PL192378B1 - Atenuowane mutanty Salmonella i szczepionka przeciw durowi brzusznemu - Google Patents
Atenuowane mutanty Salmonella i szczepionka przeciw durowi brzusznemuInfo
- Publication number
- PL192378B1 PL192378B1 PL344593A PL34459399A PL192378B1 PL 192378 B1 PL192378 B1 PL 192378B1 PL 344593 A PL344593 A PL 344593A PL 34459399 A PL34459399 A PL 34459399A PL 192378 B1 PL192378 B1 PL 192378B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mutant
- cvd
- supra
- typhi
- salmonella
- Prior art date
Links
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title claims abstract description 61
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 122
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 120
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims abstract description 111
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 94
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 42
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 44
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 44
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 43
- 101150114741 guaA gene Proteins 0.000 claims description 32
- 101150035744 guaB gene Proteins 0.000 claims description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 101150085008 guaAB gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101150093309 guaAA gene Proteins 0.000 claims description 17
- 101100126053 Dictyostelium discoideum impdh gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101100029763 Rattus norvegicus Inpp5j gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 53
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 53
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 40
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 38
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 30
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 101100206300 Escherichia coli tetC gene Proteins 0.000 description 24
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 23
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 18
- 230000004044 response Effects 0.000 description 16
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 13
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 13
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 12
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 101150044129 nirB gene Proteins 0.000 description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100404144 Bacillus subtilis (strain 168) nasD gene Proteins 0.000 description 6
- 241000392514 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin Species 0.000 description 6
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 101150007310 htrA gene Proteins 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 6
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 6
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 6
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 5
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 5
- 241000147000 Shigella flexneri 2a Species 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 5
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 5
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 5
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- VDXLUNDMVKSKHO-XVFCMESISA-N 5'-phosphoribosyl-n-formylglycinamide Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](NC(=O)CNC=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O VDXLUNDMVKSKHO-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 4
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 4
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 4
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 4
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 4
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 101150002054 galE gene Proteins 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 101150028857 phoP gene Proteins 0.000 description 4
- 101150086617 phoQ gene Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- -1 viaB Proteins 0.000 description 4
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 3
- 101100317005 Salmonella typhi vipB gene Proteins 0.000 description 3
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 3
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 101150091444 ompR gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M sodium arsenite Chemical compound [Na+].[O-][As]=O PTLRDCMBXHILCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960001266 typhoid vaccines Drugs 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N (2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-(6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolane-2-carboxylic acid Chemical compound [C@]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)(N1C=NC=2C(O)=NC=NC12)C(=O)O AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N 0.000 description 2
- PDACUKOKVHBVHJ-XVFCMESISA-N 5-amino-1-(5-phospho-beta-D-ribosyl)imidazole Chemical compound NC1=CN=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 PDACUKOKVHBVHJ-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- SKCBPEVYGOQGJN-TXICZTDVSA-N 5-phospho-beta-D-ribosylamine Chemical compound N[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O SKCBPEVYGOQGJN-TXICZTDVSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 101000939689 Araneus ventricosus U2-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000633673 Buthacus arenicola Beta-insect depressant toxin BaIT2 Proteins 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101000654318 Centruroides noxius Beta-mammal toxin Cn2 Proteins 0.000 description 2
- 101001028695 Chironex fleckeri Toxin CfTX-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 101000739899 Entamoeba histolytica Serine-rich 25 kDa antigen protein Proteins 0.000 description 2
- 101100172469 Escherichia coli (strain K12) envZ gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000926 GMP synthase (glutamine-hydrolyzing) Proteins 0.000 description 2
- 102100033452 GMP synthase [glutamine-hydrolyzing] Human genes 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087227 IMP Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006674 IMP dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- 101100317004 Salmonella typhi vipA gene Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 2
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N arsenite(1-) Chemical compound O[As](O)[O-] AQLMHYSWFMLWBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940028843 inosinic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000004245 inosinic acid Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 244000000053 intestinal parasite Species 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 101150047779 ompB gene Proteins 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000004144 purine metabolism Effects 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 244000000033 sexually transmitted pathogen Species 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-M 2,3-dihydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=CC(C([O-])=O)=C1O GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzenesulfonamide;5-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101001023095 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1a Proteins 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000705294 Arabidopsis thaliana Oxygen-evolving enhancer protein 1-2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101000641989 Araneus ventricosus Kunitz-type U1-aranetoxin-Av1a Proteins 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical group OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101001028691 Carybdea rastonii Toxin CrTX-A Proteins 0.000 description 1
- 101000685083 Centruroides infamatus Beta-toxin Cii1 Proteins 0.000 description 1
- 101000685085 Centruroides noxius Toxin Cn1 Proteins 0.000 description 1
- 101001028688 Chironex fleckeri Toxin CfTX-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 101000822695 Clostridium perfringens (strain 13 / Type A) Small, acid-soluble spore protein C1 Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 description 1
- 101710154303 Cyclic AMP receptor protein Proteins 0.000 description 1
- 101000644407 Cyriopagopus schmidti U6-theraphotoxin-Hs1a Proteins 0.000 description 1
- 229930195711 D-Serine Natural products 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-Serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 101100410642 Dictyostelium discoideum purC/E gene Proteins 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241001050985 Disco Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100410443 Escherichia coli (strain K12) purM gene Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194268 Eublemma pura Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010057081 Merozoite Surface Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108090000849 Nitrate reductase (NADH) Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000007533 Nucleotidases Human genes 0.000 description 1
- 108010071195 Nucleotidases Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 101000679608 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) Cysteine rich necrotrophic effector Tox1 Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 101000983333 Plasmodium falciparum (isolate NF54) 25 kDa ookinete surface antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100119347 Plasmodium falciparum EXP-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000576807 Protobothrops flavoviridis Small serum protein 2 Proteins 0.000 description 1
- GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N Pyrocatechuic acid Natural products OC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 101100317006 Salmonella typhi vipC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241001353427 Shigella flexneri Y Species 0.000 description 1
- 241001591005 Siga Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101001060868 Strawberry mild yellow edge-associated virus Helicase Proteins 0.000 description 1
- 101000870438 Streptococcus gordonii UDP-N-acetylglucosamine-peptide N-acetylglucosaminyltransferase stabilizing protein GtfB Proteins 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002215 Synaptobrevin Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 241001467018 Typhis Species 0.000 description 1
- 102100021436 UDP-glucose 4-epimerase Human genes 0.000 description 1
- 108010075202 UDP-glucose 4-epimerase Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 101000645119 Vibrio campbellii (strain ATCC BAA-1116 / BB120) Nucleotide-binding protein VIBHAR_03667 Proteins 0.000 description 1
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 102000036859 Zinc-dependent proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091006973 Zinc-dependent proteases Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 101150078331 ama-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002096 anti-tetanic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960004755 ceftriaxone Drugs 0.000 description 1
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940047766 co-trimoxazole Drugs 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 208000028104 epidemic louse-borne typhus Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 210000004837 gut-associated lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 101150032598 hisG gene Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940022007 naked DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940127249 oral antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 101150028995 purC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105087 purC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076045 purF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005367 tetanus antitoxin Drugs 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960002766 tetanus vaccines Drugs 0.000 description 1
- 229940041007 third-generation cephalosporins Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010061393 typhus Diseases 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 101150072178 viaA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940104152 vivotif Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 101150075472 ycf27 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/255—Salmonella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/879—Salmonella
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
1. Atenuowany mutant Salmonella, znamienny tym, ze konstytutywnie wyra za antygen Vi i ze promotor vipR w mutancie jest zast apiony konstytutywnym promotorem tak, ze powoduje konstytu- tywn a ekspresj e viaB. 2. Atenuowany mutant Salmonella wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze jest mutantem Sal- monella typhi. 3. Atenuowany mutant Salmonella wed lug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, ze w mutancie promotor vipR jest zast apiony promotorem wybranym z grupy sk ladaj acej si e z P tac , P trc , P Olac i P Ipp , powodujac konstytutywn a ekspresj e viaB. 12. Szczepionka przeciw durowi brzusznemu, znamienna tym, ze zawiera: (A) farmaceutycznie skuteczn a ilo sc atenuowanego mutanta Salmonella typhi, który konsty- tutywnie wyra za antygen Vi, i w którym promotor vipR jest zast apiony konstytutywnym promotorem, powoduj ac konstytutywn a ekspresj e viaB; i (B) farmaceutycznie dopuszczalny no snik lub rozcie nczalnik. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są atenuowane mutanty Salmonella i szczepionka przeciw durowi brzusznemu.
Wynalazek dotyczy atenuowanych mutantów Salmonella konstytutywnie wyrażających antygen Vi, jak również zawierających je szczepionek przeciw durowi brzusznemu.
Antygen Vi.
Antygen Vi, polisacharyd otoczki, po raz pierwszy został opisany przez Felix i wsp., Lancet, 227:186-191 (1934). Ten polisacharyd otoczkowy jest obecny zarówno u Salmonella, jak S. typhi, S.
paratyphi C i S. dublin, jak również u Citrobacter freundii. Strukturalnie antygen Vi jest liniowym polimerem kwasu e-4,2-deoksy-2N-acetylogalakturonowego o zmiennej O-acetylacji (Daniels i wsp., Infect. Immun., 57: 3159-3164 (1989)). Jego obecność u S.typhi korelowała in vitro ze znaczącym zmniejszeniem lizy przez surowicę, aktywacji układu dopełniacza i fagocytozy (Looney i wsp. J. Lab Clin. Med., 108:506-5!6 (1986)). Zatem antygen Vi może działać jako osłona ochraniająca S. typhi przed układem odpornościowym.
A. Obszar chromosomowy viaB a regulacja wyrażania antygenu Vi
Uważa się, że do wyrażania antygenu Vi niezbędne są trzy bardzo oddalone od siebie loci chromosomalne, viaA, viaB i ompB (Johnson i wsp., J. Bacteriol., 90:302-308 (1965); i Snellings i wsp., J. Bacteriol 145:1010-1017 (1981)). Spośród nich, locus viaB jest zawsze wykrywany w pozytywnych pod względem antygenu Vi szczepach i sądzi się, że zawiera geny kodujące enzymy niezbędne do syntezy Vi (Hashimoto i wsp., J. Bacteriol., 175:4456-4465 (1993) i Virlogeux i wsp., Microbiol., 141:3039-3047 (1995)). Locus viaB składa się z 11 otwartych ramek odczytu (ORF) (fig. 1A), z których geny vipA i vipB kodują enzymy syntetyzujące cukier nukleotydowy polisacharydu Vi, a pięć genów vex (vexA-E) uważa się za odpowiedzialne za translokację antygenu Vi (Hashimoto i wsp., (1993) powyżej). Pierwsza ORF obszaru viaB, to jest vipR (fig. 1A), reguluje pozytywnie własną ekspresję na poziomie transkrypcji, jak również ekspresję viA, vipB, orf4, vipC i być może innych genów położonych poniżej od vipR (Hashimoto i wsp., J. Bacteriol., 178:1430-1436 (1996)). Ponadto, promotor położony w górę od vipR kontroluje również transkrypcję (przynajmniej) vipA i vipB (kodujących podjednostki strukturalne antygenu Vi), tworząc wewnątrz regionu viaB operon. Inny region chromosomalny, operon ompB, zawierający geny ompR-envZ, odgrywa rolę w wyrażaniu antygenu Vi jako regulator transkrypcji viaB (Pickard i in, Infect. Immun., 62:3984-3993 (1994)). Region ompR-envZ jest współodpowiedzialny za odpowiedź adaptacyjną E. coli na warunki wysokiej osmolarności. U S.typhi, antygen Vi jest regulowany osmotycznie, a ompR jest niezbędny do jego wyrażenia (Pickard i wsp., powyżej).
B. Związek między ekspozycją na antygen Vi i ochroną odpornościową
Otoczkowy polisacharyd Vi S.typhi jest czynnikiem wirulencji i antygenem ochronnym u ludzi (Felix i wsp., 1934, powyżej). Oczyszczony polisacharyd Vi jest dopuszczoną do obrotu pozajelitową szczepionką przeciw durowi brzusznemu, wywołującą umiarkowany stopień ochronnej odporności po zaszczepieniu pojedynczą dawką, a w ochronie tej pośredniczą surowicze przeciwciała IgG (Acharya i wsp., New England Journal of Medicine, 317:1101-1104 (1987) i Klugman i wsp., Lancet, 2: 1165-1169 (1987)). Przeciwnie do tego, atenuowany szczep S. typhi Ty21a, dopuszczona do obrotu żywa szczepionka doustna, nie wyraża antygenu Vi, ani nie wywołuje powstania przeciwciał anty - Vi w surowicy; mimo to, Ty21a nadaje przynajmniej umiarkowany stopień ochrony (Wahdan i wsp., J. Infect. Dis., 145:292-296 (1982); oraz Levine i wsp., Lancet, 1:1049-1052 (1987a)). Uważa się, że w tych sytuacjach za ochronę odpowiada odporność komórkowa. Kilka nowych atenuowanych szczepów S.typhi, wyrażających antygen Vi in vitro nie wywołało odpowiedzi w postaci przeciwciał Vi w surowicy po podaniu w formie szczepionki doustnej, nawet gdy wywołały wysokie miano przeciwciał O i H (Tacket i wsp., J. Infect. Dis., 163:901-904 (1991); Tacket i wsp., Vaccine, 10:443-446 (1992a) oraz Tacket i wsp., Infect. Immun., 65:452-456 (1997)). Prawdopodobnym wyjaśnieniem tego zjawiska jest ścisła regulacja wyrażania Vi w zależności od bodźca osmotycznego (Picard i wsp., powyżej). Przypuszcza się, że wyrażanie antygenu Vi jest przerywane, za wyjątkiem sytuacji, gdy bakterie znajdują się pozakomórkowo we krwi lub innym płynie ustrojowym (np. żółci).
W niniejszym wynalazku założono, że konstytutywne wyrażenie antygenu Vi spowoduje stymulację powstawania przeciwciał IgG przeciw Vi w surowicy, wzmacniając w ten sposób całkowitą ochronę przed durem brzusznym. W niniejszym wynalazku założono również, że konstytutywne wyrażanie
PL 192 378 B1 poprawi odpowiedź odpornościową na obce antygeny wyrażane przez atenuowane żywe szczepionki wektorowe Salmonella oraz szczepionki oparte na DNA.
II. Populacje zagrożone durem brzusznym
Dur brzuszny jest niezwykle rzadki we współczesnych krajach uprzemysłowionych, których ludność ma dostęp do źródeł oczyszczonej, monitorowanej bakteriologicznie wody i systemu sanitarnego usuwającego ludzkie fekalia. Natomiast w mniej rozwiniętych krajach, których ludności brak takich udogodnień bytowych, często występuje endemicznie dur brzuszny i z punktu widzenia zdrowia publicznego, stanowi największy problem spośród chorób jelitowych dzieci w wieku szkolnym (Levine i wsp., Pediatr. Infect. Dis. J. 8:374-381 (1989a)). Systematyczny nadzór kliniczny, epidemiologiczny i bakteriologiczny duru brzusznego w zwią zku z badaniami w terenie szczepionek-kandydatów pozwoliły na określenie z dużą dokładnością występowania duru brzusznego w wielu populacjach (Levine i wsp., Lancet, 336:891-894 (1990); Black i wsp., Vaccine, 8:81-84 (1990); Levine i in, (1987a) powyżej; Ferreccio i in, J. Infect. Dis., 159:766-769 (1989); oraz Siunjuntak i wsp. Lancet, 338:1055-1059 (1991)). Określona częstość wystąpień okazała się o wiele większa niż przypuszczana, oparta na niesystematycznych kontrolach. Systematyczne badania wykazały również zaskakująco dużą częstość klinicznie łagodnej bakteriemicznej infekcji duru brzusznego wśród noworodków i niemowląt na obszarach endemicznych (Ferreccio i wsp., J. Pediatr., 104:899-901 (1984)).
Oprócz dzieci w wieku szkolnym w krajach rozwijających się dwoma innymi populacjami o zwię kszonym ryzyku zachorowania na dur brzuszny są podróż nicy oraz mikrobiolodzy kliniczni. Dla podróżników z USA największym ryzykiem odznaczają się kraje Ameryki Południowej wzdłuż wybrzeża Oceanu Spokojnego oraz subkontynent indyjski (Ryan i wsp., Rev. Infect. Dis., 11:1-8 (1989) oraz Mathieu i wsp., Arch. Intern. Med., 154:1713-1718 (1994)). Dodatkowo, mikrobiolodzy kliniczni, w tym ci z krajów uprzemysłowionych, są w zwiększonym stopniu narażeni na S. typhi w środowisku pracy, zatem są grupą zwiększonego ryzyka (Blaser i wsp., J. Clin. Microbiol., 13:855-858 (1981)).
III. Wielooporne szczepy S.typhi
Od około 1990 roku na Środkowym Wschodzie, w północno-wschodniej Afryce, południowej i południowo-wschodniej Azji zaczęły się pojawiać sporadyczne przypadki i lokalne wybuchy zakażeń durem brzusznym. Te wybuchy spowodowane były szczepami S.typhi niosącymi kodowaną przez plazmid oporność na trimetoprim/sulfametoksazol, jak również oporność na chloramfenikol (Gupta i wsp., Pediatr. Infect. Dis., 13:124-140 (1994); oraz Rowe i wsp., Lancet, 336: 1065-1066 (1990)). Leczenie przeciw takim szczepom wymaga użycia antybiotyków hydrochinonowych, jak doustna ciprofloksacyna doustnie lub cefalosporyny trzeciej generacji, jak dojelitowy ceftriakson. Antybiotyki te dla krajów rozwijających się są drogie. W odróżnieniu od wcześniejszych antybiotykoopornych szczepów, które powodowały sporadyczne przypadki zachorowań lub rozwijały epidemie, jak w Meksyku 1972-1973 (Olarte i wsp., Antimicrob. Agtents. Chemother., 4:597-601 (1973)) oraz w Peru w latach 1979-1981 (Goldstein i wsp., J. Infect. Dis., 2:261-266 (1986)) i które w końcu znikały zastąpione przez szczepy wrażliwe, wieloantybiotykooporne szczepy S. typhi, które pojawiły się na Środkowym Wschodzie i subkontynencie indyjskim około 1990 pozostają wciąż szczepami dominującymi na tych terenach. Co więcej, te wieloantybiotykooporne szczepy w dużym stopniu się rozpowszechniły i przeważają w północnej Afryce (Mikhail i wsp., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 83:120 (1989)) i południowowschodniej Azji (Vinh i wsp., Antimicrob. Agents. Chemother., 40:958-961 (1996)).
Wydaje się, że S.typhi przejawiająca oporność na wiele wcześniej stosowanych antybiotyków może nie być zjawiskiem przejściowym. Zatem dur brzuszny już nie jest chorobą, z której można łatwo i tanio wyleczyć antybiotykami doustnymi. Co więcej, służba zdrowia nie może dłużej opierać programów kontroli duru brzusznego na wczesnym leczeniu choroby. Wzrasta liczba powikłań duru brzusznego i zgonów ze względu na zbyt późne lub niewłaściwe i niewystarczające leczenie antybiotykami (Singh, Indian Pediatr., 28:329-332 (1991); Bhutta, Ann. Trop. Paediatr., 16:299-306 (1996) oraz Gupta, powyżej).
Zatem szerzenie się licznych, wieloantybiotykoopornych szczepów S. typhi stanowi wzrastające zagrożenie zdrowia publicznego w wielu krajach mniej rozwiniętych i wzbudziło na nowo zainteresowanie rozwojem ulepszonych doustnych szczepionek przeciw durowi. Należy również rozważyć wprowadzenie immunoprofilaktyki w stosunku do dzieci na obszarach częstego występowania choroby, szczególnie w przypadku szczepów S. typhi wieloantybiotykoopornych, jak również wobec podróżników i mikrobiologów klinicznych.
IV. Wczesne szczepionki przeciw durowi brzusznemu
A. Inaktywowane pozajelitowe szczepionki z całych komórek
PL 192 378 B1
W latach 60-tych wykazano w losowych, kontrolowanych próbach terenowych finansowanych przez Światową Organizację Zdrowia, że dla wynalezionych w końcu XIX wieku szczepionek opartych na całych komórkach, inaktywowanych ciepłem i konserwowanych fenolem (Wright i wsp., Br. Med. J., 1:256-258 (1897) oraz Pfeiffer i wsp., Deutsch. Med. Wochescr. 22:735-737 (1896)) zapewniają umiarkowany stopień ochrony (51-67% skuteczności szczepionki), trwający do siedmiu lat (Ashcroft i wsp., Am. J. Hyg., 79:196-206 (1964), Ashcroft i wsp., Lancet, 2:1056-1060 (1967); Jugosłowiańska Komisja Duru Brzusznego, Bull. WHO, 34:321-339 (1966)). Jednakże, ze względu na wywoływanie przez nią niepożądanych reakcji z nieakceptowalną częstością, jest to wyraźnie niezadowalająca szczepionka i jako taka, nigdy nie stała się popularnym narzędziem zdrowia publicznego (Levine, Typhoid Fever Vaccines, w Vaccines, II wyd., wyd. Plotkin i in. Filadelfia, PA, W.B. Saunders (1994)). W kontrolowanych badaniach, u około 25% osób, które otrzyma ły szczepionkę z całych komórek, inaktywowanych ciepłem i konserwowanych fenolem, pojawia się gorączka i reakcja układowa, u około 15% dochodzi do nieobecności w szkole i pracy po zaszczepieniu (Ashcroft i wsp., (1964), powyżej; oraz Hejfec, powyżej). Z tego powodu w dużym stopniu zastąpiono tę szczepionkę dwiema później licencjonowanymi szczepionkami, żywą szczepionką doustną ze szczepu Ty21a (Vivotif®) oraz pozajelitową szczepionką zawierającą oczyszczony polisacharyd otoczkowy Vi (TyphiVim®)) (Levine i wsp., (1989a) powyżej). Obydwie nowe szczepionki nadają ochronę porównywalną do powyżej opisanej szczepionki z całych komórek, ale są dużo lepiej znoszone.
B. Pozajelitowa szczepionka z polisacharydu Vi
Jak to omówiono powyżej, w połowie lat 30-tych odkryto antygen Vi, polisacharyd otoczki S. typhi (Felix i wsp., (1934) powyżej). Wykazano również obecność tego antygenu u większości szczepów wyizolowanych z krwi chorych na dur brzuszny oraz, że jest czynnikiem wirulencji S. typhi u myszy; jego obecność chroni antygen O przed aglutynacją przez surowicę odpornościową O (Felix i wsp., J. Hyg. Cambridge, 49:92-109 (1951); Felix i wsp., J. Hyg. 35:421-427 (1935)).
Zaproponowano tezę, że przeciwciało Vi ma istotną rolę w ochronie przeciw durowi brzusznemu i sugerowano, ż e inaktywowane fenolem całokomórkowe szczepionki pozajelitowe można zastąpić inaktywowanymi alkoholem całokomórkowymi szczepionkami pozajelitowymi. Podstawą tej propozycji było lepsze zachowywanie antygenu Vi w tych ostatnich i wywoływanie przez nie wyższych mian przeciwciał Vi u zwierząt i ludzi (Felix, BMJ, L:391-395 (1941)). Jednakże w losowych, kontrolowanych badaniach terenowych w Jugosławii inaktywowane ciepłem i fenolem całokomórkowe szczepionki pozajelitowe miały znacząco lepsze działanie ochronne od inaktywowanych alkoholem całokomórkowych szczepionek pozajelitowych (Jugosłowiańska Komisja Duru Brzusznego, Bull. WHO, 26:357-369 (1962)). Na tej samej podstawie zaproponowano pozajelitową szczepionkę przeciwko durowi brzusznemu z inaktywowanych acetonem całych komórek (Landy i wsp., Am. J. Public Health, 44:1572-1579 (1954)). W dwóch niezależnych badaniach terenowych wykonanych w latach 1960 w Gujanie i Jugosławii, stwierdzono lepszą ochronę przez szczepionkę inaktywowaną acetonem niż inaktywowaną ciepłem i fenolem (Jugosłowiańska Komisja Duru Brzusznego (1962), powyżej). Dowodzono, że wyższość szczepionki inaktywowanej acetonem, polega na lepszym zabezpieczeniu antygenu Vi (Wong i wsp., J.Infect.Dis., 125:360-366 (1972)) lub wyższym mianie przeciwciał przeciwko antygenowi H, otrzymywanym dzięki tej szczepionce.
Zasadniczy postęp został dokonany przez oczyszczenie antygenu Vi techniką niedenaturującą (Levine i wsp., Infect. Immun., 12:1290-1294 (1975 oraz Robbins i wsp., J. Infect. Dis., 150:436-449 (1984)). Porównano immunogenność dwóch partii niezdenaturowanego antygenu Vi przygotowanego w National Institute of Health (Bethesda, Maryland) i w Institute Merieux (Lyon, Francja) (Tacket i wsp., Vaccine, 6:307-308 (1988)). Obie partie wywoł ywał y wysokie miana przeciwciał Vi u okoł o 90% szczepionych. Co więcej, wykazano, że przeciwciała Vi powstałe wskutek szczepienia przetrwały przynajmniej przez trzy lata (Tacket i wsp, (1988), powyżej). Poziomy przeciwciał Vi wywoływane przez pozajelitową, oczyszczoną szczepionkę Vi dorównywały jedynie obserwowanym w naturze u chronicznych nosicieli duru. Dla odróż nienia, wię kszość ozdrowień ców, którzy przeszli dur brzuszny, nie posiada wysokiego miana przeciwciał Vi (Lanata i wsp., Lancet, 2:441-43 (1983) oraz Losonsky i wsp., J. Clin. Microbiol., 25:2266-2269 (1987)).
Przeprowadzono dwa losowe, kontrolowane badania terenowe aby ocenić bezpieczeństwo i skuteczność proponowanej szczepionki-antygenu Vi produkowanej w Institut Merieux. W obu badaniach szczepionka była dobrze tolerowana(Acharya i wsp., powyżej i Klugman i wsp., powyżej).
W Nepalu pojedyncza dawka domięśniowa 25 μg szczepionki antygenu Vi dawała 72% ochronę na przynajmniej 17 miesięcy przeciw potwierdzonemu posiewem durowi brzusznemu, w badaniu obejmuPL 192 378 B1 jącym zarówno dzieci jak i dorosłych (Klugman i wsp., powyżej). Podobne wyniki uzyskano w badaniach terenowych u dzieci szkolnych w Południowej Afryce, u których taka sama dawka szczepionki-antygenu Vi dawała 64% ochronę przeciw potwierdzonemu posiewem durowi brzusznemu przez co najmniej 21 miesięcy (Klugman i wsp., powyżej).
Oprócz bezpieczeństwa i skuteczności u dzieci w wieku szkolnym i dorosłych, zaletą szczepionki opartej na antygenie Vi, jest to, że powoduje umiarkowaną odporność już po pojedynczej dawce. Jednakże, w porównaniu do atenuowanej szczepionki przeciw durowi Ty21a, szczepionka antygenowa jest niekorzystna ze względu na pozajelitową (domięśniową) drogę podawania.
C. Wczesne atenuowane szczepy jako żywe szczepionki doustne
1. Szczepionki ze streptomycyno-zależnych szczepów S.typhi
Pierwszymi atenuowanymi szczepami obiecującymi w roli żywych doustnych szczepionek przeciw durowi były uzyskane w późnych latach sześćdziesiątych i wczesnych siedemdziesiątych szczepy streptomycyno-zależne (SmD) (DuPont i wsp., Antimicrob. Agents Chemother., 10:236-239 (1970; oraz Levine i wsp., J. Infect. Dis., 133:424-429 (1976)). Podane w wielu oddzielnych dawkach zawierających około 1010 jednostek tworzących kolonie (cfu) na dawkę, szczepy SmD były dobrze znoszone i wykazywały około 80% ochronę przeciw doświadczalnej prowokacji ochotnika durem brzusznym (DuPont i wsp., powyżej). Jednakże, po immunizacji ochotników liofilizowanymi preparatami rekonstytuowanymi do ciekłej zawiesiny organizmów szczepionki nie potwierdzono ochrony (Levine i wsp., 1976, powyżej). W związku z tym przerwano dalsze badania nad użyciem szczepów SmD jako szczepionek.
2. Szczep Ty21a, licencjonowana żywa szczepionka doustna przeciwko durowi brzusznemu
Atenuowany szczep S. typhi, Ty21a, bezpieczny i zabezpieczający jako żywa doustna szczepionka, został otrzymany na początku lat 1970 przez chemiczną mutagenezę patogennego szczepu S. typhi Ty2 (Germanier i wsp., J. Infect. Dis., 141:553-558 (1975)). Charakterystyczne dla tego szczepu mutacje, którym początkowo przypisywano odpowiedzialność za atenuację, obejmują inaktywację galE (kodującego 4-epimerazę UDP-galaktozową, enzym biorący udział w syntezie lipopolisacharydu) oraz niezdolność do wyrażania polisacharydu Vi. Podczas gdy w przeprowadzanych z placebo badaniach klinicznych udowodniono zuważalnie dobrą tolerancję Ty21a (Gilman i wsp., J. Infect. Dis., 136:717-723 (1977); Wahdan i wsp., 1982, powyżej oraz Wahden i wsp., Bull. WHO, 58:469-474 (1980)), nie jest ostatecznie wyjaśnione, które mutacje odpowiadają za stabilny, wysoce atenuowany fenotyp tej szczepionki. Wyniki trzech podwójnie ślepych, przeprowadzanych z placebo badań z użyciem aktywnych metod kontroli w celu określenia reaktywności Ty21a u dorosłych i dzieci wykazały, że niepożądane reakcje nie występują znacząco częściej niż w grupie placebo pod względem objawów. Podobnie w terenowych badaniach skuteczności na dużą skalę na grupie około 530 000 dzieci w wieku szkolnym w Chile, 32 000 dzieci w wieku szkolnym w Egipcie i około 20 000 pacjentów, dzieci i dorosłych, leczonych w Indonezji, bierny nadzór nie pozwolił na zaobserwowanie możliwych do przypisania szczepionce reakcji niepożądanych (Ferreccio i wsp., (1984) powyżej; Levine i wsp., (1987a), powyżej; Simunjuntuk i wsp., powyżej, Wahdan i wsp., (1982) powyżej; oraz Wahdan i wsp., (1980) powy ż ej).
Kontrolowane badania terenowe Ty21a podkreślają, że preparat szczepionki, liczba podanych dawek i przerwy pomiędzy ich podawaniem znacząco wpływają na potencjalny poziom ochrony (Black i wsp., powyżej; Ferreccio i wsp., (1984) powyżej; Levine i wsp., (1987a), powyżej; oraz Wahdan i wsp., (1980) powyż ej). W pierwszych losowych, przeprowadzanych z placebo badaniach terenowych Ty21a w Aleksandrii, w Egipcie, dzieci szkolne w wieku 6-7 lat otrzymywały trzy dawki liofilizowanej szczepionki ponownie zawieszonej w rozcieńczalniku (w dziennych odstępach między dawkami). Aby zneutralizować kwas żołądkowy dzieci żuły 1,0 g tabletkę NaHCO3 kilka minut przed połknięciem szczepionki lub placebo. Podczas trzyletniego okresu obserwacji wykazano, że Ty21a ma 96% skuteczność ochronną przeciw potwierdzonemu durowi brzusznemu (Wahdan i wsp., (1982), powyżej).
Ostatni preparat, który stał się produktem komercyjnym od połowy lat osiemdziesiątych, składa się z liofilizowanej szczepionki w dojelitowej, kwasoodpornej powłoczce. W losowych, przeprowadzanych z placebo badaniach terenowych w Santiago, Chile, trzy dawki tego dojelitowego preparatu podawane w ciągu tygodnia zapewniały 67% ochronę przez pierwsze trzy lata po szczepieniu (Levine i wsp., (1987a), powyżej) i 63% ochronę w ciągu siedmiu lat po szczepieniu. Cztery dawki Ty21a w dojelitowych kapsułkach podawanych w ciągu ośmiu dni powodowały znacząco lepszą ochronę niż dwie lub trzy dawki (Ferreccio i wsp., (1984) powyżej). W licencji dla Ty21a wydanej przez przez U.S.
PL 192 378 B1
Drug and Food Administration w końcu 1989, zalecany harmonogram obejmował cztery dawki podawane co drugi dzień; w innych krajach przyjęto trzydawkowy harmonogram immunizacji.
Jednakże uznane słabe punkty Ty21a obejmują brak molekularnych podstaw jego atenuacji, jego niewielka immunogenność i co najistotniejsze, konieczność przyjęcia przynajmniej trzech osobnych dawek w celu wytworzenia odporności. Inną wadą Ty21a jest brak stymulacji do wytwarzania surowiczych przeciwciał IgG anty-Vi.
3. Współzależności ochrony po immunizacji atenuowanymi szczepionkami
Choć licencjonowana przeciwdurowa żywa szczepionka doustna ze szczepu Ty21a jest jedynie w niewielkim stopniu immunogenna i wymaga trzech lub czterech podawanych w odstę pach dawek do wywołania ochrony, jej skuteczność trwa zaskakująco długo, 5-7 lat. Wyniki dwóch badań immunologicznych wykazują współzależność z ochroną powstającą wskutek działania różnych preparatów i harmonogramów immunizacji Ty21 w badaniach terenowych. Obejmuje to serokonwersję surowiczych IgG O (Levine i wsp., Rev. Infect. Dis., 11 (suppl.)): S552-S567 (1986b)) i wyliczenie pochodzących z jelit komórek wydzielających przeciwciała IgA O (ASC) wykrytych wśród jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) (Kantele, Vaccine 8:321-326 (1990)); Tacket i wsp., Infect. Immun., 60:536-541 (1992b) i Van de Erg i wsp., Infect. Immun., 58:2002-2004 (1990)). Określenie tych pomiarów jako współzależnych z ochroną dostarcza nieocenionego narzędzia do zastosowania we wczesnych etapach badań klinicznych podczas oceny nowych atenuowanych szczepów S. typhi jako potencjalnych żywych szczepionek doustnych.
V. Nowe generacje atenuowanych S. typhi jako żywe szczepionki doustne
Badacze w różnorodnych laboratoriach całego świata podjęli zadanie wytworzenia nowego szczepu szczepionki-kandydata, tolerowanego tak dobrze jak Ty21a, ale znacznie bardziej immunogennego tak, by pojedyncza dawka doustna powodowała ochraniającą odporność. W tym celu przygotowywano szczepy szczepionek-kandydatów przez inaktywację genów kodujących rozmaite szlaki biochemiczne, ogólne układy regulacyjne, białka szoku cieplnego, inne geny regulatorowe i przypuszczalne właściwości wirulencji (Curtiss i in, Infect. Immun., 55:3035-3043 (1987) powyżej; Edwards i wsp., J. Bacteriol., 170:3991-3995 (1984); Hohmann i wsp., J. Infect. Dis., 173:1408-1414 (1996a); Hone i wsp., Infect. Immun., 56:1326-1333 (1988); Hone I wsp., Vaccine, 9:810-816 (1991) oraz Levine i wsp., J. Biotechnol., 44:193-196 (1996)). Uczyniono również próbę zwiększenia immunogenności Ty21a przez przywrócenie jego zdolności wyrażania antygenu Vi (Cryz i wsp., Infect. Immun., 57:3863-3868 (1989) oraz Tacket i wsp., (1991), powyżej). Względny stopień atenuacji tych zmutowanych szczepów zwykle określano przez podawanie myszom w pokarmie szczepów S. typhimurium niosących te mutacje i porównywanie otrzymanych wyników z uzyskanymi dla dzikich izogenicznych szczepów. Mutacje wprowadzone do różnych rekombinowanych szczepów S. typhi podawanych ludziom jako żywe doustne szczepionki-kandydaci w badaniach klinicznych zebrano w tabeli 1 poniżej.
T a b e l a 1
Zmutowany gen | Szczep szczepionki | Dziki szczep rodzicielski | Fenotyp kliniczny | Fenotyp immunologiczny |
galE, via | EX462 | Ty2 | nie atenuowany | immunogenny |
aroA, purA | 541Ty | CDC1080 | nadmiernie atenuowany | słabo immunogenny |
aroA, purA, Vi | 543Ty | CDC1080 | nadmiernie atenuowany | słabo immunogenny |
aroC.aroD | CVD908 | Ty2 | atenuowany | immunogenny |
aroC, aroD, htrA | CVD908-htrA | Ty2 | atenuowany | immunogenny |
cya, crp | X3927 | Ty2 | niewystarczająco atenuowany | immunogenny |
cya,crp,cdt | X4073 | Ty2 | atenuowany | immunogenny |
phoP/phoQ | Ty800 | Ty2 | atenuowany | immunogenny |
A. Poniżej podsumowano uderzające cechy i wyniki badań klinicznych z najważniejszymi atenuowanymi szczepami S. typhi, które odegrały decydującą rolę w rozwoju żywej doustnej szczepionki przeciw durowi brzusznemu.
Szczep Vi+ Ty21a.
PL 192 378 B1
Pochodna Ty21a została skonstruowana przez wprowadzenie viaB (kodującego geny struktury wymagane dla syntezy polisacharydu Vi) ze szczepu Ty2 typu dzikiego do chromosomu TY21a i uzyskanie ekspresji otoczkowego polisacharydu Vi płaszcza (Cryz i wsp. powyżej). Uzyskany szczep Vi+ Ty21a podano zdrowym mieszkańcom Ameryki Północnej w postaci pojedynczej dawki zawierającej 5,0 x 105, 5 x 107 i 5 x 109 jednostek tworzących kolonie (cfu) i bufor; dodatkowa grupa osób otrzymała dawkę 5,0 x 109 cfu i bufor (z dziennymi odstępami pomiędzy dawkami) (Tacker i wsp. (1991), powyżej). Szczep Vi+ Ty21a był dobrze tolerowany i większość z osób, które otrzymały trzy dawki rozwinęła w surowicy przeciwciał a klasy IgG i IgA ASC przeciw antygenowi O z S. typhi. Jednakż e u ż adnej z osób nie był o obecnoś ci w surowicy przeciwciał klasy IgG przeciw Vi lub ASC, które uwalniają przeciwciało klasy IgA przeciw Vi (Tacker i wsp., (1991), powyżej).
B. EX462
Podjęto próbę skonstruowania nowej pochodnej Ty2 stosując metody rekombinowania DNA, która będzie obejmowała mutacje, które były do tej pory uważane za mutacje atenuujące w Ty21a, i które został y wywołane przez mutagenezę chemiczną (Hone i wsp., (1986), powyż ej). Konkretnie pochodne niosące mutacje typu delecja w galE były niezdolne do wyrażania polisacharydu Vi, lecz nie posiadały mnogości innych mutacji obecnych w Ty21a jako efektu tego, że zostały uzyskane przez niespecyficzną mutagenezę chemiczną. Uzyskany szczep EX462 był jednoznacznie niedostatecznie osłabiony, ponieważ ujawnił u kilku pacjentów zespół podobny do duru brzusznego. Obserwacje te prowadzą do wniosku, że sama kombinacja mutacji galE i niezdolności do wyrażania antygenu Vi sama nie jest odpowiedzialna za atenuację szczepu Ty21a.
C. Szczepy 541Ty i 543Ty
Pomysł otrzymania auksotroficznego mutanta Salmonella z nieaktywnymi genami kodującymi enzymy ze szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych został spopularyzowany (Edwards i wsp., powyżej i Hoiseth i wsp., Nature, 292: 238-239 (1981)). Mutacje te czynią bakterie Salmonella zależnymi od substratów pokarmowych (kwas para-aminobenzoesowy i 2,3-dihydroksybenzoesan), które nie są dostępne w wystarczających ilościach w tkankach ssaków; w konsekwencji tego szczepionka pozostaje żywotna lecz jej zdolność do proliferacji jest znacznie zahamowana.
Prototyp aroA-, szczepy 541Ty i 543Ty (wariant Vi- szczepu 541Ty) zostały skonstruowane z CDC1080, szczepu dzikiego uzyskanego z Centres for Disease Control (Edwards i wsp. powyżej). Patogenność szczepu CDC1080 nigdy nie była bezpośrednio badana na ochotnikach. Przeciwnie, większość innych badaczy rozpoczynała prace od szczepu typu dzikiego T2, rodzicielskiego dla Ty21a (Germanier i wsp., powyżej), podejmując próby uzyskania nowych atenuowanych szczepów. Patogenność Ty2 została ustalona przez badania na ochotnikach (Hornick i wsp., N. Eng. J. Med., 283:686-691 i 739-746 (1970)).
Szczepy 541Ty i 543Ty również niosą mutację typu delecja w purA, której efektem jest specyficzne wymaganie adeniny (lub przyswajalnego związku, takiego jak adenozyna) (Edwards i wsp., powyżej). Trzecia mutacja w hisG, prowadząca do wymagania histydyny, nie wpływa na wirulencję, lecz dostarcza dodatkowego markera biochemicznego pozwalającego wyraźnie odróżnić szczep tworzący szczepionkę od szczepu S typhi typu dzikiego.
Szczepy 541TY i 543Ty były całkiem dobrze tolerowane w dawkach 5,0 x 1010 cfu w Fazie 1 badań, lecz były znacząco mniej immunogenne niż Ty21a w pobudzaniu humoralnej odpowiedzi przeciwciała (Levine i wsp., J. Glin., Inwest., 79:888-902 (1987b)). Przykładowo, tylko 11% badanych rozwinęło surowicę IgG z przeciwciałami przeciw O (Levine i wsp., (1987b), powyżej).
D. Szczep CVD 908
Jeden szczep szczepionkowy, który, jak się okazało, że jest dobrze tolerowany i wysoce immunogenny po podaniu w postaci pojedynczej dawki w Fazie 1 badań klinicznych u ludzi, z wykorzystaniem świeżo zebranych organizmów, jest szczepem CVD 908 (Tacket i wsp., (1992b), powyżej i Tacket i wsp. (1992a), powyżej), który niesie precyzyjną mutację typu delecji w aroC i aroD (Hone i wsp. (1991), powyżej). Rzeczywiście, CVD 908 był pierwszym genetycznie zmienionym szczepem S. typhi będącym kandydatem na szczepionkę, wykazującym wysoką immunogenność i równocześnie dobrze tolerowanym, co za tym idzie stwarzającym nadzieję, że będzie możliwe opracowanie szczepionki podawanej w postaci jednej doustnej dawki szczepionki przeciw durowi brzusznemu. Przy dobrze tolerowanej dawce 5,0 x 107 cfu, 92% biorców CVD 908 ujawniało w surowicy przeciwciała klasy IgG przeciw O i ujawniało objawy wzbudzenia jelitowego systemu immunologicznego (IgA ASC) (Tacker i wsp. (1992a), powyż ej).
PL 192 378 B1
1. Odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem komórki, po immunizacji atenuowaną szczepionką CVD 908
Postępowanie kliniczne z CVD 908 charakteryzuje się intensywnym badaniem odpowiedzi immunologicznej, za pośrednictwem komórki (CMI) (Sztein i wsp., J. Immunol., 155:3987-3993 (1995); i Sztein i wsp., J. Infect. Dis., 170:1508-1517 (1994)). Podana zdrowemu człowiekowi CVD 908 wyzwala odpowiedź CMI na antygeny S. typhi obejmującą wytworzenie cytokiny i odpowiedź, przez proliferację, na bodziec cieplny i inaktywowane fenolem cząsteczki z całych komórek S. typhi i oczyszczonych wici (Sztein i wsp., (1994), powyżej).
Ponieważ S. typhi jest pasożytem wewnątrzkomórkowym, przypuszczano również, że odpowiedź przez cytotoksyczne limfocyty (CTL) może odgrywać ważną rolę w ograniczaniu postępu infekcji wywołanej przez bakterię duru brzusznego, przez uszkodzenie komórek gospodarza niosących S. typhi. A zatem oznaczenie CTL zostało opracowane dla oceny czy immunizowanie dorosłych ochotników atenuowaną S. typhi CVD 908 pobudza efektory CTL we krwi zdolne zabić komórki stransformowane wirusem Epstain-Barr (EBV) będące analogami limfocytów B zarażonych S. typhi typu dzikiego (Sztein i wsp., (1995), powyżej). Aktywność CTL była oceniana przy pomocy PBMC izolowanych przed, w 14 i 29 dni po pierwszej immunizacji. PBMC były zarówno użyte niezwłocznie w oznaczeniu CTL lub rozszerzonym in vitro na 6-8 dni w obecności zarażonych S. typhi, autologicznych komórek stransformowanych EBV, przed pomiarem odpowiedzi CTL. Przy pomocy tego systemu, efektory CTL lizują zainfekowane S. typhi autologiczne komórki stransformowane EBV. Specyficzną aktywność CTL obserwowano w preparatach PBMC uzyskanych 14 dni po immunizacji i następnie rozszerzono o 7 do 8 dni w obecności zainfekowanych S. typhi autologicznych komórek stranformowanych EBV. PBMC uzyskane 29 dni po immunizacji wykazywały porównywalny lub większy poziom aktywności CTL niż obserwowany w komórkach izolowanych 14 dni po immunizacji. Populacją komórek efektorowych CTL w tych hodowlach PBMC była zazwyczaj, populacja cytotoksycznych limfocytów T CD8+ ograniczona do MHC klasy I (Sztein i wsp., (1995), powyżej). Obserwacja, że immunizacja atenuowanymi S. typhi wywołuje krążące CD8+, ograniczone do MHC klasy I, komórki efektorowe CTL zdolne do zabicia autologicznych zainfekowanych S.typhi celów, podtrzymując rozumowanie, że CTL odgrywa kluczową rolę w ograniczaniu rozwoju zakażeń durowych przez niszczenie komórek gospodarza niosących bakterie.
2. Wady atenuowanych szczepionek ze szczepów CVD 908.
Możliwą niedogodnością obserwowaną w Fazie 1 prób klinicznych CVD 908 jest to, że u 50% pacjentów, którzy przyjmowali szczepionkę z tego szczepu w dawkach 5,0 x 107 cfu i u 100% pacjentów, którzy otrzymali dawkę 5,0 x 108 cfu, ujawniła się bezobjawowa infekcja poszczepienna-waksynemia (ang. vaccinemia), gdy organizm użyty do szczepienia był odzyskiwany z hodowli krwi zebranej w jednym lub więcej punktach czasowych między 4 a 8 dniem po szczepieniu. Próbki krwi były pobierane systematycznie od osób w godzinę po spożyciu szczepionki i następnie w 2, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 20, 27 i 60 dniu. Żadna z próbek krwi od szczepionych nie była pozytywna przed dniem 4 i po 8. Infekcje poszczepienne wydawały się nie mieć klinicznych konsekwencji (np. nie były związane z gorączką) i były krótkotrwałe, spontanicznie zanikające bez użycia antybiotyku. Jednak, szansa konsekwencji, że dojdzie do infekcji poszczepiennej atenuowanym szczepem S. typhi, licznej populacji, w której prawdopodobnie mogą występować osoby o obniżonej odporności immunologicznej, pozostaje nieznana. Inną dostrzeżoną niekorzystną właściwością CVD 908 jest to, że wywołuje ona gorączkę u niewielkiej części osób szczepionych, które otrzymały wysoką dawkę szczepionki (Tacket i wsp., (1992a), powyżej).
Jako alternatywa do CVD 908 powinny być wprowadzone dodatkowe mutacje dla uzyskania pochodnej, która będzie dobrze tolerowana i immunogenna, i nie będzie powodowała bezobjawowych infekcji poszczepiennych i gorączki.
E. CVD 908-htrA
Stwierdzono, że inaktywacja htrA, genu kodującego białko stresu, które działa również jako proteaza serynowa, atenuuje szczep typu dzikiego S. typhimurium w modelu mysim (Chatfield i wsp., Microbial Pathogenesis, 12:145-151 (1992a)). Ponadto myszy immunizowane doustnie S. typhimurium niosącymi mutacje typu delecji w htrA były chronione przed kolejną prowokacją śmiertelną dawką S. typhimurium typu dzikiego (Chatfield i wsp. (1992a) powyżej). Dlatego mutacja typu delecji została wprowadzona do htrA z CVD 908 w wyniku czego otrzymano szczep CVD 908-htrA (Levine i wsp. (1996), powyżej). Pojedynczą dawkę CVD 908-htrA podano trzem grupom osobników, które przyjęły w pokarmie 5,0 x 107 (N=7), 5 x 108 (N=8) lub 5,0 x 109 (N=7) cfu (Tacket i wsp. (1997), powyżej).
PL 192 378 B1
Szczep CVD 908-htrA był dobrze tolerowany, tak jak jego szczep rodzicielski CVD 908. Tylko jeden z dwudziestu dwóch obiektów miał nieznacznie podwyższoną temperaturę , co wykryto w rutynowym badaniu i nie towarzyszyły jej jakiekolwiek objawy choroby. Jednakże 2 z 22 osobników cierpiało na wolne stolce (Tacket i wsp. (1997), powyżej). Podobnie znakomita była odpowiedź immunologiczna: 20 z 22 osobników (91%) ujawniło znaczący wzrost przeciwciał IgG O w surowicy a pochodzących z jelita IgG ASC, które wytwarzają przeciwciała przeciw antygenowi O, wykryto u 100% szczepionych. Ta odpowiedź immunologiczna jest zasadniczo identyczna jak obserwowane w Fazie 1 badań klinicznych u osobników szczepionych porównywalną dawką CVD 908 (Tacket i wsp. (1992a), powyżej). Jedna rzucająca się w oczy różnica dotyczyła bezobjawowych infekcji poszczepiennych. Podczas, gdy bezobjawowe infekcje poszczepienne były wykrywane u 12 z 18 badanych, którzy otrzymali dawką 5,0 x 107 lub 5,0 x 108 cfu CVD 908, nie obserwowano bezobjawowych infekcji poszczepiennych u ż adnego z 22 badanych, którzy spoż yli dobrze tolerowan ą wysoko immunogenną dawkę 5,0 x 107-9 cfu CVD-908-htrA (p<0.001) (Levine i wsp. (1987b), powyżej; Tacket i wsp. (1992a), powyżej i Tacket i wsp. (1997), powyżej). CVD 908-htrA wywołuje również silną odpowiedź immunologiczną , w której pośredniczy komórka, u zaszczepionych porównywalną z siłą odpowiedzi immunologicznej odnotowanej dla CVD 908 (Tacket i wsp. (1992a) powyżej i Tacket i wsp., (1997), powyżej). Opierając się na tych bardzo zachęcających danych dopuszczono CVD 908-htrA do Fazy 2 badań klinicznych dla określenia jej klinicznej akceptowalności i immunogenności na większej liczbie podmiotów włącznie z dzieć mi.
F. Szczepy z mutacjami w cya, crp lub cya, crp, cdt
U Salmonella geny cya (kodujące cyklazę adenylową) i crp (bia łko receptora cyklicznego AMP) tworzą ogólny system regulacji, który dotyczy wielu genów i operonów (Curtiss i wsp., Dev. Biol. Stand., 82:23-33 (1994)). S. typhimurium które mają delecje w cya i crp są osłabione w porównaniu do ich dzikich rodziców i immunizacja doustna chroni myszy przed prowokacją chorobotwórczą S. typhimurium (Curtis i wsp., (1987), powyżej).
Skonstruowano szczep S. typhi, χ3927, podwójny mutant cya- crp-, który był szczepem kandydatem na szczepionkę (Curtiss i wsp. (1994), powyżej). W Fazie l badań klinicznych pokazano, że szczep χ3927 był osłabiony w porównaniu ze szczepem dzikim lecz nie dostatecznie osłabiony, aby służyć jako żywa szczepionka doustna dla ludzi, bowiem badani którym ją podano mieli wysoką temperaturę i objawy podobne do objawów tyfusu (Tacket i wsp. (1992b), powyżej). Szereg badanych ujawniło również bezobjawowe infekcje poszczepienne Tacket i wsp. (1992b), powyżej).
Dla uzyskania znaczniejszej atenuacji wprowadzono trzecią mutację, typu delecja, do cdt u cya-, crp- mutanta χ3927 (Curtis i wsp. (1994 powyżej). Gen cdt ma wpływ na rozsiewanie Salmonella z tkanki limfoidalnej zwią zanej z jelitem do głębszych organów systemu retikuloendotelialnego takiego jak wątroba, śledziona i szpik kostny (Kelly i wsp., Infect. Immun., 60:4881-4890 (1992)). Uzyskany szczep potrójnego mutanta cya-, crp-, cdt- χ3927 był podany w pokarmie zdrowemu dorosłemu mieszkańcowi Ameryki Północnej z buforem w pojedynczych dawkach zawierających 5,0 x 105, 5,0 x 106, 5,0 x 107 lub 5,0 x 108 cfu (Tacket i wsp. (1997), powyżej). Szczep był dobrze tolerowany z wyją tkiem jednego osobnika z grupy, która otrzymał a 5,0 x 107 cfu, u którego pojawił a się biegunka (Tacket i wsp., (19097), powyżej). U żadnego osobnika nie pojawiły się bezobjawowe infekcje poszczepienne. Czterech z pięciu osobników, którym podano w pokarmie 5,0 x 108 cfu, wykazało znaczący wzrost w surowicy przeciwciała IgG O i posiadało ASC wytwarzające przeciwciało IgG O (Tacket i wsp. (1997), powyżej).
G. Szczepy z mutacjami w phoP i phoQ.
Skonstruowano dwa szczepy kandydatów S. typhi niosące delecje w phoP/phoQ (Hohmann i wsp. (1996a), i Hohmann i wsp., Vaccine, 14:19-24 (1996b). Stwierdzono, ż e szczep Ty 445, który niesie również delecje w aroA, był nadmiernie osłabiony i tylko nieznacznie immunogenny(Hohmann i wsp. (1996b), powyżej). Przeciwnie, szczep Ty800 będ ący pochodną Ty2 posiadający delecję w phoP, phoQ był ogólnie dobrze tolerowany i immunogenny, gdy oceniano go w dawkach od 107 do 1010 cfu w małych klinicznych badaniach Fazy 1 obejmujących 11 osobników (Hohmann i wsp. (1996b), powyżej). Przy największych dawkach jeden z trzech szczepionych osobników miał biegunkę (10 luźnych stolców). Trudno jest porównać odpowiedź immunologiczną osobników, którzy otrzymali Ty800 z tymi obserwowanymi u biorców CVD 908-htrA i χ4073, bowiem niektóre z technik oznaczeń immunologicznych były różne i nawet gdy zastosowano to samo oznaczenie (np., IgA ASC, które wytwarzają przeciwciało O), występują znaczące różnice między laboratoriami.
PL 192 378 B1
H. Podsumowanie
CVD 906 jest dobrze tolerowany lecz towarzyszą mu bezobjawowe infekcje poszczepienne występujące u około 50% badanych, którym podano drogą pokarmową dawkę 107 cfu. Łagodną, lecz wyraźną biegunkę obserwowano u 10% badanych, którzy przyjęli drogą pokarmową CDV 908-hrtA, TY800 lub χ4073. Odpowiedź immunologiczna na χ4073 była mniejsza niż obserwowana po doustnej immunizacji przy pomocy CVD 908, CVD 908-htrA i czasami Ty800 (patrz tabela 1, powyżej). Tak więc pomimo, że istnieją cztery atenuowane szczepy S. typhi, które przeszły pełną Fazę 1 badań klinicznych, każdemu towarzyszy co najmniej jeden efekt uboczny, co jest wystarczające, aby rozważyć opracowanie dalszych szczepów S. typhi użytecznych jako szczepionka. Co więcej, żaden z tych czterech szczepów nie wywoływał powstania surowiczego przeciwciała klasy IgG przeciw Vi, o których wiadomo, że są związane z ochronną odpowiedzią odpornościową.
VI. Zastosowanie atenuowanych szczepów Salmonella jako żywych szczepionek wektorowych do ekspresji obcych genów kodujących ochronne antygeny z innych patogenów i dostarczenie tych antygenów do układu odpornościowego.
Żywe wektory szczepionek nazywane również „nośnikami szczepionek lub „żywymi systemami dostarczającymi antygeny obejmuje ekscytującą i szeroką dziedzinę nauki o szczepionkach (Levine i wsp., Microecol. Ther. 19:23-32 (1990); Morris i wsp., Gastroenterol. , 103: 699-702, (1992); Barletta i wsp., Res. Microbiol., 141:931-940 (1990 (Dougan i wsp., Para Immunol., 9: 151-160 (1937) i Curtiss i wsp., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 146: 35-49 (1989)). W tych próbach szczepionka z żywego wirusa lub bakterii jest zmodyfikowana tak, że wyraża ochronne obce antygeny z innego mikroorganizmu i dostarcza te antygeny do układu odpornościowego, a co za tym idzie pobudza ochronną odpowiedź odpornościową. Żywe wektory bakteryjne, które są opublikowane, obejmują między innymi atenuowaną Salmonella (Levine i wsp., (1990), powyżej; Morris i wsp., powyżej; Dougan i wsp., (1989), powyżej), i Curtiss i wsp. (989) powyżej, Bacille, Calmette, Guerin (Barletta i wsp., powyżej), Yersinia enterocolitica (Van Damme i wsp., Gastroenterol., 103: 520-531 (1992)), V. cholerae 01 (Viret i wsp., Mol. Microbiol., 7: 239-252 (1993)) i E. coli (Hale, Res. Microbiol. 141: 913-919 (1990)). Każdy z nich posiada pewne korzystne i pewne niekorzystne właściwości.
Atenuowaną S. typhi jest szczególnie atrakcyjna jako żywy wektor szczepionki dla człowieka, ponieważ jest podawana doustnie, zasiedla związaną z jelitem tkankę limfoidalną, jak również system retikulo-endotelialny wywołując rozległą odpowiedź odpornościową (która obejmuje przeciwciała surowicze, SIgA śluzówki, różnorodne komórki pośredniczące w odpowiedzi odpornościowej obejmującej klasyczny CTL i postać zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej) (Conry i wsp., Gene Therapy, 2: 59-65 (1995); Cox i wsp., J. Virol., 67: 5664-5667 (1993); Davis i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 7213-7218 (1996a); Davis i wsp., Vaccines, 96: 111-116, Brown i wsp., (Wyd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996b); Tacket i wsp., (1992a), powyżej; Gonzalez i wsp., J. Infect. Dis., 169; 927-931 (1994); i Sztein i wsp., (1994), powyżej). Ponadto Salmonellą można łatwo manipulować genetycznie i wiele obcych antygenów było już wyrażanych w tych bakteriach. W teorii jedną dawkę szczepionki doustnej przeciw różnorodnym chorobom infekcyjnym można uzyskać przez stabilne wprowadzenie i wyrażenie obcych genów kodujących ochronne antygeny w dobrze tolerowanym i wysoce immunogennym żywym szczepie wektorowym S. typhi (Levine i wsp. (1990), powyżej).
VII. Salmonella z mutacjami w genach szlaku metabolizmu puryny
A. Wcześniejsze doniesienia o szczepach Salmonella z mutacjami w szlaku metabolizmu puryny
Mutacje w genach purA i purB u Salmonella (zaburzające syntezę de novo nukleotydów adeninowych (patrz fig. 2) są wysoce atenuujące(McFarland i wsp., Microb. Pathogen., 3: (129-141 (1987)) tak, że szczepy te nie są ochronne u zwierzęt (O'Callaghan i wsp., Infect.Immun., 56: 419-423 (1988) i są sł abo immunogenne u człowieka (Levine i wsp., (1987b), powyż ej). Przeciwnie mutacje w kilku genach uczestniczących w podstawowym szlaku puryn (np. purF, purG, purC, purHD), które zaburzają biosyntezy obu nukleotydów purynowych (patrz fig. 2) lub w guaB lub guaA, które zaburzają biosyntezę nukleotydów guaninowych (fig. 2), o których donoszono, że w znacznie mniejszym stopniu atenuują bakterie (McFarland i wsp., powyżej), rzeczywiście takie szczepy wywołują śmierć myszy, gdy podane są w dawkach tak małych jak 102 cfu (McFarland i wsp., powyżej).
Obserwacje, których przeglądu dokonano powyżej, sugerują, że:
(i) mutacje dotyczące enzymów z podstawowego szlaku puryn w małym stopniu atenuują bakterie (McFarland i wsp., powyżej), a (ii) mutacje odległe od wspólnego szlaku i wpływają na syntezę nukleotydów adeninowych atenuują bakterie nadmiernie (tzn. purA, purB) (McFarland i wsp., powyżej; O'Callaghan i wsp., powyżej;
PL 192 378 B1 i Levine i wsp., (1987b) powyżej), ale odleglejsze mutacje wpł ywające na syntezę nukleotydu guaninowego tylko w niewielkim stopniu osłabiają bakterie (McFarland i wsp., powyżej).
B. Nieoczekiwane i wyjątkowe obserwacje w obecnym wynalazku
Opierając się na opublikowanych obserwacjach, które przedstawiono powyżej nieoczekiwanie stwierdzono, że swoiste auksotrofy gua w S. typhi powodują znaczną atenuację bakterii. Atenuacja ta przypuszczalnie zależy częściowo od obniżonej inwazyjności (właściwość, która wcześniej nie była opisywana dla innych Salmonella spp., z mutacjami atenuującymi w genach ze szlaków metabolicznych), jak również od obniżonej częstości replikacji wewnątrzkomórkowej mutantów ΔguaB-A S. typhi. Stwierdzenie to było nieoczekiwane, bowiem S. dublin i S. typhimurium niosą wywołaną przez Tn5 mutację insercyjną wpływającą na syntezę nukleotydu guaninowego, odnośnie której donoszono, że powoduje jedynie minimalną atenuację (McFarland i wsp., powyżej). Ponadto, innym nieoczekiwanym stwierdzeniem było, że pomimo wysokiego stopnia atenuacji ΔguaB-A S. typhi., szczep CVD915, który został tu opisany, jest bardzo immunogenny w mysim modelu zwierzęcym. Obserwacja ta jest nieoczekiwana w świetle wcześniejszych doniesień, w których silnie atenuowane szczepy z mutacjami inaktywującymi purA i purB były bardzo słabo immunogenne (Edward i wsp., powyżej). Również inną nieoczekiwaną obserwacją było, że szczep CVD915 wywoływał zaskakującą odpowiedź odpornościową na zrekombinowany antygen wyrażany w tym samym atenuowanym szczepie. Obserwacja ta jest nieoczekiwana w świetle wcześniejszych doniesień, w których obserwowano, że wysoce atenuowane szczepy są słabymi żywymi wektorami dla zrekombinowanych heterologicznych antygenów (Tacket i wsp., (1997), powyżej). Ponadto szczep CVD915 był zdolny do dostarczenia eukariotycznego wektora ekspresyjnego kodującego obcy, zrekombinowany antygen (szczepionka DNA) i wywoływania zdumiewającej odpowiedzi odpornościowej. Zdolność dostarczania plazmidowego, eukariotycznego wektora ekspresyjnego była opisana dla atenuowanych wektorów Shigella (Sizemore i wsp., Science, 270: 299-302 (1995)); i atenuowanych wektorów Salmonella typhimurium (Darji i wsp., Cell, 91: 765-775 (1997)). Shigella ssp. są organizmami inwazyjnymi i ich powodzenie w dostarczaniu szczepionki DNA wydaje się być wtórnym wobec faktu, że porzucają one fagosom bezpośrednio po zarażeniu (Sansonetti i wsp., Infect. Immun., 51: 461-469 (1986)). Jednak, Salmonella nie opuszcza fagosomu po inwazji. Co za tym idzie, obserwacja prezentowana tutaj jest nieoczekiwana w świetle wcześniejszych poglądów i jest wyjątkowa. Podsumowując, w obecnym wynalazku zastosowany został sposób genetycznej zmiany atenuowanej Salmonella dla uzyskania konstytutywnej i stabilnej ekspresji antygenu Vi. Ponadto, mutanty Salmonella z obecnego wynalazku korzystnie są również atenuowane przez mutacje w de novo szlaku metabolizmu guaniny.
Atenuowany mutant Salmonella, według wynalazku konstytutywnie wyraża antygen Vi a promotor vipR w mutancie jest zastąpiony konstytutywnym promotorem, tak że powoduje konstytutywną ekspresję viaB.
Korzystnie atenuowany mutant jest mutantem Salmonella typhi. Korzystniej mutant Salmonella typhi pochodzi z rodzicielskiego Salmonella typhi CVD 915 (ATCC No 202115).
Korzystnie mutantem Salmonella jest CVD 916 (ATCC Nr 202116) lub Salmonella typhi CVD 909 (ATCC Nr 202117).
Korzystnie atenuowany mutant koduje i wyraża obcy antygen.
Korzystnie atenuowany mutant zawiera plazmid, który koduje i wyraża obcy antygen w komórce eukarionta.
Korzystnie promotor vipR w mutancie jest zastąpiony promotorem wybranym z grupy składającej się z Ptac, Ptrc, POlac i PIpp tak, aby powodować konstytutywną ekspresję viaB.
Korzystnie atenuowany mutant ma mutację w operonie guaB-A, z powodu której jest niezdolny do tworzenia de novo nukleotydów guaninowych. Bardziej korzystnie mutacja w operonie guaB-A jest delecją i delecja ta jest w genie guaA, genie guaB lub w obu genach guaA i guaB, najkorzystniej zarówno w genie guaA jak i guaB.
Najbardziej korzystnie atenuowany mutant ma fenotyp aro-.
W zakres wynalazku ponadto wchodzi szczepionka przeciw durowi brzusznemu, która zawiera:
(A) farmaceutycznie skuteczną ilość atenuowanego mutanta Salmonella typhi, który konstytu tywnie wyraża antygen Vi, i w którym promotor vipR jest zastąpiony konstytutywnym promo torem, powodując konstytutywną ekspresję viaB; i (B) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.
Korzystnie w szczepionce w mutancie promotor vipR jest zastąpiony promotorem wybranym z grupy składającej się z Ptacr, Ptrc, POlac i PIpp, powodowodując konstytutywną ekspresję viaB. Korzyst12
PL 192 378 B1 niej mutant ma mutację w operonie guaB-A, z powodu której jest niezdolny do tworzenia de novo nukleotydów guaninowych. Bardziej korzystnie mutacja w operonie guaB-A jest delecją, która jest w genie guaA, genie guaB lub w obu genach guaA i guaB, najkorzystniej delecja występuje zarówno w genie guaA jak i w genie guaB. Najbardziej korzystnie mutant ma fenotyp aro-.
Krótki opis rysunków.
Na figurach 1A-1B przedstawiono operon viaB i schematycznie przedstawiono wymianę osmotycznie regulowanego promotora typu dzikiego vipR w operonie viaB przez kasetę sacB-Neo (fig. 1A) i wymianę wstawionej kasety i sacB-Neo przez silny konstytutywny promotor Ptac celem uzyskania konstytutywnej ekspresji antygenu Vi (fig. 1B).
Figura 2 przedstawia szlak biosyntezy de novo puryn i udział szlaku metabolicznego związków aromatycznych. Na figurze 2 przerywane strzałki ilustrują szlak metaboliczny, w którym poszczególne etapy nie są opisane. Enzymy są przedstawione przez kodujące je geny. Superskriptem opisane są wybrane szczepy z mutacjami w genie zaangażowanym w tej reakcji. Przedstawione są szczepy: a: purF1741::Tn10 S. dublin SL5437 (McFarland i wsp., powyżej); b: purG876:: Tn10 S. dublin SL5436 (McFarland i wsp., powyżej); c: purC882: : Tn10 S. dublin SL5435 (McFarland i wsp., powyżej); d: purH887:: Tn10 S. dublin SL2975 (McFarland i wsp., powyżej); e: ΔguaB-A S. flexneri 2a CVD 1204 i ΔguaB-A, ΔvirG S. flexneri 2a CVD 1205 (Noriega i wsp.,, Infect. Immun., 64: 3055-3061 (1996)) i ΔguaB-A Salmonella typhi CVD 915 (obecny wynalazek); f: aroD25:: Tn10 S. flexneri Y SFL114 (Lindberg i wsp., (1990) powyżej), SFL 124 (Lee i wsp., powyżej), S. flexneri 2a 1070 (Karnell i wsp., (1995), powyżej); g: ΔaroC, ΔaroD S. typhi CVD 908 (Hone i wsp. (1991), powyżej); h: hisG46 DEL407, aroA554:: Tn10 S. typhimurium SL3261 (Hoiseth i wsp., powyżej); i: ΔaroA S. flexneri 2a CVD 1201 i ΔaroA, ΔvirG CVD 1203 (Noriega i wsp., Infect. Immun., 62: 5168-5172 (1995) i j: ΔaroA, ΔhisG, ΔpurA S. typhi 541 Ty (Levine i wsp. (1987b), powyżej). Na figurze 2 skróty mają następujące znaczenia: PRPP: 5-fosforybozylo-e-1-pirofosforan; PRA: 5-fosforybozyloamina; GAR: 5'-fosforybozylo-lglicynoamid; FGAR: 5'-fosforybozylo-N-formyloglicynamid; FGAM: 5'-fosforybozylo-N-formyloglicynoamid; AIR: 5'-fosforybozylo-5-aminoimidazol; CAIR: kwas 5'-fosforybozylo-5-aminoimidazolo-4-karboksylowy; SAICAR: 5'-fosforybozylo-4-(N-sukcynylokarboksyamido)-5-aminoimidazol; AICAR: 5'-fosforybozylo-4-karboksamido-5-aminoimidazol; FAICAR: 5'-fosforybozylo-4-karboksamido-5-formamidoimidazol; IMP: kwas inozynowy; Hx: hipoksantyna; G: guanina i A:adenina.
Na figurze 3A-3G przedstawiono sekwencje DNA kodujące geny guaA i guaB Escherichia coli (SEK ID NR: 1) (GenBank nr dostępu M10101-M10102) (Thomas i wsp., Gene, 36: 45-53 (1965); Tiedeman i wsp., J. Biol. Chem., 260: 8676-8679 (1965); i Tiedeman i wsp., Nucleic Acids Res., 13: 1303-1316 (1985)), które są uznawane za wysoce homologiczne z guaA i guaB z Salmonella spp., podobnie jak pewne miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych przydatne w tworzeniu mutantów delecyjnych według wynalazku.
Na figurze 4 przedstawiono schematycznie orientację operonu guaB-A oraz lokalizację pewnych miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych użytecznych w tworzeniu mutantów delecyjnych według obecnego wynalazku; zamplifikowane przez PCR fragmenty operonu guaB-A i połączone przez PCR fragmenty operonu guaB-A tworzące allel ΔguaB-A. Przedstawione jest również klonowanie operonu arseninowego (ars) w środku allelu ΔguaB-A, w wyniku czego otrzymano kasetę ΔguaB-A :: Ptac -ars. Taka kaseta delecyjna jest następnie klonowana w plazmidzie „samobójcy i wymieniona na dziki allel guaB-A w szczepie Ty2 S. typhi, w wyniku czego otrzymuje się szczep ΔguaB-A S. typhi CVD 915.
Na figurze 5 przedstawiono schematycznie konstrukt pcDNA3/tetC (szczepionka DNA zawierająca gen kodujący fragment C toksyny tężca znajdujący się pod kontrolą promotora ludzkiego wirusa cytomegali (CMV).
Na figurze 6 przedstawiono odpowiedź myszy polegającą na wytworzeniu przeciwciała przeciw fragmentowi C po donosowej immunizacji szczepem ΔguaB-A CVD 915 wyrażającym fragment C toksyny tężcowej lub niosącym eukariotyczną kasetę ekspresyjną kodującą fragment C toksyny tężcowej.
Na figurze 7 przedstawiono proliferację mysich limfocytów jako odpowiedź przeciw fragmentowi C toksyny tężcowej po donosowej immunizacji samym szczepem ΔguaB-A CVD 915 lub jako wektorem wyrażającym fragment C toksyny tężcowej lub niosącym eukariotyczną kasetę ekspresyjną kodującą fragment C toksyny tężcowej.
Na figurze 8 przedstawiono proliferację mysich limfocytów jako odpowiedź skierowaną przeciw wiciom S. typhi po donosowej immunizacji szczepem ΔguaB-A CVD 915 samym lub lub jako wektoPL 192 378 B1 rem wyrażającym fragment C toksyny tężcowej niosącym poza chromosomalną kasetkę ekspresyjną kodującą fragment C toksyny tężcowej.
Na figurze 9 przedstawiono odpowiedź przeciwciała przeciw wiciom S. typhi u myszy po donosowej immunizacji szczepem ΔguaB-A S. typhi CVD 915 lub szczepem ΔaroC, ΔaroD, AhtrA S. typhi CVD 908-htrA.
Na figurze 10 przedstawiono odpowiedź przeciwciała przeciw LPS S. typhi u myszy po donosowej immunizacji szczepem ΔguaB-A S. typhi CVD 915 lub szczepem ΔaroC, ΔaroD, AhtrA S. typhi CVD 908-htrA.
Atenuowana Salmonella według wynalazku jest przeznaczona do użycia, inter alia, jako szczepionka doustna przeciwko durowi brzusznemu, oraz jako żywy wektor i szczepionka DNA-zależna wyrażająca obce antygeny. „Obcy antygen w użytym tu znaczeniu oznacza antygen obcy dla Salmonella.
Korzystnie w obecnym wynalazku, chromosomowy genom Salmonella jest modyfikowany przez zastąpienie wysoce regulowanego promotora vipR przez silnie konstytuowany promotor, dzięki czemu ekspresja antygenu Vi w atenuowanej Salmonella jest konstytutywna i stabilna. Szczególny konstytutywny promotor stosowany w obecnym wynalazku nie jest krytyczny. Przykłady takich konstytutywnych promotorów zawarte są w Ptac (de Boer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., 80:21-25 (1983)), P1ac (De Boer i wsp., powyżej), Ptrc (De Sutter i wsp., Gene, 141:163-170 (1994)), P01ac i P1PP (De Sutter i wsp., powyżej; i Guisez i wsp., Protein Expr. Purif., 2:249-258 (1998)).
Szczególny S. typhi użyty jako materiał wyjściowy w obecnym wynalazku nie jest krytyczny.
Szczepionka S.typhi według przykładów została skonstruowana z dzikiego typu S.typhi szczep Ty2.
S.typhi Ty2 jest dobrze znanym wirulentnym szczepem Salmonella dostępnym z różnych źródeł, takich jak CVD, Centers for Disease Control (CDC), Walter Reed Army Institute of Research, Uniformed Services Uniwersity of the Health Sciences, Institut Pasteur (Francja), Imperiał College (Anglia).
Inne dzikie szczepy S. typhi, które zostały użyte w rozwoju atenuowanych kandydatów na szczepionkę, i które mogą być użyte jako materiał wyjściowy w obecnym wynalazku obejmują: szczep CDC1080 (Levine i wsp. (1987b), powyżej), który można otrzymać z Uniwersytetu Stanford lub z CDC, i szczep ISP1820 (Hone i wsp. (1991), powyżej), który można otrzymać z Center for Vaccine Development, Uniwersytet Maryland.
Korzystnie, w obecnym wynalazku, genom chromosomowy Salmonella jest modyfikowany przez usunięcie lub modyfikowanie w inny sposób operonu guaB-A i dzięki temu blokowanie biosyntezy de novo nukleotydów guaninowych. Korzystniej, określona, w ramce, niepolarna mutacja w operonie guaB-A inaktywuje enzymy szlaku metabolicznego puryny IMP dehydrogenazę (kodowaną przez guaB) i syntetazę GMP (kodowaną przez guaA). W konsekwencji tych mutacji Salmonella są niezdolne do syntezy de novo GMP i w konsekwencji, nukleotydów GDP i GTP (patrz fig. 2), co poważnie ogranicza jej wzrost w tkankach ssaków. In vitro, mutanty Salmonella ΔguaB-A według wynalazku są niezdolne do wzrostu w pożywce minimalnej, jeżeli nie zawiera guaniny. W hodowlach tkankowych stwierdzono, że mutanty ΔguaB-A Salmonella według wynalazku wykazują znaczące ograniczenie ich zdolności do inwazji. Mutanty Salmonella ΔguaB-A mogą wyciągać nukleotydy guaninowe z tkanek gospodarza będącego ssakiem. Jednak, ich włączenie do Salmonella wymaga ich uprzedniej defosforylacji do nukleozydów przez peryplazmatyczne nukleotydazy, aby mogły być włączone jako prekursory nukleotydów w szlak odzyskiwania guaniny. Dlatego, ponieważ nukleotydy są łatwo dostępne w środowisku wewnątrzkomórkowym ssaczego gospodarza, atenuacja zależna od syntezy de novo nukleotydów guaninowych jest spowodowana niewydolnością szlaku odzyskiwania lub przyczynami obecnie nieznanymi.
Gen guaA, który koduje syntetazę GMP, ma wielkość 1575 par zasad (patrz fig. 3A-3G). Dlatego wielkość inaktywującej, wewnątrzcistronowej delecji w mutancie guaA może mieścić się w zakresie od 1 do 1575 par zasad, korzystnie od 100 do 1575 par zasad, jeśli delecja jest w ramce. Delecja może również roziągać się poza gen guaA, np. poza cistronowa delecja poniżej guaA, np. poza cistronowa delecja poniżej guaA może wpływać na transkrypcję tego genu a co za tym idzie inaktywować go. Jednak taka delecja nie jest korzystna.
Gen guaB, który koduje dehydrogenazę IMP ma wielkość 1533 par zasad (patrz fig. 3A-3G). Dlatego wielkość wewnątrz cistronowych delecji w mutancie guaB może wynosić od 1 pary zasad do 1533 par zasad, korzystnie od 100 do 1533 par zasad, jeśli delecja jest w ramce. Delecja może rów14
PL 192 378 B1 nież rozciągać się poza gen guaB, np. pozacistronowa delecja poniżej guaA może wpływać na transkrypcję obu genów (guaB i guaA), i co za tym idzie inaktywować je. Jednakowoż ta ostatnia nie jest korzystna.
Delecje w genie guaA mogą być wytworzone przy pomocy 2 miejsc dla enzymów restrykcyjnych zlokalizowanych w genie guaA; ich przykładami są Scal lub AccI i EcoRV lub Sall lub Smal lub Sphl lub Xmal (fig. 3A-3G i fig. 4), lub przez ukierunkowaną mutagenezę przy pomocy oligonukleotydów (Sambrook i wsp., w: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd., Colt Spring Harbor Publications (1989)).
Delecja w genie guaB może być wytworzona przy pomocy dwóch dogodnych miejsc dla enzymów restrykcyjnych zlokalizowanych w genie guaB; ich przykładami są Bcll i BsmI lub EcoRI lub PvuII lub SacII lub Sspl lub XhoII (fig. 3A-3G i fig. 4) lub przez ukierunkowaną mutagenezę przy pomocy oligonukleotydów (Sambrook i wsp., powyżej).
Ponadto dla uzyskania mutantów delecyjnych według wynalazku może być zastosowana dowolna kombinacja miejsc restrykcyjnych zlokalizowanych równocześnie w genach guaB i guaA; ich przykłady obejmują Acclll, AflIII, Ahll, AlwI, AlwNI, AsuI, BanI, BcnI, Bsp1286, BspMIl i Ddel (fig. 3A-3G).
Unieczynnienie genu guaA i/lub genu guaB może być również uzyskane przez insercję obcego DNA w którekolwiek z wyżej wspomnianych miejsc restrykcyjnych lub przez ukierunkowaną mutagenezę przy pomocy oligonukleotydów (Sambroook i wsp., powyżej) tak, żeby zaburzyć prawidłową transkrypcję guaB i/lub guaA. Zazwyczaj wielkość insercji, która może inaktywować gen guaA i gen guaB wynosi od 1 pary zasad do 100 tysięcy par zasad, choć insercje mniejsze niż 100 tysięcy par zasad są korzystne. Insercja może być wykonana gdziekolwiek wewnątrz regionu kodującego genu guaA lub genu guaB lub pomiędzy kodującymi regionami i promotorem.
Innymi sposobami inaktywacji genu guaA i/lub genu guaB jest przeniesienie do Salmonella delecji lub insercji wytworzonych w genach guaA lub guaB innych enterobakterii, delecje wytworzone przy pomocy transpozonu i niedokładne wycięcie insercji DNA. Dwie ostatnie metody najprawdopodobniej doprowadzają do powstania delecji rozciągających się poza gen guaA lub guaB, a co za tym idzie nie są one korzystne.
Mutanty gua według wynalazku są użyteczne do uzyskania niereaktywnych Salmonella będących kandydatami na żywą szczepionkę doustną.
Można skonstruować Salmonella będące kandydatami na szczepionkę które oprócz innych atenuujących mutacji mają zahamowaną ekspresję genu aro. Mogą być one uzyskane przez delecje części co najmniej jednego z genów aro (aroA, aroC lub aroD) w chromosomie Salmonella warunkującym auksotrofię szczepu na PABA, substratu który nie może być usunięty w komórce ssaka, tak, jak ma to miejsce w przypadku Salmonella typhi szczepu CVD908 (Hone i wsp. (1991), literatura).
Szczególny obcy antygen zastosowany w żywym wektorze Salmonella nie jest krytyczny dla obecnego wynalazku. Atenuowane szczep(y) według wynalazku mogą być zastosowane jako żywe wektor(y) do immunizacji przeciw pasożytom jelitowym (patogeny określone jako bakteryjne, wirusowe, itp.), chorobom wywołanym patogenami przekazywanymi drogą płciową, ostrym chorobom dróg oddechowych wywołanym patogenami lub patogenem śluzówki, które powodują ciężkie, układowe objawy chorobowe (np. choroby wywołane przez meningokoki). Mogą być one również użyte do ochrony przed różnego rodzaju infekcjami wywołanymi przez pasożyty takie jak Plasmodium falciparum, gatunki Leishmania, Entameba histolytica i Cryptosporidium.
Przykłady antygenów z pasożytów jelitowych, które mogą być wyrażane w żywych wektorach Salmonella według wynalazku obejmują:
(a) fimbrialne czynniki do kolonizacji wytwarzających enterotoksyny E. coli i zarówno podjenostka B termowrażliwej enterotoksyny lub zmutowana, termowrażliwa enterotoksyna (która nie powoduje wydzielania w jelicie lecz pobudza neutralizację antytoksyny);
(b) fimbrialne antygeny i/lub itymina jelitowych krwotocznych E. coli razem z B podjednostką toksyny 1 lub 2 z Shiga (lub toksyny 1 lub 2 z mutanta Shiga);
(c) Antygeny O z Shigella i antygeny plazmidu inwazyjnego lub VirG z Shigella;
(d) Antygeny zobojętniające z rotawirusów;
(e) Ureazę, antygeny odpowiedzialne za kolonizację i inne antygeny ochronne z Helicobacter pylori i (f) Inaktywowane toksyny Clostridium difficile lub pochodzące od nich antygeny
PL 192 378 B1
Przykłady antygenów z patogenów przenoszonych drogą płciową, które mogą być wyrażane w ż ywych wektorach Salmonella wed ług wynalazku obejmują:
(a) pili i inne białka błonowe z Neisseria gonorrhoae i (b) białka z Chlamydia trachomatis.
Przykłady antygenów z patogenów wywołujących ostre choroby układu oddechowego, które mogą być wyrażane w żywych wektorach Salmonella według wynalazku obejmują:
(a) zmutowaną toksynę błonicy z podstawieniem w domenie wiążącej NAD, co powoduje utratę aktywności toksyny i powoduje wytwarzanie neutralizujących antytoksyn;
(b) antygeny z Bordetella pertussis, włącznie z białkiem fuzyjnym składającym się ze skróconej podjednostki S1 toksyny krztuśca połączonej z fragmentem C toksyny tężca, zmutowana toksyna krztuśca, filamentalna hemaglutynina i pertaktyna;
(c) glikoproteiny F i G z syncytialnego wirusa układu oddechowego;
(d) polisacharydu otoczki Haemophilus influenzae typu b (e) polisacharydy typu A i typu C z otoczki Neisseria meningitidis i zewnętrzne białka błonowe z grupy B z N. meningitidis
Przykłady antygenów z pasożytów, które mogą być wyrażane w żywych wektorach Salmonella według wynalazku obejmują:
(a) białko wokółsporozoidowe (CSP), antygen spichrzeniowy-1 wątroby (LSA-1), SSP-2 (znane również jako TRAP) i Exp-1 z Plasmodium falciparum;
(b) antygeny erytrocytarnego stanu aseksualnego P.falciparum obejmujące MSP-1, MSP-2, SERA, AMA-1 i SREHP;
(c) antygeny stadium płciowego P. falciparum obejmujące Pfs25 i gp63 z gatunków Leishmania i (d) bogate w serynę białko Entameba histolytica (SREHP).
Szczegóły jak skonstruować i używać szczepionkę DNA mogą być znalezione w zgłoszeniach patentowych U.S. Nr Serii 08/433,790 złożonych 3 maja 1995, który jest włączony w całości przez cytowanie.
Szczególny, obcy DNA użyty w szczepionce DNA nie jest krytyczny. Przykłady takich patogenów obejmują te, pochodzące z różnorodnych patogenów takich jak grypa (Justewicz i wsp., J.Virol., 69: 7712-7717 (1995); i Fynan i wsp., int. J. Immunopharmacol., 17: 79-83 (1995)), limfocytarny wirus zapalenia błon płodowych (Zarozinski i wsp., J.Immunol., 154: 4010-4017 (1995)), wirus nabytego zespołu niedoboru odporności (Shiver i wsp., Ann. NY. Acad.Sci., 772: 198-208 (1995), wirus zapalenia wątroby typu B (Davies i wsp., Vaccine, 12: 1503-1509 (1994)), wirus zapalenia wątroby typu C (Lagging i wsp., J.Virol., 69; 5859-5863 (1995)), wirus wścieklizny (Xiang i wsp., Virology, 209: 569-579 (1995)), Schistosoma (Yang i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun., 212: 1029-1039 (1995)), Plasmodium (sedegah i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 9866-9870 (1994)); i Mycoplasma (Barry i wsp., Nature 377: 632-635 (1995)).
Decyzja czy wyrażać obcy antygen w Salmonella (używając prokariotycznego promotora w szczepionce z ż ywego wektora) lub w komórkach zarażonych przez Salmonella (uż ywają c eukariotycznego promotora w szczepionce DNA) może opierać się na tym, która szczepionka daje najlepszą odpowiedź immunologiczną dla określonego antygenu w badaniach na zwierzętach lub w badaniach klinicznych i/lub czy glikozylacja antygenu ma zasadnicze znaczenie dla jego ochronnej immunogenności i/lub czy uzyskanie prawidłowej trzeciorzędowej struktury antygenu jest lepsze przy jednej postaci jego ekspresji niż przy innej.
W szczepionkach wedł ug obecnego wynalazku, podawana farmaceutycznie skuteczna ilość mutanta według wynalazku może się różnić zależnie od wieku, wagi i płci osobnika i sposobu podania. Ogólnie stosowane dawki będą wynosiły około 102 cfu do 1010 cfu.
Korzystnie około 106 cfu do 109 cfu jest stosowane przy podaniu doustnym, gdzie szczepionka jest podawana w kapsułkach lub zawieszona w zbuforowanym roztworze aby ochronić atenuowane bakterie przed kwaśnym pH żołądka lub jest stosowana w ilości około 102 cfu do 107 cfu przy podaniu donosowym, w którym bakterie są podane w kroplach lub w aerozolu.
Szczególny stosowany farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik, nie są krytyczne dla obecnego wynalazku i są typowe w technice farmaceutycznej. Przykłady rozcieńczalników obejmują: bufory do buforowania kwasów żołądkowych w żołądku takie, jak bufor cytrynianowy (pH 7,0) zawierający sacharozę, bufor węglanowy (pH 7.0) bez uzupełnień (Levine i wsp., (1987b) powyżej i Black i wsp., powyż ej) lub bufor węglanowy (pH 7,0) zawierający kwas askorbinowy, laktozę i ewen16
PL 192 378 B1 tualnie aspartam (Levine i wsp.,Lancet, II: 467-470)). Przykłady nośników obejmują: białka, np. jakie znajdują się w odtłuszczonym mleku; cukry np., sacharozę lub poliwinylopirolidon.
Mutanty według wynalazku mogą być przechowywane w -70°C, gdy są zawieszone w pożywce Luria (DIFCO) zawierającej 30 do 50% obj. glicerolu.
Poniższe przykłady są podane tylko w celu zilustrowania propozycji i w żaden sposób nie ograniczają zakresu obecnego wynalazku.
P r z y k ł a d 1.
Konstrukcja szczepów ΔguaB-A S. typhi
A. Konstrukcja kasety delecyjnej ΔguaB-A w pJW101
Metodą PCR zamplifikowano fragmenty DNA obejmujące 5' koniec genu guaB i 3' koniec genu guaA stosując jako matrycę genomowy DNA S. typhi szczepu Ty2 a następnie łączono je w kolejnej reakcji PCR uzyskując allele ΔguaB-A (fig. 4). Sposoby użyte w konstrukcji allelu ΔguaB-A były analogiczne do opisanych dla konstrukcji allelu ΔguaB-A w ΔguaB-A S.flexneri 2a szczepu CVD 1204 (Noriega i wsp. (1996), powyżej i w zgłoszeniu patentowym USA nr serii 98/629,600, złożonego 9 kwietnia 1996 (obecnie dopuszczonego), które jest włączone tutaj w całości przez cytowanie).
W pierwszej reakcji PCR (fig. 4) starterami użytymi do amplifikacji 5' końca allelu guaB-A były:
5'-CGAGCTCGCGAGCTCGGTAAAGTACCAGTGACCGGAAGCTGGTTGCGT-3' (Sek. Id.D Nr: 2) i
5'GGGCCCGGGGGATCCTCAACCGACGCCAGTCACGATACGAGTTGTACAGAT-3' (Sek. Id. Nr: 3) i startery użyte dla amplifikacji 3' końców allelu ΔguaB-A były:
5'-TGAGGATCCCCCGGGCCCGGCTACGCGCAGGTTGAAGTCGTAAACGACAGC-3' (Sek. Id. Nr:4) i
5'-GCTCTAGAGCTCTAGAGCTCATTCCCACTCAATGGTAGCTGGCGGCTT-3' (Sek. Id. Nr: 5).
W obrębie wewnętrznych starterów (Sek. Id. Nr: 3 i 4) wprowadzono w ramce kodon stop (TGA i TCA) powyżej dwóch unikalnych miejsc dla enzymów restrykcyjnych (Apal i BamHI) (podkreślone), które dodano w celu wprowadzenia obcych genów do znajdującego się na chromosomie allelu ΔguaB-A. Sygnał stop zapobiega powstaniu translacyjnej fuzji produktów ΔguaB z ΔguaA lub produktu ΔguaB z produktami obcych genów, wbudowanymi w środku allelu ΔguaB-A. Dodatkowo te wewnętrzne startery wprowadzają sekwencje, które służą jako region homologiczny (wytłuszczone), w obrębie którego dochodzi do fuzji produktów PCR uzyskanych dla 5' i 3' końców, do której dochodzi w czasie drugiej reakcji PCR (w ten sposób tworzony jest allel ΔguaB-A) (fig. 4).
W drugiej reakcji PCR 5' i 3' segmenty są łączone przy pomocy zewnętrznych starterów (Sek. Id. Nr: 2 i 5) i uzyskany produkt fuzji jest amplifikowany w tej samej reakcji. W reakcji tej dane regiony homologiczne (Apal-BamHI) łączą się ze sobą skutecznie łącząc 5' i 3' segmenty, które w tym samym momencie mogą działać jako startery dla samych siebie i/lub matryce dla polimerazy Taq w zależności od tego, które nici DNA są przyłączane. Dla ułatwienia takiej fuzji zaprojektowano program PCR w którym pierwsze 15 cykli ma przebieg temperatury przyłączania (1°C/6 sek. od 40°C do 50°C + + 50°C przez 2 min. A następnie 15 cykli z temperaturą przyłączania starterów 55°C w czasie których amplifikowany był nowy allel ΔguaB-A. W ten sposób nie jest amplifikowane 900 par zasad operonu guaB-A dając ΔguaB-A (fig. 4).
Zewnętrzne startery (Sek. Id. Nr: 2 i 5) były zaprojektowane, aby wprowadzić unikalne sekwencje dla enzymów restrykcyjnych (Sstl i Xbal) (podkreślone), których użyto do wklonowania allelu ΔguaB-A w unikalne miejsca restrykcyjne w termowrażliwym, opartym na pSC101 (Blomfield i wsp., Mol. Microbiol., 5:1447-1457 (1991)) samobójczym plazmidzie pFM307A, pozwalającym otrzymać plazmid pFM307:: ΔguaB-A. Plazmid FM307A (6,3 tysięcy par zasad) został skonstruowany przez podstawienie fragmentu Nael-Nael o wielkości 4,3 tysięcy par zasad zawierającym gen cam (odporność na chloramfenikol) w plB307 (Blomfield i wsp., powyżej) fragmentem BamHI-BamHI o wielkości 3,8 tysięcy par zasad (końce wytępione polimerazą Klenow'a) zawierającym kasetę SacB-Kan (warunkującą oporność na kanamycynę i selekcję negatywną na sacharozę) z pLB279 (Blomfield i wsp., powyżej). Dodatkowo rozważano jako korzystne wbudowanie niezwiązanego z odpornością na antybiotyk markera selekcyjnego do środka allelu ΔguaB-A celem:
(i) ułatwienia zastąpienia allelem ΔguaB-A sprawnego allelu guaB-A w Ty2 i (ii) dostarczenia markera selekcyjnego, który umożliwiłby identyfikację, w środowisku szczepu stanowiącego szczepionkę.
PL 192 378 B1
A zatem, następnie fragment o wielkości 5,0 tys. par zasad operonu warunkującego oporność na arsen (ars) czynnika R z R773 otrzymanego jako fragment Hindlll z pUM1 (Chen i wsp., J. Bacteriol., 161: 758-763 (1985)) (uzyskany dzięki uprzejmości dr Rosen, Wayne State University, Detroit, MI) i klonowano pod promotorem Ptac do pKK223-3 (Pharmacia, Piscataway, NJ). A zatem, otrzymano segment (z tępymi końcami) Ptac-ars Nael-Dral, który sklonowano w miejsce Apal (tępe końce przy pomocy polimerazy T4) allelu ΔguaB-A w pFM307:: ΔguaB-A, otrzymując pJW101 (fig. 4).
B. Samobójcze mutacje typu delecji wywoływane przez kasetę
PJW101 został użyty dla wprowadzenia allelu ΔguaB-A ::Ptac- ars do szczepu typu dzikiego S. typhi Ty2, przez rekombinację homologiczną, jak to opisali Blomfield i wsp., powyżej; Noriega i wsp., (1995), powyżej i Noriega i wsp. (1996), powyżej z tym wyjątkiem, że w pożywce użytej w czasie procedury znajdował się 6,0 μM arseninu sodu (Sigma).
B. Wyszukiwanie mutantów przy pomocy sond DNA i PCR
Będące kandydatami klony bakterii hodowano przez noc w 37°C uzyskując ziarnisty wzór na płytkach z pożywką Luria uzupełnionych 6,0 μM arseninu sodu lub na pożywce minimalnej. Kolonie rosnące na agarze L uzupełnionym arseninem, lecz nierosnące na pożywce minimalnej, przeniesiono następnie na filtry z bibuły, nr 541 (Whatman, Maidstone, Anglia) i przenoszono jak to opisali Gickuelais i wsp., J. Clin. Microbiol., 20; 2485-2490 (1990), i sondowano przy pomocy wyznakowanego yP32 oligonukleotydu o długości 40 par zasad:
5'-GGGCGGCCTGCGCTCCTGTATGGGTCTGACCGGCTGTGGT-3' (Sek. Id. Nr: 6) odpowiadającemu wydeletowanej części dzikiego typu allelu guaB-A (kontrola negatywna). Wybrano klony, które nie hybrydyzowały z wyznakowanym yP32 sondą oligonukleotydową 40 pz. Klony guaB-A S. typhi nie mogły rosnąć na pożywce minimalnej z wyjątkiem sytuacji, gdy pożywka była uzupełniona 10 mg guaniny/l. Mutanty delecyjne w operonie guaB-A i insercja Ptac-ars do allelu ΔguaB-A były potwierdzone przez hybrydyzację typu Southern blot z wyznakowanymi P32 operonem ΔguaB-A, operonem ars i wyżej opisanym jako sonda negatywna guaB-A. Arbitralnie wybrano jeden klon S. typhi ΔguaB-A, który nazwano CVD 915. Szczep CVD 915 został złożony w American Type Culture Collection 4 maja 1998 r. pod numerem ATCC No 202115.
Szczep CVD 915 jest rutynowo hodowany na podłożu zawierającym 6,0 μM arseninu sodu, lecz nie uzyskano wzrostu szczepu Ty2 oraz żadnych innych badanych szczepów Salmonella, Shigella lub E.coli na podłożu zawierającym takie stężenie arseninu.
P r z y k ł a d 2
Inwazja i wewnątrzkomórkowy wzrost w hodowlach tkankowych.
Inwazja i wzrost wewnątrzkomórkowy były badane przy użyciu testów chronionych gentamycyną, które przeprowadzono z niewielkimi modyfikacjami w stosunku do metody opisanej uprzednio przez Tartera i wsp., Infect. Immun., 61: 3084-3089 (1993). Krótko, półzlewające się murawki monowarstw komórek Henle 407 na 24-studzienkowej płytce, były zarażane potrójnie w studzienkach szczepem Ty2 typu dzikiego; ΔguaB-A CVD 915; ΔaroC; ΔaroD, CVD 908 lub ΔaroC, ΔaroD, Δhtr CVD 908-htrA w stosunku 50:1 przez 90 min., a następnie poza komórkowe organizmy były zabijane 100 μg/ml gentamycyny przez 30 min, płukane (punkt czasowy 0 godz.), i zaraz potem inkubowane w obecności 20 μg/ml gentamycyny. Po upływie 0 godz., 4 godz. i 22 godz. potrójnie zarażone monowarstwy hodowli tkankowych były lizowane sterylną wodą i seryjne rozcieńczenia tych zawiesin hodowano przez noc, w temperaturze 37°C, na agarze LB wzbogaconym 10 μg guaniny na litr. Wyniki przedstawiono w tabeli 2 poniżej.
T a b e l a 2
Inwazja i wzrost wewnątrzkomórkowy w komórkach Henle 407 Wewnątrzkomórkowe cfua
Szczep | Genotyp | 0 godz. | 4 godz . | 22 godz. |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Ty2 | Typu dzikiego | 6,7x103 | 3,1x104 | 8,8x104 |
CVD 915 | ΔguaB-A | 3,3x102 | 2,9x102 | 2,5x102 |
CVD 908 | ΔaroC | |||
ΔaroD | 5,8x102 | 1,3x103 | 3,5x103 |
PL 192 378 B1 cd. tabeli 2
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
CVD908-htrA | ΔaroC | |||
ΔaroD | ||||
\htrA | 1,3x103 | 3,4x103 | 1,3x103 |
aJednostki tworzące kolonię
Jak pokazano w tabeli 2 powyżej, szczep CVD 915 wykazywał zdolność do inwazji i wzrost wewnątrzkomórkowy znacząco niższy niż wykazywany przez szczep typu dzikiego Ty2, i porównywalny do wykazywanego przez szczep CVD 908-htrA. To znaczy, jak pokazano w tabeli 2 powyżej, w dwóch różnych eksperymentach, szczep Ty2 typu dzikiego S. typhi wydajnie wniknął do komórek Henle 407 i replikował w nich ponad 13 razy, podczas 22-godzinnego okresu. AaroC, ΔaroD szczepu CVD 908 konsekwentnie wytworzyły mniej generacji wewnątrzkomórkowych, tzn. replikowały 6-krotnie w ciągu 22 godzin. Również, jak pokazano w tabeli 2 powyżej, zmutowany szczep ΔguaB-A CVD 915 był znacząco mniej inwazyjny dla komórek Henle, niż jego rodzicielski szczep typu dzikiego lub szczepy CVD 908 i CVD 908 htrA, a także jego wewnątrzkomórkowy wzrost, tzn. 0-razy, był równoważny do obserwowanego w przypadku mutanta CVD 908-htrA.
P r z y k ł a d 3
Porównanie bezpieczeństwa szczepów Ty21A, CVD 908 i CVD 915, które są kandydatami do szczepionki.
Atenuację szczepu ΔguaB-A S.typhi CVD 915 określano w odniesieniu do szczepu typu dzikiego Ty2 i innych atenuowanych szczepów stosując mysi test świńskiej mucyny (Powell i wsp., J. Biolog. Standar., 8: 79-85 (1980)).
Krótko, myszy zaszczepiano dootrzewnowo różnymi 10-krotnymi rozcieńczeniami różnych szczepów zawieszonych w 0,5 ml 10% (wag./obj.) świńskiej mucyny. Następnie, badano myszy na śmiertelność pojawiającą się po 72 godzinach po zaszczepieniu i dla różnych grup obliczano LD50 przez analizę liniowej regresji. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 3.
T a b e l a 3
Szczep | LD50 wyrażona cfu |
Ty2 | 1,4x102 |
CVD 908 | 4,4x106 |
CVD 915 | 7,7x107 |
Ty21a | 1,9x108 |
Jak pokazano powyżej w tabeli 3 szczep CVD 915 posiada oszacowane LD50, które jest ponad 105 razy wyższe niż otrzymane dla szczepu typu dzikiego Ty2 i mieści się między wartościami otrzymanymi dla szczepu CVD 908 z mutacjami ΔaroC i ΔaroD i zmutagenizowanym chemicznie nieinwazyjnym szczepem TY21a.
P r z y k ł a d 4
Zastosowanie szczepu CVD 915 jako żywego wektora do dostarczania obcych białek i szczepionek z plazmidowego DNA dla wyrażenia obcych antygenów w komórkach eukariontów.
Mysi model immunizacji donosowej przy pomocy zmienionych genetycznie szczepów ΔaroC i ΔaroD S. typhi (CVD 908) niosących fragment C toksyny tężcowej (fragment C z TT), został opisany przez Galen i wsp., Vaccine, 15:700-708 (1997). Konstrukty, które oznaczano w tym układzie modelowym obejmują CVD 908 niosący plazmidy kodujące niesfuzowany fragment C z TT znajdujące się pod kontrolą aktywowanego beztlenowo promotora prokariotycznego pochodzącego z nirB lub silnego konstytutywnego promotora 1pp. Obserwowano, że:
(i) donosowe immunizowanie myszy tym konstruktem prowadzi do wysokiego miana w surowicach neutralizujących przeciwciał klasy IgG przeciw TT;
(ii) immunizowane myszy były chronione przeciw prowokacji stukrotną dawką TT wywołującą 50% śmiertelność u myszy, która zabija wszystkie myszy kontrolne i
PL 192 378 B1 (iii) że komórki uzyskane ze śledziony i szyjnych węzłów chłonnych myszy, immunizowanych donosowo, w 6 tygodni po immunizacji ujawniają znaczącą proliferację w odpowiedzi na S. typhi (Hd wić i cząsteczki z całej komórki S. typhi inaktywowanej fenolem) jak również fragment C z TT i antygeny TT.
Te badania rozszerzono, jak opisano poniżej przez badanie immunogenności u myszy nowych atenuowanych szczepów S. typhi niosących plazmidy zawierające geny kodujące obce antygeny (tj. fragment C z TT) pod kontrolą prokariotycznych lub eukariotycznych promotorów.
A. Odpowiedzi odpornościowe wywołane przez immunizację atenuowanymi szczepami S. typhi niosącymi prokariotyczne i eukariotyczne wektory ekspresyjne kodujące fragment C z TT.
Na podstawie obserwacji, że odpowiedź odpornościowa może być wywołana przez bezpośrednią immunizację plazmidowym DNA (Ulmer i wsp., Science, 259:1745-1749 (1993)), jako szczepionki oszacowano wiele wektorów kwasów nukleinowych kodujących obce antygeny. Pokazano, że szczepienie DNA wywołuje wysoki poziom odpowiedzi odpornościowej zarówno humoralnej jak i komórkowej, gdy stosuje się plazmidy kodujące wiele wirusowych antygenów w tym NP z wirusa grypy typu A (Ulmer i wsp., powyżej). Od czasu tych wczesnych obserwacji jako szczepionki przebadano wiele wektorów kwasów nukleinowych kodujących obce antygeny. Szczególnie szczepienie DNA było bardzo dokładnie badane przy pomocy antygenów wirusa grypy. Ochronną odpowiedź odpornościową wywołano u myszy (Fynan i wsp., Proc, Natl. Acad. Sci., U.S.A., 90:11478-11482 (1993a); Justewicz i wsp., (1995)), fretek (Webster i wsp., Vaccine, 12: 1495-1498 (1994), kurczaków (Fynan i wsp., DNA Cell Biol., 12:785-789 (1993b) i Fynan i wsp., (1993a), powyżej), i naczelnych nie będących ludźmi (Donnelly i wsp., Nat. Med., 1:583-587 (1995)) po domięśniowym (i.m.) lub doskórnym („strzelba genowa) immunizowaniu eukariotycznymi wektorami ekspresyjnymi kodującymi antygeny wirusa grypy. Przez szczepienie DNA indukowano również w różnych modelach zwierzęcych odpowiedź odpornościową przeciw kilku innym antygenom pochodzącym z innych wirusów (Cox i wsp., powyżej; Davies i wsp., (1996a), powyżej; Donnelly i wsp., powyżej; Lagging i wsp., powyżej; Wang i wsp. Virol., 211:102-112 (1995) i Zarozinski i wsp., powyżej); pasożytów (Doolan i wsp., J. Exp. Med., 183:173917456 (1996); Gardner i wsp., J. Pharm. Sci., 85:1294-1300 (1996); Hoffman i wsp., Vaccine, 12:1529-1533 (1994); Sedegah i wsp., powyżej i Yang i wsp., powyżej); bakterii (Andersen i wsp., Infect. Immun., 64:3168-3173 (1996); Barry i wsp., powyżej; Huygan i wsp., Nat. Med., 2:893-898 (1996); Luke i wsp., J. Infect. Dis., 175:91-97 (1997) i Tascon i wsp.., Nat. Med., 2:888-892 (1996)) i komórek nowotworowych (Conry i wsp., Cancer Res., 54:1164-1168 (1994); Conry i wsp., (1995) powyżej; i Wang i wsp., Human Gene Therapy, 6: 407-418 (1995)). Badania te powiększyły nasze zrozumienie natury odpowiedzi odpornościowej wywołanej przez szczepionki DNA. Przykładowo silna odpowiedź przeciwciała została wywołana u myszy przeciw antygenowi powierzchniowemu z Hepatitis B (HbsAg) po jednokrotnej i.m. immmunizacji plazmidem kodującym ten antygen (Davis i wsp., Hum. Mol. Genet., 2:1847-1851 (1993) i Michel i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92:5307-5311 (1995)). W badaniach tych najwyższe miano IgG obserwowano w 4-8 tygodni po immunizacji i utrzymywało się ono na wysokim poziomie przez 6 miesięcy. Wykazano również, że szczepionki DNA kodujące ten antygen są skuteczne w wywoływaniu przeciwciał i odpowiedzi CTL ograniczonych do klasy I MHC u myszy, które nie reagują na oczyszczone HbsAg (Davis i wsp., (1996b), powyżej i Schirmbeck i wsp., J. Virol., 69:5929-5934 (1995)). Zatem co najmniej w przypadku HbsAg, wykazano, że szczepienie DNA pozwala pominąć genetyczne ograniczenia myszy i wywołać trwalszą odpowiedź odpornościową niż uzyskana w przypadku pozajelitowego podania oczyszczonych białek.
Toksyna tężcowa (TT) jest silną neurotoksyną syntetyzowaną przez Clostridium tetani. Ochronna odporność przeciw tężcowi, u człowieka i u zwierząt koreluje z mianem neutralizujących TT przeciwciał w surowicy (Bizzini, w: Clostridium Tetani, Gyles i wsp. (wyd.), Iowa State University Press, Ames, IA, str. 97-105 (1993) i Habig i wsp., Vaccines and Immunotheraphy (1991)). Zatem, dobrą ochronę przeciw tężcowi można wywołać przez pozajelitową immunizację unieczynnionym TT lub nietoksycznymi pochodnymi. Pomiar mocy takiego preparatu szczepionki jest procedurą dobrze opanowaną i jest opisany przez European and British Pharmacopeias (Costar i wsp., Lancet, 345:949-952 (1995) i Sanchez i wsp., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 89:542-545 (1995)). Poziom przeciwciał przeciw tężcowi jest tradycyjnie określany przez oznaczenie zobojętniania toksyny u myszy. Ostatnio opracowane zostały czułe oznaczenia ELISA, które są mniej czasochłonne i tańsze lecz dobrze korelują z testem zobojętniania toksyny (Manghi i wsp., J. Immunol. Methods, 168:17-24 (1994) i Melville i Smith, w: Diptherie i Tetanus Antitoxins, Wreghitt i wsp., (wyd.), ELISA in the Clinical Microbiology Laboratory, Public Health Laboratory Service, Londyn, strony 136-147 (1990)). Miano przeciwciał
PL 192 378 B1 przeciw toksynie jest zwykle określane w jednostkach (IU)/ml (gdzie 0,1 IU/ml w ludzkiej surowicy jest wystarczające do ochrony przeciw TT) przez porównanie z międzynarodowym standardem surowicy przeciw TT (WHO). W związku z tym siła szczepionki (wyrażona w IU/ml) może być porównana dla różnych preparatów szczepionek przeciw TT. Obecnie szczepionki przeciw tężcowi są wytwarzane przez inaktywację TT z C. tetani przy pomocy aldehydu mrówkowego, co jest procedurą czasochłonną i technicznie wymagającą. Wymaga to natychmiastowego przeprowadzenia badań nad alternatywnymi sposobami detoksyfikacji preparatów TT, aby można było je stosować jako szczepionki.
TT stanowi białko o masie 150 kDa zawierające 50 kDa łańcucha lekkiego (L) połączonego mostkami dwusiarczkowymi z łańcuchem ciężkim (H) o masie 100 kDa (Helting i wsp., J.Biol. Chem., 252: 187-193 (1977a) i Niemann i wsp., Molecular Biology of Clostridial Neurotoxines, Alouf wyd., Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Academic Press, Londyn (1991)). Toksyczna aktywność tego białka związana jest z łańcuchem L, zależną od cynku proteazą (Schiavo i wsp., EMBO J., 11:3577-3583 (1992), której przypisuje się blokowanie uwalniania inhibitora z neuronów przez proteolizę synaptobreviny (Schiavo i wsp., Nature (Londyn), 359:832-335 (1992)). Uważa się, że łańcuch H zapoczątkowuje wiązanie i wychwyt toksyny na błonach presynaptycznych (Helting i wsp., J. Biol. Chem., 252:194-197 (1977b) i Morris i wsp. J. Biol. Chem., 255:6071-6076 (1980)). Trawienie cząsteczki toksyny papainą generuje polipeptyd o wielkości 50 kDa, który odpowiada C-końcowi łańcucha H i cząsteczkę o masie 100 kDa odpowiadającą łańcuchowi L połączonemu z N-końcem łańcucha H (Helting i wsp. (1977a), powyżej). Polipeptyd 50 kDa określany jako fragment C z TT (FC), jest nietoksyczny lecz niesie aktywność gangliozydu (Halpern i wsp., Infect. Immun., 56:1004-1009 (1990) i Morris i wsp., (1960), powyżej) i aktywność wiążącą białko (Schiavo i wsp., FEBS. Lett., 290:227-230 (1991)). We wczesnych badaniach, szczepienie zwierząt FC, otrzymanym przez proteolizę natywnej toksyny, chroniło je przed kolejną śmiertelną dawką TT (Helting i wsp., (1997a), powyżej). Ponadto, badania przeciwciał monoklonalnych wykazały, że zobojętniające epitopy występują w obrębie cząsteczki (Kenimer i wsp., Infect. Immun., 42:942-948 (1983)). Zatem, FC został zidentyfikowany jako cząsteczka będąca dobrym kandydatem do wytwarzania alternatywnej szczepionki przeciw TT.
Ostatnie dane wskazują, że immunizacja domięśniowa plazmidem kodującym fragment C z TT pod kontrolą regionu promotora/enhancera z CMV (pcDNA3/tetC) wywołała wysokie miana przeciwciała przeciw fragmentowi C w surowicy, odpowiedź przez proliferację komórek i wytwarzanie interferonu γ. Co więcej, wykazano, że myszy te były chronione przed śmiertelną dawką TT (Andersen i wsp., powyżej).
Dla dalszego sprawdzenia czy immunogenne i ochronne właściwości pcDNA3/tet mogą być zoptymalizowane, zapoczątkowano serię badań celem dostarczenia tego konstruktu do gospodarza za pośrednictwem atenuowanego szczepu S. typhi. Podejście to stwarzało możliwość dostarczenia nowego systemu dostarczania dla szczepionek DNA przeciw bakteriom i innym organizmom wywołującym zakażenia.
Opis tych badań obejmujący konstrukcję pcDNA/A3/tetC został podany poniżej.
1. Gen kodujący fragment C z TT
Sekwencja genu kodującego TT została opisana w stanie techniki (Eisel i wsp., EMBO J., 5:2495-2502 (1986); Fairweather i wsp., J. Bacteriol., 165:21-27 (1986) i Fairweather i wsp., Nucleic Acids Res., 14:7809-7812 (1986)). Wektory plazmidowe kodujące natywne fragmenty sekwencji C pod kontrolą Ptac uprzednio pokazały, że wyrażają z małą wydajnością (3-4% tcp) FC w E. coli (Makoff i wsp., Bio/Technology, 7:1043-1046 (1989)). Celem zwiększenia ekspresji zoptymalizowano dla E. coli kodony w naturalnym genie kodującym fragment C (który jest bogaty w A-T) Uzyskany, w 99% syntetyczny gen dla fragmentu C (tetC) kieruje ekspresją z większą wydajnością (11-14% tcp) w E. coli (Makoff i wsp., Nucleic Acids Res., 17:10191-10202 (1989)). Przyspieszyło to badania nad innymi systemami ekspresji w celu wytwarzania dużych ilości fragmentu C dla szczepienia. Przygotowanie zrekombinowanego fragmentu C, oczyszczonego z komórek drożdży (Clare i wsp., Biotechnology (N.Y.), 9:455-460 (1991) i Romanos i wsp., Nucleic Acids Res., 19:1461-1467 (1991) i hodowanych komórek owadów (Charles i wsp., Infect. Immun., 59:1627-1632 (1991)) obecnie również zostało przedstawione w celu pobudzania ochronnej odpowiedzi odpornościowej przeciw toksynie tężca po immunizacji pozajelitowej. Co interesujące, tak jak to miało miejsce w przypadku E. coli, tak również w komórkach drożdży naturalny gen kodujący fragment C nie może ulegać ekspresji W Saccharomyces cerevisiae, podczas gdy znajdujący się w pTETtac115 gen z zoptymalizowanymi kodonami ulega w tym organizmie ekspresji. Syntetyczny gen dla fragmentu C, którego kodony zostały zoptymalizowane dla ekspresji w E. coli, teraz został starannie zoptymalizowany dla ekspresji w eukariontach.
PL 192 378 B1
2. Konstrukcja pTETnir15
Uzyskanie wysokiej ekspresji obcych antygenów in vivo, może doprowadzić do utraty plazmidu kodującego antygen, osłabienia zdolności przenoszącego antygen szczepu do dostarczania go do układu odpornościowego. Konsekwentnie, zastosowano szereg podejść uzyskania stabilnego in vivo plazmidu. Jednym takim podejściem jest zastosowanie in vivo indukowalnych promotorów, takich jak promotor nirB. Promotor ten pierwotnie został określony w E. coli, gdzie kontroluje ekspresję operonu, który zawiera gen nirB kodujący NADH-zależną reduktazę azotanową. Jest on regulowany przez azotany i zmiany ciśnienia tlenu w środowisku, a maksymalna aktywność jest uzyskiwana w warunkach beztlenowych. Skonstruowano zmodyfikowaną wersję promotora nirB, która ulega indukcji, gdy komórki bakteryjne hodowane są w środowisku z ograniczoną dostępnością tlenu lub in vitro wnikają do eukariotycznej komórki. Zostały skonstruowane homologiczne plazmidy oparte na Col-E1, które wyrażają fragment C odpowiednio z genów kontrolowanych przez promotory nirB i tac. Wykazano, że szczepy te pobudzają, po podaniu doustnym, wytworzenie ochrony przed TT. Jednakże, dla uzyskania całkowitej ochrony koniecze było podanie dwóch dawek szczepu wykorzystującego gen z promotorem tac, podczas gdy tylko jedna dawka była wymagana, gdy użyto szczepu wyrażającego fragment C z promotorem nirB. W ten sposób konstrukt z promotorem nirB okazał się bardziej trwały i stabilniejszy in vivo niż konstrukt z promotorem tac (Chatfield i wsp., Biotechnology, 10:888 (1992b)).
3. Konstrukcja pcDNA3/tetC
Konstrukcję i charakterystykę plazmidu pcDNA3/tetC przeprowadzono jak to opisali Andersen i wsp. powyż ej, co jest włączone tu w cał o ś ci przez cytowanie (patrz fig. 5).
4. Immunizacja przy pomocy S. typhi CVD915 niosącego pcDNA3/tetC lub pTETnir15.
Jak omówiono powyżej, zapoczątkowano badania celem oceny zdolności atenuowanych szczepów S. typhi do dostarczenia prokariotycznych i eukariotycznych wektorów ekspresyjnych kodujących obce antygeny, np. fragment C z TT, do ssaczego układu odpornościowego i indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej. Aby porównać ten system z tradycyjną immunizacją nagim DNA, oceniono również odpowiedź wywołaną nagim wektorem pcDNA3/tetC.
Dla realizacji tego, plazmidy pcDNA3/tetC lub pTETnir15 były wprowadzane przez elektroporację do CVD 915. Struktura oczyszczonych plazmidów była potwierdzona przez rozdział produktów trawienia plazmidów endonukleazami restrykcyjnymi w żelach agarozowych: pcDNA3 i pcDNA3/tetC Hindlll i Xbal i pTETnir15 EcoRI i BamHI. Wytwarzanie fragmentu C potwierdzono przez SDS-PAGE i blot immunologiczny. Próbki bakterii hodowano do fazy stacjonarnej i próbki o obję toś ci 1,0 ml zbierano przez wirowanie i zawieszano w 200 μΐ buforu SDS do próbek. Następnie próbki te poddano SDS-PAGE i Western blotowi. Jako pierwsze i drugie przeciwciało zastosowano odpowiednio mAb przeciw fragmentowi C i skoniugowane z peroksydazą z chrzanu kozie przeciwciała przeciw mysim.
Każdą próbkę nanoszono w ilości 1,0x108 cfu/studzienkę.
Podanie donosowe zastosowano dla żywego nośnika (CVD915) przenoszącego zarówno plazmidy (CVD 915) (pcDNA3/tatC) jak i CVD 915 (pTETnir15)) a domięśniową, drogę zastosowano do immunizacji nagim DNA (pcDNA3/tetC). Myszy Balb/c immunizowano zgodnie z protokołem podanym poniżej w tabeli 4:
T a b e l a 4
Grupa | Liczba myszy | Immunogen | Droga immunizacji | Pierwsza dawka | Druga dawka |
1 | 10 | CVD915 (pcDNA3/tetC) | Donosowo | 5,9x109 cfu | 11x109 cfu |
2 | 10 | CVD915 (pTETnir15) | Donosowo | 5,0x109 cfu | 6,3x109 cfu |
3 | 10 | CVD915 | Donosowo | 6,5x109 cfu | 5,25x109 cfu |
4 | 10 | pcDNA3/tetC | Domięśniowo | 98 pg | 95 pg |
5 | 5 | PBS | Donosowo | 25 pl | 5,0 pl |
5. Odpowiedź w postaci przeciwciał
PL 192 378 B1
Zwierzęta skrwawiano z żyły ocznej według poniższego schematu (a) przed immunizacją (b) 14 dni po immunizacji dni po immunizacji (c) 14 dni po doszczepieniu dni po doszczepieniu dni po doszczepieniu dni po doszczepieniu (uśmiercono)
Łączny poziom przeciwciał IgG przeciw fragmentowi C w surowicy zmierzono testem ELISA. Krótko, zrekombinowany fragment C został użyty do opłaszczania płytek ELISA antygenem o stężeniu 4,0 μg/ml. Surowicę miareczkowano dla ośmiu dwukrotnych rozcieńczeń. Poziomy porzeciwciał są wyrażone w jednostkach międzynarodowych przez porównanie z wcześniej skalibrowanymi standardowymi surowicami. Standardowe surowice sporządzono przez czterokrotną immunizację myszy zaadsorbowanym toksoidem tężca wykonaną w dwutygodniowych odstępach. Surowice zbierano i oznaczano miano przy pomocy wykonanego in vivo na myszach testu neutralizacji, przeprowadzonego zgodnie z procedurą opisaną w European Pharmacopoeia. Liczbę międzynarodowych jednostek neutralizacji określono zgodnie z Międzynarodowym Standardem dla Antytoksyny Tężcowej. Wyniki przedstawiono na fig. 6.
Jak przedstawiono na fig. 6, choć wydaje się, że nieco wyższy poziom przeciwciał jest wywoływany przez konstrukt CVD 915 (pcDNA3/tetC), bardzo wysoki poziom w surowicy przeciwciał przeciw fragmentowi C (u człowieka 1000 do 2000 krotny poziom ochronnych przeciwciał przeciw TT) był obserwowany po immunizacji i pojedynczym doszczepieniu zarówno konstruktem CVD 915 (pTETnir15) jak i konstruktem CVD 915 (pcDNA3/tetC). Obserwowane w surowicy poziomy przeciwciał przeciw fragmentowi C wynosiły do 20 lU/ml co odpowiada końcowemu rozcieńczeniu do miareczkowania wynoszącemu około 1:50000. Przeciwnie, w surowicy stosunkowo niskie poziomy przeciwciał przeciw fragmentowi C (u ludzi około 50-krotny ochrony przeciw TT) były obserwowane u myszy immunizowanych nagim pcDNA/tetC. Maksymalny poziom w surowicy przeciwciała przeciw fragmentowi C został osiągnięty w 50 dni po pierwszej immunizacji i był utrzymywany do 92 dni po pierwszej immunizacji, do ostatniego momentu, w którym prowadzono badania. Nie obserwowano odpowiedzi u myszy immunizowanych tylko CVD 915.
6. Komórkowa odpowiedź odpornościowa: oznaczenie proliferacji
Dziewięćdziesiąt dwa dni po immunizacji sporządzono pule z zawiesiny pojedynczych komórek otrzymanych z szyjnych węzłów limfatycznych, kreskówkowych węzłów limfatycznych i śledziony 5 do 7 myszy pozostałych w każdej z wyżej omawianych grup. Pule komórek sporządzono również z podjęzykowych węzłów limaftycznych uzyskanych z myszy immunizowanych i. m. nagim pcDNA3/tetC. Uzyskano niżej podane średnie ilości komórek:
Szyjne węzły limaftyczne: 6,6x106 komórek/mysz
Kreskówkowe węzły limfatyczne: 10,1x106 komórek/mysz
Podjęzykowe węzły limfatyczne: 1,6x106 komórek/mysz
Śledziona: 52,5 x 106 komórek/mysz
Oznaczenia proliferacji przeprowadzono przez zawieszenie komórek w kompletnej pożywce RPML (RPMI zawierającej 10% (obj./obj.) płodową surowicę cielęcą, glutaminę i antybiotyki), inkubowano przy stężeniu 2,0x105 komórek/studzienkę w trzech powtórzeniach w 96 studzienkowej, okrągłodennej płytce w obecności i przy braku antygenu. W badaniach tych użyto następujących rozpuszczalnych antygenów: albumina z surowicy bydlęcej (BSA), fragment C z TT i wysoce oczyszczoną fagellinę z S. typhi w stężeniu 0,02, 0,2 i 2,0 μg/ml. Po pięciu dniach inkubacji w 37°C, i 5% CO2, hodowlę znakowano pulsowo 3H tymidyną i w 18 godzin później hodowlę zakończono przez jej automatyczne zebranie. Wbudowanie tymidyny określano przez scyntylację w cieczy. Wyniki, które są pokazane na fig. 7 i 8, są wyrażone jako współczynniki pobudzenia (S.I.).
Jak przedstawiono na fig. 7 immunizacja konstruktem CVD 915 (pTETnir15) i CVD 915 (pcD-NA3/tetC) , jak również nagą szczepionką DNA z pcDNA3/tetC wywoływała pojawienie się uczulonych komórek limfoidalnych, które poroliferowały w odpowiedzi na fragment C z TT. Taka odpowiedź w formie proliferacji była obserwowana w populacji komórek izolowanych z szyjnych węzłów limfatycznych i śledziony, a nie była obserwowana w populacji komórek izolowanych z kreskówkowych węzłów limfatycznych. Specyficzna odpowiedź w formie proliferacji była również obserwowana dla TT.
PL 192 378 B1
Brak znaczącej odpowiedzi w formie proliferacji na fragment C z TT (>3 S.I.) obserwowano dla komórek izolowanych z myszy immunizowanych CVD 915 lub PBS.
Jak przedstawiono na fig. 8 odpowiedzi przez proliferację na rzęski z S. typhi obserwowano w populacjach komórek izolowanych z myszy immunizowanych CVD 915, i konstruktami CVD 915 (pTETnir15) i CVD 915 (pcDNA3/tetC). Również jak przedstawiono na fig. 8 odpowiedź taką obserwowano we wszystkich populacjach izolowanych z myszy immunizowanych CVD 915 i komórek limfoidalnych izolowanych z szyjnych węzłów limfatycznych z myszy immunizowanych konstruktami CVD 915 (pTETnir15) i CVD 915 (pcDNA3/tetC). Stosunkowo niską proliferację obserwowano dla splenocytów i komórek izolowanych z krezkówkowego węzła limfatycznego otrzymanego od myszy immunizowanej konstruktami CVD 915 (pTETnir15) i CVD 915 (pcDNA3/tetC). Z uwagi na techniczne trudności nie ma dostępnych danych dotyczących proliferacji komórek myszy immunizowanych nagim DNA pcDNA3/tetC będącym szczepionką DNA na rzęski z S. typhi Interesującym jest, że komórki izolowane z podjęzykowych węzłów limfatycznych myszy immunizowanych i.m. nagim pcDNA3/tetC nie ujawniały odpowiedzi przez proliferację na żaden z badanych antygenów. Nie obserwowano odpowiedzi przez proliferację w żadnej z badanych grup na BSA.
7. Porównanie IgG w surowicy przeciw LPS Salmonella i rzęskom S. typhi indukowanych przez donosową immunizację CVD915 i CVD 908-htrA
Jedną z istotnych kwestii do sprawdzenia w czasie oceny nowych kandydatów na nośniki szczepionki jest porównanie odpowiedzi odpornościowej wywołanej przez nowe konstrukty (np. CVD 915) względem tych wiodących kandydatów (np. CVD 908-htrA), dla których dostępna jest znaczna ilość danych. W tym celu grupy liczące 10 myszy Balb/C immunizowano donosowo 1010 cfu atenuowanego szczepu CVD 915 lub CVD 908-htrA, wykonując tę czynność dwukrotnie w ciągu 36 dni. Myszy skrwawiano przed immunizacją (dzień 0) i w dniach 35,55 i 95 (tylko CVD915). Testem ELISA, jak to opisali Tacket i wsp., (1977) powyżej, określano przeciwciała przeciw antygenom LPS i antygenom rzęskowym. Płytki do ELISA opłaszczano 5,0 μg każdego antygenu, próbki surowicy sprawdzano w dwukrotnych rozcieńczeniach, miana przeciwciała wyrażano jako jednostki ELISA/ml określone jako odwrotność rozcieńczenia dającego absorbancję 0,5 przy 492 nm. Wyniki przedstawiono na fig. 9 i 10.
Jak pokazano na fig. 9 i 10 w obu grupach zwierząt wywołano odpowiednio podobny poziom przeciwciał przeciw rzęskom z Salmonella i przeciw LPS z Salmonella.
P r z y k ł a d 5
Konstrukcja atenuowanych szczepów S. typhi, które konstytutywnie wyrażają antygen Vi
A. Konstrukcja szczepów S. typhi (CVD 916 i CVD 909), które konstytutywnie wyrażają antygen Vi
Celem zmiany ekspresji antygenu Vi regulowanej osmotycznie na konstytutywną skupiono się na promotorze vipR (fig. 1A). Wiadomo, że produkty vipR i ompR-envZ realizują swoją aktywność regulacyjną wiążąc się z obszarem poprzedzającym vipR (Hashimoto i wsp. (1996), powyżej). Z uwagi na ten efekt postuluje się w obecnym wynalazku, że gdy zastąpi się promotor vipR silnym promotorem np. Ptac inhibicja zależna od vipR, a następnie kontrola ekspresji antygenu Vi, będą wykluczone. Promotor Ptac jest konstytutywny w Salmonella spp., ponieważ organizm ten utracił laql. Zgodnie z tym konstytutywnie wyrażające antygen Vi pochodne CVD 915 i CVD 908-htrA zostały skonstruowane w następujący sposób.
W pierwszej fazie wprowadzono delecję do vipR i równocześnie markerem selekcja/przeciwselekcja np. kasetą sacB-neo zastąpiono region promotora vipR (fig. 1A).
Precyzyjniej fragment o długości 601 par zasad położony bezpośrednio przed obszarem -35 promotora vipR był amplifikowany na matrycy genomowego DNA szczepu S. typhi Ty2, typu dzikiego, przy pomocy starterów:
5'-GGGGGAGCTCAATTCTGCAAACCAGCCCTGTACCATCAAGTTCATA-3', (Sek Id. Nr: 7) i
5'-CCTCATCCCGGGCCCGGATCCACCTGCACAATTCATTGTTTGTACCTATC-3' (Sek. Id. Nr: 8). Pierwszy, liczący 601 par zasad zamplifikowany fragment (segment A), został sklonowany przy pomocy zestawu pGEM-T Vector System (Promega Madison, WI), dając pGEM-T::fragment A. System ten obejmuje zlinearyzowany plazmid (pGEM-T) z 3'-T wydłużoną sekwencją w miejscu insercji, co zwiększa wydajność włączania przez ligację produktów PCR. Następnie, pGEM-T::segment A był trawiony Sstl i BamHI i wklonowany w miejsca Sstl i BamHI znajdujące się bezpośrednio powyżej Ptac w pBS::Ptac (plazmid ten uzyskano przez klonowanie promotora Ptac w miejsca BamHI-EcoRI pBlu-escript (Stratagene)), uzyskując pBS::segment A-Ptac. Równocześnie na matrycy tego samego geno24
PL 192 378 B1 mowego DNA szczepu Ty2 amplifikowano segment o wielkości 770 par zasad z vipR (obejmujący kodon inicjacyjny z vipR) (segment B), stosując startery:
5'-GCAGGTGGATCCGGGCCCGGGATGAGGTTTCATCATTTCTGGCCTCCGAATGATATC-3' (Sek. Id. Nr: 9) i
5'-ATCCTTGAATTCGGGGGATCCTACTAAAATTTTATATTTACAAAGTTAATTCTAGGT-3' (Sek. Id.D Nr:10). W starterach tych wprowadzono unikalne miejsca dla enzymów restrykcyjnych Sstl, EcoRI, BamHI i Smal dla klonowania (podkreślone). Zamplifikowany Segment B był najpierw klonowany w pGEM-T przy pomocy zestawu pGEM-T Vector System, w wyniku czego uzyskano pGEMT::segment B. Plazmid ten następnie trawiono EcoRV i SaII, a otrzymny fragment klonowano w miejscach EcoRV i SalI pBS::segment A-Ptac. Uzyskany plazmid nazywany pBS: : Ptac-vipR zawiera segment A-Ptac-segment B i posiada delecję 167 par zasad obejmującą obszar -35, -10 i obszar kodujący miejsce wiązania rybosomu z promotora vipR. Jednak, w konstrukcie pBS: : Ptac-vipR delecja promotora vipR została skutecznie zastąpiona przez insercję 257 par zasad obejmującą sekwencję -35, -10 i sekwencję kodującą miejsce wiązania rybosomu z promotora tac.
Równocześnie skonstruowano inną kasetę przez wbudowanie sacB-neo pomiędzy opisanymi wyżej segmentem A i segmentem B. Początkowo segment A i segment B były łączone przez PCR wykorzystującą oba fragmenty jako matrycę i jako startery oligonukleotydy Sek. Id. Nr: 7 i Sek. Id. Nr: 10, jak to opisali Noriega i wsp., (1996), powyżej). Otrzymana w wyniku amplifikacji fuzja fragmentu A i B została wklonowana w pGEM-T przy pomocy zestawu pGEM-T Vector System, w wyniku czego uzyskano pGEM-T::fragment A-fragment B. Następnie, sacB-neo została uzyskana przez trawienie Smal pIN729 (Blomfield i wsp., powyżej) i wbudowana w miejsce Smal pGEM-T::segment A-segment B. Otrzymany plazmid nazwano pGEM-T::vipR::sacB-neo. Plazmid ten został strawiony Sstl, w wyniku czego skutecznie usunięto allel vipR::sacB-neo, który został sklonowany w miejsce Sstl samobójczego wektora pJG14, w wyniku czego uzyskano pJG14::vipR::sacB-neo. PJG14 jest termowrażliwy, pSC101 pochodzi z replikacyjnej pochodnej samobójczego plazmidu warunkującego oporność na chloramfenikol (Galen i wsp., 96th General Meeting, American Society for Microbiology, skrót, strona 529-H260 (1996)). Dodatkowo strawiony SstL allel vipR::sacB-neo został sklonowany w miejsce SstL samobójczego wektora pKTN701 (Hone i wsp., (1991), powyżej), w wyniku czego uzyskano pKT::vipR::sacB-neo. Do szczepu S. typhi CVD 915 wprowadzono przez elektroporację pJG14::vipR::sacB-neo. Równocześnie do szczepu S. typhi CVD 908-htrA wprowadzono przez elektroporację pKT::VIP::samb-neo. Zaszła rekombinacja homologiczna pomiędzy pJG14::vipR::sacB- neo i genem vipR S.typhi CVD 915 dzięki procedurze opisanej przez Noriega i wsp., (1996), powyżej), i między pKT::vipR::sacB-neo i genem vipR z S. typhi CVD 908-htrA przy pomocy procedury opisanej przez Hone i wsp. (1991), powyżej, z wyjątkiem tego, że selekcja mutantów uzyskana przez podwójne crossing-over była wspomagana przez izolację klonów opornych na kanamycynę i wrażliwych na chloramfenikol. Otrzymane szczepy S. typhi będące pochodnymi CVD 915 i CVD 908, nie wyrażały antygenu Vi z uwagi na isercję/delecję allelu vipR.
W drugiej fazie konstytutywny Ptac promotor został podstawiony przez insercję sacB-neo do lokus vipR pochodnej S. typhi CVD 915 i pochodnej S. typhi CVD 908-htrA szczepów, które opisano powyżej (fig. 1B). Precyzyjniej, segment Ptac- vipR z pBS: : Ptac-vipR został sklonowany w miejsce BamHL-EcoRI pJG14, w wyniku czego uzyskano pJG14: : Ptac-vipR. Następnie plazmid pJG14: : Ptac-vipR został użyty do zamiany Ptac na sacB-neo, przez homologiczną rekombinację w pochodnych szczepów CVD 915 i CVD 908-htrA, jak to opisano powyżej. Izolacja mutantów otrzymanych przez podwójne crossing-over była wspomagana przez selekcję negatywną dostarczoną przez toksyczność sacharozy ustaloną przez sacB i rewersję wrażliwości na kanamycynę. Otrzymany szczep pochodzący z CVD 915 został nazwany CVD 916 i został zdeponowany w American Type Culture Collection 4 maja 1998 pod ATCC Nr 202116. Uzyskany szczep pochodzący z CVD 908-htrA został nazwany CVD 909 i złożony w American Type Culture Collection 4 maja 1998 pod ATCC Nr 202117.
Genotypowo insercja Ptac w obu szczepach została scharakteryzowana przez PCR, która wykazała, że insercja Ptac jest w odpowiednim miejscu.
B. Konstytutywna ekspresja antygenu Vi przez szczepy CVD 916 i CVD 909
Oszacowano fenotypowo konstytutywną ekspresję antygenu Vi, przez aglutynację bakterii rosnących na podłożach o różnej osmolarności, przy pomocy komercyjnie dostępnej surowicy odpornościowej przeciw Vi (Disco). Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 5.
PL 192 378 B1
T a b e l a 5
Aglutynacja przy pomocy surowicy odpornościowej specyficznej przeciw Vi
NaCl | Szczep | ||||
CVD915 | CVD916 | CVD908htrA | CVD909 | Ty2 | |
0,17 M | +++ | ++++ | +++ | ++++ | +++ |
0,3 M | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
0,5 M | - | +++ | +/- | +++ | - |
0,6 M | - | +++ | - | +++ | - |
0,7 M | - | +++ | - | +++ | - |
Jak pokazano wyżej w tabeli 5 w szczepie S. typhi typu dzikiego Ty2 i atenuowanych szczepach CVD 915 i CVD 908-htrA ekspresja antygenu Vi jest w znacznym stopniu zależna od osmolarności (wywołanej stężeniem NaCl) w pożywce. Przeciwnie, ekspresja antygenu Vi w szczepach CVD 916 i CVD 909 jest silna i konstytutywna i nie jest regulowana przez zmiany osmolarności.
P r z y k ł a d 6
Odpowiedź odpornościowa przeciw ulegającemu konstytutywnej ekspresji antygenowi Vi
Grupę dziesięciu 6 tygodniowych myszy Balb/c immunizowano donosowo 1,0 x 1010 cfu zarówno szczepem CVD 915 jak i CVD 916. Myszy skrwawiano przed i 30 dni po immunizacji a ich surowicę do momentu zastosowania przechowywano w -20°C. Obecne w surowicy przeciwciała przeciw pochodzącym z S.typhi antygenom LPS, H (flagelina) i Vi określano przez ELISA, tak jak opisali to Tacket i wsp., (1997), powyżej. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 6.
T a b e l a 6
Geometryczna średnia mian w surowicy przeciwciał IgG przeciw antygenom S. typhi po jednokrotnej immunizacji szczepami CVD 915 lub CVD 916
Przeciwciała klasy IgG specyficzne przeciw | ||||||
Vi | LPS | H | ||||
Szczep | Dzień 0 | Dzień 30 | Dzień 0 | Dzień 30 | Dzień 0 | Dzień 30 |
CVD915 | 21 | 46 | 19 | 640 | 20 | 197 |
CVD916 | 26 | 109* | 17 | 747** | 21 | 320** |
*p = 0,033 p = nieistotny
Jak pokazano powyżej w tabeli 6 immunizacja szczepem CVD 916 wywołuje poziomy przeciwciał przeciw antygenowi Vi, które są znacząco wyższe niż te uzyskiwane dla szczepów CVD 915. Odpowiedź odpornościowa na inne antygeny S.typhi (LPS i H) była podobna w obydu immunizowanych grupach. Wyniki pokazują, że konstytutywna ekspresja antygenu Vi wzmaga odpowiedź odpornościową przeciw temu antygenowi nie wpływając na odpowiedź odpornościową skierowaną przeciw innym antygenom somatycznym S.typhi.
Choć wynalazek został opisany szczegółowo i w stosunku do jego specyficznych postaci, powinno być oczywiste dla specjalistów, że można przeprowadzić różne zmiany i modyfikacje nie zmieniając istoty i nie wychodząc poza zakres wynalazku.
PL 192 378 B1
Lista sekwencji <110> NORIEGA, Fernando
SZTEIN, Marcelo B.
LEVINE, Myron M.
<120> Atenuowane mutanty Salmonella konstytutywnie wyrażające antygen Vi <130> A7140 <140> 09/076,761 <141> 1998-05-13 <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 3531 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 gtaaagtacc agtgaccgga agctggttgc gtgaaattag aaatttcgcc gctgatccaa 60 acctgtccca tctcatgctc aagcagcaga cgaaccgttt gattcaggcg actaacggta 120 aaaattgcag gggattgaga aggtaacatg tgagcgagat caaattctaa atcagcaggt 180 tattcagtcg atagtaaccc gcccttcggg gatagcaagc attttttgca aaaaggggta 240 gatgcaatcg gttacgctct gtataatgcc gcggcaatat ttattaacca ctctggtcga 300 gatattgccc atgctacgta tcgctaaaga agctctgacg tttgacgacg ttctcctcgt 360 tcctgctcac tctaccgttc tgccgaatac tgctgacctc agcacccagc tgacgaaaac 420
PL 192 378 B1
tattcgtctg | aatatcccta | tgctttccgc | agcaatggat | accgtaacgg | aagcgcgcct | 480 |
ggctattgct | ctggctcagg | aaggcggtat | cggctttatc | cacaaaaaca | tgtccattga | 540 |
acgccaggca | gaagaagttc | gccgtgtgaa | aaaacacgaa | tctggtgtgg | tgactgatcc | 600 |
gcagactgtt | ctgccaacca | cgacgctgcg | cgaagtgaaa | gaactgaccg | agcgtaacgg | 660 |
ttttgcgggc | tatccggtcg | ttaccgaaga | aaacgaactg | gtgggtatta | tcaccggtcg | 720 |
tgacgtgcgt | tttgttaccg | acctgaacca | gccggttagc | gtttacatga | cgccgaaaga | 780 |
gcgtctggtc | accgtgcgtg | aaggtgaagc | ccgtgaagtg | gtgctggcaa | aaatgcacga | 840 |
aaaacgcgtt | gaaaaagcgc | tggtggttga | tgacgaattc | cacctgatcg | gcatgatcac | 900 |
cgtgaaagac | ttccagaaag | cggaagctaa | accgaacgcc | tgtaaagacg | agcaaggccg | 960 |
tctgcgtgtt | ggtgcagcgg | ttggcgcagg | tgcgggtaac | gaagagcgtg | ttgacgcgct | 1020 |
ggttgccgca | ggcgttgacg | ttctgctgat | cgactcctcc | cacggtcact | cagaaggtgt | 1080 |
actgcaacgt | atccgtgaaa | cccgtgctaa | atatccggat | ctgcaaatta | tcggcggcaa | 1140 |
cgtggcaaca | gctgcaggtg | cacgcgctct | ggcagaagct | ggttgcagtg | cggttaaagt | 1200 |
cggcattggc | cctggctcta | tctgtacaac | tcgtatcgtg | actggcgtcg | gtgttccgca | 1260 |
gattaccgct | gttgctgacg | cagtagaagc | cctggaaggc | accggtattc | cggttatcgc | 1320 |
tgatggcggt | attcgcttct | ccggcgacat | cgccaaagct | atcgccgctg | gcgcaagcgc | 1380 |
ggtgatggta | ggttccatgc | tggcgggtac | tgaagaatct | ccgggtgaaa | tcgaactcta | 1440 |
ccagggccgt | tcttacaaat | cttaccgtgg | tatgggttcc | ctgggcgcga | tgtccaaagg | 1500 |
ttcctctgac | cgttatttcc | agagcgataa | cgctgccgac | aaactggtgc | cggaaggtat | 1560 |
cgaaggtcgc | gtagcctata | aaggtcgcct | gaaagagatc | attcaccagc | agatgggcgg | 1620 |
cctgcgctcc | tgtatgggtc | tgaccggctg | tggtactatc | gacgaactgc | gtactaaagc | 1680 |
ggagtttgta | cgtatcagcg | gtgcgggcat | tcaggaaagc | cacgttcacg | acgtgaccat | 1740 |
tactaaagag | tccccgaact | accgtctggg | ctcctgattc | tcttcgcccg | acttcatgtc | 1800 |
gggcgattta | tattatctgt | ttcacttgcc | tcggaataag | cgtcaatgac | ggaaaacatt | 1860 |
cataagcatc | gcatcctcat | tctggacttc | ggttctcagt | acactcaact | ggttgcgcgc | 1920 |
cgcgtgcgtg | agctgggtgt | ttactgcgaa | ctgtgggcgt | gggatgtgac | agaagcacaa | 1980 |
attcgtgact | tcaatccaag | cggcattatt | ctttccggcg | gcccggaaag | tactactgaa | 2040 |
gaaaacagtc | cgcgtgcgcc | gcagtatgtc | tttgaagcag | gcgtaccggt | attcggcgtt | 2100 |
tgctatggca | tgcagaccat | ggcaatgcag | ttgggcggtc | acgttgaagc | ctctaacgaa | 2160 |
cgtgaatttg | gctacgcgca | ggttgaagtc · | gtaaacgaca | gcgcactggt | tcgcggtatc | 2220 |
PL 192 378 B1
gaagatgcgc | tgaccgcaga | cggtaaaccg | ctgctcgatg | tctggatgag | ccacggcgat | 2280 |
aaagttaccg | ctattccgtc | cgacttcatc | accgtagcca | gcaccgaaag | ctgcccgttt | 2340 |
gccattatgg | ctaacgaaga | aaaacgcttc | tatggcgtac | agttccaccc | ggaagtgact | 2400 |
catacccgcc | agggtatgcg | catgctggag | cgttttgtgc | gtgatatctg | ccagtgtgaa | 2460 |
gccctgtgga | cgccagcgaa | aattatcgac | gatgctgtag | ctcgcatccg | cgagcaggta | 2520 |
ggcgacgata | aagtcatcct | cggcctctct | ggtggtgtgg | attcctccgt | aaccgcaatg | 2580 |
ctgctgcacc | gcgctatcgg | taaaaacctg | acttgcgtat | tcgtcgacaa | cggcctgctg | 2640 |
cgcctcaacg | aagcagagca | ggttctggat | atgtttggcg | atcactttgg | tcttaacatt | 2700 |
gttcacgtac | cggcagaaga | tcgcttcctg | tcagcgctgg | ctggcgaaaa | cgatccggaa | 2760 |
gcaaaacgta | aaatcatcgg | tcgcgttttc | gttgaagtat | tcgatgaaga | agcgctgaaa | 2820 |
ctggaagacg | tgaagtggct | ggcgcagggc | accatctacc | ctgacgttat | cgaatctgcg | 2880 |
gcgtctgcaa | ccggtaaagc | acacgtcatc | aaatctcacc | acaacgtggg | cggcctgccg | 2940 |
aaagagatga | agatgggcct | ggttgaaccg | ctgaaagagc | tgttcaaaga | cgaagtgcgt | 3000 |
aagattggtc | tggagctggg | cctgccgtac | gacatgctgt | accgtcaccc | gttcccggga | 3060 |
ccaggccttg | gcgttcgtgt | tctgggtgaa | gtgaagaaag | agtactgtga | cctgctgcgc | 3120 |
cgtgctgacg | ccatcttcat | tgaagaactg | cgtaaagcgg | acctgtacga | caaagtcagc | 3180 |
caggcgttca | ctgtgttcct | gccggtacgt | tccgttggcg | taatgggcga | tggtcgtaag | 3240 |
tatgactggg | ttgtctctct | gcgtgctgtc | gaaaccatcg | actttatgac | cgcacactgg | 3300 |
gcgcatctgc | cgtacgattt | cctcggtcgc | gtttccaacc | gcattatcaa | tgaagtgaac | 3360 |
ggtatttccc | gcgtggtgta | tgacatcagc | ggcaagccgc | cagctaccat | tgagtgggaa | 3420 |
tgatttgacc | ctgcactatg | aatgaacaaa | accctctgtt | actacagagg | gttttttatc | 3480 |
ttcaagaatt | ataggattga | agttactaac | atcgattaat | taaaccagct | g | 3531 |
<210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 2 cgagctcgcg agctcggtaa agtaccagtg accggaagct ggttgcgt 48
PL 192 378 B1 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 3 gggcccgggg gatcctcaac cgacgccagt cacgatacga gttgtacaga t 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 4 tgaggatccc ccgggcccgg ctacgcgcag gttgaagtcg taaacgacag c 51 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 5 gctctagagc tctagagctc attcccactc aatggtagct ggcggctt 48 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny
PL 192 378 B1 <400> 6 gggcggcctg cgctcctgta tgggtctgac cggctgtggt 40 <210> 7 <211> 46 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 7 gggggagctc aattctgcaa accagccctg taccatcaag ttcata 46 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 8 cctcatcccg ggcccggatc cacctgcaca attcattgtt tgtacctatc 50 <210> 9 <211> 57 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 9 gcaggtggat ccgggcccgg gatgaggttt catcatttct ggcctccgaa tgatatc 57 <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 10 atccttgaat tcgggggatc ctactaaaat tttatattta caaagttaat tctaggt 57
Claims (18)
- Zastrzeżenia patentowe1. Atenuowany mutant Salmonella, znamienny tym, że konstytutywnie wyraża antygen Vi i że promotor vipR w mutancie jest zastąpiony konstytutywnym promotorem tak, że powoduje konstytutywną ekspresję viaB.
- 2. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 1, znamienny tym, że jest mutantem Salmonella typhi .
- 3. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że w mutancie promotor vipR jest zastąpiony promotorem wybranym z grupy składającej się z Ptac, Ptrc, POlac i PIpp powodując konstytutywną ekspresję viaB.
- 4. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że mutant ma mutację w operonie guaB-A, z powodu której jest niezdolny do tworzenia de novo nukleotydów guaninowych.
- 5. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 4, znamienny tym, że mutacja w operonie guaB-A jest delecją i delecja ta jest w genie guaA, genie guaB lub w obu genach guaA i guaB.
- 6. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 5, znamienny tym, że delecja jest zarówno w genie guaA jak i guaB.
- 7. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 6, znamienny tym, że ma fenotyp aro-.
- 8. Atenuowany mutant Salmonella, według zastrz. 2, znamienny tym, że mutant Salmonella typhi pochodzi z rodzicielskiego Salmonella typhi CVD 915 (ATCC No 202115).
- 9. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 1, znamienny tym, że mutantem Salmonella jest CVD 916 (ATCC Nr 202116) lub Salmonella typhi CVD 909 (ATCC Nr 202117).
- 10. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 1, znamienny tym, że koduje i wyraża obcy antygen.
- 11. Atenuowany mutant Salmonella według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera plazmid, który koduje i wyraża obcy antygen w komórce eukarionta.
- 12. Szczepionka przeciw durowi brzusznemu, znamienna tym, że zawiera:(A) farmaceutycznie skuteczną ilość atenuowanego mutanta Salmonella typhi, który konstytutywnie wyraża antygen Vi, i w którym promotor vipR jest zastąpiony konstytutywnym promotorem, powodując konstytutywną ekspresję viaB; i (B) farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.
- 13. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że w mutancie promotor vipR jest zastąpiony promotorem wybranym z grupy składającej się z Ptac, Ptrc, POlac i PIpp, powodując konstytutywną ekspresję viaB.
- 14. Szczepionka według zastrz. 12 lub 13, znamienna tym, że mutant ma mutację w operonie guaB-A, z powodu której jest niezdolny do tworzenia de novo nukleotydów guaninowych.
- 15. Szczepionka według zastrz. 14, znamienna tym, że mutacja w operonie guaB-A jest delecją, która jest w genie guaA, genie guaB lub w obu genach guaA i guaB.
- 16. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że delecja występuje zarówno w genie guaA jak i w genie guaB.
- 17. Szczepionka według zastrz. 16, znamienna tym, że mutant ma fenotyp aro-.
- 18. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że mutant Salmonella typhi pochodzi od rodzicielskiego szczepu Salmonella typhi CVD 915 (ATCC Nr 202115).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/076,761 US6190669B1 (en) | 1998-05-13 | 1998-05-13 | Attenuated mutants of salmonella which constitutively express the Vi antigen |
PCT/US1999/006554 WO1999058146A1 (en) | 1998-05-13 | 1999-04-30 | ATTENUATED MUTANTS OF SALMONELLA WHICH CONSTITUTIVELY EXPRESS THE Vi ANTIGEN |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL344593A1 PL344593A1 (en) | 2001-11-05 |
PL192378B1 true PL192378B1 (pl) | 2006-10-31 |
Family
ID=22134022
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL344593A PL192378B1 (pl) | 1998-05-13 | 1999-04-30 | Atenuowane mutanty Salmonella i szczepionka przeciw durowi brzusznemu |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6190669B1 (pl) |
EP (1) | EP1076566B1 (pl) |
JP (1) | JP4363782B2 (pl) |
AT (1) | ATE333285T1 (pl) |
AU (1) | AU754795B2 (pl) |
CA (1) | CA2328056C (pl) |
DE (1) | DE69932425T2 (pl) |
DK (1) | DK1076566T3 (pl) |
ES (1) | ES2268864T3 (pl) |
HU (1) | HUP0101747A3 (pl) |
MX (1) | MXPA00011075A (pl) |
NO (1) | NO20005672L (pl) |
NZ (1) | NZ508110A (pl) |
PL (1) | PL192378B1 (pl) |
WO (1) | WO1999058146A1 (pl) |
ZA (1) | ZA200006381B (pl) |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3633933B2 (ja) * | 1992-07-31 | 2005-03-30 | アカンビス、リサーチ、リミテッド | 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現 |
GB9521568D0 (en) * | 1995-10-20 | 1995-12-20 | Lynxvale Ltd | Delivery of biologically active polypeptides |
US6797275B1 (en) * | 1998-12-04 | 2004-09-28 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine |
DE69930147T2 (de) * | 1998-12-04 | 2007-01-11 | University Of Manitoba, Winnipeg | Zwei-schritte-verfahren zur impfung gegen chlamydia |
US7026155B2 (en) * | 1999-02-02 | 2006-04-11 | Regents Of The University Of California | Method of reducing bacterial proliferation |
DE60011560T2 (de) * | 1999-12-28 | 2005-08-18 | Akzo Nobel N.V. | Salmonella Impfstoff, der keinen Antikörper gegen Flagellin oder gegen Flagella induziert |
DE60125528T2 (de) * | 2000-04-20 | 2007-10-11 | University Of Maryland, Baltimore | Isolierung und charakterisierung des csa-operons (etec-cs4 pili) und verfahren zu dessen anwendung |
US7780961B2 (en) * | 2001-05-03 | 2010-08-24 | Actogenix N.V. | Self-containing Lactococcus strain |
US7541043B2 (en) | 2002-01-16 | 2009-06-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine for protection against Shigella sonnei disease |
JP2005529622A (ja) * | 2002-06-19 | 2005-10-06 | ヴェーイーベー・ヴェーゼットウェー | 腸吸収を促進するための方法および手段 |
WO2004046346A2 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Vib Vzw | Self-containing lactobacillus strain |
JP2009516503A (ja) * | 2005-10-28 | 2009-04-23 | ユニバーシティ オブ メリーランド, ボルチモア | 弱毒化s・パラチフスa菌株およびその使用 |
US8137930B2 (en) | 2005-10-28 | 2012-03-20 | University Of Maryland, Baltimore | Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi A and uses thereof |
WO2007062371A2 (en) * | 2005-11-23 | 2007-05-31 | University Of Maryland, Baltimore | Live vector vaccine and uses thereof |
ES2405552T3 (es) | 2005-11-29 | 2013-05-31 | Actogenix N.V. | Inducción de tolerancia mucosa a antiantígenos de células beta de islotes pancreáticos |
JP2009529895A (ja) * | 2006-03-20 | 2009-08-27 | ヴリジェ ユニヴェルシテ ブリュッセル | 弱毒化サルモネラ生ワクチン |
JP2009531029A (ja) * | 2006-03-20 | 2009-09-03 | ヴリジェ ユニヴェルシテ ブリュッセル | 弱毒化サルモネラ生ワクチン |
EP2066339B1 (en) | 2006-09-18 | 2014-08-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses |
BRPI0807857A2 (pt) | 2007-01-25 | 2014-05-27 | Actogenix Nv | Tratamento de doença imune por meio de distribuição através da mucosa de antígenos. |
US20110020399A1 (en) * | 2007-04-16 | 2011-01-27 | University Of Maryland, Baltimore | Vaccines and Immunomodulatory Therapies for Tularemia |
AU2008318615A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | Texas A&M University System | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium |
HUE047164T2 (hu) | 2007-11-01 | 2020-04-28 | Univ Arkansas | Kompozíciók és eljárások eimeria elleni immunválasz fokozására |
WO2010036226A1 (en) * | 2008-09-26 | 2010-04-01 | George Nelson | Process for treatment of rheumatoid arthritis, tremors/parkinson's disease and multiple sclerosis |
WO2010141143A2 (en) * | 2009-04-21 | 2010-12-09 | Vivocure, Inc. | Engineered avirulent bacteria strains and use in medical treatments |
CA2787661C (en) | 2010-01-21 | 2021-10-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses |
EP3556397A1 (en) | 2010-06-09 | 2019-10-23 | The Board of Trustees of the University of Arkansas | Vaccine and methods to reduce campylobacter infection |
WO2013126622A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for displaying polypeptides and uses thereof |
PL2956165T3 (pl) | 2013-02-14 | 2020-04-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Kompozycje i sposoby wzmacniania odpowiedzi immunologicznych na Eimeria lub ograniczania infekcji Eimeria |
EA033538B1 (ru) | 2013-03-15 | 2019-10-31 | Univ Arkansas | Композиции и способы усиления иммунного ответа на кишечные патогены |
US10682398B2 (en) | 2016-05-03 | 2020-06-16 | The Texas A&M University System | Yeast vaccine vector including immunostimulatory and antigenic polypeptides and methods of using the same |
AU2022343176A1 (en) * | 2021-09-10 | 2024-04-11 | Regents Of The University Of Minnesota | Salmonella engineered for nontoxic colonization of tumors |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5077044A (en) | 1980-05-19 | 1991-12-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting shigella live vaccines |
US5783196A (en) | 1996-04-09 | 1998-07-21 | University Of Maryland At Baltimore | Gua mutants of shigella spp. and vaccines containing the same |
-
1998
- 1998-05-13 US US09/076,761 patent/US6190669B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-04-30 AT AT99919755T patent/ATE333285T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-04-30 JP JP2000547997A patent/JP4363782B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-30 NZ NZ508110A patent/NZ508110A/xx unknown
- 1999-04-30 PL PL344593A patent/PL192378B1/pl unknown
- 1999-04-30 ES ES99919755T patent/ES2268864T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 DK DK99919755T patent/DK1076566T3/da active
- 1999-04-30 HU HU0101747A patent/HUP0101747A3/hu unknown
- 1999-04-30 WO PCT/US1999/006554 patent/WO1999058146A1/en active IP Right Grant
- 1999-04-30 EP EP99919755A patent/EP1076566B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 DE DE69932425T patent/DE69932425T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-30 AU AU37405/99A patent/AU754795B2/en not_active Expired
- 1999-04-30 MX MXPA00011075A patent/MXPA00011075A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-04-30 CA CA2328056A patent/CA2328056C/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-11-07 ZA ZA200006381A patent/ZA200006381B/en unknown
- 2000-11-10 NO NO20005672A patent/NO20005672L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA200006381B (en) | 2002-02-07 |
JP2002514398A (ja) | 2002-05-21 |
PL344593A1 (en) | 2001-11-05 |
DK1076566T3 (da) | 2006-11-13 |
CA2328056C (en) | 2010-07-06 |
EP1076566B1 (en) | 2006-07-19 |
JP4363782B2 (ja) | 2009-11-11 |
AU3740599A (en) | 1999-11-29 |
WO1999058146A1 (en) | 1999-11-18 |
ATE333285T1 (de) | 2006-08-15 |
CA2328056A1 (en) | 1999-11-18 |
AU754795B2 (en) | 2002-11-28 |
NO20005672L (no) | 2001-01-15 |
NZ508110A (en) | 2002-10-25 |
US6190669B1 (en) | 2001-02-20 |
ES2268864T3 (es) | 2007-03-16 |
HUP0101747A2 (hu) | 2001-09-28 |
NO20005672D0 (no) | 2000-11-10 |
EP1076566A4 (en) | 2005-01-05 |
MXPA00011075A (es) | 2002-04-24 |
HUP0101747A3 (en) | 2002-03-28 |
DE69932425D1 (de) | 2006-08-31 |
DE69932425T2 (de) | 2007-03-08 |
EP1076566A1 (en) | 2001-02-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4363782B2 (ja) | Vi抗原を構成的に発現するSalmonellaの弱毒化した変異株 | |
Cardenas et al. | Oral immunization using live attenuated Salmonella spp. as carriers of foreign antigens | |
JP3004049B2 (ja) | 病原性のないphoP型微生物を含有するワクチン | |
US4888170A (en) | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes | |
US7887816B2 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
KR100242798B1 (ko) | 안정한 pur A 벡터 및 이의 사용 | |
CZ100593A3 (en) | Recombinant proteins expression in weakened bacteria | |
EP0500699B1 (en) | Cross-protective salmonella vaccines | |
US20070116725A1 (en) | Live Attenuated Samonella Strains for Producing Monovalent or Multivalent Vaccines | |
KR20010024650A (ko) | RpoS 양성 표현형을 가진 면역원성 약독화 박테리아를포함하는 재조합 백신 | |
US8475810B2 (en) | Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi a and uses thereof | |
KR100628657B1 (ko) | AroC, OmpF 및 OmpC 유전자 각각에 비복귀돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아 | |
US8137930B2 (en) | Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi A and uses thereof | |
Sory et al. | Yersinia enterocolitica O: 9 as a potential live oral carrier for protective antigens | |
AU2002339623A1 (en) | Live attenuated salmonella strains for producing vaccines | |
US5874088A (en) | Deletion mutants of cholera vaccines expressing heterologous antigens | |
CZ20003851A3 (cs) | Oslabený mutovaný kmen Salmonella a vakcína proti břišnímu tyfu | |
Freytag | Effect of gene location on in vitro and in vivo stability, immunogenicity and expression of foreign antigens in bacterial vaccine fectors | |
PL171476B1 (en) | Method of obtaining attenuated salmonella bacterium |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RECP | Rectifications of patent specification |