JP2002514398A - Ｖｉ抗原を構成的に発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化した変異株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｖｉ抗原を構成的に発現する弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株、ならびに、それを含有する腸チフスに対するワクチン、それを含有する生のベクターワクチン、およびそれを含有するＤＮＡ媒介性ワクチンが、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明の開発は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｂａｌｔ
ｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄによって、ならびに契約番号第ＡＩ２９４７１号
、同第ＡＩ３６５２５号、同第ＡＩ４０２６１号、および同ＡＩ４５２５１号の
もとで国立衛生研究所の資金提供によって支持された。米国政府は、米国政府に
よって認められた上記の契約によって提供された、本明細書中の本発明を実施す
るか、あるいは、本発明を米国の代わりに実行させる、撤回不能な、払済みの、
通常実施権を有する。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、Ｖｉ抗原を構成的に発現する、弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
変異株、ならびにそれを含有する腸チフスに対するワクチン、それを含有する生
のベクターワクチン、およびそれを含有するＤＮＡ−によって媒介されるワクチ
ンに関する。

【０００３】 （発明の背景） （Ｉ．Ｖｉ抗原） Ｖｉ抗原（夾膜ポリサッカライド）は、Ｆｅｌｉｘら、Ｌａｎｃｅｔ、２２７
：１８６−１９１（１９３４）によって最初に記載された。この夾膜ポリサッカ
ライドは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙ
ｐｈｉ Ｃ、およびＳ．ｄｕｂｌｉｎ）ならびにＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒ
ｅｕｎｄｉｉ中に存在する。構造的には、Ｖｉ抗原は、可変性のＯ−アセチル化
を有するβ−４，２−デオキシ−２Ｎ−アセチルガラクツロン酸の直鎖状のポリ
マーである（Ｄａｎｉｅｌｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５７：３１５９
−３１６４（１９８９））。Ｓ．ｔｙｐｈｉ中でのその存在は、インビトロにお
いては、血清、補体活性化、および食作用による溶解における有意な低下と相関
している（Ｌｏｏｎｅｙら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０８：５０６
−５１６（１９８６））。従って、Ｖｉ抗原は、免疫システムに対してＳ．ｔｙ
ｐｈｉを防御する盾として作用し得る。

【０００４】 （Ａ．ｖｉａＢ染色体領域およびＶｉ抗原の発現の領域） ３つの大きく分けられた染色体遺伝子座である、ｖｉａＡ、ｖｉａＢ、および
ｏｍｐＢが、Ｖｉ抗原の発現に必要であると考えられている（Ｊｏｈｎｓｏｎら
、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９０：３０２−３０８（１９６５）；およびＳｎ
ｅｌｌｉｎｇｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４５：１０１０−１０１７（
１９８１））。これらの中では、ｖｉａＢ遺伝子座が、通常はＶｉ抗原−陽性株
において見出されており、そしてＶｉの合成のために必要な酵素をコードする遺
伝子を含むと考えられている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．，１７５：４４５６−４４６５（１９９３）；およびＶｉｒｌｏｇｅｕｘら、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：３０３９−３０４７（１９９５））。ｖｉａＢ
遺伝子座は、１１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から構成され（
図１Ａ）、そのうちｖｉｐＡおよびｖｉｐＢ遺伝子は、Ｖｉポリサッカライドの
ヌクレオチド糖を合成する酵素をコードする。そして５つのｖｅｘ遺伝子（ｖｅ
ｘＡ−Ｅ）は、Ｖｉ抗原のトランスロケーションの原因であると考えられる（Ｈ
ａｓｈｉｍｏｔｏら、（１９９３）前出）。ｖｉｒＢ領域の第１ののＯＲＦ（す
なわち、ｖｉｐＲ（図１Ａ））は、それ自身の発現について、ならびにｖｉｐＡ
、ｖｉｐＢ、ｏｒｆ４、ｖｉｐＣ、およびおそらくｖｉｐＲの下流の他の遺伝子
の発現についてのポジティブな転写調節因子である（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８：１４３０−１４３６（１９９６））。さらに
、ＶｉｐＲの上流のプロモーターもまた、（少なくとも）ｖｉｐＡおよびｖｉｐ
Ｂ（Ｖｉ抗原の構造的なユニットをコードする）の転写を制御し、それによって
ｖｉａＢ領域中でオペロンを形成する。別の染色体領域である、ｏｍｐＢオペロ
ンは、ｏｍｐＲ−ｅｎｖＺ遺伝子を含み、ｖｉａＢの転写調節因子としてＶｉ抗
原の発現において役割を果たす（Ｐｉｃｋａｒｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
．，６２：３９８４−３９９３（１９９４））。ｏｍｐＲ−ｅｎｖＺ領域は、高
い浸透圧条件に対するＥ．ｃｏｌｉの適応性応答の一部を形成する。Ｓ．ｔｙｐ
ｈｉにおいては、Ｖｉ抗原は、浸透圧によって調節され、そしてｏｍｐＲは、そ
の発現に不可欠である（Ｐｉｃｋａｒｄら、前出）。

【０００５】 （Ｂ．Ｖｉ抗原の暴露と免疫防御との間の相関関係） Ｓ．ｔｙｐｈｉのＶｉ夾膜ポリサッカライドは、ヒトにおける毒性因子であり
、そして防御抗原である（Ｆｅｌｉｘら（１９３４）、前出）。精製されたＶｉ
ポリサッカライドは、単回の用量での接種後に中程度の防御免疫を誘発する、公
認された非経口的な腸チフスワクチンである。そして防御は、血清ＩｇＧ抗体に
よって媒介される（Ａｃｈａｒｙａら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３１７：１１０１−１１０４（１９８７）；およ
びＫｌｕｇｍａｎら、Ｌａｎｃｅｔ，２：１１６５−１１６９（１９８７））。
対照的に、弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ株であるＴｙ２１ａは公認された生経口
ワクチンであり、Ｖｉ抗原を発現せず、そして血清Ｖｉ抗体も誘発しないが；そ
れにもかかわらず、Ｔｙ２１ａは、少なくとも中程度のレベルの防御を付与する
（Ｗａｈｄａｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１４５：２９２−２９６（１
９８２）；およびＬｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ、１：１０４９−１０５２（１
９８７ａ））。細胞によって媒介される免疫機構は、この状況において防御を媒
介すると考えられている。Ｓ．ｔｙｐｈｉのいくつかの新しい弱毒化された株（
これらは、インビトロでＶｉ抗原を発現する）は、高力価のＯおよびＨ抗体を誘
発するにも関わらず経口ワクチンとして投与された場合には、血清Ｖｉ抗体を誘
発できなかった。（Ｔａｃｋｅｔら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６３：９
０１−９０４（１９９１）；Ｔａｃｋｅｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１０：４４３−
４４６（１９９２ａ）；およびＴａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，
６５：４５２−４５６（１９９７））。この表現型についての可能性のある説明
は、Ｖｉ抗原の発現が浸透圧の刺激と関連して高度に調節されていることである
（Ｐｉｃｋａｒｄら、前出）。この仮説は、Ｖｉ抗原の発現が、細菌が血液中ま
たは他の体液（例えば、胆汁）中で細胞外である場合を除いて、遮断されること
である。

【０００６】 Ｖｉ抗原の発現が構成的に行われる場合に、これは血清ＩｇＧ Ｖｉ抗体の刺
激を生じ、それによって腸チフスに対する全体的な防御を増強することが、本発
明において仮定された。構成的な発現が弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生
のベクターワクチンおよびＤＮＡによって媒介されるワクチンによって発現され
る外来抗原に対する免疫応答を改善することもまた、本発明において仮定された
。

【０００７】 （ＩＩ．腸チフスの標的集団） 腸チフスは、集団が、処理済みの、細菌学的にモニターされた水の供給へのア
クセス、およびヒトの糞便排出物を除去する衛生設備を有する、近代的先進工業
国においては著しく珍しい。対照的に、発展途上国においては、このような快適
さを欠いている集団においては、腸チフスはしばしば地域流行性であり、そして
公衆衛生の見通しによると、典型的には、就学年齢の子供の最も重大な腸疾患の
問題となっている（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．
Ｊ．，８：３７４−３８１（１９８９ａ））。候補のワクチンの実地試験に関し
て、腸チフスの全身の臨床的、疫学的および細菌学的な監視により、多くの集団
における腸チフスの発病率が、非常に正確に確証されている（Ｌｅｖｉｎｅら、
Ｌａｎｃｅｔ、３３６：８９１−８９４（１９９０）；Ｂｌａｃｋら、Ｖａｃｃ
ｉｎｅ；８：８１−８４（１９９０）；Ｌｅｖｉｎｅら（１９８７ａ）、前出；
Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５９：７６６−７６９
（１９８９）；およびＳｉｍｕｎｊｕｎｔａｋら、Ｌａｎｃｅｔ，３３８−１０
５５−１０５９（１９９１））。明らかになった発病率は、非全身的な監視に基
づいて推定されるよりも、はるかに高かった。全身的な監視はまた、乳児および
幼児において腸の領域において、臨床的にはまだ穏やかな、驚くべき頻度の菌血
症性の腸チフス感染を示した（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，
１０４：８９９−９０１（１９８４））。

【０００８】 発展途上国における就学年齢の子供に加えて、腸チフスの増大した危険性を有
する２つの他の集団は、旅行者および臨床微生物学者である。米国の旅行者にお
いては、危険性は南アメリカの太平洋岸に連なる国、およびインド亜大陸におい
て最も高い（Ｒｙａｎら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｔ．Ｄｉｓ．，１１：１−８（１９
８９）；およびＭａｔｈｉｅｕら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５４
：１７１３−１７１８（１９９４））。さらに、臨床微生物学者（先進国の微生
物学者を含む）は、作業環境中でＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉに対する曝
露が増大しており、従って、高い危険性のグループに含まれる（Ｂｌａｓｅｒら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：８５５−８５８（１９８１））
。

【０００９】 （ＩＩＩ．多剤耐性Ｓ．ｔｙｐｈｉ株） およそ１９９０年から、腸チフスの散発性の症例および局所的な大発生が、中
東、北東アフリカ、ならびに南アジアおよび東南アジアで出現し始めている。こ
れらの大発生は、トリメトプリム／スルファメトキサゾールに対するプラスミド
によって媒介される耐性、およびクロラムフェニコールに対する耐性をコードす
るＳ．ｔｙｐｈｉの株によって引き起こされる（Ｇｕｐｔａら、Ｐｅｄｉａｔｒ
．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３：１２４−１４０（１９９４）；およびＲｏｗ
ｅら、Ｌａｎｃｅｔ，３３６：１０６５−１０６６（１９９０））。このような
株に対する治療は、経口のシプロフロキサシンのようなキノロン抗生物質、また
は非経口のセフトリアキソンのような第３世代のセファロスポリンの使用を必要
とする。これらの抗生物質は、発展途上国にとってはコストが高い。例えば、１
９７２年から１９７３年までのメキシコ、（Ｏｌａｒｔｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４：５９７−６０１（１９７３）
）、および１９７９年から１９８１年までのペルー（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｊ
．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２：２６１−２６６（１９８６）におけるような、
散発性の症例または長期の流行を生じ、そして最終的に消滅して感受性の株によ
って再度取って代わられた、以前の抗生物質耐性株とは対照的に、およそ１９９
０年に中東およびインド亜大陸で出現した多剤耐性のＳ．ｔｙｐｈｉがなお、こ
れらの地域においては優勢な株である。さらに、これらの多剤耐性株は、広範に
広がっており、そして北東アフリカにおいて（Ｍｉｋｈａｉｌら、Ｔｒａｎｓ．
Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，８３：１２０（１９８９））および
東南アジアにおいて（Ｖｉｎｈら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈ
ｅｍｏｔｈｅｒ．，４０：９５８−９６１（１９９６））優勢である。

【００１０】 以前に有用であった複数の抗生物質に対して耐性を示すＳ．ｔｙｐｈｉが、現
在存在し得るようである。従って、腸チフスは、経口の抗生物質で簡単かつ安価
に処置され得る疾患では、もはやない。さらに、健康の典拠（ｈｅａｌｔｈ ａ
ｕｔｈｏｒｉｔｙ）は、もはや疾患の初期の処置に対する腸チフスの制御プログ
ラムに基き得ない。腸チフスの合併症および死亡は、不適切か、遅延したか、ま
たは不十分な抗生物質の治療が原因で増大している（Ｓｉｎｇｈ、Ｉｎｄｉａｎ
Ｐｅｄｉａｔｒ．、２８：３２９−３３２（１９９１）；Ｂｈｕｔｔａ，Ａｎ
ｎ．Ｔｒｏｐ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．，１６：２９９−３０６（１９９６）；およ
びＧｕｐｔａ、前出）。

【００１１】 従って、これらの多剤耐性Ｓ．ｔｙｐｈｉ株の普及は、多くの発展途上国にお
いて増大しつつある公衆衛生上の重大危機を構成し、そして改善された経口の腸
チフスワクチンの開発における再燃した目的を有する。免疫予防もまた、高い発
病率の地域（特に、Ｓ．ｔｙｐｈｉ株が多剤耐性である地域）の子供について考
えられ、そして旅行者および臨床微生物学者について考えられるべきである。

【００１２】 （ＩＶ．腸チフスに対する初期のワクチン） （Ａ．不活化された非経口の全細胞ワクチン） １９世紀の終わりに開発された熱不活化された、フェノール保存された全細胞
ワクチン（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．，１：２５６−２５８（１８９
７）；およびＰｆｅｉｆｆｅｒら、Ｄｔｓｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｓｃｒ．２
２：７３５−７３７（１９８６））は、１０６０年代に世界保健機構によって発
起された無作為の制御された実地試験において、中程度のレベルの防御（５１−
６７％のワクチン有効性）を与えることが示された。これは、７年間にわたって
持続した（Ａｓｈｃｒｏｆｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，７９：１９６−２０６（
１９６４）：Ａｓｈｃｒｏｆｔら、Ｌａｎｃｅｔ，２：１０５６−１０６０（１
９６７）；Ｙｕｇｏｓｌａｖ Ｔｙｐｈｏｉｄ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｂｕｌ
ｌ．ＷＨＯ，３０：６２３−６３０（１９６４）；およびＨｅｊｆｅｃ，Ｂｕｌ
ｌ．ＷＨＯ，３４：３２１−３３９（１９６６））。しかし、これは、それが受
容不可能な高い頻度で有害な反応を生じるので、明らかに不十分なワクチンであ
り、従って一般的な公衆衛生ツールには決してなっていない（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｔ
ｙｐｈｏｉｄ Ｆｅｖｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第２版、Ｐ
ｌｏｔｋｉｎら編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒ
ｓ（１９９４））。制御された治験においては、熱不活化されフェノール保存さ
れた全細胞ワクチンのレシピエントの約２５％が、熱および全身的な反応を発症
し、そして約１５％が、ワクチン接種後の作業または学校を休む傾向にあった（
Ａｓｈｃｒｏｆｔら（１９６４）、前出；Ｙｕｇｏｓｌａｖ Ｔｙｐｈｏｉｄ
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（１９６４）、前出；およびＨｅｊｆｅｃ，前出）。この
理由のために、このワクチンは、２つのより最近承認されたワクチン（生の経口
ワクチン株Ｔｙ２１ａ（Ｖｉｖｏｔｉｆ^R）および非経口的な精製されたＶｉ夾
膜ポリサッカライドワクチン（ＴｙｐｈｉＶｉＭ^R）（Ｌｅｖｉｎｅら（１９８
９ａ）、前出）によって大きく取って代わられている。これらの２つのより新し
いワクチンは、上記の全細胞ワクチンに匹敵する防御を付与するが、非常に良好
に寛容化されている。

【００１３】 （Ｂ．非経口的なＶｉポリサッカライドワクチン） 上記のように、１９３０年代の中期に、Ｖｉ抗原（Ｓ．ｔｙｐｈｉ上のポリサ
ッカライド夾膜）が発見された（Ｆｅｌｉｘら、（１９３４）、前出）。この抗
原は、腸チフスの患者の血液から単離された株の大部分において存在し、マウス
におけるＳ．ｔｙｐｈｉの毒素因子であることがまた示された；その存在は、Ｏ
抗血清による凝集からＯ抗原を保護する（Ｆｅｌｉｘら、Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ，４９：９２−１０９（１９５１）；およびＦｅｌｉｘら、Ｊ．Ｈｙ
ｇ．，３５：４２１−４２７（１９３５））。Ｖｉ抗体が、腸チフスに対する防
御において重要な役割を果たすことが提唱されて、そしてフェノール不活化した
全細胞の非経口の腸チフスワクチンがアルコール不活化した全細胞の非経口ワク
チンにより取って代わられることが、示唆された。この案の原理は、後者がＶｉ
抗原をより良好に保存し、そして動物およびヒトにおいてより高いＶｉ抗体力価
を生じたことであった（Ｆｅｌｉｘ、ＢＭＪ，１：３９１−３９５（１９４１）
）。しかし、ユーゴスラビアでの無作為の制御された実地試験においては、熱お
よびフェノール不活化した全細胞の非経口ワクチンは、アルコール不活化したワ
クチンよりも有意に防御的であった（Ｙｕｇｏｓｌａｖ Ｔｙｐｈｏｉｄ Ｃｏ
ｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ，２６：３５７−３６９（１９６２））。
それにもかかわらず、同じ原理を使用して、アセトンで不活化した全細胞の非経
口腸チフスワクチンが、報告されている（Ｌａｎｄｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉ
ｃ Ｈｅａｌｔｈ，４４：１５７２−１５７９（１９５４））。１９６０年代に
ギアナおよびユーゴスラビアにおいて行われた２つの別々の実地試験においては
、アセトンで不活化されたワクチンは、熱およびフェノールで不活化されたワク
チンよりも優れた防御を付与した（Ｙｕｇｏｓｌａｖ Ｔｙｐｈｏｉｄ Ｃｏｍ
ｍｉｓｓｉｏｎ（１９６２）、前出）。アセトンで不活化されたワクチンの優位
性は、Ｖｉ抗原のより良好な保存に起因したこと（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｄｉｓ．，１２５：３６０−３６６（１９７２））、またはそのワクチンを
用いて得られるＨ抗原に対するより高い抗体力価に起因したことが論じられてい
る。

【００１４】 決定的な進歩は、非変性技術によってＶｉ抗原を精製することによる（Ｌｅｖ
ｉｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１２：１２９０−１２９４（１９７５
）；およびＲｏｂｂｉｎｓら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５０：４３６−
４４９（１９８４））。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａ
ｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）およびＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅ
ｒｉｅｕｘ（Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）で調製された２つの未変性のＶｉ抗原ロ
ットの免疫原性が、評価された（Ｔａｃｋｅｔ、Ｖａｃｃｉｎｅ、６：３０７−
３０８（１９８８））。両方の群が、約９０％のレシピエントにおいて高力価の
Ｖｉ抗体を誘発した。さらに、このワクチンによって生成されたＶｉ抗体が、少
なくとも３年間持続したことが示された（Ｔａｃｋｅｔら、（１９８８）、前出
）。非経口的な精製されたＶｉワクチンによって誘発されたものと同等のＶｉ抗
体のレベルは、慢性の腸チフスキャリアにおいてのみ、天然に見られる。対照的
に、腸チフスの回復期のほとんどの患者は、高力価のＶｉ抗体を生じない（Ｌａ
ｎａｔａら、Ｌａｎｃｅｔ、２：４４１−４４３（１９８３）；およびＬｏｓｏ
ｎｓｋｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２５：２２６６−２２６９
（１９８７））。

【００１５】 ２つの無作為の制御された実地試験が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｍｅｒｉｅｕｘで
産生された候補のＶｉ抗原ワクチンの安全性および効率を評価するために行われ
た。両方の試験において、ワクチンは、十分に寛容化された（Ａｃｈａｒｙａら
、前出；およびＫｌｕｇｍａｎら、前出）。ネパールにおいては、単回の２５μ
ｇの筋肉内用量のＶｉ抗原ワクチンが、子供および成人の両方を含む研究におい
て、培養して確認された腸チフスに対する少なくとも１７ヶ月間の７２％の防御
を提供した（Ｋｌｕｇｍａｎら、前出）。同様の結果が、南アフリカの就学児童
における実地試験において得られた。ここでは、同じ用量のＶｉ抗原が、少なく
とも２１ヶ月間にわたって培養されて確認された腸チフスに対して、６４％の防
御を付与した（Ｋｌｕｇｍａｎら、前出）。

【００１６】 就学児童および成人におけるその安全性および効率以上に、Ｖｉ抗原ワクチン
の利点は、単回の用量のみを用いて中程度のレベルの防御を提供することである
。しかし、弱毒化された腸チフスワクチンＴｙ２１ａと比較して、Ｖｉ抗原ワク
チンは、非経口的に（筋肉内で）投与されなければならないという欠点で不利で
ある。

【００１７】 （Ｃ．生の経口ワクチンとしての初期の弱毒化株） （１．ストレプトマイシン依存性Ｓ．ｔｙｐｈｉワクチン株） 生の経口腸チフスワクチンとして見込みがあることが示された最初の弱毒化株
は、１９６０年代の後期および１９７０年代の初期に開発された、ストレプトマ
イシン依存性株（ＳｍＤ）であった（ＤｕＰｏｎｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．
Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１０：２３６−２３９（１９７０）；お
よびＬｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３３：４２４−４２９（
１９７６））。用量あたり約１０¹⁰個のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を含有する
、複数回の間隔をあけた用量で送達される場合は、ＳｍＤ株は十分に寛容化され
、そして腸チフスのボランティアモデルにおける実験的なチャレンジに対してお
よそ８０％の防御を実証した（ＤｕＰｏｎｔら、前出）。しかし、ボランティア
が、ワクチン生物の液体の懸濁物を作製するように再構成された凍結乾燥調製物
で免疫される場合には、防御は付与されなかった（Ｌｅｖｉｎｅら、（１９７６
）、前出）。このために、ＳｍＤワクチン株を用いるさらなる研究は、続けられ
なかった。

【００１８】 （２．株Ｔｙ２１ａ、公認された生の経口腸チフスワクチン） 生の経口ワクチンとして安全でありそして防御的である、Ｓ．ｔｙｐｈｉの弱
毒化された株である、Ｔｙ２１ａが、病原性のＳ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株の化学
的な変異誘発によって１９７０年代の初期に開発された（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒら
、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１４１：５５３−５５８（１９７５））。この
ワクチン株における特徴的な変異（これは、その弱毒化を担うと最初に推定され
た）として、ｇａｌＥ（これは、リポポリサッカライドの合成に関与する酵素で
ある、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼをコードする）の不活化および
Ｖｉポリサッカライドを発現することの不能性が挙げられる。Ｔｙ２１ａは、プ
ラシーボでコントロールした実地試験において著しく十分に寛容化されているこ
とが証明された（Ｇｉｌｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３６：７１
７−７２３（１９７７）；Ｗａｈｄａｎら（１９８２）、前出；およびＷａｈｄ
ａｎら、Ｂｕｌｌ，ＷＨＯ、５８：４６９−４７４（１９８０））にもかかわら
ず、どの変異がこのワクチンの安定な高度に弱毒化された表現型の原因であるか
は正確には明らかではない。成人および子供におけるＴｙ２１ａの反応原性（ｒ
ａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を評価するために能動的な監視方法を利用する３つ
の二重盲プラシーボでコントロールした研究の結果は、有害な反応が任意の症状
または徴候について、プラシーボの群よりもワクチンレシピエントにおいて有意
により高い頻度では観察されなかったことを示した。同様に、チリでの約５３０
，０００人の就学児童、エジプトでの約３２，０００人の就学児童、ならびにイ
ンドネシアでの約２０，０００人の小児科および成人の被験体を含む大規模な効
力の実施試験においては、受動的な監視によって、ワクチンに起因し得る有害な
反応を同定することに失敗した（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏら、（１９８４）、前出；
Ｌｅｖｉｎｅら（１９８７ａ）、前出；Ｓｉｍｕｎｊｕｎｔａｋら、前出；Ｗａ
ｈｄａｎら（１９８２）、前出；およびＷａｈｄａｎら（１９８０）、前出）。

【００１９】 Ｔｙ２１ａの制御された実地試験は、ワクチンの処方物、投与される用量の回
数、および用量の間隔が、達成され得る防御のレベルに大きく影響を与えること
を強調する（Ｂｌａｃｋら、前出；Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏら（１９８４）、前出；
Ｌｅｖｉｎｅら（１９８７ａ）、前出；およびＷａｈｄａｎら（１９８０）、前
出）。アレキサンドリア（エジプト）での最初の無作為化した、プラシーボでコ
ントロールされたＴｙ２１ａの実地試験においては、６−７歳の就学児童が、希
釈物中に再懸濁された凍結乾燥ワクチンの３回の用量を受容した（それぞれの用
量の間には１日おきの間隔）（Ｗａｈｄａｎら（１９８０）、前出）。胃酸を中
和するために、子供に、ＮａＨＣＯ₃の１．０ｇの錠剤を、ワクチンまたはプラ
シーボの摂取の数分前に噛ませた。３年間の監視の間には、Ｔｙ２１ａは、確認
された腸チフスに対して９６％の防御効力を付与することを示した（Ｗａｈｄａ
ｎら（１９８２）、前出）。

【００２０】 より最近の処方物（これは、１９８０年代の中期以来市販の製品となっている
）は、腸コーティングされた、酸耐性のカプセル中の凍結乾燥ワクチンからなる
。サンチエゴ（チリ）での無作為化された、プラシーボでコントロールされた実
地試験においては、１週間で与えられたこの腸溶処方物の３回の用量が、その後
の最初の３年間の間に６７％の効力を提供し（Ｌｅｖｉｎｅら（１９８７ａ）、
前出）、そしてその後の７年間にわたって６３％の防御を提供した。８日間で与
えた腸溶カプセル中のＴｙ２１ａの４回の用量は、２回または３回の用量よりも
さらに有意に防御的であった（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏら（１９８４）、前出）。Ｔ
ｙ２１ａは、１９８９年の後半に、米国のＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍ
ｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認されたものによると、推奨されるスケジュ
ールは、１日おきに与えられる４回の用量である；他の国は、３回用量の免疫ス
ケジュールを使用している。

【００２１】 しかし、Ｔｙ２１ａの認識された欠点として、その弱毒化のために分子的な基
礎を欠くこと、その適度な免疫原性、そして最も重要なことに、防御を付与する
ために少なくとも３回、間隔を空けて投与することが必要とされることが挙げら
れる。Ｔｙ２１ａの別の欠点は、血清ＩｇＧ抗−Ｖｉ抗体を刺激しないことであ
る。

【００２２】 （３．弱毒化されたワクチンと免疫後の防御との相関） 公認された生の経口腸チフスワクチン株Ｔｙ２１ａは中程度にのみ免疫原性で
あり、そして防御を誘発するために３回または４回の間隔を空けた用量を必要と
するが、効力は、５−７年間の間の驚くべきほど長期間持続する。２つの免疫学
的アッセイの結果は、異なる処方物によって付与される防御、および実地試験に
おけるＴｙ２１ａの免疫スケジュールと相関することが見出された。これらは、
血清ＩｇＧ Ｏ抗体セロコンバーション（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｄｉｓ．，１１（補遣３）：Ｓ５５２−Ｓ５６７（１９８９ｂ））、および
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中で検出される腸由来ＩｇＡ Ｏ抗体分泌細胞（Ａ
ＳＣ）を数え上げること（Ｋａｎｔｅｌｅ、Ｖａｃｃｉｎｅ、８：３２１−３２
６（１９９０）；Ｔａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０：５３６
−５４１（１９９２ｂ）；およびＶａｎ ｄｅ Ｖｅｒｇら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｎ．，５８：２００２−２００４（１９９０））を含む。防御の免疫学的
な相関としてのこれらの測定値の同定は、新規の弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ株
を可能な生の経口ワクチンとして評価する場合に、初期の臨床試験における使用
の非常に貴重なツールを提供する。

【００２３】 （Ｖ．生の経口ワクチンとしての弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉの新たな生成） 世界中の種々の研究室の研究者らは、単回の経口用量が防御免疫を誘発するよ
うな、Ｔｙ２１ａと同程度に十分に寛容化されているが、相当により免疫原性で
ある、新規の候補のワクチンを操作する作業を行った。その終わりには、候補の
ワクチン株は、種々の生化学的な経路、全体的な調節システム、熱ショックタン
パク質、他の調節遺伝子、および推定の病原性特性をコードする遺伝子を不活化
させることによって、調製されている（Ｃｕｒｔｉｓｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．，５５：３０３５−３０４３（１９８７）、前出；Ｅｄｗａｒｄｓら、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：３９９１−３９９５（１９８４）；Ｈｏｈ
ｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３：１４０８−１４１４（１９
９６ａ）；Ｈｏｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６：１３２６−１３３
３（１９８８）；Ｈｏｎｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、９：８１０−８１６（１９９１
）；およびＬｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４：１９３−１９
６（１９９６））。１つの試みが、Ｖｉ抗原を発現するその能力を回復すること
によって、Ｔｙ２１ａの免疫原性を増大させるために行われた（Ｃｒｙｚら、Ｉ
ｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５７：３８６３−３８６８（１９８９）；およびＴ
ａｃｋｅｔら（１９９１）、前出）。これらの変異の相対的な弱毒化能は、代表
的には、マウスに対してこれらの変異を保有しているＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ株を摂取させること、および同種同系の野生型株によって誘発されるものと結
果を比較することによって評価されている。種々の組換えＳ．ｔｙｐｈｉ株中に
導入された変異（これらは、臨床試験において生の経口ワクチンの候補としてヒ
トに摂取された）を、以下の表１にまとめる。

【００２４】

【表１】

【００２５】 生の経口腸チフスワクチンの開発において中心的な役割を果たす、最も重要な
弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ株を用いた臨床試験の突出した特徴および結果を、
以下にまとめる。

【００２６】 （Ａ．Ｖｉ⁺ Ｔｙ２１ａ株） Ｔｙ２１ａの誘導体は、ｖｉａＢ（Ｖｉポリサッカライドの合成に必要とされ
る構造遺伝子をコードする）を野生型のＴｙ２株からＴｙ２１ａの染色体中に導
入すること、およびＶｉ莢膜ポリサッカライドの発現を実証することによって構
築された（Ｃｒｙｚら、前出）。得られたＶｉ⁺ Ｔｙ２１ａ株を、５．０×１
０⁵、５．０×１０⁷、および５．０×１０⁹のｃｆｕ、ならびに緩衝液を含有す
る液体の懸濁物の単回の用量中で、健常な北アメリカの成人に摂取させた；被験
体のさらなる群には、３回の５×１０⁹ｃｆｕの用量および緩衝液（用量の間は
１日の間隔）を受容させた（Ｔａｃｋｅｔら（１９９１）、前出）。Ｖｉ⁺ Ｔ
ｙ２１ａ株は、十分に寛容化されており、そして３回の用量を受容したほとんど
の被験体は、血清ＩｇＧ抗体およびＳ．ｔｙｐｈｉ Ｏ抗原に対するＩｇＡ Ａ
ＳＣの上昇を生じた。しかし、血清ＩｇＧ抗Ｖｉ抗体の上昇を生じたか、または
ＩｇＡ抗Ｖｉ抗体を分泌するＡＳＣを示した被験体はなかった（Ｔａｃｋｅｔら
（１９９１）、前出）。

【００２７】 （Ｂ．ＥＸ４６２） 化学的な変異誘発によって誘導されたＴｙ２１ａにおける弱毒化変異を含む（
当時そう考えられていた）、組換えＤＮＡ技術を使用するＴｙ２の新規の誘導体
を構築するための試みが、行われた（Ｈｏｎｅら（１９８８）、前出）。詳細に
は、誘導体は、ｇａｌＥにおいて欠失変異を有し、そしてＶｉポリサッカライド
を発現し得なかったが、非特異的な化学的変異誘発を使用して得られるその結果
としての、Ｔｙ２１ａ中に存在する複数の他の変異は有さなかった。得られた株
であるＥＸ４６２は、それがいくつかのレシピエントにおいて腸チフス様症候群
を生じたので、明らかに不十分に弱毒化されていた。これらの観察は、ｇａｌＥ
の変異とそれ自体がＶｉ抗原を発現することができないこととの組合せが、Ｔｙ
２１ａ株の弱毒化の原因ではないことを、決定的に実証する。

【００２８】 （Ｃ．５４１Ｔｙ株および５４３Ｔｙ株） 芳香族アミノ酸の生合成経路中の酵素をコードする遺伝子の不活化を伴う、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａの栄養要求性変異株を作製する概念が、普及している（Ｅｄ
ｗａｒｄｓら、前出；およびＨｏｉｓｅｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：２３８
−２３９（１９８１））。これらの変異は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを、基質（パ
ラ−アミノ安息香酸および２，３−ジヒドロキシベンゾエート）（これらは、哺
乳動物組織中において十分な量では入手することができない）に対して栄養的に
依存性にする；結果として、ワクチンは生存性のままであるが、その増殖能力に
おいては厳しく阻害される。

【００２９】 原型ａｒｏＡ^-の５４１Ｔｙ株および５４３Ｔｙ株（５４１ＴｙのＶｉ^-改変体
）を、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｅｄｗａｒ
ｄｓら、前出）から得た野生型株ＣＤＣ１０８０から構築した。ＣＤＣ１０８０
株の病原性は、ボランティアにおいては直接試験されていない。対照的に、ほと
んどの他の研究者らは、新規の弱毒化された株を操作する彼らの試みにおいて、
Ｔｙ２１ａの親である野生型のＴｙ２株を用いて開始した（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ
ら、前出）。Ｔｙ２の病原性は、ボランティアの研究において確立されている（
Ｈｏｒｎｉｃｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８３：６８６−６９１、お
よび７３９−７４６（１９７０））。

【００３０】 ５４１Ｔｙ株および５４３Ｔｙ株もまた、ｐｕｒＡにおいて欠失変異を有し、
これは、アデニン（または、アデノシンのような吸収可能な化合物）についての
特異的な要求性を生じる（Ｅｄｗａｒｄｓら、前出）。ヒスチジン要求性に至る
ｈｉｓＧにおける第３の変異は、病原性には影響を与えないが、このワクチン株
を野生型のＳ．ｔｙｐｈｉと明らかに区別するさらなる生化学的マーカーを提供
する。

【００３１】 ５４１Ｔｙ株および５４３Ｔｙ株は、第１期の研究において５．０×１０¹⁰ｃ
ｆｕまでの投与量においてきわめて十分に寛容化されていたが、体液性の抗体応
答を刺激することにおいては、Ｔｙ２１ａよりも明らかに免疫原性が低かった（
Ｌｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７９：８８８−９０２（１９
８７ｂ））。例えば、１１％の被験体のみが、血清ＩｇＧ抗Ｏ抗体を生じた（Ｌ
ｅｖｉｎｅら（１９８７ｂ）、前出）。

【００３２】 （Ｄ．ＣＶＤ９０８株） 新たに回収された生物体を用いるヒトにおける第１期の臨床試験において、単
回の経口用量の投与後に十分に寛容化されておりそして高度に免疫原性であるこ
とが証明された１つのワクチンの株が、ＣＤＶ９０８株である（Ｔａｃｋｅｔら
（１９９２ｂ）、前出；およびＴａｃｋｅｔら（１９９２ａ）、前出）。これは
、ａｒｏＣおよびａｒｏＤに正確な欠失変異を有する（Ｈｏｎｅら（１９９１）
、前出）。実際、ＣＶＤ９０８は、なお高度に免疫原性であり、十分に寛容化さ
れており、それによって単回の用量の生の経口腸チフスワクチンを開発する可能
性があり得る見通しがたてられた、最初の遺伝的に操作されたＳ．ｔｙｐｈｉワ
クチン候補であった。５．０×１０⁷ｃｆｕの十分に寛容化された用量では、Ｃ
ＶＤ９０８のレシピエントの９２％が、ＩｇＧ Ｏ抗体セロコンバーションを実
証し、そして腸の免疫系の感作の証拠（ＩｇＡ ＡＳＣ）を示した（Ｔａｃｋｅ
ｔら（１９９２ａ）、前出）。

【００３３】 （１．弱毒化されたワクチンＣＶＤ９０８での免疫後の細胞によって媒介され
る免疫応答） ＣＶＤ９０８を用いる臨床試験は、細胞によって媒介される免疫（ＣＭＩ）応
答の集中的な研究によって特徴付けられている（Ｓｚｔｅｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１５５：３９８７−３９９３（１９９５）；およびＳｚｔｅｉｎら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０：１５０８−１５１７（１９９４））。健
常な成人に投与された場合、ＣＤＶ９０８は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ抗原に対するＣＭ
Ｉ応答を誘発し、これは、サイトカインの産生、ならびに熱およびフェノールで
不活化された全細胞Ｓ．ｔｙｐｈｉ粒子および精製された鞭毛に対する増殖応答
を含む（Ｓｚｔｅｉｎら（１９９４）、前出）。

【００３４】 Ｓ．ｔｙｐｈｉが細胞内病原体であるので、細胞毒性のリンパ球（ＣＴＬ）応
答がＳ．ｔｙｐｈｉを保有している宿主細胞を破壊することによって腸チフス感
染の進行を制限することにおいて重要な役割を果たし得ることもまた、推測され
ている。従って、ＣＴＬアッセイが、弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９０
８を用いた成人のボランティアの免疫が、野生型のＳ．ｔｙｐｈｉで感染させた
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換された自己由来のＢリンパ球
を死滅させ得る血液中のＣＴＬエフェクターを誘発するかどうかを評価するため
に、開発された（Ｓｚｔｅｉｎら（１９９５）、前出）。ＣＴＬ活性は、最初の
免疫の前、ならびに免疫の１４日および２９日後に単離されたＰＢＭＣを使用す
ることによって評価された。ＰＢＭＣは、ＣＴＬアッセイにおいてすぐに使用し
たか、またはＣＴＬ応答の測定の前にＳ．ｔｙｐｈｉに感染させた自己由来のＥ
ＢＶで形質転換された細胞の存在下で６〜８日間インビトロで増殖させられたか
のいずれかであった。このシステムを使用すると、ＣＴＬエフェクターは、Ｓ．
ｔｙｐｈｉに感染させた自己由来のＥＢＶで形質転換した細胞を溶解させた。特
異的なＣＴＬ活性は、免疫の１４日後、およびＳ．ｔｙｐｈｉに感染させた自己
由来のＥＢＶで形質転換した細胞の存在下でのインビトロでの増殖の７〜８日後
に得られたＰＭＢＣ調製物中で観察された。免疫の２９日後に得られたＰＢＭＣ
は、免疫の１４日後に単離された細胞中で観察されたものに匹敵するか、または
それよりも大きなＣＴＬ活性のレベルを示した。これらのＰＢＭＣ培養物中のＣ
ＴＬエフェクター細胞の集団は、伝統的なＣＤ８⁺、ＭＨＣクラスＩ制限、細胞
毒性Ｔリンパ球集団であった（Ｓｚｔｅｉｎら（１９９５）、前出）。弱毒化さ
れたＳ．ｔｙｐｈｉでの免疫が、自己由来のＳ．ｔｙｐｈｉで感染させた標的を
死滅させ得る、循環しているＣＤ８⁺、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬエフェクター
細胞を誘発するという観察は、ＣＴＬが細菌を保有している宿主細胞を破壊する
ことによって腸チフスの感染の進行を制限することにおいて重要な役割を果たす
という主張を支持する。

【００３５】 （２．弱毒化されたワクチン株ＣＶＤ９０８の欠点） ＣＶＤ９０８を用いるフェーズ１の臨床試験において観察された可能性のある
欠点は、このワクチン株を５．０×１０⁷ｃｆｕの用量で摂取した被験体の５０
％、および５．０×１０⁸ｃｆｕの用量で受容した被験体の１００％が、サイレ
ントなワクチネミア（ワクチネミアｓ）を実証したことである。ここで、ワクチ
ン生物体は、ワクチン接種の４日後から８日後の間の１回以上の時点で採取され
た血液培養物から回収された。血液培養物は、彼らがワクチンを摂取した後の数
時間以内に、そして次いで２日、４日、５日、７日、８日、１０日、１４日、２
０日、２７日、および６０日目でこれらの個体において全身的に採取された。い
ずれのワクチン接種を受けた人に由来する血液培養物も、４日目前および８日目
後には陽性ではなかった。ワクチネミアは、臨床結果を示さないようであり（例
えば、彼らは、発熱を伴わなかった）、そしてこれらは、短い間存続し、突然に
抗生物質の使用を伴わずになくなった。しかし、弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ株
を用いたワクチネミアが、免疫無防備の個体がおそらく含まれる大きな集団中に
有し得る可能性のある結果は未知である。ＣＶＤ９０８の別の認知された欠点は
、高用量のワクチンを受けるワクチン接種を受けた人の小さな集団における、発
熱である（Ｔａｃｋｅｔら（１９９２ａ）、前出）。

【００３６】 あるいは、さらなる変異がＣＶＤ９０８中に導入されることが求められて、十
分に寛容化されたままであり、そしてなお免疫原性であり、ワクチネミアまたは
発熱を示さない誘導体を得た。

【００３７】 （Ｅ．ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ） ｈｔｒＡ（セリンプロテアーゼとしてもまた機能するストレスタンパク質をコ
ードする遺伝子）の不活化が、マウスのモデルにおいて野生型のＳ．ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍを弱毒化することが見出された（Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１２：１４５−１５１（１９９２ａ）
）。さらに、ｈｔｒＡ中に欠失変異を有するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで経口
的に免疫されたマウスは、野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの致死用量での続
くチャレンジに対して防御された（Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら（１９９２ａ）、前出
）。従って、欠失変異が、ＣＶＤ９０８のｈｔｒＡ中に導入され、これによって
株ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡが得られた（Ｌｅｖｉｎｅら（１９９６）、前出）。
ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡの単回の用量を、５．０×１０⁷（Ｎ＝７）、５．０×
１０⁸（Ｎ＝８）、または、５．０×１０⁹（Ｎ＝７）のｃｆｕを摂取した被験体
の３つの群に与えた（Ｔａｃｋｅｔら、（１９９７）前出）。ＣＶＤ９０８−ｈ
ｔｒＡ株はＣＶＤ９０８の親株と同様に十分に寛容化されていた。これらの２２
人の被験体の１人だけが、低い程度の発熱を生じ、これは、日常的な監視によっ
て検出され、そして任意の倦怠感の苦情は伴わなかった。しかし、２２人の被験
体のうちの２人は、軟便を発症した（Ｔａｃｋｅｔら（１９９７）、前出）。同
様に、免疫応答は優れていた：２２人の個体のうちの２０人（９１％）が、血清
ＩｇＧ Ｏ抗体において有意な上昇を実証し、そしてＯ抗原に対する抗体を作成
する腸に由来するＩｇＡ ＡＳＣが、ワクチン接種を受けた人の１００％におい
て検出された。これらの免疫学的応答は、ＣＶＤ９０８の匹敵する用量を用いて
免疫した被験体におけるフェーズ１の臨床試験において観察されるものと実質的
に同一である（Ｔａｃｋｅｔら、（１９９２ａ）、前出）。１つの著しい相違は
、ワクチネミアに関した。ワクチネミアが、ＣＶＤ９０８の５．０×１０⁷また
は５．０×１０⁸のｃｆｕの用量を受容した１８人の被験体のうちの１２人にお
いて検出されたが、十分に寛容化された高度に免疫原性の、ＣＶＤ９０８−ｈｔ
ｒＡの５．０×１０^7-9のｃｆｕの用量を摂取した２２人の個体においてはワク
チネミアは全く検出されなかった（ｐ＜０．００１）（Ｌｅｖｉｎｅら（１９８
７ｂ）、前出；Ｔａｃｋｅｔら（１９９２ａ）、前出；およびＴａｃｋｅｔら（
１９９７）、前出）。ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡもまた、ＣＶＤ９０８で記録され
たものに強さにおいて匹敵する、ワクチン接種された人における強力な細胞によ
って媒介される免疫応答を誘発する（Ｔａｃｋｅｔら（１９９２ａ）、前出；お
よびＴａｃｋｅｔら（１９９７）、前出）。これらの非常に有望なデータに基づ
いて、ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡは、子供を含む多数の被験体におけるその臨床的
な受容可能性および免疫原性を評価するためのフェーズ２の臨床試験に入った。

【００３８】 （Ｆ．ｃｙａ、ｃｒｐ、またはｃｙａ、ｃｒｐ、ｃｄｔ中に変異を有する株） Ｓａｒｍｏｎｅｌｌａにおいては、遺伝子ｃｙａ（アデニル酸シクラーゼをコ
ードする）およびｃｒｐ（サイクリックＡＭＰレセプタータンパク質）は、多く
の遺伝子およびオペロンに影響を与える全体的な調節システムを構成する（Ｃｕ
ｒｔｉｓｓら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，８２：２３−３３（１９９４
））。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ｃｙａおよびｃｒｐに欠失を有する）は、
それらの野生型の親と比較して弱毒化されており、そして経口の免疫によって病
原性のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍでのチャレンジに対してマウスを防御する（
Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８７）、前出）。

【００３９】 ワクチンの候補株である、χ３９２７（Ｓ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株のｃｙａ^-、
ｃｒｐ^-の二重変異株）が構築された（Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９９４）、前出）
。フェーズ１の臨床試験においては、χ３９２７株が、野生型株と比較して弱毒
化されていたが、ヒトにおいて生の経口ワクチンとして作用するには不十分に弱
毒化されており、その結果、被験体は時折、高熱および腸チフス様の症状を発症
することが示された（Ｔａｃｋｅｔら、（１９９２ｂ）、前出）。いくつかの被
験体はまた、ワクチネミアを示した（Ｔａｃｋｅｔら、（１９９２ｂ）、前出）
。

【００４０】 より大きな程度の弱毒化を達成するために、ｃｄｔにおける第３の欠失変異を
、ｃｙａ^-、ｃｒｐ^-変異株であるχ３９２７中に導入した（Ｃｕｒｔｉｓｓら（
１９９４）、前出）。ｃｄｔは、肝臓、脾臓、および骨髄のような、細網内皮細
胞系のより深い器官に対して、腸に関連するリンパ球様組織からのＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａの汎発に影響を与える遺伝子である（Ｋｅｌｌｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ
ｍｍｕｎ．，６０：４８８１−４８９０（１９９２））。得られるｃｙａ^-、ｃ
ｒｐ^-、ｃｄｔ^-の三重変異株であるχ４０７３を、北アメリカの健常な成人に、
緩衝液とともに、５．０×１０⁵、５．０×１０⁶、５．０×１０⁷、または５．
０×１０⁸のｃｆｕを含有する単回の用量で、摂取させた（Ｔａｃｋｅｔら、（
１９９７）、前出）。この株は、下痢を発症した５．０×１０⁷のｃｆｕの群に
おける１人の個体を除いて、十分に寛容化されていた（Ｔａｃｋｅｔら、（１９
９７）、前出）。ワクチネミアを示した被験体はなかった。５．０×１０⁸のｃ
ｆｕを摂取した５人の被験体のうちの４人は、血清ＩｇＧ Ｏ抗体において有意
な上昇を示し、そしてＩｇＡ Ｏ抗体を作成するＡＳＣを有した（Ｔａｃｋｅｔ
ら、（１９９７）、前出）。

【００４１】 （Ｇ．ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ中に変異を有する株） ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ中に欠失を有する２つの候補のＳ．ｔｙｐｈｉ株が構築さ
れた（Ｈｏｈｍａｎｎら、（１９９６ａ）、前出；およびＨｏｈｍａｎｎら、Ｖ
ａｃｃｉｎｅ，１４：１９−２４（１９９６ｂ））。Ｔｙ４４５株（これはまた
、ａｒｏＡ中にも欠失を有する）は、非常に弱毒化されており、そして最少にの
み免疫原性であることが見出された（Ｈｏｈｍａｎｎら（１９９６ｂ）、前出）
。対照的に、Ｔｙ８００株（ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ中のみに欠失を有するＴｙ２の
誘導体）は一般的に十分寛容化されており、そして１１人の被験体を含むフェー
ズ１の小さい臨床試験において１０⁷から１０¹⁰のｃｆｕまでの投与量レベルで
評価した場合には、免疫原性であった（Ｈｏｈｍａｎｎら（１９９６ｂ）、前出
）。最も高い投与量レベルでは、３人のワクチン接種を受けたヒトのうちの１人
が、下痢を発症した（１０回の軟便）。Ｔｙ８００を受容した被験体の免疫応答
と、ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡおよびχ４０７３のレシピエント中で観察されるも
のとを比較することは、困難である。なぜなら、免疫学的なアッセイ技術のいく
つかが異なり、そして同じアッセイが使用される場合（例えば、Ｏ抗体を作成す
るＩｇＡ ＡＳＣ）でさえも、相当のバリエーションが、研究室間で生じること
が知られているからである。

【００４２】 （Ｈ．まとめ） ＣＶＤ９０８は十分に寛容化されているが、１０⁷のｃｆｕの用量を摂取した
被験体の約５０％において、ワクチネミアを伴った。穏やかな、しかし明らかな
下痢が、ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ、Ｔｙ８００、またはχ４０７３を摂取した被
験体の約１０％において観察されている。χ４０７３に対する免疫応答は、ＣＶ
Ｄ９０８、ＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ、および明白には、Ｔｙ８００で経口的に免
疫した後に観察されるよりも、弱かった（上記の表１を参照のこと）。従って、
フェーズ１の臨床試験を完了した４つの弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ株が存在す
るが、それぞれは、さらなる候補の弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉワクチン株の開
発における目的が存在するという十分な関心を有する、少なくとも１つの欠点を
有する。さらに、これらの４つの株のいずれもが、既知の防御免疫応答である、
血清ＩｇＧ抗Ｖｉ抗体を誘発することに成功していない。

【００４３】 （ＶＩ．他の病原体に由来する防御抗原をコードする外来遺伝子を発現し、そ
して免疫システムに対してこれらの抗原を送達する、生のベクターワクチンとし
ての弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の使用） 生のベクターワクチン（「キャリアワクチン」または「生の抗原送達システム
」とも呼ばれる）は、ワクチン学の分野の刺激的かつ多目的な領域を含む（Ｌｅ
ｖｉｎｅら、Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９：２３−３２（１９９０）
；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０３：６９９−７０２（
１９９２）；Ｂａｒｌｅｔｔａら、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：９
３１−９４０（１９９０）；Ｄｏｕｇａｎら、Ｐａｒａ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９
：１５１−１６０（１９８７）；およびＣｕｒｔｉｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３５−４９（１９８９））。
このアプローチにおいては、生のウイルスまたは細菌ワクチンは、それが別の微
生物の防御性の外来抗原を発現し、そしてその抗原を免疫系に送達し、それによ
って防御免疫応答を刺激するように改変される。公表されている生の細菌ベクタ
ーとして、とりわけ、弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｌｅｖｉｎｅら（１
９９０）、前出；Ｍｏｒｒｉｓら、前出；Ｄｏｕｇａｎら、前出；およびＣｕｒ
ｔｉｓｓら（１９８９）、前出）、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅ
ｒｉｎ（Ｂａｒｌｅｔｔａら、前出）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌ
ｉｔｉｃａ（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０３：
５２０−５３１（１９９２））、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｏ１（Ｖｉｒｅｔら、
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２３９−２５２（１９９３））、およびＥ
．ｃｏｌｉ（Ｈａｌｅ、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：９１３−９１
９（１９９０）が挙げられる。それぞれは、特定の利点およびいくつかの欠点を
有する。

【００４４】 弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉは、ヒトについて生のベクターワクチンとしては
特に魅力的である。なぜなら、それは経口的に投与され、腸に関連するリンパ球
様組織および細網内皮細胞系にコロニー形成し、広範な免疫応答（血清抗体、粘
膜のＳＩｇＡ、広範な免疫応答（古典的なＣＴＬを含む）、および抗体依存性の
細胞性の細胞傷害性の形態を含む）を誘発するからである（Ｃｏｎｒｙら、Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：５９−６５（１９９５）；Ｃｏｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，６７：５６６４−５６６７（１９９３）；Ｄａｖｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９３：７２１３−７２１８（１９９６ａ）
；Ｄａｖｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、９６：１１１−１１６、Ｂｒｏｗｎら（編
）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９６ｂ）；Ｔａｃｋｅｔら（１９９２ａ）、前出；Ｇｏｎｚａｌｅｓら
、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６９：９２７−９３１（１９９４）；および
Ｓｚｔｅｉｎら（１９９４）、前出）。さらに、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、遺伝
的に容易に操作され、そして多くの外来抗原がすでにこれらの細菌中で発現され
ている。理論的には、種々の感染性の疾患に対する１回の用量の経口ワクチンが
、十分に寛容化されたがなお高度に免疫原性であるＳ．ｔｙｐｈｉの生のベクタ
ー株中に、防御抗原をコードする外来遺伝子を安定に導入および発現させること
によって、開発され得る（Ｌｅｖｉｎｅら（１９９０）、前出）。

【００４５】 （ＶＩＩ．プリンの代謝経路に変異を有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ） （Ａ．プリンの代謝経路に変異を有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の初期の報告
） ＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるｐｕｒＡおよびｐｕｒＢ変異（アデニンヌクレ
オチドの新たな生合成を遮断する）（図２を参照のこと）は、十分に高度に弱毒
化されている（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．，３
：１２９−１４１（１９８７））。これらの株は、動物においては非防御的であ
り（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６：４１９−
４２３（１９８８））、そしてヒトにおいては免疫原性が低い（Ｌｅｖｉｎｅら
、（１９８７ｂ）、前出）。対照的に、一般的なプリン経路に関与する遺伝子の
いくつか（すなわち、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＧ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＨＤ）における変
異（これらは、両方のプリンヌクレオチドの生合成を妨害する（図２を参照のこ
と））、またはｇｕａＢもしくはｇｕａＡにおける変異（それらによって、グア
ニンヌクレオチドの生合成が遮断される（図２を参照のこと））は、はるかに少
なく弱毒化されることが報告されている（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、前出）；実際
、このような株は、１０²ｃｆｕ程度の低い用量でマウス中で死を誘導した（Ｍ
ｃＦａｒｌａｎｄら、前出）。

【００４６】 上記で検討した観察は以下のことを示唆する： （ｉ）一般的なプリン経路の酵素に影響を与える変異は、穏やかに弱毒化する
（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、前出）；そして （ｉｉ）一般的な経路に対して遠位でありそしてアデニンヌクレオチドの合成
に影響を与える変異は、過度に弱毒化する（すなわち、ｐｕｒＡ、ｐｕｒＢ）（
ＭｃＦａｒｌａｎｄら、前出；Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｍら、前出；およびＬｅｖ
ｉｎｅら（１９８７ｂ）、前出）が、グアニンヌクレオチドの合成に影響を与え
る遠位の変異は、最少に弱毒化するだけである（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、前出）
。

【００４７】 （Ｂ．本発明における予想外でありそして特有の観察） 従って、上記に報告された公開された観察に基づけば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ中の特
異的なｇｕａ栄養要求性が高度な弱毒化を提供することは、予想外の発見であっ
た。この弱毒化は、低下した侵襲性（代謝経路中に弱毒化変異を有する他のＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．においては以前には記載されていない特性）、およ
びΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異株の低下した細胞内複製率に、一部起因
すると考えられる。この知見は、グアニンヌクレオチドの合成に影響を与える挿
入Ｔｎ５変異を保有するＳ．ｄｕｂｌｉｎおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが
、最少に弱毒化されるのみであると報告されたので、予想外であった（ＭｃＦａ
ｒｌａｎｄら、前出）。さらに、別の予想外の知見は、この高度な弱毒化にもか
かわらず、本明細書中に記載されているΔｇｕａＢ−ＡであるＳ．ｔｙｐｈｉ株
ＣＶＤ９１５は、マウスの動物モデルにおいて非常に免疫原性であった。この観
察は、ｐｕｒＡおよびｐｕｒＢを不活化させる変異を有する高度に弱毒化された
株が非常に免疫原性が低いという以前の報告からは予想できない（Ｅｄｗａｒｄ
ｓら、前出）。また、別の予想できなかった観察は、ＣＶＤ９１５株が、同じ弱
毒化株において発現される組換え抗原に対する印象的な免疫応答を誘導すること
であった。この観察は、高度に弱毒化された株が組換え異種抗原についての乏し
い生ベクターであるという、以前に報告された観察からは予想できない（Ｔａｃ
ｋｅｔら（１９９７）、前出）。

【００４８】 さらに、ＣＶＤ９１５株は、組換えの外来抗原（ＤＮＡによって媒介されるワ
クチン）をコードする真核生物発現ベクターを送達し、そしてびっくりするよう
な免疫応答を誘発することが可能であった。真核生物の発現ベクタープラスミド
を送達する特性は、弱毒化されたＳｈｉｇｅｌｌａベクターを用いて（Ｓｉｚｅ
ｍｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：２９９−３０２（１９９５））；および
弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍベクターを用いて
（Ｄａｒｊｉら、Ｃｅｌｌ、９１：７６５−７７５（１９９７））報告されてい
る。Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｓｐ．は侵襲性の生物であり、そしてＤＮＡワクチン
を送達することにおけるそれらの成功は、それらが侵襲の直後に食胞を離れると
いう事実に対して二次的であると考えられる（Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉら、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５１：４６１−４６９（１９８６））。しかし、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａは、侵襲後に食胞を離れない。従って、本明細書中で提示される
観察は、以前の概念からは予想できず、そして特有である。

【００４９】 まとめると、本発明においては、特有の方法によって、Ｖｉ抗原の構成的であ
りそして安定な発現を達成するための、遺伝子操作された弱毒化されたＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａを考案している。さらに、本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株は
、好ましくはまた、新たなグアニンの代謝経路における変異によって弱毒化させ
られる。

【００５０】 （発明の要旨） 本発明の目的は、Ｖｉ抗原を構成的に発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化
された株を提供することである。

【００５１】 本発明の別の目的は、Ｖｉ抗原の構成的な発現を達成するための方法を提供す
ることである。

【００５２】 本発明のなお別の目的は、新たなグアニン代謝経路中での変異によってもまた
弱毒化されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａを提供することである。

【００５３】 本発明のなお別の目的は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｇｕａＢおよびｇｕａＡ遺
伝子中で欠失変異を達成するための方法を提供することである。

【００５４】 本発明のさらなる目的は、腸チフスに対する経口または鼻腔内（すなわち、粘
膜）ワクチンを提供することである。

【００５５】 本発明のさらなる目的は、他の病原体からクローン化された外来遺伝子の生ベ
クターとして有用であり、そして発現および適切な免疫の際に、外来抗原が由来
する病原体に対する防御免疫応答を惹起する、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を提供す
ることである。

【００５６】 本発明のなおさらなる目的は、ＤＮＡによって媒介されるワクチンを送達する
ための生ベクターとして有用なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株を提供することである。

【００５７】 本発明のこれらのおよび他の目的は、以下に提供される本発明の詳細な説明か
ら明らかであり、１つの実施態様においては、弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ変異株によって達成される。ここで、上記の変異株はＶｉ抗原を構成的に発現
する。

【００５８】 （発明の詳細な説明） 本発明は、特に、腸チフスに対する経口ワクチンとして、ならびに外来抗原を
発現する生ベクター、ＤＮＡによって媒介されるワクチンとしての使用のための
、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｌｌａを提供する。本明細書中で使用される場合は、「外
来抗原」は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して外来である抗原を意味する。

【００５９】 また、本発明においては、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株が提供される。
ここで、上記の変異株は、Ｖｉ抗原を構成的に発現する。

【００６０】 本発明においては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの染色体ゲノムが、強力な構成的な
プロモーターによって高度に調節されたｖｉｐＲプロモーターを置きかえること
によって改変され、従って、これによって、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ中でＶ
ｉ抗原の発現を構成的かつ安定に発現させることが好ましい。本発明において使
用される特定の構成的なプロモーターは、従って重要ではない。このような構成
的なプロモーターの例として、Ｐ_tac（ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０：２１−２５（１９８３））、Ｐ_lac（Ｄｅ Ｂｏ
ｅｒら、前出）、Ｐ_trc（Ｄｅ Ｓｕｔｔｅｒら、Ｇｅｎｅ、１４１：１６３−
１７０（１９９４））、Ｐ_OlacおよびＰ_lpp（Ｄｅ Ｓｕｔｔｅｒら、前出；お
よびＧｕｉｓｅｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２：２４９−
２５８（１９９８））が挙げられる。

【００６１】 本発明において出発物質として使用される特定のＳ．ｔｙｐｈｉは、従って、
重要ではない。

【００６２】 本明細書中の実施例においては、Ｓ．ｔｙｐｈｉワクチンは、野生型Ｓ．ｔｙ
ｐｈｉ Ｔｙ２株から構築された。

【００６３】 Ｓ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２は、例えば以下のような種々の供給源から入手可能な
周知の病原性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株である：ＣＶＤ、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏ
ｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）、Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａ
ｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｆｏｒｍｄ Ｓ
ｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（フランス）、Ｉｍｐｅｒｉａ
ｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ（英国）。

【００６４】 他の野生型のＳ．ｔｙｐｈｉ株（これらは、弱毒化ワクチン候補の開発におい
て使用されており、そして本発明において出発物質として使用され得る）として
、以下が挙げられる：ＣＤＣ１０８０株（Ｌｅｖｉｎｅら（１９８７ｂ）、前出
）（これは、スタンフォード大学またはＣＤＣから入手され得る）、およびＩＳ
Ｐ１８２０株（Ｈｏｎｅら、（１９９１）、前出）（これは、Ｃｅｎｔｅｒ ｆ
ｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｍａｒｙｌａｎｄから入手され得る）。

【００６５】 好ましくは、本発明においては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの染色体ゲノムが、ｇ
ｕａＢ−Ａオペロンを除去するかまたはそうでなければ改変することによって改
変され、従って、グアニンヌクレオチドの新たな生合成をブロックする。より好
ましくは、定義された、インフレームでの、ｇｕａＢ−Ａオペロン中の非極性の
変異が、プリンの代謝経路の酵素であるＩＭＰデヒドロゲナーゼ（ｇｕａＢによ
ってコードされる）およびＧＭＰシンテターゼ（ｇｕａＡによってコードされる
）を不活化する。これらの変異の結果として、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、新たに
ＧＭＰを合成することができず、そして結果として、ＧＤＰおよびＧＴＰヌクレ
オチドの合成ができない（図２を参照のこと）。これは、哺乳動物の組織におい
てその増殖を重篤に制限する。インビトロにおいては、本発明のΔｇｕａＢ−Ａ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株は、グアニンを補充していない最少培地では増殖
することができない。組織培養物においては、本発明のΔｇｕａＢ−Ａ Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ変異株は、それらの侵襲能力において有意な低下を示すことが見
出された。ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株は、哺乳動物の宿主の
組織からグアニンヌクレオチドを廃棄し得る。しかし、それらのＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａへの同化作用が、グアニンの回収経路中にヌクレオチド前駆体として取り
こまれるペリプラズムヌクレオチダーゼによる、ヌクレオシドへの脱リン酸化の
前に、必要である。従って、ヌクレオチドが哺乳動物宿主の細胞内環境において
容易に入手可能であるので、グアニンヌクレオチドの新たな合成に起因する弱毒
化は、回収経路の不十分さ、または今日までの知見に対して曖昧である理由のい
ずれかに起因する。

【００６６】 ｇｕａＡ遺伝子（これはＧＭＰシンテターゼをコードする）は、１５７５ｂｐ
の大きさである（図３Ａ〜３Ｇを参照のこと）。従って、ｇｕａＡ変異体におけ
るシストロン内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）不活化欠失の大きさは、１か
ら１５７５ｂｐの範囲であり得、好ましくは、欠失がインフレームである場合に
は、１００から１５７５ｂｐの範囲であり得る。ｇｕａＡ遺伝子を超える範囲に
およぶ欠失もまた行われ得る。すなわち、ｇｕａＡの下流の槽内欠失が、この遺
伝子の転写に影響し得、従って、それを不活化し得る。しかし、後者は、好まし
くはない。

【００６７】 ｇｕａＢ遺伝子（これは、ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードする）は、１５３
３ｂｐの大きさである（図３Ａ〜３Ｇを参照のこと）。従って、ｇｕａＢ変異体
中のシストロン外（ｅｘｔｒａｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）欠失の大きさは、１ｂｐか
ら１５３３ｂｐの範囲であり得、好ましくは、欠失がインフレームである場合に
は、１００から１５３３ｂｐの範囲であり得る。ｇｕａＢ遺伝子を超える範囲に
およぶ欠失もまた行われ得る。すなわち、ｇｕａＢの下流のシストロン外欠失が
、両方の遺伝子（ｇｕａＢおよびｇｕａＡ）の転写に影響し得、従って、それら
を不活化し得る。しかし、後者は、好ましくはない。

【００６８】 欠失は、ｇｕａＡ遺伝子中に配置された２つの便利な制限部位を使用して、ｇ
ｕａＡ遺伝子中に作成され得る；これらの例は、ＳｃａＩまたはＡｃｃＩ、およ
びＥｃｏＲＶまたはＳａｌＩまたはＳｍａＩまたはＳｐｈＩまたはＸｍａＩであ
る（図３Ａ〜３Ｇ、および図４）か、あるいはオリゴヌクレオチドを用いる部位
特異的変異誘発による（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ編（１９８９））。

【００６９】 欠失は、ｇｕａＢ遺伝子中に配置された２つの便利な制限部位を使用して、ｇ
ｕａＢ遺伝子中に作成され得る；これらの例は、ＢｃｌＩ、およびＢｓｍＩまた
はＥｃｏＲＩまたはＰｖｕＩＩまたはＳａｃＩＩまたはＳｓｐＩまたはＸｈｏＩ
Ｉである（図３Ａ〜３Ｇ、および図４）か、あるいはオリゴヌクレオチドを用い
る部位特異的変異誘発による（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。

【００７０】 さらに、ｇｕａＢ遺伝子およびｇｕａＡ遺伝子中に同時に配置された制限部位
の任意の組み合わせが、本発明の欠失変異株を得るために使用され得る；この例
として、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｈａＩＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、Ａ
ｓｕＩ、ＢａｎＩ、ＢｃｎＩ，Ｂｓｐ１２８６、ＢｓｐＭＩＩ、およびＤｄｅＩ
が挙げられる（図３Ａ〜３Ｇ）。

【００７１】 ｇｕａＡ遺伝子および／またはｇｕａＢ遺伝子の不活化はまた、ｇｕａＢおよ
び／またはｇｕａＡの正確な転写を遮断するように、上記の制限部位の任意のも
のを使用する外来ＤＮＡの挿入によって、またはオリゴヌクレオチドを用いる部
位特異的変異誘発によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）行われ得る。ｇｕａＡ
遺伝子およびｇｕａＢ遺伝子を不活化し得る挿入物の代表的な大きさは、１塩基
対から１００ｋｂｐであるが、１００ｋｂｐよりも小さい挿入物が好ましい。挿
入は、ｇｕａＡ遺伝子またはｇｕａＢ遺伝子のコード領域の内部、またはコード
領域とプロモーターの間のどこででも行われ得る。

【００７２】 ｇｕａＡおよび／またはｇｕａＢ遺伝子の不活化のための他の方法として、他
の腸内細菌のｇｕａＡ遺伝子またはｇｕａＢ遺伝子中に作成された欠失または挿
入の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａへの移入、トランスポゾンによって生成される欠失
、およびＤＮＡの挿入物の不正確な切除が挙げられる。後者の２つの方法は、ｇ
ｕａＡ遺伝子またはｇｕａＢ遺伝子を超える範囲にわたる欠失を作成する可能性
がより高く、従って好ましくはない。

【００７３】 本発明のｇｕａ変異体は、非反応原性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｇｅｎｉｃ）であ
るＳａｌｍｏｎｅｌｌａの候補の生の経口ワクチンの開発に有用である。

【００７４】 例えば、他の弱毒化変異を含むことに加えて、ａｒｏ遺伝子産物を発現しない
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａワクチン候補が、構築され得る。これは、Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ染色体中の少なくとも１つのａｒｏ遺伝子（ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、または
ａｒｏＤ）の一部を欠失させ、ＰＡＢＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ＣＶＤ９０８株のような哺乳動物細胞中では廃棄され得ない基質）について栄養
要求性菌株にすることによって達成され得る（Ｈｏｎｅら、（１９９１）、前出
）。

【００７５】 別の実施態様においては、本発明の上記の目的は、以下を含有する腸チフスに
対するワクチンによって達成されている： （Ａ）薬学的有効量のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ変異株、ここで、上
記の変異株はＶｉ抗原を構成的に発現する；および （Ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。

【００７６】 なお別の実施態様においては、本発明の上記の目的は、以下を含有する生のベ
クターワクチンによって達成されている： （Ａ）薬学的有効量のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株、ここで、上記の変異株は
Ｖｉ抗原を構成的に発現し、そしてここで、上記の変異株は原核生物のプロモー
ターの制御下で外来抗原をコードしそして発現する（すなわち、外来抗原の細菌
性の発現）；および （Ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。

【００７７】 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの生ベクター中で使用される特定の外来抗原は、本発明
については重要ではない。本発明の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株（単数または
複数）は、腸の病原体（細菌、ウイルスなどのような定義された病原体）、性的
に伝達される疾患の病原体、急性の気道疾患の病原体、または疾患（例えば、髄
膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）疾患）の全身的な発現を生じることを導
く粘膜に侵入する病原体に対する免疫のための生のベクター（単数または複数）
として使用され得る。これらは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｅｎｔａｍｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、およ
びＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍのような、種々の型の寄生生物の感染症に対
して防御するためにもまた、使用され得る。

【００７８】 本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生ベクター中で発現され得る腸病原体に由来
する抗原の例として、以下が挙げられる： （ａ）腸毒素産性Ｅ．ｃｏｌｉの線毛の（ｆｉｍｂｒｉａｌ）コロニー形成因
子、および熱不安定性の腸毒素または変異体熱不安定性腸毒素のＢサブユニット
（これは、腸管の分泌物を生じないが、中和抗毒素を誘発する）のいずれか； （ｂ）Ｓｈｉｇａ毒素１もしくは２（または変異体Ｓｈｉｇａ毒素１もしくは
２）のＢサブユニットとともに、腸出血性のＥ．ｃｏｌｉの線毛の抗原および／
または内膜（ｉｎｔｉｍｉｎ）； （ｃ）ＳｈｉｇｅｌｌａのＯ抗原、およびＳｈｉｇｅｌｌａの侵襲性プラスミ
ド抗原またはＶｉｒＧ； （ｄ）ロタウイルスに由来する中和抗原； （ｅ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｌｏｒｉに由来する、ウレアーゼ、コ
ロニー形成抗原、および他の防御性の抗原；ならびに （ｆ）不活化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素、またはそ
れらに由来する抗原。

【００７９】 本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生ベクター中で発現され得る性的に伝達され
る病原体に由来する抗原の例として、以下が挙げられる： （ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏａｅのピリ線毛および外膜タン
パク質；ならびに （ｂ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質。

【００８０】 本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生ベクター中で発現され得る急性の気道の病
原体に由来する抗原の例として、以下が挙げられる： （ａ）毒性の活性を欠いているが、なお中和抗毒素を誘発する、ＮＡＤ結合ド
メイン中に置換を有する、変異体ジフテリア毒素； （ｂ）破傷風毒素のフラグメントＣに融合させられた百日咳毒素の短形のＳ１
サブユニット、変異体百日咳毒素、繊維状血球凝集素、およびペルタクチン（ｐ
ｅｒｔａｃｔｉｎ）からなる融合タンパク質を含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓの抗原； （ｃ）ＲＳウイルスのＦ糖タンパク質およびＧ糖タンパク質； （ｄ）Ｈａｅｍｐｈｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型の夾膜のポリサッカ
ライド；ならびに （ｅ）Ａ群およびＣ群のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの夾
膜のポリサッカライド、ならびにＢ群のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タ
ンパク質。

【００８１】 本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生ベクター中で発現され得る、寄生生物に由
来する抗原の例として、以下が挙げられる： （ａ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの、スポロゾイト周囲の
タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＳＰ）、
Ｌｉｖｅｒ Ｓｔａｇｅ抗原１（ＬＳＡ−１）、ＳＳＰ−２（ＴＲＡＰとしても
知られている）、およびＥｘｐ−１； （ｂ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの、無性の赤血球の世代の抗原（ＭＳＰ−１
、ＭＳＰ−２、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１、およびＳＲＥＨＰを含む）； （ｃ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの、有性世代の抗原（Ｐｆｓ２５を含む）、
およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種のｇｐ６３；ならびに （ｄ）セリンリッチなＥｎｔａｍｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａタンパク質
（ＳＲＥＨＰ）。

【００８２】 なお別の実施態様においては、本発明の上記の目的は、以下を含有するＤＮＡ
によって媒介されるワクチンによって達成されている： （Ａ）薬学的有効量のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株、ここで、上記の変異株は
Ｖｉ抗原を構成的に発現し、そしてここで、上記の変異株は、真核生物細胞中で
、真核生物のプロモーターを使用して、外来抗原をコードしそして発現するプラ
スミドを含む；および （Ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。

【００８３】 ＤＮＡによって媒介されるワクチンの構築および使用についての詳細は、１９
９５年５月３日に提出された、米国特許出願番号第０８／４３３，７９０号にお
いて見出され得る。これは、その全体が本明細書中で参考として援用される。

【００８４】 ＤＮＡによって媒介されるワクチンにおいて使用される特定の外来抗原は、本
発明については重要ではない。このような抗原の例として、以下のような病原体
の多様性に由来するものが挙げられる：インフルエンザ（Ｊｕｓｔｅｗｉｃｚら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：７７１２−７７１７（１９９５）；およびＦｙｎａ
ｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１７：７９−８３（１
９９５））、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（Ｚａｒｏｚｉｎｓｋｉら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５４：４０１０−４０１７（１９９５））、ヒト免疫不全ウイル
ス（Ｓｈｉｖｅｒら、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７２：１９８−２
０８（１９９５））、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｄａｖｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２
：１５０３−１５０９（１９９４））、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｌａｇｇｉｎｇら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：５８５９−５８６３（１９９５））、狂犬病ウイルス
（Ｘｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０９：５６９−５７９（１９９５））、
住血吸虫（Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，２１２：１０２９−１０３９（１９９５））、プラスモディウム（Ｓｅｄ
ｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９１：９８６
６−９８７０（１９９４））；ならびにマイコプラズマ（Ｂａｒｒｙら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、３７７：６３２−６３５（１９９５））。

【００８５】 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ中で（生のベクターワクチン中で原核生物プロモーター
を使用する）、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａによって侵入された細胞中で（ＤＮ
Ａによって媒介されるワクチン中で原核生物プロモーターを使用する）外来抗原
を発現するか否かの決定は、その特定の抗原のためのワクチン構築物が、動物研
究または臨床試験において最良の免疫応答を生じること、および／または抗原の
グリコシル化がその防御的な免疫原性に必須であるか否か、および／または抗原
の正確な三次構造が、他よりも１つの発現の形態で良好に達成されるか否かに基
づき得る。

【００８６】 本発明のワクチンにおいては、投与される薬学的有効量の本発明の変異株は、
被験体の年齢、体重、および性別、ならびに投与の形態に依存して変化し得る。
一般的には、使用される投与量は、約１０²のｃｆｕから約１０¹⁰のｃｆｕまで
である。好ましくは、約１０⁶のｃｆｕから約１０⁹のｃｆｕまでが、ワクチンが
カプセル中でまたは胃での酸性ｐＨに対して弱毒化された細菌を保護するための
緩衝液中に再懸濁されて与えられる経口投与に使用される；または、約１０²の
ｃｆｕから約１０⁷のｃｆｕまでが、細菌が錠剤またはエアゾールで与えられる
鼻腔内投与のために使用される。

【００８７】 使用される特定の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、本発明につい
ては重要ではなく、そして当該分野では従来のものである。希釈剤の例として、
以下が挙げられる：胃の胃酸に対して緩衝化するための緩衝液（例えば、スクロ
ースを含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）の
み（Ｌｅｖｉｎｅら、（１９８７ｂ）、前出；およびＢｌａｃｋら、前出）、ま
たはアスコルビン酸、ラクトース、および必要に応じてアスパルテームを含有す
る重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ，ＩＩ：４６７
−４７０（１９８８））。キャリアの例として、以下が挙げられる：タンパク質
（例えば、スキムミルク中に見出されるもの）；糖（例えば、スクロース）；ま
たはポリビニルピロリドン。

【００８８】 本発明の変異株は、３０％〜５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含有するＬｕ
ｒｉａブロス（ＤＩＦＣＯ）中に懸濁させられる場合は、−７０℃で保存され得
る。

【００８９】 以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、そして本発明の範囲を限
定するようには決して意図されない。

【００９０】 （実施例１） （ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉ株の構築） （Ａ．ΔｇｕａＢ−Ａ欠失カセットｐＪＷ１０１の構築） ｇｕａＢ遺伝子の５’末端、およびｇｕａＡ遺伝子の３’末端を含むＤＮＡセ
グメントを、鋳型としてＳ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株のゲノムＤＮＡを使用するＰ
ＣＲによって増幅し、次いで、第２のＰＣＲ反応において融合させた。それによ
って、ΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子を得た（図４）。ΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子の
構築において使用した方法は、ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ
ＣＶＤ１２０４株中のΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子の構築において記載された方法
と同様であった（Ｎｏｒｉｅｇａら、（１９９６）、前出；および１９９６年４
月９日に出願された米国特許出願番号第０８／６２９，６００号（現在は認めら
れている）（これは、本明細書中でその全体が参考として援用されている））。

【００９１】 最初のＰＣＲ反応（図４）においては、ｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子の５’末端を
増幅するために使用したプライマーは、以下のとおりであった：

【００９２】

【化１】

【００９３】 ならびに、ΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子の３’末端を増幅するために使用したプラ
イマーは、以下のとおりであった：

【００９４】

【化２】

【００９５】 内部プライマー（配列番号３および配列番号４）中には、染色体のΔｇｕａＢ
−Ａ対立遺伝子中への外来遺伝子の導入のために付加した、２つの特有の制限部
位（ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ）（下線）の上流に、インフレームで停止シグナ
ルコドン（ＴＧＡおよびＴＣＡ）を導入した。停止シグナルは、ΔｇｕａＢのΔ
ｇｕａＡ産物との翻訳融合、またはΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子の中央に挿入され
た外来遺伝子産物とのΔｇｕａＢ産物の翻訳融合を避ける。さらに、これらの内
部プライマーには、相同領域（太字）として作用する配列を導入した。これによ
って、５’および３’のＰＣＲ産物を、第２のＰＣＲ反応において融合させた（
従って、ΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子を形成する）（図４）。

【００９６】 第２のＰＣＲ反応においては、５’および３’セグメントを、端のプライマー
（配列番号２および５）を使用して融合させた。そして、得られた融合産物を、
同じ反応において増幅させた。この反応においては、所定の相同領域（ＡｐａＩ
−ＢａｍＨＩ）がアニーリングし、それによって５’および３’セグメントが効
率的に融合し、これはこの時点で、ＤＮＡの鎖がそれにアニーリングすることに
依存して、それら自身のプライマーおよび／またはＴａｑポリメラーゼの鋳型と
して作用し得た。この融合を促進するために、最初の１５サイクルはアニーリン
グ温度スロープ（４０℃から５０℃まで１℃／８秒、および５０℃にて２分間）
を有し、続く１５サイクルは、新しいΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子が増幅されるよ
うに５５℃のアニーリング温度を有するように、ＰＣＲ−プログラムを設計した
。従って、増幅されなかったｇｕａＢ−Ａオペロンの９００塩基対が存在し、こ
れによってΔｇｕａＢ−Ａを生じた（図４）。

【００９７】 端のプライマー（配列番号２および５）を、特有の制限部位（ＳｓｔＩおよび
ＸｂａＩ）（下線）を導入するように設計した。これらを、温度感受性のｐＳＣ
１０１ベース（Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１
４４７−１４５７（１９９１））の自殺プラスミドｐＦＭ３０７Ａ中の特有の制
限部位中にΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子をクローニングするために使用した。これ
によって、プラスミドｐＦＭ３０７：：ΔｇｕａＢ−ＡプラスミドＦＭ３０７Ａ
（６．３Ｋｂｐ）を得た。これは、ｐＩＢ２７９（Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら、前出
）に由来するＳａｃＢ−Ｋａｎカセット（カナマイシンに対する耐性およびスク
ロースカウンター選択を提供する）を含有する３．８ＫｂｐのＢａｍＨＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメント（クレノウポリメラーゼにより平滑末端化）で、ｐＩＢ３０
７（Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら、前出）中にｃａｍ遺伝子（クロラムフェニコール耐
性）を含有する４．３ＫｂｐのＮａｅＩ−ＮａｅＩフラグメントを置換すること
によって、構築した。さらに、ΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子の中央に非抗生物質の
選択マーカーを挿入することが、以下のために利点であると考えられた： （ｉ）Ｔｙ２の完全なｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子についての、ΔｇｕａＢ−Ａの
交換を容易にする；および （ｉｉ）培地中でのワクチン株の同定を可能にする選択マーカーを提供する。

【００９８】 従って、次に、Ｒ因子Ｒ７７３の５．０Ｋｂｐのヒ素耐性（ａｒｓ）オペロン
を、ｐＵＭ１（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１：７５８−７６
３（１９８５））（Ｒｏｓｅｎ博士、Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩから懇意によって提供された）からＨｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントとして得、そしてｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中のＰ_tacプロモーターの制御下にクローン化した。
次いで、（平滑末端化した）Ｐ_tac−ａｒｓ ＮａｅＩ−ＤｒａＩセグメントを
得、そしてｐＦＭ３０７：：ΔｇｕａＢ−Ａ中のΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子のＡ
ｐａＩ部位（Ｔ４ポリメラーゼによって平滑末端化した）中にクローン化して、
ｐＪＷ１０１を得た（図４）。

【００９９】 （Ｂ．自殺欠失カセットによって駆動される変異） ｐＪＷ１０１を、６．０μＭの亜ヒ酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ）が手順を通じ
て培地中に存在したことを除いて、Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら、前出；Ｎｏｒｉｅｇ
ａら（１９９５）、前出、およびＮｏｒｉｅｇａら（１９９６）、前出によって
記載されるように、相同組換えによって野生型のＳ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株中に
ΔｇｕａＢ−Ａ：：Ｐ_tac−ａｒｓ対立遺伝子を導入するために使用した。

【０１００】 （Ｃ．ＤＮＡプローブおよびＰＣＲによる変異株のスクリーニング） 候補の細菌クローンを、６．０μＭの亜ヒ酸ナトリウムを補充したＬｕｒｉａ
寒天プレート上の格子パターン中で、または最少培地中で、一晩３７℃にて増殖
させた。次いで、亜ヒ酸を補充したＬ寒天上では増殖しているが、最少培地中で
は増殖していないコロニーを、Ｎｏ．５４１フィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａ
ｎ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に移し、そしてＧｉｃｑｕｅｌａｉ
ｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２４８５−２４９０（１９
９０）によって記載されているようにブロットし、そしてγＰ³²−標識した４０
ｂｐの以下のオリゴヌクレオチドを使用してプローブした： ５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＴＡＴＧＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＧ
ＣＴＧＴＧＧＴ−３’（配列番号６）。このオリゴヌクレオチドは、ｇｕａＢ−
Ａ野生型対立遺伝子の欠失させられた部分に対応する（ネガティブなプローブ）
。γＰ³²−標識した４０ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし
なかったクローンを選択した。ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉクローンは、１
０ｍｇのグアニン／ｌを補充しない限りは、最少倍地中では増殖し得なかった。

【０１０１】 ｇｕａＢ−Ａオペロン中の欠失変異およびΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子中のＰ_{ta c} −ａｒｓ挿入物を、Ｐ³²−標識したΔｇｕａＢ−Ａオペオン、ａｒｓオペロン
、および上記のｇｕａＢ−Ａネガティブプローブを用いるサザンブロットハイブ
リダイゼーションによって確認した。１つのΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉク
ローンを任意に選択し、そしてＣＶＤ９１５と命名した。ＣＶＤ９１５株を、Ａ
ＴＣＣ登録番号第２０２１１５号のもとで、１９９８年５月４日にアメリカンタ
イプカルチャーコレクションに寄託した。

【０１０２】 ＣＶＤ９１５株は、培地中に６．０μＭの亜ヒ酸ナトリウムを加えて慣用的に
増殖させられるが、Ｔｙ２株を用いた場合、または試験したＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、もしくはＥ．ｃｏｌｉの任意の他の株を用いた場合は、
この亜ヒ酸濃度では増殖は得られない。

【０１０３】 （実施例２） （組織培養物中での侵入および細胞内増殖） 侵入および細胞内増殖を、ゲンタマイシン防御アッセイを使用してアッセイし
た。アッセイは、Ｔａｒｔｅｒａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１：３０
８４−３０８９（１９９３）によって以前に記載された方法にわずかな改変を用
いて行った。簡潔には、２４ウェルプレート上のセミコンフルエントなＨｅｎｌ
ｅ４０７細胞の単層を、野生型Ｔｙ２株；ΔｇｕａＢ−Ａ ＣＶＤ９１５株；Δ
ａｒｏＣ、ΔａｒｏＤ ＣＶＤ９０８株、またはΔａｒｏＣ、ΔａｒｏＤ、Δｈ
ｔｒ ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡのいずれかを用いて、５０：１の比で９０分間
、三連のウェルで感染させ、その後、細胞外の生物体を、１００μｇ／ｍｌのゲ
ンタマイシンを用いて３０分間で死滅させ、洗浄（０時間の時点）し、そしてそ
の後、２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとともにインキュベートした。その後の
、０時間、４時間、および２２時間で、三連で感染させた組織培養単層を、滅菌
水を用いて溶解させ、そしてその懸濁物の段階希釈物を、３７℃にて一晩、１リ
ットル当たり１０μｇのグアニンを補充したＬＢ寒天上で培養した。結果を、以
下の表２に示す。

【０１０４】

【表２】

【０１０５】 上記の表２に示すように、ＣＶＤ９１５株は、野生型のＴｙ２株によって示さ
れるよりも有意に低く、そしてＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ株によって示されるもの
に匹敵する、侵入能力および細胞内増殖を有した。すなわち、上記の表２に示す
ように、２つの異なる実験において、野生型のＳ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株は、Ｈ
ｅｎｌｅ ４０７細胞に効率よく侵入し、そして２２時間の期間で１３倍以上に
それらを複製した。ΔａｒｏＣ、ΔａｒｏＤ ＣＶＤ９０８株は、一貫してより
少ない（すなわち、２２時間で６倍）細胞内産生を有した。上記の表２に示すよ
うに、また、変異株ΔｇｕａＢ−Ａ ＣＶＤ９１５株は、その野生型の親株また
はＣＶＤ９０８株およびＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ株よりもＨｅｎｌｅ細胞に対し
て明らかに侵入性が低かった。そしてその細胞内増殖（すなわち、０倍）は、Ｃ
ＶＤ９０８−ｈｔｒＡ変異株のものと同等であった。

【０１０６】 （実施例３） （ワクチン候補のＴｙ２１Ａ株、ＣＶＤ９０８株、およびＣＶＤ９１５株の比
較安全性） ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１５株の弱毒化を、野生型のＴｙ
２株、および他の弱毒化された株について、マウスのブタ−ムチンアッセイを使
用して確認した（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｓｔａｎｄａｒ．，８：
７９−８５（１９８０））。簡潔には、マウスを、０．５ｍｌの１０％（ｗ／ｖ
）のブタムチン中に懸濁した異なる株の種々の１０倍希釈物を用いて腹腔内接種
した。続いて、マウスを、接種の７２時間後までに起こる死亡率について追跡し
た。そしてそれらの直線回帰の分析によって、異なる群のＬＤ₅₀を計算した。結
果を、以下の表３に示す。

【０１０７】

【表３】

【０１０８】 上記の表３に示すように、ＣＶＤ９１５株は、野生型Ｔｙ２株を用いて得られ
るものを５対数以上上回り、そしてΔａｒｏＣ、ΔａｒｏＤ ＣＶＤ９０８変異
株株によって得られるものと、化学的に変異誘発された非侵入性のＴｙ２１ａ株
によって得られるものとの間である、概算されたＬＤ₅₀を有した。

【０１０９】 （実施例４） （外来タンパク質の送達のための生ベクターとしてのＣＶＤ９１５株の使用、
および真核生物細胞中の外来抗原を発現するためのＤＮＡワクチンプラスミド） 破傷風毒素のフラグメントＣ（ＴＴのフラグメントＣ）を保有している遺伝子
操作されたＳ．ｔｙｐｈｉ（ＣＶＤ９０８）のΔａｒｏＣ株、ΔａｒｏＤ株での
鼻腔内免疫のマウスモデルが、Ｇａｌｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：７００−
７０８（１９９７）に記載されている。このモデルにおいてアッセイした構築物
は、ｎｉｒＢまたは強力な構成的プロモーターであるｌｐｐに由来する嫌気的に
活性化される原核生物プロモーターの制御下で融合されていないＴＴのフラグメ
ントＣをコードするＣＶＤ９０８保有プラスミドを含んだ。以下のことを観察し
た： （ｉ）これらの構築物を用いるマウスの鼻腔内免疫によって、高力価の中和抗
ＴＴ血清ＩｇＧ抗体を得た； （ｉｉ）免疫したマウスは、コントロールマウスの全てを死滅させた致死用量
の１５０％のＴＴを用いたチャレンジに対して防御された；ならびに （ｉｉｉ）免疫の６週間後に鼻腔内免疫したマウスの脾臓および頚部の局所性
リンパ節から得た細胞は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ（Ｈｄ鞭毛およびフェノールで不活化
した全細胞Ｓ．ｔｙｐｈｉ粒子）に応答して、ならびにＴＴのフラグメントＣお
よびＴＴ抗原に応答して、有意な増殖応答を示した。

【０１１０】 これらの研究は、原核生物プロモーターまたは真核生物プロモーターの制御下
、で外来抗原（すなわち、ＴＴのフラグメントＣ）をコードする遺伝子を含有す
るプラスミドを保有しているＳ．ｔｙｐｈｉの新規の弱毒化された株の、マウス
における免疫原性の研究によって以下に広げられている。

【０１１１】 （Ａ．ＴＴのフラグメントＣをコードする原核生物および真核生物発現ベクタ
ーを保有しているＳ．ｔｙｐｈｉの弱毒化された株での免疫によって誘発される
、免疫学的応答） 免疫応答がプラスミドＤＮＡでの直接的な免疫によって誘発され得るという観
察（Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５−１７４９（１９９３）
）に従って、外来抗原をコードするいくつかの核酸ベクターが、ワクチンとして
評価されている。ＤＮＡワクチン接種は、多くのウイルス抗原（インフルエンザ
ＡウイルスのＮＰを含む）をコードするプラスミドを使用する、高レベルの体液
性免疫応答および細胞によって媒介される免疫応答の両方を誘発することが、示
されている（Ｕｌｍｅｒら、前出）。この初期の観察から、外来抗原をコードす
るいくつかの核酸ベクターが、ワクチンとして評価されている。特に、ＤＮＡワ
クチン接種は、インフルエンザウイルス抗原を使用して非常に広範に研究されて
いる。防御免疫応答が、インフルエンザウイルス抗原をコードする真核生物発現
ベクターでの筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫または表皮（遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ
））免疫後に、マウスにおいて（Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９０：１１４７８−１１４８２（１９９３ａ）；Ｊｕｓｔ
ｗｉｃｚら、（１９９５）、前出；およびＪｕｓｔｅｗｉｃｚら、Ｖｉｒｏｌ．
，２２４：１０−１７（１９９６））、クロアシイタチ（ｆｅｒｒｅｔ）におい
て（Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１２：１４９５−１４９８（１９９４
））、ニワトリにおいて（Ｆｙｎａｎら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２
：７８５−７８９（１９９３ｂ）；およびＦｙｎａｎら、（１９９３ａ）、前出
）、ならびに非ヒト霊長類において（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，
１：５８３−５８７（１９９５））誘導されている。他のウイルス（Ｃｏｘら、
前出；Ｄａｖｉｓら、（１９９６ａ）、前出；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、前出；Ｌａ
ｇｇｉｎｇら、前出；Ｗａｎｇら、Ｖｉｒｏｌ．，２２１：１０２−１１２（１
９９５）；およびＺａｒｏｚｉｎｓｋｉら、前出）；寄生生物（Ｄｏｏｌａｎら
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：１７３９−１７４６（１９９６）；Ｇａｒｄ
ｎｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５：１２９４−１３００（１９９６）
；Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１２：１５２９−１５３３（１９９４）
；Ｓｅｄｅｇａｈら、前出；およびＹａｎｇら、前出）；細菌（Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４：３１６８−３１７３（１９９６）；
Ｂａｒｒｙら、前出；Ｈｕｙｇｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：８９３−８９８
（１９９６）；Ｌｕｋｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７５：９１−９７
（１９９７）；およびＴａｓｃｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：８８８−８９２
（１９９６））；ならびに腫瘍細胞（Ｃｏｎｒｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，
５４：１１６４−１１６８（１９９４）；Ｃｏｎｒｙら、（１９９５）、前出；
およびＷａｎｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６：４０７−４１
８（１９９５））に由来するいくつかの他の抗原に対する免疫応答もまた、種々
の動物モデルにおいてＤＮＡワクチン接種によって誘導されている。これらの研
究は、ＤＮＡワクチンによって誘発される免疫応答の性質の理解を増大させた。
例えば、強力な抗体応答が、この抗原をコードするプラスミドでの単回のｉ．ｍ
．（筋肉内）免疫後にＢ型肝炎の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対して、マウス中で
誘発されている（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２：１８４７
−１８５１（１９９３）；およびＭｉｃｈｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：５３０７−５３１１（１９９５））。これ
らの研究においては、ピークのＩｇＧ力価は、免疫後の４〜８週間で観察された
。これは、６ヶ月の間、高レベルで維持された。この抗原をコードするＤＮＡワ
クチンもまた、精製されたＨＢｓＡｇに対して応答性ではないマウスにおいて抗
体およびＭＨＣクラス１制限ＣＴＬ応答を誘発することにおいて有効であること
が示されている（Ｄａｖｉｓら、（１９９６ｂ）、前出；およびＳｃｈｉｒｍｂ
ｅｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：５９２９−５９３４（１９９５））。従っ
て、少なくともＨＢｓＡｇの場合においては、ＤＮＡワクチン接種は、マウスに
おける遺伝的な制限を克服し、そして精製されたタンパク質での非経口的な免疫
よりもより持続的な免疫応答を誘導することが、示されている。

【０１１２】 破傷風毒素（ＴＴ）は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉによって合成
される強力な神経毒である。ヒトおよび動物における破傷風に対する防御免疫性
は、血清中のＴＴ中和抗体の力価と相関する（Ｂｉｚｚｉｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ Ｔｅｔａｎｉ、Ｇｙｌｅｓら（編）、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｅｓ，ＩＡ、９７−１０５頁（１９９３）；
およびＨａｂｉｇら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ
，Ｃｒｙｚ（編）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１３−１９頁（１９
９１））。従って、破傷風に対する良好な防御が、不活化させられたＴＴまたは
非毒性の誘導体での非経口的な免疫によって誘導され得る。このようなワクチン
調製物の能力の測定は、十分に確立された手順であり、そして欧州および英国の
薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｎｄ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｍａｃｏｐｏｅｉ
ａｓ）（Ｃｏｓｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ，３４５：９４９−９５２（１９９５）
；およびＳａｎｃｈｅｚら、Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙ
ｇ．，８９：５４２−５４５（１９９５））に記載されている。抗破傷風抗体の
レベルは、マウスにおける毒素中和アッセイによって伝統的に決定される。最近
は、敏感なＥＬＩＳＡアッセイが開発されている。これは、あまり時間がかから
ず、そしてあまり高価ではないが、毒素中和試験と十分に相関する（Ｍａｎｇｈ
ｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６８：１７−２４（１９９４）
；およびＭｅｌｖｉｌｌｅ−Ｓｍｉｔｈ、ＤｉｐｔｈｅｒｉａおよびＴｅｔａｎ
ｕｓ Ａｎｔｉｔｏｘｉｎｓ，Ｗｒｅｇｈｉｔｔら（編）、ＥＬＩＳＡ ｉｎ
ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｌｏ
ｎｄｏｎ、１３６−１４７頁（１９９０））。血清中の抗毒素抗体の力価は、通
常は、国際的な標準の抗ＴＴ血清（ＷＨＯ）との比較によって、ＩＵ／ｍｌ（こ
こで、ヒトの血清中の０．１ＩＵ／ｍｌは、ＴＴチャレンジに対する防御のため
に十分である）において決定される。従って、ワクチンの効力（ＩＵ／ｍｌで表
される）は、異なるＴＴワクチン調製物について比較され得る。現在では、破傷
風に対するワクチン調製物が、Ｃ．ｔｅｔａｎｉに由来するＴＴのホルムアルデ
ヒド不活化によって産生され、これは時間を必要とし、そして技術的に骨の折れ
る手順である。これは、ワクチンとしてのＴＴの代替の脱毒素化された調製物に
ついての研究を促した。

【０１１３】 ＴＴは、１００ｋＤａの重（Ｈ）鎖にジスルフィド結合した５０ｋＤａの軽（
Ｌ）鎖を含有する１５０ｋＤａのタンパク質からなる（Ｈｅｌｔｉｎｇら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：１８７−１９３（１９７７ａ）；およびＮｉｅ
ｍａｎｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ａｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，Ａｌｏｕｆ編、Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１））。このタンパク質の毒性の活性は、Ｌ鎖、
ジンク依存性プロテアーゼ中にある（Ｓｃｈｉａｖｏら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１１
：３５７７−３５８３（１９９２））。これは、シナプトブレビンのタンパク質
分解によるニューロンからのインヒビターの放出のブロックを媒介すると考えら
れている（Ｓｃｈｉａｖｏら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３５９：８３２
−８３５（１９９２））。Ｈ鎖は、シナプス前膜で毒素に結合し、その取りこみ
を開始すると考えられている（Ｈｅｌｔｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２５２：１９４−１９７（１９７７ｂ）；およびＭｏｒｒｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２５５：６０７１−６０７６（１９８０））。パパインでの毒素
分子の消化によって、Ｈ鎖のＣ末端に対応する５０ｋＤａのポリペプチドおよび
１００ｋＤａの分子を生じるＨ鎖のＮ末端に連結されたＬ鎖に対応する（Ｈｅｌ
ｔｉｎｇら、（１９９７ａ）、前出）。５０ｋＤａのポリペプチド（ＴＴフラグ
メントＣ（ＦＣ）と呼ばれる）は非毒性であるが、ガングリオシド（Ｈａｌｐｅ
ｒｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１００４−１００９（１９９０）
；およびＭｏｒｒｉｓら、（１９８０）、前出）およびタンパク質結合活性を有
する（Ｓｃｈｉａｖｏら、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．、２９０：２２７−２３０（１
９９１））。初期の研究においては、天然の毒素のタンパク質分解によって誘導
されるＦｃでの動物のワクチン接種が、ＴＴでの続く致死チャレンジに対してそ
れらを防御することが示された（Ｈｅｌｔｉｎｇら、（１９７７ａ）前出。さら
に、モノクローナル抗体を用いた研究は、中和エピトープがこの分子内に存在す
ることを実証した（Ｋｅｎｉｍｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４２：９
４２−９４８（１９８３））。従って、ＦＣは、代替のＴＴワクチンの産生のた
めの良好な候補分子として同定された。

【０１１４】 最近のデータは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー領域（ｐｃＤＮＡ３／ｔ
ｅｔＣ）の制御下にＴＴのフラグメントＣをコードするプラスミドでの筋肉内免
疫が、高い抗フラグメントＣ血清抗体力価、増殖応答、およびインナーフェロン
−γの産生を誘発したことを示した。さらに、これらのマウスが、ＴＴでの致死
チャレンジに対して防御されたことが示された（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、前出）。

【０１１５】 ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔの免疫原性および防御能力が最適化され得るかどうかを
さらに調べるための努力において、Ｓ．ｔｙｐｈｉの弱毒化された株によって宿
主にこの構築物を送達するための一連の研究を開始した。このアプローチは、細
菌および他の感染性の疾患に対するＤＮＡ媒介ワクチンについての新たな送達系
を提供する可能性を有する。

【０１１６】 これらの研究の記載（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣの構築を含む）を、以下に示す
。

【０１１７】 （１．ＴＴのフラグメントＣをコードする遺伝子） ＴＴをコードする遺伝子の配列は、当該分野で記載されている（Ｅｉｓｅｌら
、ＥＭＢＯ Ｊ．，５：２４９５−２５０２（１９８６）；Ｆａｉｒｗｅａｔｈ
ｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：２１−２７（１９８６）；および
Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：７
８０９−７８１２（１９８６））。Ｐ_tacの制御下で天然のフラグメントＣ配列
をコードするプラスミドベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で低いレベル（３−４％の
ｔｃｐ）でＦＣを発現することが、以前に示された（Ｍａｋｏｆｆら、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１０４３−１０４６（１９８９））。発現レベルを
増大させるために、天然のフラグメントＣ遺伝子（これは、Ａ−Ｔリッチである
）のコドン使用頻度を、Ｅ．ｃｏｌｉについて最適化した。得られた９９％の合
成のフラグメントＣ遺伝子（ｔｅｔＣ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でより高いレベル（
１１−１４％のｔｃｐ）での発現を指向した（Ｍａｋｏｆｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：１０１９１−１０２０２（１９８９））。この
ことは、ワクチン接種のための大量のフラグメントＣを産生する手段としての他
の発現系の研究を促した。酵母細胞から精製された組換えフラグメントＣの調製
（Ｃｌａｒｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）、９：４５５−４６
０（１９９１）；およびＲｏｍａｎｏｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１９：１４６１−１４６７（１９９１））、および培養された昆虫細胞（
Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：１６２７−１６３２（
１９９１））もまた、現在、非経口的な免疫後に破傷風毒素に対する防御的な免
疫応答を誘導することが示されている。興味深いことに、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる
場合と同様に、フラグメントＣをコードする天然のＣ．ｔｅｔａｎｉ遺伝子は、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中では発現され得なかった
のに対して、ｐＴＥＴｔａｃ１１５に由来するコドン最適化遺伝子は、この生物
体によって発現された。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現についてコドンが最適
化されている合成のフラグメントＣ遺伝子は、真核生物中での発現について偶然
に最適化されているようである。

【０１１８】 （２．ｐＴＥＴｎｉｒ１５の構築） インビボでの外来抗原の構成的な高い発現レベルは、抗原をコードするプラス
ミドの欠失を生じ得、これは、免疫系に対して抗原を送達するキャリア株の能力
を損なう。結果として、いくつかのアプローチが、インビボでのプラスミドの安
定性を維持するために使用されている。１つのこのようなアプローチは、ｎｉｒ
Ｂプロモーターのようなインビボで誘導性であるプロモーターの使用である。こ
のプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で最初に定義され、ここでこのプロモーター
は、ＮＡＤＨ依存性の硝酸レダクターゼ遺伝子であるｎｉｒＢを含むオペロンの
発現を制御する。これは、硝酸によって調節され、そして環境の酸素圧力におい
て変化し、嫌気条件下でピーク活性を達成する。制限された酸素利用率の雰囲気
下で細菌細胞が増殖する場合に誘導されるか、またはインビトロで真核生物細胞
に侵入する、ｎｉｒＢプロモーターの改変されたバージョンが、構築されている
。相同なＣｏｌ−Ｅ１に基づくプラスミド（これは、ｎｉｒＢおよびｔａｃプロ
モーターからそれぞれフラグメントＣを発現する）が、構築されている。これら
の株は、経口免疫後のＴＴでのチャレンジに対して防御を誘導することが示され
た。しかし、完全な防御を確実にするために、２用量のｔａｃに基づく株が必要
とされたのに対し、たった１用量の、ｎｉｒＢプロモーターを使用してフラグメ
ントＣを発現する株のみが、必要とされた。従って、ｎｉｒＢ構築物は、ｔａｃ
構築物よりもインビボにおいてより持続的でありそして安定であることが、証明
された（Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：８８８（
１９９２ｂ））。

【０１１９】 （３．ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣの構築） プラスミドｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣの構築および特徴付けを、Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎら、前出（これは、その全体が本明細書中で参考として援用されている）によ
って記載されているように行った（図５を参照のこと）。

【０１２０】 （４．ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣまたはｐＴＥＴｎｉｒ１５を保有しているＳ．
ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１５での免疫） 上記に議論するように、研究を、外来抗原（例えば、ＴＴのフラグメントＣ）
をコードする原核生物および真核生物発現ベクターを哺乳動物の免疫系に送達し
、そして防御免疫応答を誘導する、Ｓ．ｔｙｐｈｉの弱毒化された株の能力を評
価するために開始した。この系を伝統的な裸のＤＮＡ免疫と比較するために、裸
のｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣベクターによって誘発される応答をもまた、評価した
。

【０１２１】 この目的のために、ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣまたはｐＴＥＴｎｉｒ１５プラス
ミドを、ＣＶＤ９１５中にエレクトロポレーションした。精製されたプラスミド
の構造を、アガロースゲル中でプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化産物：
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでのｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ
；ならびにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでのｐＴＥＴｎｉｒ１５を分離すること
によって確認した。フラグメントＣの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブ
ロッティングによって確認した。細菌サンプルを、定常期まで増殖させ、そして
１．０ｍｌのアリコートを遠心分離によって回収し、２００μｌのＳＤＳ−サン
プル緩衝液中に再懸濁した。次いで、これらのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびウェスタンブロッティングに供した。抗プラグメントＣ ｍＡｂおよび西洋
ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスを、一次および二次抗体としてそれぞ
れ使用した。各サンプルを、およそ１．０×１０⁸のｃｆｕ／ウェルでロードし
た。

【０１２２】 両プラスミドを保有している生きたベクター（ｌｉｖｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）
（ＣＶＤ９１５）（ＣＶＤ ９１５（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ）およびＣＶＤ９
１５（ｐＴＥＴｎｉｒＢ））については鼻腔内経路を使用し、そして裸のＤＮＡ
免疫（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ）については筋肉内経路を使用した。Ｂａｌｂ／
ｃマウスを、以下の表４に示すプロトコールに従って免疫した：

【０１２３】

【表４】

【０１２４】 （５．抗体応答） 動物を、以下のスケジュールに従って眼窩の後ろの静脈から採血した： （ａ）免疫前 （ｂ）免疫の１４日後 免疫の３６日後 （ｃ）追加免疫の１４日後 追加免疫の２８日後 追加免疫の４２日後 追加免疫の５６日後（屠殺） 全てのＩｇＧ抗フラグメントＣ血清抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。簡
潔には、組換えフラグメントＣを、４．０μｇ／ｍｌの抗原でＥＬＩＳＡプレー
トをコーティングするために使用した。血清を、８個の２倍希釈物中で滴定した
。抗体レベルを、予め較正した標準血清との比較によって、国際単位（Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｔｓ）で示した。標準血清を、隔週の間隔で４回の
吸着させた破傷風トキソイドを用いてマウスを免疫することによって調製した。
血清をプールし、そして欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏ
ｅｉａ）に記載されている手順に従う、マウスにおけるインビボでの中和試験に
よって滴定した。国際的な中和単位の数を、破傷風抗毒素（Ｔｅｔａｎｕｓ Ａ
ｎｔｉｔｏｘｉｎ）の国際標準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒ
ｄ）と並行して決定した。結果を図６に示す。

【０１２５】 図６に示すように、わずかにより高いレベルの抗体が、ＣＶＤ ９１５（ｐｃ
ＤＮＡ３／ｔｅｔＣ）構築物によって誘発されるようであるが、非常に高いレベ
ルの抗フラグメントＣ血清抗体（ヒトにおいては１，０００から２，０００倍の
防御抗ＴＴ抗体レベル）が、ＣＶＤ ９１５（ｐＴＥＴｎｉｒ１５）またはＣＶ
Ｄ ９１５（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ）構築物の両方を用いる免疫および１回の
追加免疫後に観察された。２０ＩＵ／ｍｌまでの観察された抗フラグメントＣ血
清抗体レベルは、約１：５０，０００の最終希釈力価に対応した。対照的に、比
較的に中程度のレベルの抗フラグメントＣ血清抗体（ヒトにおいては約５０倍の
防御抗ＴＴレベル）が、裸のｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣで免疫したマウスにおいて
観察された。抗フラグメントＣ血清抗体レベルは、初回免疫の５０日後に最高の
レベルに到達し、そして初回免疫の９２日後（研究の最終時点）まで同じレベル
で維持された。ＣＶＤ ９１５のみで免疫したマウスにおいては、応答は観察さ
れなかった。

【０１２６】 （６．細胞によって媒介される免疫応答：増殖アッセイ） 免疫の９２日後に、単細胞懸濁物のプールを、上記の群のそれぞれにおいて生
存している５から７匹のマウスからの、頚部のリンパ節、腸間膜のリンパ節、お
よび脾臓から調製した。細胞のプールをもまた、裸のｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣを
用いて筋肉内で免疫したマウスから得た鼠径部のリンパ節から調製した。以下の
平均の細胞収量を得た： 頚部のリンパ節：６．６×１０⁶細胞／マウス 腸間膜のリンパ節：１０．１×１０⁶細胞／マウス 鼠径部のリンパ節：１．６×１０⁶細胞／マウス 脾臓：５２．５×１０⁶細胞／マウス 増殖アッセイを、完全なＲＰＭＩ培地（１０％（ｖ／ｖ）のウシの胎児の血清
、グルタミン、および抗生物質を含有するＲＰＭＩ）中に細胞を再懸濁すること
によって行い、そして抗原の非存在下または非存在下で９６ウェルの丸底プレー
ト中に三連で、２．０×１０⁵細胞／ウェルでインキュベートした。以下の可溶
性の抗原を、これらの研究において使用した：０．０２、０．２、および２．０
μｇ／ｍｌでの、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＴＴのフラグメントＣ、およ
び高度に精製されたＳ．ｔｙｐｈｉの鞭毛。３７℃にて５％のＣＯ₂での５日間
のインキュベーション後、培養物を³Ｈ−チミジンでパルスし、そして培養を、
自動的に回収することによって１８時間後に停止させた。チミジンの取りこみを
、液体シンチレーションカウンティングによって決定した。図７および図８に示
す結果を、刺激指数（Ｓ．Ｉ．）として表す。

【０１２７】 図７に示すように、ＣＶＤ ９１５（ｐＴＥＴｎｉｒ１５）およびＣＶＤ ９
１５（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ）構築物、ならびにｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ裸の
ＤＮＡワクチンを用いる免疫は、ＴＴのフラグメントＣに応答して増殖した、感
作されたリンパ球様細胞の出現を誘発した。これらの増殖応答は、頚部のリンパ
節および脾臓から単離した細胞の集団において観察されたが、腸間膜のリンパ節
から単離したものにおいては観察されなかった。特異的な増殖応答がまた、ＴＴ
に対して観察された。ＴＴのフラグメントＣに対する有意な増殖応答（＞３ Ｓ
．Ｉ．）は、ＣＶＤ ９１５またはＰＢＳを用いて免疫したマウスから単離した
細胞中では観察されなかった。

【０１２８】 図８に示すように、Ｓ．ｔｙｐｈｉの鞭毛に対する増殖応答は、ＣＶＤ ９１
５構築物、ＣＶＤ ９１５（ｐＴＥＴｎｉｒ１５）構築物およびＣＶＤ ９１５
（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ）構築物で免疫したマウスから単離した細胞の集団に
おいて観察された。また、図８に示すように、これらの応答は、ＣＶＤ ９１５
で免疫したマウスから単離された全ての集団において、ならびにＣＶＤ ９１５
（ｐＴＥＴｎｉｒ１５）構築物およびＣＶＤ ９１５（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ
）構築物で免疫したマウスに由来する頚部のリンパ節から単離したリンパ球様細
胞において観察された。相当により低い増殖応答がまた、ＣＶＤ ９１５（ｐＴ
ＥＴｎｉｒ１５）構築物およびＣＶＤ ９１５（ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ）構築
物で免疫したマウスから単離した脾臓細胞および腸間膜のリンパ節の細胞におい
て観察された。技術的困難性に起因して、ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣの裸のＤＮＡ
ワクチンで免疫したマウスの、Ｓ．ｔｙｐｈｉの鞭毛に対する増殖応答について
のデータは利用可能でない。興味深いことに、裸のｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣで筋
肉内免疫したマウスに由来する鼠径部のリンパ節から単離された細胞は、試験し
た抗原のいずれに対しても、特異的な増殖応答を示さなかった。試験したいずれ
の群においても、ＢＳＡに対する増殖応答は観察されなかった。

【０１２９】 （７．ＣＶＤ ９１５およびＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡでの鼻腔内免疫によって
誘導される、血清ＩｇＧ抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＬＰＳと血清ＩｇＧ抗Ｓ．ｔ
ｙｐｈｉの鞭毛との比較） 新規候補のワクチンベクターの評価の間に取り組む１つの重要な課題は、それ
についてすでに大量のデータが入手可能であるリーディング候補（例えば、ＣＶ
Ｄ９０８−ｈｔｒＡ）のものに対して、新規の構築物（例えば、ＣＶＤ ９１５
）によって誘発される免疫応答を比較することである。この目的に関して、１０
匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの群を、弱毒化されているＣＶＤ ９１５株またはＣＶ
Ｄ９０８−ｈｔｒＡ株のいずれかの１０¹⁰ｃｆｕを用いて、３６日の間隔を空け
て２回鼻腔内免疫した。マウスを、免疫前（０日）、および３５日目、５５日目
、および９５日目（ＣＶＤ ９１５のみ）で採血した。ＬＰＳおよび鞭毛抗原に
対する抗体を、Ｔａｃｋｅｔら（１９７７）（前出）に記載されているように、
ＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートを５．０μｇの各
抗原でコーティングし、血清サンプルを８個の２倍希釈物中で試験した。抗体力
価を、４９２ｎｍで０．５の吸光度値を生じる希釈の逆数として定義された、Ｅ
ＬＩＳＡ単位／ｍｌで示した。結果を、図９および図１０に示す。

【０１３０】 図９および図１０に示すように、同様の抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの鞭毛および
抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＬＰＳ抗体レベルが、それぞれ、両方の動物の群にお
いて誘発された。

【０１３１】 （実施例５） （Ｖｉ抗原を構成的に発現する弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉ株の構築） （Ａ．Ｖｉ抗原を構成的に発現するＳ．ｔｙｐｈｉ株（ＣＶＤ ９１６および
ＣＶＤ ９０９）の構築） Ｖｉ抗原の発現を、浸透圧による調節から構成的に変更するために、ｖｉｐＲ
のプロモーターに注目した（図１Ａ）。ｖｉｐＲ、およびｏｍｐＲ−ｅｎｖＺの
産物は、ｖｉｐＲの上流の領域に結合することによってそれらの調節作用を行う
と考えられている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、（１９９６）、前出）。これを行う
ために、本発明においては、強力なプロモーター（例えば、Ｐ_tac）でｖｉｐＲ
のプロモーターを置換することによって、ｖｉｐＲの下方調節および続くＶｉ抗
原の発現における制御を排除することを仮定した。プロモーターＰ_tacは、これ
らの生物体がｌａｑＩを欠いているので、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．にお
いて構成的である。従って、ＣＶＤ ９１５およびＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡの
構成的にＶｉ抗原を発現する誘導体を、以下の様式で構築した。

【０１３２】 第１期においては、ｖｉｐＲ中に欠失を導入し、そして並行して、選択／カウ
ンター選択マーカー（すなわち、ｓａｃＢ−ｎｅｏカセット）で、ｖｉｐＲのプ
ロモーター領域を置換した（図１Ａ）。

【０１３３】 詳細には、ｖｉｐＲの−３５プロモーター領域のすぐ上流の６０１ｂｐのセグ
メントを、以下のプライマーを使用して野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株のゲノ
ムＤＮＡから増幅した：

【０１３４】

【化３】

【０１３５】 この最初の６０１ｂｐの増幅したセグメント（セグメントＡ）を、ｐＧＥＭ−Ｔ
ベクターシステムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して
クローン化して、ｐＧＥＭ−Ｔ：：フラグメントＡを得た。このシステムは、挿
入部位に３’−Ｔ突出を有する開いたプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ）を含む。これ
は、ＰＣＲ産物の連結効率を改善する。次いで、ｐＧＥＭ−Ｔ：：セグメントＡ
を、ＳｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＢＳ：：Ｐ_tac（このプラス
ミドを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ部位中にプロモーターＰ_tacをクローニングすることによって得た）中の
Ｐ_tacのすぐ上流のＳｓｔＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐ
ＢＳ：：セグメントＡ−Ｐ_tacを得た。

【０１３６】 並行して、ｖｉｐＲの７７０ｂｐのセグメント（ｖｉｐＲの開始コドンを含む
）（セグメントＢ）を、以下のプライマーを使用して同じＴｙ２株のゲノムＤＮ
Ａから増幅した：

【０１３７】

【化４】

【０１３８】 これらのプライマーを用いて、特有の制限部位ＳｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、およびＳｍａＩをクローニングの目的のために導入した（下線）。増幅した
セグメントＢを、ｐＧＥＭ−Ｔベクターシステムキットを使用してｐＧＥＭ−Ｔ
中に最初にクローン化して、ｐＧＥＭ−Ｔ：：セグメントＢを得た。次いで、こ
のプラスミドを、ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩで消化し、そして得られたフラグメ
ントを、Ｐ_tacのすぐ下流である、ｐＢＳ：：セグメントＡ−Ｐ_tacのＥｃｏＲＶ
およびＳａｌＩ部位にクローン化した。得られたプラスミド（ｐＢＳ：：Ｐ_tac
−ｖｉｐＲと呼ぶ）は、セグメントＡ−Ｐ_tac−セグメントＢを含み、そしてｖ
ｉｐＲプロモーターの−３５、−１０、およびリボソーム結合領域を含む１６７
ｂｐの欠失を有する。しかし、ｐＢＳ：：Ｐ_tac−ｖｉｐＲの構築においては、
ｖｉｐＲプロモーターの欠失は、ｔａｃプロモーターの−３５、−１０、および
リボソーム結合領域を含有する２５７ｂｐの挿入物で効率よく置きかえられた。

【０１３９】 並行して、他のカセットを、上記のセグメントＡとセグメントＢとの間へのｓ
ａｃＢ−ｎｅｏの挿入によって構築した。最初に、フラグメントＡおよびフラグ
メントＢを、Ｎｏｒｉｅｇａら（１９９６）（前出）によって記載されるように
、鋳型として両方のフラグメント、ならびにプライマーとしてオリゴヌクレオチ
ド配列番号７および配列番号１０を使用してＰＣＲによって融合させた。得られ
た増幅されたフラグメントＡ−フラグメントＢ融合体を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター
システムキットを使用してｐＧＥＭ−Ｔ中にクローン化して、ｐＧＥＭ−Ｔ：：
フラグメントＡ−フラグメントＢを得た。次いで、ｓａｃＢ−ｎｅｏを、ｐＩＢ
７２９のＳｍａＩ消化によって得（Ｂｌｏｍｆｉｅｌｄら、前出）、そしてｐＧ
ＥＭ−Ｔ：：セグメントＡ−セグメントＢのＳｍａＩ部位に挿入した。得られた
プラスミドを、ｐＧＥＭ−Ｔ：：ｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ−ｎｅｏと命名した。こ
のプラスミドをＳｓｔＩで消化し、これによってｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ−ｎｅｏ
対立遺伝子を効率よく取りだし、次いでこれを、自殺ベクターｐＪＧ１４のＳｓ
ｔＩ部位にクローン化してｐＪＧ１４：ｖｉｐＲ：ｓａｃＢ−ｎｅｏを得た。ｐ
ＪＧ１４は、温度感受性であり、ｐＳＣ１０１の複製起点によって誘導されるク
ロラムフェニコールによって選択される自殺プラスミド（Ｇａｌｅｎら、９６ｔ
ｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆ
ｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｂｓｔｒａｃｔ，５２９−Ｈ２６０頁（１
９９６））。さらに、ＳｓｔＩで消化したｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ−ｎｅｏ対立遺
伝子を、自殺ベクターｐＫＴＮ７０１（Ｈｏｎｅら、（１９９１）、前出）のＳ
ｓｔＩ部位にクローン化して、ｐＫＴ：：ｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ−ｎｅｏを得た
。Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＤＶ ９１５株を、ｐＪＧ１４：：ｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ
−ｎｅｏでエレクトロポレーションした。並行して、Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９
０８−ｈｔｒＡ株をｐＫＴ：：ｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ−ｎｅｏでエレクトロポレ
ーションした。相同組換えを、カナマイシン耐性のクロラムフェニコール感受性
クローンの単離によって増強された二重交差変異株の選択が増強されたことを除
いて、Ｎｏｒｉｅｇａら（１９９６）（前出）によって記載されている手順を使
用して、ｐＪＧ１４：：ｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ−ｎｅｏとＳ．ｔｙｐｈｉ ＣＶ
Ｄ ９１５中のｖｉｐＲ遺伝子との間で；そしてＨｏｎｅら（１９９１）（前出
）によって記載されている手順を使用して、ｐＫＴ：：ｖｉｐＲ：：ｓａｃＢ−
ｎｅｏとＳ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡ中のｖｉｐＲ遺伝子との間
で行った。得られたＳ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ ９１５誘導体株およびＣＶＤ ９
０８−ｈｔｒＡ誘導体株は、ｖｉｐＲ対立遺伝子中での挿入／欠失に起因して、
Ｖｉ抗原を発現しなかった。

【０１４０】 第２期においては、構成的なＰ_tacプロモーターで、上記のＳ．ｔｙｐｈｉ
ＣＶＤ ９１５誘導体株およびＳ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡ誘導
体株のｖｉｐＲ遺伝子座におけるｓａｃＢ−ｎｅｏ挿入物を置換した（図１Ｂ）
。詳細には、ｐＢＳ：：Ｐ_tac−ｖｉｐＲ中のＰ_tac−ｖｉｐＲセグメントを、ｐ
ＪＧ１４のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化して、ｐＪＧ１４：：Ｐ _tac −ｖｉｐＲを得た。プラスミドｐＪＧ１４：：Ｐ_tac−ｖｉｐＲを、次いで、
ＣＶＤ ９１５誘導体株およびＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡ誘導体株中のｓａｃＢ
−ｎｅｏをＰ_tacで、上記に記載するような相同組換えによって交換するために
使用した。二重交差変異株の単離を、ｓａｃＢによって付与されたスクロースに
対する毒性、およびカナマイシン感受性に対する回復によって提供されるカウン
ター選択によって増強した。ＣＶＤ ９１５から誘導された得られた株を、ＣＶ
Ｄ ９１６と命名した。これを、ＡＴＣＣ番号２０２１１６の下で、１９９８年
５月４日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。ＣＶＤ９０８
−ｈｔｒＡから誘導された得られた株を、ＣＶＤ９０９と命名した。これを、Ａ
ＴＣＣ番号２０２１１７の下で、１９９８年５月４日にアメリカンタイプカルチ
ャーコレクションに寄託した。遺伝子型的には、両方の株におけるＰ_tacの挿入
を、ＰＣＲによって特徴付けた。このことは、適切な部位でのＰ_tacの挿入を実
証する。

【０１４１】 （Ｂ．ＣＶＤ９１６株およびＣＶＤ ９０９株によるＶｉ抗原の構成的な発現
） 表現型的に構成的な、Ｖｉ抗原の発現を、市販の抗Ｖｉ抗血清（Ｄｉｆｃｏ）
を使用して、種々の容量オスモル濃度で増殖させた細菌の凝集によって評価した
。結果を以下の表５に示す。

【０１４２】

【表５】

【０１４３】 上記の表５に示すように、野生型のＳ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株、ならびに弱毒
化されたＣＶＤ ９１５株およびＣＶＤ ９０８−ｈｔｒＡ株においては、Ｖｉ
抗原の発現は、培地の容量オスモル濃度（ＮａＣｌ濃度によって提供される）に
高度に依存する。対照的に、ＣＶＤ ９１６株およびＣＶＤ ９０９株中でのＶ
ｉ抗原の発現は強力で、構成的であり、そして容量オスモル濃度における変化に
よっては調節されない。

【０１４４】 （実施例６） （構成的に発現されたＶｉ抗原に対する免疫応答） １０匹の６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの群を、ＣＶＤ ９１５株またはＣＶＤ
９１６株のいずれかの１．０×１０¹⁰ｃｆｕを用いて鼻腔内免疫した。マウス
を、それらの免疫前および免疫の３０日後に採血し、そしてそれらの血清を、使
用するまで−２０℃で保存した。Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＬＰＳ、Ｈ（鞭毛）、および
Ｖｉ抗原に対する血清中に存在する抗体を、Ｔａｃｋｅｔら（１９９７）（前出
）に記載されているようにＥＬＩＳＡによって決定した。結果を以下の表６に示
す。

【０１４５】

【表６】

【０１４６】 上記の表６に示すように、ＣＶＤ ９１６株での免疫は、ＣＶＤ ９１５株を
用いて得られたものよりも有意に高い、Ｖｉ抗原に対する抗体レベルを誘発した
。他のＳ．ｔｙｐｈｉ抗原（ＬＰＳおよびＨ）に対する免疫応答は、両方の免疫
した群の間では同様であった。結果は、Ｖｉ抗原の構成的な発現が、他の体細胞
のＳ．ｔｙｐｈｉ抗原に対する免疫応答を妨害することなく、この抗原に対する
免疫応答を増強することを実証する。

【０１４７】 本発明は、詳細に、そしてその特定の実施態様を参照して記載されているが、
種々の変更および改変が、その精神および範囲を逸脱することなくその中で行わ
れ得ることが、当業者に明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、ｖｉａＢオペロンを示し、そしてｓａｃＢ−Ｎｅｏカセットによる
、ｖｉａＢオペロン中のｖｉｐＲの野生型の浸透圧によって調節されるプロモー
ターの交換を概略的に示す。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、ｖｉａＢオペロンを示し、そしてＶｉ抗原を構成的な発現を行うた
めの、強力な構成的なプロモーターであるＰ_tacによる、ｓａｃＢ−Ｎｅｏカセ
ット挿入物の交換を示す。

【図２】 図２は、プリンの新たな生合成経路、および芳香族代謝経路の寄与を示す。図
２においては、途中で切れている矢印は経路を示す。ここで、個々の工程は示さ
れない。酵素はそれらの遺伝子によって示される。上付き文字は、その反応に関
与する遺伝子の変異を有する選択された株を示す。示される株は以下のとおりで
ある：ａ：ｐｕｒＦ１７４１：：Ｔｎ１０ Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ ＳＬ５４３７（
ＭｃＦａｒｌａｎｄら、前出）；ｂ：ｐｕｒＧ８７６：：Ｔｎ１０ Ｓ．ｄｕｂ
ｌｉｎ ＳＬ５４３６（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、前出）；ｃ：ｐｕｒＣ８８２：
：Ｔｎ１０ Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ ＳＬ５４３５（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、前出）
；ｄ：ｐｕｒＨ８８７：：Ｔｎ１０ Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ ＳＬ２９７５（ＭｃＦ
ａｒｌａｎｄら、前出）；ｅ：ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ
ＣＶＤ １２０４およびΔｇｕａＢ−Ａ、ΔｖｉｒＧ Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ
２ａ ＣＶＤ １２０５（Ｎｏｒｉｅｇａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６
４：３０５５−３０６１（１９９６））およびΔｇｕａＢ−Ａ Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ ９１５（本発明）；ｆ：ａｒｏＤ２５：：Ｔｎ１
０ Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｙ ＳＦＬ１１４（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、（１９９
０）、前出）ＳＦＬ１２４（Ｌｉら、前出）、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ １
０７０（Ｋａｒｎｅｌｌら、（１９９５）、前出）；ｇ：ΔａｒｏＣ、Δａｒｏ
Ｄ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９０８（Ｈｏｎｅら（１９９１）、前出）；ｈ：ｈ
ｉｓＧ４６ ＤＥＬ４０７、ａｒｏＡ５５４：：Ｔｎ１０ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ ＳＬ３２６１（Ｈｏｉｓｅｔｈら、前出）；ｉ：ΔａｒｏＡ Ｓ．ｆ
ｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ＣＶＤ １２０１およびΔａｒｏＡ、ΔｖｉｒＧ ＣＶ
Ｄ １２０３（Ｎｏｒｉｅｇａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：５１６
８−５１７２（１９９５）；ならびにｊ：ΔａｒｏＡ、ΔｈｉｓＧ、ΔｐｕｒＡ
Ｓ．ｔｙｐｈｉ ５４１Ｔｙ（Ｌｅｖｉｎｅら、（１９８７ｂ）、前出）。図
２においては、略号を以下のように定義する：ＰＲＰＰ：５−ホスホリボシル−
β−１−ピロホスフェート；ＰＲＡ：５−ホスホリボシルアミン；ＧＡＲ：５’
−ホスホリボシル−１−グリシンアミド；ＦＧＡＲ：５’−ホスホリボシル−Ｎ
−ホルミルグリシンアミド；ＦＧＡＭ：５’−ホスホリボシル−Ｎ−ホルミルグ
リシンアミジン；ＡＩＲ：５’−ホスホリボシル−５−アミノイミダゾール；Ｃ
ＡＩＲ：５’−ホスホリボシル−５−アミノイミダゾール−４−カルボン酸；Ｓ
ＡＩＣＡＲ：５’−ホスホリボシル−４−（Ｎ−スクシノカルボキサミド）−５
−アミノイミダゾール；ＡＩＣＡＲ：５’−ホスホリボシル−４−カルボキサミ
ド−５−アミノイミダゾール；ＦＡＩＣＡＲ：５’−ホスホリボシル−４−カル
ボキサミド−５−ホルムアミドイミダゾール；ＩＭＰ：イノシン酸；Ｈｘ：ヒポ
キサンチン；Ｇ：グアニン；およびＡ：アデニン。

【図３】 図３Ａ〜３Ｇは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのｇｕａＡ遺伝子および
ｇｕａＢ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号１）（ＧｅｎＢａｎｋ
登録番号第Ｍ１０１０１−Ｍ１０１０２）（Ｔｈｏｍａｓら、Ｇｅｎｅ、３６：
４５−５３（１９８５）；Ｔｉｅｄｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６０：８６７６−８６７９（１９８５）；およびＴｉｅｄｅｍａｎら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：１３０３−１３１６（１９８５））。こ
れは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．のｇｕａＡおよびｇｕａＢと高度に相同
であると考えられ、そしていくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位が、本発明の
欠失変異株を作成することにおいて有用である。

【図４】 図４は、ｇｕａＢ−Ａオペロンの方向、および本発明の欠失変異株を作成する
ことにおいて有用であるいくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位の位置；ＰＣＲ
によって増幅されたｇｕａＢ−Ａオペロンのセグメント；そしてΔｇｕａＢ−Ａ
対立遺伝子を構成するｇｕａＢ−ＡオペロンセグメントのＰＣＲによる融合を模
式的に示す。また、ΔｇｕａＢ−Ａ対立遺伝子の中央部のアルセナイトオペロン
（ａｒｓ）のクローニングが示され、これによってΔｇｕａＢ−Ａ：：Ｐ_tac−
ａｒｓカセットが得られる。この欠失カセットは続いて、自殺プラスミド中にク
ローン化され、そしてＳ．ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２株中の野生型のｇｕａＢ−Ａ対立
遺伝子を交換し、ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１５株を得た。

【図５】 図５は、ｐｃＤＮＡ３／ｔｅｔＣ（ヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーターの制御下の破傷風毒素フラグメントＣをコードするＤＮＡワクチン）
の構築の模式図である。

【図６】 図６は、破傷風毒素のフラグメントＣを発現するか、または破傷風毒素のフラ
グメントＣをコードする真核生物発現カセットを保有している、ΔｇｕａＢ−Ａ
ＣＶＤ９１５株での鼻腔内免疫後の、マウス中での抗フラグメントＣ抗体応答
を示す。

【図７】 図７は、ΔｇｕａＢ−Ａ ＣＶＤ９１５株のみでの、またはベクターとして、
破傷風毒素のフラグメントＣを発現するかもしくは破傷風毒素のフラグメントＣ
をコードする真核生物発現カセットを保有しているΔｇｕａＢ−Ａ ＣＶＤ９１
５株での、鼻腔内免疫後の、破傷風毒素のフラグメントＣに対するマウスのリン
パ球増殖応答を示す。

【図８】 図８は、ΔｇｕａＢ−Ａ ＣＶＤ９１５株のみでの、またはベクターとして、
破傷風毒素のフラグメントＣを発現するかもしくは破傷風毒素のフラグメントＣ
をコードする真核生物発現カセットを保有しているΔｇｕａＢ−Ａ ＣＶＤ９１
５株での、鼻腔内免疫後の、Ｓ．ｔｙｐｈｉの鞭毛に対するマウスのリンパ球増
殖応答を示す。

【図９】 図９は、ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１５株、またはΔａｒｏ
Ｃ、ΔａｒｏＤ、ΔｈｔｒＡ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＤＶ９０８−ｈｔｒＡ株での
鼻腔内免疫後の、マウスにおける抗Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛抗体応答を示す。

【図１０】 図１０は、ΔｇｕａＢ−Ａ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１５株、またはΔａｒ
ｏＣ、ΔａｒｏＤ、ΔｈｔｒＡ Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＣＤＶ９０８−ｈｔｒＡ株で
の鼻腔内免疫後の、マウスにおける抗Ｓ．ｔｙｐｈｉ ＬＰＳ抗体応答を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） Ｃ１２Ｒ 1:42） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ズテイン， マーセロ アメリカ合衆国 メリーランド 21044， コロンビア， ミドルウォーター コー ト 6023 (72)発明者 レビン， マイロン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 21044， コロンビア， ウィンドミル レーン 5209 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 DA05 FA02 GA19 GA25 4B065 AA46X AB01 AC14 BA02 BA14 BA16 CA45 4C084 AA13 NA14 ZB322 4C085 AA03 BA24 CC07 EE05

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株であって、ここで
   、該変異株は、Ｖｉ抗原を構成的に発現し、そしてここで該変異株において、ｖ
   ｉｐＲプロモーターは、ｖｉａＢの構成的な発現を生じるように、構成的なプロ
   モーターによって置きかえられている、弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異
   株。
2. 【請求項２】 前記変異株が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ変異株で
   ある、請求項１に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
3. 【請求項３】 前記変異株において、ｖｉｐＲプロモーターが、ｖｉａＢの
   構成的な発現を生じるように、Ｐ_tac、Ｐ_trc、Ｐ_Olac、およびＰ_lppからなる群
   より選択されるプロモーターによって置きかえられている、請求項１または請求
   項２に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
4. 【請求項４】 前記変異株が、ｇｕａＢ−Ａオペロン中での変異に起因して
   、新たなグアニンヌクレオチドを形成することができない、請求項１または請求
   項２に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
5. 【請求項５】 前記ｇｕａＢ−Ａオペロン中の変異が欠失変異であり、そし
   て該欠失変異がｇｕａＡ遺伝子中、ｇｕａＢ遺伝子中、またはｇｕａＡ遺伝子お
   よびｇｕａＢ遺伝子の両方中に存在する、請求項４に記載の弱毒化されたＳａｌ
   ｍｏｎｅｌｌａ変異株。
6. 【請求項６】 前記欠失変異が、ｇｕａＡ遺伝子およびｇｕａＢ遺伝子の両
   方中に存在する、請求項５に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
7. 【請求項７】 前記変異株が、ａｒｏ^-表現型を有する、請求項６に記載の
   弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
8. 【請求項８】 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ変異株が、親のＳａ
   ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１５株（ＡＴＣＣ番号２０２１１５）
   に由来する、請求項２に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
9. 【請求項９】 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
   ＣＶＤ９１６株（ＡＴＣＣ番号２０２１１６）であるか、またはＳａｌｍｏｎ
   ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９０９（ＡＴＣＣ番号２０２１１７）である、請
   求項１に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
10. 【請求項１０】 前記変異株が、外来抗原をコードし、そして発現する、請
    求項１に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異株。
11. 【請求項１１】 前記変異株が外来抗原をコードし、そして真核生物細胞中
    で発現するプラスミドを含有する、請求項１に記載の弱毒化されたＳａｌｍｏｎ
    ｅｌｌａ変異株。
12. 【請求項１２】 以下を含有する、腸チフスに対するワクチン： （Ａ）薬学的有効量の弱毒化されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ変異株
    であって、ここで、該変異株は、Ｖｉ抗原を構成的に発現し、そしてここで該変
    異株において、ｖｉｐＲプロモーターは、ｖｉａＢの構成的な発現を生じるよう
    に、構成的なプロモーターによって置きかえられている；および （Ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。
13. 【請求項１３】 前記変異株において、ｖｉａＢの構成的な発現を生じるよ
    うに、ｖｉｐＲプロモーターが、Ｐ_tac、Ｐ_trc、Ｐ_Olac、およびＰ_lppからなる
    群より選択されるプロモーターによって置きかえられている、請求項１２に記載
    のワクチン。
14. 【請求項１４】 前記変異株が、ｇｕａＢ−Ａオペロン中での変異に起因し
    て、新たなグアニンヌクレオチドを形成することができない、請求項１２または
    請求項１３に記載のワクチン。
15. 【請求項１５】 前記ｇｕａＢ−Ａオペロン中の変異が欠失変異であり、そ
    して該欠失変異がｇｕａＡ遺伝子中、ｇｕａＢ遺伝子中、またはｇｕａＡ遺伝子
    およびｇｕａＢ遺伝子の両方中に存在する、請求項１４に記載のワクチン。
16. 【請求項１６】 前記欠失変異が、ｇｕａＡ遺伝子およびｇｕａＢ遺伝子の
    両方中に存在する、請求項１５に記載のワクチン。
17. 【請求項１７】 前記変異株が、ａｒｏ^-表現型を有する、請求項１６に記
    載のワクチン。
18. 【請求項１８】 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ変異株が、親のＳ
    ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１５株（ＡＴＣＣ番号２０２１１５
    ）に由来する、請求項１２に記載のワクチン。
19. 【請求項１９】 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ変異株が、Ｓａｌ
    ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９１６株（ＡＴＣＣ番号２０２１１６）で
    あるか、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ＣＶＤ９０９（ＡＴＣＣ番
    号２０２１１７）である、請求項１２に記載のワクチン。
20. 【請求項２０】 前記変異株が、外来抗原をコードし、そして発現する、請
    求項１２に記載のワクチン。
21. 【請求項２１】 前記変異株が外来抗原をコードし、そして真核生物細胞中
    で発現するプラスミドを含有する、請求項１２に記載のワクチン。
22. 【請求項２２】 前記薬学的有効量が、約１０²ｃｆｕから１０¹⁰ｃｆｕま
    でである、請求項１２に記載のワクチン。
23. 【請求項２３】 前記薬学的有効量が、約１０⁶ｃｆｕから１０⁹ｃｆｕまで
    である、請求項２２に記載のワクチン。