ES2268864T3 - Mutantes atenuados de salmonela que expresan de manera constitutiva el antigeno vi. - Google Patents

Mutantes atenuados de salmonela que expresan de manera constitutiva el antigeno vi. Download PDF

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Abstract

Mutante de salmonela atenuado, en el que dicho mutante expresa de manera constitutiva el antígeno vi, y en el que en dicho mutante, se sustituye el promotor vipR por un promotor constitutivo, de manera que se provoca una expresión constitutiva de viaB.

Description

Mutantes atenuados de salmonela que expresan de manera constitutiva el antígeno Vi.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a mutantes de salmonela atenuados que expresan de manera constitutiva el antígeno Vi, así como vacunas frente a la fiebre tifoidea que contienen el mismo, vacunas de vector atenuado que contienen el mismo, y vacunas mediadas por ADN que contienen el mismo.
Antecedentes de la invención I. El antígeno Vi
El antígeno Vi, un polisacárido capsular, se describió por primera vez por Felix et al, Lancet, 227:186-191 (1934). Este polisacárido capsular está presenten en la salmonela, tal como S. typhi, S. paratyphi C, y S. dublin, así como en Citrobacter freundii. Estructuralmente, el antígeno Vi es un polímero lineal de ácido \beta-4,2-desoxi-2N-acetilgalacturónico con O-acetilación variable (Daniels et al, Infect. Immun., 57:3159-3164 (1989)). Se ha correlacionado su presencia en S. typhi, in vitro, con una disminución significativa en la lisis mediante suero, la activación complementaria y la fagocitosis. (Looney et al, J. Lab. Clin. Med., 108:506-516 (1986)). Por tanto, el antígeno Vi puede actuar como un escudo protegiendo a S. typhi frente al sistema inmunitario.
A. La región cromosómica de viaB y la regulación de la expresión del antígeno Vi
Se cree que son necesarios tres loci cromosómicos ampliamente separados, viaA, viaB, y ompB para la expresión del antígeno Vi (Johnson et al, J. Bacteriol., 90:302-308 (1965); y Snellings et al, J. Bacteriol., 145:1010-1017(1981)). De estos, el locus viaB se encuentra siempre en las cepas positivas para el antígeno Vi, y se piensa que contiene los genes que codifican para las encimas necesarias para la síntesis de Vi (Hashimoto et al, J. Bacteriol., 175:4456-4465 (1993); y Virlogeux et al, Microbiol., 141:3039-3047 (1995)). El locus viaB consiste en 11 marcos de lectura abierta (ORF) (figura 1A), de de los cuales los genes vipA y vipB codifican para las enzimas que sintetizan el azúcar nucleótido del polisacárido Vi, y se piensa que los cinco genes vex (vexA-E) son responsables de la translocación del antígeno Vi (Hashimoto et al (1993), mencionado anteriormente). El primer ORF de la región viaB, es decir, vipR (figura 1A), es un regulador transcripcional positivo para su propia expresión, así como para la expresión de vipA, vipB, orf4, vipC, y quizás otros genes en el sentido de 3' de vipR (Hashimoto et al, J. Bacteriol., 178:1430-1436 (1996)). Además, el promotor en el sentido de 5' de vipR también controla la transcripción de (al menos) vipA y vipB (unidades estructurales codificantes del antígeno Vi), que forman un operón dentro de la región viaB. Otra región cromosómica, el operón ompB, que comprende los genes ompR-envZ, desempeña un papel en la expresión del antígeno Vi como regulador transcripcional de viaB (Pickard et al, Infect. Immun., 62:3984-3993 (1994)). La región ompR-nvZ forma parte de la respuesta adaptativa de E. coli a condiciones de elevada osmolaridad. En S. typhi, el antígeno Vi se regula osmóticamente y se necesita ompR para su expresión (Pickard et al, mencionado anteriormente).
B. Relación entre la exposición del antígeno Vi y la inmunoprotección
El polisacárido capsular Vi de S. typhi es un factor de virulencia y un antígeno protector en seres humanos (Felix et al(1934), mencionado anteriormente). El polisacárido Vi purificado es una vacuna antitifoidea parenteral autorizada que provoca un grado moderado de inmunidad protectora tras la inoculación con una única dosis, y la protección está mediada por anticuerpos IgG séricos (Acharya et al, New England Journal of Medicine, 317:1101-1104 (1987); y Klugman et al, Lancet, 2:1165-1169 (1987)). En cambio, aunque la cepa Ty21a de S. typhi atenuada, una vacuna oral atenuada autorizada, no expresa el antígeno Vi, tampoco provoca un anticuerpo anti-Vi sérico; sin embargo, Ty21a confiere al menos niveles moderados de protección (Wahdan et al, J. Infect. Dis., 145:292-296 (1982); y Levine et al, Lancet, 1:1049-1052 (1987a)). Se cree que mecanismos inmunitarios mediados por células median en la protección en esta situación. Varias cepas atenuadas nuevas de S. typhi que expresan el antígeno Vi in vitro no han logrado provocar anticuerpos anti-Vi séricos cuando se administran como vacunas orales, aunque provocan títulos elevados de anticuerpos O y H (Tacket et al, J. Infect. Dis., 163:901-904 (1991); Tacket et al, Vaccine, 10:443-446 (1992a); y Tacket et al, Infect. Immun., 65:452-456 (1997)). La explicación probable para este fenómeno es que la expresión del antígeno Vi está sumamente regulada en relación con los estímulos osmóticos (Pickard et al, mencionado anteriormente). La suposición es que se interrumpe la expresión del antígeno Vi, excepto cuando las bacterias son extracelulares en la sangre u otro líquido corporal (por ejemplo, la bilis).
Se postuló en la presente invención que si se hace constitutiva la expresión del antígeno Vi, esto daría como resultado la estimulación de anticuerpos IgG séricos, potenciando así la protección global frente a fiebre tifoidea. También se postuló en la presente invención, que la expresión constitutiva mejoraría las respuestas inmunitarias frente a xenoantígenos expresados por vacunas de vector atenuado de salmonela atenuada y vacunas mediadas por ADN.
II. Poblaciones diana de fiebre tifoidea
La fiebre tifoidea es extremadamente poco común en países industrializados modernos en los que la población tiene acceso a suministros de agua tratados, monitorizados bacteriológicamente, y a servicios de saneamiento que retiran los desechos fecales humanos. En cambio, en países menos desarrollados, entre las poblaciones que carecen de tales servicios, la fiebre tifoidea es a menudo endémica, y desde la perspectiva de la salud pública, constituye normalmente el problema de enfermedad entérica más importante de los niños en edad escolar (Levine et al, Pediatr. Infect. Dis. J., 8:374-381 (1989a)). La vigilancia clínica, epidemiológica y bacteriológica sistemática para la fiebre tifoidea en relación con ensayos en el campo de vacunas candidato ha establecido, con gran precisión, la incidencia de fiebre tifoidea en muchas poblaciones (Levine et al, Lancet, 336:891-894 (1990); Black et al, Vaccine, 8:81-84 (1990); Levine et al (1987a), mencionado anteriormente; Ferreccio et al, J. Infect. Dis., 159:766-769 (1989); y Simunjuntak et al, Lancet, 338:1055-1059(1991)). Las tasas de incidencia reveladas fueron muy superiores a lo previsto, basándose en la vigilancia no sistemática. Los estudios sistémicos también ha demostrado una frecuencia sorprendente de infección tifoidea clínicamente leve, aunque bacteriémica, entre niños y niños pequeños en áreas endémicas (Ferreccio et al, J. Pediatr., 104:899-901 (1984)).
Además de los niños en edad escolar en países menos desarrollados, dos poblaciones más con riesgo aumentado de fiebre tifoidea son microbiólogos clínicos y viajeros. Entre los viajeros de los EE.UU., el riesgo es mayor en países entre la costa pacífica de Sudamérica, y en el subcontinente indio, (Ryan et al, Rev. Infect. Dis., 11:1-8 (1989); y Mathieu et al, Arch. Intern. Med., 154:1713-1718 (1994)). Además, los microbiólogos clínicos, incluyendo aquellos en países industrializados, tienen una exposición aumentada a Salmonella typhi en el entorno de trabajo, y por tanto constituyen un grupo de alto riesgo (Blaser et al, J. Clin. Microbiol., 13:855-858 (1981)).
III. Cepas de S. typhi multiresistentes
Desde cerca de 1990, han empezado a aparecer casos esporádicos y brotes epidémicos de fiebre tifoidea en Oriente Medio, el nordeste de África y sur y sudeste de Asia. Estos brotes epidémicos están provocados por cepas de S. typhi que codifican para resistencia mediada por plásmidos frente a trimetoprima/sulfametoxazol, así como resistencia frente a cloranfenicol (Gupta et al, Pediatr. Infect. Dis., 13:124-140 (1994); y Rowe et al, Lancet, 336:1065-1066 (1990)). El tratamiento frente a tales cepas requiere el uso de antibióticos de quinolona, tales como ciprofloxacina oral o cefalosporinas de tercera generación, tales como ceftriaxona parenteral. Estos antibióticos son costosos para países en desarrollo. Al contrario que las cepas resistentes a los antibióticos anteriores que provocaron casos esporádicos o epidemias extendidas, tales como en México desde 1972-1973 (Olarte et al, Antimicrob. Agents Chemother., 4:597-601 (1973)); y en Perú desde 1979-1981 (Goldstein et al, J. Infect. Dis., 2:261-266 (1986)), y que desaparecieron finalmente para sustituirse de nuevo por cepas sensibles, las cepas de S. typhi resistentes a múltiples antibióticos que aparecieron en Oriente Medio y el subcontinente indio cerca de 1990 todavía son cepas dominantes en esas zonas. Además, esas cepas resistentes a múltiples antibióticos se han extendido ampliamente, y son frecuentes en el nordeste de África (Mikhail et al, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 83:120(1989)), y el sudeste de Asia (Vinh et al, Antimicrob. Agents Chemother., 40:958-961(1996)).
Parece que la S. typhi que manifiesta resistencia frente a múltiples antibióticos anteriormente útiles puede no desaparecer. Por tanto, la fiebre tifoidea ya no es una enfermedad que puede tratarse de manera sencilla y económica con antibióticos orales. Además, las autoridades sanitarias ya no pueden basar programas de control tifoideo en el tratamiento temprano de la enfermedad. Las complicaciones de la fiebre tifoidea y muertes están aumentando debido al tratamiento con antibióticos inapropiado, tardío o inadecuado. (Singh, Indian Pediatr., 28:329-332(1991); Bhutta, Ann. Trop. Paediatr., 16:299-306 (1996); y Gupta, mencionado anteriormente).
Por tanto, la diseminación de estas cepas de S. typhi resistentes a múltiples antibióticos constituye una crisis de salud pública en aumento en muchos países menos desarrollados, y ha vuelto a despertar interés en el desarrollo de vacunas antitifoideas orales mejoradas. También debe considerarse la profilaxis inmunitaria para niños en zonas de alta incidencia, particularmente en las que las cepas de S. typhi son resistentes a múltiples antibióticos, así como para viajeros y microbiólogos clínicos.
IV. Vacunas tempranas frente a la fiebre tifoidea A. Vacunas de célula entera parenterales inactivadas
Se mostró, en ensayos de campo aleatorizados, controlados, patrocinados por la organización mundial de la salud en la década de 1960, que la vacuna de célula entera conservada en fenol, inactivada por calor, desarrollada al final del siglo XIX (Wright et al, Br. Med. J., 1:256-258 (1897); y Pfeiffer et al, Dtsch. Med. Wochescr. 22:735-737 (1896)) confería niveles moderados de protección (un 51-67% de eficacia de la vacuna) que duraba hasta siete años (Ashcroft et al, Am. J. Hyg., 79:196-206(1964); Ashcroft et al, Lancet, 2:1056-1060 (1967); Yugoslav Typhoid Commission, Bull. WHO, 30:623-630 (1964); y Hejfec, Bull. WHO, 34:321-339 (1966)). Sin embargo, ésta es una vacuna claramente insatisfactoria debido a que provoca reacciones adversas con una frecuencia inaceptablemente elevada, y por tanto, no ha llegado a ser nunca una herramienta de salud pública popular (Levine, Typhoid Fever Vaccines, In: Vaccines, 2ª Ed., Ed. Plotkin et al, Filadelfia, PA, W. B. Saunders (1994)). En ensayos controlados, aproximadamente el 25% de los destinatarios de la vacuna de célula entera conservada en fenol inactivada por calor desarrolló fiebre y reacciones sistémicas, y aproximadamente el 15% tiende a ausentarse del trabajo o escuela tras la vacunación (Ashcroft et al (1964), mencionado anteriormente; Yugoslav Typhoid Commission (1964), mencionado anteriormente; y Hejfec, mencionado anteriormente). Por esta razón, esta vacuna se ha sustituido en gran medida por dos vacunas más recientemente autorizadas, vacuna oral atenuada de cepa Ty21a (Vivotif^{R}), y la vacuna de polisacárido capsular Vi parenteral (TyphiViM^{R}) (Levine et al (1989a), mencionado anteriormente). Estas dos vacunas más nuevas confieren protección comparable a la vacuna de célula entera mencionada anteriormente, pero se toleran muy bien.
B. Vacuna de polisacárido Vi parenteral
Tal como se trató anteriormente, a mediados de la década de 1930, se descubrió el antígeno Vi, una cápsula de polisacárido en S. typhi, (Felix et al (1934), mencionado anteriormente). También se mostró que este antígeno está presente en la gran mayoría de las cepas aisladas de la sangre de pacientes con fiebre tifoidea y es un factor de virulencia de S. typhi en ratones; su presencia protege al antígeno O de la aglutinación mediante antisuero O (Felix et al, J. Hyg. Cambridge, 49:92-109 (1951); y Felix et al, J. Hyg., 35:421-427 (1935)). Se propuso que el anticuerpo anti-Vi desempeñaba un papel importante en la protección frente a la fiebre tifoidea, y se sugirió sustituir la vacuna antitifoidea parenteral inactivada en fenol con vacunas parenterales de célula entera inactivadas en alcohol. La justificación para esta proposición fue que éstas últimas conservaban mejor el antígeno Vi, y facilitaban un título de anticuerpo anti-Vi superior en animales y en seres humanos (Felix, BMJ, 1:391-395 (1941)). Sin embargo, en un ensayo de campo aleatorizado, controlado en Yugoslavia, la vacuna parenteral de célula entera inactivada por fenol y calor fue significativamente más protectora que una vacuna inactivada en alcohol (Yugoslav Typhoid Commission, Bull. WHO, 26:357-369 (1962)). Sin embargo, usando la misma justificación, se ha propuesto una vacuna antitifoidea parenteral inactivada en acetona (Landy et al, Am. J. Public Health, 44:1572-1579 (1954)). En dos ensayos de campo independientes realizados en la década de 1960 en Guyana y Yugoslavia, la vacuna inactivada en acetona confirió una protección superior que la vacuna inactivada por calor y fenol (Yugoslav Typhoid Commission (1962), mencionado anteriormente). Se ha discutido que la superioridad de la vacuna inactivada en acetona se debía a una mejor conservación del antígeno Vi (Wong et al, J. Infect. Dis., 125:360-366 (1972)), o a títulos de anticuerpo superiores frente al antígeno H obtenidos con esa vacuna.
Se realizó un avance crucial purificando el antígeno Vi mediante una técnica no desnaturalizante (Levine et al, Infect. Immun., 12:1290-1294 (1975); y Robbins et al, J. Infect. Dis., 150:436-449 (1984)). Se evaluó la inmunogenicidad de dos lotes de antígeno Vi no desnaturalizados preparados en Institutos Nacionales de la Salud (Bethesda, Maryland) y en el Instituto Merieux, (Lión, Francia) (Tacket, Vaccina, 6:307-308 (1988)). Ambos lotes provocaron títulos elevados de anticuerpo anti-Vi en aproximadamente el 90% de los destinatarios. Además, se mostró que los anticuerpos anti-Vi generados por las vacunas persistían durante al menos tres años (Tacket et al (1988), mencionado anteriormente). Se observan niveles de anticuerpo anti-Vi iguales a los provocados por la vacuna Vi purificada parenteral en la naturaleza sólo en portadores tifoideos crónicos. En cambio, la mayoría de los pacientes convalecientes de fiebre tifoidea no desarrollan títulos elevados de anticuerpo anti-Vi (Lanata et al, Lancet, 2:441-443 (1983); y Losonsky et al, J. Clin. Microbiol., 25:2266-2269 (1987)).
Se realizaron dos ensayos de campo aleatorizados, controlados para evaluar la seguridad y eficacia de la vacuna de antígeno Vi candidata producida en el Instituto Merieux. En ambos ensayos, la vacuna se toleró bien (Acharya et al, mencionado anteriormente; y Klugman et al, mencionado anteriormente). En Nepal, una única dosis intramuscular de 25 mg de la vacuna del antígeno Vi proporcionó el 72% de protección durante al menos 17 meses frente a fiebre tifoidea confirmada en cultivo en un estudio que implicaba tanto a niños como a adultos (Klugman et al, mencionado anteriormente). Se obtuvieron resultados similares en un ensayo de campo en niños escolares sudafricanos en los que la misma dosis del antígeno Vi confería el 64% de protección frente a fiebre tifoidea confirmada en cultivo durante al menos 21 meses (Klugman et al, mencionado anteriormente).
Más allá de su seguridad y eficacia en niños escolares y en adultos, una ventaja de la vacuna del antígeno Vi es que proporciona un nivel moderado de protección con sólo una dosis única. Sin embargo, comparado con la vacuna antitifoidea atenuada Ty21a, una vacuna de antígeno Vi es desventajosa porque debe administrarse por vía parenteral (intramuscular).
C. Cepas atenuadas tempranas como vacunas orales atenuadas 1. Cepas de vacuna de S. typhi que dependen de la estreptomicina
Las primeras cepas atenuadas que se mostraron prometedoras como vacunas antitifoideas orales atenuadas fueron las cepas que dependen de la estreptomicina (SmD) desarrollas a finales de la década de 1960 y principios de la década de 1970 (DuPont et al, Antimicrob. Agents Chemother., 10:236-239(1970); y Levine et al, J. Infect. Dis., 133:424-429 (1976)). Cuando se administran en múltiples dosis espaciadas que contienen aproximadamente 10^{10} unidades formadoras de colonias (ufc) por dosis, las cepas SmD se toleraron bien, y demostraron aproximadamente el 80% de protección frente a exposición experimental en un modelo voluntario de fiebre tifoidea (DuPont et al, mencionado anteriormente). Sin embargo, cuando se inmunizó a los voluntarios con preparaciones liofilizadas que se volvían a constituir para preparar suspensiones líquidas de organismos de vacunas, no se confería protección (Levine et al (1976), mencionado anteriormente). Debido a ello, se interrumpieron estudios adicionales con las cepas de vacuna SmD.
2. Cepa Ty21a, una vacuna antitifoidea oral atenuada autorizada
Se desarrolló Ty21a, una cepa atenuada de S. typhi que es segura y protectora como vacuna oral atenuada, a principios de la década de 1970 mediante mutagénesis química de una cepa de S. typhi patógena Ty2 (Germanier et al, J. Infect. Dis., 141:553-558(1975)). Las mutaciones características en esta cepa de vacuna que se supuso inicialmente que eran responsables de su atenuación incluyen una inactivación de galE (que codifica para UDP-galactosa-4-epimerasa, una enzima implicada en la síntesis de lipopolisacáridos), y una incapacidad para expresar polisacárido Vi. Aunque que se ha probado que Ty21a se tolera remarcablemente bien en ensayos clínicos controlados por placebo (Gilman et al, J. Infect. Dis., 136:717-723 (1977); Wahdan et al (1982), mencionado anteriormente; y Wahdan et al, Bull. WHO, 58:469-474 (1980)), no está claro precisamente qué mutaciones son responsables del fenotipo estable, sumamente atenuado de esta vacuna. Los resultados de tres estudios doble ciegos, controlados por placebo que utilizaron métodos de vigilancia activa para evaluar la reactogenicidad de Ty21a en adultos y niños mostraron que no se observaban reacciones adversas de manera significativamente más frecuente en los destinatarios de la vacuna que en el grupo de placebo para cualquier síntoma o signo. De manera similar, en ensayos de campo de la eficacia a gran escala que implicaban a aproximadamente 530.000 niños escolares en Chile, 32.000 niños escolares en Egipto, y aproximadamente 20.000 sujetos pediátricos y adultos en Indonesia, la vigilancia pasiva no pudo identificar reacciones adversas atribuibles a la vacuna (Ferreccio et al (1984), mencionado anteriormente; Levine et al (1987a), mencionado anteriormente; Simunjuntak et al, mencionado anteriormente; Wahdan et al (1982), mencionado anteriormente; y Wahdan et al (1980), mencionado anteriormente).
Los ensayos de campo controlados de Ty21a enfatizan que la formulación de la vacuna, el número de dosis administradas, y la separación de las dosis, influencian de manera marcada el nivel de protección que puede lograrse (Black et al, mencionado anteriormente; Ferreccio et al (1984), mencionado anteriormente; Levine et al (1987a), mencionado anteriormente; y Wahdan et al (1980), mencionado anteriormente). En el primer ensayo de campo aleatorizado, controlado por placebo de Ty21a en Alejandría, Egipto, niños escolares de 6-7 años de edad recibieron tres dosis de vacuna liofilizada que se volvía a suspender en un diluyente (intervalo de dos días entre las dosis) (Wahdan et al (1980), mencionado anteriormente). Para neutralizar el ácido gástrico, los niños masticaron un comprimido de 1,0 g de NaHCO_{3} varios minutos antes de ingerir la vacuna o placebo. Durante tres años de vigilancia, se mostró que Ty21a confería el 96% de eficacia protectora frente a fiebre tifoidea confirmada (Wahdan et al (1982), mencionado anteriormente).
Una formulación más reciente que ha constituido el producto comercial desde mediados de la década de 1980 consiste en una vacuna liofilizada en cápsulas recubiertas entéricas, resistentes al ácido. En un ensayo de campo aleatorizado, controlado por placebo en Santiago, Chile, tres dosis de esta formulación recubierta entérica administradas en un plazo de una semana proporcionaron el 67% de eficacia durante los tres primeros años de seguimiento (Levine et al (1987a), mencionado anteriormente), y el 63% de protección durante siete años de seguimiento. Cuatro dosis de cápsulas recubiertas entéricas de Ty21a administradas en un plazo de ocho días son significativamente más protectoras que dos o tres dosis (Ferreccio et al (1984), mencionado anteriormente). Cuando se autorizó Ty21a por la U.S. Food and Drug Administration a finales de 1989, el programa recomendado era cuatro dosis que debían administrarse cada dos días; otros países usaron un programa de inmunización de tres dosis.
Sin embargo, inconvenientes reconocidos de Ty21a incluyen la falta de una base molecular para su atenuación, su inmunogenicidad moderada y, lo más importante, la necesidad de administrar al menos tres dosis espaciadas con el fin de conferir protección. Otro inconveniente de Ty21a es que no estimula el anticuerpo IgG anti-Vi sérico.
3. Correlaciones de protección tras la inmunización con vacunas atenuadas
Aunque la cepa Ty21a de vacuna oral atenuada antitifoidea autorizada sólo es moderadamente inmunogénica, y requiere tres o cuatro dosis espaciadas para provocar protección, la eficacia es de una duración sorprendentemente larga, durando durante 5-7 años. Se encontró que los resultados de dos evaluaciones inmunológicas se correlacionaban con la protección conferida por diferentes formulaciones y programas de inmunización de Ty21a en ensayos de campo. Éstos incluyen seroconversiones de anticuerpo IgG anti-O sérico (Levine et al, Rev. Infect. Dis., 11(sup. 3):S552-S567 (1989b)), y recuento de células que secretan anticuerpo IgA anti-O derivado de intestino (ASC) detectadas en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) (Kantele, Vacuna, 8:321-326 (1990); Tacket et al, Infect. Immun.,60:536-541 (1992b); y Van de Verg et al, Infect. Immun., 58:2002-2004 (1990)). La identificación de estas mediciones como correlaciones inmunológicas de la protección proporciona una herramienta inestimable para su uso en los ensayos clínicos tempranos cuando se evalúan nuevas cepas de S. typhi atenuadas como posibles vacunas orales atenuadas.
V. Nuevas generaciones de S. typhi atenuadas como vacunas orales atenuadas
Los investigadores en diversos laboratorios en todo el mundo han emprendido la tarea de diseñar mediante ingeniería nuevas cepas de vacuna candidatas que se tolerarán tan bien como Ty21a pero considerablemente más inmunogénicas de manera que una dosis oral única provocara inmunidad protectora. Hacia el final, se han preparado cepas de vacuna candidatas inactivando genes que codifican diversas rutas bioquímicas, sistemas reguladores globales, proteínas de choque térmico, otros genes reguladores, y supuestas propiedades de virulencia (Curtiss et al, Infect. Immun., 55:3035-3043 (1987), mencionado anteriormente; Edwards et al, J. Bacteriol., 170:3991-3995 (1984); Hohmann et al, J. Infect. Dis., 173:1408-1414 (1996a); Hone et al, Infect. Immun., 56:1326-1333(1988); Hone et al, Vaccine, 9:810-816 (1991); y Levine et al, J. Biotechnol., 44:193-196 (1996)). También se ha realizado un intento para aumentar la inmunogenicidad de Ty21a restaurando su capacidad para expresar el antígeno Vi (Cryz et al, Infect. Immun., 57:3863-3868 (1989); y Tacket et al (1991), mencionado anteriormente). El potencial de atenuación relativo de estas mutaciones se ha evaluado normalmente alimentando cepas de S. typhimurium que albergan estas mutaciones a ratones, y comparando los resultados con los provocados por cepas de tipo natural isogénicas. Las mutaciones introducidas en diversas cepas de S. typhi recombinantes que se alimentaron a seres humanos como candidatos de vacunas orales atenuadas en ensayos clínicos se resumen en la tabla 1 a continuación.
TABLA 1
Gen mutado Cepa de vacuna Cepa original de Fenotipo clínico Fenotipo inmunológico
tipo natural
galE, via EX462 Ty2 No atenuado Inmunogénico
aroA, purA 541Ty CDC1080 Demasiado atenuado Poco inmunogénico
aroA, purA, Vi 543Ty CDC1080 Demasiado atenuado Poco inmunogénico
aroC, aroD CVD 908 Ty2 Atenuado Inmunogénico
aroC, aroD, htrA CVD 908-htrA Ty2 Atenuado Inmunogénico
cya, crp X3927 Ty2 Insuficientemente atenuado Inmunogénico
cya, crp, cdt X4073 Ty2 Atenuado Inmunogénico
phoP/phoQ Ty800 Ty2 Atenuado Inmunogénico
Los resultados y características destacables de los ensayos clínicos con las cepas atenuadas más importantes de S. typhi que han desempeñado un papel fundamental en el desarrollo de vacunas antitifoideas orales atenuadas se resumen a continuación.
A. Cepa Vi^{+} Ty21a
Se construyó un derivado de Ty21a introduciendo viaB (que codifica para los genes estructurales requeridos para la síntesis de polisacárido Vi) a partir de la cepa Ty2 de tipo natural dentro del cromosoma de Ty21a, y demostrando la expresión de polisacárido capsular Vi (Cryz et al, mencionado anteriormente). Se alimentó la cepa Vi^{+} Ty21a resultante a adultos norteamericanos sanos en dosis únicas de suspensiones líquidas que contenían 5,0 x 10^{5}, 5,0 x 10^{7} y 5,0 x 10^{9} ufc y tampón; un grupo adicional de sujetos recibió tres dosis de 5,0 x 10^{9} ufc y tampón (intervalo de dos días entre las dosis) (Tacket et al (1991), mencionado anteriormente). La cepa de Vi^{+} Ty21a se toleró bien, y la mayoría de los sujetos que recibió tres dosis desarrolló aumentos de anticuerpos IgG séricos y ASC de IgG frente a antígeno O de S. typhi. Sin embargo, ningún sujeto manifestó aumentos de anticuerpo IgG anti-Vi sérico, ni mostró ASC que secretaran anticuerpo IgA anti-Vi (Tacket et al (1991), mencionado anteriormente).
B. EX462
Se realizó un intento para construir un nuevo derivado de Ty2 usando técnicas de ADN recombinante que contenían lo que en aquel momento se pensó que eran las mutaciones atenuantes en Ty21a que se habían inducido mediante mutagénesis química (Hone et al (1988), mencionado anteriormente). Específicamente, el derivado albergaba una mutación por deleción en galE, y no podía expresar polisacárido Vi, pero no tenía las muchas otras mutaciones presentes en Ty21a como resultado de haberse obtenido usando mutagénesis química no específica. La cepa resultante, EX462, estaba atenuada de manera claramente insuficiente, ya que provocó un síndrome similar a fiebre tifoidea en varios destinatarios. Estas observaciones demuestran en conclusión que la combinación de la mutación de galE y la incapacidad para expresar antígeno Vi en sí mismas no son responsables de la atenuación de la cepa Ty21a.
C. Cepas 541Ty y 543Ty
Se ha popularizado el concepto de preparar mutantes auxotrópicos de salmonela con inactivación de genes que codifican para enzimas en la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (Edwards et al, mencionado anteriormente; y Hoiseth et al, Nature, 292:238-239 (1981)). Estas mutaciones hacen que la salmonela dependa nutricionalmente de sustratos (ácido para-aminobenzoico y 2,3-dihidroxibenzoato) que no están disponibles en cantidades suficientes en los tejidos de mamíferos; como consecuencia, la vacuna permanece viable pero su capacidad para proliferar se ve gravemente inhibida.
Se construyeron prototipos de cepas aroA 541Ty y 543Ty (una variante Vi^{-} de 541Ty) a partir de CDC1080, una cepa de tipo natural obtenida de los centros para el control de enfermedades (Edwards et al, mencionado anteriormente). Nunca se ha probado directamente la patogenicidad de la cepa CDC1080 en voluntarios. En cambio, la mayoría de los otros investigadores han comenzado con la cepa Ty2 de tipo natural, la cepa original de Ty21a (Germanier et al, mencionado anteriormente), en sus intentos para diseñar mediante ingeniería nuevas cepas atenuadas. Se ha establecido la patogenicidad de Ty2 en estudios en voluntarios (Hornick et al, N. Engl. J. Med., 283:686-691 y 739-746 (1970)).
Las cepas 541Ty y 543Ty también albergan una mutación por deleción en purA, lo que da como resultado un requisito específico de adenina (o un compuesto asimilable, tal como adenosina) (Edwards et al, mencionado anteriormente). Una tercera mutación en hisG, que conduce a un requisito de histidina, no afecta a la virulencia, pero proporciona un marcador bioquímico adicional para diferenciar claramente la cepa de vacuna de S. typhi de tipo natural.
Las cepas 541Ty y 543Ty se toleraron bastante bien en dosis de hasta 5,0 x 10^{10} ufc en estudios en fase 1, pero fueron notablemente menos inmunogénicas que Ty21a al estimular respuestas de anticuerpo hormonal (Levine et al, J. Clin. Invest., 79:888-902 (1987b)). Por ejemplo, sólo el 11% de los sujetos desarrollaron anticuerpos IgG anti-O séricos (Levine et al (1987b), mencionado anteriormente).
D. Cepa CVD 908
Una cepa de vacuna que se ha probado que se tolera bien y es sumamente inmunogénica tras la administración de una dosis oral única en ensayos clínicos en fase 1 en seres humanos con microorganismos recién recogidos es la cepa CVD 908 (Tacket et al(1992b), mencionado anteriormente; y Tacket et al (1992a), mencionado anteriormente), que alberga mutaciones por deleción precisas en aroC y aroD (Hone et al (1991), mencionado anteriormente). De hecho, CVD 908 fue el primer candidato de vacuna de S. typhi diseñado genéticamente mediante ingeniería que se mostró que era sumamente inmunogénico aunque bien tolerado, generando así optimismo de que podía ser posible desarrollar una vacuna antitifoidea oral atenuada de dosis única. A una dosis bien tolerada de 5,0 x 10^{7} ufc, el 92% de los destinatarios de CVD 908 manifestaron seroconversiones de anticuerpos IgG anti-O, y mostraron evidencias de sensibilización del sistema inmunitario intestinal (ASC de IgA) (Tacket et al (1992a),mencionado anteriormente).
1. Respuesta inmunitaria mediada por células tras la inmunización con CVD 908 de vacuna atenuada
Los ensayos clínicos con CVD 908 se han caracterizado mediante investigaciones intensas de respuestas inmunitarias mediadas por células (CMI) (Sztein et al, J. Immunol., 155:3987-3993 (1995); y Sztein et al, J. Infect. Dis., 170:1508-1517(1994)). Cuando se administra a adultos sanos, CVD 908 desencadena respuestas CMI frente a antígenos de S. typhi, incluyendo producción de citocina, y respuestas proliferativas frente a flagelos purificados y partículas de S. typhi de células enteras inactivadas por calor y fenol (Sztein et al (1994), mencionado anteriormente).
Dado que S. typhi son patógenos intracelulares, también se ha resumido que las respuestas de linfocitos citotóxicos (CTL) podrían desempeñar un papel importante para limitar la progresión de la infección tifoidea destruyendo las células huésped que albergan S. typhi. Por tanto, se desarrolló un ensayo de CTL para evaluar si la inmunización de voluntarios adulto con CVD908 de S. typhi atenuada provoca efectores de CTL en la sangre que pueden destruir linfocitos B autólogos transformados con virus de Epstein-Barr virus (EBV) infectados con S. typhi de tipo natural (Sztein et al (1995), mencionado anteriormente). Se evaluó la actividad de CTL usando CMSP aisladas previamente 14 y 29 días tras la primera inmunización. Las CMSP o bien se utilizaron inmediatamente en los ensayos de CTL o bien se expandieron in vitro durante 6-8 días en presencia de células transformadas por EBV autólogas infectadas con S. typhi antes de la medición de las respuestas de CTL. Usando este sistema, los efectores de CTL lisaron células transformadas por EBV autólogas infectadas con S. typhi. Se observó la actividad de CTL específica en preparaciones de CMSP obtenidas 14 días tras la inmunización, y siguiendo de 7 a 8 días de expansión in vitro en presencia de células transformadas por EBV autólogas infectadas por S. typhi. Las CMSP obtenidas 29 días tras la inmunización mostraron niveles de actividad de CTL comparables o superiores a los observados en células aisladas 14 días tras la inmunización. La población de células efectoras de CTL en esos cultivos de CMSP era una población de linfocitos T citotóxicos, restringidos al CMH de clase I, de CD8^{+} clásica (Sztein et al (1995), mencionado anteriormente). La observación de que la inmunización con S. typhi atenuada provoca células efectoras de CTL, restringidas al CMH de clase I, de CD8^{+} circulantes que pueden destruir dianas infectadas con S. typhi autólogas confirma la contención de que CTL desempeña un papel crucial al limitar la progresión de la infección tifoidea destruyendo células huésped que albergan bacterias.
2. Desventajas de cepa CVD 908 de vacuna atenuada
Un inconveniente posible observado en ensayos clínicos de fase 1 con CVD 908 es que el 50% de los sujetos que ingirieron esta cepa de vacuna con una dosis de 5,0 x 10^{7} ufc, y el 100% de los sujetos que recibieron una dosis de 5,0 x 10^{8} ufc, manifestaron vaccinemias silenciosas, en las que se recuperaron microorganismos de vacuna de cultivos de sangre recogida en uno o más puntos de tiempo entre el día 4 y el día 8 tras la vacunación. Se recogieron los cultivos de sangre sistemáticamente en estos individuos en un plazo de horas tras haber ingerido la vacuna, y en los días 2, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 20, 27 y 60. Ningún cultivo de sangre de ninguna vacuna fue positivo antes del día 4 ni después del día 8. Las vaccinemias parecían no tener consecuencias clínicas (por ejemplo, no estaban asociadas a fiebre), y eran de vida corta, desapareciendo espontáneamente sin usar antibióticos. Sin embargo, se desconocen las consecuencias posibles que puede tener la vaccinemia con cepa de S. typhi atenuada cepa en una población mayor en la que es posible que se incluyan individuos inmunodeficientes. Otra desventaja percibida de CVD908 es la producción de fiebre en una pequeña proporción de vacunados que reciben una dosis alta de vacuna (Tacket et al (1992a), mencionado anteriormente).
Como alternativa, se buscó introducir mutaciones adicionales en CVD 908 para dar un derivado que siga tolerándose bien y sea inmunogénico, aunque no manifieste vaccinemias ni fiebre.
E. CVD 908-htrA
Se encontró que la inactivación de htrA, un gen que codifica para una proteína de stress que también funciona como una serina proteasa, atenúa el S. typhimurium de tipo natural en un modelo de ratón (Chatfield et al, Microbial. Pathogenesis, 12:145-151 (1992a)). Además, los ratones inmunizados por vía oral con S. typhimurium que albergaban una mutación por deleción en htrA estaban protegidos frente a exposiciones posteriores con una dosis letal de S. typhimurium de tipo natural (Chatfield et al (1992a), mencionado anteriormente). Por tanto, se introdujo una mutación por deleción en htrA de CVD 908, dando como resultado una cepa CVD 908-htrA (Levine et al (1996), mencionado anteriormente). Se alimentó una dosis única de CVD908-htrA a tres grupos de sujetos que ingirieron 5,0 x 10^{7} (N=7), 5,0 x 10^{8} (N=8) o 5,0 x 10^{9} (N=7) ufc (Tacket et al (1997), mencionado anteriormente). La cepa CVD 908-htrA se toleró bien como la cepa original CVD 908. Sólo uno de esos 22 sujetos desarrolló una fiebre de grado bajo, que se detectó mediante vigilancia rutinaria, y no estuvo asociada con ninguna queja de malestar. Sin embargo, 2 de los 22 sujetos desarrollaron heces blandas (Tacket et al (1997), mencionado anteriormente). De manera similar, la respuesta inmunitaria fue excelente: 20 de los 22 individuos (91%) manifestaron aumentos significativos de anticuerpo IgG anti-O sérico, y se detectaron ASC de IgA derivadas de intestino que fabricaron anticuerpos frente al antígeno O en el 100% de los vacunados. Estas respuestas inmunológicas son virtualmente idénticas a las observadas en ensayos clínicos de fase 1 en sujetos inmunizados con dosis comparables de CVD 908 (Tacket et al (1992a), mencionado anteriormente). La diferencia sorprendente fue con respecto a las vaccinemias. Mientras que se detectaron vaccinemias en 12 de 18 sujetos que recibieron una dosis de 5,0 x 10^{7} o 5,0 x 10^{8} ufc de CVD 908, no se detectaron vaccinemias en ninguno de los 22 individuos que ingirieron dosis de 5,0 x 10^{7-9} ufc sumamente inmunogénicas, bien toleradas de CVD 908-htrA (p<0,001) (Levine et al (1987b), mencionado anteriormente; Tacket et al (1992a), mencionado anteriormente; y Tacket et al (1997), mencionado anteriormente). CVD 908-htrA también provoca fuertes respuestas mediadas por células en vacunados comparables en fuerza a las conseguidas con CVD 908 (Tacket et al (1992a), mencionado anteriormente; y Tacket et al (1997), mencionado anteriormente). Basándose en estos datos sumamente estimulantes, CVD 908-htrA ha entrado en ensayos clíni-
cos en fase 2 para evaluar su inmunogenicidad y aceptabilidad clínica en un gran número de sujetos, incluyendo niños.
F. Cepas con mutaciones en cya, crp o cya, crp, cdt
En la salmonela, los genes cya (que codifican para adenilato ciclasa) y crp (proteína receptora de AMP cíclica) constituyen un sistema regulador global que afecta a muchos genes y operones (Curtiss et al, Dev. Biol. Stand., 82:23-33 (1994)). Los S. typhimurium que albergan deleciones en cya y crp están atenuados comparados con sus cepas originales de tipo natural, y la inmunización por vía oral protege a ratones frente a exposiciones con S. typhimurium virulento (Curtiss et al (1987), mencionado anteriormente).
Se construyó la cepa \chi3927 candidata a vacuna, un mutante doble de cya^{-}, crp^{-} de la cepa de S. typhi Ty2 (Curtiss et al (1994), mencionado anteriormente). En ensayos clínicos en fase 1, se demostró que la cepa \chi3927 estaba atenuada comparada con la cepa de tipo natural, pero insuficientemente atenuada como para servir como vacuna oral atenuada en seres humanos, ya que los sujetos ocasionalmente desarrollaron fiebre elevada y síntomas similares a la fiebre tifoidea (Tacket et al (1992b), mencionado anteriormente). Varios sujetos también manifestaron vaccinemias (Tacket et al (1992b), mencionado anteriormente).
Con el fin de lograr un mayor grado de atenuación, se introdujo una tercera mutación por deleción en cdt en el mutante \chi3927 de cya^{-}, crp^{-} (Curtiss et al (1994), mencionado anteriormente). cdt es un gen que afecta a la diseminación de la salmonela desde el tejido linfoide asociado al intestino hacia órganos más profundos del sistema reticuloendotelial, tales como hígado, bazo y médula ósea (Kelly et al, Infect. Immun., 60:4881-4890 (1992)). La cepa triple mutante de cya^{-}, crp^{-}, cdt^{-} resultante, \chi4073, se alimentó a norteamericanos adultos sanos, con tampón, en dosis únicas que contenían 5,0 x 10^{5}, 5,0 x 10^{6}, 5,0 x 10^{7} o 5,0 x 10^{8} ufc (Tacket et al (1997), mencionado anteriormente). La cepa se toleró bien, excepto por un individuo en el grupo de 5,0 x 10^{7} ufc que desarrolló diarrea (Tacket et al (1997), mencionado anteriormente). Ningún sujeto manifestó vaccinemia. Cuatro de los cinco sujetos que ingirieron 5,0 x 10^{8} ufc mostraron aumentos significativos de anticuerpo IgG anti-O sérico, y tuvieron ASC que fabricaban anticuerpo IgA anti-O (Tacket et al (1997), mencionado anteriormente).
G. Cepas con mutaciones en phoP/phoQ
Se han construido dos cepas de S. typhi candidatas que albergan deleciones en phoP/phoQ have (Hohmann et al (1996a), mencionado anteriormente; y Hohmann et al, Vaccina, 14:19-24 (1996b)). Se encontró que la cepa Ty445, que también alberga una deleción en aroA, estaba demasiado atenuada y sólo era mínimamente inmunogénica (Hohmann et al (1996b), mencionado anteriormente). En cambio, la cepa Ty800, un derivado de Ty2 que sólo tiene deleciones en phoP, phoQ se toleraba generalmente bien y era inmunogénica cuando se evaluó en niveles de dosificación desde 10^{7} hasta 10^{10} ufc en un pequeño ensayo clínico en fase 1 que implicaba a 11 sujetos (Hohmann et al (1996b), mencionado anteriormente). En el nivel de dosificación superior, 1 de los 3 vacunados desarrolló diarrea (heces blandas de 10). Es difícil comparar las respuestas inmunitarias de los sujetos que recibieron Ty800 con las observadas en destinatarios de CVD 908-htrA y \chi4073, ya que algunas de las técnicas de evaluación inmunológica fueron diferentes, e incluso cuando se usó el mismo ensayo (por ejemplo, ASC de IgA que fabrican anticuerpos anti-O), se sabe que se producen variaciones considerables entre laboratorios.
H. Resumen
CVD 908 se tolera bien, pero se asocia con vaccinemias en aproximadamente el 50% de los sujetos que ingieren una dosis de 10^{7} ufc. Se ha observado diarrea leve, pero definitiva, en aproximadamente el 10% de los sujetos que han ingerido CVD908- htrA, Ty800 o \chi4073. La respuesta inmunitaria frente a \chi4073 fue menos potente que la observada tras la inmunización oral con CVD 908, CVD 908-htrA y, aparentemente, Ty800 (véase la tabla 1 anterior). Por tanto, aunque existen cuatro cepas de S. typhi atenuadas que han completado ensayos clínicos en fase 1, cada una está asociada con al menos un inconveniente de preocupación suficiente para que exista interés en el desarrollo de cepas de vacunas de S. typhi atenuadas candidatas adicionales. Además, ninguna de estas cuatro cepas ha conseguido provocar anticuerpo IgG anti-Vi sérico, una respuesta inmunitaria protectora conocida.
VI. Uso de cepas de salmonela atenuadas como vacunas de vector atenuado para expresar genes extraños que codifican para antígenos protectores a partir de otros patógenos y administrar esos antígenos al sistema inmunitario
Las vacunas de vector atenuado, también denominadas "vacunas de vector" o "sistemas de administración de antígeno atenuado", comprenden un área excitante y versátil del estudio de las vacunas (Levine et al, Microecol. Ther., 19:23-32 (1990); Morris et al, Gastroenterol., 103:699-702(1992); Barletta et al, Res. Microbiol., 141:931-940 (1990); Dougan et al, Para. Immunol., 9:151-160 (1987); y Curtisset al, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 146:35-49 (1989)). En este enfoque, una vacuna bacteriana o viral atenuada se modifica de manera que expresa xenoantígenos protectores de otros microorganismos, y administra esos antígenos al sistema inmunitario, estimulando así una respuesta inmunitaria protectora. Los vectores bacterianos atenuados que están promulgándose incluyen, entre otros, salmonela atenuada (Levine et al (1990), mencionado anteriormente; Morris et al, mencionado anteriormente; Dougan et al, mencionado anteriormente; y Curtiss et al (1989), mencionado anteriormente), bacilo de Calmette-Guerin (Barletta et al, mencionado anteriormente), Yersinia enterocolitica (Van Damme et al, Gastroenterol.,103:520-531 (1992)), V. cholerae O1 (Viret et al, Mol. Microbiol., 7:239-252 (1993)), y E. coli (Hale, Res. Microbiol., 141:913-919 (1990)). Cada uno tiene ciertas ventajas y algunas desventajas.
S. typhi atenuada es particularmente atractiva como vacuna de vector atenuado para seres humanos debido a que se administra por vía oral, forma colonias en el tejido linfoide asociado al intestino así como en el sistema reticuloendotelial, provoca una amplia respuesta inmunitaria (que incluye anticuerpos séricos, SIgA mucosal, diversas respuestas inmunitarias mediadas por células incluyendo CTL clásica, y una forma de citotoxicidad celular que depende de anticuerpos) (Conry et al, Gene Therapy, 2:59-65 (1995); Cox et al, J. Virol., 67:5664-5667 (1993); Davis et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:7213-7218 (1996a); Davis et al, Vaccines, 96:111-116, Brown et al, (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996b); Tacket et al (1992a), mencionado anteriormente; Gonzalez et al, J. Infect. Dis., 169:927-931 (1994); y Sztein et al (1994), mencionado anteriormente). Además, es fácil manipular genéticamente la salmonela, y ya se han expresado muchos xenoantígenos en esta bacteria. En teoría, pueden desarrollarse vacunas de una dosis oral frente a una variedad de enfermedades infecciosas introduciendo de manera estable y expresando genes extraños que codifican para antígenos protectores en una cepa de vector atenuado de S. typhi bien tolerada, aunque sumamente inmunogénica (Levine et al (1990), mencionado anteriormente).
VII. Salmonela con mutaciones en la ruta metabólica de la purina A. Informes tempranos de cepas de salmonela con mutaciones en la ruta metabólica de la purina
Las mutaciones de purA y purB en la salmonela (que interrumpen la biosíntesis de novo de nucleótidos de adenina) (ver la figura 2) son tan sumamente atenuantes (McFarland et al, Microb. Patogen., 3:129-141 (1987)) que esas cepas no son protectoras en animales (O'Callagham et al, Infect. Immun., 56:419-423 (1988)), y son poco inmunogénicas en seres humanos (Levine et al (1987b), mencionado anteriormente). En cambio, se ha notificado que las mutaciones en varios de los genes implicados en la ruta de la purina común (es decir, purF, purG, purC, purHD) que interrumpen la biosíntesis de ambos nucleótidos de purina (ver la figura 2), o en guaB o guaA, interrumpiendo así la biosíntesis de nucleótidos de guanina (ver la figure 2), son mucho menos atenuantes (McFarland et al, mencionado anteriormente); de hecho, tales cepas inducen la muerte en ratones en dosis de tan solo 10^{2} ufc (McFarland et al, mencionado anteriormente).
Las observaciones revisadas anteriormente sugieren que:
(i) las mutaciones que afectan a las enzimas de la ruta de la purina común son levemente atenuantes (McFarland et al, mencionado anteriormente); y
(ii) las mutaciones distales de la ruta común y que afectan a la síntesis de nucleótidos de adenina son demasiado atenuantes (es decir, purA, purB) (McFarland et al, mencionado anteriormente; O'Callagham et al, mencionado anteriormente; y Levine et al, (1987b) mencionado anteriormente), pero las mutaciones distales que afectan a la síntesis del nucleótido de guanina sólo son mínimamente atenuantes (McFarland et al, mencionado anteriormente).
B. Observaciones inesperadas y únicas en la presente invención
Basándose en las observaciones publicadas notificadas anteriormente, se descubrió por tanto de manera inesperada que una auxotrofía de gua específica en S. typhi proporcionaba un alto grado de atenuación. Se cree que esta atenuación se debe, en parte, a una invasividad reducida (una propiedad que no se ha descrito anteriormente en otras Salmonella spp. con mutaciones atenuantes en rutas metabólicas) así como a la disminución de la tasa de replicación intracelular de mutantes de S. typhi \DeltaguaB-A. Este hallazgo era inesperado ya que se notificó que S. dublin y S. typhimurium que albergan mutaciones de Tn5 de inserción que afectan a la síntesis de nucleótidos de guanina sólo estaban mínimamente atenuados (McFarland et al, mencionado anteriormente). Además, otro hallazgo inesperado fue que a pesar de este alto grado de atenuación, la cepa CVD 915 de S. typhi \DeltaguaB-A descrita en el en el presente documento era muy inmunogénica en un modelo de animal murino. Esta observación es inesperada a partir de informes previos en los que cepas sumamente atenuadas, con mutaciones que inactivan purA y purB, han sido muy poco inmunogénicas (Edwards et al, mencionado anteriormente). Además, otra observación inesperada fue que la cepa CVD 915 indujo una respuesta inmunitaria impresionante frente a un antígeno recombinante expresado en la misma cepa atenuada. Esta observación es inesperada a partir de observaciones notificadas previamente en las que las cepas sumamente atenuadas han sido malos vectores atenuados para antígenos heterólogos recombinantes (Tacket et al (1997), mencionado anteriormente).
Además, la cepa CVD 915 pudo administrar un vector de expresión eucariótico que codificaba para un xenoantígeno recombinante (vacuna mediada por ADN) y provocar una respuesta inmunitaria asombrosa. La propiedad de administrar un plásmido de vector de expresión eucariótico se ha notificado con vectores de shigella atenuada (Sizemore et al, Science, 270:299-302(1995)); y con vectores de Salmonella typhimurium atenuada (Darji et al, Cell, 91:765-775 (1997)). Shigella spp. son microorganismos invasivos y se cree que su éxito para administrar vacunas de ADN es secundario al hecho de que dejan el fagosoma inmediatamente tras la invasión (Sansonetti et al, Infect. Immun., 51:461-469 (1986)). Sin embargo, la salmonela no deja el fagosoma tras la invasión. Por tanto, la observación presentada en el presente documento es inesperada desde el concepto previo y es única.
En resumen, en la presente invención se ha ideado un método único para diseñar mediante ingeniería genética salmonela atenuada para lograr la expresión constitutiva y estable del antígeno Vi. Además, los mutantes de salmonela de la presente invención también están preferiblemente atenuados mediante mutaciones en la ruta metabólica de guanina de novo.
Sumario de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar cepas atenuadas de salmonela que expresan manera constitutiva el antígeno Vi.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para lograr una expresión constitutiva del antígeno Vi.
Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar salmonela que también está atenuada mediante mutaciones en la ruta metabólica de la guanina de novo.
Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para lograr una mutación por deleción en los genes guaB y guaA de salmonela.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una vacuna oral o intranasal (es decir, mucosal) frente a la fiebre tifoidea.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar cepas de salmonela que son útiles como vectores atenuados de genes extraños clonados a partir de otros patógenos, y que con una expresión e inmunización apropiada, harán surgir respuestas inmunitarias protectoras frente a los patógenos de los que se derivan los xenoantígenos.
Todavía un objeto adicional de la presente invención es proporcionar cepas de salmonela que son útiles como vectores atenuados para administrar vacunas mediadas por ADN.
Estos y otros objetos de la presente invención, que resultarán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención proporcionada a continuación, se han cumplido, en una realización, mediante un mutante de salmonela atenuado, en el que dicho mutante expresa manera constitutiva el antígeno Vi.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-1B muestran el operón viaB; y representan esquemáticamente el intercambio del promotor de tipo natural, regulado de manera osmótica, de vipR en el operón viaB mediante el casete sacB-Neo (figura 1A); e intercambio de la inserción del casete sacB-Neo mediante el potente promotor constitutivo P_{tac}, con el fin de hacer constitutiva la expresión del antígeno Vi (figura 1B).
La figura 2 muestra la ruta de biosíntesis de novo de purina y la contribución de la ruta metabólica aromática. En la figura 2, las flechas discontinuas ilustran rutas en las que no se representan las etapas individuales. Las enzimas se representan por sus genes. Las letras en superíndice representan cepas seleccionadas con una mutación del gen implicado en esa reacción. Las cepas representadas son: a: purF1741::Tn10 S. dublin SL5437 (McFarland et al, mencionado anteriormente); b: purG876::Tn10 S. dublin SL5436 (McFarland et al, mencionado anteriormente); c: purC882::Tn10 S. dublin SL5435 (McFarland et al, mencionado anteriormente); d:purH887::Tn10 S. dublin SL2975 (McFarland et al, mencionado anteriormente); e: \DeltaguaB-A S. flexneri 2a CVD 1204 y \DeltaguaB-A, DvirG S. flexneri 2a CVD 1205 (Noriega et al, Infect. Immun., 64:3055-3061 (1996)) y \DeltaguaB-A Salmonella typhi CVD915 (presente invención); f: aroD25::Tn10 S. flexneri Y SFL114 (Lindberg et al, (1990) mencionado anteriormente), SFL124 (Li et al, mencionado anteriormente), S. flexneri 2a 1070 (Karnell et al (1995) mencionado anteriormente); g: \DeltaaroC, \DeltaaroD S. typhi CVD 908 (Hone et al (1991), mencionado anteriormente); h:hisG46 DEL407, aroA554::Tn10 S. typhimurium SL3261 (Hoiseth et al, mencionado anteriormente); i: \DeltaaroA S. flexneri 2a CVD 1201 y \DeltaaroA, \DeltavirG CVD 1203 (Noriega et al, Infect. Immun., 62:5168-5172 (1995); y j: \DeltaaroA, \DeltahisG, \DeltapurA S. typhi 541Ty (Levine et al (1987b), mencionado anteriormente). En la figura 2, las abreviaturas se definen tal como sigue: PRPP: 5-fosforibosil-\beta-1-pirofosfato; PRA: 5-fosforibosilamina; GAR: 5'-fosforibosil-1-glicinamida; FGAR: 5'-fosforibosil-N-formilglicinamida; FGAM: 5'-fosforibosil-N-formilglicinamidina; AIR: 5'-fosforibosil-5-aminoimidazol; CAIR: ácido 5'-fosforibosil-5-aminoimidazol-4-carboxílico; SAICAR: 5'-fosforibosil-4-(N-succinocarboxamida)-5-aminoimidazol; AICAR: 5'-fosforibosil-4-carboxamida-5-aminoimidazol; FAICAR: 5'-fosforibosil-4-carboxamida-5-formamidoimidazol; IMP: ácido inosínico; Hx: hipoxantina; G: guanina; y A: adenina.
Las figuras 3A-3G muestran la secuencia de ADN que codifica para los genes guaA y guaB Escherichia coli (SEQ ID NO:1)(números de acceso de GenBank M10101-M10102) (Thomas et al, Gene, 36:45-53 (1985); Tiedeman et al, J. Biol. Chem.,260:8676-8679 (1985); y Tiedeman et al, Nucleic Acids Res., 13:1303-1316 (1985)), que se considera que es sumamente homóloga con los guaA y guaB de Salmonella spp., así como algunos sitios de endonucleasa de restricción útiles para crear los mutantes de deleción de la presente invención.
La figura 4 muestra esquemáticamente la orientación del operón guaB-A, así como la ubicación de algunos sitios de endonucleasa de restricción útiles para crear los mutantes por deleción de la presente invención; los segmentos del operón guaB-A amplificados mediante PCR; y la fusión mediante PCR de los segmentos del operón guaB-A que constituyen el alelo \DeltaguaB-A. Además, se muestra la clonación del operón de arsenito (ars) en el medio del alelo \DeltaguaB-A que da como resultado el casete \DeltaguaB-A::P_{tac}-ars. Este casete de deleción se clonó posteriormente en un plásmido suicida y se intercambió por el alelo guaB-A de tipo natural en la cepa Ty2 de S. typhi, dando como resultado la cepa \DeltaguaB-A S. typhi CVD 915.
La figura 5 es una representación esquemática de la construcción de pcADN3/tetC (una vacuna de ADN que codifica para el fragmento C de la toxina del tétanos con el control del promotor del citomegalovirus (CMV) humano).
La figura 6 muestra la respuesta del anticuerpo anti-fragmento C en ratones tras la inmunización intranasal con cepa \DeltaguaB-ACVD 915 que expresa el fragmento C de la toxina del tétanos, o que lleva un casete de expresión eucariótico que codifica para el fragmento C de la toxina del tétanos.
La figura 7 muestra la respuesta proliferativa del linfocito murino frente al fragmento C de la toxina del tétanos tras la inmunización intranasal con cepa \DeltaguaB-A CVD 915 sola, o como un vector que expresa el fragmento C de la toxina del tétanos o que lleva un casete de expresión eucariótico que codifica para el fragmento C de la toxina del tétanos.
La figura 8 muestra la respuesta proliferativa del linfocito murino frente a cilios de S. typhi tras la inmunización intranasal con cepa \DeltaguaB-A CVD 915 sola, o como un vector que expresa el fragmento C de la toxina del tétanos o que lleva un casete de expresión eucariótico que codifica para el fragmento C de la toxina del tétanos.
La figura 9 muestra la respuesta del anticuerpo anti-cilios de S. typhi en ratones tras la inmunización intranasal con cepa \DeltaguaBA S. typhi CVD 915 o cepa \DeltaaroC, \DeltaaroD, \DeltahtrA S. typhi CVD 908-htrA.
La figura 10 muestra la respuesta del anticuerpo anti-LPS de S. typhi en ratones tras la inmunización intranasal con cepa \DeltaguaB-A S. typhi CVD 915 o cepa \Deltaa\rhooC, \Deltaa\rhooD, DhtrA S. typhi CVD 908- htrA.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona salmonela atenuada para su uso, entre otros, como vacunas orales frente a la fiebre tifoidea, y como vacunas de vector atenuado y mediadas por ADN que expresan xenoantígenos. Tal como se usa en el presente documento, un "xenoantígeno" se refiere a un xenoantígeno para la salmonela.
Además, en la presente invención, se proporciona un mutante de salmonela atenuado, en el que el genoma cromosómico de la salmonela se modifica sustituyendo el promotor vipR sumamente regulado por un promotor fuerte constitutivo, haciendo así que la expresión del antígeno Vi en la salmonela atenuada sea estable y constitutiva. El promotor constitutivo particular empleado en la presente invención no es crítico para la misma. Ejemplos de tales promotores constitutivos incluyen P_{tac}(de Boer et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:21-25 (1983)), P_{lac} (De Boer et al, mencionado anteriormente), P_{trc} (De Sutter et al, Gene, 141:163-170 (1994)), P_{01ac} y P_{1pp} (De Sutter et al, mencionado anteriormente; y Guisez et al, Protein Expr. Purif., 2:249-258 (1998)).
La cepa S. typhi particular empleada como material de partida en la presente invención no es crítica para la misma.
En los ejemplos en el presente documento se construyó la vacuna de S. typhi a partir de la cepa Ty2 de S. typhi de tipo natural. La cepa Ty2 de S. typhi es una cepa de salmonela virulenta bien conocida disponible a partir de una diversidad de fuentes, tales como el CVD, el centro para el control de enfermedades (CDC), el instituto de investigación Walter Reed Army, la universidad de los servicios uniformados para las ciencias de la salud, el Instituto Pasteur (Francia), Imperial College (Inglaterra).
Otras cepas de S. typhi de tipo natural que se han usado en el desarrollo de candidatos de vacuna atenuada, y que pueden emplearse como materiales de partida en la presente invención incluyen: cepa CDC1080 (Levine et al (1987b), mencionado anteriormente), que puede obtenerse de la universidad de Standford o del CDC, y cepa ISP1820 (Hone et al (1991), mencionado anteriormente), que puede obtenerse del centro para el desarrollo de vacunas, universidad de Maryland.
Preferiblemente, en la presente invención, el genoma cromosómico de la salmonela se modifica retirando o modificando de otro modo el operón guaB-A, y bloqueando así la biosíntesis de novo de nucleótidos de guanina. Más preferiblemente, una mutación definida, en el marco, no polar, en el operón guaB-A inactiva las enzimas de la ruta metabólica de la purina IMP deshidrogenasa (codificada por guaB) y GMP sintetasa (codificada por guaA). Como consecuencia de estas mutaciones, la salmonela no puede realizar la síntesis de novo de GMP, y en consecuencia de los nucleótidos GDP y GTP (ver la figura 2), lo que limita gravemente su crecimiento en tejidos de mamíferos. In vitro, los mutantes de salmonela \DeltaguaB-A de la presente invención no pueden crecer en medio mínimo a menos que se suplemente con guanina. En cultivos tisulares, se encontró que los mutantes de salmonela \DeltaguaB-A de la presente invención muestran una reducción significativa de su capacidad de invasión. Los mutantes de salmonela \DeltaguaB-A pueden eliminar nucleótidos de guanina de los tejidos en el huésped mamífero. Sin embargo, su asimilación en la salmonela requiere una desfosforilación previa en nucleósidos mediante nucleotidasas periplásmicas para incorporarse como precursores de nucleótidos en la ruta de recuperación de guanina. Por tanto, ya que los nucleótidos están fácilmente disponibles en el entorno intracelular del huésped mamífero, la atenuación debida a la síntesis de novo de nucleótidos de guanina se debe o bien a la ineficacia de la ruta de recuperación o bien a razones que no resultan claras para los conocimientos actuales.
El gen guaA, que codifica para la GMP sintetasa, tiene un tamaño de 1575 pb (ver las figuras 3A-3G). Por tanto, el tamaño de una deleción inactivante intracistrónica en el mutante guaA puede oscilar desde 1 hasta 1575 pb, preferiblemente, desde 100 hasta 1575 pb si la deleción está dentro del marco. También pueden realizarse deleciones que se extienden más allá del gen guaA, es decir, las deleciones extracistrónicas en el sentido de 3' del guaA pueden afectar a la transcripción de este gen, y por tanto inactivarlo. Sin embargo, esto último no es preferible.
El gen guaB, que codifica para la IMP deshidrogenasa, tiene un tamaño de 1533 pb (ver las figuras 3A-3G). Por tanto, el tamaño de una deleción intracistrónica en el mutante guaB puede oscilar desde 1 pb hasta 1533 bp, preferiblemente, desde 100 hasta 1533 pb si la deleción está dentro del marco. También pueden realizarse deleciones que se extienden más allá del gen guaB, es decir, las deleciones extracistrónicas en el sentido de 3' del guaB pueden afectar a la transcripción de ambos genes (guaB y guaA), y por tanto inactivarlos. Sin embargo, esto último no se prefiere.
Pueden realizarse deleciones en el gen guaA usando 2 sitios de restricción convenientes localizados en el gen guaA; ejemplos de los mismos son ScaI o AccI y EcoRV o SalI o SmaI o SphI o XmaI (figuras 3A-3G y figura 4), o mediante mutagénesis dirigida al sitio con oligonucleótidos (Sambrook et al, In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Eds., Cold SpringHarbor Publications (1989)).
Pueden realizarse deleciones en el gen guaB usando dos sitios de restricción convenientes localizados en el gen guaB; ejemplos de éstos son BclI y BsmI o EcoRI o PvuII o SacII o SspI o XhoII (figuras 3A-3G y figura 4), o mediante mutagénesis dirigida al sitio con oligonucleótidos (Sambrook et al, mencionado anteriormente).
Además, puede usarse cualquier combinación de sitios de restricción localizados simultáneamente en los genes guaB y guaA para obtener los mutantes por deleción de la presente invención; ejemplos de los cuales incluyen AccIII, AflIII, AhaII, AlwI, AlwNI, AsuI, BanI, BcnI, Bsp1286, BspMII, y DdeI (figuras 3A-3G).
La inactivación del gen guaA y/o el gen guaB también puede llevarse a cabo mediante una inserción de un ADN extraño usando cualquiera de los sitios de restricción mencionados anteriormente, o mediante mutagénesis dirigida al sitio (Sambrook et al, mencionado anteriormente) de modo que se interrumpe la transcripción correcta de guaB y/o guaA. El tamaño típico de una inserción que puede inactivar el gen guaA gene y el gen guaB es de desde 1 par de bases hasta 100 kpb, aunque se prefieren las inserciones menores de 100 kpb. La inserción puede realizarse en cualquier sitio dentro de la región codificante del gen guaA o gen guaB o entre la región codificante y el
promotor.
Otros métodos para la inactivación del gen guaA y/o el gen guaB incluyen la transferencia en la salmonela de deleciones o inserciones realizadas en otros genes guaA o guaB de enterobacterias, deleciones generadas por transposones, y escisión imprecisa de inserciones de ADN. Es más probable que los dos últimos métodos realicen deleciones que se extienden más allá del gen guaA o guaB, y por tanto no se prefieren.
Los mutantes de gua de la presente invención son útiles para el desarrollo de una vacuna oral atenuada candidata de salmonela no reactogénica.
Pueden construirse candidatos de vacuna de salmonela que, por ejemplo, además de contener otras mutaciones atenuantes, no consiguen expresar los productos del gen aro. Esto puede conseguirse delecionando la parte de al menos uno de los genes aro (aroA, aroC, o aroD) en el cromosoma de salmonela, volviendo a la cepa auxotrófica para PABA, un sustrato que no puede eliminarse en la célula de mamífero, tal como la cepa CVD 908 de Salmonella typhi (Hone et al (1991), mencionado anteriormente).
En otra realización, se han cumplido los objetos descritos anteriormente de la presente invención mediante una vacuna frente a la fiebre tifoidea que comprende:
(A) una cantidad farmacéuticamente eficaz de un mutante de Salmonella typhi, en el que dicho mutante expresa de manera constitutiva antígeno Vi en el que en dicho mutante, se sustituye el promotor vipR por un promotor constitutivo, de manera que se provoca una expresión constitutiva de viaB; y
(B) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Aún en otra realización, se ha cumplido el objeto descrito anteriormente de la presente invención mediante una vacuna de vector atenuado frente a la fiebre tifoidea que comprende:
(A) una cantidad farmacéuticamente eficaz de un mutante de salmonela, en el que dicho mutante expresa de manera constitutiva antígeno Vi, en el que en dicho mutante, se sustituye el promotor de vipR por un promotor constitutivo, de manera que se provoca la expresión constitutiva de viaB, y en el que dicho mutante codifica y expresa un xenoantígeno con el control de un promotor procariótico (es decir, expresión bacteriana del xenoantígeno); y
(B) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
El xenoantígeno particular empleado en el vector atenuado de salmonela no es crítico para la presente invención. La(s) cepa(s) de salmonela atenuada(s) de la presente invención pueden usarse como vector(es) atenuado(s) para la inmunización frente a patógenos entéricos (definiéndose patógeno como bacteriano, vírico, etc.), patógenos de enfermedades de transmisión sexual, patógenos de enfermedades de las vías respiratorias agudas o patógenos con una entrada mucosal que conduce a manifestaciones sistémicas graves (por ejemplo, enfermedad por meningococos). También puede usarse para proteger frente a diferentes tipos de infecciones parasitarias, tales como Plasmodium falciparum, Leishmania species, Entameba histolytica y Cryptosporidium.
Ejemplos de antígenos a partir de patógenos entéricos que pueden expresarse en los vectores atenuados de salmonela de la presente invención incluyen:
(a) Factores de colonización de fimbria de E. coli enterotoxigénica, y o bien la subunidad B de la enterotoxina termolábil o una enterotoxina termolábil mutante (que no provoca secreción intestinal, pero provoca una antitoxina neutralizante);
(b) Antígenos de fimbra y/o intimina de E. coli enterohemorrágica, junto con la subunidad B de la toxina Shiga 1 ó 2 (o toxina Shiga 1 ó 2 mutante);
(c) antígenos anti-O de Shigella y antígenos plásmidos de invasión o VirG de Shigella;
(d) Antígenos de neutralización de rotavirus;
(e) Ureasa, antígenos de colonización y otros antígenos protectores de Helicobacter pilori; y
(f) Toxinas de Clostridium difficile inactivado o antígenos derivados de ellas.
Ejemplos de antígenos de patógenos de transmitidos por vía sexual que pueden expresarse en vectores atenuados de salmonela de la presente invención incluyen:
(a) Pili o proteínas de membrana externa de Neisseria gonorrhoae; y
(b) Proteínas de Chlamydia trachomatis.
Ejemplos de antígenos de patógenos de las vías respiratorias agudas que pueden expresarse en vectores atenuados de salmonela de la presente invención incluyen:
(a) Una toxina de difteria mutante con sustituciones en el dominio de unión NAD que carece de capacidad tóxica, aunque provoca una antitoxina neutralizante;
(b) Antígenos de Bordetella pertussis, incluyendo una proteína de fusión que consiste en la subunidad S1 truncada de la toxina de pertussis condensada al fragmento C de la toxina del tétanos, toxina de pertussis mutante, hemaglutinina filamentosa y pertactina;
(c) glucoproteínas F y G del virus respiratorio sincitial;
(d) Polisacárido capsular de Haemphlus influenzae de tipo b; y
(e) Polisacáridos capsulares de Neisseria meningitidis de grupo A y C, y proteínas de membrana externa de N. meningitidis de grupo B.
Ejemplos de antígenos de parásitos que pueden expresarse en vectores atenuados de salmonela de la presente invención incluyen:
(a) La proteína del circunsporozoito (CSP), antígeno del estadio hepático-1 (LSA-1), SSP-2 (también conocido como TRAP) y Exp-1 de Plasmodium falciparum;
(b) Antígenos en fase eritrocítica asexual de P. falciparum, incluyendo MSP-1, MSP-2, SERA, AMA-1 y SREHP;
(c) Antígenos en fase sexual P. falciparum, incluyendo Pfs25, y gp63 de Leishmania species; y
(d) La proteína de Entameba histolytica rica en serina (SREHP).
Todavía en otra realización, se han cumplido los objetos descritos anteriormente de la presente invención mediante una vacuna mediada por ADN que comprende:
(A) una cantidad farmacéuticamente eficaz de un mutante de salmonela, en el que dicho mutante expresa de manera constitutiva antígeno Vi, y en el que dicho mutante contiene un plásmido que codifica y expresa, usando un promotor eucariótico, en una célula eucariótica, un xenoantígeno; y
(B) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los detalles en cuanto a la construcción y uso de vacunas mediadas por ADN pueden encontrarse en la solicitud de patente de los EE.UU. de número de serie 08/433.790, presentada el 3 de mayo, 1995, que se incorpora como referencia al presente documento en su totalidad.
El xenoantígeno particular empleado en la vacuna mediada por ADN no es crítico para la presente invención. Ejemplos de tales antígenos incluyen los de una variedad de patógenos, tales como influenza (Justewicz et al, J. Virol., 69:7712-7717 (1995); y Fynan et al, Int. J. Immunopharmacol., 17:79-83 (1995)), virus de la coriomeningitis linfocítica (Zarozinski et al, J. Immunol., 154:4010-4017 (1995)), virus de la inmunodeficiencia humana (Shiver et al, Ann. NY. Acad.Sci., 772:198-208 (1995)), virus de la hepatitis B (Davis et al, Vacuna, 12:1503-1509 (1994)), virus de la hepatitis C (Lagging et al, J. Virol., 69:5859-5863 (1995)), virus de la rabia (Xiang et al, Virology, 209:569-579 (1995)), esquistosoma (Yang et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:1029-1039 (1995)), plasmodio (Sedegah et al, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 91:9866-9870 (1994)); y micoplasma (Barry et al, Nature, 377:632-635 (1995)).
La decisión de si expresar el xenoantígeno en salmonela (usando un promotor procariótico en una vacuna atenuada) o en las células invadidas por salmonela (usando un promotor eucariótico en una vacuna mediada por ADN) puede basarse en qué construcción de vacuna para ese antígeno particular da la mejor respuesta inmunitaria en estudios en animales o ensayos clínicos, y/o, si la glucosilación de un antígeno es esencial para si inmunogenicidad protectora, y/o, si la conformación terciaria correcta de un antígeno se logra mejor con una forma de expresión que con la otra.
En las vacunas de la presente invención, la cantidad farmacéuticamente eficaz de los mutantes de la presente invención que debe administrarse puede variar dependiendo de la edad, el peso y el sexo del sujeto, y del modo de administración. Generalmente, la dosis empleada será de aproximadamente 10^{2} ufc a 10^{10} ufc. Preferiblemente, se usan de aproximadamente 10^{6} ufc a 10^{9} ufc para una administración oral en la que la vacuna se administra en cápsulas o se vuelve a suspender en una disolución tampón para proteger a la bacteria atenuada frente al pH ácido en el estómago; o se usan de aproximadamente 10^{2} ufc a 10^{7} ufc para una administración intranasal en la que se administra la bacteria en gotas o en aerosol.
El vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable particular empleado no es crucial para la presente invención, y son convencionales en la técnica. Ejemplos de diluyentes incluyen: tampones para el tamponamiento frente al ácido gástrico en el estómago, tales como tampón citrato (pH 7,0) que contiene sacarosa, tampón bicarbonato (pH 7,0) solo (Levine et al, (1987b) mencionado anteriormente; y Black et al, mencionado anteriormente), o tampón bicarbonato (pH 7,0) que contiene ácido ascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo (Levine et al, Lancet, II:467-470 (1988)). Ejemplos de vehículos incluyen: proteínas, por ejemplo, tal como se encuentran en la leche desnatada; azúcares, por ejemplo, sacarosa; o polivinilpirrolidona.
Los mutantes de la presente invención pueden almacenarse a -70ºC mientras están suspendidos en caldo de Luria (DIFCO) que contiene el 30%-50% (v/v) de glicerol.
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo para fines ilustrativos, y no se pretende de ninguna manera que limiten el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1 Construcción de cepas de S. typhi \DeltaguaB-A A. Construcción del casete pJW101 de deleción de \DeltaguaB-A
Se amplificaron segmentos de ADN que incluyen el extremo terminal 5' del gen guaB, y el extremo terminal 3' del gen guaD mediante PCR usando ADN genómico de cepa Ty2 de S. typhi como molde, y luego se condensó con una segunda reacción de PCR, dando lugar así al alelo \DeltaguaB-A (figura 4). Los métodos usados en la construcción del alelo \DeltaguaB-A fueron análogos a los descritos en la construcción del alelo \DeltaguaB-A en la cepa CVD 1204 S. flexneri 2a de \DeltaguaB-A (Noriega et al (1996), mencionado anteriormente; y solicitud de patente de los EE.UU. de número de serie 08/629.600, presentada el 9 de abril, 1996 (ahora permitida), que se incorpora como referencia en el presente documento en su totalidad).
En la primera reacción de PCR (figura 4) los cebadores usados para amplificar el extremo terminal 5' del alelo guaB-A fueron: 5'-CGAGCTCGCGAGCTCGGTAAAGTACCAGTGACCGGAAGCTGGTTGCGT-3' (SEQ ID NO:2); y
5'-GGGCCCGGGGGATCCTCAACCGACGCCAGTCACGATACGAGTTGTACAGAT-3' (SEQ ID NO:3); y
los cebadores usados para amplificar el extremo terminal 3' del alelo \DeltaguaB-A fueron: 5'-TGAGGATCCCCCGGG
CCCGGCTACGCGCAGGTTGAAGTCGTAAACGACAGC-3' (SEQ ID NO:4); y
5'-GCTCTAGAGCTCTAGAGCTCATTCCCACTCAATGGTAGCTGGCGGCTT-3' (SEQ ID NO:5).
Dentro de los cebadores internos (SEQ ID NOS:3 y 4) se introdujo un codón de señal de parada en el marco (TGA y TCA) en el sentido de 5' de dos sitios de restricción únicos (ApaI y BamHI) (subrayados) que se añadieron para la introducción de genes extraños dentro del alelo de \DeltaguaB-A cromosómico. La señal de parada evita condensaciones de traducción de los productos de \DeltaguaB con \DeltaguaA, o del producto de \DeltaguaB con los productos de genes extraños insertados en el medio del alelo \DeltaguaB-A. Además, estos cebadores internos introdujeron secuencias que servían como región homóloga (en negrita) con las que se condensaban los productos de PCR en 5' y 3' en una segunda reacción de PCR (formando así el alelo \DeltaguaB-A) (figura 4).
En la segunda reacción de PCR, se condensaron los segmentos 5' y 3' usando cebadores de extremo (SEQ ID NOS:2 y 5), y el producto de condensación resultante se amplificó en la misma reacción. En esta reacción, una región homóloga dada (ApaI-BamHI) se hibridó, condensando de manera eficaz con los segmentos 5' y 3', que en ese momento pueden haber actuado como sus propios cebadores y/o moldes para la Taq polimerasa, dependiendo de qué cadena del ADN se hibridó. Para facilitar esta condensación, se diseñó un programa de PCR en el que los 15 primeros ciclos tenían una pendiente de temperatura de hibridación (1ºC/8 seg desde 40ºC hasta 50ºC + 50ºC durante 2 min), seguido de 15 ciclos con una temperatura de hibridación de 55ºC en la que se amplificó el nuevo alelo \DeltaguaB-A. Por tanto, había 900 pares de bases del operón guaB-A que no se amplificaron, dando lugar a \DeltaguaB-A
(figura 4).
Los cebadores de extremo (SEQ ID NOS:2 y 5) se diseñaron para introducir sitios de restricción únicos (SstI y XbaI)(subrayados) que se usaron para clonar el alelo \DeltaguaB-A en sitios de restricción únicos en el plásmido pFM307A suicida basado en psC101 (Blomfield et al, Mol. Microbiol., 5:1447-1457 (1991)) sensible a la temperatura, dando lugar a plásmido pFM307::\DeltaguaB-A. Se construyó el plásmido FM307A (6,3 Kpb) sustituyendo un fragmento de NaeI-NaeI de 4,3 Kpb, que contenía el gen cam (resistencia al cloranfenicol) en pIB307 (Blomfield et al, mencionado anteriormente) con un fragmento de BamHI-BamHI de 3,8 Kpb (terminado en extremos romos mediante la Klenow polimerasa) que contenía el casete SacB-Kan (que proporciona resistencia frente a la contraselección de kanamicina y sacarosa) a partir de pIB279 (Blomfield et al, mencionado anteriormente). Además, se consideró ventajoso insertar un marcador de selección no antibiótico en el medio del alelo \DeltaguaB-A con el fin de:
(i) facilitar el intercambio del \DeltaguaB-A por el alelo competente guaB-A en Ty2; y
(ii) proporcionar un marcador de selección que permita la identificación de la cepa de vacuna en el campo.
Por tanto, a continuación, se obtuvo el operón de resistencia arsénica (ars) de 5,0 Kpb de factor R R773 como un fragmento HindIII a partir de pUM1 (Chen et al, J. Bacteriol., 161:758-763 (1985)) (amablemente proporcionado por el Dr. Rosen, Wayne State University, Detroit,MI), y se clonó con la regulación del promotor P_{tac} en pKK223-3 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Luego, se obtuvo un segmento de P_{tac}-ars NaeI-DraI (de extremo romo), y se clonó en el sitio de ApaI (terminado en extremo romo por la T4 polimerasa) del alelo \DeltaguaB-A en pFM307::\DeltaguaB-A, dando pJW101 (figura 4).
B. Mutaciones producidas por casete de deleción de suicidio
Se usó pJW101 para introducir el alelo \DeltaguaB-A::P_{tac}-ars del mismo en la cepa Ty2 S. typhi de tipo natural mediante recombinación homóloga, tal como se describe por Blomfield et al, mencionado anteriormente; Noriega et al (1995), mencionado anteriormente, y Noriega et al (1996), mencionado anteriormente con la excepción de que estaba presente arsenito de sodio 6,0 \muM (SIGMA) en el medio a lo largo de todo el procedimiento.
C. Selección de mutantes mediante sondas de ADN y PCR
Se hicieron crecer clones bacterianos candidatos a 37ºC durante la noche en una cuadrícula sobre placas de agar Luria complementadas con arsenito de sodio 6,0 \muM o en medio mínimo. Entonces se transfirieron las colonias que crecían sobre el agar L complementado con arsenito, pero que no crecían en medio mínimo, a papel de filtro número 541 (Whatman, Maidstone, Inglaterra), se sometieron a inmunotransferencia tal como se describe por Gicquelais et al, J. Clin. Microbiol., 28:2485-2490 (1990), y se detectaron usando un polioligonucleótido de 40 pb marcado con \gammaP^{32}: 5'-GGGCGGCCTGCGCTCCTGTATGGGTCTGACCGGCTGTGGT-3' (SEQ ID NO:6), correspondiente a la parte delecionada del alelo de tipo natural guaB-A (sonda negativa). Se seleccionaron los clones que no consiguieron hibridarse con la sonda de polioligonucleótido de 40 pb marcado con \gammaP^{32}. Los clones de S. typhi \DeltaguaB-A no pudieron crecer en medio mínimo a menos que se complementase con 10 mg de guanina/l.
La mutación por deleción en el operón guaB-A y la inserción de P_{tac}-ars en el alelo \DeltaguaB-A se confirmó mediante hibridación por inmunotransferencia de tipo Southern con un operón \DeltaguaB-A marcado con p^{32}, operón ars, y la sonda negativa guaB-A descrita anteriormente. Se seleccionó arbitrariamente un clon de S. typhi \DeltaguaB-A y se denominó CVD 915. Se depositó la cepa CVD 915 en la colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection) el 4 de mayo, 1998, con el número ATCC 202115.
Se hace crecer la cepa CVD 915 de manera rutinaria con arsenito de sodio 6,0 \muM en el medio, pero no se obtiene crecimiento con esta concentración de arsenito con la cepa Ty2, o con cualquier otra cepa de salmonela, Shigella o E. coli probada.
Ejemplo 2 Crecimiento intracelular y de invasión en cultivos tisulares
Se sometió a ensayo el crecimiento intracelular y de invasión usando ensayos de protección de gentamicina, que se realizaron con ligeras modificaciones de los métodos descritos anteriormente por Tartera et al, Infect. Immun., 61:3084-3089 (1993). Brevemente, se infectaron monocapas de células Henle 407 sobre placas de 24 pocillos en pocillos por triplicado o bien con cepa Ty2 de tipo natural; CVD 915 \DeltaguaB-A; \DeltaaroC, CVD 908 \DeltaaroD o \DeltaaroC, \DeltaaroD, CVD 908-htrA \Deltahtr a una razón de 50:1, durante 90 min, tras lo cual se destruyeron los microorganismos extracelulares con 100 \mug/ml de gentamicina durante 30 min, se lavaron (punto de tiempo 0 horas), y luego se incubaron con 20 \mug/ml de gentamicina. A las 0 h, 4 h y 22 h después, se lisaron las monocapas de cultivo tisular infectadas por triplicado con agua estéril y se cultivaron durante la noche diluciones en serie de esa suspensión, a 37ºC, sobre agar LB complementado con 10 \mug de guanina por litro. Los resultados se muestran en la tabla 2 a continuación.
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TABLA 2 Crecimiento intracelular y de invasión en células Henle 407
ufc^{a} intracelulares
Cepa Genotipo 0 h 4 h 22 h
Ty2 Tipo natural 6,7 x 10^{3} 3,1 x 10^{4} 8,8 x 10^{4}
CVD 915 \DeltaguaB-A 3,3 x 10^{2} 2,9 x 10^{2} 2,5 x 10^{2}
CVD 908 \DeltaaroC, \DeltaaroD 5,8 x 10^{2} 1,3 x 10^{3} 3,2 x 10^{3}
CVD 908-htrA \DeltaaroC, \DeltaaroD, \DeltahtrA 1,3 x 10^{3} 3,4 x 10^{3} 1,3 x 10^{3}
^{a} Unidades formadoras de colonias
Tal como se muestra en la tabla 2 anterior, la cepa CVD 915 tenía una capacidad de invasión y un crecimiento intracelular que era significativamente inferior al mostrado por la cepa Ty2 de tipo natural, y comparable al mostrado por la cepa CVD 908-htrA. Es decir, tal como se muestra en la tabla 2 anterior, en dos experimentos diferentes, la cepa Ty2 de S. typhi de tipo natural invadió eficazmente células Henle 407, y las replicó durante 13 veces en un periodo de 22 h. La cepa CVD 908 \DeltaaroC, \DeltaaroD tenía sistemáticamente menos generaciones intracelulares, es decir, 6 veces a las 22 h. Como también se muestra en la tabla 2 anterior, la cepa mutante CVD 915 \DeltaguaB-A fue significativamente menos invasiva para las células Henle que su cepa original de tipo natural o las cepas CVD 908 y CVD 908-htrA, y su crecimiento intracelular, es decir, 0 veces, fue equivalente al del mutante CVD 908-htrA.
Ejemplo 3 Seguridad comparativa de cepas candidatas de vacuna Ty21A, CVD 908 y CVD 915
Se determinó la atenuación de la cepa CVD 915 \DeltaguaB-A de S. typhi con respecto a la cepa Ty2 de tipo natural, y otras cepas atenuadas, usando el ensayo de mucina de cerdo en ratones (Powell et al, J. Biolog. Standar., 8:79-85 (1980)). Brevemente, se inocularon ratones por vía intraperitoneal con diversas diluciones de diez veces de las diferentes cepas suspendidas en 0,5 ml de mucina de cerdo al 10%(p/v). Posteriormente, se realizó un seguimiento de los ratones para determinar la mortalidad que se producía en un plazo de 72 h tras la inoculación, y se calculó la DL_{50} de los diferentes grupos mediante análisis de su regresión lineal. Los resultados se muestran en la tabla 3 a continuación.
TABLA 3
Cepa DL_{50} en ufc
Ty2 1,4 x 10^{2}
CVD 908 4,4 x 10^{6}
CVD 915 7,7 x 10^{7}
Ty21a 1,9 x 10^{8}
Tal como se muestra en la tabla 3 anterior, la cepa CVD 915 tenía una DL_{50} estimada que estaba más de 5 potencias de diez por encima de la obtenida con la cepa Ty2 de tipo natural, y entre la obtenida con la cepa CVD 908 mutante \DeltaaroC, \DeltaaroD y la cepa Ty21 no invasiva, químicamente mutagenizada.
Ejemplo 4 Uso de la cepa CVD 915 como vector atenuado para administrar proteínas extrañas y plásmidos de vacuna de ADN para expresar xenoantígenos en células eucariotas
Se ha descrito un modelo de ratón de inmunización intranasal con una cepa \DeltaaroC, \DeltaaroD diseñada mediante ingeniería genética de S. typhi (CVD908) que lleva fragmento C de toxina del tétanos (fragmento C de TT) por Galen et al, Vaccine, 15:700-708(1997). Los constructos que se sometieron a ensayo en este modelo incluyeron CVD 908 que lleva plásmidos que codifican para fragmento C de TT no condensado con el control de un promotor procariótico anaeróbicamente activado derivado de nirB o el potente promotor constitutivo lpp. Se observó que:
(i) la inmunización intranasal de ratones con estos constructos dio como resultado títulos elevados de anticuerpos IgG anti-séricos de TT neutralizantes;
(ii) los ratones inmunizados estaban protegidos frente a una exposición con cien dosis letales al 50% de TT que mataron a todos los ratones control; y
(iii) que las células obtenidas a partir de los bazos y nódulos linfáticos regionales cervicales de ratones inmunizados por vía intranasal 6 semanas tras la inmunización mostraron respuestas proliferativas significativas frente a S. typhi (partículas de S. typhi de célula entera inactivadas por fenol y cilios Hd), así como frente a fragmento C de TT y antígenos TT.
Estas investigaciones se han extendido a continuación estudiando la inmunogenicidad en ratones de cepas atenuadas novedosas de S. typhi que llevan plásmidos que contienen genes que codifican para xenoantígenos (es decir, fragmento C de TT) con el control de promotores procarióticos o eucarióticos.
A. Respuestas inmunológicas provocadas por la inmunización con cepas atenuadas de S. typhi que llevan vectores de expresión procarióticos y eucarióticos que codifican para fragmento C de TT
Tras la observación de que pueden provocarse respuestas inmunitarias mediante inmunización directa con ADN de plásmidos (Ulmer et al, Science, 259:1745-1749 (1993)), se han evaluado varios vectores de ácidos nucleicos que codifican para xenoantígenos como vacunas. Se ha mostrado que la vacunación por ADN provoca altos niveles de respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células usando plásmidos que codifican para muchos antígenos virales, incluyendo NP del virus influenza A (Ulmer et al, mencionado anteriormente). Desde esta observación temprana, se han evaluado varios vectores de ácidos nucleicos que codifican para xenoantígenos como vacunas. En particular, se ha estudiado muy extensamente la vacunación por ADN usando antígenos del virus influenza. Se han inducido respuestas inmunitarias protectoras en ratones (Fynan et al, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 90:11478-11482 (1993a); Justewicz et al (1995), mencionado anteriormente; y Justewicz et al, Virol., 224: 10-17 (1996)), hurones (Webster et al, Vaccine, 12:1495-1498 (1994)), pollos (Fynan et al, DNA Cell Biol., 12:785-789 (1993b); y Fynan et al (1993a), mencionado anteriormente) y primates no humanos (Donnelly et al, Nat. Med., 1:583-587 (1995)) tras la inmunización por vía intramuscular (i.m.) o epidérmica (pistola de genes) con vectores de expresión eucarióticos que codifican para antígenos del virus influenza. También se han inducido respuestas inmunitarias frente a varios otros antígenos de otros virus (Cox et al, mencionado anteriormente; Davis et al (1996a), mencionado anteriormente; Donnelly et al, mencionado anteriormente; Lagging et al, mencionado anteriormente; Wang et al, Virol., 211:102-112 (1995); y Zarozinski et al, mencionado anteriormente); parásitos (Doolan et al, J. Exp. Med., 183:1739-1746 (1996); Gardner et al, J. Pharm. Sci., 85:1294-1300 (1996); Hoffman et al, Vaccine, 12:1529-1533 (1994); Sedegah et al, mencionado anteriormente; y Yang et al, mencionado anteriormente); bacterias (Anderson et al, Infect. Immun., 64:3168-3173 (1996); Barry et al, mencionado anteriormente; Huygen et al, Nat. Med., 2:893-898 (1996); Luke et al, J. Infect. Dis., 175:91-97 (1997); y Tascon et al, Nat. Med., 2:888-892 (1996)); y células tumorales (Conry et al, Cancer Res., 54:1164-1168 (1994); Conry et al (1995), mencionado anteriormente; y Wang et al, Human Gene Therapy, 6:407-418 (1995)) mediante vacunación por ADN en diversos modelos animales. Estos estudios han aumentado el entendimiento de la naturaleza de la respuesta inmunitaria provocada por vacunas de ADN. Por ejemplo, se han provocado fuertes respuestas de anticuerpos en ratones frente al antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) tras una única inmunización i.m. con un plásmidos que codifica para este antígeno (Davis et al, Hum. Mol. Genet., 2:1847-1851 (1993); y Michel et al, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 92:5307-5311 (1995)). En estos estudios, se observaron títulos de IgG máximos 4-8 semanas tras la inmunización, que persistieron con niveles altos durante 6 meses. También se ha mostrado que las vacunas de ADN que codifican para este antígeno son eficaces para provocar respuestas de anticuerpo y de CTL restringidos al CMH de clase I en ratones que no responden a HBsAg purificado (Davis et al (1996b), mencionado anteriormente; y Schirmbeck et al, J. Virol., 69:5929-5934 (1995)). Por tanto, al menos en el caso de HBsAg, se ha mostrado que la vacunación por ADN supera la restricción genética en ratones, e induce una respuesta inmunitaria más persistente que la inmunización por vía parenteral con proteínas purificadas.
La toxina del tétanos (TT) es una potente neurotoxina sintetizada por Clostridium tetani. La inmunidad protectora frente al tétanos en el hombre y los animales está relacionada con el título de anticuerpos neutralizantes de TT en el suero (Bizzini, In: Clostridium Tetani, Gyles et al (Eds.), Iowa State University Press, Ames, IA, páginas 97-105 (1993); y Habig et al, Vaccines and Immunotherapy, Cryz (Ed.), Pergamon, Nueva York, páginas 13-19 (1991)). Por tanto, puede inducirse una buena protección frente al tétanos mediante inmunización por vía parenteral con TT inactivada o derivados no tóxicos. La medición de la potencia de tales preparaciones de vacuna es un procedimiento bien establecido, y se describe por las farmacopeas europea y británica (Coster et al, Lancet, 345:949-952 (1995); y Sánchez et al, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 89:542-545 (1995)). El nivel de anticuerpos antitétanos se determina normalmente mediante ensayos de neutralización de toxinas en ratones. Recientemente, se han desarrollado ensayos ELISA sensibles que requieren menos tiempo y son más económicos, pero se relacionan bien con la prueba de neutralización de la toxina (Manghi et al, J. Immunol. Methods, 168:17-24 (1994); y Melville-Smith, In: Diptheria and Tetanus Antitoxins, Wreghitt et al (Eds.), ELISA in the Clinical Microbiology Laboratory, Public Health Laboratory Service, Londres, páginas 136-147(1990)). Los títulos de anticuerpo antitoxina en el suero se determinan normalmente en UI/ml (en el que 0,1 UI/ml en el suero humano son suficientes para proteger frente a una exposición de TT) mediante comparación con un patrón internacional de suero anti-TT (WHO). Por tanto, puede compararse la potencia de la vacuna (expresada en UI/ml) para diferentes preparaciones de vacuna. En la actualidad, las preparaciones de vacuna frente al tétanos se producen mediante inactivación por formaldehído de TT a partir de C. tetani, que es un procedimiento que requiere mucho tiempo, y técnicamente exigente. Esto ha dado lugar a una búsqueda de preparaciones detoxificadas alternativas de TT como vacunas.
TT consiste en una proteína de 150 kDa que contiene una cadena ligera (L) de 50 kDa unida mediante disulfuro a una cadena pesada (H) de 100 kDa (Helting et al, J. Biol. Chem., 252:187-193 (1977a); y Niemann et al, Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins, Alouf Ed., Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Academic Press, Londres (1991)). La actividad tóxica de esta proteína se encuentra dentro de la cadena L, una proteasa que depende del cinc (Schiavo et al, EMBO J., 11:3577-3583 (1992)), que se piensa que media en el bloqueo de la liberación de inhibidor de las neuronas mediante proteolisis de la sinaptobrevina (Schiavo et al, Nature (Londres), 359:832-835 (1992)). Se piensa que la cadena H inicia la unión y captación de la toxina en las membranas presinápticas (Helting et al, J. Biol. Chem., 252:194-197 (1977b); y Morris et al, J. Biol. Chem., 255:6071-6076 (1980)). La digestión de la molécula de toxina con papaína da un polipéptido de 50 kDa, que corresponde al extremo C-terminal de la cadena H y una molécula de 100 kDa que corresponde a la cadena L unida al extremo N-terminal de la cadena H (Helting et al (1977a), mencionado anteriormente). El polipéptido de 50 kDa, denominado fragmento C de TT (FC), no es tóxico, pero posee gangliósido (Halpern et al, Infect. Immun., 58:1004-1009 (1990); y Morris et al (1980), mencionado anteriormente) y actividades de unión a proteína (Schiavo et al, FEBS. Lett., 290:227-230 (1991)). En estudios tempranos, se mostró que la vacunación de animales con FC derivado mediante proteolisis de la toxina nativa protegía frente a exposiciones letales posteriores con TT (Helting et al (1977a), mencionado anteriormente). Además, los estudios con anticuerpos monoclonales demostraron que existen epítopos neutralizantes dentro de esta molécula (Kenimer et al, Infect. Immun., 42:942-948 (1983)). Por tanto, se identificó FC como una buena molécula candidato para la producción de una vacuna anti-TT alternativa.
Datos recientes han indicado que la inmunización por vía intramuscular con un plásmido que codifica para el fragmento C de TT con el control del promotor de CMV/región potenciadora (pcDNA3/tetC) provocó títulos elevados de anticuerpo sérico anti-fragmento C, respuestas proliferativas y producción de interferón-\gamma. Además, se mostró que esos ratones estaban protegidos frente a una exposición letal con TT (Anderson et al, mencionado anteriormente).
En un esfuerzo por explorar adicionalmente si la inmunogenicidad y capacidad protectora de pcDNA3/tet puede optimizarse, se iniciaron una serie de estudios para administrar este constructo al huésped mediante cepas atenuadas de S. typhi. Este enfoque tiene el potencial para proporcionar un nuevo sistema de administración para vacunas mediadas por ADN frente a enfermedades infecciosas bacterianas y otras.
A continuación se expone una descripción de estos estudios, incluyendo la construcción de pcDNA3/tetC.
1. Gen que codifica para el fragmento C de TT
La secuencia del gen que codifica para TT se ha descrito en la técnica (Eisel et al, EMBO J., 5:2495-2502(1986); Fairweather et al, J. Bacteriol., 165:21-27 (1986); y Fairweather et al, Nucleic. Acids Res., 14: 7809-7812(1986)). Previamente se mostró que los vectores de plásmido que codifican para la secuencia del fragmento C nativa con el control de P_{tac} expresaban FC en E. coli con un bajo nivel (3-4% de tcp) (Makoff et al, Bio/ Technology, 7:1043-1046 (1989)). Con el fin de aumentar el nivel de expresión, se optimizó el uso del codón del gen del fragmento C nativo (que es rico en A-T) para E. coli. El gen de fragmento C sintético al 99% resultante (tetC) dirigió la expresión a niveles superiores (11-14% de tcp) en E. coli (Makoff et al, Nucleic. Acids Res., 17:10191-10202 (1989)). Esto dio lugar a la investigación de otros sistemas de expresión como un medio para producir grandes cantidades de fragmento C para la vacunación. Ahora también se ha mostrado que las preparaciones de fragmento C recombinante purificado a partir de células de levadura (Clare et al, Biotechnology (N.Y.), 9:455-460 (1991); y Romanos et al, Nucleic. Acids Res., 19:1461-1467(1991)), y células de insectos cultivadas (Charles et al, Infect. Immun., 59:1627-1632 (1991)), inducen respuestas inmunitarias protectoras frente a la toxina del tétanos tras la inmunización por vía parenteral. De manera interesante, tal como fue el caso con E. coli, el gen de C. tetani nativo que codifica para el fragmento C no pudo expresarse en Saccharomyces cerevisiae, mientras que el gen con codón optimizado de pTETtac115 se expresó por este microorganismo. El gen de fragmento C sintético que se optimizó en el codón para la expresión en E. coli parecía por tanto haberse optimizado fortuitamente para su expresión en eucariotas.
2. Construcción de pTETnir15
La expresión constitutiva de alto nivel de xenoantígenos in vivo puede dar como resultado la pérdida del plásmido que codifica para el antígeno, dañando a la capacidad de la cepa vehículo para administrar el antígeno al sistema inmunitario. En consecuencia, se han usado varios enfoques para mantener la estabilidad del plásmido in vivo. Un enfoque de este tipo es el uso de promotores que pueden inducirse in vivo, tales como el promotor de nirB. Este promotor se definió originalmente en E. coli, en la que controla la expresión de un operón que incluye el gen de la nitrato reductasa que depende de NADH, nirB. Se regula por nitratos, y cambios en la tensión de oxígeno en el entorno, alcanzándose la actividad máxima en condiciones anaerobias. Se ha construido una versión modificada del promotor de nirB que se induce cuando células bacterianas crecen en una atmósfera de disponibilidad de oxígeno limitada o entra en células eucarióticas in vitro. Se han construido plásmidos basados en Col-E1 homólogos, que expresan el fragmento C a partir de los promotores de nirB y tac respectivamente. Se mostró que estas cepas inducen protección frente a una exposición con TT tras una inmunización oral. Sin embargo, se requirieron dos dosis de la cepa basada en tac para garantizar una protección completa, mientras que sólo se requirió una dosis de la cepa que expresaba el fragmento C usando el promotor de nirB. Por tanto, el constructo de nirB probó ser más persistente y estable in vivo que el constructo de tac (Chatfield et al, Biotechnology, 10:888 (1992b)).
3. Construcción de pcDNA3/tetC
Se llevó a cabo la construcción y caracterización del plásmido pcDNA3/tetC tal como se describe por Anderson et al, mencionado anteriormente, que se incorpora como referencia al presente documento en su totalidad (ver la figura 5).
4. Inmunización con S. typhi CVD 915 que alberga pcDNA3/tetC o pTET nir15
Tal como se trató anteriormente, se iniciaron estudios para evaluar la capacidad de cepas atenuadas de S. typhi para administrar vectores de expresión procariótica y eucariótica que codifican para xenoantígenos, por ejemplo, fragmento C de TT, al sistema inmunitario de mamíferos e inducir respuestas inmunitarias protectoras. Para comparar este sistema con la inmunización por ADN desnudo tradicional, también se evaluó la respuesta provocada por el vector pcDNA3/tetC desnudo.
Con este fin, se electroporaron plásmidos de pcDNA3/tetC o pTET nir15 en CVD 915. Se confirmó la estructura de los plásmidos purificados separando los productos de digestión por endonucleasa de restricción de los plásmidos en geles de agarosa: pcDNA3 y pcDNA3/tetC con HindIII y XbaI; y pTET nir15 con EcoRI y BamHI. Se confirmó la expresión del fragmento C mediante SDS-PAGE, e inmunotransferencia. Se hicieron crecer muestras bacterianas hasta la fase estacionaria y se recogieron alícuotas de 1,0 ml mediante centrifugación, y volvieron a suspenderse en 200 \mul de tampón de muestra de SDS. Entonces se sometieron estas muestras a SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western. Se usaron anticuerpos mAb anti-fragmento C y anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con peroxidasas del rábano como primer y segundo anticuerpo, respectivamente. Se cargó cada muestra a aproximadamente 1,0 x 10^{8} ufc/pocillo.
Se usó la vía intranasal para el vector atenuado (CVD 915) que llevaba ambos plásmidos (CVD 915 (pcDNA3/tetC) y CVD 915 (pTETnir15)), y se usó la vía intramuscular para la inmunización con ADN desnudo (pcDNA3/tetC). Se inmunizaron ratones Balb/c según el protocolo mostrado en la tabla 4 a continuación:
TABLA 4
Grupo Número de ratones Inmunógeno Vía de inmunización Primera dosis Segunda dosis
1 10 CVD 915 Intranasal 5,9 x 10^{9} ufc 11 x 10^{9} ufc
(pcDNA3/tetC)
2 10 CVD 915 Intranasal 5,0 x 10^{9} ufc 6,3 x 10^{9} ufc
(pTETnir15)
3 10 CVD 915 Intranasal 6,5 x 10^{9} ufc 5,25 x 10^{9} ufc
4 10 pcDNA3/tetC Intramuscular 98 \mug 95 \mug
5 5 PBS Intranasal 25 \mul 5,0 \mul
5. Respuestas de anticuerpos
Se sangraron los animales desde la vena retroorbital según el siguiente programa:
(a)
Antes de la inmunización
(b)
14 días tras la inmunización
36 días tras la inmunización
(c)
14 días tras la administración de refuerzo
28 días tras la administración de refuerzo
42 días tras la administración de refuerzo
56 días tras la administración de refuerzo (sacrificio).
Se midieron los anticuerpos IgG anti-fragmento C séricos totales mediante ELISA. Brevemente, se usó el fragmento C recombinante para recubrir las placas de ELISA con antígeno a 4,0 \mug/ml. Se titularon los sueros en ocho diluciones al doble. Se expresaron los niveles de anticuerpos en unidades internacionales en comparación con un suero patrón previamente calibrado. Se preparó suero patrón inmunizando ratones con toxina del tétanos absorbida cuatro veces a intervalos de dos semanas. Se combinaron los sueros y se titularon mediante una prueba de neutralización in vivo en ratones según el procedimiento descrito en la farmacopea europea. Se determinó el número de unidades neutralizadoras internacionales en paralelo con el patrón internacional de antitoxina del tétanos. Los resultados se muestran en la figura 6.
Tal como se muestra en la figura 6, aunque parecieron producirse niveles ligeramente superiores de anticuerpos por el constructo CVD 915 (peDNA3/tetC), se observaron niveles muy altos de anticuerpos séricos anti-fragmento C (de 1.000 a 2.000 veces el nivel de anticuerpo anti-TT protector en seres humanos) tras la inmunización y una única administración de refuerzo tanto con constructos CVD 915 (pTET nir15) como CVD 915 (pcDNA3/tetC). Los niveles de anticuerpo sérico anti-fragmento C observados de hasta 20 UI/ml corresponden a títulos de final de dilución de aproximadamente 1:50.000. En cambio, se observaron niveles relativamente moderados de anticuerpos séricos anti-fragmento C (aproximadamente 50 veces los niveles anti-TT protectores en seres humanos) en ratones inmunizados con pcDNA3/tetC desnudo. Los niveles de anticuerpo sérico anti-fragmento C alcanzaron niveles máximos 50 días tras la inmunización principal, y permanecieron en el mismo nivel hasta 92 días tras la inmunización principal, el último punto de tiempo estudiado. No se observaron respuestas en ratones inmunizados sólo con CVD 915.
6. Respuestas inmunitarias mediadas por células: ensayos de la proliferación
Noventa y dos días tras la inmunización, se prepararon combinaciones de suspensiones de células únicas a partir de nódulos linfáticos cervicales, nódulos linfáticos mesentéricos y bazos de los 5 a 7 ratones que permanecían de cada uno de los grupos tratados anteriormente. También se preparó una combinación de células de los nódulos linfáticos inguinales a partir de ratones inmunizados por vía i.m. con pcDNA3/tetC desnudo. Se obtuvieron los siguientes rendimientos celulares promedio:
Nódulos linfáticos cervicales: 6,6 X 10^{6} células/ratón
Nódulos linfáticos mesentéricos: 10,1 X 10^{6} células/ ratón
Nódulos linfáticos inguinales: 1,6 X 10^{6} células/ ratón
Bazos: 52,5 X 10^{6} células/ratón.
Se realizaron ensayos de proliferación volviendo a suspender las células en medio RPMI completo (RPMI que contiene suero bovino fetal al 10%(v/v), glutamina y antibióticos), y se incubaron a 2,0 x 10^{5} células/pocillo por triplicado en placas de fondo redondo de 96 pocillos en ausencia o en presencia de antígeno. Se usaron los siguientes antígenos solubles en estos estudios: albúmina de suero bovino (BSA), fragmento C de TT y cilios de S. typhi sumamente purificados, a 0,02, 0,2 y 2,0 \mug/ml. Tras cinco días de incubación a 37ºC, 5% de CO_{2}, se pulsaron los cultivos con ^{3}H-timidina, y se terminaron los cultivos 18 horas después mediante recogida automática. Se determinó la incorporación de timidina mediante recuento de centelleo líquido. Los resultados, que se muestran en las figuras 7 y 8, se expresan como índice de estimulación (I.E.).
Tal como se muestra en la figura 7, la inmunización con constructos CVD 915 (pTETnir15) y CVD 915 (pcDNA3/tetC), así como la vacuna de ADN desnudo de pcDNA3/tetC, provocaron la aparición de células linfoides sensibilizadas que proliferaron en respuesta al fragmento C de TT. Se observaron estas respuestas proliferativas en poblaciones celulares aisladas de bazos y nódulos linfáticos cervicales, pero no en las aisladas de nódulos linfáticos mesentéricos. También se observaron respuestas proliferativas específicas frente a TT. No se observaron respuestas proliferativas significativas frente al fragmento C de TT (> 3 I.E.) en células aisladas de ratones inmunizados con CVD 915 o PBS.
Tal como se muestra en la figura 8, se observaron respuestas proliferativas frente a cilios de S. typhi en poblaciones celulares aisladas de ratones inmunizados con constructos de CVD 915, CVD 915 (pTET nir15) y CVD 915 (pcDNA3/tetC). Además, tal como se muestra en la figura 8, se observaron estas respuestas en todas las poblaciones aisladas de ratones inmunizados con CVD 915, y en células linfoides aisladas de nódulos linfáticos cervicales de ratones inmunizados con constructos de CVD 915 (pTET nir15) y CVD 915 (pcDNA3/tetC). También se observaron respuestas proliferativas considerablemente menores en células de nódulos linfáticos mesentéricos y esplenocitos aisladas de ratones inmunizados con constructos de CVD 915 (pTET nir15) y CVD 915 (pcDNA3/tetC). Debido a dificultades técnicas, no se dispone de datos sobre las respuestas proliferativas de ratones inmunizados con vacuna de ADN desnudo pcDNA3/tetC frente a cilios de S. typhi. De manera interesante, las células aisladas de nódulos linfáticos inguinales de ratones inmunizados por vía i.m. con pcDNA3/tetC desnudo no mostraron respuestas proliferativas específicas frente a ninguno de los antígenos probados. No se observaron respuestas proliferativas frente a BSA en ninguno de los grupos probados.
7. Comparación de IgG sérica anti-LPS de salmonela y cilios de S. typhi inducida mediante inmunización intranasal con CVD915 y CVD 908-htrA
Uno de los problemas importantes que deben tratarse durante la evaluación de nuevos vectores de vacuna candidata es comparar las respuestas inmunitarias provocadas por los nuevos constructos (por ejemplo, CVD 915) con las de los candidatos líder (por ejemplo, CVD 908-htrA) para los que ya están disponibles un gran conjunto de datos. Con este objetivo, se inmunizaron por vía intranasal grupos de 10 ratones Balb/C con 10^{10} ufc de o bien cepa CVD 915 o bien CVD 908-htrA atenuadas, dos veces, con 36 días de separación. Se sangraron los ratones antes de la inmunización (día 0) y en los días 35, 55 y 95 (sólo CVD 915). Se determinaron los anticuerpos frente a antígenos de LPS y cilios mediante ELISA tal como se describe por Tacket et al (1977), mencionado anteriormente. Brevemente, se recubrieron placas de ELISA con 5,0 \mug de cada antígeno, se probaron las muestras de suero en 8 diluciones dobles, se expresaron los títulos de anticuerpo como unidades de EILSA/ml definidas como la inversa de la dilución que produce valores de absorbancia 0,5 a 492 nm. Los resultados se muestran en las figuras 9 y 10.
Tal como se muestra en las figuras 9 y 10, se provocaron niveles de anticuerpo anti-cilios de salmonela y anti-LPS de salmonela similares, respectivamente, en ambos grupos animales.
Ejemplo 5 Construcción de cepas de S. typhi atenuadas que expresan de manera constitutiva el antígeno Vi A. Construcción de cepas S. typhi (CVD 916 y CVD909) que expresan de manera constitutiva el antígeno Vi
Con el fin de cambiar la expresión del antígeno Vi de osmóticamente regulada a constitutiva, se enfocó en el promotor de vipR (figura 1A). Se cree que los productos de vipR, y ompR-envZ realizan su acción de regulación uniéndose a la región en el sentido de 5' de vipR (Hashimoto et al (1996), mencionado anteriormente). Con este fin, se postuló en la presente invención que sustituyendo el promotor de vipR con un promotor fuerte, por ejemplo, P_{tac}, se eliminaría la regulación por disminución de vipR, y posteriormente el control en la expresión del antígeno Vi. El promotor P_{tac} es constitutivo en Salmonella spp., ya que estos microorganismos carecen de laqI. En consecuencia, Se construyeron derivados de CVD 915 y CVD 908-htrA que expresan antígeno Vi constitutivos de la siguiente manera.
En la primera fase, se introdujo la deleción en vipR, y en paralelo, se sustituyó un marcador de selección/contra-
selección, es decir, el casete sacB-neo, por la región del promotor de vipR (figura 1A).
Específicamente, se amplificó un segmento de 601 pb inmediatamente en el sentido de 5' de la región del promotor -35 de vipR del ADN genómico de la cepa Ty2 de S. typhi de tipo natural, usando los cebadores: 5'-GGGGGAGCT
CAATTCTGCAAACCAGCCCTGTACCATCAAGTTCATA-3', (SEQ ID NO:7) y 5'-CCTCATCCCGGGCCCGGAT
CCACCTGCACAATTCATTGTTTGTACCTATC-3' (SEQ ID NO:8). Este primer segmento amplificado de 601 pb (segmento A) se clonó usando el kit pGEM-T Vector System (Promega, Madison, WI) dando lugar a pGEM-T::frag-
mento A. Este sistema incluye un plásmido abierto (pGEM-T) con T en 3' que sobresalen en el sitio de inserción, lo que mejora la eficacia de la unión de productos de PCR. Entonces, se digirió pGEM-T::segmento A con SstI y BamHI, y se clonó en sitios SstI y BamHI inmediatamente en el sentido de 5' de P_{tac} en pBS::P_{tac} (este plásmido se obtuvo clonando el promotor P_{tac} en los sitios BamHI-EcoRI de pBluescript (Stratagene)), dando pBS::segmento A-P_{tac}.
En paralelo, se amplificó un segmento de 770 pb de vipR (que incluía el codón de iniciación de vipR) (segmento B) a partir del mismo ADN genómico de la cepa Ty2, usando los cebadores:
5'-GCAGGTGGATCCGGGCCCGGG ATGAGGTTTCATCATTTCTGGCCTCCGAATGATATC-3' (SEQ ID
NO:9); y
5'-ATCCTTGAATTCGGGGGATCCTACTAAAATTTTATATTTACAAAGTTAATTCTAGGT-3' (SEQ ID NO:
10). Con estos cebadores, se introdujeron los sitios de restricción únicos SstI, EcoRI, BamHI y SmaI para fines de clonación (subrayados). En primer lugar se clonó el segmento B amplificado en pGEM-T usando el kit pGEM-T Vector System, dando pGEM-T::segmento B. Entonces se digirió este plásmido con EcoRV y SalI, y el fragmento resultante se clonó en los sitios EcoRV y SalI de pBS::segmento A-P_{tac}, inmediatamente en el sentido de 3' de P_{tac}. El plásmido resultante, denominado pBS::P_{tac}-vipR, contiene segmento A-P_{tac}-segmento B, y tiene una deleción de 167 pb, incluyendo las regiones de unión -35, -10 y ribosómica del promotor de vipR. Sin embargo, en la construcción de pBS::P_{tac}-vipR, la deleción del promotor de vipR se sustituyó eficazmente con una inserción de 257 pb que contenía las regiones de unión -35, -10 y ribosómica del promotor tac.
En paralelo, se construyó otro casete mediante inserción de sacB-neo entre el segmento A y el segmento B a los que se hace referencia anteriormente. Inicialmente, se condensaron el fragmento A y el fragmento B mediante PCR usando ambos fragmentos como moldes y los oligonucleótidos SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:10 como, tal como se describe por Noriega et al (1996), mencionado anteriormente). Se clonó la condensación de fragmento A-fragmento B amplificada resultante en pGEM-T, usando el kit pGEM-T Vector System, dando pGEMT::fragmento A-fragmento B. Entonces, se obtuvo sacB-neo mediante digestión con SmaI de pIB729 (Blomfield et al, mencionado anteriormente), y se insertó en el sitio de SmaI de pGEM-T::segmento A-segmento B. El plásmido resultante se denominó pGEM-T::vipR::sacBneo. Este plásmido se digirió con SstI, eliminando eficazmente el alelo vipR::sacB-neo, que entonces se clonó en el sitio SstI del vector pJG14 suicida, dando pJG14::vipR::sacB-neo. El pJG14 es un plásmido suicida, seleccionado por cloranfenicol, derivado del origen de replicación de pSC101, sensible a la temperatura (Galen et al, 96th General Meeting, American Society for Microbiology, Abstract, página 529-H260 (1996)). Además, el alelo vipR::sacB-neo digerido por SstI se clonó en el sitio SstI del vector suicida pKTN701 (Hone et al (1991), mencionado anteriormente), dando pKT::vipR::sacB-neo. Se electroporó la cepa CVD 915 de S. typhi con pJG14::vipR::sacB-neo. En paralelo, se electroporó la cepa CVD 908-htrA de S. typhi con pKT::vipR::sacB-neo. Se llevó a cabo una recombinación homóloga entre pJG14::vipR::sacB-neo y el gen vipR en CVD 915 S. typhi, usando los procedimientos descritos por Noriega et al (1996), mencionado anteriormente; y entre pKT::vipR::sacB-neo, y el gen vipR en CVD 908-htrA S. typhi, usando los procedimientos descritos por Hone et al (1991), mencionado anteriormente, con la excepción de que se potenció la selección mutante de doble entrecruzamiento aislando los clones sensibles a cloranfenicol, resistentes a kanamicina. Las cepas derivadas de CVD 908-htrA y derivadas de CVD 915 de S. typhi resultantes no expresaron el antígeno Vi debido a la inserción/deleción del alelo vipR.
En la segunda fase, el promotor P_{tac} constitutivo se sustituyó por la inserción de sacB-neo en el locus vipR de las cepas derivadas de CVD 908-htrA de S. typhi y derivadas de CVD 915 de S. typhi mencionadas anteriormente (figura 1B). Específicamente, se clonó el segmento P_{tac}-vipR en pBS::P_{tac}- vipR en el sitio BamHI-EcoRI de pJG14, dando pJG14::P_{tac}- vipR. Entonces se usó el plásmido pJG14 :: P_{tac}-vipR para intercambiar P_{tac} por sacB-neo en las cepas derivadas de CVD 915 y CVD 908-htrA mediante recombinación homóloga, tal como se describió anteriormente. El aislamiento de mutantes de doble entrecruzamiento se potenció y se proporcionó una contraselección mediante la toxicidad a la sacarosa conferida por sacB, y la reversión frente a la sensibilidad a la kanamicina. La cepa resultante derivada de CVD 915 se denominó CVD 916, que se depositó en la colección americana de cultivos tipo el 4 de mayo, 1998, con el número ATCC 202116. La cepa resultante derivada de CVD 908-htrA se denominó CVD909, que se depositó en la colección americana de cultivos tipo el 4 de mayo, 1998, con el número ATCC 202117. La inserción de P_{tac} se en ambas cepas se caracterizó de manera genotípica mediante PCR, demostrando la inserción de P_{tac} en el sitio apropiado.
B. Expresión constitutiva del antígeno Vi por las cepas CVD 916 y CVD 909
La expresión constitutiva del antígeno Vi se evaluó de manera fenotípica mediante aglutinamiento de bacterias hechas crecer con diferentes osmolaridades usando antisuero anti-Vi comercial (Difco). Los resultados se muestran en la tabla 5 a continuación.
TABLA 5 Aglutinamiento con anticuerpo específico para Vi
NaCl Cepa
CVD 915 CVD 916 CVD 908htrA CVD 909 Ty2
0,17 M +++ ++++ +++ ++++ +++
0,3 M +++ +++ +++ +++ +++
0,5 M - +++ +/- +++ -
0,6 M - +++ - +++ -
0,7 M - +++ - +++ -
Tal como se muestra en la tabla 5 anterior, en la cepa Ty2 de S. typhi de tipo natural y las cepas atenuadas CVD 915 y CVD908-htrA, la expresión del antígeno Vi depende sumamente de la osmolaridad (proporcionada por la concentración de NaCl) del medio. En cambio, la expresión del antígeno Vi en las cepas CVD 916 y CVD 909 es fuerte, constitutiva, y no regulada por los cambios de osmolaridad.
Ejemplo 6 Respuesta inmunitaria frente a antígeno Vi expresado de manera constitutiva
Se inmunizaron grupos de diez ratones Balb/c de 6 semanas de edad por vía intranasal con 1,0 x 10^{10} ufc de cepa o bien CVD915 o bien CVD 916. Se sangraron los ratones antes y 30 días tras la inmunización, y se almacenó su suero a -20ºC hasta que se usó. Se determinaron los anticuerpos presentes en el suero frente a antígenos Vi, H (cilios) y LPS de S. typhi y mediante ELISA tal como se describe por Tacket et al (1997), mencionado anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 6 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Títulos medios geométricos de anticuerpos IgG séricos frente a antígenos de S. typhi tras una única inmunización con cepas CVD 915 o CVD 916
Anticuerpos IgG específicos frente a
Vi LPS H
Cepa Día 0 Día 30 Día 0 Día 30 Día 0 Día 30
CVD 915 21 46 19 640 20 197
CVD 916 23 109^{\text{*}} 17 747^{\text{**}} 21 320^{\text{**}}
^{\text{*}} P = 0,033
^{\text{**}} P = no significativo
Tal como se muestra en la tabla 6 anterior, la inmunización con cepa CVD 916 provocó niveles de anticuerpo frente al antígeno Vi que fueron significativamente superiores a los obtenidos con la cepa CVD 915. Las respuestas inmunitarias frente a otros antígenos (LPS y H) de S. typhi fueron similares entre ambos grupos inmunizados. Los resultados demuestran que la expresión constitutiva del antígeno Vi potencia la respuesta inmunitaria frente a este antígeno sin interferir con la respuesta inmunitaria frente a otros antígenos de S. typhi somáticos.
<110> NORIEGA, Fernando
\hskip1cm SZTEIN, Marcelo B.
\hskip1cm LEVINE, Myron M.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MUTANTES ATENUADOS DE SALMONELA QUE EXPRESAN DE MANERA CONSTITUTIVA EL ANTÍGENO Vi
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A7140
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 09/076,761
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 1998-05-13
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent In Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgagctcgcg agctcggtaa agtaccagtg accggaagct ggttgcgt 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcccgggg gatcctcaac cgacgccagt cacgatacga gttgtacaga t 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaggatccc ccgggcccgg ctacgcgcag gttgaagtcg taaacgacag c 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctctagagc tctagagctc attcccactc aatggtagct ggcggctt 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcggcctg cgctcctgta tgggtctgac cggctgtggt 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggagctc aattctgcaa accagccctg taccatcaag ttcata 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctcatcccg ggcccggatc cacctgcaca attcattgtt tgtacctatc 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaggtggat ccgggcccgg gatgaggttt catcatttct ggcctccgaa tgatatc 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atccttgaat tcgggggatc ctactaaaat tttatattta caaagttaat tctaggt 
\hfill
57

Claims (17)

1. Mutante de salmonela atenuado, en el que dicho mutante expresa de manera constitutiva el antígeno vi, y en el que en dicho mutante, se sustituye el promotor vipR por un promotor constitutivo, de manera que se provoca una expresión constitutiva de viaB.
2. Mutante de salmonela atenuado según al reivindicación 1, en el que dicho mutante es un mutante de Salmonella typhi.
3. Mutante de salmonela atenuado según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que en dicho mutante, se sustituye el promotor vipR por un promotor seleccionado del grupo que consiste en P_{tac}, P_{trc}, P_{01ac} y P_{1pp}, de manera que se provoca una expresión constitutiva de viaB.
4. Mutante de salmonela atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho mutante puede formar nucleótidos de guanina de novo, debido a la mutación en el operón guaB-A.
5. Mutante de salmonela atenuado según la reivindicación 4, en el que dicha mutación en el operón guaB-A es una mutación por deleción, y dicha mutación por deleción está en el gen guaA, el gen guaB, o tanto en el gen guaA como en el gen guaB.
6. Mutante de salmonela atenuado según la reivindicación 5, en el que dicha mutación por deleción está tanto en el gen guaA como en el gen guaB.
7. Mutante de salmonela atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho mutante tiene un fenotipo aro.
8. Mutante de salmonela atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que dicho mutante de Salmonella typhi se deriva de una cepa original de Salmonella typhi CVD 915 (ATCC número 202115).
9. Mutante de salmonela atenuado según la reivindicación 1, en el que dicho mutante de salmonela es Salmonella CVD 916 (ATCC número 202116) o Salmonella typhi CVD 909 (ATCC número 202117).
10. Mutante de salmonela atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho mutante codifica y expresa un xenoantígeno.
11. Mutante de salmonela atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho mutante contiene un plásmido que codifica y expresa, en una célula eucariota, un xenoantígeno.
12. Vacuna frente a la fiebre tifoidea que comprende:
(A) una cantidad farmacéuticamente eficaz de un mutante de Salmonella typhi atenuado, según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11; y
(B) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
13. Vacuna según la reivindicación 12, en la que dicha cantidad farmacéuticamente eficaz es aproximadamente de 10^{2} ufc a 10^{10} ufc.
14. Vacuna según la reivindicación 12, en la que dicha cantidad farmacéuticamente eficaz es aproximadamente de 10^{6} ufc a 10^{9} ufc.
15. Vacuna según la reivindicación 12, para su uso en un medicamento.
16. Vacuna según la reivindicación 12, para su uso para hacer surgir respuestas inmunitarias de protección.
17. Uso de un mutante de salmonela atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, para la preparación de un medicamento para prevenir la fiebre tifoidea.
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