelt immunsystem og reagerer over for I

20 antigener ved at fremstille antistoffer. Således er alle hvir- I

I veldyr i stand til at reagere på vacciner. Selvom vacciner I

I mest almindeligt gives til pattedyr, såsom mennesker og hunde I

I (rabiesvaccine), er vacciner til kommercielt opdrættede hvir- I

I veldyr af andre klasser, såsom fiskene og fuglene, hvis de er I

I 25 af den heri beskrevne natur, inden for den foreliggende opfin- I delses omfang.

I Et hvirvelløst dyr er ethvert medlem af dyreriget, bortset fra I hvirveldyrene. Sådanne dyr udgør division Invertebrata og har I 30 ingen rygrad eller hvirvelsøjle. Denne klassifikation omfatter alle dyr, bortset fra fisk, amfibier, krybdyr, fugle og patte- dyr. Mange hvirvelløse dyr er i stand til at fremkalde en pri- I mitiv immunreaktion over for antigen stimulering og er modta- I gelig over for de samme mikroorganismer, som inficerer hvir- I 35 veldyr, og som er beskrevet heri ifølge den foreliggende op- I findelse. Eksempler på sådanne hvirvelløse dyr er skaldyr og I bløddyr og andre beslægtede dyr. Selvom anvendelsen af vacci- I ner til beskyttelsen af hvirvelløse dyr hidtil ikke har været I DK 175512 B1 H veldokumenteret vil en fagmand inden for området forstå anven- deligheden af den omhandlede opfindelse til sådanne hvirvel- løse dyr ved brug af deres primitive immunsystemer. F.eks. og I ifølge den foreliggende opfindelse vil skaldyrs modtagelighed 5 over for infektion af Salmonella muliggøre introduktionen af avirulente stammer af Salmonella-arter og derved tilvejebringe

mulighed for, at det primitive immunsystem reagerer. Derfor er I

anvendelsen af et avirulent derivat af en patogen mikrobe, som I

er i stand til at inficere et hvirvelløst dyr, til at stimule- I

H .10 re en reaktion fra et immunsystem, som forekommer i det hvir- I

vel løse dyr over for et patogen inden for den foreliggende I

opfindelses omfang, I

En udførelsesform ifølge opfindelsen er anvendelsen af et avi- I

15 rulent derivat af en patogen mikrobe, som hører hjemme i GALT I

eller BALT som en bærer for genproduktet, som anvendes til I

H stimulering af antistof reaktion over for et patogen eller al- I

I lergen. Avirulent betyder ikke, at en mikrobe af den slægt el- I

I ler art aldrig kan fungere som et patogen, men at den specielt I

H 20 anvendte mikrobe er avirulent med hensyn til det bestemte dyr, I

som behandles. Mikroben kan høre til en slægt eller endda en I

art, som normalt er patogen, men må høre til en stamme, som I

er avirulent. Ved patogen menes i stand til at forårsage syg- I

dom eller svække normal fysiologisk funktion. Avirulente stam- I

25 mer er ude af stand til at fremkalde en fuld suite af sygdoms- I

symptomer, som normalt forbindes med dens virulente patogene I

modpart. Mikrober, som anvendt heri, omfatter bakterier, pro- I

tozoer og encellede svampe. I 1 2 3 4 5 6

Teknikken til overførsel af genetisk materiale fra en første I

2

organisme til en anden organisme, som normalt ikke udveksler I

3

genetisk materiale med den første organisme, er på det seneste I

4

blevet bredt tilgængelig som resultatet af hurtigt ekspande- I

5

rende rekombinant DNA-teknologi. I denne ansøgning refereres I

6

der til genetisk materiale, som er blevet overført fra en or- I

ganisme til en anden på en sådan måde, at reproduktion af den I

anden organisme giver anledning til efterkommere indeholdende I

det samme genetiske materiale som et rekombinant gen. Beteg- I

DK 175512 B1 I

15 I

neiser» gen anvendes heri i dens bredeste betydning til at re- I

præsentere enhver biologisk arveenhed. Det er ikke nødvendigt» I

at det rekombinante gen er et komplet gen, som det er til ste- I

de i moderorganismen, der var i stand til at fremstille eller I

5 regulere produktionen af et makromolekyle, f.eks. et fungeren- I

de polypeptid. Det er kun nødvendigt, at genet er i stand til I

I at tjene som skabelonen, der anvendes som en guide ved frem- I

I stillingen af et antigent produkt. Produktet kan være et, som I

I ikke blev fundet i den eksakte form i moderorganismen. F.eks. I

I 10 kan et funktionelt gen, som koder for et polypeptidantigen I

I omfattende 100 am inosyrerester delvis overføres til en bærer- I

I mikrobe, således at der fremstilles et peptid omfattende kun I

I 75, eller endda 10, aminosyrerester af den cellulære mekanisme I

I hos værtcellen. Hvis dette genprodukt imidlertid er et anti- I

I 15 gen, som vil forårsage dannelse af antistoffer over for et I

I lignende antigen, som er til stede i moderorganismen, anses I

I genet for at være inden for omfanget af udtrykket gen, som I

I defineret i den omhandlede opfindelse. Hvis aminosyresekvensen I

I af et bestemt antigen eller fragment deraf er kendt, er det I

I 20 alternativt muligt kemisk at syntetisere DNA-fragmentet eller I

I analogen derfor ved hjælp af automatiserede gensynteseappara- I

I ter eller lignende og indføre DNA-sekvensen i den passende I

I ekspressionsvektor. I den anden ende af spektret er en lang I

I DNA-sektion, som koder for flere genprodukter, hvoraf en eller I

25 alle kan være antigene. Således er et gen som defineret og I gjort genstand for krav heri en hvilken som helst arveenhed, som er i stand til at producere et antigen. Genet kan være af kromosom-origin, plasmid origin eller viral origin.

I 30 For at genet skal kunne være effektivt til fremkaldelse af en I immunreaktion, må genet udtrykkes. Ekspression af et gen bety- I der, at den iboende information i genstrukturen (sekvensen af I DNA-baser) transformeres til et fysisk produkt i form af et I RNA-molekyle, polypeptid eller andet biologisk molekyle ved I 35 hjælp af cellens biokemiske mekanismer, hvori genet er lokali- I seret. Det således producerede biologiske molekyle kaldes gen- produktet. Udtrykket genprodukt som anvendt heri refererer til I ethvert biologisk produkt eller produkter, som er fremstillet I DK 175512 B1

i I

som et resultat af de biokemiske reaktioner, der forekommer I

under reguleringen af et gen. Genproduktet kan f.eks. være et I

RNA-molekyle, et peptid eller et produkt, som er produceret I

under reguleringen af et enzym eller andet molekyle, som er I

I 5 det indledningsvise produkt af genet, dvs. et metabolisk pro- I

dukt. F.eks. kan et gen først regulere syntesen af et RNA- I

I molekyle, som translateres ved ribosomernes virkning til et I

I enzym, som regulerer dannelsen af glycaner i miljøet uden for I

den oprindelige celle, hvori genet blev fundet. RNA-molekylet, I

10 enzymet og glycanen er alle genprodukter, som udtrykket er an- I

I vendt heri. Enhver af disse såvel som mange andre typer gen- I

I produkter, såsom glycoproteiner og polysaccharider, vil virke I

I som antigener, hvis de introduceres i et dyrs immunsystem. I

I Proteingenprodukter, omfattende glycoproteiner og lipoprotei- I

I 15 ner, er foretrukne genprodukter til anvendelse som antigener i I

I vacciner. I

I For at en vaccine skal kunne være effektiv til fremstilling af I

I antistoffer, skal det antigene materiale frigives på en sådan I

I 20 måde, at den anti stof-producerende mekanisme hos det vaccine- I

I rede dyr kan sættes igang. Derfor skal genproduktmikrobebære- I

I ren introduceres i dyret. For at stimulere en foretrukken I

I reaktion hos GALT- eller BALT-celler som tidligere beskrevet I

I foretrækkes introduktion af mikroben eller genproduktet direk- I

25 te i tarmen eller bronchus, såsom ved oral administration, I

gastrisk intubation eller i form af aerosoler, selvom andre I

metoder til administration af vaccinen, såsom intravenøs eller I

intramuskulær eller subkutan injektion eller intrabrystadmini- I

stration eller intrapenial eller vaginal administration er I

30 mulige. I

Når den avirulente mikrobe anvendes som en bærermikrobe, og I

når bærermikroben er til stede i dyret, er det nødvendigt, at I

antigenet bliver tilgængeligt for dyrets immunsystem. Dette I

35 kan muligvis opnås, når bærermikroben dør, således at antigen- I

molekylerne frigives. Anvendelsen af "lækkende" avirulente I

mutanter, som frigiver indholdet af periplasma uden lyse, er I

selvsagt også mulig. Alternativt kan der muligvis vælges et I

17 I

DK 175512 B1 I

gen, som regulerer produktionen af et antigen, der vil blive I

gjort tilgængelig af bærercellen for miljøet udenfor før cel- I

lens død. På denne måde er det muligt at anvende en levedygtig I

mikrobe, som vil bevares i det vaccinerede dyr, f.eks. i dets I

5 Peyerske plaques, og fortsætte med at fremstille antigen og I

derved kontinuert inducere anti stofdannelse. Et foretrukkent I

genprodukt under disse omstændigheder er et produkt, som over- I

I føres gennem cellemembranen til det ydre miljø eller et pro- I

I dukt, som bliver bundet til eller indlejret i den ydre mem- I

I 10 bran, således at hele eller dele af genproduktet er udsat for I

I miljøet. Typiske for denne sidstnævnte type af genprodukt er I

I antigener, som normalt findes på overfladen af organismen, I

I over for hvilken beskyttelse ønskes. Hvis disse antigener I

I transporteres til celleoverfladen på en normal måde, vil anti- I

I 15 stofdannelse over for antigenerne blive forstærket. I

I Anvendelsen af patogener til levering af antigener fra andre I

I patogener til GALT eller BALT ville være upassende, hvis det I

I ikke var for den kendsgerning, at sådanne patogener kan gøres I

I 20 avirulente, mens de bevarer evnen til at invadere Peyerske I

I plaques eller BALT.

Organismen, hvorfra det rekombinante gen hidrører, kan være I ethvert patogen for dyret, som vaccineres, eller kan være en I 25 organisme, som producerer et allergen eller andet antigen for I dyret. Allergener er stoffer, som forårsager allergisk reak- I tion, i dette tilfælde i dyret, som vil blive vaccineret over for dem. Mange forskellige materialer kan være allergener, I såsom dyreskæl og pollen, og den allergiske reaktion hos indi- I 30 viduelle dyr vil variere med hensyn til ethvert bestemt aller- gen. Det er muligt, at indføre tolerance over for et allergen I hos et dyr, som normalt udviser en allergisk reaktion. Frem- I gangsmåderne til indføring af tolerance er velkendte, og om- | fatter generelt administration af allergenet til dyret i sti- I 35 gende doser. Yderligere diskussion af toleranceinduktion er anført i Barrett's tekstbog som tidligere citeret. Til sidst I kan værtsorgan ismen i sig selv tjene som en kilde for genetisk I materiale, når iramunoregulatoriske gener eller gener for andre I farmakologisk aktive stoffer udtrykkes af vektorer.

I DK 175512 B1 18 H Administration af en levende vaccine af den ovenfor beskrevne I type til et dyr kan være ved hjælp af en hvilken som helst kendt teknik eller standardteknik. Disse omfatter oral ind- I tagelse, gastrisk intubation eller broncho-nasal spray. Alle 5 disse metoder muliggør, at den levende vaccine let når GALT- eller BALT-cel1 erne og inducerer antistofdannelse og er de foretrukne admi nistrationsmetoder. Andre admi ni strati onsmeto- der, såsom intravenøs injektion, som muliggør, at bærermikro- I ben når dyrets blodstrøm, kan være acceptable. Intravenøs,

I 10 intramuskulær eller intrabryst injekti on er også acceptable I

I sammen med andre udførelsesformer ifølge opfindelsen, som I

senere beskrevet. I

Da foretrukne administrationsmetoder er oral indtagelse, aero- I

15 solspray og gastrisk intubation, er foretrukne bærermikrober I

sådanne som hører til arterne, der hører hjemme fortrinsvis I

hos en hvilken som helst af 1ymfoepite 1 strukturerne i tarmene I

H eller i bronkierne hos dyret, som vaccineres. Disse stammer I

I foretrækkes at være avirulente derivater af enteropatogene I

I 20 stammer, som fremstilles ved genetisk manipulation af entero- I

I patogene stammer. Stammer, som hører hjemme i de Peyerske pla- I

I ques og således direkte stimulerer produktion af IgA er mest I

I foretrukne. Hos dyr omfatter disse specifikke stammer af Sal- I

I monel la og Salmonella-E. coli-hybrider, som hører hjemme i de I

I 25 Peyerske plaques. I

Rekombinante DNA-teknikker er nu tilstrækkeligt velkendte og I

almindeligt udbredte, således at de må anses for at være ruti- I

ne. Meget generelt og bredt beskrevet består denne metode af I

30 overførsel af det genetiske materiale eller mere sædvanligvis I

en del af det genetiske materiale fra en organisme til en an- I

den organisme, således at det overførte genetiske materiale I

bliver en permanent del af (rekombinerer med) det genetiske I

materiale hos organismerne, hvortil det er overført. Dette om- I

35 fatter sædvanligvis, at man først opnår et lille stykke DNA I

fra moderorganismen, enten fra et plasmid eller et moderkromo- I

som. Et plasmid (også benævnt et ekstrakromosomelement) er en I

arvenhed, som er fysisk adskilt fra cellens kromosom. DNA’et I

19 I

DK 175512 B1 I

kan have enhver størrelse og opnås ofte ved indvirkning af et I

I restriktionsendonukleaseenzym, som virker således at DNA-mole- I

I kyler kløves ved specifikke baseparsteder. Efter ligering til I

I plasmid-, fag- eller kosmidvektorer til dannelse af rekombi- I

I 5 nante molekyler, kan de rekombinante molekyler overføres til I

I en værtscelle ved hjælp af forskellige metoder, såsom trans- I

I formation {optagelse af nøgent DNA fra det ydre miljø, som kan I

I induceres kunstigt ved tilstedeværelsen af forskellige kemiske I

I midler, såsom calciumioner). Andre métoder, såsom transdukti- I

I 10 on, er også egnede, hvor det rekombinante DNA er emballeret i I

I en fag, såsom transducerede fag- eller -kosmidvektorer. Når I

I først det rekombinante DNA er i bærercellen, kan det fortsætte I

I med at eksistere som et separat stykke (generelt sandt for I

I fuldstændigt overførte plasmider) eller det kan indsættes i I

I 15 værtscellekromosomet og reproduceres sammen med kromosomet I

I under celledeling. I

I Selvom overførsel af genetisk materiale er relativt ligefremt, I

I er det endnu ikke muligt at forudsige hvilke overførsler, der I

I 20 vil resultere i udtrykte gener. Denne selektionsfremgangsmåde I

I giver imidlertid ikke nogle vanskeligheder for den foreliggen- I

I de opfindelse. Da værtsmikroben skal udtrykke det overførte I

I gen og derved producere et antigen, virker en "haglgeværs"-me- I

I tode godt. Antistoffer fremstilles først over for det ønskede I

I 25 antigen, f.eks. fragmenter af cellemembraner fra patogene mi- I

I krober, ved hjælp af standardteknik. DNA fra organismen, dvs.

I kilden for antigenet, kløves i flere fragmenter ved hjælp af I endonukleaser, og fragmenterne indsættes tilfældigt i bærermi- I krober, fortrinsvis ved hjælp af kloningsvektorer. Hikroberne, I 30 som udtrykker antigener fra patogenet, kan let identificeres I ved hjælp af deres reaktion med antistof over for patogenan- tigener. Antigen-udtrykkende mikrober kan udvælges og klones I til opnåelse af den ønskede rekombinante organisme. Haglge- I værskloning er velkendt og beskrevet detaljeret af Maniatis, I 35 t. et al., Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratories I (1982), som er inkorporeret heri ved henvisning. Genoverfør- selsteknik anses ikke for at udgøre en del af denne opfindel- I se, og en hvilken som helst fremgangsmåde, som er i stand til I DK 175512 B1

I 20 I

at fremstille rekombinante organismer omfattende gener fra en organisme, som udtrykkes i avirulente mikrober, vil være til- strækkelig.

5 i tilfælde hvor arterne normalt udveksler genetisk informati- I

on, kan mere klassiske genoverførselsfremgangsmåder anvendes, I

såsom konjugation, transformation eller transdukti on. I

Derivater af avirulente mikrober er også ment at være inden I

10 for den foreliggende opfindelses omfang. Ved derivat menes I

seksuelt eller aseksuelt afledt afkom og mutanter af de aviru- I

lente stammer, som omfatter enkelte eller flere basesubsti tu- I

tioner, deletioner, indsættelser eller inversioner, som beva- I

rer den manglende evne til at fremstille funktionelt adenylat- I

15 cyklase og cAMP-receptorprotein med eller uden naturligt fore- I

kommende virulensplasmider. F.eks. stammer, såsom χ4062 og I

I X4064, som bærer gyrÅ-mutationen, hvilket giver nalidixinsyre- I

resistens, som er blevet anvendt heri som en hensigtsmæssig I

markør til at følge stammer efter oral podning. Lægemiddel re- I

20 sistens er imidlertid ikke en ønskelig egenskab hos stammer, I

som skal anvendes som vacciner. Således kan gyrA+-mutationen I

let fjernes ved at transducere gyrA+-genet (som giver følsom- I

I hed over for nalidixinsyre) til stammer ved udvælgelse for arv I

af en tæt forbundet TnlO og derefter fjernelse af TnlO ved I

25 udvælgelse for fusarsyreresistens. I

I De nødvendige doser vil variere med genproduktets antigenici- I

I tet og behøver kun at være en mængde, som er tilstrækkelig til I

I at inducere en immunreaktion, som er typisk for eksisterende I

I 30 vacciner. Rutineeksperimentering vil let fastslå den nødvendi- I

ge mængde. Typiske indledningsvaccinedoser kunne være 0,001-1 I

mg antigen/kg legemsvægt med stigende mængder eller flere do- I

ser anvendt efter behov til tilvejebringelse af det ønskede I

I beskyttelsesniveau. I

I 35 I

I Oen farmaceutiske bærer, hvori vaccinen suspenderes eller op- I

I løses, kan være et hvilket som helst opløsningsmiddel eller I

I fast stof, eller indkapslet i et materiale, som er ikke-tok- I

21 DK 175512 B1

sisk over for det podede dyr og forligelig roed bærerorganismen I

eller det antigene genprodukt. Egnede farmaceutiske bærere oro- I

fatter flydende bærere, såsom normal saltopløsning og andre I

ikke-toksi ske salte ved eller i nærheden af fysiologiske kon- I

5 centrationer, og faste bærere, såsom talkuro eller saccharose, I

I og soro også kan inkorporeres i foder til 1 andbrugsdyr. Hjælpe- I

I stoffer kan være tilsat for at forstærke antigeniciteten om I

I ønsket. Når vaccinen anvendes til administration via bronkial- I

I rørene, er den fortrinsvis til stede i form af en aerosol. I

I 10 I

I Immunisering med et patogenafledt genprodukt kan også anvendes I

I sammen med forudgående immunisering med det avirulente derivat I

I af en patogen mikroorganisme, der virker soro en bærer til at I

I udtrykke genproduktet, som specificeres af et rekombinant gen I

I 15 fra et patogen. Sådan parenteral immunisering kan tjene som en I

I booster til at forstærke ekspression af sekretionsimmunreak- I

I tionen så snart sekretionsimmunsystemet over for det patogen- I

afledte genprodukt er blevet primet ved immunisering med bæ- I

I rermikroben, som udtrykker det patogenafledte genprodukt, til I

I 20 stimulering af lymfecellerne i GALT eller BALT. Den forstærke- I

I de reaktion er kendt som en sekundær-, booster- eller anam- I

I nesereaktion og resulterer i forlænget immunbeskyttelse af I

I værten. Boosterimmuniseri nger kan gentages adskillige gange I

med gunstige resultater. I

I 25 I

Beskrivelsen ovenfor beskriver generelt den foreliggende op- I

findelse. En mere fuldstændig forståelse kan opnås ved henvis- I

I ning til de følgende specifikke eksempler, som er vist heri I

I udelukkende til illustrationsformål og ikke er ment at begræn- I

I 30 se, med mindre andet er anført.

I Deponeringer af stammer, som er egnede ved udøvelse af opfin- I delsen 35 En deponering af biologiske rene kulturer af de følgende stam- mer blev foretaget hos the American Type Culture Collection I (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland den 15. juli I 1987 og det viste accessionsnr. blev givet efter succesrig le- I DK 175512 B1 I 22 vedygtighedsundersøgelser, og de nødvendige honorarer var be- H talt. Deponeringerne blev foretaget i overensstemmelse med Bu- dapesttraktatens bestemmelser. De nævnte kulturer vil forblive vedvarende tilgængelige i en periode på i det mindste 5 år ef- 5 ter den seneste anmodning om udlevering af en prøve og i et- hvert tilfælde 30 år efter deponeringsdatoen.

Hvis kulturen skulle blive ikke-levedygtig eller uforvarende ødelagt vil den blive erstattet med en levedygtig kultur eller

10 kulturer med den samme taxonomiske beskrivelse. I

Stamme ATCC nr. I

I *4062 53647

X4064 53648 I

Eksempel 1 I

Dette eksempel viser konstruktionen af en avirulent mikrobe I

ved introduktionen af deletionsmutationer, som påvirker cAMP- I

20 syntese og anvendelse. I

I Bakteriestammer. De anvendte Salmonella typhimurium-stammer I

er vist i tabel 1. De blev opbevaret som frosne kulturer sus- I

penderet i 1% Bacto-pepton indeholdende 5% glycerol og lyn- I

25 frosne i tør is-ethanol for lagring in duplo ved -70°C og også I

suspenderet i 1% Bacto-pepton indeholdende 50% glycerol for I

lagring ved -20°C for rutineanvendelse. I

Med i er. Komplekse medier til rutinedyrkning var L-suppe (Len- I

30 nox, Virology 1:190-206, (1965)) og Luria-suppe (Luria and I

Burrous, J. Bacteriol. 74:461-476 (1957)). Difco-agar blev sat I

til Luria-suppe ved 1,2% til baseagar og 0,65% til blød agar. I

Penassay-agar blev anvendt til rutinebakterieoptæl1ing. Fer- I

mentering blev bedømt ved at supplere MacConkey-baseagar eller I

35 Eosin-methylenblåtagar (Curtiss, Genetics 58:9-54 (1968)) med I

et passende carbohydrat i en slutkoncentration på 1%. I

Syntetiske medier var minimal væske (ML) og minimal agar (MA), I

som var suppleret med næringsstoffer i optimale nivauer som I

DK 175512 B1

23 I

tidligere beskrevet (Curtiss, J. Bact. 89:28-40 (1965)). Puf- I

ret saltopløsning med gelatine (BSG) (Curtiss, 1965 supra) I

blev rutinemæssigt anvendt som et fortyndingsmiddel. I

5 Transduktion. Bakteriofag P22 HT int blev rutinemæssigt an- I

vendt til transduktion under anvendelse af standardmetoder I

(Davis et al., "A Man. for Genet. Eng.-Adv. Bact. Genetics"., I

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NV, I

I (1979)). En kultur fra natten over af donorstammen blev for- I

I 10 tyndet 1:20 i foropvarmet Luria-suppe, dyrket i 60 minutter I

I under rysten ved 37°C og derefter inficeret med P22 HT int ved I

I én multiplicitet på 0,01. Infektionsblandingen blev rystet I

I natten over i ca. 15 timer, chloroform blev tilsat og blev I

I rystet i yderligere 10 minutter ved 37eC, og suspensionen blev I

I 15 centrifugeret (Sorvall RC5C, SS-34-rotor, 7.000 o/m, 10 min.) I

I til fjernelse af bakterielt nedbrydningsmateriale. Superna- I

I tantvæsken indeholdende fagen (ca. 10l°/ml) blev lagret ved I

I 4°C over chloroform. Tetracyklin til en koncentration på 12,5 I

I pg/ml blev anvendt til udvælgelse for transduktion af TnlO-in- I

I 20 ducerede mutationer. I

I Fusarsyreudvælqelse for deletionsmutationer. Der blev anvendt I

I medierne og metoderne som beskrevet af Maloy og Nunn (J. Bact. I

I 145:1110-1112, (1981). Stammer med Tn-inducerede mutationer I

I 25 blev dyrket natten over i L-suppe indeholdende 12,5 pg tetra- I

I cyklin/ml ved 37°C til ca. 5xl08 cfu/ml. Kulturer blev deref- I

I ter fortyndet 1:40 ind i forvarmet L-suppe uden tetracyklin og I

I blev luftet ved 37eC til en titer på ca. 2xl09 cfu/ml. Passen- I de celleantal (dvs. 10^-10®), som var fortyndet i BSG, blev 30 udpladet på fusarsyrehoIdigt medium og inkuberet i 48 timer ved 37 eC. Fusarsyreresistente isolater blev oprenset på det I samme selektive medium. Enkelte isolater blev udtaget, dyrket og undersøgt for tetracyklinfølsomhed på Penassay-agar med og I uden 12,5 pg tetracyklin/ml .

I 35 I Mus. BALB/C-hunmus (Sasco, St. Louis, MO) blev anvendt til I alle infektivitets- og immuniseringsforsøg. Dyr med en alder I på 3 eller 7 uger blev leveret og holdt i en uge i et karan- I DK 175512 B1 tænerum før de blev anvendt i forsøg. Forsøgsmus blev anbragt i Nalgenefilter-d*kkede bur med trådgulve. Føde og vand blev givet ad libitum. Dyrerummet blev holdt ved 22-23eC med en 12 timers belysningsperiode.

I 5

Dyreinfektivitet. Virulensen af S. typhi mur ium-stammer blev I bestemt efter peroral eller intraperitoneal indpodning. Bakte- rier til indpodning i mus blev dyrket natten over som hen- standskulturer ved 37°C i L-suppe. Disse kulturer blev fortyn- 10 det 1:50 i foropvarmet L-suppe og beluftet ved 37°C i ca. 4 timer til en ODgoo På ca· 0,8-1,0. Cellerne blev koncentreret I 50 gange ved centrifugering i en GSA-rotor ved 7000 o/m i 10

minutter ved 4°C i en Sorvall RC5C-centrifuge efterfulgt af I

I suspension i BSG. Egnede fortyndinger blev udpladet på Penas- I

15 say-agar til titerbestemmelse og på MacConkey-agar med 1% mal- I

tose for at verificere Cya/Crp-phenotype. I

For alle perorale indpodninger blev mus unddraget føde og vand I

I i 4 timer før infektion. De blev da givet 30 μΐ 10% (vægt/vol) I

20 natriumbicarbonat under anvendelse af en Pipetman P200 5 mi- I

nutter før peroral fodring med 20 μΐ S. typhimurium suspende- I

I ret i BSG under anvendelse af en Pipetman P20. Føde og vand I

I blev bragt tilbage 30 minutter efter oral indpodning. Morbidi- I

tet og mortalitet hos mus blev iagttaget i løbet af en periode I

I 25 på 30 dage. I

Intraperitoneal indpodning hos mus, som ikke havde fastet, I

blev udført anvendelse af en 26-gauge nål til udlevering af I

300 μΐ bakteriesuspension fortyndet i BSG. Morbiditet og mor- I

30 talitet hos mus blev iagttaget i løbet af en periode på 30 I

dage. I

Bedømmelse af beskyttende immunitet. I indledningsvise forsøg I blev enhver mus, som overlevede infektion med enhver S. typhi- I

35 murium-mutantstamme i 30 dage, udfordret på dag 31 med 103-10* I

gange LDsg-doserne for den muse-virulente vildtype-S. typhimu- I

rium SRll-stamme χ3306 ad den perorale vej. Derefter blev I

grupper af mus peroralt immuniseret med forskellige doser af I

25 I

DK 175512 B1 I

avirulente mutanter og derefter udfordret med forskellige do- I

ser af virulente x3306-celler på forskellige tidspunkter efter I

den indledningsvise immunisering. Morbiditet og mortalitet I

blev iagttaget under hele forsøget og i mindst 30 dage efter I

5 udfordring med x3306-cel1 er. I

Optælling af levedyqtiqe S. tvphimurium-celler in vivo. Ko- I

Ionisering og vedvarenhed af vildtype- og mutant-S. typhimuri- I

um SRll-stammer blev bestemt efter peroral indpodning af mus I

10 med ca. 1 x 109 celler ved hjælp af de ovenfor beskrevne meto- I

der. Titere af S. typhimuriumceller blev bestemt efter 4, 24, I

48, 72 og 96 timer og 7 dage efter peroral infektion i indhol- I

dene af tyndtarmen og colon og i homogenater af Peyerske pla- I

ques (8-10), en 10 cm sektion af tyndtarmsvæggen lokaliseret I

15 ved den distale sektion af ileum med Peyerske plaques fjernet I

og colonvæggen. Celletitere i homogenater af mesenteriske lym- I

fekirtler og milt blev også bestemt. Mus blev aflivet ved CO2- I

I kvælning, og de mesenteriske lymfekirtler, milten, tyndtarmen I

I og colon blev øjeblikkelig anbragt i afkølet ML + 15% saccha- I

I 20 rose minimal salte (MLS), som blev opbevaret på is. En petri- I

I skål indeholdende 4,0 ml afkølet MLS blev anvendt til at holde I

I tyndtarmene, mens de Peyerske plaques blev fjernet med små ki- I

I rurgiske sakse. Peyerske plaques blev skyllet to gange hver I

I med 1 ml afkølet BSG før anbringelse i et glasskruelågsrør (15 I

I 25 x 100 mm) indeholdende 1 ml afkølet MLS og glaskugler. Tynd- I

I tarmen blev derefter skåret på langs og indholdene og væggene I

I anbragt i et 50 ml konisk engangsrør, og afkølet MLS blev til- I

I sat. til et volumen på 5,0 ml før hvirvlen i 1 minut. En 10 cm I

I sektion af tyndtarmen blev fjernet, skyllet to gange i 5 ml I

30 BSG og anbragt i et glasskruelågsrør (15 x 100 mm) indeholden- I

I de 2,5 ml afkølet MLS og glaskugler. Tyndtarmens indhold blev I udvundet fra den afkølede MLS, som blev anvendt under dissek- I tionen på langs og vask af tyndtarmen og sat til det koniske I 50 ml engangsrør indeholdende tyndtarms indho1dene. En petri- I 35 skål indeholdende 4,0 ml afkølet MLS blev anvendt til at holde I colon, mens den blev skåret på langs gennem coecum. Indholdet I af colon og colonvæggen blev anbragt i et 50 ml slutvolumen I før hvirvlen i 1 minut. Colonvæggen blev derefter fjernet og I DK 175512 B1 I 26 skyllet to gange i 5 ml BSG før anbringelse i et glasskrue- lågsrør (15 x 100 mm) indeholdende 2,5 ml afkølet MLS og glas- I kugler. Colonindholdene blev opsamlet fra det afkølede MLS, som blev anvendt under dissektionen på langs og vask af colon,

5 og sat til det 50 ml koniske engangsrør indeholdende colon- I

indholdene. De mesenteriske lymfekirtler og dermed forbundet I

fedtvæv blev anbragt i et glasskruelågsrør (15 x 100 mm) inde- I

I holdende 1,0 ml afkølet MLS og glaskugler og hvirvlet. Milte, I

som var høstet efter 96 timer og 7 dage bearbejdes ved an- I

10 bringelse direkte i et Dounce-vævshomogeniseringsapparat af I

stødertypen og formaling med 2,5 ml afkølet MLS. Hvert rør med I

I glaskugler og væv blev hvirvlet i 4 til 5 minutter under an- I

I vendelse af en super-mixer ved høj hastighed. Suspensioner I

I blev fortyndet i BSG og udpladet på MacConkey-agar indeholden- I

15 de 1% lactose og 40 ug nalidixinsyre/ml. Samlet antal levedyg- I

tige titere blev bestemt under anvendelse af volumerne fra I

suspensionerne, fortyndingerne og pladetællingerne. MacConkey- I

agarer indeholdende 1% af forskellige carbohydrater blev an- I

I vendt til at verificere, at de udvundne organismer havde den I

20 forventede phenotype. I

I Konstruktion af S. tvphimurium SRll-stammer med cva- og crp- I

I mutationer. S. typhi murium SRll-stammen x3041 blev anvendt I

I til peroral infektion af BALB/C-mus. Et bemærkelsesværdigt I

I 25 sygt dyr blev aflivet efter 5 dage, og det efterfølgende veri- I

I ficerede, fuldstændigt muse-virulente i solat χ3181 blev udvun- I

I det fra en Peyersk plaque. En gyrA-mutation, som giver resis- I

tens over for nal idixinsyre, blev indført i X3181 ved P22- I

I transduktion til opnåelse af χ3306, som er moderen til alle I

I 30 stammerne, som vil blive beskrevet heri (Tabel 1). I

I Da det er blevet vist, at S. typhimurium-isolater helbredt for I

I 100 kb virulensplasmid er fuldt i stand til at binde sig til, I

I invadere og forblive i Peyerske plaques, men ikke kan vandre I

I 35 til de mesenteriske lymfekirtler og milt, blev cya- og crp- I

I mutationer indført i den plasmidhelbredte S. typhimurium SR11- I

I stamme χ3337 såvel som i det plasmidholdige SRll-derivat I

I X3306. Det bør understreges, at genintroduktionen af pStSRIOO- I

DK 175512 B1 I

plasmidet i χ3337 fuldstændigt genopretter dets virulens (se I

eks. 3), og således sikrer at der ikke opstår nogen sekundære

mutationer i x3337 under helbredelsen for virulensplasmidet. I

10 I

I 15 I

I 20 I 25 I 30 I 35 I DK 175512 B1 I 28 to

C <M

0) —i I

I 4-1 i—I I

I £ 3 * 7 H Λ cm

J-1 ·Η — 3 I

. w - > *—> o — o I

·!( t". — "* I

I W X3 7, - = I

^ — s ti m := — u-'i I

H i O = c o o c r> ^ i“C o I

Φ — o — -i <—· · o o —> —>. —. s o c o I

CV · — s — o;— nnx-r—iX-rXX I

w xk t s: s i® *x * I

aj fi - o " Lill! *.ή t.'WH I

H to -H ~ <4_( O i- — <0 (β (0 <Q I

T. » .H n C Jj —i NfjN NN >r-N >rs I

w =- = 55^^1:- «%· o· o -< —!; o — —» I

Η Ό — ·— ^0-=^10^..^..00^00-'O — — I

C ;=-Hnjj-(l) - . ---rr — — rt — - tz I

·Η ~ = rH v| Γ;μ «Λ ---: — — I

Η μ - Γ1 0 Λ· S ^J3 — 5 r-l r: c:— — — — — — I

I O H= nj § = iQ) = I v. c,i w. c;! =: = r= =: = ·-= = — -= I

I - = c c—ico—I = o —.— i — ,—; — i I

H "-(OjjS. ·η. — ri— K'w mww I

— — •Pc®' — ΨΒ—_£5!rtr.t,lrt:.'-’lr.w.c' I

I ” Λ 5* ®^"~ = 3ΪΓ=»ΰί — r-s- I

f5-^O4JøjP*-f'rl<0<*»'— S Ξ f-J r-j i- cm γν: l. rv:ι-ι I

I o o [β g g<=r..<<: I

I 21 2! I

I «Ξ £Z I

·«<

I O CM I

I C £! —.. ni niNui I

O ··* οι r*-l I I I i I

2 -= Ί q =1 y x:“” I

S 2 - o S Sit: c!2! I

fed W ♦— fSJ zJ «► — 1

* rj S ^ ~\ «-*»»—·*—i·^ rinrw~- I

_ o S —-I ^ I I I t .. I i i i I I I I

- *z “*“* = ^-, ·· ^- f r; I -t ·« i? i ?; i ?r»?5 I

5 2 £ rj = - c>| *='—>-··ni I

f. _ “ _ ™ cm c— — — I >»: -1 u i \j i xi u i u i ·_ι ι υ I

— — — — —* ·* = UIUIQ Q UI<3<2<C<3 I

— — — ·· O} c— I

{= 2 - - o O IO o —I — OICIOlO to IO lo lo to I

u ~j> = Z ξΙξ -ti Ξί=Ξ!=Ξ!=ΞΞί= I

g ~ P < — *= << ^5 *** <I<IO<I<KKKI< I

g p - I- o w i- — «I — -i-ii-i-n-i-i-ii-ii- I

g i; — <Λ x i- i-ι s-.| >,1 >-i >J s^! >, I

(0 — >eal— — i -d —' u| u =u = = a = u;au I

•M

W \ I

Φ <U I

•Η E o z s o O — czzz

M · g O Z O OO o oooo o I

qj m — — — o o — — — — —ι I

11 ij — — f-> zz m — oocszsiss — I

.ii rn 2 — <Λ —3 CO -O (Λ i — W W ιο ΙΛ <Λ I

m U E <Λ to in LO LO (Λ _3 j W LO to W V5 I

oq a> w — — — — — - =.

TSfl ϊϋϊς ί ΐ SV>sS ^ I

$ o * — — — — “ >r I

f^·* * ι ι i i rw oj· i j j i i t i j ι I

r^CίΗ ΐίΐίΐ Si u I

• —i wi-jt/jooi/jto-j 1) ' I

1-1 ' I

(D h ι-i E <D .

Kl g E cm rs.

ca <T3E R·;'; iSi ί 2 n λον·.ί = ο-ν>: I

ril 4-* O nn- C2Z ‘^OOC'r'r-iL'-iin'OOOO I

XKX XXX X i. i. x X X X XX >( >C K I

I 29 I

DK 175512 B1 I

I I tabel 2 er de phenotype egenskaber hos alle mutantstammerne I

I og deres ophav med hensyn til fermentering af sukker og vækst I

I på forskellige carbonkilder anført. Phenotyperne er som for- I

I ventet baseret på publicerede rapporter om behovene for cyk- I

I 5 lisk AMP og det cykliske AMP-receptorprotein for kataboliske I

I aktiviteter. (En undtagelse er χ4060, som opførte sig som en I

I cya crp-dobbeltmutant, snarere end en cya-enke1 tmutant. Alle I

I cya/crp-mutantstammerne mangler fimbriaer og flagella som for- I

I ventet baseret på tidligere resultater (Saier et al., J. Bact. I

I 10 134(1):356-358 (1978); Yokota og Gots, J. Bact. 103:513-16 I

I (1970) og Komeda et al., Mol. Gen'l Genet. 142:289-298 I

I (1975)). Det er også tydeligt, at tilstedeværelsen af I

I pStSR100-plasmi det ikke har nogen indvirkning på disse pheno- I

I typer. I

I 15 I

Ved hvert trin i konstruktionen efter udvælgelsen af et fusar- I

syreresistent tetracyklinsensitivt derivat blev der udført en I

I undersøgelse af, hvorvidt tetracyklinresistente revertanter/ I

I mutanter kunne udvindes med større hyppigheder end det kunne I

I 20 iagttages for moder-x3306-stammen. I alle tilfælde blev sådan- I

I ne tetracyk1 inresi stente revertanter/mutanter ikke iagttaget. I

I 1 I 35 30 I 30 DK 175512 B1

Q> 3 + L

TD V) <0 c 1- Φ r- Ό t- + + I + 3 >— V) O L· £ *- - 0> 0) 0) + + I + I I l ,- T) Σ ΓΗ e <u

H t— I

+> + + + -ο

1- Σ Q

H 10 i- o ·“ a> <0 (0 + l I I I (/) S >

ηυ I

Η ε > c H *»** r“ + + + I ¢) c a a I ε => v <-+ + + + + + +

Η <0 O

Η α <- 10

Η +>«+ + + + + + + 4J

” ° «

* ν I

Η w *· "έ Η S- >->-+111111 Στ 0) ο ^ li I s t I * i fl> rot/) rj <U r-

H <0 -<T3 X3 <u + + 1 + I I I I

Δ OL C ε a>

tø <D Ό >— I

O CL I- V + + I + I I * ' I

£ > o ε 2

v x * I

(- o e> <- I

0) C Ό ro +11 i I i i *v I

a <i) c ε +i

ro x -i- *5 I

I * °- ° «

w w c_ > J* I

c σ> ro >— + + i + i i i >· I

0) C cn C3 +> I

σ» -i- ro L tn I

0) (_ I 3 (U ^ ]

+1 <U>r-+ + + + + + + '"a I

in +> ro o "" > I

c _y: ® I

in ro c i— i c. I

> e o ro ++^+i i i ® φ I

(. U C9 + c ·— I

D) 0) O '·" i— I

o u. ro o L φ I

εΐ-+ + + + + + + fl> I

t u. v σ> I

tn c c I

σι ® ·<- I

c ε t-

I -r- t- gi I

U φ -P

I u **- c I

** CL Φ I

c (-O + + 1++11 <- ε I

ro o c ro O i_ I

e a> q +- <u I

l. ro x > +- I

tu >ο.+·+ι + ιιιι > I

U. L> ·>- (_ I

I ** o - +.

tn I

CM I O > I

03 Q- -r- I

_J £ · tDLOtOCMOCM·^· +> I

lu £ '— ooicnroiotoio n ro I

m roe ococnoooo σ» I

< +» η η n « <t <t μ +tt> I

t- ert X X X X X X X roe I

DK 175512 B1 I

31 I

Kolonidiaroetre på HA indeholdende 0,5% glucose som en funktion I

af i nkuberingstid og generationstider i ML indeholdende 0,5%

glucose hos flere af mutantstammerne og deres ophav er vist i I

tabel 3. Det er tydeligt at Acya-stammerne med eller uden I

5 Acrp-mutationen og uafhængigt af tilstedeværelsen eller fravæ- I

ret af pStSRIOO-plasmidet vokser meget langsommere end ophavs- I

kulturen χ3306. I

10 I

15 I

20 1 I 35 25 I 30 I DK 175512 B1 I 32

XI

H

H OT

c

H

H t -—· I

-M C CO<MOOO<000 I

ro-r- Ι“(Β(ΜΗΐηΝΟΟΙΛ I

H L· £ r* ri H pH Η Η I

<u —

H

0) o

I ID £ I

H -« ΗΗΟί^ΙββΟ I

et- ........ I

S 00 NNNflrtrlrlN I

I

I

οι α» I

H 4-1 sz OT I

H 0) HririOHrUDt* O ‘ I

em o I

H (OtO NNNHHHHH S I

H r— I

Ό ΟΙ I

I <- c w I

Η <u o jr m I

e — oomoocncoo I

eoo o I

n (VNrtHHOOn I

-p I

OT I

ni < I

s I

. L I

dl «Π5 I

V Q. I

Ji£ N Η I

n) o i i 0) I

Ώ t* O. O. Ό I

c i_ i_ es I

ot o >- u υ i— I

O VO) <D ri · <3 <i o. I

-c c o. α Φ c ·· I

(0>i > ακ η η η η η i_ I

L>+-'4-'>"t-ll1l(l)lD I

lU a>OOO**t-«<DflJ<0a.OT I

jQr-Cr-i-raa>>>> O I

ro aiQ)*f-‘i*>t.oOOOOU I

ae σ> >>ου<·ο<< os I

OT ri r I

c σ> I

φ i I

en ae I

a> -w m I

X« r- I

ot ai o I

J£ Ό I

tt s- + I

> o I

Q) 1 I

ε · ιομλιρνον^ s I

el οηασιηιοιοΦ l I

<0 C ΓΟΓΟΓΟΠΟΟΟΟ φ-r- I

ro +» ooron'i'iiii’i ·>- I

(Λ XXXXXXXXC-μ I

-I O OT I

UJ r~ .Y I

m o « I

< > I

t- id xi I

I 33 I

DK 175512 B1 I

I Virulens af mutantstaroroer over for mus. Indledende informa- I

I tion med hensyn til virulens af mutantstammer blev opnået ved I

I at inficere individuelle mus med enten 103 mutantceller intra- I

I peritonealt eller 108 mutantceller peroralt og registrere mor- I

I 5 biditet og mortalitet. Da χ3395 med cya::TnlO-mutationen og I

I X3396 med crp::TnlO-mutationen tilsyneladende var avirulente, I

I og da mus, som overlevede infektion med den ene eller den an- I

I den blev immune over for udfordring med vildtype x3306-celler I

I blev der foretaget yderligere undersøgelser af virulensen af I

I 10 X3395 og χ3396. Tabel 4 indeholder resultater, som viser at I

I mus overlever infektion med ca. 103 gange LDso'dosen af enten I

I cya::TnlO-mutanten eller crp::Tn-mutanten. Undersøgelser blev I

I derefter igangsat med stammer, hvor TnlO og nærliggende DNA- I

I sekvenser var blevet deleteret. Tabel 5 viser resultater med I

I 15 hensyn til morbiditet og mortalitet hos mus, som var inficeret I

I peroralt med S. typhimurium vildtype, Acya- og Åcrp-stammer. I

I Det er tydeligt, at uafhængigt af musenes alder på infektions- I

I tidspunktet overlever alle mus infektion med 10004000 vildtype I

I LD5o~doser af enhver af mutantstammerne. Informationen i tabel I

I 20 5, som angår avirulens af det pStSR100-he1 bredte derivat I

I X3337, er i overensstemmelse med de mere omhyggelige undersø- I

I gelser, som er vist i eksempel 3. I

I Tabel 6 viser yderligere resultater angående infektion med I

I 25 Acya- og Acya Acrp-stammer χ4060 og χ4062 (plasmidhelbredte) I

I og χ4032 og χ4064 (plasmidholdige), som viser, at mus infice- I

I ret peroralt med 1 χ 108 bakterier vokser i alt væsentligt I lige så godt som mus, som forbliver uinficerede.

I 30 Tabel 7 viser resultater for intraperitoneal udfordring med S.

I typhimurium-mutanter. Mus overlevede infektion med 102 til 103 I gange vildtype LDsg-dosen for de forskellige mutantstammer.

Ved højere doser blev der iagttaget sygdom, som muligvis del- vis skyldes virkninger af endotoksin.

I 35 I 34 DK 175512 B1 ^b Η ® ^β **- υ

^Β Cl -Q

¢) ι— γ- Η αι -C αι α> Ό

^Β Ο) Ό «Λ (Λ C

Η ιο c μ ιη 3

Η Ό 3 '3 3 W

t/> Η ο ^Β Η Η ε σ> Η c

Η 3 Δ - I

^Β .c 4-> σ> I

Η ·* <ο Η Ο £ Ό ^Β ·ν. in in c- t- i CO SO ri -I CJ β H < CO ' CO c Φ in o H ° H ^ . i ^b *“ O φ r~ >—1 m nj ^B c i— h- Q) -r-

^B > V. ιΛ ΙΛ lO

<D <D \ \ \ H o >— Ό csi <m in .

H *“ c- c t- φ Φ CL > >

(- O (U

O r— O) > ^B σι in H ° ^b +* H o x- σι H r-· <0 -r- H C S_ L. l_ I— H i— i_ ro o ο» φ c Η o in σι o σι > Ό 3 3 3 3 in

« r~ E

> < o o to i I υ r-t Q) H »* in ' in ir 1/)--. 3 co σι 3 CM- ΙΛ (Jl oa E -i- u o o o ε

3 C *-r r-t r-t r-t Q

f Ό T3 i- o in χ x x σι

3 Q. -f > I

E "o in w> co r» in i ·> c o , H -C ι-ι Ό CM r-t <M <0 Q. CD Q.

>. C

-Μ -I- +J c

c o ,χ σι . I

Ό r-t c αι

CO o C 3 -P

α o f— o.

M-OPClIUr-l >·(/)© (0 C CO. Q. C ·· Ό U\ H ·<” 10 > > H CO ·<- -r- in > -p p ·· t- +j . i—

Ci— ejo^O“p-incic

Ci(0 <— C 1— (0 Q. σ> Ό > ·— s- «©·»-> u coin

30 QTCJ) >OU -I--D

M - u I- c -1- o d) S o > o. m o σι -i- in c c- C τ- Ι -C Dr

I ΙΟ ΙΛ li) S l_ I

φ o σι σι £ > ' Β —I E ro (O rt -i- T3 Ό B uj e co co co c I co raXXXiBM-3 < +* o. ro in B i- ίο λ xi o

DK 175512 B1 I

35 I

I Λ I

I -o i— i— •σ-ο'αΌΌ'σΌΌ

I. 0) dlflJCCC'CCCCC

I JZ WM33333333 I xj wintowintni/iiDWin

I C 3 3 I

I 3 I

I W I

Ιό

I Φ I

Ι ε I

I w *> I

I 3 0) ·—

I . ε w (o I

I r· I

I u <u ·<- o I

\ \ (O VO ID ID IO ID ID (O ID ID

I at ej « I

I _j ,_ xj (ijIDIDICIOIDICIDIC^

I < S- C I

eo w <u

I > > I

I 4- 0 4) I »3 r-

I σ> I

c »*-

I -r- (O

(_ cio o>d)d>o>fl)d>G)d)d>G)

I (_ niv) σ>σ>σ)θ>σ>σ)σ>σ>σ*σ* I

O T33 33 33333333

I <4~ «— Ε I

xj < Ο0«ιί«ηβ9®^00

I 3 C ' I

Id) ^ I

I I- ε > I

Ισε w I

I t- m 4* I

o ** I ti I

t_ (Λ U) 01

<u i σ> 3 I

D.Q. c u- «Λοο<»σιοοοοσ»σ>σ>σι ' i. *-o oooooooooo c

L ϋ C ^ ri rH Η H r-H «-Ι i—· r-l r-l ri . I

Φ < Ό ^ I

V o (Λ xxxxxx xxxx I S- £_ Ω. -I- 1 Φβ) OW ujO<*>fooo«oiNCJcgo)

r- CO ..... 'T

fll r- l-l X3 CMWrHr-lt-t-rHr-lf-lr-l d) 6) 0. " I w "

ti en J

I o I ° o ‘‘ oo i o = ro ri o er +I + +IIII++ Ό d, o ω ®

-w <J v rT

I -I- CO tft I r~ t—< Q.

I z v . - I o ω Φ ^ H c d) σι ""g OMCMr-lr-* 4-< d) Il I O) 3 I I I I ^ 4- I O-r· Q.Q.O.Q.CD) f_ I_ L. C C 3 Φ ®

+>3 O o o o o. en -O

ide -ud) did) <<<j< in-i-w I 44··- CO. 0. 0. 'Z n

-r- £. ro >, >,>.«-Ιγ400ΓΟΓΟΟΟ·-<·-ι -r- CS

XJQ. >44 44 4J I I I I I I I I 44>.X5 <DO -ΟΌσησσ™®®*0 win I Π 44 r— C i*r- >>>>>>*>> O) Ol d) 0) "r *r- OOOOOOOO C C "·— o· ex σι >><<<<<3<<< -r- φ i— I i » C σ> 44

Ι_ ·γ· C

O (Λ

I i/) I Ί- 1 E

d) [_ T5 d) I

I _J Ed) VOt-IMCSIOOCMCM'*'» 3 X3 C

I yj g £ OOOCOOO<fl(0(DlO(0(D CC

I CD (0 E rtCOOOOOOOOO <03d) I x 443 o. <λ en j_ wc xxxxxxxxxx reuo I DK 175512 B1 I 36 Η η

H

c o

o I

^B +» I

H -d I

^B (0 0)0) CO O CO ΙΛ «Τ CD I

(. O) *1- ........... I

H +> (O C O fO rH o *-· o o I

V> Ό ·<“

^ +l +1 +1 +| +1 a.1 Al I

c .root. *' +l

·>- q co ø co o m «» »i t- σ> I

e +> .....

Μ Ό —r-< 0O O »-1 t-l r-l t-( I

Η 10 εθ) N Η (Μ N tM (M CSJ I

H

H L i- i

ø σ I

^B I

H t- I

0 — 00 CO Ift ID tO CM 4T I

c +j ....... I

0 +· O .T O O T-I O O O O I

Η Ό) σ ·- c I

B s ; j j.

øø <Μοοσ>οο^τι-ισ> I

O *4— Ό ....... I

H CO C*r- O) t* (D O) O) O S) I

H H«4^ T-<i-lrH<-ii-iCMi-) I

vi I

3 I

ε I

c I

3 ^ I

£ Φ I

lit- I

oø^ø I

S O) D ϋ I

H co c >4- t σι co ao co ao o) I

-I r- o H-OOOOOO I

<C C -—' C Η H t-* H ri ιΗ I

£0 Ό -I- I

o ø x x x x x x I

^B 0 Q. -i- ø I

·— Ό 0 JO CO CO 00 00 o I

e co .x - ~ * I

H 0 1-4 Ό -I- r-1 CM 00 00 CO ι-l I

σι I

t—f I

I H I

v 1 I

O) oc o I

3 CO O I

r* i

CO E ir -4- + -4-11+ I

3 CO I

H -c +-> I

10 t- (/) I

o a I

+ Ε I

H w -i- I

^ r I

ft Q. I

> > I

V CM <-· I

«4- oii I

ro «-i a a I

(/) C U L. I

0 0 4— O O I

ø a. +>ø <-·.<< I

>- s- c a c ·· I

H 0 0 (0 P> )— CO r-l CO CO r-t I

ε < >+> ·· t- i i i i I

ε øo · c— øøøø I

qø r- c øa>>>> I

Ό >* 00 >. t_ O O O O I

ØO CCO) 00-0<J<< I

co < I

CO I r— I

ø i- o I

—I E 0 C tn O CM O CM 43- I

u) εε 4-* σ> a> co to to o I

co ro ε c co co o o o σ I

< +> 3 O co CO 4¾ 4f 41 I

4- WC * X X X X X X I

DK 175512 B1 I

η -Μ H

Ό <— C i— C (Jr C r- C

0 0 0 0 0 "D l_ ø ΌΌΦ "04)4 0 c. n oiiiioi ctivi ccoi cnoi

>- -o U)CWC:j-OI/»33'C3(nC

B C 3 T 3 ·Ρ Id o 3 « Kl ,r « 3 ^ «3ε σι V) Η ø σι οι * 3 r- οι 4-> > Η

¢0 ·ι- (Λ I

c re >+- w σι re ε re σ> £_ ΟΙΌ f- CM Γ- CO I CO CM I ΙΟ I (O •r-

Ql i) C (Λ I—I r-l r-f r-t r-l r-l r— C E C Ό 0 •i- ε o o "o L. β O Ό > O4J +* L· l/> O I ' M- Q. +» "D t_ 0 i— c- 3 υ w re o <3 »— w

r™ ^ >r W

re t- > 'v. o I (Ud) did) (O IT) Kl lA KlUlli) ΙβΙΑΚ) IflUlIfl

I C Γ- i— Ό \ \W \SN WN

I Or- (_ c CO O r-1 O til r-l IO Kl O lOCMO Dl I +4 0 dl (U . >» I r X > > « U Dl O dl I dl O r- *·> U cl re I re i *- I L· re i o I 4J > W Ό c o σι 3 o

<] c i+- li) ID »} II) ΙΟ ^ Kl ΙΟ ΤΪΙΛ113 S

-Γ* o οοοσοοοοοοοο

I L. *-* 1· s«' Η Η Η Η Η Η H r*< H tH Η I

I 0) "Ό O

-Ml (_V) tf> XXX XXX XXX XXX +* v*_ cc o -i- v re I dlio M- (fl O O O (Jl O) <J) OOO Φ ID iO f- I Ό O ' - ' - - - ..... d>

ØE 3"D r-l »—I r-l Η Η H rH r-l r-l r-l r-l T-H "O

I σι 3 o re ·- e -dl.

3

O E O E

(O -r- o o I Jl r- Ό 4j cl q:+++i + σι 0 >> (Λ > 4-> 4J 4->

I ·«- . W

r- o. « π (O ΟΙ -l-> I L T3 c O dl Dl I E E 0 CSI ri 4-> σι ι/ι οιι I 0 3 r-l CL Q. 0 £ C t_ C D> +J C O K l> O -I- 03 4JØ 0 i-η <3 <3 r— 4->jc c o. Q. C -0 -ι-l (O >. >1— CO CO «1 0 Ό I ό υ >4-> 4·» ·· c- i i Ό >> -γ-^ øo ό t- re re Q 4-*

.Q CO I— C i— re Q. >> >· "D

t._l 00 -i- > L. OD C

o < ccoi > υ υ <3 <i eø I Σ CO O Dl

WC

I 1 ^ c- i ø c. >

EØ (O in ID CM "S "D "D

lu εεοσιαιοιο c I CO re E CO CO (O O O M- 3 I < *·> 3 (ococo'»'* row v- wc XXX XX re 43 I DK 175512 B1 Η 38

H Effektivitet af immunisering med avirulente mutanter. Tabel 8 I

H viser resultater med hensyn til forskellige S. typhimurium I

I Acya- og Acya Acrp-mutanters evne til at inducere immunitet I

I over for efterfølgende peroral udfordring med 10* gange LD50- I

I 5 doserne af fuldstændigt virulente S. typhimurium SRll-x3306- I

celler. Under disse udfordringer af værste tilfælde udviste I

I mange af musene moderat sygdom med faldende fødeindtagelse, I

I bortset fra mus immuniseret med x4064, som forblev sunde og I

spiste og voksede normalt. Aflivning af alle dyr (selv sådanne I

I 10 immuniseret med χ4064) 30 dage efter udfordring viste spleno- I

megalia og mulighed for at udvinde χ3306 vi 1dtypeudfordrings- I

stamme, men ikke de avirulente Acya- eller Acya Acrp-vaccine- I

stammer. I modsætning hertil blev der ikke iagttaget splenome- I

galia og udvinding af udfordringsstammen, når mus immuniseret I

15 med ca. 1 x 109 x4064 blev udfordret kun med 100 til 1000 I

I LDsg-doser af den fuldstændigt virulente x3306-moderstamme. I

I Vævstrofisme og vedvarenhed af avirulente mutanter in vivo. I

Fig. 1 og 2,viser resultater med hensyn til udvinding af Acya I

20 Acrp-stammen χ4064 sammenlignet med udvinding af den nalidi- I

I xinsyreføl somme vildtypestamme χ3456 (Tn minitet-mærket, se I

tabel 1) som en funktion af tiden efter peroral indpodning. I

I Det er tydeligt at Acya- og Acrp-mutationer ikke signifikant I

svækker evnen hos S. typhimurium til at binde sig til, inva- I

I 25 dere og bevares i de Peyerske plaques, i det mindste i en I

I tidsperiode, som er tilstrækkelig til at inducere beskyttende I

I immunitet (fig. 1}, men svækker evnen til at nå eller overleve I

i milten (fig. 2). I

I 30 I

I i I

35 I

I

39 DK 175512 B1 +, <D i-· t- T—< xj -σι re tj +>+,+>+<+<+> t-tr «-ι Φ m æ to to (tj ra o tn i-4 x: i- t_ t_ i_ t_ £_ +- li Ό ΐιφίιΐιιυοίοο Ό

C TJXJ-D-OTJTJCC 3S

+, (O 3 00000033 3 c tn Eeeeeetnw tn ·" to ε 3 i v 3 ε 3 3 -i- = ε t- o > "1 13 I O) O) o α ε ε <o r- ?- L· -i- 0) ·— Ό X> ^ C +> tft I 40 I I tO ¢0 I I +*

< O- C Ό Ί ^ 'S L

> 0) C Q 0, to +> a m x> e * > s in O · «α <i cn +, ** « Ϊ τη φ 0) -- P- a « w 0 > CC +< φ -r- , ~ y)Xj > x icictceieiOIOtO ~ ,- r— «0) \'S \\XVV\ ® ·*“ E -Γ- <— -η (OiAtO(OU)iO(O<0 _ > 3 > L C £ < •r- I 0) 0) ® +» I- 4-» > > *~ 3 c ο o -S ^ ε <u <- I +:3 t_t.Lt_t-t-t.t- Ό t_ o.t_ l φφφφφφφο) aj-r- σ> I >, -Γ- Φ js rararararararara ε > >< +, > T3 V) 33333333 trt i— *+- 3 V) .3 < (0 ε ^Ο'ίβ'ίΟ'ίβΟ 3 10 +* I tn +- e 0 ® 0 tn t- I ® a> ” ® +, <n v 1 1— * c 0 to to ε ° Φ T-4 ο» to * r— — C cnoieoeuioiffl® I 3X 3 -i— OOOOOOOO <0 1 I L M-t-d) r-tT-Hr-4r-<r-4r-,T-,^-t j_ I -,- cm ο ® ε ej_ t! > '—we xxxxxxxx ra3 ® I (0 Ό -f- (TJ 3 ^ J- I φ w C +, COCOtDCOCMCMCMCM ο ® I Ό e 3 W ........ _ φ w ε 0

I ε 0 0 e t E

c t. !Z « I -Γ- Ό r— . o

Li. o (Uxaj-o I φ ο ο ό ra w +· T-( ® > -r- XJ CC ο Ό (Λ C3 tn ++1111++ «4- * 3+> to CM ε <9 I ε ό tn ° a ε 0 a ra ,- I - b c > ,= i(_ to t_ ra I *·* ® . 0 ^ I +, w W +,

I +»>, CMCMT-»rH >f_ r- JX M- <D

Φ + I I I I — (fl C (0 O) +>w cl a a a 3 0 3 -r- a> t_l_t_t- ε ό cl ra >J0 OOOO eWCO) >r +, φ 4 < < < .p Ό 3 +, +, c a. ^ to ra >, ' «-1 co co co to «-, »-· to +, tu +* Φ >+, iiiitiii rrt-totn

+. φ 0 fljto totototototo rJora-fC

+. -r- ,- C >>>>.>'>'>>* £ l_ C C 0) LU +, 0)0» OOOOOOOO 0)-,-301 I cc ra ·4·4<ι·<^·44·4 '“cll.sc ο ε ® OT -Γ-

00 I O) c ·>- I

I φ L ® <P C t_ I _J £ φ MOJOOOJCsI-si'i Ό 3 0) Ό uj EE nntotooototo E+,c I cq ΐδε oooooooo ο ό e >+ 3 I <f +,3 ro tn Φ w +. tnc xkxxxxxx «jh-oots I DK 175512 B1 Η 40 .

H Genetisk stabilitet af avirulente mutanter. Stammer, som skal H administreres oralt som levende vacciner, skal være fuldstæn- H dig stabile med hensyn til både deres avirulens og deres immU' H nogene egenskaber. Flere af kandidatvaccinestammerne har der- H 5 for været dyrket i L-suppe til sen log-fase med beluftning, koncentreret 50 gange og udpladet i forskellige fortyndinger H på en række minimal agarmedier indeholdende carbonki1 der, som ikke understøtter væksten af modermutanten (tabel 2). Et dob-H belt sæt af plader blev udsat for ultraviolet lys ved en in- H 10 tensitet, som forårsagede 70% celledød. Spontane revertanter/ H mutanter blev iagttaget med lave, men målelige hyppigheder H (tabel 9) hos Acya-stammen χ4032 og med højere hyppigheder hos H Acya-stammen χ4060. Mange af disse revertanter var i stand til H at vokse på de fleste carbonkiIder, og det var derfor sandsyn- H 15 ligt at de var crp*- (Schalte and Postma, J. Bact. 141:751-57 I (1980); Garges and Adhya, Cell 41:745-51 (1985)) eller csm- mutationer (Melton et al., Mol. Gen'l Genet. 182:480-89 (1981)), som muliggør, at CRP aktiverer transkription ved fra- vær af cyklisk AMP. Revertanter/mutanter fra Acya Acrp-stam- H 20 mer, såsom *4064 var særdeles sjældne (tabel 9) og var, selvom de var i stand til at vokse på carbonkilden (dvs. mannitol), hvorpå de blev udvalgt, ude af stand til at vokse på en hvil- ken som helst af de andre carbonki1 der, som den oprindelige stamme var ude af stand til at udnytte (tabel 2). Disse rever- 25 tanter/mutanter har uden tvivl promotormutationer, som forår- H sager transkription af det specifikke gen/operon til at være uafhængigt af CRP. Ultraviolet lysudsættelse forstærkede ikke I mutat i on/revers ion-hyppigheder. 1 30 Seks revertanter/mutanter er blevet bedømt for virulens. Fire I mus blev anvendt til at undersøge hver revertant. En modtog en peroral dosis på 105 celler, en anden en peroral dosis på ca.

I 10® celler, en anden en intraperi toneal dosis på 102 celler og I en anden en intraperitoneal dosis på 105 celler. I alle ti 1 — I 3® fælde bevarede de fire revertanter fra Acya-mutanter og de to revertanter af Acya Acrp-stammer deres ophavs avirulens, da eller 32 mus forblev sunde uden nogen tydelig sygdom. Det ser derfor ud til, at avirulensen af Acya-stammer ikke udelukkende I kan skyldes mangelfuld carbohydratkatabolisme.

41 DK 175512 B1 I

B

(0

CL O B

O TJ ·- ·- _x > 0) ΟΣΟ C Σ. t-

0> O

σι n cl ro to σι υ o- o ro ΙΛ o> o o *->

I. 4- r- 3 OXOO

I ro *— co o I Φ I σ> .x οι I c w

. -r- L

I c o I "DM- rof- I — »*- o. ro o Ό +* r-i I 3 C -r- 0X00

I O O O

I O r- (UV 04 > ro

L

+> *· I

wc·· I r- (U Ό t—

> O 0) I

C -C O

e o σι i— *-< ro oxoo I in +» q s: o

3 O. I

L r- > M

ro ro sz s w

ε ae c I

ro w o w> * *-

tf) O V) O

L· f— O

Q_ "U 0> L· X I- O O I

l <u > w o ε

υ e o> - η- I

< oc ro I

L I

ro ro I

> σ> I

o ro m oo oo I

< I

r- o ro o o

<*_ ro r— r-f O t-i «-« I

roe +> xk-xx r- ε o Σ e- o c c * y~

O -r- <o <m (O

·>- ε +< ro <ro oa ri v q. i t cn

3 o. o. C

EL +> <U L L ·γ· \ <D CO. υ o «— - cl ro>> <<· <—

o 3 > -M B

-1-+4 flj o fl CO CO r-< +4 w r- »- c i i i i o.

i_ 3 rod) ro ro ro ro o α» .x ex σι >.>.>> > o o o o i— φ φ «a < <a <a -f L· -O ^

(V

cl 0) ro ro o σ> +4 L· o c c +4 h ro o c l cc ε ο. Φ QJ CO + 11 +

to υ +4 +4 L

to o o. o.

^B

I O) I

Φ L

_l HID C4 O 04 -et O

ΟΙ εε <010(0(0 t- m ro ε o © o o ε < +J 3 h coc x x x x ro I DK 175512 B1 I 42 H De ovenfor anførte resultater viser konstruktionen af en række derivater af den musevirulente S. typhimurium SRll-stamme X3306, som mangler evnen til at syntetisere adenylatcyklase og det cykliske AMP-receptorprotein, og som har eller ikke har 5 pStSRIOO-virulensplasmidet. Selvom alle stammer er avirulente ad den perorale indpodningsvej, og alle fremkalder et højt niveau af beskyttende immunitet over for efterfølgende udfor- dring med virulente S. typhimurium-vildtypecel ler, foretrækkes χ4062 og χ4064, som indeholder både Acya- og Acrp-mutationer.

10 Anvendelsen af den dobbelte mutant med deletionen af crp-genet udelukker udvinding af crp*-mutationer, som muliggør tran- skription af gener og operoner, som kræver aktivering af CRP- proteinet ved fravær af et hvilket som helst behov for cyklisk AMP. På lignende måde udelukker fraværet af crp-genet også 15 udvinding af cms-suppressormutationer, som er tæt forbundet med crp-genet, og som også kan forebygge behovet for cyklisk AMP. Selvom Acya crp*- eller cms-revertantstammer, som blev undersøgt, forblev avirulente, er nok uafhængige revertantiso- H later ikke blevet undersøgt for virulens til at konkludere, at

20 virulens ikke kunne genoprettes. Acrp-mutationen skulle derfor I

H udelukke sådan genoprettelse af virulens lige meget, hvor I

usandsynlige sådanne ændringer muligvis ville være. Endvidere I

reducerer A-crp::TnlO-mutationen signifikant S. typhimuriums I

virulens (tabel 4) og derfor ville Acrp-mutationen stadig gøre I

25 stammen avirulent ved den usandsynlige hændelse, at Δ-cya-mu- I

tationen blev tabt ved en eller anden type genoverførse 1sbegi - I

I venhed. I

I Vaccinestammen χ4064, som stadig har pStSR100-plasmidet, indu- I

I 30 cerer et højere immunitetsniveau end den plasmidfrie stamme I

X4062 gør (tabel 8). Dette skyldes uden tvivl den forøgede I

evne hos χ4064 (figurerne 1 og 2) og hos plasmidholdige stam- I

mer generelt til at opnå højere titere og bevares længere end I

plasmidfrie stammer i mesenteriske lymfekirtler og milt (se I

35 eksempel 3). På den anden side vil immunisering med χ4064 mu- I

ligvis blive mindre godt tolereret end immunisering med χ4062 I

hos unge dyr eller hos individer, som er underernæret eller på I

anden måde kompromiteret. Med hensyn til dette kunne man immu- I

DK 175512 B1 I

43 I

nisere først med x4062 og derefter med χ4064, hvis det var I

ønskeligt med to immunseringer. I

En hensigtsmæssig anvendelse af vaccinestammer, såsom χ4062 og I

5 χ4064 er at tjene som bærere for målrettet kolonisering eller I

virulensantigener udtrykt af gener fra andre patogener til det I

tarmassocierede lymfevæv for således at inducere en generali- I

seret sekretionsimmunreaktion og humoral og cellulær immuni- I

tet, hvis dette skulle være ønskeligt. Derfor er der blevet I

10 introduceret en række kloningsvektorer ind i χ4062 og χ4064, I

og disse plasmider udviser en stabilitet, som er lig med eller I

større end hos vi 1dtypemoderstammerne. Faktisk forstærker den I

langsommere væksthastighed af χ4062 og χ4064 (tabel 3) uden I

tvivl evnen hos plasmidreplikoner til at holde trit med kromo- I

15 somreplikation for at sikre, at afkomsceller indeholder plas- I

mider. Endvidere er en lang række rekombinante derivater ble- I

vet konstrueret, og det viste sig, at koloniseringsantigenet I

SpaA, som er nødvendigt for kolonisering af S. mutans og S. I

sobrinus på den spytglycoprotein-overtrukne tandoverflade 20 (Curtiss, J. Dent. Res. 65:1034-1045 (1986)), udtrykkes i et højere niveau hos Acya crp-mutanter end hos S. typhimurium-stammer sammen med andre mutationer, som giver avirulens.

EKSEMPEL 2 25

Dette eksempel illusterer, hvorledes Acya Acrp-mutationer kan indføres i andre Salmonella-arter for at gøre nævnte arter avirulente og således egnede som vaccinekomponenter.

I 30 Salmonella-arter, som er egnede til udøvelse af denne udførel- I sesform ifølge opfindelsen, omfatter S. arizona og S. galli- I narum, som aviære Salmonella-stammer. S. choleraesuis som en I porcin-specifik Salmonella, S. dublin som en bovin-specifik I Salmonella og en række S. typhimurium-derivater, som er blevet I 35 isoleret fra kyllinger, kalkuner, kalve, svin og heste. Disse I stammer kan anvendes til at konstruere Acya åcrp-mutanter med | I eller uden virulensplasmider til bedømmelse af beskyttende im- I munitet, først hos mus og derefter i bestemte dyreværtarter.

I DK 175512 B1

Disse avirulente Salmonella-derivater kan også anvendes til at I

konstruere bivalente levende vaccinestammer til stimulering af I

I beskyttende immunitet over for kolonisering og virulensprotei- I

ner hos andre bakteriepatogener. Specifikt kan der fremstilles I

5 vacciner over for B. avium og E. coli, som er to åndedrætspa- I

I togener, der er ansvarlige for høj morbiditet og mortalitet I

I hos fjerkræ, og Streptococcus equi, som forårsager kværke hos I

heste. I

I 10 Konstruktion af avirulente Salmonella-stammer. I

I S. typhimurium LT-2-stammer, som har cya::TnlO eller crp::TnlO I

sammen med A[gal-uvrB]1005-mutationen, som gør en glat eller I

I ru phenotype afhængig af henholdsvis tilstedeværelsen eller I

I 15 fraværet af galactose i kulturmedi urnet, anvendes til at frem- I

I bringe Acya Acrp-genotypen. Transduktion med P22 HT int anven- I

des til at indføre cya::TnlO- og crp::TnlO-mutationer i stam- I

I mer af S. typhimurium, som er opnået fra forskellige værter, I

I og ind i S. typhi. S. paratyphi og andre Salmonella med lig- I

I 20 nende 0 antigener. Den ru-specifikke generaliserede transdu- I

I cerende fag P1L4 anvendes til at indføre TnlO-inducerede muta- I

tioner i S. arizona, S. gallinarum, S. dublin og S. cholerae- I

suis. PlL4-transduktion af Salmonella-arterne, som beskrevet I

ovenfor, nødvendiggør isolering af ru mutanter. Selektion for I

25 2-deoxygalactoseresistens resulterer i galE-mutanter. galE- I

fejlen kan til sidst elimineres ved transduktion med P1L4, som I

er opformeret på en ru mutant med vildtype gal+-genet. I

Stabile deletionsmutanter isoleres ved selektion for fusarsy- I

30 re-resistente derivater af stammer indeholdende cya::TnlO- I

og/eller crp: iTnlb-indsættelsesmutationerne, Fusarsyre-resis- I

tente derivater er tetracyklinsensiti ve på grund af upræcis I

udskæring af transposon- og nærliggende værtskromosomgener. I

Når successiv anvendelse af TnlO ønskes, er det nødvendigt at I

35 fastslå, at fusarsyre-resi stente i sol ater fuldstændigt har I

tabt TnlO, f.eks. ved anvendelse af en λ·. :TnlO-vektor, som en I

hybri di ser ingssonde. I

45 DK 175512 B1

Salmonella-stammer helbredt for virulensplasmidet konstrueres under anvendelse af fremgangsmåder og genetiske værktøjer, som er udviklet for S. typhimurium (se eksemplerne 1 og 3). Tnmini-tet beskrevet af Way et al., (Gene 32:369-79 (1984)) 5 anvendes på dette konstruktionstrin. Dette transposon, som mangler transposase og ikke spontant kan deletere, indsættes i den virulensassocierede region af 100 kb virulensplasmidet, som sandsynligvis er homologe med virulensplasmiderne af S. dublin, S. gallinarum og S. choleraesuis (Popoff et al.,' Ann.

10 Microbiol. (Inst. Pasteur) 135A:389-398 (1984)). Transposon- indsættelserne transduceres ind i de homologe sekvenser af galE-mutanter af disse andre arter. Tnmini-tet-mærkede viru-lensplasmider helbredes ved dyrkning af bakterier i novobiocin, en DNA-gyraseinhibitor, ved forhøjede temperaturer på ca.

I 15 43°C. Helbredelse for virulensplasmider kan verificeres ved I hybridisering af helbredte derivater med 32p-mærket naturligt I forekommende vi ru 1ensp1 asm id.

I Alle konstruerede stammer bedømmes for de genetiske egenska- I 20 bers stabilitet og for at fastslå, at phenotypen, som udvises I hos S. typhimurium-mutanter, udvises hos andre Salmonella-ar- I ter. Et sidste trin for at lette undersøgelser i dyr, er at I indføre en lægemiddelresistensmarkør til at hjælpe med at føl- I ge Salmonella-stammen under dyreforsøg. Sædvanligvis anvendes I 25 resistens over for enten nalidixinsyre eller rifampicin, da I disse resistenser ikke er almindelige i den normale flora hos I mus, kyllinger eller kalkuner.

I Indføring af nogle af de transposoninducerede mutationer i I 30 nogle af Salmonella-arterne ved transdukti on, kan være umu- I ligt. Alternativt kan konjugation muligvis med fordel anven- I des, hvor den transposon-inducerede mutation klones på et I plasmid, som kan mobiliseres fra en Hfr med et integreret I IncF- eller IncP-plasmid i Salmonella. Transformation giver I 35 endnu et yderligere alternativ, hvor trinnene selektion for I rekombination af sekvensen ind i kromosomet, eliminering af I plasmidet og verifikation af den præcise genetiske læsion fo- I retages.

I DK 175512 B1

I 46 I

I Bedømmelse af i mmunogen -i c i tet, koloniser i ng oa vedvarenhed. I

I De ovenfor konstruerede avirulente Salmonella-stammer kan be- I

I dømmes hos mus under anvendelse af peroral indpodning, gas- I

I 5 trisk intubation eller intraperitoneal injektion. I

I Fremgangsmåden initieres ved at dyrke Salmonella-stammer til I

logfase og koncentrere dem til næsten 10l° celler/ml i en puf- I

I ret saltopløsning med gelatine. Oyr, som skal indpodes per- I

I 10 oralt eller ved gastrisk intubation, fratages føde og vand i 4 I

I timer før indpodning. Natriumbicarbonat indgives til mus 5 mi- I

I nutter før indpodningen for at neutralisere mavesurhed. Føde I

I og vand tilbagegives til musene 30 minutter efter indpodning. I

I Baseret på tidligere forsøg med disse mutantstammer af S. typ- I

I 15 himurium hos mus, er udfordringer hos mus, sædvanligvis med I

I 103 L05()-doser. Dette er muligvis ikke praktisk, hvis vildty- I

I pen af de forskellige Salmonella-arter ikke har LDsg-værdier I

I så høje som allerede iagttaget for den musevirulente S. typhi- I

I murium. Dette udgør mere af et problem for den perorale ind- I

I 20 podningsvej, da administration af mere end 10® organismer er I

I vanskelig. I ntraperi tonea 1e indpodninger kan også udføres ved I

I doser på op til niveauet, som ville resultere i endotoksisk I

I chok (ca. 107 celler). Vægten og sundhedstilstanden hos dyr I

I iagttages i en måned. I

I 25 I

I Mus indpodet med den mutant-Salmonella-stammen, som overlever I

I i 30 dage, udfordres med 103 LDgø'er af den virulente Salmo- I

nel 1a-moderstamme ad den perorale eller interperitoneale vej. I

De inficerede dyrs sundhedstilstand følges dagligt med perio- I

30 disk bedømmelse for væksthastighed. Før udfordring er der ud- I

taget spytprøver ved pilocarpinstimuler ing, og hvert dyr blød- I

te til opsamling af serum. Kvantitative titere af sekretions- I

IgA og -IgG i spyt og af IgA og IgG i serum over for Salmonel- I

la-overfladeantigener bestemmes. Virkningen af sekundær immu- I

35 nisering på antistoftitere og på vedvarenhed af immunitet an- I

føres også. I

Vaccinestammer, som er avirulente, inducerer en høj immuni- I

tetsgrad og ikke i ugunstig retning påvirker vægtforøgelse, I

DK 175512 B1 47 anvendes til at bestemme de kvantitative titere af stammen, som er forbundet til væggene i tyndtarmen og colon, og til stede i Peyerske plaques, indholdet i tyndtarmen og colon, de mesenteriske lymfekirtler og i milten efter 4, 24, 48, 72 og 5 96 timer og i ugentlige intervaller derefter, hvis dette skul le være nødvendigt. Denne information korreleres med opnåede immunreaktionsresultater.

Stammer, som er avirulente og immunogene i mus, undersøges 10 derefter i passende dyrearter, f.eks. S. arizona-, S. gallina-rum- og aviære S. typhi mur ium-stammer i kyllinger og kalkun-kyllinger. Efter bedømmelse af avirulens og immunogenicitet i aviær værter, bestemmes titere af virulente Salmonella i kroen, ceacum og Bursa Fabricii ud over vævene undersøgt hos mus.

15

Konstruktion og undersøgelse af bivalente vaccinestammer til immunisering over for Bordetalla avium.

Vacciner over for B. avium skulle udtrykke de overfladestruk-20 turer, som er involverede i kolonisering og de antigene, men ikke toksiske determinanter af dermonekroti sk toksin. Vacciner over for overfladeproteiner bør. frembringe immunitet ved at blokere kolonisering af luftrøret, mens antistoffer over for dermonekrotisk toksin bør neutralisere dets ugunstige virknin-25 ger. Selvom B. avium-overfladestrukturer, som er involveret i kolonisering, ikke er kendte, muliggør tilgængeligheden af genbiblioteker af B. avium i Xgtll-ekspressionsvektorer og transposon-inducerede B. avium-mutanter isolering og identifikation af gener, som koder for overfladeproteinerne. Ved ind-30 førsel af de rekombinante plasmider, indeholdende gener for overf ladeproteiner og/eller dermonekroti ske toksindeterminanter i en avirulent Salmonella, kan man udvælge en bivalent stamme, som inducerer beskyttende immunitet ved at forhindre kolonisering (og således identificere gener, som er involveret 35 i kolonisering) eller ved at neutralisere toksin.

Generne for B. avium-ydermembranproteiner og/eller dermonekrotisk toksin overføres til passende avirulente S. arizona-, S.

I DK 175512 B1

I 46 I

gallinarum- og/eller S. typhiraurium-derivater via transforms- I

tion ifølge den af Curtiss beskrevne fremgangsmåde (Manual of I

I Meth. in Bacteriol., ASM. Washington, O.C. (1981)), og eks- I

I pression af disse proteiner undersøges under anvendelse af I

I 5 Western-aftryksmetoder (Towbin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. I

I (USA) 76:4350-54 (1979)). Et 5 minutters varmechok ved 50°C I

I før transformation vil blive anvendt til at overkomme en hvil- I

ken som helst restriktionsbarriere i Salmonella. Tidligere I

rapporter har vist, at Bordetel1a-gener ikke udtrykkes effek- I

I 10 tivt i E. coli, med mindre de transkriberes fra en E. coli- I

I promotor. Sådanne problemer med ekspression af B. avium-gener I

og translokation af proteinerne til den ydre membran af Salmo- I

H nella elimineres ved anvendelse af en rekombinant vektor, I

hvori genet vil blive sammensluttet til E. coli lamB- eller I

I 15 ompA-genet. Endvidere ville B. avium-proteiner translokere til I

I den ydre membran af Salmonella og forstærke sandsynligheden I

for stimulering af en stærk immunreaktion, så snart den biva- I

I lente vaccinestamme koloniserer de Peyerske plaques. Når B. I

I avium-gener er indsat i Salmonella, analyseres de rekombinante I

I 20 kloner for ekspression af generne ved koloniimmunoaftryk under I

I anvendelse af specifik antistof- og elektronmikroskopi af im- I

I munomærket Salmonella, som beskrevet af Chorbit et al., EMBO I

I J. 5:3029-37. ( 1986) . I

25 En til tre dage gamle kyllinger immuniseres peroralt med den I

I bivalente vaccine, og serum- og respirationssekreter overvåges I

I til bestemmelse af typen [IgY (IgG, 7S Ig), IgM og IgA (IgB)] I

I og mængden af antistofreaktionen. Immuniserede og ikke-immuni- I

I serede kyllinger sammenlignes med hensyn til vægttab for at I

I 30 overvåge mulige bivirkninger ved den bivalente vaccine. Endvi- I

I dere udfordres kalkunkyllinger ved intranasal indpodning med I

109 virulent B. avium eller ved udsættelse for inficerede fug- I

I le. Udfordrede kalkunkyllinger observeres for sygdom, obduce- I

res og undersøges for tracheal vævsbeskadigelse og ændringer I

35 i titerne i organismen. I

Hvis en mucosal immunreaktion over for B. avium er utilstræk- I

kelig til at beskytte meget unge kyllinger og kalkuner, kan I

DK 175512 B1 I

avlshøns immuniseres med avirulent Salmonella, som udtrykker I

B. avium-koloniserings- og/eller virulensantigener til mulig- I

gørelse af ægoverførsel af moderantistoffer. En sådan behand- ling ville øge immunitet over for B. avium, mens de unge kyl-

5 linger eller kalkunkyllinger udvikles. En beskyttende peroral I

immunisering under anvendelse af den samme rekombinante bærer

kan også indgives under udvikling. I

Konstruktion og undersøgelse af bivalente vaccinestammer til I

10 immunisering over for aviær E. coli I

Rekombinante kloner, som bibringer avirulent E. coli forøget I

virulens eller evnen til at kolonisere luftsække hos kyllin- I

ger, introduceres i avirulente stammer af S. gallinarum og/el- I

I 15 ler S. typhimurium ved hjælp af de ovenfor beskrevne metoder.

I Ekspressionen af virulens-determinanter på Salmohella-celle- I overfladen bestemmes ved fluorescensantistof teknik, men det I bør bemærkes, at E. col i-cel 1eoverf1adedeterminanter sandsyn- I ligvis vil blive udtrykt på overfladen af Salmonella.

I 20 I Kyllinger immuniseres peroralt med den bivalente vaccinestamme I og udfordres ved injektion af virulent E. coli i den kaudale I luftsæk. Hvis septicaemia ikke udvikles obduceres fugle til be- I stemme Ise af, om evnen til at kolonisere luftsækken er blevet I 25 påvirket. Derefter udføres en omfattende undersøgelse af ty- I perne, mængden og varigheden af antistof reaktionen i ånde- I drætssekreterne og serum, som beskrevet ovenfor for kalkunkyl- I linger.

I 30 Teknikker til vaccineadministration og bedømmelse er de samme, I som tidligere beskrevet for B. avium-vaccinen.

I Konstruktion og undersøgelse af bivalente vaccinestammer til I bibringelse af immunitet over for Streptococcus equi.

I 35 I Avirulente derivater af S. typhimurium, som udtrykker S. equi I M-proteinet, er blevet konstrueret.

I DK 175512 B1 I 50

DNase I- frembragte tilfældige fragmenter af S. equ i M-protein- I

genet klonedes ind i en Agtll-ekspressionsvektor. Biblioteket I

screenes sekventielt med antiserum over for M-proteinf ragmen- I

I terne, som fremkalder beskyttende immunitet og antiserum over I

I 5 for M-proteindeterminanterne, som er til stede i immunkomplek- I

serne hos heste med purpura-hæmorrhagica. Klonede gener, som I

udtrykker de beskyttende, men ikke purpuragene determinanter I

I udvælges for fusion til enten lamB- eller ompA-genet. Immunre- I

aktionen over for avirulent Salmonella, som bærer sådanne de- I

10 terminanter, undersøges først i mus og derefter i ponyer eller I

I heste. I

Tilgængeligheden af den beskrevne Salmonella-stamme, som på I

I dens overflade udtrykker de relevante epitoper af M-proteinet I

I 15 af S. equi, udgør en meget effektiv måde til stimulering af I

I mucosal nasopharyngealbeskyttende immunreaktion over for kvær- I

ke hos hesten. Dissektionen af de purpuragene determinanter I

I fra M-proteinet bidrager til vaccinens ufarlighed. I

I 20 EKSEMPEL 3 I

I Dette eksempel illustrerer virkningen af vi ru lenspi asmidde1e- I

I tion på immunogeniciteten og virulensen hos flere Salmonella- I

stammer. I

I 25 I

I Bakteriestammer I

De i dette eksempel anvendte bakteriestammer er anført i tabel I

I 10 sammen med plasmidbeskrivelser. Dér blev anvendt tre linier I

I 30 af S. typhimurium-stammer: muse-gennemførte virulente stammer I

I SR-ll og SL1344 og den mindre virulente stamme LT2. Escheri- I

I chia coli HB101 og C600 blev anvendt i genetiske manipulatio- I

I ner. I

I 35 I

DK 175512 B1 I

51 I

Kulturmedier og vækstbetingelser. I

Med mindre andet er anført blev bakterier dyrket i L-suppe el- I

ler på L-agarplader (Lennox, Virology 1:190-206 (1955)), som I

5 var suppleret med passende antibiotika i de følgende koncen- I

trationer (pg/ml)rampici11 in (Amp) - 100-200, tetracyklin I

(Tet) - 12,5-25, chloramphenicol (Chl) - 30, kanamycin (Kan) - I

I 50, streptomycin (Str) - 50, og nalidixinsyre (Nal) - 50. Til I

I vedhæftning, invasion og makrofagi nfektion blev nogle kulturer I

I 10 dyrket i Brain Heart Infusion broth (Oifco, Detroit), da dette I

I medium forøgede bakterievedhsftning til de anvendte pattedyrs- I

I celler. Alle kulturer blev dyrket natten over ved 37eC i sta- I

I tiske supper af det passende medium og blev subdyrket i ryste- I

I supper indtil sen logaritmisk vækstfase (ODgoo ca- 0,4-0,7). I

I 15 I

I Genetisk udveksling. Transformation blev udført ved anvendelse I

I af metoden beskrevet af Bagdasarian og Timmis (Curr. Top. Mi- I

I crobiol. Immunol. 96:47-67 (1981)). Fag P22 HT int-medieret I

I transduktion blev udført som beskrevet af Schmeiger (Mol. I

I 20 Gen'l Genet. 119:75-88 (1972)). Konjugationer blev udført en- I

ten ved pladeparringer eller fi 1terparri nger (Willetts, Meth- I

I in Microbiol. 17:33-58 (1984)). I

I 25 I 1 I 35 30 ^^1 I I i .. ! 52 DK 175512 B1

I I 2 Ϊ § t S 1 S

S „ 3 " ^ «8 9 » « o A n n' '-i <o in c r£ α .3 ·« ti .o · n u u 3 ® H jj >=ί· E 3 U V-i QJ N £ .^s^xJ-HroSOiLU· >l 3 ,n

^B X J] U) ro Ή I <D CD V lD

H w'SoC-raJ-KiSo- A o 5oS^ ® ^ ·§ i? m u . jj n ^>oiEc-^u-i-HCpH 1-1 U-l H H * H Ol "H Ϊ , 3 « ^ Dl I <4-1 TJ S Λ I s SH 2 2 ϋ = S m s| ϊ I ·| Ϊ i

I φ 7 ^ I 4J ·« ^ § = i! 4J - g S I

I > 2 e I u J, S S ? t N

U 5 * S i 4 ® 0 ^ S 2 'rt· 8 ! 9 1 W c-ι r Ή & Di J 3 -H ' r·» *ti ^ 7? ^B Φ ^ ^ ° rp ' in .5 Ji ιο ·* H m r‘,_5 » ° j, <44 jj Κω uov--H oj-ir- U V -$$ £ «j W Ό υιΗ(ϋΟ r H to 7 £ C -Ϊ B tu ; g Φίϋ^ΟΜ^,πί-ί-Ηίί ®OnJcSii

I ^ »s^wii I

^B

Di U O

g Ss C

Hl UH

H n ^B jj vo ro in vo τ'

u CO

H

I Ιέ in

In» 8 C

P3 5< i—i o ir Λ υ H o a ^B I C L| ta φ > ci1 o O 5 ^| pH + pH £0

J JO I

I w 2 5 < g* 2 g ' <0 vo

S >h >-l ro· ty, JZ JJ

I H VS LoSrf CO CO

JL ri i»d ^ <; _ι _j I 2u ^J,to < c r* >: tn>,io >, 7 >. W si XIr £| £1

o H

m <8 i—i

Qi O O —t O O

. Λ S o o o o Η «Ο H pH H _y

I ^ J J 1 J 1 ® EC I

I oridS 2 «s I s a a a a a.

I ε B O tv t-* rs. . in B ΟΟ^ΤιίΜίρ. IT S £ 3ΟΜΓ0Π rp 2 2 2 I ε η η ο n S in 8 3 I I tx x x x X k χ x I s a? B 4-1 04 rn · Jj T; I J W J C£

J W

O 53_ DK 175512 B1 I

3 * S § § I

2 ϊ g 3 S I

g -5 q* 2 u I

S m ^ « I

Z S ίο o\ <u

4JmSt5u ΓΟ -U tø jJ

8 S 5 g £ S ^ IC I

la^iSrc C * - > u

Ic^jjOu Χ|ο·η

Sne αι -H i> E g; Jj H

|.IS JJ4JQI N |(^ m

JjH w3 UOfi®0 Ό ^ i rfj -πω^Λί^Ηΐ i

^CcOCfOOOjj'nJC-HW

^EuHUJJHWslE'PZ

1 c ij J -U -c J £ .¾ c -5 1-1— rnCQH-M ®WQ 6 1--¾

^^Hjjonoocuoiiimjg'jS "? I

I 5 I

^ I

ΐ « ϊ 1 I nj »· c jj

CO Ή E

4J J OT

I U A. ~

In ~ ΙΛ

0 «. r-t I

Ή ,Η X r-l I w > O > I U 10 x

I O *$ J

I ι-t ^ o

I fli ΓΜ nj --V

I vj α 3 < J I

I M S„ itf O 0) CQ

I S 5 C U Qi E

I So· o oj u( I S c ^ Γ ,¾ » id ro m

^ ID 03 ^-t U

£0 3 < *-» I 3 οι υ Λ

QI r—i QI O

I i—I iJ ΓΊ

I ·» W

I 1)1 Ol O o «. 'ί ~ Ό

I oil tul in w >h ih M

I φ ·Η j ΉI ·Η ·Η I t -C

I <-· _c| .cl .c .c U .2 I 2 *· v 5 m « n h I < j| j| j o i * i I u to ro w ® .*' *d ,* i! I X . oj d ell di 1 J3 l <T3 -J3 I uiijlujui tu u b σι ai Ιό

I »H

C

ή I 10 I Q H rj O O ej

O O O O O

O rH Ή <—4 I—i y o: os j j i os C/J w to co to

O AJ 4J 0J JJ JJ

I o w V? <ώ Φ <Ώ I-I Qi di Di Qi Qi I ni CO Ό nj cd O ή Ϊ to m c rt c in pro ’T orororo

Ero ro ro ro ro <o I ί >( x ^xxx I «Ϊ ° ri ^ u g ro rsi r—i

I i—i ι-H CQ

j ω| « s I DK 175512 B1 DNA-manipulationer. Der blev udført minilysatplasmidekstrak- H tioner i stor målestok og hurtigt under anvendelse af metoden beskrevet af Birnboim (Meth Enzymol. 100:243-255 (1983)). Cæ- H siumchloriddensitetsgradientcentri fuger i ng, Southern-aftryks- 5 hybridisering, koloniaftrykshybridisering og gelelektroforese, blev udført under anvendelse af standardfremgangsmåder. Hak- translation af DNA med [γ ~32p]Ajp (Amersham, Arlington H Heights, 111.; specifik aktivitet = 1445 Ci/mmol) var med the

Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md. (BRL) udstyr H 10 ifølge instruktionerne fra fabrikanten. Restriktionsenzymfor- døjeiser var med enzymer fra BRL ifølge instruktionerne fra fabrikanten.

Mærkning af S. typhimurium 100 kb plasmid med Tnmini-tet, 15 Stamme χ3000 indeholdende pStLTlOO blev transformeret med pNK861, som har Tnmini-tet (Way et al., Gene 32:369-79

(1984)). Tnmini-tet er i alt væsentligt TetR-genet fra TnlO

inden i inveterede gentagelser. pNK861 blev udelukket fra bib- I lioteket af AmpR, TetR χ3000 (pStLTlOO, pNK861) ved mobilise- 20 ring i det inkompatible plasmid pNK259 fra x3000(pNK259,F::Tn5) under anvendelse af F::Tn5. Til udvælgel- I se for Tnmini-tet-indsættelser ind i 100 kb plasmidet, som er mobi1iserbart ved F, blev χ3000::Tnmini-tet (pNK259, I F::Tn5)-biblioteket parret med E. coli H8101 udvalgt for TetR, I 25 KanR og StrR. Potentielle Tnmini-tet-mærkede 100 kb plasmider I i HB101 blev mobiliseret tilbage ind i S. typhimurium-stamme I X3147 ved udvælgelse for TetR og NalR. Flere NalR-, TetR-, I Kans“isolater, som ikke havde F::Tn5, blev udsøgt.

I 30 Tnmini-tet-indsættelser i 100 kb plasmidet blev transduceret ind i hver af de 100 kb-holdige vildtype-S. typhimurium-stam- I mer ved fag P22 HT int-forroidlet transduktion. TetR~transc*u*c' I tanter blev screenet for forøget størrelse af 100 kb plasmidet I og ændring i restriktionsenzymprofilen sammenlignet med den 35 hos moderplasmidet.

I En alternativ fremgangsmåde til isolering af pStLTlOO::Tnmini- tet-indsættelser var at opnå plasmid-DNA fra χ3000(pStLTlOO, 55 DK 175512 B1 pNK861) og transformere E. coli HB101(pNK259), idet der udvælges for Tet^ og Chl^.

Helbredelse af S. typhi murium for det Tnmini-tet-mærket 100 kb 5 plasmid. S. typhimurium-stammer med Tnmini-tet-i ndsæt teiser i 100 kb plasmidet blev underkastet to helbredelsessystemer -vækst ved 43°C eller vækst i suppe indeholdende novobiocin. Tnminitet-mærkede stammer blev overført dagiig med lave podemængder (103-104 kolonidannende enheder [CFU]) for hver af 10 helbredelsessystemerne. Når kulturerne havde nået stationær fase (ODgoo ca. 0.9), blev en portion fortyndet og udpladet på L-agar indeholdende fusarsyre. Fusarsyre-resistente kolonier blev screenet for Tets, og plasmidindhold af fusarsyre-re-sistent, Tets-ko1 on i er blev undersøgt ved anvendelse af mini-15 1ysatana1yse. Helbredte derivater blev yderligere undersøgt ved Southern-aftrykshybridisering af minilysater og koloniaf-trykshybridisering af bakterieceller med 32p-mærket pStSRIOO til bekræftelse på helbredelse og mangel af et kromosomalt integreret plasmid.

20

Musei nfekt i oner. 7-10 uger gamle BALB/c-hunmus (Harlan Spra- gue/Dawley [Indianapolis] og Sasco [St. Louis]) blev anvendt til alle dyre i nfekti oner . Ældre mus blev anvendt til opnåelse af peritoneale makrofager. Normalt museserum blev opnået fra 25 hanmus med forskellig alder.

Til p.o.-indpodning blev mus holdt uden foder og vand i 6 timer, derefter fodret 50 μΐ 10% (vægt/vol) natriumbicarbonat efterfulgt af 20 ml bakterier, som var suspenderet i pufret 30 saltopløsning indeholdende 0,1% (vægt/vol) gelatine (BSG).

Peroral indpodning var med en mikropipettespids anbragt direkte bag ved incisiverne for at undgå beskadigelse af den orale mucosa. Musene blev fodret med doder og vand 30 minutter efter 35 indpodning.

Til i.p. indpodning og lateral halevenei.ntravenøs (i.v.) indpodning blev ikke-fastende mus injiceret med 0,1-0,2 ml bakterier, som var suspenderet i BSG.

I DK 175512 B1 I

I 56

Organer og væv fra inficerede mus blev undersøgt for tilstede- værelse af Salmonella på følgende måde. Mus blev aflivet ved C02~kvælning. Milte blev aseptisk fjernet og homogeniseret i 5 ml 8SG i enten en OMNI-blander, udstyret med en mikroskål 5 (Dupont, Wilmington, Del.) eller en gi asvævshomogen isator.

Peyerske plaques blev fjernet fra tyndtarme og vasket to gange ved hvirvlen i BSG. Skyllede Peyerske plaques blev homogeni- seret i 2,5 ml BSG i enten en OMNI-blander eller ved hvirvlen I i glasrør indeholdende glaskugler. Mesenteriske lymfekirtler 10 blev homogeniseret i 2,5 ml BSG i gi asvævshomogeni satorer.

Fortyndinger af vævs- og organhomogenater blev udpladet på L- I

agarplader indeholdende passende antibiotika. I

Statistiske metoder. Til sammenligning af CFU i væv hos mus, I

15 som var inficeret med enten vildtype- eller helbredt S. typhi- I

murium, blev geometriske gennemsnit bestemt og sammenlignet i I

1-halet Student's t test for vildtype-CFU værende større end I

I helbredt CFU. Til analyse af blandede infektioner blev geome- I

triske gennemsnit af forhold mellem vildtype- og plasmid-hel- I

20 bredt CFU fra individuelle mus sammenlignet i en 1-halet Stu- I

I dent's t test for gennemsnit af log^g af forhold større end 0 I

(forhold større end 1). Muse-LDso~værdier blev bestemt ved me- I

toden beskrevet af Reed and Muench (Amer. J. Hyg. 27:493-497 I

I (1938)). Bakterie-CFU i vævskultur og makrofagi nfektioner blev I

25 sammenlignet ved Student's t test af gennemsnit CFU/brønd i en 1 I 2-halet test. I 1

Tilstedeværelse af 100 kb plasmider i S. typhi mur ium-stammer. I

I Alle tre undersøgte S. typhimurium-stammer havde 100 kb plas- I

I 30 mider (fig. 3). Endvidere havde χ3339 to andre plasmider på 90 I

kb og 8 kb. Det følgende trepartsnomenklatursystem for 100 kb I

I plasmider af S. typhimurium-stammer blev anvendt ved denne I

I undersøgelse. For at identificere serotypen som S. typhimuri- I

I um blev betegnelsen "St” indbefattet. Stammebetegnelsen ("LT" I

I 35 for LT2, "SR" for SR-11 og "SL" for SL1344) følger. En nuroe- I

I risk betegnelse identificerer til sidst plasmidet soro værende I

I vi 1dtype (100) eller et derivat (100 for en bestemt Tnmini- I

I tet-indsættelse, osv.). Vi ldtypeplasroidet af stamme SR-11 er I

DK 175512 B1 I

57 I

derfor pStSRlOO. Oprensede plasmidpræparater blev analyseret I

ved restriktionsenzymfordøjelse, og der blev opnået identiske I

profiler for 100 kb plasmiderne fra alle tre stammer med I

Hindlll (fig. 4) og EcoRI (data ikke vist). Restriktionsenzym- I

5 fordøjelse af 100 kb plasmid-helbredt SL1344, x3340, (fig. 4, I

bane f), viste tab af båndene, som svarer til båndene fra I

pStLTlOO (fig. 4, bane b) og pStSRlOO (fig. 4, bane c), som I

var til stede i x3339 (bane e). Derfor lignede 100 kb plasmi- I

derne fra hver af de tre S. typhimurium-stammer, som blev un- I

I 10 dersøgt i disse undersøgelser, hinanden meget, hvis de ikke I

I var identiske. I

I Stammekonstruktion. Transposone Tnmini-tet, som er beskrevet I

I af Way et al. (supra) blev anvendt til at mærke 100 kb plasmi- I

I 15 der med en Tet-resistensmarkør. Tnmini-tet, et TnlO-derivat, I

I har ikke ISlOR-transposasegenet inden i de inveterede genta- I

I gelser, da transposasegenet tabes ved transposition fra donor- I

I plasmidet, pNK861, og kan følgende ikke formidle transposition I

I eller deletion af Tnmini-tet. Derfor er Tnmini-tet-indsættel- I

I 20 serne meget mere stabile end de hos ophavet TnlO. I 1

En Tnmini-tet-indsættelse ind i 100 kb plasmidet fra stamme I

I χ3000, resulterende i pStLTlOl, muliggjorde selektion af deri- I

I vater helbredt for 100 kb plasmidet med en hyppighed på 10“® I

I 25 til 10-7 celle-1 generation"2 efter vækst i novobiocin eller I vækst ved 43eC, hvilket gav *3344. Denne samme Tnmini-tet-ind- I sættelse blev derefter transduceret ind i χ3339 og χ3306 og I blev anvendt til at helbrede disse stammer for deres 100 kb I plasmider, hvilket henholdsvis gav x3340 og χ3337. χ3340 be- I 30 varede 90 kb og 8 kb plasmiderne (fig. 3, bane h). Helbredelse I for 100 kb plasmiderne blev bekræftet ved gelelektroforese af I plasmid-ONA fra clearede lysater (fig. 3) og hybridisering af I minilysater i Southern-aftryk og lyserede bakterier i koloni- I aftryk med 32P-mærket pStSRlOO (resultater ikke vist). Hybri- 35 diseringsmangel i koloniaftryk hos de helbredte derivater vis- I te, at der ikke var noget kromosomalt integreret plasmid til I stede. Der blev ikke iagttaget nogen, plasmid-helbredte deri- I vater, som havde integrerede plasmider.

2 I DK 175512 B1 I 58

Tnmi ni-tet-mærkede plasm i der af χ3000, pStLTlOl, og χ3306,

pStSRIOl blev genintroduceret i helbredte derivater ved trans- I

formation, hvilket henholdsvis gav χ3347 og χ3338. pStSRIOl I

I blev transformeret ind i χ3340, hvilket gav χ3351 (tabel 3,

5 fig. 3, bane i). I

I Musevirulens. p.o. LDsø'er i BALB/c-mus for hver af vildty- I

pe-, helbredte og gentransformerede derivater blev bestemt I

H (tabel 11). p.o. LDsg'er for de muse-gennemførte χ3306 og I

I 10 χ3339 var henholdsvis 3xl05 CFU og 6xl04 CFU, og p.o. LD50 for I

I X3000 var > 10® CFU. p.o. LOso'er for de respektive helbredte I

I derivater var > 108 CFU. Mus inficeret med χ3337 og χ3340 blév I

syge, og der blev iagttaget dødsfald nu og da. LDso'er for de I

100 kb plasmid-gentransformerede derivater vendte tilbage til I

15 de for viIdtypeophavsstammerne. Dette bekræftede, at den gene- I

I tisk læsion af helbredte derivater faktisk var tab af 100 kb I

plasmidet. I

I 20 I

I 25 I

I 30 i 1

35 I

59 I

DK 175512 B1 I

TABEL 11. Muse-LDso-værdier® (CFU) for vildtype- og 100 kb I

plasmid-helbredt S. typhimurium I

5 _ I

Stamme 100 kb plasmid p.o. i.p, I

SR-lls I

X3306 + 3x10® <50 I

10 X3337 - >108 <50b I

χ333β + 10® <50 I

SL1344: I

X3339 + 6xl04 <50 I

I X3340 >6x10® 400 I

I 15 X3351 + <5xi04 <50 I

I LT2-Z: I

I X3000 + >10® 2xl03 I

I X3344 NTC 2xl03 I

I χ3 3 47 ♦ >109 NT I

I 20 _;_ I

aBestemt ved metoden beskrevet af Reed og Meunsch (supra) I ^Gennemsnit)ig tidsrum indtil død for χ3337 (12,3 dage) større I end det for χ3306 (7,0 dage) (p<0,001 Student's t test).

I 25 CNT - ikke undersøgt I I.p. LD5o'er for vildtype- og helbredte derivater var ikke så I forskellige som p.o. LDso'er var (tabel 11). I.p. LDso'er for I χ3306 og χ3339 var <50 CFU med lOOVs mortalitet opnået med I 30 hver af disse podemængder. Det helbredte derivat af χ3306, I x3337, dræbte også de fleste mus injiceret med mindre end 50 I CFU. Det gennemsnitlige tidsrum indtil død var imidlertid I større for 3337 (12,3 dage) i forhold til x3306 (7,0 dage) I (p<0,001, 1 halet Student's test). I modsætning hertil steg I 35 i.p. LD50 for 100 kb plasmid-helbredt SL1344, χ3340, til 400 CFU fra <50 CFU. Denne genindførsel af det Tmini-tet-mærkede I 100 kb plasmid i χ3340 genoprettede vildtype i.p. LD50· Ι·Ρ· L050'er for vildtype- og helbredte LT2-stammer var hver ca.

I 2000 CFU.

I DK 175512 B1 I

I 60 virkninger af plasmidudvekslinq mellem stammerne 5R-11 og LT2.

Stamme LT2 var meget mindre virulent end stamme SR-11 ad den p.o. vej (tabel 11). For at bestemme om 100 kb plasmiderne fra disse to stammer havde indflydelse på denne forskel i viru- 5 lens, blev Tnmini-tet-derivaterne af hver af 100 kb plasmider- ne transformeret ind i de heterologt helbredte stammer. Mus inficeret p.o. med 109 CFU af stamme SR-11 besiddende enten pStLTlOl eller pStSRIOl døde 7 dage efter indpodning, mens stamme LT2 var avirulent (p.o. podestof 109 CFU) med det ene 10 eller det andet plasmid. Derfor skyldes avirulensen hos stamme

H LT2 ikke mangler i dens 100 kb plasmid. Dette resultat sammen I

H med det, der blev opnået ved introduktion af SR-ll-plasmidet, I

I pStSRIOl, i stamme SL1344, hvilket gav virulent x3351 (tabel I

I 11), viste at 100 kb plasmiderne fra disse tre stammer var I

I 15 funktionelt ækvivalente. I

I Patogenese efter p.o. indpodning. De mere tydelige forskelle I

I i virulens mellem vildtype- og helbredte derivater ad p.o. ve- I

jen versus i.p. vejen, frembragte den mulighed, at 100 kb I

I 20 plasmidet var involveret i virulens i tarmen i stedet for un- I

der senere trin af invasionssygdom. For at undersøge denne I

mulighed blev mus inficeret p.o. med enten vildtype-SR-11, I

χ3306 eller 100 kb plasmid-helbredt SR-11, χ3337 og Peyerske I

plaques og milte undersøgt for S. typhimurium på forskellige I

25 tidspunkter efter infektion. De samlede resultater af tre I

forsøg er vist i fig. 5. Tre timer efter infektion blev meget I

få S. typhimurium påvist i Peyerske plaques (<100 CFU). Dette I

var ikke resultatet af utilstrækkelig overførsel af podestof- I

fer fra mundhulen til tarmene, da i alt væsentligt 100% af po- I

30 destofferne blev udvundet fra tarmen, primært indhold i tyk- I

tarm, i løbet af 2 timer efter indpodning. Endvidere var CFU i I

tyndtarmindholdet lige stort mellem vildtype- og helbredt I

SR-11 i op til 3 dage efter indpodning. 1 og 2 dage efter ind- I

podning steg CFU i Peyerske plaques gradvist til 103 til 10* I

35 CFU, og CFU i milte forblev lavt. Tre dage efter indpodning I

havde Peyerske plaques og milte signifikant mere vildtype- I

X3306 end helbredt χ3337. Forskellen i CFU i Peyerske plaques I

blev ikke konsekvent iagttaget '•i forskellige forsøg og var I

61 DK 175512 B1 midlertidig som resultater for andre tidspunkter viser. CFU i milte forblev imidlertid signifikant forskelligt, idet χ3306 udnummerede χ3337 i stigende mængder, indtil mus inficeret med X3306 døde 8 dage efter indpodning. χ3337 i milte nåede ni-5 veauer i størrelsesordenen af 104 CFU og forblev påviselig i milte så længe som 25 dage efter indpodning. Således var den primære forskel i patogenese efter p.o. indpodning mellem vildtype- og virulensplasmidhelbredt S. typhimurium SR-11 i antallet af S. typhimurium som nåede og/eller formerede sig i 10 milte.

For mere præcist at sammenligne de relative virulenser af vildtype- og piasmid-helbredt SR-11, blev der udført blandet infektionsforsøg med TetR, vildtype- SR-11, χ3456, og NalR, 15 piasmid-helbredt SR-11, χ3337. Forhold mellem vildtype CFU og plasmid-helbredt CFU blev bestemt for hver mus. Endvidere blev CFU-forhold bestemt for mesenteriske lymfekirtler, som er in-termediære ved invasionsprocessen fra Peyerske plaques til milte. Oer blev iagttaget store intervaller i CFU og forholdet 20 mellem individuelle mus, hvilket nødvendiggjorde analyse af geometriske gennemsnit af forhold. Samlede resultater af 3 forsøg er vist i fig. 6. Som iagttaget for forsøgene med mus inficeret med enten vildtype- eller plasmid-helbredt S. typhimurium (fig. 5), var der ingen påviselige signifikante for-25 skelle i CFU i Peyerske plaques eller milte hos mus med blandede infektioner indtil 3 dage efter indpodning, hvor forhold mellem vildtype og helbredte i Peyerske plaques, mesenteriske lymfekirtler og milte var henholdsvis 11:1, 200:1 og 79:1.

Fire dage efter indpodning var kun forholdet for milte signi-30 fikant større end 1,0 (forhold = 160:1), mens Peyerske plaques og mesenteriske lymfekirtler havde forhold på henholdsvis 1,5:1 og 13:1. Som det blev iagttaget hos mus med separate infektioner var CFU i Peyerske plaques igen ca. lige store for vildtype- og helbredt SR-11 efter de kortvarige forskelle, som 35 blev iagttaget 3 dage efter indpodning. Fem dage efter indpodning havde mesenteriske lymfekirtler og milte forhold på henholdsvis 200:1 og 1600:1, det Peyerske piaqueforhold var 1,1:1. Syv dage efter indpodning overlevede en enkelt mus med I DK 175512 B1

I 62 I

H I

Peyerske plaques-, mesenterisk lymfekirtel- og milt-forhold på I

I henholdsvis 2,1:1, 290:1 og 210:1. De største forskelle i CFU I

I i de forskellige organer var i milt og mesenteri ske lymfekirt- I

I ler i forhold til Peyerske plaques. 3, 4 og 5 dage efter ind- I

H 5 podning var miltforhold signifikant større end Peyerske pla- I

I ques-forhold, og 3 og 5 dage efter indpodning var mesenteriske I

I lymfekirtelforhold signifikant større end Peyerske plaques- I

I forhold. (Fig. 6). I

I 10 Patagonese af vi 1dtype-SL1344, χ3339 og 100 kb plasmid-hel- I

I bredt SL1344, χ3340, blev undersøgt hos mus inficeret p.o. Re- I

I sultater for to forsøg er vist i fig. 7. Tre dage efter ind- I

I podning blev der ikke iagttaget nogen signifikante forskelle i I

CFU i Peyerske plaques, mesenteriske lymfekirtler eller milte I

I 15 mellem vildtype- og helbredt SL1344. 7 til 8 dage efter ind- I

I podning blev der påvist signifikant større antal vildtype I

I X3339 end helbredt x3340 i alle tre organer. Større forskelle I

blev iagttaget i mesenteriske lymfekirtler og milte end i I

Peyerske plaques. Endvidere var forskellen i CFU i Peyerske I

20 plaques i et af forsøgene ikke signifikant. Således repræsen- I

terer infektion af mesenteriske lymfekirtler og milte den væ- I

sentligste konsistente forskel i patogenicitet mellem vildty- I

pe- og 100 kb plasmid-helbredt SL1344. 14 dage efter indpod- I

ning var alle musene inficeret med vildtype χ3339 døde, mens I

25 mus inficeret med helbredt χ3340 havde infektion i Peyerske I

plaques og milte på henholdsvis 2xl03 CFU og 6,3xl03 CFU. 31 I

dage efter indpodning havde Peyerske plaques og milte hos mus I

inficeret med χ3340 henholdsvis 400 CFU og 320 CFU. Således I

overlevede 100 kb plasmid-helbredt SL1344 i Peyerske plaques I

30 og milte i længere tidsperioder efter p.o. indpodning. I

Infektion af milte efter i.v. indpodning. De ovenfor beskrev- I

ne resultater viste, at 100 kb plasmidet primært var involve- I

ret i invasion fra Peyerske plaques til mesenteriske lymfe- I

35 kirtler og milte efter p.o. indpodning i stedet for at være I

involveret i infektion af Peyerske plaquers eller tidligere I

forløb. For at undersøge vækst af S. typhimurium i milte, blev I

mus indpodet i.v. med blandinger af vildtype-SR-11, χ3456, og I

63 DK 175512 B1 plasmid-helbredt SR-11, χ3337, og milte blev overvåget for CFU (tabel 12). Når mus var indpodet i.v. med 105 CFU af χ3456 og X3337 blev stammerne i lige.stor udstrækning clearet til milte 1 time efter indpodning. Således påvirkede tilstedeværelsen af 5 100 kb plasmidet ikke clearance fra blodet. Andre mus blev indpodet i.v. med lxlO3 til 4xl03 CFU af blandinger af x3456 og χ3337. Oer blev ikke påvist nogen signifikante forskelle i CFU i milte 4 dage efter indpodning (tabel 12). 6 til 7 dage efter indpodning var forhold mellem vildtype- og helbredt S.

10 typhimurium, som var udvundet fra milte, imidlertid 11,5:1. På dette tidspunkt var gennemsnitsniveauer i milte af χ3456 og X3337 henholdsvis 2,7xl06 og 2,3xl05. Således overlevede og replikerede plasmid-helbredt SR-11 i milte i længere tidsperioder efter i.v. indpodning. Forhold mellem vildtype og hel-15 bredt for SR-11 i milte på 11,5:1 1 uge efter i.v. indpodning var i skarp kontrast med forholdene på 1600:1 og 210:1, som blev opnået 5 og 7 dage efter p.o. indpodning. Det lavere opnåede forhold med blandet i.v. indpodning skyldtes ikke synergi mellem χ3456 og χ3337, da der 6 dage efter indpodning hos 20 mus inficeret med 2xl03 CFU af χ3337 alene eller χ3337 blandet med lige så store mængder χ3456 blev opnået gennemsnitlige miltniveauer på 2,3xl05 CFU for χ3337 (tabel 12).

25 30 1

I DK 175512 B1 I

I I

I TABEL 12. Miltinfektioner efter i.v. indpodning af mus®. I

I 5 ____Tidsrum efter indpodning___ I

I 1 hb 4dc 6-7 dc ' I

I CFU x3456d 1,9x10$ 4,6xl04 2,7χ10δ I

I 1 CFU X3337d 1,4x10$ 2,5xl04 2,3xl0$e I

I Forhold (x3456:x3337)f 1,3:1 1,8:1 11,5:1 (Ρ<0,0025) I

I 10 ForholdiSD9 0,11±0,25 0,26±0,38 l,06i0,39 I

I aMus fik indpodet i.v. lige store blandinger af vildtype χ3456 I

I og 100 kb pladmid-helbredt χ3337. n=3 til 5 mus. I

I 15 bPodestof = 5x10$ CFU hver af χ3456 og χ3337. I

I cPodesstof = lxlO4 til 4xl04 CFU hver af x3456 og χ3337 (lige I

I store podestofmængder blev givet i hvert forsøg). I

^Geometrisk gennemsnit af CFU fra milte. I

I e6 dage efter indpodning havde mus inficeret med 2xl03 CFU af I

I 20 χ3337 alene miltniveauer på 2,3x10$ CFU af χ3337. I

^Geometrisk gennemsnit af forhold χ3456:χ3337 (P-værdi i 1-ha- I

I let Student's t-test for forhold > 1:1). I

I ^Gennemsnit af log^Q af forhold tstandardafvigelse anvendt til I

I statistisk analyse. I

I 25 I

Plasmid-helbredt S. typhimurium var i stand til at formere sig I

I i Peyerske plaques og nåede mesenteriske lymfekirtler og milte I

I efter p.o. indpodning (f i g. - 5, 6, 7). Forskelle i egenskaberne I

hos vildtype- versus plasmid-helbredt S. typhimurium med hen- I

I 30 syn til at invadere til mesenteriske lymfekirtler og milte I

I blev imidlertid konsekvent fundet. Det blev også bestemt, at I

vildtype-S. typhimurium var meget mere effektivt til at infi- I

I cere milte efter p.o. indpodning af mus (forhold mellem vild- I

type og helbredt på 1600:1, fig. 6). Selv helbredte derivater I

35 nåede imidlertid miltniveauer så høje som 104 CFU og forblev I

I påviselige i milte i så længe som 31 dage efter indpodning I

I (fig. 5). Efter p.o. indpodning med blandinger af vildtype- og I

helbredt SR-11 blev der fundet signifikant højere forhold mel- I

lem vildtype- og helbredt SR-11 i milte og mesenteri ske lymfe kirtler sammenlignet med Peyerske plaques (fig. 6).

65 DK Ϊ75512 B1 i.p. LDso'er for piasmid-helbredt SR-11 og SL1344 var hen-5 holdsvis <50 CFU og 400 CFU, hvilket viser at 100 kb plasmid-helbredt S. typhimurium bevarede signifikant virulens ved denne indpodningsvej (tabel 11). Det er vigtigt at bemærke, at ingen af de helbredte stammer hybridiseret med 32P-mærket vi-rulensplasmid, således at tilstedeværelsen af en kromosomal 10 integreret kopi af plasmidet, som kunne bidrage til virulens, blev udelukket. Egenskaberne hos vildtype- og helbredte stammer til at inficere milte efter i.v. indpodning blev undersøgt, og signifikante forskelle i CFU i milte en uge efter i.v. indpodning med blandinger af vildtype- og helbredt S.

15 typhimurium (gennemsnitforhold mellem vildtype og helbredt på 7,5:1 og 20:1) blev fundet. Forskellene i milt-CFU efter i.v. indpodning var ikke så store som de, der blev opnået 5 til 7 dage efter p.o. indpodning (1600:1- og 210:1-gange). Disse forsøg viste igen, at plasmid-helbredt S. typhimurium kunne nå 20 høje niveauer og formere sig i milte, og at de største virkninger af 100 kb plasmidet på patogenese er efter p.o. indpodning. Vi har opstillet den hypotese, at 100 kb plasmid-helbredt S. typhimurium bevarer virulens ad i.p. vejen på grund af, at bakterierne hurtigt formerer sig ekstracel1ulært og 25 ikke effektivt fagocytoseres i det peritoneale hulrum, således at der udvikles en overvældende infektion før mus kan modvirke infektionen ved at cleare bakterier til makrofager. Når indgivet ad p.o.-vejen, antages det, at alle eller de fleste af de invaderende bakterier er intracellulære, når de når de mesen-30 teriske lymfekirtler.

35

Claims (15)

1. Vaccine til immunisering af et hvirveldyr eller et hvirvelløst dyr, k e n d e t e g- I I net ved, at den omfatter et avirulent derivat af eri patogen mikrobe, idet derivatet i alt I I 5 væsentligt er ude af stand til at fremstille funktionel adenylatcyklase og cyklisk AMP- I I receptorprotein. I

2. Vaccine ifølge krav 1,kendetegnet ved, at mikroben er i stand til at udtrykke I I et rekombinant gen, som hidrører fra en patogen for hvirveldyret eller det hvirvelløse dyr, I I til fremstilling af et antigen, som er i stand til at fremkalde en immunreaktion hos hvir- I I 10 veldyret eller det hvirvelløse dyr over for patogenet. I

3. Vaccine ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det rekombinante gen koder for et I I farmakologisk aktivt produkt. I

4. Vaccine ifølge krav 1 eller 2,kendetegnet ved, at den patogene mikrobe er en I I bakterie. I I 15 5. Vaccine ifølge krav 4, kendetegnet ved, at bakterien er Shigella, Erwinia, I I Yersinia, Pasteurella, Legionella eller Brucella. I

6. Vaccine ifølge krav 4, kendetegnet ved, at bakterien hører til en art, som hører I I hjemme i lymfoepithelstrukturen hos hvirveldyret eller inficerer det hvirvelløse dyr. I

7. Vaccine ifølge krav 6, kendetegnet ved, at bakterien er Salmonella eller I I 20 Salmonelle-Escherichia-hybrider. I DK 175512 B1 67

8. Vaccine ifølge krav 7, kendetegnet ved, at bakterien er valgt blandt S. typhi-murium, S. typhi, S. paratyphi, S. gallinarum, S. enteritidis, S. dublin, S. choleraesuis og S. arizona.

9. Vaccine ifølge krav 8, kendetegnet ved, at bakterien er en derivatstamme valgt 5 blandt χ4062 (ATCC 53647) og χ4064 (ATCC 53648) og derivater deraf.

10. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3,kendetegnet ved, at patoge-net er en virus, bakterie, protozo, parasit eller svamp.

11. Vaccine ifølge krav 10, kendetegnet ved, at patogenet er Neisseria go-norrhoeae, Chlamydia trachomatis, Streptococcus mutans, Mycobacterium tuberculosis,

10 Mycobacterium leprae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema palladium, Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae, Hemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordetella avium, Escherichia coli eller Streptococcus equi. 1 2 3 Bæremikrobe til syntese af et værtsprotein i et hvirveldyr eller et hvirvelløst dyr, kendetegnet ved, at den omfatter et avirulent derivat af en patogen mikrobe, idet 2 15 derivatet i alt væsentligt er ude af stand til at fremstille funktionel adenylatcyklase og cyklisk AMP-receptorprotein, mens det er i stand til at udtrykke et rekombinant gen, som hidrører fra en hvirveldyrsvært til fremstilling af et produkt, som er i stand til at undertrykke, modulere eller forstærke en immunreaktion hos hvirveldyret eller det hvirvelløse dyr.

13. Mikrobe ifølge krav 12, kendetegnet ved, at bæremikroben er en bakterie. 3 Mikrobe ifølge krav 12 eller 13,kendetegnet ved, at bakterien er Salmonella eller Salmonella-Escherichia-hybrider og hører hjemme i en lymfoepitelstruktur hos hvirveldyret eller inficerer det hvirvelløse dyr. I DK 175512 B1 I I 68 I I ] 5. Mikrobe ifølge krav 14, kendetegnet ved, at bakterien er Salmonella typhi- I I murium. I

16. Mikrobe ifølge krav 15, kendetegnet ved, at bakterien er χ4062 (ATCC I I 53647) eller χ4064 (ATCC 5364S) og derivater deraf. I I 5 17. Anvendelse af et avirulent derivat afen patogen mikrobe, idet derivatet i alt væsent- I I ligt er ude af stand til at fremstille funktionel adenylatcyklase og cyklisk AMP-receptor- I I protein, til fremstilling af en vaccine til stimulering af immunsystemet hos et hvirveldyr I I eller hvirvelløst dyr. I

18. Anvendelse af et avirulent derivat af en patogen mikrobe, idet derivatet i alt væsent- I I 10 ligt er ude af stand til at fremstille funktionel adenylatcyklase og cyklisk AMP-receptor- I I protein, til fremstilling af en vaccine til stimulering, regulering eller desensibilisering I I af immunsystemet hos et hvirveldyr eller hvirvelløst dyr. I

19. Fremgangsmåde til fremstilling af et avirulent derivat af en patogen mikrobe, idet I I derivatet i alt væsentligt er ude af stand til at fremstille funktionel adenylatcyklase og I I 15 cyklisk AMP-receptorprotein, kendetegnet ved, at den omfatter, at man muterer I I den patogene mikrobe ved hjælp af rekombinante DNA-teknikker eller transposenmuta- I I genese til dannelse af en del etionsmutation i hver af generne for adenylatcyklase og I I cyklisk AMP-receptorprotein og isolerer derivaterne. I I 20 I