KR20010024650A - ＲｐｏＳ 양성 표현형을 가진 면역원성 약독화 박테리아를포함하는 재조합 백신 - Google Patents

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Abstract

RpoS+표현형을 갖는 약독화된 면역원성 박테리아, 특히 RpoS+표현형을 갖는 살모넬라 엔테리카 혈청형 Typhi와 그를 위한 방법들이 개시되어 있다. 상기 살모넬라는 RpoS+표현형 이외에 이 미생물을 약독화하는 하나 이상의 유전자에서의 불활화 돌연변이와 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 유전자를 갖는다. 상기 살모넬라는 약독화되어 있고 높은 면역원성을 가지므로, 백신내에 사용될 수 있고, 또한 유전자와 유전자 생성물을 위한 운반수단으로서 사용될 수 있다. 또한, 백신 운반 수단의 제조방법들이 개시되어 있다.

Description

ＲｐｏＳ 양성 표현형을 가진 면역원성 약독화 박테리아를 포함하는 재조합 백신{RECOMBINANT VACCINES COMPRISING IMMUNOGENIC ATTENUATED BACTERIA HAVING RpoS POSITIVE PHENOTYPE}
생균 약독화 살모넬라(Salmonella) 균주는 재조합 항원들 또는 다른 단백질들을 위한 운반 비히클들로 사용될 수 있다. 또한 항원 운반체들로써, 재조합 살모넬라는 생균 백신들로 사용되는 것이 개시되어 있다(Curtiss 등, Essentials of Musocal Immunology, Kagnoff 및 Kiyono, Eds., Academic Press, 샌디에고, 1996, pp 599∼611; Doggett 및 Brown, Mucosal Vaccines, Kiyono 등, Eds., Academic Press, 샌디에고, 1996, pp 105∼118; Hopkins 등, Infect Immun. 63:3279∼3286, 1995; Srinavasin 등, Vaccines 95, R.N.Chanock 등, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, p 273∼280, 1995 참조).
이상적으로는 생균 약독화 백신 균주들은 약독화(attenuation) 및 면역원성(immunogenicity)의 두 성질사이의 균형을 유지하여야 한다. 이같은 백신 균주들은 어떠한 질병도 유발하지 않아야 하며, 정상 숙주의 생리 및 성장에 손상을 끼쳐서는 않되므로, 이와 같이 약독화되며, 동시에 경구 투여에 의한 림프 조직 또는 다른 경로의 투여에 의한 림프 기관에 연관되어 면역원성이 되기 위해 장 및 창자(intestine and gut)에서 콜로니를 형성할 수 있다. 그러나, 실용적인 방법으로 상기와 같은 이상적인 균형을 달성하지 못하고 있다(Curtiss, New Generation Vaccines Woodrow 및 Levine, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1990, pp. 161∼188). 이와 같이 거의 대부분의 노력은 살모넬라 백신에 있어 높은 면역원성을 갖는 균주들의 생산보다 균주의 약독화 성분의 개량의 개발에 초점이 맞춰져 있다.
백신들로 사용하기 위한 미생물에서 약독화를 달성하기 위한 작업은 생합성 유전자들, 조절 유전자들 및/또는 독성(virulence) 균주 내에 포함되어 있는 유전자들에서 약독화 돌연변이들을 이용하였다(상기 Doggett 및 Brown 참조). 약독화 달성을 위한 방법으로 돌연변이를 유발시킨 상기의 조절 유전자의 하나는 rpoS 유전자이었다. rpoS 유전자는 교대성 시그마 인자(alternative sigma factor)인 RpoS를 암호화하며, 30개의 이상의 유전자를 발현하는 중지기(stationary phase)를 조절하는 것으로 알려져 있다(Loewen 및 Hengge-Aronis, Annu Rev Microbiol 48:53∼80, 1994). 상기 rpoS 유전자는 염색체(chromosomal) 뿐만 아니라 플라스미드 유래의 유전자들의 RpoS 조절에 의해 마우스에서 살모넬라 엔테리카 항원형 티피(Salmonella enterica serotype Typhimurium, Salmonella Typhimurium 라고도 언급한다)의 독성에 기여하는 것으로 나타났다(Fang 등, Proc Natl Acad Sci 89;11978∼11982, 1992; Norel 등, FEBS Microbiol Lett 99: 271∼276, 1992; Kowarz 등, J Bactriol 176:6852∼6860, 1994). 동시에, RpoS는 염색체 유전자 독성 결정기들(determinants)과 작용하여 인체에서 Salmonella Typhi의 독성에 기여한다고 생각되며, 이같은 까닭에 상기의 미생물들은 S. Typhimurium 에 존재하는 독성 플라스미드를 갖고 있지 않다(Robbe-Saule 등, FEMS Microbiol Let 126:171∼176, 1995: Coynault 등, Mol Microbiol 22: 149∼160, 1996). 돌연변이 rpoS S. Typhimurium 균주들은 약독화되었으며(상기 Fang 등), 마우스내에서 보호적 면역성(protective immunity)을 나타낼 수 있다고 알려져 있다(Nickerson 및 Curtiss, Abstracts of the 96th General Meeting of the American Society for Microbiology B-141:179, 1996; Coynault 등, Mol Microbiol 22:149∼160, 1996). 상기의 결과와 같이, rpoS 돌연변이들은 백신들을 개발하는데 주요한 후보자가 될 수 있다(상기 니커슨 및 커티스).
Salmonella Typhi의 약독화 균주들은 장티푸스(typhoid fever)에 대하여 뿐만 아니라 재조합 항원 운반 비히클들로 사용될 때 이종 항원들에 대하여 인간 백신들로서 사용되었다(Forrest, CRC Press Inc., 1994, pp. 59∼80; Levine 등, New Generation Vaccines Woodror 및 Lerine, Eds., Marcel Dekker, Inc, New York, 1990, pp. 269∼287). 티피(Typhi) 균주들에 기초하는 상기의 백신들은 대부분이 전적으로 Ty2 균주, 특히, 다른 돌연변이들과 함께 galE 돌연변이를 포함하는 Ty21a 균주에서 유래되었다. Ty2 및 이의 Ty21a 유도체 백신 균주는 rpoS 돌연변이를 나타내며, 이 돌연변이는, 적어도 부분적으로, Ty21a 및 아마도 rpoS 유전자 생성물에 의해 조절되는 염색체 독성 유전자들의 억제 조절에 의한 Ty2로부터 유래되는 다른 백신 균주들에서 나타나는 약독화에 의할 수 있다. Ty21a 백신은 Ty2에서 유래되는 전형적인 백신들이며, 비록 약독화되었지만, Ty21a 백신은 낮은 백신 효능(efficacy)을 갖고 있음이 증명되었고, 보호적 면역성을 유도하기 위해 백신접종된 개인들의 약 2/3에서 약 1010cfu의 3배의 고 용량을 필요로 한다(상기 포레스트). 이와 같이, 숙주에 원하는 유전자 생성물의 운반에 적합한 백신들에 사용하기 위한 고 면역원성뿐만 아니라 낮은 독성을 나타내는 Salmonella Typhi 균주들의 계속적 필요성이 남아있다.
S. Typhi의 다른 균주들은 비록 보고될 때에는 기대되지 않았지만 기능적(functional) rpoS 유전자를 갖을 수 있는 것으로 보고되었다 예컨대 27V 및 ISP1820 균주들에 기초한 인간 백신들이 보고되었다(Reitman, J Infect Dis 117: 101∼107, 1967; Levine 등, J Infect Dis 133:424∼429, 1976; Tacket 등, Infect Immun 60:536∼541, 1992). 어떠한 균주들도 재조합 유전자를 포함하지 않으며, 백신조성물내에 재조합 유전자를 운반하는 것도 없었다.
재조합 rpoS+S. Typhi에 대한 보고에서, 코이널트(Coynault) 등은 미생물에 RpoS+표현형을 주는 재조합 rpoS 유전자를 포함하는 Ty2 유도체의 구성을 개시하였다. 그러나, 상기 Ty2 유도체는 오직 실험실적인 연구에만 사용할 수 있으며, 부가적인 재조합 유전자는 도입되지 않으며, 백신조성물내에 상기 유도체의 사용에 대하여는 아무것도 가르쳐 주지 않는다.
최종적으로 S. Typhi 균주 ISP1820 및 ISP1822(미국특허 제5,387,744호, 제5,294,441호 및 PCT 출원 WO/9424291) 및 S. Typhi 균주 531Ty(미국특허 제4,837,151호)는 구조적(construct) 유도체 백신 균주들을 사용하였다. 비록 여기에 보고된 연구들이 RpoS+가 되기위해 ISP1820, ISP1822 및 균주 531Ty를 기재하였다하여도, 선행 문헌들에서는 전혀 알려지지 않았다. 더구나, 상기의 문헌의 어느것도 백신 제제에 있어 고 면역원성의 달성에서 기능성 rpoS 유전자의 존재의 중요성을 인식하지 못하고 있다. 그 결과, 상기의 문헌들은 RpoS+표현형의 존재에 근거한 백신 균주들의 선택을 개시하지 못하였다.
본 명세서의 상·하에 언급되는 모든 참고문헌은 참고문헌 항에 삽입하였다. 여기의 참고문헌의 언급은 그 저자들에 의한 주장을 요약할 의도이고, 언급된 참고문헌들의 정확성 또는 관련성을 인정하는 것은 아니며, 어떤 참고문헌도 특허성의 소재가 되지 않는다.
본 발명은 일반적으로 약독화 미생물들에 관한 것이며, 좀더 상세하게는 백신으로 사용하거나 유전자 및 유전자 생산물을 위한 운반 비히클들을 위한 RpoS+표현형을 포함하는 새로운 약독화 박테리아 및 이들을 제조하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 특히 살모넬라 엔테리카 항원형 티피(Salmonella enterica serotype Typhi, Salmonella Typhi 라고도 언급한다)와 같은 살로넬라에 적용될 수 있다.
본 발명의 요약
본 발명에 의하면, 본 발명자들은 살모넬라 백신 균주들에 있어 기능성 rpoS 유전자 및 RpoS+표현형의 존재가 살모넬라에게서 고 면역원성을 부여하는데 있어, 기능성 rpoS 유전자의 결정적으로 중요함을 발견하는데 성공하였다. 그 결과, RpoS+표현형이 rpoS 유전자에서의 돌연변이와는 다른, 하나 이상의 불활성화 돌연변이들(inactivating mutations)과 같이 존재할 때, 미생물에게 약독화를 부여하며, 약독화와 고 면역원성의 새롭고 이로운 균형이 달성된다. 본 발명은 특히 S. Typhi에 기초한 백신에 적용될 수 있으나, S. paratyphi A, B 및 C와 같은 다른 살모넬라뿐만 아니라 다른 티피뮤리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 두브린(Dublin) 및 콜레라수이스(Choleraesuis)와 같은 S. enterica의 다른 항원형에도 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 쉬겔라(Shigella), E. coli, 및 살모넬라-쉬겔라 잡종(hybrid), 살모넬라-E. coli 잡종, 쉬겔라-E. coli 잡종와 같은 상기 박테리아들의 잡종를 포함하는 인간 조직에 콜로니를 형성할 수 있는 rpoS 유전자 및 그의 기능성 동등물을 갖는 다른 박테리아에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서는, 인간에게 원하는 유전자 생성물의 운반방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 특성을 갖는 균주에 근거한 S. Typhi와 같은 박테리아 균주를 선별(selecting)을 포함한다; (i) RpoS+표현형, (ii) 균주에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (iii) 유전자 생성물을 암호화하는 재조합 유전자. RpoS+표현형에 관한 선별 과정은 전부 또는 부분적으로 그것의 RpoS 표현형을 결정하는 균주의 시험을 포함할 수 있다. 이 같이 선택된 균주는 인간에게 투여된다. 균주에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들은 하나의 유전자 내에서의 돌연변이 또는 두개 이상의 유전자 각각에서의 돌연변이를 포함할 수 있다.
살모넬라 또는 다른 박테리아의 RpoS+표현형 활성들은 염색체 rpoS 유전자 및/또는 균주에 도입된 재조합 유전자에 의해서 생성될 수 있다. 이같이, 다른 구체예에서는, 상기 방법은 하기의 특성을 갖는 박테리아의 생균 약독화 균주를 인간에게 투여하는 것을 포함한다; (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 상기 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (d) 원하는 생성물을 암호화하는 2차 재조합 유전자. 재조합 rpoS+유전자 또는 야생형 rpoS 유전자에서, rpoS 유전자는 기능적 rpoS 유전자 생성물을 생산하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.
본 발명의 약독화 미생물들은 원하는 유전자 생성물을 발현하는 것이 가능한 최소한 하나의 재조합 유전자를 포함하며, 이것은 인간에게 유전자 생성물의 담체(carrier) 또는 운반 비히클(delivery vehicle)로서의 사용을 부여한다. 본 발명의 미생물에 의해 운반될 수 있는 유전자 생성물들의 예들은, 하기에 제한되지는 않지만: 인간 병원체(pathogen)로부터 발생될 수 있는 또는 예컨대, 생식자(gamete)-특이 항원과 같이 인간 자체로부터 자동면역 적용들에서의 사용을 위해 발생될 수 있는 항원들; 다당질(polysaccharide), 지질단백질(lipoprotein), 당단백질(glycoprotein) 및 당지질(glycolipid)과 같은 항원들을 생성할 수 있는 효소들; 사람의 알레르기원(allergen); 면역조절 분자들; 및 약물학적 활성 폴리펩타이드들이 포함된다. 원하는 유전자 생성물의 운반에서, 유전자 생성물 및 상기 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 인간에게 운반하는 것을 의미한다. 재조합 rpoS 유전자를 포함하는 약독화 박테리아의 구체예들에서는, 원하는 유전자 생성물은 2차 재조합 유전자에 의해 암호화된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 인간에게 원하는 유전자 생성물의 운반을 위한 담체 미생물들의 균주를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (1) RpoS+표현형을 포함하는 S. Typhi 또는 다른 박테리아 균주의 선별; (2) 상기 균주에 약독화를 부여하는 RpoS+균주에서의 하나 이상의 불활성화 돌연변이들의 생성; (3) 원하는 유전자 생성물을 암호화하는 재조합 유전자의 상기 균주내로의 도입을 포함한다. 선별단계는 전체 또는 부분적으로 그것의 RpoS 표현형을 결정하는 균주의 시험을 포함할 수 있다. 1∼3의 단계는 여러 순서로 행해질 수 있다.
다른 구체예에서는, 본 발명은 원하는 유전자 생성물을 인간에게 운반하기 위한 담체 미생물을 생성하는 다른 방법을 포함한다. 상기 방법은 (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 상기 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (d) 원하는 생성물을 암호화하는 2차 재조합 유전자를 포함하는 S. Typhi 또는 다른 박테리아 생균 약독화 균주의 생성을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서는, 원하는 유전자 생성물을 인간에게 운반하기 위한 담체 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 상기 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (d) 원하는 생성물을 암호화하는 2차 재조합 유전자를 포함하는 S. Typhi 또는 다른 박테리아 생균 약독화 균주를 포함한다.
다른 구체예에서는 인간의 면역(immunization)을 위한 백신이 제공된다. 상기 백신은 (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 상기 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (d) 원하는 생성물을 암호화하는 2차 재조합 유전자를 포함하는 S. Typhi 또는 다른 박테리아 생균 약독화 균주를 포함한다.
또한 본 발명의 다른 구체예에서는 유전적으로 조작된 세포(cell)를 제공한다. 상기 세포는 (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 상기 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (d) 원하는 생성물을 암호화하는 2차 재조합 유전자를 포함하는 S. Typhi 또는 다른 박테리아 생균 약독화 균주를 포함한다. 또한 인간에게 투여하기 적절하게, 상기 유전적으로 조작된 세포들과 약제학적으로 수용가능한 제제(formulation)의 혼합을 포함하는 백신의 제법을 제공한다.
또한 본 발명은 유전적으로 조작된 박테리아, 특히, RpoS 또는 야생형 박테리아에서 이것의 기능적 동등물에 의해 조절되는 재조합 병독성 유전자를 포함하는 S. Typhi를 제공하며, 인간에게 원하는 유전자 생성물의 전달을 위한 유전적으로 조작된 박테리아의 사용방법을 제공한다. 상기 재조합 병독성 유전자는 창자 관련 림프조직(GALT), 코(nasal) 관련 림프조직(NALT) 또는 기관지 관련 림프조직(BALT) 및 이의 유사물의 하나에 침입 및 콜로니화를 촉진하는 유전자 생성물을 발현할 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 S. Typhi 또는 다른 박테리아는 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 돌연변이뿐만 아니라 원하는 생성물을 암호화하는 2차 재조합 유전자를 포함하는 특징을 갖을 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명은 박테리아 균주 특히, 살모넬라의 면역원성의 지표로서 RpoS 표현형을 평가하는 방법을 제공한다. 실험실적 조건들하에서 전파되고 유지되는 많는 박테리아 균주들은 rpoS 돌연변이를 축적한다고 믿어졌다. 이와같이, 살모넬라 또는 다른 박테리아, 특히 백신에서의 사용을 위해 개발된 균주의 RpoS 표현형의 평가 방법의 제공은 유용하다. 이 방법은 RpoS에 의해 조절되는 미생물의 특성을 평가하여 박테리아의 RpoS 표현형을 결정하는 것을 포함한다. 증가된 면역원성은 RpoS-표현형을 갖는 동질유전자(isogenic) 균주의 면역원성에 비하여 RpoS+표현형의 존재에 의해 나타난다. 동질유전자 RpoS-균주는 RpoS+표현형를 나타내지 못하나, 시험 균주로서 같은 유전적 정보를 갖고 있다.
상기에서 기술한 것과 같이, 인간에게 원하는 유전자 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 운반은 본 발명의 방법들 및 조성물들의 범위에 속한다. 더구나, RpoS+표현형을 갖는 미생물에 근거한 방법들 및 조성물들을 포함하는 상기의 구체예들의 각각은 더욱 더 인간의 세포들로의 상기 유전자 또는 그것의 부분의 운반을 위한 방법들 및 조성물들을 포함하는 것을 의도한다. 상기 유전자 또는 그것의 부분은 인간의 세포들로 운반이 의도되어진 DNA 또는 RNA와 같은 유전정보를 포함하는 진핵 발현 카세트(cassette)를 포함할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 하나의 구체예에서는 인간의 세포들로 유전자 또는 그의 일부분의 전달방법들을 제공한다. 이같은 방법은 (i) RpoS+표현형, (ii) 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (iii) 상기 유전자 또는 그의 부분을 포함하는 균주에 근거하는 S. Typhi와 같은 박테리아의 선별을 포함한다. RpoS+표현형에 관한 선별 과정은 전부 또는 부분적으로 그것의 RpoS 표현형을 결정하는 균주의 시험을 포함할 수 있다. 이 방법은 또한 (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 상기 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (d) 상기 유전자 또는 그의 부분을 갖는 박테리아의 생균 약독화 균주를 인간의 세포들로 운반하는 것을 포함할 수 있다. 상기 유전자 또는 그의 부분은 진핵 발현 카세트내에 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 인간의 세포들로 원하는 유전자 또는 그의 일부분의 전달하기 위한 담체 미생물들의 균주를 생산한다. 이같은 방법은 (1) RpoS+표현형을 포함하는 S. Typhi 또는 다른 박테리아 균주의 선별; (2) 상기 균주에 약독화를 부여하는 RpoS+균주에서의 하나 이상의 불활성화 돌연변이들의 생성; (3) 원하는 유전자 또는 그의 부분을 상기 균주내로의 도입을 포함한다. 상기 유전자 또는 그의 부분은 진핵 발현 카세트내에 존재할 수 있다. 선별단계는 전체 또는 부분적으로 그것의 RpoS 표현형을 결정하는 균주의 시험을 포함할 수 있으며, 상기의 단계들은 여러 순서로 행해질 수 있다. 상기 방법은 또한 (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 상기 미생물에 약독화를 부여하는 하나 이상의 불활성화 돌연변이들, (d) 원하는 유전자 또는 그의 부분을 갖는 S. Typhi 또는 다른 박테리아 생균 약독화 균주의 생성을 포함할 수 있다. 상기 유전자 또는 그의 부분은 진핵 발현 카세트내에 존재할 수 있다.
약독화된 박테리아가 목표 숙수세포내에서 핵산을 유리하기 위해 용해(lyse)되는 한, 용균유전자 또는 그의 부분을 운반하는데 사용할 수 있는 박테리아는 약독화된 살모넬라, E. coli, 쉬겔라, 살모넬라-쉬겔라 잡종, 살모넬라-E. coli 잡종 또는 쉬겔라-E. coli 잡종일 수 있다.
그러므로 본 발명에 의해 달성되는 몇가지 이점들 중에서, 콜로니 형성할 수 있고 만일 경구적으로 투여될 때 창자와 관련된 림프 조직으로, 비강내로 투여될 때 코와 관련된 림프조직으로, 다른 경로로 투여될 때 다른 림프조직으로 원하는 유전자 생성물 또는 원하는 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있는 담체 미생물의 공급; 핵산 분자의 용해 및 유리하는 RpoS+담체 박테리아 세포의 사용에 기초한 인간 세포들로의 핵산 분자의 효율적이고 저렴한 운반 방법의 제공; 약독화되고 고 면역원성인 백신 제제들의 제공; 면역 반응을 일으키기 위하여 담체 미생물 투입에 의한 개개인에게의 원하는 유전자 생성물 또는 폴리뉴클레오티드의 운반방법들의 제공; RpoS+담체 미생물들 및 고 면역원성을 가질뿐 아니라 약독화된 백신들의 제조방법들의 제공; 및 RpoS 표현형의 결정에 의한, 살모넬라 또는 다른 박테리아의 면역원성의 평가 방법들의 제공에 주목할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 rpoS+Salmonella Typhimurium, χ3339 및 동질유전자 rpoS 돌연변이 Salmonella Typhimurium, χ4973의 J774 쥐의 마크로파지(macrophage)-유사 세포들내의 생존 시간 코스를 도시한 것이고,
도2는 rpoS+Salmonella Typhimurium, χ3339 및 동질유전자 rpoS 돌연변이 Salmonella Typhimurium, χ4973의 래트(rat) 골수 유래 마크로파지들내의 생존 시간 코스를 도시한 것이며,
도 3은 도 3A에서 정상적인 쥐의 페이어스 패취(Peyer's patch) 조직; χ4973으로 경구 감염 1일 후의 쥐의 페이어스 패취 조직(도 3B), 3일 후(도 3C), 5일 후(도 3D); 및 χ3339로 경구 감염후 1일 후의 쥐의 페이어스 패취 조직(도 3E 및 3F), 3일 후(도 3G), 5일 후(도 3H)의 약 200 ×배율(50㎛ 선에 의해 나타남)에서 광 현미경사진을 도시한 것이고,
도 4는 정상적인 쥐의 페이어스 패취 림프 조직(도 4A), χ4973(도 4B) 또는 χ3339(도 4C)로 경구 감염 5일 후의 쥐의 페이어스 패취 조직의 약 2000 ×배율(5㎛ 선에 의해 나타남)에서 전도(transmission) 전자 현미경사진을 도시한 것이며,
도 5는 정상적인 쥐의 페이어스 패취 조직(도 5A), χ4973(도 5B) 또는 χ3339(도 5C)로 경구 감염 5일 후의 정상적인 쥐의 페이어스 패취 조직의 약 2000 ×배율(50㎛ 선에 의해 나타남)에서 전도 전자 현미경사진을 도시한 것이고,
도 6은 한정된 ΔpoPQ23 돌연변이를 갖는 플라스미드 벡터들 및 박테리아 균주들의 구조를 도시한 것이며,
도 7은 한정된 ΔasdA16 돌연변이를 갖는 플라스미드 벡터들 및 박테리아 균주들의 구조를 도시한 것이고,
도 8은 Asd+벡터, pYA3167을 포함하는 S. Typhimurium Δcya Δcrp Δasd RpoS+및 RpoS-균주들에 의한 재조합 HBV 코아-전구-S 단백질의 발현, Asd+벡터를 S. Typhimurium χ8296(Δcys Δcrp Δasd) 및 χ8309(Δcys Δcrp Δasd rpoS)내로 도입하여 구성된 HBV 코아-전구-S 단백질의 발현을 도시한 것이며, (A)쿠마씨 블루(Coomassie blue)에 염색된 12% 소디움 오데실 설페이트(SDS) 폴리아트릴아마이드 겔 일렉트로포레시스(PASE) 및 (B) 전구S2 에피토프(epitope)로 향한 모노클로날 항원을 사용한 웨스턴 블롯으로 시험되었으며, 두 겔들은 다음과 같은 라인들을 갖는다: 라인 1, 분자 마커들; 라인 2, χ8296(Δcys-27 Δcrp-28 ΔasdA16 cfs RpoS+): 라인 3 및 4, pYA3167을 포함하는 χ8296(HBV 코아-전구-S 항원을 발현하는 Asd+벡터); 라인 5, χ8309(Δcys-27 Δcrp-28 ΔasdA16 cfs rpoS); 라인 6 및 7, χ8309 플러스 pYA3167(HBV 코아-전구-S 항원을 발현하는 Asd+벡터).
도 9는 pYA3167(HBV 코아-전구-S 항원을 발현하는 Asd+벡터) 또는 이에 상당하는 RpoS-유도체, χ8309(pYA3167를 포함하는 Δcys Δcrp Δasd RpoS+)을 포함하는 109CFU 또는 및 χ8296(Δcya Δcrp Δasd RpoS+)에 의해 경구적으로 면역화된 쥐에서 얻어진 S. Typhimurium, SL1344 균주들에 의해 발현되는 HBV 코아-전구-S 단백질에 대한 항체 틸터(tilter)들의 유도를 도시한 것이며, 코팅 항원으로서 전구-S 서열 전체 길이를 나타내는 재조합 폴리펩타이드를 사용하는 ELISA에 의한 면역후 4 및 6주 후에 측정된 (A) 혈청 IgG 항체 틸터 및 (B) 생식기 세척물내의 IgA 항체(n=4).
도 10은 pYA3167 플라스미드를 도시한 것이며,
도 11은 pYA3433 플라스미드를 도시한 것이고,
도 12는 S. Typhi ΔphoPQ Δasd 백신 균주들내의 재조합 하이브리드 HBcAg-전구-S 항원의 발현을 나타내는 12% 소디움 도데실 설페이트(SDS) 폴리아트릴아마이드 겔 일렉트로포레시스(PASE)의 쿠마씨 블루 염색을 도시한 것이며, 여기에서 화살표는 라인 1, 폴리펩타이드 SDS-PASE 크기 표준들을 위한 재조합 항원의 위치를 나타내고; 라인 2, MGN-1191; 라인 3, MGN-1191/pYA3167, 형질전환체 (transformant) #1(χ8281); 라인 4, MGN-1191/pYA3167, 형질전환체 #2; 라인 5, MGN-1191/pYA3167, 형질전환체 #3; 라인 6, MGN-1256; 라인 7, MGN-1256/pYA3167, 형질전환체 #1(χ8280); 라인 8, MGN-1256/pYA3167, 형질전환체 #2; 라인 9, MGN-1256/pYA3167, 형질전환체 #3; 및 라인 10, χ6212/pYA3167.
도 13은 S. Typhi ΔphoPQ Δasd 백신 균주들내의 재조합 하이브리드 HBcAg-전구-S 항원의 발현을 나타내는 SDS 12% PASE 후의 항-HBV-전구S 모노클로날 항체에 의한 면역염색을 도시한 것이며, 여기에서 화살표는 라인 1, 폴리펩타이드 SDS-PASE 크기 표준들을 위한 재조합 항원의 위치를 나타내고; 라인 2, MGN-1191; 라인 3, MGN-1191/pYA3167, 형질전환체 #1(χ8281); 라인 4, MGN-1191/pYA3167, 형질전환체 #2; 라인 5, MGN-1191/pYA3167, 형질전환체 #3; 라인 6, MGN-1256; 라인 7, MGN-1256/pYA3167, 형질전환체 #1(χ8280); 라인 8, MGN-1256/pYA3167, 형질전환체 #2; 라인 9, MGN-1256/pYA3167, 형질전환체 #3; 및 라인 10, χ6212/pYA3167.
도 14는 pCMV 베타-asd 플라스미드를 도시한 것이다.
바람직한 실시예들의 기술
본 발명에서는 기능적 rpoS 유전자 및 RpoS+표현형을 포함하는 살모넬라는 고 면역원성을 갖고 백신들 및 담체 미생물들로서 사용하기 유리할 수 있다는, S. Typhi와 같은 다른 살모넬라에서 기대할 수 있는 S. Typhimurium에서 행하여진 발견에 근거한다. 이 같은 백신들 및 담체 미생물들은 인간에게 항원으로서 원하는 유전자 생생물들을 위한 운반수단(vehicle) 뿐만 아니라 핵산, 즉, DNA 또는 RNA를 목표 인간 세포들로의 운반을 위한 운반수단로써 작용할 수 있다.
rpoS 유전자 생성물은 독성의 염색체 유전자 결정인자들의 발현의 조절에 의한 마우스에서의 Salmonella Typhimurium의 독성에 최소한 부분적으로 기여하며, 유사한 기전을 통해 인간에서 S. Typhi의 독성에 기여하는 것으로 믿어진다. 인간의 면역을 위한 생균 S. Typhi 백신들의 개발하기 위해 행하여진 많은 연구는 마우스에서 시험된 S. Typhimurium의 균주들을 사용한 연구에 의존하였다. 상기 S. Typhimurium 균주들은 감수성있는 마우스에서 인간의 장티프스와 유사한 침해적 감염(invasive infection)을 발병한다(Carter 및 Collins, J. Exp. Med. 139:1189∼1203; Hohmanm 등 Infect Immun 22: 763∼770, 1978; Coynaut 등 Molecular Microbiol. 22:149∼160, 1996). 게다가, Salmonella Typhimurium의 침입성 및 독성에서 rpoS 유전자의 역할은 야생형 미생물과 유사한 효능을 갖는 페이어스 패취들의 콜로니화에서 보여지는 독성 플라스미드의 회복(cure)된 Salmonella Typhimurium 균주이므로, 독성 플라스미드가 결여된 Salmonella Typhi의 침입성 및 독성과 관련된다(Gulig 및 Curtiss, Infect Immun 55:2891∼2901, 1987; Hackett 등, J Infect Dis 153:1119∼1125, 1986). Salmonella Typhi에서도 적용될 수 있는, Salmonella Typhimurium의 연구들의 결과는 rpoS 유전자 생성물은 침입성 및 독성에 중요한 염색체의 암호화 유전자들의 발연을 조절하는 것으로 나타났다(Nickerson 및 Curtiss, Infect 및 Immun 65:1814∼1823, 1997; Kowarz 등 J Bacteriol 176:6852∼6860, 1994).
하기 실시예들에서 기술된 연구들에서, 본 발명자들은 기능적 rpoS 유전자의 존재가 페이어스 패취들의 수준에서 Salmonella Typhimurium 감염 과정의 초기 단계에서 필요하다는 것과 rpoS 유전자 생성물이 염색체 유전자들과 상호작용을 통하여 작용한다는 것을 발견했다. 특히, S. Typhimurium의 rpoS 돌연변이체는 인간 태아의 장 상피 세포 라인, Int-407 및 쥐의 마크로파지-유사 세포 라인, J774의 세포들의 부착 및 침입에 대한 야생형 능력을 나타냈다. 게다가, rpoS 유전자내의 돌연변이는 H774 마크로파지-유사 세포들 또는 래트 골수-유래의 마크로파지들에서 S. Typhimurium의 세포내의 생존에 영향을 미치지 않았다. 그러나 rpoS 돌연변이주는 야생형 독성 부모 균주에 비하여 경구 접종후 쥐의 페이어스 패취를 콜로니하하는 능력의 감소함이 증명되었다.
게다가, rpoS 돌연변이주의 유전자독성 플라스미드-회복 유도체들은 동질유전자 야생형 S. Typhimurium의 플라스미드-회복 유도체들에 비하여 쥐의 페이어스 패취로부터 낮은 수를 회복하였다. 이것은 염색체의 암호화 유전자의 RpoS 조절은 S. Typhimurium에 의한 쥐의 창자에 관련된 임파 조직(GALT)의 콜로니화에 중요하다는 것을 지적한다.
마우스의 경구 투입후의 페이어스 패취들로부터 얻어진 조직학적 단면들의 현미경적 분석은 야생형 독성 부모 균주와는 달리, 동질유전자 rpoS 돌연변이주에서는 GALT의 여포(follicle)-관련 상치가 파과되지 않는다. 게다가, rpoS 돌연변이주는 야생형의 부모에 비하여 쥐의 페어스 패취의 조직학적 단편들의 부착성이 감소하는 것이 증명되었다. 상기의 데이타는 살모넬라에 의한 전신적인 감염의 초기 단계에서 rpoS 유전자는 페이어스 패취의 세포에서 살모넬라의 상호작용을 포함한다는 것을 지적하다.
rpoS 돌연변이주의 페이어스 패취를 콜로니화의 감소된 능력의 결과때문에, 초기의 보고서들은 rpoS 유전자에서 불활성화 돌연변이를 갖는 살모넬라 균주들은 생균 경구 약독화 백신들에서 사용하기 위한 좋은 후보자라고 제안하였다(상기 니커슨 및 커티스, 1996). 이같은 초기의 연구에 비하여, 본 발명은 다른 유전자내에 약독화 돌연변이와 함께 기능적 rpoS+유전자를 포함하는 살모넬라 균주들 및 다른 박테리아에 관련된다. 그 결과, 본 발명의 균주들은 경구 투여시에 고 면역원성을 달성하기 위하여 침입 세포들을 파괴하는 것이 없이, 페이어스 패취 또는 예컨대,인간의 GALT의 다른 림프조직들 포함하는 유사 조직들을 콜로니화 할 수 있다. 게다가 GALT의 여포-관련 림프조직의 M 세포들은 결막 관련 림프조직(CALT), 기관지 관련 림프조직(BALT), 코 관련 림프조직(BALT) 뿐만아니라 직장내 등의 림프조직과 같은 신체내의 다른 점막의 림프조직들과 관련된 M 세포들과 기능적, 형태적 및 구조적으로 동일하다. 이같이 살모넬라에서 기능적 rpoS+유전자의 존재는 경구, 비강, 직장 등을 포함하는 경로들에 의해 투여될 때, 이 같은 조직들에 대한 침입 및 콜로니화에 중요한 역할을 한다고 믿어진다. 사실, 하기 실시예들에서 볼 수 있는 것과 같이, 비강으로 운반될 때, NALT 및 BALT의 콜로니화가 가장 중요한 곳에서, RpoS+S. Typhimurium , 외래 항원을 발현하는 비재조합 및 재조합 모두 보호적 면역부여 및 외래 항원들에 반응하여 항체를 생성하는데 있어 동질유전자 RpoS-S. Typhimurium보다 우수하다.
본 발명의 범위에 속하는 살모넬라 및 다른 박테리아 균주들은 기능적 rpoS 유전자 생성물을 생산하는 그들의 기능적 rpoS+유전자를 갖는 것에 근거하여 선택될 수 있다. rpoS 유전자 생성물은 기근(starvation) 및 변이기에서 정지기사이에 반응하여 발현되는 30개 유전자들 이상의 레귤론(regulon)의 조절에 반응하는 정지기 시그마 인자로 알려져있다. RpoS의 조절하의 유전자들의 단백질 생성물들은 DNA 손상, 형태적 변화의 결정, 독성의 조정, 삼투보호(osmoprotection) 및 열저항성(thermotolerance)에 대한 보호를 포함하는 세포 기능들의 다수를 조절한다(Loewen 및 Hengge-Aronis, Annu. Rev. Microbiol. 48:53∼80, 1994). 여기의 RpoS 표현형에 대한 참고문헌은 미생물에서 rpoS 유전자 발현에 의해 조절되는 세포기능들의 표시(manifestation)를 의미하는 것이다.
RpoS 조절에 의해 조절되는 많은 세포 기능들은 미생물의 RpoS 표현형을 결정하여 평가할 수 있다. 예컨대, 카탈라제(catalasa) 생성을 위한 배양을 분석할 수 있다. 이 시험은 하이드로페록시다제(hydroperoxidase) II 카탈라제를 생산하는 katE 유전자의 RpoS 양성 조절에 근거한다. 야생형 rpoS 알렐(allele)을 운반하는 균주들의 배양 배지는 정지기에서 자라고, 과산화수소의 첨가로 심하게 거품이 발생하며, 돌연변이 rpoS 알렐을 운반하는 균주들의 정지기 배양 배지에서 최소의 거품이 발생한다(Lowen, J. Bacteriol. 157:622∼626, 1984; Mulvey 등 , Gene 73: 337∼345, 1988). 약독화 S. Typhimurium 균주들의 RpoS 표현형은 또한 이 균주들의 영양손실, 산 또는 산화 압박 및 글리코겐 생합성 능력 손실의 측정에 의해 평가할 수 있다. 상기 연구의 변수에서, RpoS 표현형은 상기에서 기술한 것 같이 카탈라제의 생산을 위한 유도된 미생물의 계속적 실험과 함께, 야생형 S. Typhimurium χ3339 내로의 rpoS 알렐의 P22HTint-조정 형질도입(transduction)에 의해 결정된다.
접합, 형질전환 또는 형질도입를 사용한 기능적 rpoS+유전자를 포함하지 않는 균주를 카탈라제 시험에서 rpoS+표현형을 나타내는 기능적 재조합 rpoS+유전자를 도입하여 유전적으로 변화할 수 있다. 재조합 rpoS+유전자는 적절한 동형 또는 이형 재료, 바람직하게는 동형 재료로부터 얻을 수 있다.
또한 RpoS 단백질에 의해 조절되는 유전자들의 발현을 더욱 증가시키기 위해 기능적 rpoS+유전자를 포함하는 살모넬라네로 플라스미드 리플리콘(replicin)상의 또는 염색체내로 통합된 다른 기능적 재조합 rpoS+유전자를 도입하는 것도 가능하다. 이것은 예컨대 미생물에서 rpoS 유전자 발현의 감소를 나타낼 때, 즉 미생물이 GALT의 가장 바람직하지 않은 콜로니화를 나타날 때 또는 비록 rpoS 유전자 발현은 감소하지 않고 원하는 정상의 발현보다 더 클 때와 같은 어떤 상황에서 바람직하다.
또한 비록 기능적 RpoS를 발현하지 않아도, GALT 또는 다른 림프조직들을 효과적으로 콜로니화할 수 있는 살모넬라 또는 다른 박테리아를 제공하는 것이 가능하다. 예컨대, rpoS-표현형은 최소한 하나의 재조합 독성 유전자를 rpoS 돌연변이 균주내로의 도입을 방해할 수 있다. 염색체의 독성 유전자의 기능이 RpoS에 의해 일반적으로 조절되는 것처럼, 재조합 독성 유전자 또는 여기에 언급된 재조합 RpoS 독성 유전자는 같은 생물학적 기능, 즉, GALT 또는 다른 림프조직의 효율적인 콜로니화를 촉진 기능을 갖는 유전자 생성물의 발현을 가능한 재조합 유전자를 의미하는 것이다. 그러나, 삽입된 재조합 독성 유전자의 발현은 기능적 RpoS의 존재에 의존하지 않는 조절 요소들에 의해 조절되어, 기능적 RpoS 없이 재조합 독성 유전자 생성물의 발현을 제공한다. 예컨대, 기능적 rpoS+유전자는 하기 조직의 콜로니화에 필수적인, 페이어스 패취에 살모넬라의 부착(adherence)에 중요함을 나타낸다. 상기 부착에 요구되는 하나 이상의 유전자들은 RpoS에 의해 조절된다고 믿어진다. RpoS에 의해 조절되는 페이어스 패취에 부착을 조절하는 후보자 유전자 그룹의 하나는 lpf 섬모(fimbrial) 오페론일 수 있다(Baumler 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:279 χ283, 1996). 이와 같이 rpoS 돌연변이 미생물의 침입성 및 면역원성은 기능적 RpoS의 존재에 의존하지 않는 조절요소들의 조절하에 미생물에 하나 이상의 독성 유전자들의 형질전환에 의해 증가될 수 있다.
본 발명의 일구체예에서, rpoS+박테리아 균주, 더욱 상세하게는 rpoS+살모넬라 균주는 병원성 균주의 약독화된 유도체이다. 유도체 또는 유도된 균주란 그 균주가 유래되는 양친으로부터 유전적으로 변형되어진 균주를 의미한다. 병원성이 있다란 당해 미생물이 질병을 유발시키거나 정상적인 생리 기능을 손상시킬 수 있는 능력이 있다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 기재된 비독성 또는 약독화란 특정 미생물 균주가 정상적으로는 당해 균주의 독성이며 약독화 되지 않은 병원성 짝균과 연관되어지는 질병 상태를 나타내는 전체 병징을 유도할 수 있는 능력이 없다는 의미를 나타내려고 한 것이다. 따라서, 비독성 또는 약독화는 약화된 독성 또는 질병 상태를 만들수 있는 능력을 가진 상태를 포함하고 약독화된 또는 무독성 미생물이란 반드시 숙주의 정상 생리적 기능을 손상시킬 수 있는 어떠한 능력도 완전히 상실되었다는 것을 의미하는 것은 아니다. 더욱이, 약독화된 또는 비독성 미생물은 반드시 병원체으로서 기능할 수 있는 능력이 항상 없다는 것은 아니나, 사용되어지는 특정 미생물은 치료되어지고 있는 특정 개체에 대하여 약독화되어 있다.
rpoS+살모넬라 균주를 포함하여, 본 발명의 rpoS+균주는 해당 미생물을 약독화시키는 하나 또는 그 이상의 유전자에 있어서 약독화시키는 돌연변이를 포함하는 것에 의해 약독화되어진다. 일실시예에 있어서, 균주들은 각각의 돌연변이가 미생물이 약독화되도록 작용하고, 조합하여서는 당해 미생물이 자연형 독성으로 되돌아가지 못할 확률을 현저히 증가시키는 적어도 2개의 돌연변이를 가지고 있다. 돌연변이는 유전자의 발현이 줄어들고 독성이 감소되는 한 삽입, 부분적 또는 완전한 결실 등이 될 수 있다. 약독화 돌연변이는 생합성 유전자, 조절 유전자 그리고/또는 독성에 관련되어지는 유전자에 존재할 수 있다(상기의 도겟과 브라운(Doggett and Brown)을 참조.). 돌연변이의 예들은 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합들에 존재하는 돌연변이를 포함하나, 상기의 돌연변이들에 한정되는 것은 아니다.
숙련된 자라면 당해 유전자의 돌연변이가 당해 미생물을 약독화시키는 한 어떠한 적합한 돌연변이도 본 발명에서 사용되어질 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
본 발명의 약독화된 미생물을 만들수 있는 돌연변이를 유발시키는 데 사용되어질 수 있는 방법은 당업계에서 알려져 있다. 예를 들면, 트렌스포존, Tn10이 살모넬라를 포함한 아주 다양한 범위의 박테리아에서 염색체 결실을 유발하기 위하여 사용되어질 수 있다(Kleckner 등, J.MOl.Biol.116:125-159,1977;EPO pub.No.315,682; 미국 특허 제5, 387, 744호).
최근에는, 특정 유전자들에 있어서 결실을 유발하기 위하여 새로운 방법들을 이용할 수 있게 되었다. 이들 방법들은 결실이 유발되어져야 하는 특정 유전자를 먼저 선발하는 것과 관련되어 있다. 한 접근법에 있어서, 상기 유전자는 상업적으로 구입된 또는 당업계에서 잘 알려진 방법들(Sambrook 등, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)을 사용하여 제조된 게노믹 라이브러리로부터 선발되어질 수 있다. 상기 유전자들을 포함하는 클론들은 동일한 유전자에 돌연변이를 포함하는 균주의 상보성(comprementation)에 의해서 게노믹 라이브러리로부터 분리되어진다. 대안으로, 상기 유전자의 DNA 서열이 밝혀진 경우에는 중합효소 연쇄반응법(PCR) 용도로 선발된 프라이머가 박테리아의 시료 또는 정제된 게노믹 DNA로부터 상기 유전자, 종종 약간의 인접 서열을 가진 상기 유전자를 증폭할 수 있고 상기 PCR 산물은 클로닝 벡터에 삽입되어질 수 있다.
선발되어진 유전자에 존재하는 특정 결실은 2개의 일반적 방법들 중 어느것에 의해 유발되어질 수 있다. 첫 번째 방법은 제한효소들을 이용하여 게노믹 DNA 라이브러리에 포함되어진 클론들의 집단으로부터 분리된 유전자에 돌연변이를 유발시키고 두 번째 방법은 PCR를 사용하여 알려진 서열의 유전자에 돌연변이를 유발시킨다.
첫 번째 방법을 사용하면, 벡터 상에서의 당해 유전자의 위치는 트렌스포존 꼬리표(tagging)를 사용하여 확인되어지고 벡터에 있는 재조합 DNA의 제한효소 지도가 만들어진다. 트렌스포존 꼬리표로부터 얻어진 정보에 의하여 한 유전자 전부 또는 일부분을 잘 알려진 제한효소 자리를 이용하여 벡터로부터 절제해낼 수 있게된다.
PCR 방법론에 근거를 둔 두 번째 방법은 당해 유전자의 DNA 서열이 알려져 있을 때 사용되어질 수 있다. 이 방법에 의하면, 벗어난 PCR 프라이머들은 당해 유전자로부터 결실되어져야 할 DNA의 특정 단편에 접하는 상류와 하류 지역을 증폭하고 클로닝 벡터와 뉴크레오티드 서열들에 접하는 상류와 하류로 구성되는 PCR 산물을 만든다(Inees 등. Eds., PCR Protocols, 1990, Academic Press, New York). 이 방법의 변형으로서, 유전자의 일부분 또는 인접 서열을 나타내는 PCR 산물들이 만들어지고, 그런 다음 클로닝 벡터에 함께 이어진다.
돌연변이 유전자를 포함하는 DNA는 화학적 수단 또는 전기천공법을 사용한 형질전환, 재조합 파아지 감염 또는 접합에 의하여 박테리아 숙주내로 도입되어질 수 있다. 실시예들에 있어서, 돌연변이 유전자는 박테리아의 염색체 내로 도입되어지는 데, 이는 당업계에서 잘 알려진 많은 방법들 예를 들면, 온도 민간성 레플리콘(Replicons)(Hamilton 등. J. Bacteriol. 171:4617-4622,1989), recBC 돌연변이체의 직선형 형질전환(Jasin 등. J.Bacteriol. 159:783-786,1984), 또는 자살 벡터들로 알려진 숙주 제한된 레플리콘(Miller 등., J.Bacteriol. 170:2575-2583,1988)을 사용하는 방법들 중 어느 것이라도 사용하여 이루어질 수 있다. 사용된 특정 방법은 예를 들면, 표현형적 특성들에 근거하거나 PCR, 핵산 교잡법 또는 면역학적 방법을 사용하여 돌연변이 알렐(allele)를 포함하는 클론을 찾기 위하여 스크리닝을 하는 푸사리산(fusaric acid) 저항성 또는 자당 저항성과 같은 적절한 카운터 선발법과 연계되어진다.
본 발명의 약독화된 rpoS+박테리아 균주, 특히 약독화된 S.typhi 돌연변이체는 재조합 항원을 인간에게 전달하기 위하여 백신의 형태로 또는 인간의 목표 세포에 핵산의 형태로 사용되어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 국부적 면역이 중요하고 방어의 첫 번째 전선이 되는 박테리아, 균류, 기생충 또는 바이러스성 질병 유발인자에 대한 효과적인 재조합 백신의 개발을 위한 분야에서 다양한 적용가능성을 가지고 있다는 것은 분명하다. 몇 가지 예로는 Yersinia pestis에 의해 발생하는 선페스트, Neisseria gonorrhoea에 의해 발생하는 임질, Treponema pallidum에 의해 발생하는 매독, Chlamydia trachomatis에 의해 발생하는 안질환 뿐만 아니라 성병을 방제하기 위한 재조합 백신들이 있다. 목아픔(sore throat)이나 심장병을 발병시킬 수 있는 그러한 종과 같은 그룹A와 그룹B 모두로부터 유래되는 Streptococcus, Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Streptococcus pneumoniae, Brucella abortus, Vibrio cholerae, Shigella 종, Pseudomonas aeruginosa, 그리고 ETEC, EPEC, UTEC, EHEC 및 EIEC 균주와 같은 병원성 E.coli의 종들은 유전자가 얻어질 수 있는 본 발명의 범위 내에 있는 미생물들의 추가적인 예들이다. 인플루엔자 바이러스에 대항하여 생산되는 것들과 같은 재조합 항바이러스성 백신은 본 발명에 의해 포함되어진다. 또한 재조합 항바이러스성 백신은 Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae 또는 Retroviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae 또는 Poxviridae와 같은 RNA 바이러스를 포함하는 바이러스에 대항하여 만들어질 수 있다. 병원성 균류, 원생생물 또는 기생충에 의한 감염을 방지하기 위한 재조합 백신 또한 본 발명에 의하여 고려되어진 것이다.
따라서, 실시예들의 일 집합에 있어서, 본 발명은 병원성 S.typhi와 같은 병원성 박테리아의 생 약독화되고, 기능적 rpoS 유전자를 포함하고 RpoS+표현형을 발현하는 유도체로 이루어지는 인간의 면역을 위한 백신으로서 기술되어질 수 있다. 또한 상기 약독화 박테리아는 인간의 병원체가 개체 또는 인간의 알러젠(allergen)을 생산하는 개체로부터 유래한 재조합 유전자를 발현할 수 있는 능력이 있다.
백신의 면역원성 요소가 숙주의 알러젠인 실시예에 있어서, 그러한 백신은 알러지 숙주를 특정적으로 민감성을 제거하기 위하여 고안된 노출 섭생법(regimen)으로 사용되어진다. 꽃가루, 곰팡이 포자, 곤충의 일부분, 동물 비듬 등에 대한 알러지는 공기의 흡입 및/또는 그러한 알러젠들을 포함하는 음식의 섭취 때문이다. 결과적으로 발생한 알러지는 알러젠과 결합하고, 히스타민을 방출시키기 위하여 마스트 세포을 활성화시키는 IgE형 항체의 존재와 연관되어진다. 잘 알려진 바 대로, 알러젠에 대한 민감성의 제거는 알러젠을 포함하는 추출물의 반복적인 비경구적 면역화에 의하여 이루어질 수 있다. 비슷하게, 꽃가루를 포함하는 천연 꿀을 경구 섭취하면 이들에 대한 내성 상태를 효과적으로 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다. 한편으로는 그러한 알러젠의 경구 섭취는 알러젠이 IgE 및 마스트 세포와 반응할 수 있는 능력을 저해할 수 있거나 혹은 충분한 양으로 주입되었다면 IgE 형 항체의 합성를 억제하는 역할을 할 수 있는 SIgA를 유도할 수 있다. 즉, 내성을 유도할 수 있는 것이다. 많은 알러젠에 있어서 특정 알러지 유발 분자가 동정되었고 당해 알러젠을 지정하는 뉴클레오티드 서열을 얻기위하여 cDNA가 클론되었기 때문에, 현재 알러젠을 발현하기 위하여 이질적인 숙주 세포들을 유전적으로 조작하는 것이 가능하다(예를 들면, Valenta 등, Allergy 53:552-561. 1998; Olsson 등, Clin. Exp. Allergy 28:984-991. 1998; Soldatova 등, J. Allergy Clin. Immunol. 101:691-698, 1998; Asturias 등, Clin Exp Allergy 27: 1307-1313; Twardosz 등, Biochem Biophys Res Commun 239:197-204, 1997을 참조). 따라서, 본 발명의 약독화된 RpoS+살모넬라는 알러젠을, 아마도 내성 상태를 유도하기 위한 또는 알러젠에 대항하는 SIgA의 생산을 활발하게 촉진하기 위하여 변형되어 면역원성이 있으나 비알러지성인 형태로 발현시키기 위하여 조작될 수 있다. 본 명세서에 기술된 RpoS+약독화된 살모넬라는 면역 반응을 유도하는 데에 있어서 효과적임이 개시되었고 따라서, 변형된 알러젠을 발현하기 위하여 그러한 RpoS+살모넬라를 사용하는 것은 흡입 또는 섭취에 의하여 알러젠에 대하여 인간이 노출된 결과를 개선시키는 데에 있어서 효과적일 것이다.
다른 실시예에 있어서, 상기 재조합 유전자는 면역된 개인에 대하여 불임 효과를 부여하는 면역 반응을 유도할 수 있는 배우자 특이적 항원을 발현한다(미국 특허 제5, 656, 488호 참조).
본 발명의 약독화된 미생물들은 다양한 숙주 단백질의 합성을 위한 벡터로서 추가적으로 사용되어질 수 있다. 본 발명의 약독화된 미생물들은 소화관연관림프조직(GALT, gut-associated lymphoid tissue), 장간막 림프절 및 이자를 포함한 다양한 면력능 있는 구조들을 가로지를 수 있기 때문에, 숙주로 도입된 후에 그러한 미생물들은 다양한 면역조절 생산물을 목표로 하여 사용되어질 수 있다. 따라서, 미생물들이 적절한 면력능 있는 조직에서 점유를 차지하게 되었을 때에는 숙주내에서 면역 반응을 억제, 증가 또는 변형시킬 수 있는 재조합 생산물을 발현시킬 수 있도록, 면역조절 단백질 또는 펩티드를 코드하는 하나 또는 그 이상의 유전자들은 약독화된 미생물 속으로 재조합적으로 도입될 수 있다. 면역조절 분자들의 예들에는 다음을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.; 콜로니 촉진인자(마크로파이지, 그래뉼로사이트, 또는 그 혼합), 마크로파이지 키모톡신, 마크로파아지 억제인자, 루코사이트 억제인자, 림포톡신, 블라스토제닉 인자, 인터페론, 인터루킨, 종양괴사인자, 시토킨 그리고 림포킨.
또한 본 발명의 약독화된 미생물들은 다양한 생리적 기능(예를 들면,성장 속도, 혈압 등)을 촉진 또는 억제할 수도 있는 약리학적으로 활성이 있는 생산물을 전달 및 생산하기 위한 용도에 대하여도 고려되고 있다. 그러한 미생물들에 있어서, 상기 재조합 유전자는 상기 약리학적으로 활성이 있는 생산물을 코드한다.
본 발명의 미생물들의 재조합 유전자는 미생물의 생존을 재조합 유전자의 계속적인 존재와 연결시킴으로써 재조합 유전자을 포함하고 발현할 수 있는 미생물들만을 선발하는 "균형잡힌 치명적" 시스템 속으로 통합되어질 수 있다. 이러한 형태의 "균형잡힌 치명적" 돌연변이체들은 세포 생존에 필수적인 효소, 바람직하게는 아미노피멜산(DAP)의 생합성에 있어서 한 단계를 촉매하는 효소 및 더욱더 바람직하게는 베타 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(Asd)를 코드하는 유전자를 코드하는 기능이 있는 자연적 염색체 유전자가 결여되어 있는 점에 의하여 특징지어 진다. DAP 경로 효소들 및 Asd는 세포벽 합성에 요구되어진다. 또한 상기 돌연변이체는 비기능적 염색체 유전자를 상보하는 역할을 할 수 있는 첫 번째 재조합 유전자를 포함하고 이것은 희망하는 생산물을 코드하는 두 번째 재조합 유전자에 구조적으로 연결되어진다. 상보하는 재조합 유전자의 상실은 세포가 DAP가 없는 환경에서 존재할 때 세포가 용원에 의하여 죽도록 하는 원인이 된다. 이 전략은 DAP는 진핵생물에서는 생산되지 않고 그러므로, 면역화된 숙주 조직들에는 존재하지 않기 때문에 특히 유용하다. 이러한 형태의 "균형잡힌 치명적" 미생물들을 제조하는 방법은 미국 특허 제5, 672, 345호에 개시되어 있다.
면역원성 인자는 개인의 면역 체계를 촉진, 그래서 면역 체계의 하나 또는 그 이상의 기능이 증가 및 면역원성 인자를 향하여 방향지시 하도록 하기 위하여 사용되어지는 인자를 의미한다. 면역원성 인자들에는 백신도 포함한다. 면역원성 인자들은 업계에 알려진 기술을 사용하여 항체, 분리된 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 모두의 생산에 사용되어질 수 있다.
항원 또는 면역원이란 숙주 면역 체계가 그 항원에 특이적인 분비성, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 일으키도록 촉진할 수 있는 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 분자를 의미하고자 한 것이다.
에피토프는 그 자리에 특이적인 항체가 결합하는 항원상의 어떤 자리가 될 수 있다. 어떤 에피토프는 그 에피토프에 독특한 공간 배치 속에 있는 3개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.; 일반적으로, 에피토프는 적어도 5개 아미노산 및 보다 일반적으로는 적어도 8∼10개 아미노산으로 구성된다. "에피토프"라는 용어는 본 명세서에서 사용되어진 바와 같이 "항원 결정기"라는 용어와 교환가능한 의미를 의도한 것이다. 또한 "에피토프"라는 용어는 항원 결정기가 주조직적합성인자(MHC) 클라스 II 분자들과 연계를 통하여 T-헬퍼 세포에 의하여 인지되는 T-헬퍼 세포 에피토프를 포함하고자 한 것이다. 더욱이, 에피토프란 용어는 항원제공세포의 표면에 존재하는 MHCI 분자에 의하여 제시될 때 세포독성 T 세포들에 의해 인지되는 어떠한 항원, 에피토프 또는 항원 결정기를 포함한다. 어떤 세포독성 T 세포 에피토프는 약 6∼11개 아미노산, 바람직하게는 8∼9개 아미노산의 서열을 포함할 수 있다.
백신이란 면역 체계에 의하여 자기 항원으로서 인지되지 않은 항원에 대항하여 보호되도록 개인의 면역 체계를 촉진시키기 위하여 사용되어지는 인자를 의미한다. 면역화란 항체 및/또는 세포성 면역 반응을 계속적으로 고수준으로 유도하는 공정을 의미한다. 상기에서 세포성 면역 반응에서는 T 림프구가 병원체를 죽이고/또는 개체내에서 그렇게 하도록 다른 세포들(예, 식균세포)을 활성화시킬 수 있고, 그 개체가 이전에 노출되었던 병원체 또는 항원에 대항하도록 방향지시되어진다. 비록 "면역 체계"라는 어구는 외계 물질의 존재에 대한 단세포 개체들의 반응들도 포함할 수 있는 것이나, 본 출원에 있어서 본 어구는 개인이 개인의 세포 또는 세포외액을 침입하는 항원성 물질에 대항하는 항체을 생산하도록 하는 해부학적 특징 및 기작들을 나타내고자 한 것임과 동시에 또한 세포성 면역 반응들을 포함하고자 한 것이다. 항체 생산의 경우에 있어서, 이렇게 생산된 항체는 면역글로불린 A, D, E, G, M과 같은 면역 부류들 중 어느 것에도 해당될 수 있다. 본 발명의 백신이 IgA 생산을 촉진시키기 위한 것들에 한정되는 것은 아니지만, IgA는 항온 동물들의 분비 체계에 의해 생산되는 주요 면역글로불린이기 때문에 IgA의 생산을 촉진하는 백신이 특별한 관심사가 되고 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기술된 자연의 백신은 IgA 형성과 더불어 넓은 범위의 다른 면역 방응들 예를 들면, 세포성 및 체액성 면역을 일르키기 쉽다. 항원들에 대한 면역 반응들은 잘 연구되고 널리 보고되어 있다. 면역학에 관한 개괄은 Elgert, Klaus D., Immunoloy, Wiley Liss, Inc.,(1996) ; Stites 등, Basic ＆ Clinical Immunology;7th Ed., Appleton ＆ Lange,(1991)에 제공되어 있다. 이들 참조문헌의 전체 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 통합되어진다.
본 발명의 백신으로 처치된 "개인"은 본 명세서에서 인간 숙주를 나타내는 것으로 정의되어 있다.
본 명세서에서 사용된 미생물들은 박테리아, 원생생물 및 단세포 균류를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 기생체는 Entamoeba, Leishmania와 같은 종들 뿐 아니라 Plasmodium과 Toxoplasma의 종들과 같은 원생동물과 trematodes, cestodes, nematodes와 같은 장내기생충(helminths)을 포함하고시키고자 한 것이다. 본 명세서에 사용된 바이러스는 예를 들면, Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae 및 Retroviridae와 같은 RNA 바이러스; 예를 들면, Hepadnaviridae, Paroviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae 및 Poxviridae와 같은 DNA 바이러스를 포함할 수 있다.
재조합 유전자란 첫 번째 개체에서 복제되었을 때 동일한 유전적 물질을 함유하는 자손을 낳는 두 번째 개체 속으로 인간이 매개가 되어 전이되는 유전적 물질을 의미하고자 한 것이다. 일반적으로 그러한 첫 번째 개체에서 두 번째 개체로의 유전적 물질의 교환은 자연적으로는 일어나지 않든가 거의 일어나지 않는다.
가장 넓은 의미로서 본 명세서에 사용된 유전자라는 용어는 유전의 생물학적 어떠한 단위를 나타낸다. 그러나, 재조합 유전자가 양친 개체에 존재하는 것과 같은 완전한 유전자 및 예를 들면, 기능성 폴리펩티드와 같은 거대분자의 생산을 산출하거나 조절할 수 있는 유전자일 필요는 없다. 따라서, 재조합 유전자는 항원상 생산물의 전부 또는 일부분을 코드할 수 있다. 더욱이, 재조합 유전자는 프로모터, 인핸서 또는 터미네이터 역할을 하는 DNA 서열들과 항원의 전부 또는 일부분을 코드하는 재조합 유전자의 발현을 조절하는 억제자(repressors) 또는 활성자(activators)를 코드하는 DNA 서열들을 또한 포함할 수 있다. 또한 재조합 유전자는 폴리펩티드 융합 생산물을 코드할 수 있는 유전자 융합을 의미할 수도 있다. 따라서, 코드된 유전자 산물은 양친 개체에서 존재하는 정확한 형태로 발견되지 않는 것일 수 있다. 예들 들면, 100개 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩티드 항원을 코드하는 기능적 유전자는 숙주 세포의 세포성 기작에 의하여 단지 75개, 심지어는 10개 아미노산 잔기만을 함유하는 펩티드가 생산되도록 부분적으로 운반 미생물 속으로 전이되어질 수 있다. 그러나, 만약 이런 유전자 생산물이 양친 개체에 존재하는 유사한 항원에 대항하는 항체의 형성을 야기시키는 항원 또는 T-헬퍼 세포에 의해 인지되는 T 세포 에피토프로서 역할을 할 수 있다면, 그 유전자는 본 발명에서 정의된 바와 같은 유전자의 범위 내에 있다고 여겨진다. 대안으로, 만약 특정 항원 또는 그들의 단편의 아미노산 서열이 알려져 있다면, 자동 유전자 합성기 등과 같은 수단에 의하여 그 DNA 단편 또는 그들의 유사체를 화학적으로 합성하고 상기 DNA 서열을 적절한 발현 벡터 속으로 도입할 수 있다. 살모넬라에서 고수준의 발현을 위한 선호되는 코돈들이 되도록 코돈들을 사용하기 위하여 후자가 바람직하다. 다른 한편으로는 하나 또는 전부가 항원성일 수 있는 여러 유전자 생산물들을 코드하는 DNA의 긴 절편이 있다. 예를 들면, 그러한 DNA의 긴 절편은 병원체의 숙주 세포로의 흡착을 매개하는 핌브리아 항원(핌브리에,fimbriae)의 합성에 필요한 5에서 15 단백질들을 코드할 수 있다(Baumler 등, 상게서). 핌브리에에 대항하는 면역 반응의 유도는 병원체에 대항하는 보호를 제공할 수 있다. 따라서, 정의되고 명세서에서 청구된 바와 같은 유전자는 항원을 생산할 수 있는 유전자의 어떤 단위이다. 그 유전자는 염색체, 플라스미드, 또는 바이러스 유래의 것일 수 있다. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 유전자는 예를 들면, cDNA 분자들에 관한 경우와 같이 그 DNA 서열이 소망하는 유전 생산물을 코드하는 하기만 하면, 인트론이 없는 DNA 분자들도 추가로 포함한다. 더욱이, 유전자라는 용어는 그것의 의미 속에는 , RNA 바이러스의 유전자로서 역할을 할수 있는 RNA 분자들 또는 그러한 RNA 분자들의 상보체로서, 면역원성이 있는 바이러스성 단백질로 번역되어지는 mRNA로서 역할을 할수 있는 상기 RNA 분자들 또는 그러한 RNA 분자들의 상보체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 유전자는 또한 면역원성이 있는 바이러스성 단백질로 번역되어지는 mRNA로서 역할을 하는 바이러스성 가닥을 지정하는 DNA 서열을 포함한다.
유전자가 면역 반응을 유발하는 데 효과적이기 위해서는, 그 유전자는 반드시 발현되어져야 한다. 유전자의 발현이란 유전자의 구조(DNA 염기들의 서열) 속에 내재하는 정보가 그 유전자가 위치하는 세포의 생화학적 기작에 의하여 RNA 분자,폴리펩티드 또는 다른 생물학적 분자로 전환되는 것을 의미한다. 그렇게 생산된 생물학적 분자는 유전자 생상물이라고 한다. 본 명세서에서 사용되어진 바와 같은 유전자 생산물이라는 용어는 유전자의 통제하에서 일어나는 생화학적 반응들의 결과로서 생산된 어떠한 생리적 생산물 또는 생산물들을 의미한다. 그 유전자 생산물들은 예를 들면, RNA 분자, 펩티드, 또는 어떠한 효소 또는 유전자의 최초 생산물, 즉 대사 생산물인 다른 분자의 통제하에 생산된 생산물 같은 것이 될 수 있다. 예를 들면, 어떤 유전자는 리보좀의 작용에 의하여 그 유전자가 발견된 원래 세포에 대하여 외부환경에서 글리칸의 형성을 제어하는 효소로 번역되어질 수 있는 RNA 분자의 합성을 첫 번째로 제어할 수 있다. RNA 분자, 효소, 그리고 글리칸은 본 명세서에서 사용된 용어로서 모두 유전자 생산물이다. 글리코프로틴, 글리코리피드 및 폴리사카라이드와 같은 많은 다른 형태의 유전자 생산물 뿐만 아니라 이들 중의 어느 것이나 개인의 면역 체계 속으로 도입되어진다면 항원으로서 작용할 것이다. 글리코프로틴과 리포프로틴을 포함한 단백질 유전자 생산물은 백신에 존재하는 항원용도로서 선호되는 유전자 생산물이다.
백신이 세포성 면역을 촉진하거나 항체를 생산하는 데 효과적이기 위해서는, 그 항원성 물질은 백신 투여된 개인의 세포성 면역의 유도를 유발 및/또는 항체 생산 기작을 유도하도록 반드시 방출 및/또는 제시되어져야만 한다. 그러므로, 유전자 생산물의 미생물 운반자는 개인 내로 도입되어져야 한다. 바람직하게는 소화관연관림프조직(GALT) 또는 기관지연관림프조직(BALT, bronchus-associated lymphoid tissue)의 반응을 촉진시키기 위하여, 비록 정맥, 근육, 피하주사 또는 유방 또는 음경 또는 질 또는 직장내 투여와 같은 다른 백신의 투여 방법들이 가능하지만, 경구 투여, 위장관삽입 또는 에어로졸의 형태로 코를 통한 투여에 의하는 것과 같이 소화관 또는 기관지로 직접적으로 미생물 또는 유전자 생산물을 도입시키는 것이 적절하다.
약독화된 미생물은 예를 들면, 항원을 위한 또는 DNA 백신 벡터를 위한 운반 미생물로서 사용되어질 수 있고 일단 운반 미생물이 개인 내에 존재하면, 항원은 개인의 면역 체계에 이용되어질 수 있어야 한다. 핵산 분자의 전달을 위한 운반 미생물의 경우에 있어서, 그 핵산 분자는 목표 세포 내에서 방출될 필요가 있다. 이것은 항원 분자 또는 핵산 분자들이 방출되도록 운반 미생물이 사멸할 때 이루어질 수 있다. 물론, 용균 없이 페리플라즘의 내용물을 방출하는 "누출성" 약독화 돌연변이체를 사용하는 것도 또한 가능하다.
다른 방법으로, 세포의 사멸 이전에 운반 세포에 의하여 외부 환경에서 이용되어질 수 있도록 만들어지는 항원의 생산을 제어하는 유전자는 선발될 수 있다. 이런 식으로 하여, 백신을 투여 받은 개인 내 예를 들면, 패이어의 패치(Peyer's patches)나 다른 GALT, NALT 또는 BALT 등에서 지속하고 항원 생산을 계속하여, 결과적으로 계속적으로 항체 형성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하도록 하는 생 미생물을 사용할 수 있다. 이러한 상황하에서 바람직한 유전자 생산물은 약독화된 운반 미생물의 세포막을 통과하여 외부환경으로 전이되는 생산물 또는 유전자 생산물의 전부 또는 일부가 환경에 노출되어지도록 외부 막에 부착되거나 함입되어 있는 생산물이다. 이러한 후자 형태의 유전자 생산물의 전형은 보호가 요구되는 개체의 표면상에 정상적으로 발견되는 항원이다. 만약 이러한 항원이 정상적으로 박테리아 세포 표면으로 운반되어진다면, 항원에 대항하는 항체형성은 증진될 수 있다.
핵산 백신은 당업계에서 잘 알려져 있고(예로 다음을 참조, Ulmer 등, Amer. Soc. Microbiol. News 62:476-479,1996; Ulmer 등, Curr. Opinion. Immunol. 8:531-536,1996; 그리고 Robinson,H.L., Vaccine 15:785-787, 1997) DNA 백신에 의하여 코드되는 단백질에 대항하는 면역 반응을 촉진시키는 약독화된 박테리아에 의한 DNA 백신의 전달은 이미 기술되어 있다(Sizemore 등, Vaccine 15:804-806,1997). 따라서, 본 발명의 약독화된 미생물은 또한 DNA 백신을 위한 전달 운반체로서 사용되어질 수 있다. 전형적으로, 그러한 DNA를 함유하는 박테리아는 DNA 백신에 의하여 코드되는 유전자 생산물을 스스로 발현하지는 않으나, 그 DNA 백신을 그 유전자 생산물이 숙주 세포 전사 및 번역 기구에 의해 발현되어지는 곳인 하나 또는 그 이상의 인간 조직 속으로 방출한다. 그러나, RNA 바이러스에 대항하는 면역화를 위한 DNA 백신은 RNA 바이러스 게놈 또는 그들의 단백질을 코드하는 부분의 사본들이 약독화된 박테리아의 세포질 속에 만들어질 수 있다는 것도 또한 고려된다. 그러한 RNA 분자들은 면역원성 바이러스성 단백질의 합성을 위한 mRNA로서 역할을 하게되는 곳인 인간 조직 속으로 예를 들면, 약독화된 박테리아의 용균에 의해 방출될 것이다.
다른 병원균으로부터 항원을 GALT 또는 BALT로 전달하기 위하여 병원체을 사용하는 것은 그러한 병원체들이 이들 조직들을 콜로니화할 수 있는 능력을 유지하는 동안 약독화된 상태로 있을 수 없다면 부적절한 것이다.
재조합 유전자가 유래되어진 개체는 임의의 인간 병원체이 될수 있거나 알러젠 또는 인간이 민감성을 가질수 있는 다른 항원을 생산하는 개체일수도 있다. 알러젠은 알러지 반응을 야기하는 물질로서, 이 경우 인간은 그들에 대항하여 예방접종될 수 있을 것이다. 동물 비듬과 꽃가루와 같은 아주 다양한 물질들이 알러젠이 될 수 있고 개인의 알러지 반응은 어떤 특정한 알러젠에 대하여 변하기 마련이다. 정상적인 경우에는 알러지 반응을 보이는 개인에게 있어서 어떤 알러젠에 대한 내성을 유도하는 것이 가능하다. 내성을 유도하는 방법은 잘 알려져 있고 일반적으로 도우즈 양을 증가시키면서 알러젠을 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 내성 유도에 대한 보다 상세한 논의는 상기한 바레트(Barrett)의 교과서에 제공되어 있다. 마지막으로, 면역조절 유전자 또는 다른 약리학적으로 활성이 있는 물질에 대한 유전자가 벡터에 의하여 발현되어질 때 숙주 개인 자신이 유전적 물질의 원천으로서 역할을 할 수 있다.
개인에게 위에서 개시한 형태의 생 백신의 투여는 임의의 알려진 또는 표준 기법에 의하여 이루어질 수 있다. 이러한 것들에는 경구 섭취, 위장관삽입, 또는 기관지-코-눈부분에 대한 분무를 포함한다. 이들 방법들 모두는 생 백신이 쉽게 NALT, GALT 또는 BALT 세포에 도달하게 하고 항체 형성과 세포 매개성 면역을 유도하며 바람직한 투여 방법이다. 정맥 주사와 같이 운송 미생물이 개인의 혈류에 도달하게 하는 다른 투여 방법들도 허용될 수 있다. 정맥, 근육 또는 유방내 주사 또한 이하에서 기술되어지는 것과 같은 본 발명의 다른 실시예에 따라 허용될 수 있다.
통상적으로 사용되는 많은 재조합 DNA 기법들 중의 어느 것이라도 재조합 유전자를 발현할 수 있는 본 발명의 약독화된 미생물을 생산하는 데에 사용되어질 수 있다. 플라스미드, 파아지 또는 코스미드 벡터에 연결한 후에, 그렇게 형성된 재조합 분자들은 접합, 형질전환(외부 환경으로부터 나체 DNA의 섭취, 이는 칼슘과 같은 다양한 화학적 인자의 존재에 의하여 인공적으로 유도될 수 있다.), 전기 천공법을 포함하여 다양한 수단에 의하여 숙주 세포 속으로 전이되어질 수 있다. 재조합 DNA가 형질도입성 파아지 또는 코스미드 벡터와 같은 재조합 DNA는 파아지 속에 포장되는 과정을 포함하는 형질도입과 같은 다른 방법도 또한 적합하다. 일단 재조합 DNA가 운반 세포 내에 존재하게 되면, 분리된 독립적 레플리콘으로서 계속 존재할 수도 있고 또는 숙주 세포 염색체 속으로 삽입되어져 세포 분열 동안 염색체와 함께 복제되어질 수 있다.
일단 유전적 물질이 전이되어지면, 전이된 유전적 물질을 함유하는 미생물들이 선발된다.
필요한 면역화 도우즈의 양은 유전자 생산물의 항원성에 따라 변하게 되고 단지 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이 요구되어진다. 통상적인 실험에 의하여 쉽게 필요한 양을 결정할 수 있게 된다. 복수의 도우즈 양은 소망하는 수준의 보호를 제공하기 위하여 필요로 하는 만큼 사용되어진다.
백신이 부유되거나 용해되어지는 약제학적 담체 또는 보형제는 백신의 동결건조된 형태을 위한 것과 같은 어떠한 용매나 고체 또는 캡슐화 재료라도 될 수 있다. 담체는 접종되어지는 개인에 대하여는 비독성이고 미생물 또는 항원성 유전자 생산물과 공존가능한 것이다. 적합한 약제학적 담체는 당업계에서 알려져 있고 예를 들면, 통상적인 식염수 및 다른 생리적 농도나 그 근처에 있는 비독성 염과 같은 액체 담체, 탈크나 수크로즈와 같은 고체 담체가 있다. 젤라틴 캡슐은 동결건조된 백신을 위한 담체로서 역할을 할 수 있다. 보조제는 원한다면 항원성을 증진시키기 위하여 부가될 수 있다. 기관을 통하여 투여되어질 때, 백신은 에어로졸 형태로 제시되는 것이 바라직하다. 적합한 약제학적 담체 및 보조제 그리고 도우즈 형태의 제조는 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition,(Gennaro, Ed., Mack Publishing Co.,Easton, Pa., 1985)에 기재되어 있다.
병원체에서 유래되어진 유전자 생산물로 개인을 면역화는 또한 병원체로부터 유래한 재조합 유전자에 의해 지정되어진 유전자 생산물을 발현하기 위한 운반체로서 작용하는 병원성 미생물의 약독화된 유도체에 의한 이전의 면역화와 연계하여 사용되어질 수 있다. 그러한 비경구적 면역화는 만약 그 병원체 유래의 유전자 생산물에 대한 분비성 면역 체계가 GALT 또는 BALT의 림프 세포를 촉진하기 위하여 병원체 유래의 유전자 생산물을 발현하는 운반 미생물에 의한 면역화에 의하여 최초 자극되었다면 분비성 면역 반응의 발현을 증진시키기 위한 부스터로서 역할을 할 수 있다. 그 증진된 반응은 이차, 부스터, 또는 기억 반응으로 알려져 있고 숙주의 면역에 의한 보호 기간을 연장시키게 한다. 부스터 면역화는 좋은 결과를 얻기 위하여 많이 반복되되어질 수도 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 살모넬라의 RpoS 표현형을 결정하는 것을 함유하는 살모넬라의 면역원성을 검사하기 위한 방법을 제공한다. 그 방법은 Shigella 및 E.coli, Salmonella-Shigella 잡종, Salmonella-E.coli 잡종, Shigella-E.coli 잡종과 같은 다른 박테리아에도 또한 적용할 수 있다. rpoS+표현형의 존재는 미생물에게 투여에 사용되어진 특정 경로와 연관되어진 림프 조직 예를 들면, 경구 투여 후 GALT 또는 다른 경로의 투여 후 NALT나 BALT와 같은 다른 림프 조직을 침범하고 점령할 수 있는 능력을 부여한다. 이 것은 순서대로 고수준의 면역원성을 가지도록 한다. 따라서, rpoS+표현형의 존재를 검출할 수 있다는 것은 그 미생물이 rpoS-인 것을 제외하고는 유전적으로 동일한 미생물에 비하여 고수준의 면역원성을 가질 것이라는 것을 나타낸다.
rpoS+표현형은 미생물의 특성을 결정함으로써 검사할 수 있다. 이 것은 많은 가능한 방법들 중에서 어떤 하나의 방법에 의하여 되어질 수 있다. 예를 들면, 배양액에 대하여 카탈라제 생산 여부를 분석하는 것에 의하는 것이다. 이 시험은 하이드로퍼옥시다아제 II 카탈라제를 생산하는 katE 유전자의 RpoS 양성 조절에 근거한 것이다. 자연형 rpoS 알렐을 갖는 균주의 배양액은 과산화수소를 첨가하엿을 때 격렬하게 거품을 발생시키나, 돌연변이형 rpoS 알렐을 가진 균주의 배양액에서는 최소한의 거품이 발생한다(Lowen, J. Bacteriol. 157:622-626, 1984; Mulvey 등, Gene 73:337-345, 1988). 또한 약독화된 살모넬라 또는 다른 박테리아 균주들의 RpoS 표현형을 결정하는 데에 있어서 영양분 결핍, 산 또는 산소 스트레스 그리고 글리코겐 생합성 능력의 결핍에 대한 균주들의 민감성을 결정하는 것을 포함한 다른 방법들이 사용되어질 수 있다. 이 접근법의 변형으로서, rpoS 유전자는 자연형 살모넬라에 도입되어질 수 있고 그 결과 생성된 유도체 살모넬라를 RpoS 표현형 유무에 대하여 시험하는 것이다.
또한 기능적 rpoS 유전자 생산물을 만들어 낼 수있는 기능적 rpoS+유전자의 존재는 RpoS+표현형을 나타내는 미생물의 유전적 구성을 결정함으로써 RpoS+표현형을 검사할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 다음의 실시예들에 기술되어 있다. 본 명세서에 기재된 청구범위내의 다른 실시예들은 본 명세서에 개시된 본 발명의 명세서 또는 실습를 고려하면 당업자에게 명확하게 될 것이다. 실시예들이 뒤따르는 청구항들에 의해 나타내어진 본 발명의 범위와 사상에 비추어 실시예들과 함께 명세서는 단지 예시적인 것으로 고려되어야 한다.
일반적 방법들 :
본 연구에서 사용되어진 박테이라의 균주들은 다음의 일반적인 재료와 방법들을 사용하여 제조되었다. 균주들을 제조하기 위하여 사용되어진 파아지, 플라스피드와 미생물의 목록은 표 1과 2에 제시되어 있다. 박테리아 균주들을 복제하기위하여 5% 글리세롤을 포함한 1% 박토-펩톤(Difco)에 현탁된 -70℃ 냉동 배지에서 유지시키고, 1% 박토-펩톤과 통상적으로 사용되는 50% 글리세롤 내에서 -20℃에 저장하였다. 박테리아는 일반적으로 L 배양액(Broth)(Lennox, Virology 1:190~206, 1965) 또는 루리아(Luria) 배양액(Luria 등, J. Bacteriolo. 74:461~476, 1957)에
서 배양되었다. 한천평판(plate)들은 1.5% 디프코(Difco) 한천을 포함하였다. 탄화수소 이용은 맥콘키(MacConkey)(Difco사) 또는 에오신 메틸렌 블루 한천 베이스(Curtiss, Genetics 58:9~54, 1968)를 적합한 탄화수소의 1% 최종농도로 보충하므로써 평가하였다. 최소 액체(ML) 및 최소 한천(MA)을 Curtiss(J. Bacteriol. 89:28~40, 1965)에 따라 제조하고 최적 농도로 영양분을 보충하였다. 통상적인 희석제로써 젤라틴으로 완충된 식염수(BSG)를 사용하였다(Curtiss, 1965 상기 문헌 참조).
박테리오파아지 P22HTint를 표준방법에 따라 형질도입에 사용하였다(Davis 등, A Manual for Genetic Engineering-Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Haror, NewYork, 1979). 공여 균주를 하룻밤동안 배양한 것을 예열시킨 루리아 배양액 내로 1:20의 희석비로 넣어 37℃에서 한시간동안 진탕하면서 배양한 후 0.01의 감염다중도(MOT)에서 P22HTint로 감염시켰다. 감염 혼합물을 하룻밤 또는 약 15시간동안 진탕하였다. 박테리아 세포의 용균이 완전하게 보장되도록 클로로포름을 몇방울 첨가하였으며, 이 혼합물을 37℃에서 추가로 10분동안 진탕하였고, 그 후 Sorvall SS-34 원심분리기 내에서 7,000rpm으로 원심분리하여 박테리아 파편을 제거하였다. 상등액을 추출하여 한두방울의 새로운 클로로포름과 함께 깨끗한 튜브에 옮겨 4℃에서 저장하였다. 이 방법은 일반적으로 약 χ3000에서 1010PFU/㎖의 역가를 포함하는 파아지 용균액(lysate)을 제공한다. 염색체적으로 통합된(integrated) 자살벡터들로부터 Tn10-유도된 테트라사이클린-내성 유전자들을 발현하는 Tn10 형질도입주들, Tn10-유도된 돌연변이들 또는 부분이배체(merodiploid) 균주들의 선발을 위해 평판들에 테트라사이클린을 12.5㎍/㎖로 사용하였다. Tn10 트랜스포존(transposon)은 염색체로부터 낮은 빈도로 종종 상기 트랜스포존에 측면근접하는 게놈의 일부 결실을 절제(excise)한다. 또한 삭제되는 세포들은 테트라사이클린에 민감하게 되고, 테트라사이클린 내성 박테리아를 사멸시키는 푸사린산(fusaric acid)을 포함하는 배지에 도말하여 선발할 수 있다(Maloy와 Nunn, J. Bacteriol. 145:1110~1112, 1981). 테트라사이클린 내성인 유전자들에 연결된 플라스미드와 함께 통합된 자살 플라스미드를 손실한 테트라사이클린에 민감한 균주들 또한 푸사린산 배지에서 선별될 수 있다.
테트라사이클린 내성 배양균들은 12.5㎍/㎖ 테트라사이클린을 포함하는 L 배양액내에서 37℃에서 하룻밤동안 정치하여 약 5×108CFU/㎖로 배양되었다. 이들 배양균들을 테트라사이클린 없이 예열된 L 배양액 내로 1:40의 희석비로 희석하여 넣고 37℃에서 약 2×109CFU/㎖의 역가까지 환기시키고, 연속적으로 BSG내로 희석시킨 후 희석액으로부터 푸사린산 배지상으로 도말하였다. 푸사린산 내성 콜로니들을 37℃에서 48시간동안 인큐베이션 처리한 후에 선별하였다. 푸사린산 내성 분리체들을 푸사린산 배지에 재도말(restreak)하여 접종한 후, Tn10-유도된 항생물질 내성성분의 손실을 확인하기 위하여 테트라사이클린과 함께, 그리고 테트라사이클린 없이 펜어세이(Penassay) 한천(Difco)으로 옮겼다. 적합한 배지를 사용하여 다른 표현형들이 나타난 곳을 표시하였다.
암피실린 내성 유전자, 수크로오즈 이용 카셋트 및 incP 이동화(mobilization) 부위를 포함하는 자살벡터들을 구성하였다. 이러한 플라스미드들에 도입되어진 돌연변이 유전자들은 암피실린 내성인 부분이배체를 생성하기 위하여(100㎍/㎖), 형질전환후에, 또는 바람직하게는 접합에 의해 박테리아 염색체 내로 도입될 수 있다. 이러한 부분이배체들은 암피실린 내성 및 수크로오즈 이용 유전자들과 함께 통합된 플라스미드의 손실에 대한 선별을 위해 5% 수크로오즈를 포함하는 배지상에서 배양될 수 있다. 암피실린에 민감한 균주들은 적합한 지정된(defined) 결실 돌연변이 대립유전형질들의 존재로써 표현형적으로 특징지어질 수 있다.
자살벡터에 암피실린 내성인 유전자 및 클로람페니칼(40㎍/㎖)에 내성을 부여하는 cat 유전자를 도입하므로써 향상된 부분이배체들의 선별을 수행할 수 있다. 부분이배체의 제조후, 5% 수크로오즈를 지닌 배지상에서 선별하는 것은 약물 내성 유전자들과 수크로오즈 이용 유전자들 모두의 손실을 가져왔다. 그 후 이들 재조합체들은 바람직한 대립유전형질 치환(replacement)을 위해 선발될 수 있다.
실시예 1
본 실시예에서는 유효한 침입(invasion) 및 rpoS 돌연변이 균주 χ4973을 사용한 S. typhimurium에 의한 GALT의 콜로니화에 있어서 rpoS 유전자의 역할을 설명하고 이를 이의 야생형 부모인 χ3339에 비교하였다.
균주 제조(Construction):
χ3339는 야생형이고, 유독한, Guling 등에서 개시된 S. typhimurium 균주 SL1344의 동물을 경유한 분리체이다(Infect Immun 55:2891~2901, 1987). SF1005는 S. typhimurium 균주 ATCC 14028들로부터 유도된 rpoS::RR10 돌연변이체이며, rpoS::RR10 돌연변이체 대립유전자에 연결된 암피실린 내성 유전자를 포함하고 있다(Fang 등, Pro. Nat'l. Acad. Sci., USA 89:11978~11982, 1992). 돌연변이체 rpoS::RR10 대립유전자를 SF1005에서 제조된 P22HTint 형질도입 파아지 용균액을 사용하고, rpoS 유전자내의 RR10 삽입체에 연결된 β-락타마아제 유전자(bla)의 존재로 인한 암피실린 내성(Apr)에 대해 선별하여 χ3339내로 옮겼다. SF1005와 χ3339간의 대립유전자 교환을 서던 블롯 분석으로 확인하고, 결과의 χ3339 rpoS::RR10 돌연변이 유도체를 χ4973으로 명명하였다. 깨끗한 플라크 돌연변이인 P22H5를 교차 도말(streaking)하므로써 P22HTint에 대한 민감성이 있는 형질도입체들을 선발하였다. 유사용원성(Pseudolysogenic) 콜로니들을 에반스 블루와 우라닌(uranine)(EBU) 지시제 한천에서 비용원균들과 분리하였다(Sternberg 등, Meth. Enzymol. 204:2~23, 1991). χ4974를 선별하기 위해 필요한 경우, 배지를 ㎖당 50㎍의 암피실린으로 보충하였다.
Hitchcock 등의 방법을 사용하여 χ4974내의 유연한 리포폴리삭카라이드(LPS)의 존재를 확인하였다(J. Bacteriol. 154:269~277, 1983). LPS는 Tsai 등의 방법에 의해 은색으로 염색되었다(Anal Biochem 119:115~119, 1982). 본 실험은 rpoS 내의 돌연변이가 LPS 구조에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내었다.
쥐에서의 RpoS 돌연변이체 독성
8~10주된 암컷 BALB/c 쥐들에 경구접종하여, χ3339의 독성을 rpoS 돌연변이 균주 χ4973의 독성과 비교하였다. 50% 치사량(LD50)의 결정을 위하여, 앞에서 설명된 것과 같은 방법을 약간만 변경하여 동물에 접종시켰다(Gulig 등, Infect Immun 55:2891~2901, 1987). 경구접종하기 전 4~6시간 동안은 쥐들에게 식음료를 주지않았다. 감염전에 위의(gastric) 산도를 중화하지 않았다. 각 균주에 대하여 30일의 기간동안 계산된 접종량 당 4마리의 쥐들로부터 얻은 결과를 사용하여 LD50역가를 Reed와 Muench의 방법(Am. J. Hyg. 27:493~497, 1983)에 따라 결정하였다.
rpoS 돌연변이 균주 χ4974에 대한 경구 LD50치는 투여량 당 8×109콜로니 형성 유니트보다 더 컸다. 이 값은 야생형 부모 균주 χ3339에서 측정된 8×105콜로니 형성 유니트의 경구 치사 투여량에 대해 로그값으로 4를 넘는 것으로 나타난다. 이 결과는 rpoS+부모 균주 ATCC 14028들에 비교했을 때, SF1005에 대해 경구 LD50투여량이 3 로그값 증가하는 것으로 보고한 Fang 등의 상기 논문과 일치하는 것이었다. rpoS 돌연변이 균주가 이의 야생형 부모균주에 비교하여 약화된 이유를 결정하기 위하여 연구를 더 수행하였다.
부착, 침입 및 생존의 비교 실험:
인간 배의 장관 상피 세포주인 Int-407(Henle 등, J. Immunol. 79:54~59, 1957)과 쥐과의 매크로파아지 유사세포주 J774(Ralph 등, Nature 257:393~394, 1975)를 사용하여 S. typhimurium의 부착성과 침입 능력들에 대한 rpoS의 영향을 시험하였다. 각 세포주를 행크 균형 염용액(Hank's Balance Salt Solution)(HBBS; GibcoBRL), 2mM 글루타민과 10%의 소 태반 혈청(FCS; HyClone, Logan, UT)을 포함한 최소 필수영양배지(MEM; GibcoBRL사, Grand Island, NY)내에서 37℃, 5% CO2를 포함하는 대기하에서 보존하였다. 세포들을 2~3일에 한번 새로운 배지로 이동시켰다. 이동된 세포들을 용액내로 살짝 긁어내고, 세포 현탁액을 희석하여 24개 웰(well)의 미세역가 판(microtiter dish)의 웰들에 접종한 후, 37℃, 5% CO2환경에서 인큐베이션하므로써 감염분석에 사용된 매크로파아지 단일층들을 제조하였다. 단일층들로부터의 제거를 위해 트립신화 된 것을 제외하고, Int-407 세포들을 유사한 방법으로 분포시켰다.
인간 장관 상피세포주, Int-407과 쥐의 매크로파아지 유사 세포주, J774로부터의 세포들을 사용한 박테리아 부착 및 침입 분석들은 약간 변형된 Galan 등, Pro Natl Acad Sci, USA 86:6383~6387, 1989에 따른 방법들을 따라 수행되었다.
박테리아를 L 배양액 내에서 정치 배양법으로 중간 로그기(mid log phase) 또는 600nm에서 측정했을 때 약 0.5의 광학적 밀도값을 나타낼 때까지 37℃에서 배양하였다. 세포들이 정지기로 들어감에 따라 rpoS와 RpoS-조절된 유전자들의 발현이 증가되기 때문에, rpoS 발현의 최대 수준을 설정하기 위하여 4일동안 포화될 때까지 정치 배양하여 대조 배양하였다. 박테리아 배양액을 세척하고 단일층들이 감염되기 전에 즉시 HBSS내에 재현탁시켰다. Int-407 단일층 부착 및 침입은 5% CO2의 대기, 37℃ 환경하에, MEM내에서, 그리고 Int-407 세포당 2~10개의 박테리아 세포들의 MOI에서 2시간동안 진행되었다. J774 세포들을 사용한 부착 및 침입 분석들은 부착과 침입을 위해 단지 한시간만 허용한 것을 제외하고는 Int-407 세포들을 사용한 때와 같은 방법으로 수행하였다. 단일층 세포들에 의한 박테리아 세포들의 식세포 작용과 부착을 구분하기 위한 조절로써, J774 세포들을 Lee 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 87:4304~4308, 1990의 방법에 따른 박테리아의 존재하에서 4℃에서 관찰하였다.
감염된 단일층들을 부착 및 침입 인큐베이션 후, 등장의(isotonic) 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 세번 세척하고, 배양된 세포들과 관련된 박테리아의 총 수를 계산하기 위하여 0.1% 소듐 디옥시콜레이트(deoxycholate)를 포함하는 PBS로 용균하였다. 평행하게 감염된 복제 단일층들을 용균전에 세포외 박테리아들을 사멸시키기 위하여 10㎍/㎖의 젠타마이신을 포함하는 MEM과 함께 추가의 두시간동안 인큐베이션시켜 흡수된 박테리아의 수시 계산될 수 있도록 하였다. L 한천상에 용균된 단일층들의 희석액을 도말하고 18~24시간동안 3℃에서 인큐베이션 시키므로써 생존가능한(viable) 박테리아 세포들의 총 수를 얻었다. 결과는 아래 표 3과 4에 나타내었다.
표 3. S. typhimurium χ3339 및 이의 rpoS: 돌연변이 유도체인 χ4973a에 의한 Int-407 세포들에의 부착성과 Int-407 세포들의 침입에 대한 rpoS::RR10 돌연변이의 영향
a: 세번의 시험에 대한 평균 ±SEM으로써 주어진 데이타이다.
b: 2시간동안 인큐베이션한 후, 세포들에 부착된 접종물의 %
c: 젠타마이신(10㎍/㎖)내에서 추가의 2시간동안 인큐베이션한 후, 회수된 접종물의 %
표 4. S. typhimurium χ3339 및 이의 rpoS: 돌연변이 유도체인 χ4973a에 의한 J774 세포들에의 부착성과 J774 세포들의 침입에 대한 rpoS::RR10 돌연변이의 영향
a: 세번의 시험에 대한 평균 ±SEM으로써 주어진 데이타이다.
b: 1시간동안 인큐베이션한 후, 세포들에 부착된 접종물의 %
c: 젠타마이신(10㎍/㎖)내에서 추가의 2시간동안 인큐베이션한 후, 회수된 접종물의 %
S. typhimurium 균주들이 지수기까지 배양되었을 때, rpoS::RR10 돌연변이체 χ4973은 Int-407과 J774 세포들에 이의 야생형 부모 χ3339와 같은 정도로 부착되었다(표 3과 표 4). 장관 상피세포주 Int-407에서 두 균주의 침입% 또한 모두 동일하였다(표 3). 그러나, 매크로파아지 세포주 J774에서, 침입은 야생형에 비해 rpoS::RR10 돌연변이체의 경우 약간의 감소를 나타내었다(표 4). 이들 데이타는 S. typhimurium이 지수적 성장기에 있을 때, rpoS 유전자는 세포에 부착되거나 세포내에 침입하는 박테리아의 능력에 거의 또는 전혀 기여하지 못한다는 것을 나타낸다. 하지만, 박테리아 세포들이 정지기에 있을 때의 결과들은 확실하지 않다. Int-407 세포들에서 정지기까지 배양된 rpoS::RR10 돌연변이체들의 경우 부착 및 침입이 약간 증가한 반면, J774 세포들에서 정지기까지 배양된 rpoS::RR10 돌연변이체들의 경우에서 부착은 약간 감소하였다. 여기 나타내지 않은 추가의 연구에서, 4℃에서 분석하였을 때(데이타는 여기 나타내지 않음) J774 세포들에 부착하거나 또는 침입하는 이들 균주들의 능력에는 아무런 차이가 없는 것으로 관찰되었다. 이들 데이타들은 rpoS 유전자 생성물이 S. typhimurium의 지수 성장기 및 정지 성장기 동안에 장관 상피세포들과 매크로파아지 유사세포들로의 시험관 내 부착이나 또는 이들로의 침입에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않으며, S. typhimurium LT-2로부터의 변경된 rpoS 대립유전자를 포함하는 SL1344-유도된 S. typhimurium에 대해 보고된 것과 일치된다는 것을 나타내었다(Wilmes-Riesenberg 등, Infec. Immun. 65:203~210, 1997).
J774 쥐의 매크로파아지 유사 세포들 또는 쥐의 골수 유도된 매크로파아지 내로 흡수되어졌을 때 rpoS 돌연변이를 지닌 S. typhimurium 박테리아 또한 생존가능하였다. 쥐의 골수 유도된 매크로파아지들은 Sprague Dawley 쥐들(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN))의 대퇴골(femur)들과 경골(tibia)들로부터 얻었으며, 10%의 소 대반 혈청(FCS), 100 유니트 페니실린/㎖ 및 100㎍ 스트렙토마이신/㎖를 포함한 Dulbecco 최소 필수영양 배지(DMEM; GibcoBRL사, Grand Island, NY)를 포함하는 75㎠ 플라스크 내에서 10일동안 배양되었다. 매크로파아지들은 그 후 10% 소 태반 혈청(FCS), 5% 말 혈청(HS; Sigma사, St. Louis, MO), 10% L-세포-조절된(conditioned) 배지, 1mM 글루타민 및 1% 페니실린을 포함한 DMEM에서 5% CO2를 포함하는 환경에서 37℃에서 24시간동안 배양되었다. 부착되지 않은 세포들을 제거하고, 사용된 배지를 교체한 후 추가로 5일간 세포들을 인큐베이션 처리하였다. 매크로파아지를 플라스크의 표면으로부터 살짝 긁어내어 항생제 없이 10% FCS, 5% HS 및 10% L-세포-조절된 배지로 보충된 새로운 DMEM에 재부유시켜, 감염 실험 전에 24개 웰의 미세역가 평판들의 웰에 쥐 골수 유도된 매크로파아지 또는 J774 세포들 각 ㎖당 5×105또는 1×106세포농도로 접종하는데 사용하였다.
χ3339 또는 χ4973은 상기에서 설명한 바와 같이 정지기까지 배양하여 약간 변형된 Buchmeier 등, Infect. Immun. 57:1~7, 1989에 따라 J774 세포들 또는 쥐 골수 유도된 매크로파아지들에서의 세포내 생존 분석실험에 사용하였다. 박테리아는 세포당 2~10개의 박테리아 범위의 중복 감염도(MOI)에서 상기에서 제조된 단일층들의 감염전에 10% 정상 생쥐(mouse) 혈청으로 30분동안 옵소닌화되었다(opsonized). 감염된 단일층들은 침입이나 식세포작용이 일어나도록 20분동안 인큐베이션 한 후, PBS로 두번 세척하여 용액상에 잔류하는 박테리아를 제거하였다. 세포외 박테리아 성장을 제거하기 위하여, 10㎍/㎖의 젠타마이신을 포함하는 새 배양 매질을 세척, 감염된 단일층들에 첨가하였다. 젠타마이신을 첨가한 후에, 감염된 단일층들을 표시된 시간동안 인큐베이션 처리하고, 항생제 잔여물을 제거하기 위해 세척한 후, PBS에서 0.1% 소듐 디옥시콜레이트로 용균시켰다. 용균액들의 희석액을 L 한천상에 도말하고 생존하는 내부 세포 박테리아들의 수를 계산하기 위하여 37℃에서 24~36시간동안 인큐베이션 처리하였다.
도 1과 도 2는 24시간 동안 세개의 웰로부터 얻은 세포들에 대한 박테리아의 수들의 시간진행에 따른 평균과 표준편차들의 로그를 나타낸 것이다. 처음 2~4시간 동안에는 J774 세포들 내에서 χ3339과 χ4973은 박테리아 세포 수가 감소됨을 나타내었으며, 그 다음 10시간 동안에는 세포수가 증가되었다. 그러나, 쥐의 골수 매크로파아지들 내에서는 4~20시간 사이에 이러한 박테리아 생존수의 감소가 관찰되었지만, 연구과정중 다수의 박테리아가 rpoS 야생형 또는 rpoS 돌연변이 균주간에 거의 차이가 없이 생존하였다. 따라서, S. typhimurium rpoS 돌연변이들은 쥐의 매크로파아지 유사 J774 세포들 또는 쥐 골수 유도된 매크로파아지들과 이들의 야생형 부모에서 생존할 수 있었으며, 이는 rpoS 유전자 산물이 이들 매크로파아지들 내에서 미생물의 생존에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
P.O. 감염후 rpoS 돌연변이들의 조직분포:
rpoS::RR10 돌연변이와 야생형 균주들의 GALT 콜로니화 능력을 비교하여 동물 감염도 연구를 수행하였다.
이 연구들에 사용된 박테리아는 100㎖ 부피의 L 배양액내에서 37℃에서 호기적으로, 600nm에서 광학밀도 0.8까지 배양되었다. 7,000rpm에서 10분간 원심분리하여 박테리아를 채취하였다. 세포 펠렛을 젤라틴으로 완충된 식염수(BSG) 1㎖에 재부유시켰다.
Charles River Laboratoreis(Wilmington, MA)로부터 구입한 8~10주된 암컷 BALB/C 생쥐들을 χ4973 rpoS 돌연변이와 χ3339 야생형 균주들과 함께 공동감염(coinfect)시키거나 또는 각 균주들을 개별적으로 감염시켰다. 공동감염과 개별감염 실험 각각에서, 각 3마리의 생쥐로 이루어진 4그룹들에 거의 동일한 수의 박테리아를 경구적으로 접종시켰다. 생쥐들을 경구접종 후 1일, 3일 그리고 5일에 1시간 동안 CO2질식시키므로써 안락사시켰다. 대상이 되는 창자 및 조직들을 무균적으로 제거하여 조직 균질기(Brinkman Instrumetns사)로 균질화하였다. 파이에르씨판(Peyer's patch)들을 대표하는 5~10개의 림프성 난포들을 각 생쥐로부터 모아, 균질화하기 전에 혼합시켰다. 균질체를 BSG 내에 희석하여 암피실린과 함께 또는 암피실린 없이 MacConkey/1% 한천상에 도말하였다. 이로써 조직들을 성공적으로 콜로니화하는 야생형과 rpoS 돌연변이 Salmonella typhimurium의 총 수와, 동일한 조직들을 성공적으로 콜로니화하는 rpoS 돌연변이 박테리아의 총 수를 비교할 수 있었다. 공동감염과 개별감염 실험들에 대한 데이타들은 아래 표 5와 표 6에 각각 나타내었다.
표 5. 경구 공동감염a후, 생쥐 조직들 내에서의 S. typhimurium 야생형의 rpoS 돌연변이들에 대한 비율.
a: 거의 같은 수의 χ3339(야생형)과 χ4973 rpoS(각각 4.5×109및 4.0×109콜로니 형성 단위(CFU))를 10주된 BALB/c 생쥐에게 경구적으로 투여하였다. χ3339/χ4973±SEM(n=3)에 대한 조직의 CFU/g 평균 비율은 주어졌다. 20 CFU/g보다 큰 박테리아 수만 비율계산시 고려하였다.
b: 파이에르씨 판이 있는 소장 및 대장은 제거하였다.
c: N.D., 박테리아 수가 결정되지 않았음(not determined).
표 6. S. typhimurium 야생형 또는 rpoS 돌연변이 균주a들로 개별감염된 후 생쥐 조직들의 콜로니화.
a: 10주된 BALB/c 생쥐들을 야생형 χ3339(2.7×109CFU) 또는 rpoS 돌연변이 χ4973(1.1×109CFU) 박테리아로 경구적으로 감염시켰다. 20 CFU/g보다 큰 박테리아 수만 비율계산시 고려하였다.
b: 장관 벽과 파이에르씨 판들은 표시한 시간 후에 절제해내었다. 세마리 생쥐들을 각 시점에서 안락사시켰다. 표준오차들을 각 실험에 대하여 나타내었다.
c: 파이에르씨 판을 지닌 소장 및 대장은 제거하였다.
rpoS 돌연변이 균주 χ4973과 야생형 χ3339는 혼합된 감염(표 5) 및 개별감염(표 6) 모두에서 3일째에 장관벽에서의 박테리아 수를 판단했을 때 유사한 효율로 위장관을 초기에 콜로니화하였다. 따라서 rpoS 돌연변이들은 야생형 부모균주 뿐만 아니라 위에서도 생존하였다.
그러나, rpoS 돌연변이 균주 χ4973는 이의 야생형 부모균주 χ3339에 비교했을 때 훨씬 적은 효율로 파이에르씨 판들을 콜로니화하였다(표 5 와 표 6). 이러한 rpoS 균주의 단점은 비장(spleen)에서도 확인되었다(표 5). 따라서, rpoS 돌연변이 대립유전형질을 지닌 S. typhimurium 균주는 면역반응들이 제거되는 두개의 주요 림프기관들인 GALT와 비장을 콜로니화 하는 능력이 불완전하였다.
rpoS 유전자 산물이, 파이에르씨 판의 S. typhimurium의 콜로니화에 중요한 산물을 생성하는 염색체적으로 암호화되는 유전자들의 발현을 조절하는지의 여부를 결정하기 위하여, 야생형 χ3339 및 rpoS 돌연변이 χ4973 균주들이, 플라스미드 처리된 동위유전자 유도체 χ3340과 χ3125를 각각 생성하도록 유독성 플라스미드로 처리하였다. 이들 유도체 균주들이 파이에르씨 판들을 콜로니화하는 능력을 χ3340과 χ8125을 1:1의 비로 경구투여하여 실험하였고, 데이타는 아래 표 7에 나타내었다.
표 7. 경구 공동감염 후a, 생쥐 조직들에서 유독성 플라스미드 처리된 S. typhimurium에 대한 야생형 대 rpoS 돌연변이형들의 비율
a: 거의 같은 수의 χ3340과 χ8125(각각, 4.0×109CFU 및 3.4×109CFU)를 10주된 BALB/c 생쥐에 경구투여하였다. χ3340/χ8125±SEM(n=3)에 대한 조직의 CFU/g의 평균비는 주어졌다. 20 CFU/g보다 큰 박테리아 수만 비율계산시 고려하였다.
b: 파이에르씨 판을 지닌 소장 및 대장은 제거하였다.
c: 1:100 희석액에서 박테리아 수의 탐지 불가능.
표 7에 나타난 바와 같이, rpoS 돌연변이 균주 χ4974의 유독성 플라스미드 처리된 유도체인 χ8125는 야생형 χ3339 균주의 유독성 플라스미드 처리된 유도체인 χ3340의 콜로니화 능력에 비하여, 감염후 5일째에 파이에르씨 판들을 콜로니화하는 능력이 감소됨을(ca. 5.1배) 나타내었다. 이들 데이타는 RpoS가 경구접종 후 쥐의 파이에르씨 판들의 성공적인 콜로니화에 중요한 산물을 생성하는 염색체적으로 암호화된 유전자(들)의 발현을 조절한다는 것을 나타낸다.
파이에르씨 판들의 조직학에 대한 RpoS￣ 균주의 영향
χ3339와 χ4973으로 경구 접종한 후 여러 시점에서 생쥐의 장관 벽으로부터 파이에르씨 판들을 제거하여, 얼음으로 냉각시킨 pH 7.4의 0.1M의 소듐 포스페이트 완충액 내에 존재하는 1.5% 글루타르알데히드와 1.5% 파라포름알데히드의 용액내에 즉시 고정시키고, 그 후 pH 7.4의 소듐 포스페이트 완충액 내의 2.5% 글루타르알데히드내에 실온에서 한시간동안 고정시켰다. 파이에르씨 판들의 돔들을 위치시키기 위하여 고정된 조직을 두껍게 슬라이스한 단편들을 에폭시 티슈 스테인(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)으로 염색하였다. 얇게 슬라이스된 단편들을 75kV의 가속 전압에서 가동되는 Hitachi H-600 전자전달 현미경(TEM)을 이용하여 실험하였다.
광 또는 TEM 현미경검사를 사용하여 단편들을 관찰하므로써 야생형 유독성 균주 χ3339로 경구접종한 후 빠르게는 하루만에 파이에르씨 판 상피조직의 온전성에 있어서의 주요한 형태학적 변화들을 밝혀내었다(도 3E 및 도 3F). 난포관련 상피(FAE)의 파괴는 도 3G 및 도 3H에 나타난 바와 같이 χ3339로 경구접종 후 3일 및 5일에 더욱 명백하였다. 엔테로사이트들(enterocytes)은 돔형 상피조직으로부터 완전히 탈피되어졌으며, 광범위한 조직 탈저(necrosis)가 관찰되었다. 또한, χ3339로 생쥐를 경구접종 한 후 5일에 파이에르씨 판 림프성 난포조직의 세포밀도가 극적으로 감소되었다(도 3h와 도 4c).
반면에, rpoS 돌연변이 균주 χ4973으로 감염되거나 감염되지 않은 생쥐로부터 얻은 파이에르씨 판들은 χ3339 감염으로 인한 조직 형태학상의 극적인 변화를 나타내지 않았다. 그 대신, 돔 상피조직의 온전성이 보충되지 않았으며, 경구접종 후 1일, 3일 및 5일에, 근본적인(underlying) 림프조직의 세포밀도에서의 아주 적은 감소가 관찰되었다(도 3B~3D).
rpoS 돌연변이 균주 χ4973으로 경구투여하기 전 및 경구투여 후 5일에 파이에르씨 판 조직의 TEM 분석은 FAE가 변하지 않고 온전하게 남아있다는 것을 나타내는 반면(도 5A 및 도 5B), χ3339 감염된 파이에르씨 판들에서는 빠르게는 경구접종 후 1일에 FAE가 완전히 파괴되었다(도 5F).
근본적인 림프조직 내에서의 극적인 형태학적 변화들은 TEM으로 보았을 때도 매우 명백하였다. χ4973으로 감염된 후 5일에, 파이에르씨 판 난포내의 림프세포들은 건강하였고, 감염되지 않은 생쥐들로부터의 파이에르씨 판들과 형태학적으로 유사하였다(도 5A 및 도 5B). 반면에, 전반적인 형태에서의 광범위한 변화들이 χ3339로 감염된 후 5일에 파이에르씨 판 림프세포들 내에서 관찰되었다(도 5C).
이러한 데이타들은 rpoS 돌연변이 S. typhimurium이 효과적으로 침입하여 GALT를 콜로니화하지 못한다는 것을 의미한다. 따라서, rpoS 돌연변이들은 GALT의 콜로니화에 의존적인, 일반화된 점막성 면역 반응을 자극하는데 결함이 있는 것으로 예측할 수 있다. 또한, GALT는 장간막 림프절들과 비장내로 들어가는 입구이기 때문에, 돌연변이들은 또한 이러한 보다 내부 깊숙한 림프조직들을 침입하여 콜로니화하는데 비효율적인 것으로 예측될 수 있다. 장간막 림프절들과 비장의 콜로니화에 의존적인, 계통, 체액 면역 및 세포성 면역반응에 결함이 있는 돌연변이체들을 야기하는 것으로 예측될 수 있다. 반면에 야생형 rpoS 대립형질 유전자를 포함하는 균주들은 보다 효율적으로 GALT 및 보다 내부의 림프조직들에 침입하여 콜로니화하며, 따라서 이들은 점막성, 체액성 및 세포성 면역반응들을 제거하는데 더욱 효과적이다.
한면, rpoS+균주들은 파이에르씨 판 조직을 파괴하기 때문에, 백신에 사용되기에는 별로 이상적인 대상이 아니다. 따라서, 미생물들이 파이에르씨 판 조직을 파괴하지는 않지만, 파이에르씨 판들을 침입하여 콜로니화할 수 있도록 하는 독성감소 돌연변이를 적어도 하나 사용하므로써, rpoS+미생물들을 변형하는 것이 바람직하다.
실시예 2
본 실시예는 인간의 백신으로서의 사용에 적당한 다른 박테리아 뿐만 아니라 rpoS+S.typhimurium과 S.typhi 균주들을 감쇠시키는 지정된 결실 돌연변이를 형성하는데 사용될 수 있는 방법을 예시한다.
트란스포손 Tn10을 사용하는 염색체 결실의 생성은 Salmonella(크렉크너 등., J. Mol.Biol. 116:125-159, 1997; EPO 공보 제 315,682호; 미국특허 제 5,387,744호; 여기에 참고문헌으로 통합되어 있음)를 포함한 박테리아의 다양한 변형으로 이미 기술되어 있다. 최근에, 새로운 방법들이 유전자로 특이적 돌연변이를 도입하는데 유용해졌다. 돌연변이되는 유전자는 클로닝 벡터 또는 PCR 방법을 사용하여 클로닝하므로써 플라스미드에 유전자의 전부 또는 일부분을 포함하는 증폭된 생성물로 형성된 게놈의 DNA 라이브러리에 포함된 클론들의 개체군으로부터 선택될 수 있다. 그러한 유전자들 또는 유전자들의 일부로 유도된 돌연변이들은 지정된 결실로서 알려져 있고, 이러한 돌연변이들은 두가지의 일반적인 방법들중의 하나를 사용하여 형성된다.
하나의 방법은 재조합 벡터로부터 분리된 유전자의 모두 또는 일부를 제거하기 위하여 제한효소를 사용한다. 이러한 방법으로 DNA 서열 정보가 유용하지 않은 유전자의 돌연변이가 가능하다. 그러나, 이 방법은 유전자 또는 DNA 측면근접하는 클론 유전자 사이에 존재하는 제한부위의 사용에 제한된다.
다른 방법은 결실되려는 유전자 사이 또는 DNA 측면근접하는 유전자 사이에 있는 공지된 DNA 서열을 기초로 하는 합성된 분기 PCR 프라이들의 사용에 적용된다. 프라이머들은 클론 유전자를 포함하는 벡터와 혼합되고, 역의 PCR 반응되기 쉽고 그 결과 전체 플라스미드가 증폭되지만 표적 유전자의 전부 또는 일부가 결실되지는 않는다(이니스 등., 인프라). PCR 반응은 결실되려는 DNA의 특정 단편에 측면근접하는 상류 영역과 하류영역을 증폭시키고, 클로닝 벡터와 상류 및 하류 측면근접 서열로 이루어지는 생성물을 발생시킨다. 공지된 DNA서열의 유전자 사이에 있는 어떤 부위에서 일정한 크기의 돌연변이의 배치가 가능하고, PCR 프라이머 또는 표적 DNA로 설계될 수 있는 새로운 제한 부위를 도입할 수 있고, 그 후에 다른 클론 서열의 연속적인 삽입에 사용될 수 있기 때문에 역의 PCR의 방법이 바람직하다. 지정된 결실을 발생시키기 위한 또 다른 PCR 방법은 유전자 또는 측면근접하는 DNA 서열의 일부분을 나타내는 증폭된 PCR 생성물에 따라 달라진다. 이들은 클로닝 벡터에서 서로 연결되어 지정된 결실 돌연변이를 형성한다.
게놈 라이브러리는 일정한 수의 클로닝 벡터들로 형성될 수 있다(샘브룩 등., 수프라). 결실이 발생할 수 있는 유전자를 포함하는 클론들은 같은 유전자에 돌연변이가 있는 박테리아 균주에 보완되므로써 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
예를 들면, 야생의 Salmonella typhimurium, UK-1(χ3761)로부터의 게놈 DNA 라이브러리는 pNEB-193(뉴잉글랜드 생물실험실)와 같은 적당한 클로닝 벡터로 형성될 수 있고, 이는 독특한 8-베이스 커터: AscI, PacI 및 PmeI를 위해 단일 부위를 운반하는 pUC19 유도체이다. 일반적으로, 게놈 DNA는 표준방법에 따라서 분리된다(샘브룩 등, 분자 클로닝/실험실 매뉴얼 제2판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 뉴욕, 1989). Sau3AL 부분적으로 소화된 게놈 DNA는 아가로스 겔상에서 크기가 만들어지고 Promega, Quiagen 또는 Bio101로부터 얻어진 키트 형태로 상업상 유용한 방법을 사용하여 추출된다. 2∼6kb의 DNA 단편들은 분리되고, BamHI 또는 BglII로 소화된 제 1의 플라스미드로 연결되며, 그 다음에 제조자들의 지시에 따라서 알칼리 포스파타제를 사용하여 탈인산화된다. 생성된 플라스미드 라이브러리는 그 후에 게놈 라이브러리를 증폭시키기 위해서 그리고 2∼6kb 크기의 범위에서 랜덤 게놈 DNA 삽입체를 포함하는 재조합 플라스미드들의 개체군을 얻기 위하여 적당한 E.coli 균주로 도입된다. 관련된 클론들은 돌연변이체 E.coli 또는 S.typhimurium 균주를 보완하므로써 게놈 라이브러리로부터 분리된다.
유전자의 DNA 서열이 이미 알려진 경우에, PCR 프라이머들은 합성되고, 유전자와 종종 몇개의 측면근접 서열이 PCR 방법을 사용하여 박테리아의 샘플로부터 직접 또는 정제된 게놈 DNA 및 pNEB-193과 같은 플라스미드 벡터로 클론된 생성물로부터 증폭된다. 그러므로 유전자 서열이 알려진 경우에 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 것은 필요하지 않다.
지정된 결실이 벡터상에 위치해 있고, 선택가능한 마커에 연결되어 있는 한, 실질적으로 어떤 클로닝 벡터는 본 발명의 균주를 형성하는데 사용될 수 있다. 지정된 결실 돌연변이를 염색체에 도입하는데 유용한 많은 다른 방법들이 존재하는데 여기에는 온도-민감성 레플리콘(replicons)(해밀톤 등., J.Bacteriol. 171:4617-4622,1989), recBC 돌연변이체의 선형 형질변환(재신 등., J.Bacteriol. 159:783-786,1984) 그리고 자살 벡터로서 알려진 레플리콘이 제한된 숙주(밀러 등., J. Bacteriol. 170:2575-2583, 1988)가 포함되어 있다. 이러한 모든 방법들로 대립유전자가 치환될 수 있는데, 이로써 벡터에 형성된 돌연변체 대립유전자가 염색체상에 야생의 대립유전자로 치환되거나 또는 그 반대가 될 수 있다.
pir-종속 R6K 레플리콘은 다수의 연구자들에 의해서 사용될 수 있고, 대립유전자 치환에 유용하고 가장 믿을만한 자살 벡터들중의 하나이다. R6K 플라스미드의 복제에 pir 유전자 생성물이 필요하다. pir-종속 플라스미드는 pir 숙주 박테리아에서 복제되지 않을 것이고, 따라서 pir-종속 플라스미드상에 있는 지정된 결실 돌연변이의 존재는 드문 경우에 선택을 위해 허용될 것이고, 여기에서 플라스미드는 플라스미드상에 형성된 결실에 측면근접하는 동족의 영역 사이에 있는 숙주 염색체로 삽입된다. 플라스미드가 복제를 할 수 없음에도 불구하고, 삽입이 일어나는 것은 플라스미드 상에 있는 성분을 적당하게 유지하는 메카니즘을 제공하기 때문에 플라스미드가 삽입된 균주상에 있는 몇개의 선택가능한 표현형이 주어질 것이다. 항생성분들이, 삽입된 플라스미드의 존재를 선택하기 위하여 일반적으로 사용되고, 앰피실린, 카나이마이신, 클로르암페니콜, 젠타마이신, 스펙티노마이신 및 테트라시클린 및 당기술분야에 공지된 다른 것들에 대해 저항성을 암호화하는 유전자들로부터 선택될 수 있다. 숙주균주는 같은 유전자에 두개의 다른 대립유전자를 포함하므로 삽입된 자살 벡터와 함께 지정된 결실을 갖는 숙주균주는 메로디플로이드로서 여겨진다. 일반적으로, 벡터상에 형성된 결실은 유전자 결실을 나타낼 것이고, 염색체에 삽입된 생성물은 삽입된 벡터의 하나의 말단에 측면근접하는 야생의 대립유전자 및 벡터의 다른 말단에 있는 지정된 결실 돌연변이 대립유전자의 존재로서 특징지어지는 구조를 가질 것이다. 다른 구조들은 당기술 분야에 공지되어 있다.
항생-저항성 마커와 함께 염색체로부터 절단된 자살 벡터가 있는 박테리아는 특정 배지상에서 선택될 수 있다. 두개의 그러한 반대 선택 방법들은 항생-민감성 균주를 증명하기 위하여 사용되었다. 실시예 1에 기술된 하나의 방법은 테트라시클린 저항성 균주들의 푸사르산 민감성에 따라 달라진다. 푸사르산 플레이트에 나타난 콜로니들은 테트라시클린 저항성의 상실과 돌연변이체 대립유전자의 존재를 위해서 스크린된다. 다른 반대의 선택 방법은 5% 슈크로오스의 존재하에서 레바노슈크라제의 발현이 sacB 유전자가 갖는 세포에 대해 독성인 sacRB 시스템(카니가 등., Gene 109:137-141, 1991)을 사용하여 슈크로오스 민감성에 대해 장점을 갖는다.
균주로 지정된 결실 돌연변이 대립유전자가 도입된 후에, 돌연변이 유전자와 관련된 표현형들이 당기술분야에 잘 알려진 표준화된 테스트를 사용하여 특징지어진다. 이러한 테스트들은 표현형의 역전 빈도의 결정, 서던 블롯(Southern blot) 또는 PCR에 의한 결실의 확인, O-그룹 특정 항혈청에 의한 접합, 완전한 LPS의 생성, 편모 H 항원의 존재, 운동성, 플라스미드 함량 및 옥소트로피의 확인을 포함한다.
돌연변이 균주들은 야생에 대해 상대적으로 DNA의 운동성 이동에 의해 나타난 바와 같이, 결실된 지역 및 플라스미드상에 형성된 지정된 결실 돌연변이 대립유전자에 따른 유전자 물질의 손실을 포함하는 것이 서던 블롯에 의해 나타날 수 있다. DNA 분리가 필요하지 않고, 그 결과가 하루도 걸리지 않아서 완성될 수 있기 때문에, 돌연변이 균주들의 PCR 분석은 지정된 돌연변이의 존재를 확인하기 위하여 필요한 시간을 상당히 줄일 수 있다. PCR 방법은 또한 PCR 생성물의 겔 분석에 기대되는 것들 보다도 더 다중 DNA 단편의 운동성 이동 또는 생성물에서 나타난, 에러의 재조합 사건의 또는 운반 벡터 서열의 보유의 확인을 할 수 있다.
형성한 후에, 지정된 결실 돌연변이들을 갖는 균주들은 돌연변이 관련된 특성들 및/또는 감쇠될 뿐만 아니라 면역원으로 되는 균주들에게 중요한 특성들로 전적으로 평가된다. 예를 들어, 부계의 야생의 균주와 유사한 전체-길이 LPS의 생성물은 은으로 염색한 젤을 사용하여 평가된다. 정확한 O-항원의 확인은 돌연변이 세포들의 항혈청 접합에 의해서 결정된다. 돌연변이 균주들은 희석된 폴리 H 항혈청(Difco)를 사용하여 양성 접합을 평가하고, 아버지 균주 및 편모가 없는 조절 균주, χ3420 및 χ3422에 대한 부드러운 한천 운동성 튜브에서 운동성 테스트가 행해진다. 표준 치료의 API 테스트 줄무늬들은 부계 균주와 비교하기 위한 발효 및 생화학적 데이터를 얻기 위하여 각각의 돌연변이 균주의 분리에 사용된다. 돌연변이 균주들의 성장속도와 함량은 또한 부계 균주들의 것과 비교된다. S.typhi 균주들을 가지고, 플라스미드 함량이 평가되지는 않는데, 그 이유는 S.typhimurium에 존재하는 커다란 독성 플라스미드가 S.typhi에는 없기 때문이다(구리그 등., Infect. Immu. 56:3262-3271, 1987).
phoP, phoQ 및 phoPQ 유전자들로 지정된 결실의 형성
Salmonella phoPQ 오페론은 phoP 유전자와 인접하는 하류 phoQ 유전자들로 이루어진다. 오페론의 전체 뉴클레오타이드 서열과 몇개의 측면근접 서열이 공지되어 있기 때문에 phoP 유전자와 phoQ 유전자들에서의 지정된 결실들은 역의 PCR 방법을 사용하여 형성될 수 있다. DNA 서열은 이러한 유전자들의 지정된 결실들을 형성하는데 유용할 수 있는 제한 부위의 존재와 위치를 나타낸다. 유전자들은 단일 2,110 염기쌍 PCR 생성물 위에서 분리될 수 있고, 플라스미드 벡터로 클론될 수 있다. phoPQ 유전자 카세트를 포함하는 재조합 벡터는 제한효소로 소화되어 phoQ 유전자가 그대로 남으면서 대부분의 phoP 유전자가 제거될 수 있다. phoPQ 유전자 카세트상의 지정된 phoP 결실은 자살 벡터로 삽입될 수 있고, 항생-저항성 머로디플로이드를 생성하기 위해 야생 phoPQ Salmonella의 염색체로 도입될 수 있으며, 이는 항생 마커와 함께 삽입된 플라스미드의 손실을 선택하기 위하여 적당한 배지에서 성장할 수 있다. 항생-민감성 균주들은 키에르 등의 한천을 덮는 방법(J.Bacteriol. 130:399-410, 1977)을 사용하여 산 포스파타제 활성의 손실을 스크리닝하므로써 적당한 지정된 결실 phoP 돌연변이 대립유전자의 존재로서 표현형으로 특징지어질 수 있다. phoP 또는 phoQ 중의 하나의 돌연변이는 PhoP-표현형을 주기에 충분하다.
phoQ에 있는 또는 phoP와 phoQ에 모두 있는 지정된 결실 돌연변이들은 phoQ 또는 두개의 phoP와 phoQ로부터의 DNA의 지정된 단편들을 제거하기 위하여 제한 효소를 사용하는 유사한 방법들을 사용하여 생성될 수 있고, 머로디플로이드를 생성하기 위하여 자살 벡터상에 있는 염색체로 유도될 수 있으며, 이는 삽입된 플라스미드와 항생 마커의 손실을 위해 적당한 배지에서 반대로 선택될 수 있고, 표현형을 증명하기 위하여 PCR을 사용하여 관련된 지정된 결실 돌연변이 대립유전자의 존재를 위하여 표현형으로 스크린될 수 있다.
cya 유전자에서의 지정된 결실의 형성
말토오즈 양성 표현형을 E.coly cya 돌연변이 균주에 주는 재조합 벡터는 맥콘케이(MacConkey) 말토오즈 배지에서 성장할 때 Salmonella cya 유전자에서 지정된 결실을 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 공지된 Salmonella cya 유전자를 기초로 하는 분기 프라이머들은 벡터와 PCR 프라이머 위치에 의해 특정된 결실된 DNA의 말단에 측면근접하는 DNA로 이루어진 선형 생성물을 만들기 위하여 주형으로서 재조합 벡터를 보완하면서 역의 PCR 반응에 사용될 수 있다. 선택적으로 제한효소들이 재조합 벡터로부터 보완하는 cya 유전자의 전부 또는 일부를 제거하기 위하여 사용될 수 있다.
이러한 방법을 사용하여 형성된 지정된 결실은 제한효소를 사용하는 클로닝 벡터로부터 삭제될 수 있고, 항생 마커를 포함하는 자살 벡터로 유도될 수 있다. 지정된 결실 cya 대립유전자를 포함하는 생성된 재조합 자살 벡터는 야생 cya Salmonella 균주의 염색체로 유도되어 항생 머로디플로이드를 생성할 수 있다. 머로디플로이드는 항생 마커와 함께 삽입된 플라미드의 손실을 위해 선택되어질 수 있는 적당한 배지에서 성장한다. 항생-민감성 균주들은 적당한 지정된 결실 Δcya-27 돌연변이 대립유전자의 존재로 표현형으로 특징지어질 것이다. MGM-232 및 χ8217은 이러한 방법들로 형성된 지정된 Δcya-27 돌연변이를 갖는 두개의 S.typhimurium UK-1이다(표 1 참조).
crp 유전자에서의 지정된 결실의 형성
Salmonella crp 유전자의 지정된 결실들은 cya에서의 결실의 형성에 사용되는 방법과 유사한 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 재조합 벡터가 맥콘케이 말토오즈 배지에서 성장할 때 E.coli crp 돌연변이 균주에게 말토오즈 양성 표현형을 주는 것이 선택될 수 있다. 분기형 CPR 프라이머들은 공지된 Salmonella crp 유전자와 측면근접 서열들을 제거하기 위하여 사용될 수 있으며, 생성된 지정된 결실은 자살 벡터상에 있는 야생 crp Salmonella의 염색체로 유도되어 항생 머로디플로이드를 생성한다. 머로디플로이드는 항생 저항성과 삽입된 플라스미드의 손실을 위해 선택하기 위하여 적당한 배지상에서 성장할 수 있으며, 항생-민감성 균주들은 적당한 지정된 결실 crp 돌연변이 대립유전자의 존재로 표현형으로 특징지어질 수 있다.
Δcya Δcrp 이중 돌연변이체들의 형성
두개의 cya 및 crp에 지정된 결실 돌연변이를 포함하는 균주들 또한 형성될 수 있다. 예를 들어, cya 돌연변이체는 상기 기술된 바와 같이 형성될 수 있으며, 그 후에 지정된 결실 돌연변이 crp 대립유전자가 적당한 항생 배지상에서 선택된 머로디플로이드를 생성하기 위하여 자살 벡터상으로 유도될 수 있다. 상기 기술된 푸사르산 또는 5% 슈크로오즈와 같은 적당한 배지상에서의 머로디플로이드의 성장은 염색체로부터 항생 유전자와 함께 자살 벡터의 손실을 위해 반대의 선택을 위해 사용될 수 있고, 적당한 지정된 결실 crp 돌연변이체는 2mM cAMP를 포함하는 맥콘케이 말토오즈 배지상에서 표현형으로 확인될 수 있다. 이는 cAMP가 표현형으로 맥콘케이 말토오즈 한천상에 있는 Cya+로 될 수 있는 cya 돌연변이를 야기하는 cya 유전자에 의해 암호화되는 아데닐산시클라아제의 생성물이기 때문이다. 그러나, crp 돌연변이는 말토오즈를 더이상 발효시킬 수 없는 cya 돌연변이체 균주를 주고, 따라서 말토오즈 배지상에서의 선택은 지정된 Δcya 및 Δcrp 돌연변이로 균주를 쉽게 검출할 수 있도록 한다. MGN-431 및 χ8214는 이러한 방법으로 형성된 지정된 cya 및 crp 결실 돌연변이들을 갖는 두개의 균주들이다(표 1 참조).
pmi 및 cdt 유전자에서의 지정된 결실의 형성
다른 유전자들에서의 돌연변이들은 또한 cdt와 pmi 대립유전자를 포함하여 Salmonella상에서 감쇠를 주는 것으로 밝혀졌다. pmi 유전자에 있는 지정된 결실들은 역 PCR 방법, 또는 제한 효소를 사용하여 형성될 수 있다. 맥콘케이 만노오즈 배지상에서 성장할때 E.coli 또는 Salmonella 돌연변이체 pmi 균주에 만노오즈 양성 표현형을 주는 재조합 벡터는 제한효소 또는 역 PCR을 사용하여 지정된 결실 돌연변이체 pmi 대립유전자를 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 지정된 결실 pmi 대립유전자는 자살 벡터로 삽입되고 항생 머로디플로이드를 만들기 위하여 pmi+Salmonella의 염색체로 삽입될 수 있으며, 이는 항생 유전자와 함께 삽입된 플라스미드의 손실을 위하여 선택된 적당한 배지에서 성장할 수 있다. 항생-민감성 균주들은 역전가능한 조면-활면 표현형을 스크리닝 하고, 만노오즈의 존재하에서 성장할때 O-항원 반복배열의 합성을 야기하는 활면 표현형과, LPS O-항혈청의 존재하에서 접합이 없음으로 인하여 검출된 만노오즈의 부재하에서 성장될 때 조면 표현형을 검출하므로써 적당한 지정된 결실 pmi 돌연변이체 대립유전자의 존재를 위하여 표현형으로 특징지어질 것이다.
Salmonella상에 Cdt- 표현형을 주는 지정된 결실은 Salmonella cdt 돌연변이체를 보완하는 재조합 벡터로부터 이 표현형과 관련된 DNA를 제거하기 위하여 제한 효소를 사용하여 형성될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 형성된 돌연변이체 대립유전자는 자살 벡터로 삽입되어 항생 머로디플로이드를 만들기 위하여 cdt+Salmonella의 염색체내로 유도될 수 있다. 머로디플로이드는 항생 마커와 함께 삽입된 벡터의 손실을 선택하기 위하여 적당한 배지상에서 성장할 수 있으며, 항생- 민감성 균주들은 적당한 지정된 결실 cdt 돌연변이체 대립유전자의 존재를 위하여 표현형으로 특징지어질 수 있다.
실시예 3
이 실시예들은 각각 균주들 MGN-1191 및 MGN-1256을 만들기 위하여 S.typhi ISP1820 및 Ty2에서 지정된 ΔphoPQ23 및 ΔasdA16 결실의 형성을 예시한다.
ISP1820과 Ty2 배경하에 있는 지정된 ΔphoPQ23 ΔasdA16 S.typhi 균주들의 형성은 두개의 자살 플라미드들, ΔphoPQ23 영역을 포함하는 pMEG-213과 ΔasdA16 영역을 포함하는 pMEG-006의 사용과 관련되어 있다.
ΔphoPQ23 결실은 PhoP의 C터미널 말단과 PHoP의 인산화반응에 책임이 있는 PHoQ의 His 영역을 암호화하는 1103 bp EcoRV-TthIII1 단편을 제거하는 EcoRV와 TthIII1로 pMEG-068을 소화시키므로써 얻어진다(도 6). 선형화된 플라스미드는 그 후에 T4 DNA 폴리머라제로 처리되었고, pMEG-210을 만들기 위하여 다시 연결되었다(도 6). ΔphoPQ23 결실을 포함하는 pMEG-210의 BamHI-XbaI 단편은 그 다음에 pir-종속 자살 벡터 pMEG-149로 삽입되어 pMEG-213이 생성되었다(도 6). pMEG-213은 앰피실린 저항에 선택가능한 마커와, 슈크로오스에 민감성으로 되는 반대로 선택가능한 마커, 레바노슈크라아제를 암호화하는 기동가능한 자살 벡터이므로, 플라스미드는 앰피실린 저항을 위해 바람직하게 선택하는 어떤 균주에 결합될 수 있고, 그 다음에 슈크로오즈의 존재하에 돌연변이체 phoPQ23으로 야생 phoPQ 유전자들의 보완을 위해 반대로 선택된다. pMEG-213의 운반에 책임이 있는 숙주 균주는 MGN-758을 만들기 위하여 pMEG-213을 Pir+Asd-운반 숙주 MGN-617로 형질변환시키므로써 얻어졌다.
ΔphoPQ23 결실의 S.typhi ISP1820, χ3744 및 S.typhi Ty2, χ3769로의 도입은 MGN-758을 야생의 S.typhi 부계와 결합하므로써, 그리고 DAP(디아미노피멜산) 없이 성장한 앰피실린-저항성 분리주를 선택하므로써 이루어진다. 이러한 결합으로부터 얻어진 분리주들은 돌연변이체 ΔphoPQ23을 갖는 야생의 유전자의 복제를 생성하는 염색체로의 ΔphoPQ23 결실의 첫번째 삽입을 나타낸다. 이러한 분리주들, MGN-1037과 MGN-1017은 앰피실린-저항성 자살 벡터의 손실을 위하여 선택하는 5% 슈크로오즈가 있는 루리아(Luria) 한천위에 놓여졌다. 이러한 선택에 의해서 얻어진 분리주들은 그 후에 키에르 등의 한천 오버레이 방법을 사용하여 산 포스파타제 활성으로 스크린되었다(J.Bacteriol. 130:399-410,1977). 흰색 포스파타제-음성 콜로니들은 그 후에 ΔphoPQ23 포스파타제 마이너스 표현형으로 확인되고, S.typhi ISP1820의 MGN-1038과 S.typhi Ty2의 MGN-1018로 저장되었다.
지정된 asd 결실의 유도는 그 후에 유사한 항원의 운반을 위한 백신 균주를 제공하기 위하여 필요하다. pMEG-006상에 존재하는 지정된 asd 결실은 새로운 유니크 Bg1II 부위를 포함하는 pMEG-006를 만들기 위하여 219와 1460bp 사이에서 asd 유전자의 코딩 영역의 대부분을 제거하기 위하여 pMEG-003상에서 역 PCR을 수행하므로써 얻어졌다(도 7). pMEG-006은 pir-종속 레플리콘과 트랜스포손 Tn10으로부터의 테트라시클린-저항 유전자를 갖지만, 결합을 할 수 있는 기동 기능을 갖지는 않는다.
어떤 균주로의 지정된 ΔasdA16 결실의 유도는 테트라시클린 저항을 위해 선택하므로써 바람직한 균주로 엘렉트로포레이트화될 수 플라스미드 DNA를 필요로 한다. 얻어진 테트라시클린-저항성 분리주는 그 후에 자살 벡터의 테트라시클린-저항성 성분의 손실을 위해 선택하기 위한 배지를 포함하는 푸사르산 위에 놓여지고(말로이 등., J.Bacteriol. 145:1110-1112,1981), 이어서 Asd-DAP-를 필요로 하는 표현형으로 스크리닝된다. 두개의 MGN-1038 및 MGN-1018은 pMEG-006으로 엘렉트로포레이션되었고, 테트라시클린-저항성 분리주가 얻어졌다. 이러한 분리주들은 그 후에 50㎍ DAP/ml를 포함하는 푸사르산 플레이트에 놓여졌고, 얻어진 분리 콜로니들은 자살 벡터의 테트라시클린-저항 성분의 손실과 ΔasdA16 돌연변이로 야생 asd 유전자의 보완을 위해서 스크리닝되었다. 분리주는 그 후에 테트라시클린 민감성과 DAP의 필요에 의해서 확인되었다. 각각의 균주의 S.typhi ΔphoPQ23 ΔasdA16 유도체가 그 다음의 연구를 위해서 선택되었고, 이는 여기에서 MGN-1191(ISP1820)과 MGN-1256(Ty2)으로 디자인 되었다(표 1 참조).
실시예 4
이 실시예는 RpoS+표현형의 Salmonella 균주들을 테스트하는 방법들을 예시한다.
RpoS는 S.typhimurium에 있는 katE 유전자로부터 하이드로퍼록시다제 II 카탈라제의 발현을 양성으로 조절하기 때문에, 카탈라제 활성의 테스트는 균주들의 rpoS 대립유전자의 상태를 결정하기 위한 하나의 방법을 제공한다(로우웬, supra). 배양물은 고정상으로 성장된 1밀리리터의 각각의 균주에 100㎕의 과산화수소(H2O2)를 첨가하므로써, RpoS 표현형의 지시기로서 카탈라제 생성물로 분석될 수 있다(물베이 등., Gene 73:337-345,1998). H2O2를 첨가한 후에 고정상 배양물을 격렬하게 거품내는 것은 균주가 야생 rpoS 대립유전자를 포함한다는 것을 예상하는 것이고, 여기에서 최소 거품은 균주가 불완전한 rpoS 대립유전자를 포함한다는 것을 의미할 것이다.
감쇠된 Salmonella 균주들의 RpoS 표현형은 또한 영양부족과 산 및 산화의 스트레스에 대한 균주들의 민감성을 평가하므로써 결정될 수 있다. Salmonella rpoS 돌연변이체들은 야생 부계들에 비교하여 이러한 스트레스들이 존재하기 위해 감소된 능력을 갖는 것으로 알려져 있다(팽 등.,Proc.Natl.Acd.Sci.89:11987-11982,1992). 연장된 고정상 생존의 평가는 6일동안 37℃에서 로터리 쉐이커에 있는 M9 배지에서 수행될 수 있다. pH 4.0에 대한 감수성은 고정상 박테리아를 펠레팅하므로써, 그리고 스트르산염 완충용액으로 pH 4.0으로 조절된 L-배양액에서 세포를 재현탁시키므로써 결정될 수 있다. 산화의 스트레스에 대한 균주들의 민감성은 최종 농도가 15mM로 되는 L-배양액에서 고정상 박테리아에 과산화수소를 첨가하므로써 결정될 수 있다. 이러한 실험들의 각각에서, 박테리아는 일정시간 간격으로 제거되고, 생균의 정량화를 위하여 L-한천상에 용출되어 놓여진다.
상기 언급된 각각의 스트레스들에 대한 S.typhimurium rpoS 돌연변이체 균주의 반응이 보고되었고, 이것의 독성 부계 균주와 비교되었다(팽 등.,supra). 특히 rpoS S.typhimurium 돌연변이체는 6일동안 37℃에서 로터리 쉐이커에 있는 M-9 배지에 있는 이것의 야생 부계에 대하여 연장된 고정상이 생존하는 능력이 7배 감소된 것을 나타내었다. 마찬가지로, 이러한 균주들의 고정상 배양물들이 시트르산염 완충용액으로 pH 4.0으로 고정된 L-배양액에서 재현탁된 후에, 이것의 야생 부계에 비하여 pH 4.0까지 rpoS S.typhimurium 돌연변이체는 10배 이상 죽는 것에 민감하다. 게다가, rpoS S.typhimurium 돌연변이의 접종물의 98%는 15mM H2O2에 노출되어 60분을 생존하지 못하였고, 여기에서 야생 부계는 이러한 처리에 영향을 받지 않았다.
RpoS 표현형을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 다른 연구들은 글리코겐을 합성하는 Salmonella의 능력을 평가하는 것과 관련된다. rpoS 영(null) 돌연변이들이 글리코겐-음성 표현형이 된다는 것이 알려졌다(랭 등., Mol Microbial.5:49-59,1991). 특히, glgS 유전자는 글리코겐 합성에 관련된 rpoS-종속 유전자이다. 또한, 영 glgS 돌연변이체는 rpoS 돌연변이체보다 좀더 글리코겐이 축적되어 있으므로, rpoS는 glgS 유도에 추가로 글리코겐 합성에 더 영향을 받을 수 있다. 그러므로, 글리코겐을 축적하는 그들의 능력을 분석하므로써 균주들의 rpoS 대립유전자의 상태를 결정하는 것이 가능하다.
글리코겐의 축적은 단일 콜로니로서의 세포들의 성장 또는 0.06M K2HLPO4, 0.03M KH2PO4, 0.008M (NH4)2SO4, 0.0017M 소듐 시트레이트, 8.1×10-4M MgSO4, 1.9×10-4히스티딘 HCl, 1.5×10-5M 티아민 HCl 및 0.056M 글루코오즈를 포함하는 Q-3 배지에 패치(patches)하므로써 테스트된다. 영양요구성 균주들의 글리코겐 생합성 능력을 분석할때, 적당한 영양 보충물들이 Q-3 배지에 첨가된다. 예컨대, 메티오닌(20㎍/ml), 트레오닌(80㎍/ml), 류신(20㎍/ml) 및 DAP(100㎍/ml)가 Δasd 돌연변이체 균주들의 성장을 유지하기 위하여 Q-3 배지에 첨가되어야만 한다. 또한, S.typhi Ty2 및 ISP1820은 각각 cys 및 cys trp 돌연변이체들이므로, Q-3 배지는 20㎍/ml의 농도에서 이들 아미노산 각각으로 보충되어야만 한다. 37℃에서 약 20시간 성장한 후에, 세포들은 요오드와 요오드화칼륨 용액으로 처리된다. 야생이고 글리코겐 생합성에 관련되어 기능성인 균주들은 요오드 처리한 후에 갈색으로 되고, 반면에 글리코겐 생합성 균주에 해가 없는 균주들은 노란색으로 된다.
상기 연구들을 다양하게 하므로써, 만약 대립유전자가 테스트된다면, rpoS 대립유전자의 rpoS 돌연변이를 가질것이라고 예상되는 χ3339와 같은 야생의 S.typhimurium으로 첫번째 이동 또는 만약 대립유전자가 rpoS+라면 P22HTint-중재된 형질도입을 사용한 rpos 돌연변이체 χ4973으로의 이동에 의해서 RpoS 표현형이 결정될 수 있고, 상기 기술된 테스트들중의 어느 하나에 의해서 RpoS 표현형의 유도된 마이크로브의 테스트가 연속적으로 행해진다. rpoS 대립유전자의 대립유전자의 상태의 마지막 증명은 PCR 방법을 사용하는 DNA 서열화에 의해서 이루어질 수 있다.
실시예 5
이 실시예는 상응하는 rpoS 돌연변이체 S.typhimurium 균주들의 콜로니화 능력과 비교하여, GALT의 콜로니화되는 페이어의 페치에서 cya, aroA 또는 cya와 crp 유전자들 모두에 있는 감쇠된 돌연변이들은 갖는 감쇠된 S.typhimurium rpoS+균주들의 우세한 능력을 예시한다.
테스트된 감쇠된 rpoS+S.typhimurium 균주들은 MGN-431, Δcya/Δcrp 돌연변이체; χ3679, ΔaroA 돌연변이체; 및 MGN-232, Δcya 돌연변이체(표 1의 유도를 참조)이었다. 불활성 rpoS 대립유전자를 포함하는 비교의 S.typhimurium 균주들은 하기 기술된것 처럼 형성되어 χ8214, χ8215 및 χ8217을 얻었다.
배양물들은 5% 글리세롤을 포함하는 1% 박토-펩톤에서 현탁된 냉각 배양물로 유지되었고, -70℃에서 복제되어 저장을 위하여 드라이-아이스 에탄올로 빨리 냉각되었으며, 또한 일반적인 사용을 위해 -20℃에서 저장하기 위하여 50% 글리세롤을 포함하는 1% 박토-펩톤으로 현탁되었다.
S.typhimurium 균주들의 일반적인 배양을 위한 복합배지는 상기 기술된 바와 같은 L 배양액이었다. 디프코 한천은 염기 한천의 1.5%에서 그리고 소프트 한천의 0.65%에서 레녹스 배양액에 첨가되었다. L 한천은 박테리아의 일반적인 산출을 위해 사용되었다. 발효는 최종 농도가 1%인 락토오즈를 갖는 맥코이 베이스 한천(디프코, Detroit, Mich)을 보충하므로써 측정되었다.
비교의 rpoS 돌연변이체 배양물을 만드는데 있어서, 배지에 불활성 rpoS 대립유전자를 포함하는 앰피실린-저항성 S.typhimurium 균주들을 선택하기 위하여 앰피실린(50㎍/ml)이 보충되었다. 젤라틴(BSG)(컬티스, 1965 supra)이 있는 완충 식염수가 희석에 일반적으로 사용되었다.
SF1005에 프로포게이트된 박테리오파지 P22HTint가 각각 χ8214, χ8215 및 χ8217을 만드는 MGN-431, χ3679 및 MGN-232로 rpoS 돌연변이체 대립유전자를 형질도입하기 위하여 사용되었다. 도우너 균주를 밤새도록 배양한 배양물은 미리 예열된 L 배양액에서 1:20으로 희석되었고, 37℃에서 진동하여 60분동안 성장하였고, 그 후에 0.01배의 P22HTint로 감염되었다. 감염 혼합물을 약 15시간동안 밤새도록 진동시켰고, 클로로포름이 첨가되고 37℃에서 추가로 10분동안 진동시켰으며, 현탁액은 원심분리되어(Sorvall RC5C, SS-34 rotor, 7,000rpm, 10분) 박테리아의 부스러기를 제거하였다. 파지(ca. 1010/ml)를 포함하는 상청액은 4℃ 이상의 클로로포름에 저장되었다. 50㎍/ml의 농도까지의 앰피실린은 불활성 rpoS 대립유전자를 포함하는 형질도입주를 선택하기 위하여 사용되었다.
S.typhimurium 균주들의 RpoS 표현형은 실시예 4에 기술된 카탈라제와 글리코겐 합성 활성을 테스트하므로써 결정되었다. 결과들은 표 8에 나타내었다.
표 8
균주 관련 표현형 카탈라제 활성 글리코겐 합성 활성
χ3339 SL1344 pStSL100+hisG rpsL, colicin+ + +
χ4973 SL1344 pStSR100+hisG rpsL, rpoS::PR10,colicin+ - _
χ3761 UK-1 야생 프로토트로프 + +
rpoS- UK-1 UK-1 rpoS::RR10 _ _
MGN-232 UK-1 Δcya-27 + +
χ8217UK-1 rpoS::RR10 Δcya-27 _ _
MGN-431 UK-1 Δcya-27 Δcrp-27 + _
χ8214UK-1 rpoS::RR10 Δcya-27 Δcrp-27 _ _
S.typhimurium 균주들상에서의 카탈라제 및 글리코겐 활성 테스트
야생 rpoS 유전자를 갖고 있다고 알려진 Salmonella는 카탈라제 활성을 나타내었고, 반면에 rpoS 유전자에 돌연변이를 갖는 균주들은 카탈라제 활성을 나타내지 않았다. 글리코겐 활성 테스트의 결과들은 rpoS 유전자를 갖는 MGN-431가 카탈라제에는 양성이지만. 글리코겐 테스트에서는 음성의 결과를 나타내는 것을 제외하고는 카탈라제 테스트와 일치한다. 이는 의심할 여지 없이 글리코겐 합성 또한 crp 유전자 기능에 따라 달라지기 때문이라는 사실 때문이다.
암컷 BALB/c 마이스(6∼10주)(챨스 리버 실험실, 윌밍톤, 매스)는 감염성 및/또는 면역 실험에 사용되었다. 동물들을 실험에 사용하기 전에 격리실에 일주일동안 가두어 두었다. 실험용 마이스를 철사바닥의 날겐 필터-보넷-커버의 우리(Nalgen filter-bonnet-covered cage)에 두었다. 먹이와 물은 경구 면역을 하기 전 4-6시간동안 금지되었다.
S.typhimurium 균주들의 동물 감염성은 다음의 경구(p.o) 접종으로 결정되었다. 마이스의 접종을 위한 박테리아는 L 배양액에서 37℃로 밤새도록 전치배양하여 성장시켰다. 이러한 배양물들은 미리 예열된 배양액으로 1:200으로 희석되었고, 0.8의 OD600까지 약 4시간 동안 37℃에서 통기배양되었다. 세포들은 Sorvall RC5C에 원심분리기에서 4℃, 10분동안 7,000rpm으로 GSA 로우터에서 원심분리됨으로써 50배 농축되었으며 이어서 BSG에서 현탁되었다. 적당한 희석액들이 적정 결정을 위해서 L 한천에 방치되었다. S.typhimurium으로 p.o 접종을 하는 동안 내내, 마이스는 접종하기 전에 4-6시간 동안 먹이와 물을 주지 않았다. 그 후에 피페트맨 P20을 사용하여 BSG에서 현탁된 20㎕의 S.typhimurium을 공급하였다. 먹이와 물은 경구 접종후에 30분에 회수되었다.
rpoS+ 감쇠된 S.typhimurium 균주들에 의해서 GALT 및 특히, 페이어의 패치의 콜로니화를 평가하기 위하여, 세마리의 마이스로 이루어진 세개의 그룹들은 rpoS+ 감쇠된 S.typhimurium 균주와 이것에 상응하는 rpoS::RR10 돌연변이체 유도체들이 같은 수(약 109CFU)로 경구로 주입되었고, 이는 상기 기술된 조건들에 따라 성장되었다. 페이어의 패치에 있는 생존가능한 S.typhimurium의 정량은 다음과 같이 실행되었다. 마이스는 p.o 감염후 3일, 5일 및 7일후에 안락사되었으며, 그들의 페이어의 패치들이 수집되었다. 각각의 마우스로부터의 페이어의 패치들은 무균으로 제거되었고, BSG가 있는 폴리프로필렌 튜브에 방치되었고, 브린크맨 조직 호모지나이저(Brinkmann Instruments)로 균질화되었으며 얼음 위에 방치되었다. 균질액의 적당한 희석액은 1% 락토오즈가 보충되었지만 앰피실린은 없는 맥콘케이 한천상에 방치되었다. 균주들의 분화는 불활성 rpoS:RR10 대립유전자 사이에 있는 앰피실린-저항 마커의 존재에 의해서 용이하게 되었다. 플레이트들을 37℃에서 12-15시간동안 배양하였다. 각각의 페이어의 패치에서의 적정은 매시간 동안 결정되었고, 기하학적 평균값은 샘플링의 매시간에서 그룹당 3마리 마이스로 계산되었다.
하기 표 9는 경구 감염 후에 쥐의 페이어의 패취에 있는 Δcya/Δcrp, ΔaroA 또는 Δcya 돌연변이들을 포함하는 rpoS+ 및 rpoS::RR10 돌연변이체 S.typhimurium 균주들의 분포를 나타낸다.
표 9
경구 공동감염a후의 쥐의 페이어의 패취에 있는 그들에 상응하는 동질유전자형 rpoS::RR10 돌연변이체 Δcya/Δcrp, ΔaroA 또는 Δcya 유도체들에 대한 감쇠된 rpoS+S.typhimurium Δcya/Δcrp, ΔaroA 또는 Δcya 균주들의 기하학적 평균비
a 거의 같은 수의 MGN-431(rpoS+Δcya/Δcrp) 및 χ8214(rpoS::RR10 Δcya/Δcrp)(각각 5.2×108및 5.4×108); χ3679(rpoS+ΔaroA) 및 χ8215(rpoS::RR10 ΔaroA)(각각 6.0×108및 6.0×108); 또는 MGN-232s(rpoS+ Δcya) 및 χ8217(rpoS::RR10 Δcya)(각각 6.8×108및 6.4×108)가 8주된 BALB/c 마이스에 p.o 투여되었다. 기하학적 평균비 ±S.E.M가 주어졌다(n=3).
Δcya/Δcrp 돌연변이들, MGN-431을 포함하는 rpoS+S.typhimurium은 그것의 rpoS::RR10 유도체 균주에 비하여 경구 감염된 후 5일에 페이어의 페취가 콜로니화되는 능력이 상당히 증가한 것을 나타내었다. 경구 감염후 3일과 5일에 rpoS+ ΔaroA S.typhimurium 균주 χ3679와 그것의 rpoS::RR10 유도체, χ8215는 페이어의 패취를 콜로니화하는 능력에서 큰 차이를 나타내지 않았다. 그러나 감염된 후 7일에, rpoS::RR10 ΔaroA 돌연변이체는 그것의 ΔaroA 부계 균주, χ3679에 비하여 페이어의 패취를 콜로니화하는 능력이 더 낮다는 것을 나타내었다.
코이놀트 등은 또한 rpoS ΔaroA 유도체들은 rpoS+부계 균주들에 비교하여 쥐의 페이어의 패취를 콜로니화하는데 결점이 있고, 콜로니화의 감소는 여기에 보고된 7일에 콜로니니화된 것의 감소에 비하여 경구 감염후 2일, 5일보다 좀더 일찍 관찰되었다(코이놀트 등., Mol.Microbiol. 22:149-160, 1996).
유사한 연구가 Δcya 돌연변이체를 가지고 행해졌다. 표 9에 나타난 바와 같이, 약 1:1 비로 마이스에 구강으로 투여될때, rpoS::RR10 Δcya 돌연변이체 균주 χ8217은 그것의 부계 균주, MGN-232와 비교할때 3일과 7일(ca. 각각 6배와 7배)에 페이어의 패취가 콜로니화되는 능력이 감소되었음을 나타내었다.
실시예 6
본 실시예는 대응하는 동계의 rpoS-변이 S. typhimurium 균주에 비해, 실시예 5의 aroA 또는 cya 변이를 가진 rpoS+S. typhimurium 균주의 높은 면역성과 낮은 독성의 뛰어난 균형을 보여준다.
BALB/C 마우스에 다음과 같은 경구 접종을 함으로써 대응되는 rpoS 변이주에 비해 rpoS+유전자형을 가지는 약독화된 S. typhimurium 균주에 의해 유도되는 보호면역을 측정하였다.
그룹당 5마리의 마우스에 106, 107, 108및 106CFU의 약독화된 S. typhimurium rpoS+균주 또는 그와 동계의 rpoS 변이 유도체를 각각 경구 접종하였다. 면역화 4주후에, 마우스들에 109CFU의 SR-11 또는 UK-1 야생형 독성 친주를 경구 항원투여하였다. 보호의 정도는 경구 항원투여 30일 후의 생존 마우스의 수로 측정하였으며, 그 데이터를 하기 표10 및 11에 나타내었다.
표 10
(A)χ3679(rpoS+ΔaroA ) 또는 (B)그의 동계 rpoS 변이유도체 χ8215로 면역화 후의 야생형 독성 SR-11 균주(χ3181)로 항원투여하는데 대한 마우스의 보호
A. χ3679
면역화 용량a SR-11a의 항원투여량 생존/전체 (%)
1.6×106 1×109 2/5(40%)
1.6×107 1×109 2/5(40%)
1.6×108 1×109 4/5(80%)
1.6×109 1×109 4/5(80%)
B. χ8215
면역화 용량a SR-11a의 항원투여량 생존/전체 (%)
1.4×106 1×109 0/5(0%)
1.4×107 1×109 1/5(20%)
1.4×108 1×109 3/5(60%)
1.4×109 1×109 3/5(60%)
a는 ㎖당 콜로니 형성단위를 나타낸다.
표 11
(A)MGN-232 (rpoS+Δcya ) 또는 (B)그의 동계 rpoS 변이유도체 χ8217로 면역화 후의 야생형 독성 UK-1 균주(χ3761)로 항원투여하는데 대한 마우스의 보호
A. MGN-232
면역화 용량a SR-11a의 항원투여량 생존/전체 (%)
2.0×106 8×109 4/5(80%)
2.0×107 8×109 5/5(100%)
2.0×108 8×109 5/5(100%)
2.0×109 8×109 5/5(100%)
B. χ8217
면역화 용량a SR-11a의 항원투여량 생존/전체 (%)
1.2×106 8×109 2/5(40%)
1.2×107 8×109 1/5(20%)
1.2×108 8×109 2/5(40%)
1.2×109 8×109 2/5(40%)
a는 ㎖당 콜로니 형성 단위를 나타낸다.
표 10에 나타난 데이터는 백신접종에 사용한 투여량과 무관하게, rpoS+ΔaroA 변이주, χ3679로 경구 면역화한 마우스는 동계의 rpoS 변이주, χ8215로 면역화한 마우스보다 경구 야생형 항원투여에 대해 더 잘 보호되었음을 보여준다.
마찬가지로, 표 11에 나타난 데이터는, Δcya 변이로 약독화시킨 rpoS+세균으로 면역화하는 것이 동계의 rpoS 변이주로 면역화하는 것보다 더 우수한 보호를 제공함을 보여준다.
따라서, 본 연구는 기능적 rpoS 유전자를 가진 S. typhimurium 균주가 동계의 rpoS 변이주보다 야생형 독성 살모넬라 균주로 경구 항원투여하였을 때, 더 우수한 보호 면역을 제공함을 보여준다. 따라서, S. typhimurium 내의 기능적 rpoS 대립유전자의 존재는 균주의 면역성을 향상시켜, 높은 수준의 보호 면역의 자극을 촉진한다.
실시예 7
본 실시예는 다음의 비강내 투여 S. typhimurium의 약독화된 RpoS+균주의 뛰어난 면역원성을, 대응하는 RpoS-균주를 동일한 경로에 의해 투여하였을 때의 면역원성과 대비하여 보여준다.
마우스의 비강내 면역화를 위한 박테리아는 밤새 L 배양액(broth)에서 37℃로 스탠딩 배양으로 배양하였다. 다음날 아침, 이들 배양물들은 L 배양액로 1:200으로 희석하고, 37℃에서 OD600이 0.8이 될 때까지 폭기하였다. 세포들은 소르발(Sorvall) GSA 로터(rotor)를 사용하여 7,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 농축하고, BSG에 현탁하였다. 역가를 산정을 위해 적당한 희석액을 L 아가상에서 배양하였다.
8주된 암컷 BALB/c 마우스에게 비강내 면역화하기 약 5시간 전부터 먹이와 물을 주지 않았다. 각 약독화된 박테리아 백신 균주에 대해, 마이크로피펫을 사용하여, 각 마우스는 전체 부피 0.01㎖ (10㎕)로 되도록 109또는 108CFU의 BSG를 투여받도록 하여 비강내 면역화를 수행하였다. 면역화는 각 비강에 0.005㎖ (50㎕)의 현탁액을 주입하여 행하였으며, 대조군에는 박테리아가 없는 BSG를 주입하였다. 먹이와 물은 비강내 면역화 후 30분내에 복원시켰다.
비강내 면역화하고 30일이 경과한 후, 비강내 면역화한 마우스와 비면역화한 대조군에 108또는 109CFU의 야생형 독성 S.typhimurium 균주, χ3339를 구강 항원투여하였다. 항원투여 χ3339 균주는 L 배양액, 37℃에서 스탠딩 배양으로 하룻밤 배양하여, 다음날 아침, 배양균을 L 배양액에 1:200으로 희석하고, 37℃에서 OD600이 0.8에 도달할 때까지 폭기하였다. 세포들을 소르발 GSA 로터를 사용하여 7,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 농축하고, BSG에 현탁하였다. 비강내 면역화에 사용하는 마우스에게는 경구 항원투여 약 5시간 전부터 먹이와 물을 주지 않았다. 치사율을 조사하기 위해 마우스를 30일에 걸쳐 관찰하였다. 본 실험에서 얻은 데이터를 표 12에 나타내었다.
표 12
암컷 BALB/c 마우스에 야생형 χ3339a의 경구 항원투여에 대한 보호에 있어서, S. typhimurium SL 1344 Δcya Δcrp RpoS+와 Δcya Δcrp RpoS-변이주를 사용한 비강내 면역화의 효과
균주 유전자형 면역화 용량(CFU) 항원투여량 (CFU) 생존자/전체
χ8296 Δcrp-28 1.2×109 1.1×109 1/4
Δcrp-27 1.1×108 3/4
ΔasdA16 1.2×108 1.1×109 0/4
RpoS+ 1.1×108 1/4
-----------
5/16
χ8309 Δcrp-28 1.5×109 1.1×109 0/4
Δcrp-27 1.1×108 1/4
ΔasdA16 1.5×108 1.1×109 1/4
rpoS RpoS- 1.1×108 0/4
----------
2/16
None BSG 1.1×108 0/4
a. 균주는 루리아 배양액(Luria broth)에서 DAP로 배양하였다. 박테리아 접종물 준비와 동물감염은 본문에 기술된 대로 행하였다. S. typhimurium χ3339의 경구 항원투여는 비강내 면역화하고 30일 경과후에 이루어졌다. 항원투여 후 30일간 치사율을 관찰하였다.
표에서 나타난 바와 같이, RpoS+미생물(χ8296)과 RpoS-미생물(χ8308) 양자의 비강내 투여는 모두 야생형 균주(χ3339)로 항원투여에 대해 어느 정도의 보호효과가 있었다. 그러나, RpoS+균주(5/16 생존)가 대응되는 RpoS-균주(2/16 생존)보다 야생형 균주 항원투여에 대해 더 큰 보호효과를 가졌다는 점에서 더 효과적이었다.
본 실시예의 실험에서는 RpoS+(Δ8296)나 RpoS-(Δ8309) 모두, S. typhimurium의 Δcya Δcrp Δasd 균주를 사용하였다. 이들 미생물은 염색체의 Δasd 변이를 기능적으로 대체하는 Asd+플라스미드벡터를 포함하고 있지 않아, 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid)의 합성불능으로 인해, 비강내 면역화 후 24시간내에 죽음에 이르게 될 것이다. 이것은 결과적으로, 통상 백신 세균내에 편입되는 Asd-함유 플라스미드를 부여받았다면 미생물에 의해 유도되었을 면역 반응을 감소시킨 것으로 기대된다. 그럼에도 불구하고, 상기한 바와 같이, 16마리 중 5마리의 마우스가 RpoS+균주, χ8286에 의해 면역화되어 항원투여에서 생존한 반면, RpoS-균주,χ8309를 사용하여 비강내적으로 면역화한 16마리 중 단 2마리의 마우스만이 야생형 S. typhimurium 균주, χ3339로 구강 항원투여한 후에 생존하였다. 따라서, 투여하고 최초 24시간이 경과한 후에도, RpoS+균주는 보호면역반응을 유도하는 뛰어난 능력을 나타내었다.
이미 문헌에서 보고된 바와 같이, 재조합 약독화 살모넬라 백신 균주는 다양한 경로로 투여되어 점막과 조직적 면역을 자극할 수 있다. 예를 들면, 스리노바산(Srinovasan) 등 (Vaccines 95, R.N. Chanock et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, p273~280, 1995)과 Hopkins 등 (Infect Immun. 63:3279~3286, 1995)은 마우스가 구강적, 위장내적으로 뿐만 아니라, 비강내적, 질내적 및 직장(直腸)으로도 면역화가 가능하다고 보고하였다. Nardelli-Haefliger 등 (Infect Immun 64:5219~5224, 1996)은 자원자들의 인체에 재조합 약독화 살모넬라 티피 백신 균주를 직장으로 투여하여 면역화할 수 있음을 증명하였다. 나아가, 최근 Galan 등 (Vaccine 15:700~708, 1998)은 RpoS-표현형의 일종인 재조합 약독화 S. typhi Ty2 균주를 마우스에 비강내적으로 투입하였을 때, 면역반응을 일으킬 수 있다는 것을 입증하였다. 소장(GALT의 일부인 소위 Peyer's patches) 뿐만 아니라 직장, CALT, BALT, 때로는 점막면역반응을 일으키는 다른 유도 부위도 상피 림프조직을 M세포들이 덮고 있다는 것은 잘 알려져 있다(Mucosal Immunology, 2nd Edition, Ogra et al., Eds. Acaedmic Press, San Diego, 1999).
상기한 예들은 RpoS+살모넬라가 GALT의 Peyer's patch의 상피 돔 M세포에 침입하여 이식하고, 뒤의 경구경로에 의한 투여에 면역반응을 일으킴을 입증하는 것이다. 이 예는 면역반응이 비강내 경로를 통한 투여를 통해서도 유도됨을 보여준다. 이러한 결과들을 근거로, RopS+살모넬라가 rpoS+유전자의 발현에 대해 결함이 있는 살모넬라 균주(즉, 표현형으로 RpoS-)에 비해, GALT의 M세포에 뿐만 아니라 상부 호흡관의 림프조직을 덮고 있는 M세포에도 더 잘 부착하고 침입한다고 추론하는 것이 논리적이다. 그러므로, RpoS+표현형을 나타내는 재조합 약독화 살모넬라 백신으로 인체에 면역화하는 것이 RpoS-표현형을 나타내는 것에 의한 것보다 더 효과적일 것이다. 따라서, RpoS+ 약독화된 살모넬라는 RpoS-약독화 살모넬라보다 비강내적, 경구적, 질내적, 직장적 면역화에 있어 뛰어나다고 할 수 있을 것이다. 점막 림프조직에 이식하는 외래 항원을 발현하는 약독화된 살모넬라의 투여는 점막 면역을 발현하는데 있어 가장 중요하기 때문에, 그것은 S. typhi 뿐만 아니라, 역시 인체에 한정된 S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C 및 Typhimurium, Enteritidis, Dublin 및 Choleraesuis와 같은 S. enterica의 다른 혈청형의 약독화된 유도체를 포함한 다양한 혈청형의 RpoS+약독화 살모넬라의 어느 하나를 사용함으로써 수행할 수 있을 것이다.
실시예 8
본 실시예는 RpoS+재조합 약독화 살모넬라 백신이 대응되는 RpoS-살모넬라에 의한 것보다 발현된 외래 항원에 대해 점막 IgA와 혈청 IgG 항체를 유도하는 능력이 우수함을 보여준다.
이들 연구에서는, 사용된 S. typhimurium 균주는 Δcya, Δcrp 및 Δasd 변이로 약독화된 것이며, RpoS+표현형(χ8296; 표1) 또는 RpoS-표현형(χ8309; 표1) 중의 하나이다. 이들 균주 모두, pYA3167로 부터 문헌(Schodel et al., Infect. Immun. 62:1669~1676, 1994)에 기재된 방법에 따라 pre-S1, S2 융합을 가지는 hepatitis B 바이러스 코어(HBVc) 입자를 생산하도록 유전적으로 조작되었다(Nardelli-haefliger et al., supra, 1996). HBVc preS1, S2 융합을 지정하는 플라스미드는 χ8296과 χ8309내로 일렉트로포레이트 되었으며, 얻은 균주는 preS1, S2 항원 결정기를 가진 HBVc 입자를 생산하는 것으로 평가되었다. 도8A는 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 착색한 SDS 겔을 나타내며, 도8B는 preS2 항원 결정기에 유도된 하이브리도마-5520에서 산출된 단클론 항체 2A42를 사용하여 웨스턴 블롯법(Western blot)에 의해 겔을 분석한 결과를 나타낸다. 도면에서 보듯이, 이들은 모두 웨스턴 블롯 분석에 의해서 뿐만 아니라, 쿠마시 블루 겔에서도 쉽게 검출되는 융합단백질을 생성하였다.
두 균주의 상대적인 면역원성을 평가하기 위하여, (8주된) 암컷 BALB/c 마우스 그룹을 χ8296 및 χ8309의 pYA3167-형질전환 백신 균주 유도체 109cfu로 경구 면역화하였다. Schodel 등이 기술한 면역화 스케줄(1994. supra)에 따라서, 마우스들은 이틀 간격을 두고 2 회분의 백신으로 경구 면역화하였다. 균주들은 L 배양액에서 37℃의 온도로 밤새 배양시켰다. 아침에, L broth에 1:200로 희석한 것을 OD600이 0.8에 달할 때까지 적당히 폭기하여 성장시켰다. 박테리아는 원심분리로 침전시켜, 0.02㎖(20㎕)의 양을 경구 투여할 수 있는 백신 투여량이 되도록 적당한 밀도로 BSG에 혼탁시켰다. 경구 면역화하기 약 5시간 전부터 먹이와 물을 주지 않고, 면역화 30분후에 복원시켜 주었다. 최초 면역화로부터 4주와 6주후에 혈청 샘플과 질 세척액을 채취하였다(방법적으로는 Zhang et al., Biol. Reprod. 56:33~41, 1997을 볼 것). 혈청 IgG 항체와 질 세척액 IgA 항체를 전장의 pre-S 단백질(히스티딘 융합)에 대해 ELISA 항체 측정을 하여 검출하였다.
ELISA의 실험 기록은 다음과 같다. 0.2M 중탄산염/탄산염 완충액(pH 9.6)내에서 96정의 Immulon-1 플레이트(Dynatech, Dhantilly, VA)를 4℃에서 밤새 10㎍ 재조합 HBV pre-S 단백질 (awd)/㎖로 덮었다. 실온에서 1시간 동안, 비특이적 결합부위를 1% 농도의 BSA의 인산염 완충식염수(PBS)+0.1% Tween20(pH 7.4)(블로킹 완충액) 용액으로 봉쇄하였다. 혈청 샘플과 질 세척액은 블로킹 완충액에 각각 1:100과 1:10으로 희석하였다. 2조씩 100㎕의 희석한 샘플들을 프레이트에 첨가하여, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 다음에 플레이트를 PBS+0.1% 트윈(Tween)20으로 3회 세척하였다. 100㎕의 바이오틴-라벨된 고우트 항-마우스(biotin-labelled goat anti-mouse) IgA 또는 IgG를 각각 넣고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 알칼리성 포스파타제-라벨된 엑스트라비딘(phosphatase-labelled ExtrAvidin, Sigma사제)을 플레이트에 가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 0.1M 디에탄올아민 완충액(pH 9.8)중에 p-니트로-페닐포스페이트(p-nitro-phenylphosphate)(1㎎/㎖)를 포함하는 기질용액(0.1㎖)을 가하고, 반응 결과물의 광학밀도를 자동 ELISA 판독기(BioTech, Burlington, VT)로 405㎚에서 읽었다. 모든 시약은 시그마(Sigma, St. Louis, Mo)로 부터 구매한 것을 사용하였다.
항체가 산정 결과를 도9에 나타내었다. 도면에서 보는 바와 같이, 경구 면역화 4주와 6주의후에 혈청내의 RpoS+재조합 약독화 백신 균주,χ8296은 대응되는 동일한 조건에서의 질 분비액내의 RpoS-세균, χ8309에 비해, 재조합 HBVc preS1, S2에 대해 상당히 높은 항체가를 유도하였다. 따라서, RpoS+표현형의 재조합 약독화 살모넬라 백신균주는 실시예 7에서 보았듯이 살모넬라에 대한 보호면역을 유도하는데 있어서 뛰어날 뿐만 아니라, 합성된 외부 항원에 대한 면역반응을 유도하는데 있어서도 역시 우수함이 명백하다.
실시예 9
본 실시예는 RpoS+표현형을 포함하는 백신 균주를 스크린하는 방법을 기술한다.
균주의 RpoS+표현형의 평가로, RpoS+균주를 확인하고 선별할 수 있다. 이 균주는 높은 면역원성을 나타낼 것으로 기대된다. RpoS+표현형 선별시스템에서 시험할 균주는 여러 경로로 얻을 수 있다. 예를 들면, 수탁소에서 얻은 균주로 다음에 기술한 방법으로 시험할 수 있다.
카탈라제 활성과 글리코겐 생합성 시험은 이전의 실시예 4에서 기술한 방법대로 행하였다.
전형적인 S. typhi 균주에서의 카탈라제 또는 글리코겐 생합성 활성의 시험결과를 하기 표13에 나타내었다. χ8205와 χ8208 균주는 카탈라제 활성을 나타내지 않았으며, 이러한 결과는 이들 세균이 rpoS 변이체라는 종전의 보고서들(Robbe-Saule et al., FEMS Microbiol. Lett. 126:171~176, 1995; Coynault et al., Mol Microbiol. 22:149~160, 1996)과 일치한다.
카탈라제 테스트의 결과는 χ8204와 χ8207 균주도 또한 rpoS 변이체일 수 있다는 것을 암시하였으나, 이들 두 균주에 대한 글리코겐 테스트는 양성으로, 이는 이들 두 균주가 완전한 rpoS 유전자를 가지고 있음을 암시한다. 따라서, 이들 두 균주에 있어서의 rpoS 대립유전자 상태의 최종적인 결정은 실시예 4에 기술한 다른 시험방법을 사용하여야 했다. 카탈라제와 글리코겐 테스트에서 결과를 얻을 수 있었던 나머지 균주는 각 테스트에 대응하는 결과를 나타내었다.
표 13
ATCC S. typhi 균주에 대한 카탈라제 테스트
균주 상대적유전자형 카탈라제 활성 글리코겐 합성활성a 출처/참조
χ3743 ISP1804Type 46 ± + 백신개발센터, MD, D. Hone로 부터 취득;1983년 소아환자로부터 분리.
χ3745 ISP1822Type E1 + + 백신개발센터, MD, D. Hone로 부터 취득;1983년 소아환자로부터 분리.
χ3746 ISP282SType E1 + + 백신개발센터, MD, D. Hone로 부터 취득;1983년 소아환자로부터 분리.
χ8203 cys, trp + + ATTC 999V
χ8204 cys, trp - + ATCC 33458
χ8205 Ty21a, galE, rpoS, cys, trp - 성장무 ATCC 33459
χ8206 cys, trp, aroA, serC, purA + + ATCC 39926
χ8207 cys, trp - + ATCC 10749
χ8208 Ty2 cys, rpoS - - ATCC 19430
χ8209 cys, trp + + ATCC 9993
MGN-1256 Ty2 rpoS cys ΔphoPQ23 ΔasdA16 - - Megan Health, Inc.
MGN-1191 ISP1820 cys trp ΔphoPQ23 ΔasdA16 + + Megan Health, Inc
a: H2O2투입하자 마자 활발하게 거품을 일으키는 것은 +, 중간정도의 거품
을 발생시키는 것은 ±, 거품이 발생하지 않거나 소량의 거품을 발생시킬 때
에는 -로 표시.
실시예 10
본 실시예는 대립유전자 교체를 이용해 야생형 rpoS 대립유전자를 χ3769, MGN-1018과 같은 RpoS-S. typhi 균주에 도입하는데 사용할 수 있는 방법을 나타낸다.
야생형 rpoS 유전자는 R6K-베이스 플라스미드 pMEG-149 또는 그 유도체 pMEG-375의 자기불활화하는 성질을 이용한 대립유전자 교체를 통해 χ3769, MGN-1018 또는 χ8280 염색체에 도입할 수 있다. 플라스미드 pMEG-149와 pMEG-375는 λpir-의존성 R6K 레플리콘을 운반하는 기동성있는 자기불활화 벡터이며, 따라서, trans내에 pir 유전자를 가지고 있어 복제를 가능하게 하는 숙주를 필요로 한다. 또, pMEG-149는 Apr에 대한 선택성 마커(marker)와 역선택성 마커 레바노수크라제(levanosucrase)를 코딩하며, 반면에 pMEG-375는 클로람페니콜(Cmr)내성을 지정하는 cat 유전자를 포함하기도 한다. pMEG-149와 pMEG-375가 pir 유전자를 가지지 않은 균주를 복제하지 못하기 때문에, Apr, AprCmr트란스컨쥬건트의 선택에는, 각각, 통상 삽입된 단편에서의 상동성을 통하여 일어나는 결과인 염색체내로의 플라스미드의 편입이 요구된다..
pSK::rpos 플라스미드는 pBluescript/SK의 EcoRV 위치에 클론화한 완전한 1.7 kb S. typhimurium 14028 rops 유전자를 포함한다. pSK::rpoS로 부터 유래한 야생형 rpoS 대립유전자를 포함하는 EcoRI-HindⅢ 단편을 T4 DNA 합성효소로 처리하고, 자기불활성화 벡터 pMEG-149의 SmaⅠ위치에 클론하였다. 만들어지는 재조합 벡터는 pYA3433(도11)으로 명명된 야생형 rpoS 대립유전자를 가지며, λpir+Asd-전달 숙주 균주, MGN-617에 도입될 것이다. 이 균주는 IncP mob 영역을 포함하는 어떠한 플라스미드라도 어떤 Asd+수용체로 접합 전이(conjugal transfer)할 수 있도록 하며, 그 후 디아미노피멜릭산(DAP)이 결핍되어 있는 환경에서 도너(donor)를 제거한다.
때로는, 2 약품-내성 유전자의 경쟁 선택(duel selection)으로 선택 환경에서의 암피실린을 급속하게 파괴하는 β-락타마제(lactamase)의 성능때문에 Apr을 단독으로 사용할 때 가끔 발생하는 배경 성장을 제거함으로써 염색체에 삽인된 자기불활성화 벡터를 가진 메로디플로이드(merodiploid) 균주의 선택을 향상시킬 수 있기 때문에, 암피실린 저항외에도 클로람페니콜 저항을 지정하는 pMEG-375를 사용하여 rpoS+유전자를 가진 자기불활성화 벡터도 만들었다. PmeⅠ와 SmaⅠ를 사용하여 분해하고 상기 두 효소로 분해한 pMEG-375내로의 클론을 통해, pMEG-375로부터 1.409 kb의 S. typhimurium UK-1 rpos+유전자를 재생하였다. 생성된 자기불활성화 벡터 플라스미드, pYA3467은 도10에 나타내었다.
야생형 rpoS 대립유전자를 가지는 pYA3467 플라스미드는 MGN-617을 통하여 ΔphoPQ Δasd S. typhi Ty2 균주, MGN-1018내로 일렉트로포레이션에 의해 도입하였다. 형질전환체는 DAP(100㎍/㎖), 암피실린(50㎍/㎖) 및 클로람페니콜(40㎍/㎖)를 보충한 L-agar 플레이트상에 도포하고, 37℃에서 밤새 배양하여 선택하였다. 야생형 rpoS 대립유전자를 단일 유전자교환을 통해 염색체에 도입하는 것을 포함하는 전체 플라스미드의 편입으로 표현되는 형질전환과정을 통해 암피실린-과 클로람페니콜- 내성체 분리물을 얻었다. 이 분리물은 두 종류의 rpoS 유전자의 복제물 즉, 야생형과 돌연변이된 rpoS 대립유전자를 포함한다. 다음에, 이 분리물은, 두번째 유전자교환에서의 자기불활성화 벡터의 염기서열의 손실을 선별하기 위하여 DAP(100㎍/㎖)를 보충하고, 5%의 슈크로스를 포함하는 Luria agar에서 스크린하였다. 슈크로스-내성체 분리물은 앰피실린과 클로람페니콜에 대한 감응성 및 기능적 rpoS 대립유전자의 존재에 대해 (카탈라제 또는 클리코겐 합성 시험을 이용하여) 스크린하였다.
rpoS+ 유도체를 확인한 후, LPS, Vi 항원, 전체 약독화된 변이체의 존재 및 MGN-1018 친주의 RpoS+유도체에 특징적인 다른 모든 특성을 입증하기 위하여 완전한 특성짓기를 행하였다. χ8434(표1)과 같은 하나의 유도체를 선택하였다. 야생형 S. typhi, Ty2 균주는 Rpos+표현형을 제공받으면 재조합 약독화 살모넬라 백신 벡터로서 뛰어난 속성을 가지며, 야생형 Ty2 균주, χ3769도 상기한 방법으로 pYA3467로부터 rpoS+ 유전자를 부여 받아 RpoS+유도체 χ8438(표1)을 생성시킨다. 이 균주는 실시예 2 및 3에 기술된 다양한 특정 결실 변이를 도입하여 약독화하고, 실시예 11 이하에서 기술하는 다양한 항원을 나타내는 능력을 부여받을 수 있다.
이 방법을 더욱 유효하게 하기 위하여, 도너 MGN-617로 pYA3467을 자발적 재조합 약독화 백신 균주 χ8280 [Ty2 ΔphoPQ23 rpoS ΔasdA16 (pYA3167)]으로 형질전환하였다. 이 균주는 pYA3167의 존재로 인하여 pre S1, S2 에피토프를 가진 간염(hepatitis) B 바이러스 코어를 합성한다. 상기한 방법을 사용하면, RpoS+유도체를 확인하고 완전히 특성지을 수 있다. 이것을 χ8435로 명명한다(표1).
이들 세가지 RpoS+균주의 능력은 S. typhi Ty2 및 그 자손에 존재하는 결손 rpoS 돌연변이 유전자를 대체하여 재조합 야생형 rpoS+유전자를 도입함으로써 구성되며, 글리코겐을 합성하고 표 14에서 보듯이 카탈라제 테스트에서 양성을 나타낸다.
표 14
재조합 살모넬라 균주와 그의 친주내의 RpoS 표현형의 테스트
Salmonella typhi Ty2 글리코겐축적/생합성 카탈라제 활성
χ3769 S. typhi Ty2 야생형 - -
χ8438 S. typhi Ty2 rpoS+ + +
MGN-1018; S. typhi Ty2 ΔphoPQ23 - -
χ8434 S. typhi Ty2 ΔphoPQ23 rpoS+ + +
χ8280(pYA3167) S. typhi Ty2 ΔphoPQ23 ΔasdA16 - -
χ8435(pYA3167) S. typhi Ty2 ΔphoPQ23 ΔasdA16 rpoS+ + +
이 방법은 재조합 야생형 rpoS 유전자를 ATCC 55117(χ3927; Δcya-12 Δcrp-11) 또는 ATCC 55118(χ4073; Δcya-12 Δ[crp-cdt]-10)과 같은 여러 Ty2 유래의 백신 균주에 도입하여 약독화와 면역원성간의 균형을 향상시키는데도 사용할 수 있다.
실시예 11
본 실시예는 다양한 감염성 질병에 대해 면역화하는 경구용 백신으로 사용되는 외래 항원을 발현하는 재조합 약독화 rpoS+S. typhi 균주의 구조를 설명한다.
rpoS+백신 균주는 실시예 2 및 3에서 기술한 특정 결손을 이용하는 ISP1820과 같은 기능적 rpoS 유전자를 포함하는 S. typhi 균주를 베이스로 하거나, 상기 실시예 8에서 기술한 바와 같은 재조합 rpoS 유전자를 가지는 Ty2와 같은 약독화된 rpoS 돌연변이 균주를 베이스로 하여 제조한다. 외래 항원을 발현하는 백신의 구조에 있어서, 좋은 접근법은 재조합 플라스미드상에서 클론된 유전자의 안정적인 유지와 높은 수준의 발현을 부여하는, 균형적인 치사 숙주-벡터 시스템을 사용하는 것이다. 이를 위해, 아스파테이트(aspartate) β-세미알데하이드(semialdehyde) 탈수소효소를 코딩하는 asd 유전자의 염색체 돌연변이를 RpoS+균주에 도입하여, 박테리아 세포벽의 단단한 층의 기본 구성요소이고 인체에서는 합성되지 않는 디아미노피멜릭산(DAP)의 필수적인 필요조건을 부여하였다. 그리고 나서, 염색체의 Δasd 변이는 필요한 외부 항원을 코드하는 재조합 유전자뿐만 아니라, 야생형 asd+유전자도 가지는 플라스미드 클로닝 벡터에 의해 보충된다. 플라스미드의 결손은 DAP결핍 사망과 세포 용균을 초래한다. 이러한 균형적인-치사 숙주-벡터 조합은 면역화된 동물 숙주내에서 수주간 안정하며, 살모넬라에 대해서 뿐만 아니라 클론된 유전자 산물에 대해서도 면역반응을 유도한다.
염색체 asd 유전자의 특정 결손의 구조는 상기 실시예 3에서 설명하였다. 이렇게 해서, ΔphoPQ23과 ΔasdA16 변이를 가지는 ISP1820의 유도체, MGN-1191과 Ty2 유도체, MGN-1256가 생성되었다. 필요한 외래 항원을 코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 asd-보완 플라스미드는 미국 특허 5,672,345호에 기재된 방법으로 만들 수 있다. 예를 들면, pYA3167로 명명된 간염 B 바이러스 항원 누클레오캡시드 pre-S1, pre-S2(HBcAg-pre-S) 입자를 발현하는 플라스미드를 문헌(Schodel, et al., 1996, in Novel strategies in design and production of vaccines. S. Cohen and A. Shafferman, eds., Plenum Press, New York) 에 보고된 대로 제조하였다. 따라서, S. typhi MGN-1191과 MGN-1256은 플라스미드 pYA3167를 이용하여 일렉트로포레이션을 통해 형질전환되었다. HBV pre-S2-특이적 단클론 항체를 사용한 immunoblot 분석을 통하여 MGN-1191 및 MGN-1256으로 부터 유래한 형질전환된 약독화 S. typhi 운반자 균주내의 하이브리드 코어 pre-S 유전자의 발현도를 측정하였다. ΔphoPQ Δasd 변이 S. typhi 균주내의 하이브리드 HBcAg-pre-S 항원의 발현은 다음과 같이 측정하였다. 밤새 배양한 전체 박테리아 세포 용해질의 단백질을 12% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS-12%), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 사용하여 분리하고, 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassi brilliant blue)로 착색하였다. 결과는 도 12에 나타내었다. 3개의 MGN-1191의 형질전환체와 3개의 MGN-1256의 형질전환체를 재조합 항원 부위에서 밴드를 나타내는 것에 대해 모두 연구하였다(도12의 화살표 참조). MGN-1191 형질전환체 #1(lane 3)을 χ8281로 명명하고, MGN-1256의 형질전환체 #1(lane 7)을 χ8280으로 명명하였다. 양 균주는 Vi 항혈청(Difco)에 양성 응집을 보이는 Vi 협막항원을 발현한다.
또, 재조합 항원의 발현은 이뮤노블롯팅(immunoblotting)에 의해 분석된다. 이뮤노블롯팅을 위해서는, 밤새 배양된 세포를 2X 샘플 완충액에 넣어, 10분간 끓여 세포를 용균하고, 단백질을 SDS-12% PAGE에 의해 분리하였다. 다음에 단백질을 니트로셀룰로오스에 이식하고; HBV pre-S2 특이적 단클론 항체와 함께 배양하고; 페록시다제-결합 고우트 항-마우스 (peroxidase-coupled goat anti-mouse immunoglobin G (IgG) (L쇄와 H쇄) 와 함께 발육시키고; 화학발광 물질(ECL; Amersham)과 함께 배양한 후 X-ray 필름(Kodak)에 명시화시켰다. 결과는 도13에 나타내었다. 쿠마씨 착색에서 보았듯이, χ8281(lane 3)을 포함한 MGN-1191의 3가지 형질전환체와 χ8280(lane 7)을 포함한 MGN-1256의 3가지 형질전환체는 모두 재조합 항원의 부위에서 밴드를 나타낸다(도 13의 화살표를 볼 것).
이뮤노스크리닝(immunoscreening)에는 다음 방법을 사용할 수 있다. 박테리아 콜로니를 니트로셀룰로오스 필터상으로 옮기고, 1% SDS에서 70℃, 30분간 용균시켰다. 니트로셀룰로오스상의 자유 결합부위는 10%의 말 혈청 Tris-HCl 완충 식염수로 차단하였다. 그 후, 이뮤노스크린(immunoscreen)은 이뮤노블롯(immunoblot)에서와 같이 처리하고, 제2차 고우트 항-마우스(secondary goat anti-mouse) IgG (L쇄와 H쇄)를 니트로블루 테트라졸리움-5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트 톨루이디니움(nitroblue tetrazolium-5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate toluidinium, Promega) 를 사용하여 명시화하였다.
외래 항원을 발현하는 S. typhi rpoS+균주는, 암피실린이나 테트라시클린과 같은 약품에 내성을 부여하는 유전자를 포함한 Asd+이외의 다른 선택성있는 마커를 가진 플라스미드 벡터를 사용하여서도 제조할 수 있다. 또, 상동 재조합이나 전위에 의해 박테리아 염색체에 벡터를 삽입하는 주지의 기술을 사용하여, 필요한 외래 항원을 코딩하는 재조합 벡터를 제조할 수도 있을 것이다.
실시예 12
본 실시예에는 유리한 방향으로 면역 반응을 억제, 변조 또는 증진시키기 위하여 외래 단백질을 발현하는 재조합 약독화 백신 균주를 제조하는 데에 사용될 수 있는 방법들이 예시되어 있다.
생 약독화 박테리아 백신이 T 헬퍼 림프구 기억 기능을 유도함으로써 장기간 지속되는 면역을 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 생쥐의 S.typhimuriu m 감염은 비록 점막 분비물에 SIgA의 생산을 수반하는 Th-2 반응과 살모넬라와 외래 발현 항원에 대항하는 혈청 항체가 또한 유도되기는 하지만 주로 Th-1 형태의 반응을 유도한다. IL-10은 Th-2 반응의 발생을 나타내는 수준으로 검출되어질 수 있다(Van Cott 등, J.Immuno. 156:1504-1514, 1996). 재조합 약독화 S.typhimurium 백신은 외래 항원에 대항하는 CD-8+세포와 관련되는 CTL 반응을 또한 유도할 수 있다는 것이 또한 알려져 있다(Sadoff 등, Science 240:336, 1988). 그러나, 많은 경우에, 만약 재조합 약독화 살모넬라 백신이 SIgA의 생산에 의해 점액 면역 및 그러한 SIgA의 생산을 위한 세포성 기억 반응을 증신시키기 위하여 주로 Th-2형의 반응을 유도한다면 그것은 바람직하다. 림포킨 IL-4와 IL-5가 생산될 때에는 Th-2 반응을 강화시킨다. 다른 한편으로, 항원이 재조합 약독화 살모넬라 백신에 의해 발현되는 기회성 또는 절대성 세포내 기생체에 대항하는 보호적 면역을 제공하는 데에 있어서 특히 중요할 수 있는 Th-1형의 반응을 유도하기 위하여 재조합 약독화 살모넬라의 능력을 최대화하는 것은 다른 예에 있어서 바람직하다. 면역 반응을 주로 Th-1 또는 Th-2형의 반응으로서 전환시키는 것은 재조합 약독화 살모넬라 균주를 통하여 림포킨을 발현시키는 것에 의해서 부분적으로 달성될 수 있다. 따라서, 우리는 Th-1형 반응을 증진시키고 또한 특정 형태의 암에 맞서 싸우는 데 보호작용을 하는 약독화 살모넬라 백신을 설계하는 데 있어서 중요한 CTL 반응을 강화시키는 IL-2를 발현시키는 살모넬라 균주를 제조하였다(Saltzman 등, Cancer BioTher. Radiol. Pharm. 11:145-153, 1996; Saltzman 등, J. Pediatric Surg. 32:301-306, 1997). 우세한 Th-2 반응을 유도하기 위한 살모넬라의 제조는 IL-5에 대하여 휘틀(Whittle) 등이 하였던 바와 같이 그 균주가 IL-4와 IL-5를 발현하도록 만듦으로써 달성된다(1997, J. Med. Microbiol. 46:1029-1038). IL-4는 재조합 aroA 약독화 살모넬라 백신 균주에 의해 발현되었던 적이 있으나 분비되지 않았으므로 효과적이지 않았다(Denich 등, Infect. Immun. 61:4818-4827, 1993). 약독화 살모넬라에 의한 림포킨의 그러한 분비되는 발현을 시키는 데에 있어서 한(Hahn) 등에 의해 기술된 방법(FEMS Immunol. Med. Microbiol. 20:111-119, 1998)은 이제 성공적으로 이용되고 있다. 또한 SIgA의 분비를 촉진하는 것으로 보고된 인자 P와 같은 펩티드를 공동 발현시킬 수 있다. 면역 반응을 조절하는 역할을 하는 많은 다양한 림포킨, 시토킨과 다른 펩티드나 단백질 분자들을 지정하는 cDNA에 대한 유전자가 얻어졌다. 이들 펩티드와 단백질이 특정 병원체로부터 또는 종양 세포주로부터 유래한 몇몇 항원이나 전염성 질병에 대하여 보호 또는 면역화된 인간의 조직적인 질병(systemic disease)에 대항하여 치료학적으로 교정하기 위한 면역 반응을 유도할 수도 있는 면역 반응을 목표로 하는 몇몇 다른 분자들을 발현하는 재조합 약독화 살모넬라 백신 균주에 의해 공동 발현될 수 있을 것으로 기대된다. 위와 같이 하여, IL-6는 재조합 약독화 살모넬라에 의하여 발현되었고 몇몇 경우에는 분비되었다(Dunstan 등, Infect Immun 64:2730-2736, 1996; Hahn 등, FEMS Immunol Med Microbiol 20:111-119, 1998). 쥐과의 마크로파아지 억제 인자(MIF), IL-2, IFN-또는 TNF-에 대한 유전자가 개별적으로 클론되었고 Leishimania major 감염에 대한 면역 반응을 변경시키기 위하여 재조합 약독화 살모넬라에 의해 발현되었다(Xu 등, J. Immunol. 160:1285-1289, 1998). 또한 TGF-는 IL-2와 INF-의 내재적 합성을 억제하나 IL-10의 합성은 증진시킴으로써 염증 반응을 감소시키기 위하여 재조합 약독화 살모넬라 백신 균주에서 발현되었다(Ianaro 등, Immunology 84:8-15, 1995). 앞의 실시예에서 제시된 자료에 근거하면, RpoS+표현형의 재조합 약독화 살모넬라 백신이 소망하는 방식대로 면역 반응을 억제, 증진 및/또는 조절하기 위하여 시토킨 및 다른 면역활성 분자들을 발현시키는 데 있어서 RpoS-표현형의 백신 균주보다 우수할 것이라는 것은 분명하다.
실시예 13
본 실시예에는 자가항원을 발현하고 불임 이익을 부여하기 위하여, 고면역원성과 저독성을 가진 약독화 RpoS+살모넬라 균주들의 용도가 예시되어 있다.
불임 상태를 유도하기 위하여 자가항원들을 발현시키기 위하여 재조합 약독화 살모넬라 균주를 사용하는 방법을 앞에서 기술하였다. 이러한 기술은 미국 특허 제5, 656, 488호에 개시되어 있다. 더욱이, 스리니바산(Srinivasan) 등(Biol. Reproduct. 53:462-471, 1995)은 불임 상태를 유도하기 위하여 생쥐에서 정자와 난자의 반응을 효과적으로 저해하기 위하여 그 정자 항원에 대한 항체를 유도하기 위하여 재조합 약독화 살모넬라로부터 정자 특이적 항원을 발현시키는 법을 기술한다. 그 특이적 항원은 쥐과의 cDNA 서열에 의해서 지정되어지고 재조합 살모넬라는 그 자가항원에 대항하는 면역 반응을 생쥐에서 유도할 수 있었다. 비슷하게, 장(Zhang) 등(1997, Biol. Reproduct 56:33-41)은 투명대(zona pellucida) 항원, ZP-3을 코드하는 쥐과의 cDNA 서열을 약독화 S.typhimurium 균주에서 발현시켰다. 이 자가항원을 발현하는 살모넬라로 면역화된 생쥐는 ZP-3에 대한 면역 반응을 보였다. ZP-3에 대한 항체는 난소에 있는 난자의 표면을 도포하였고 정자가 그러한 난자들을 수정할 수 있는 능력을 효과적으로 감소시켰다. 숙주에 대하여 이질적인 운반 항원에 대하여 자가항원을 융합하는 것은 이질적인 운반자 뿐만 아니라 자가항원도 인지하는 면역 반응의 유도를 가져올 수 있다. 생식력에 관한 경우에 있어서, 그러한 면역화 전략은 피임 백신의 개발을 가져올 수 있을 것이다.
실시예 14
본 실시예에는 알러젠을 발현하도록 조작되고 그 알러젠의 영향을 개선하기 위하여 면역 반응을 유도하는 약독화 RpoS+살모넬라 백신의 용도가 예시되어 있다.
꽃가루, 곰팡이 포자, 곤충의 부분, 동물 비듬 등에 대한 알러지는 그러한 알러젠을 함유하는 공기의 흡입 및/또는 음식물의 섭취 때문이다. 그 결과 발생하는 알러지는 히스타민의 방출을 위해 마스트 세포를 활성화시키는 알러젠에 결합하는 IgE 항체의 존재와 연관되어져 있다. 잘 알려진 바와 같이, 알러젠에 대한 민감성 제거는 그 알러젠을 함유하는 추출물의 반복적인 비경구적 면역화에 의해 달성될 수 있다. 비슷하게, 꽃가루를 포함하는 자연 꿀을 경구 섭취하는 것도 그러한 알러젠에 대한 내성 상태를 효과적으로 유도하기 위하여 사용되어질 수 있다는 것이 알려져 있다. 그러한 알러젠의 경구 섭취는 한편으로 알러젠이 IgE 항체 및 마스트 세포와 반응할 수 있는 능력을 저해하는 SIgA 반응을 유도할 수 있거나 혹은 충분한 양으로 투여된다면 IgE 항체 합성의 억제, 즉 내성을 유도하는 역할을 할 수 있다. 많은 알러젠에 있어서 특정 알러젠성 분자가 밝혀지고 그 알러젠을 지정하는 뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여 cDNA가 클론되어졌기 때문에, 그 알러젠을 발현하기 위한 이질적인 숙주 세포를 이제 유전적으로 조작할 수 있다(예로 다음 참조, Valenta 등, Allergy 53:552-561. 1998; Olsson 등, Clin. Exp. Allergy 28:984-991, 1998; Soldatova 등, J. Allergy Clin. Immunol. 101:691-698, 1998; Asturias 등, Clin. Exp. Allergy 27:1307-1313; Twardosz 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 239:197-204, 1997). 따라서, 본 발명의 약독화 RpoS+살모넬라는 내성 상태를 유도하기 위하여 또는 알러젠에 대한 SIgA의 생산을 활발하게 촉진시키기 위하여 알러젠, 가능하게는 변형되어 면역원성이 있으나 비알러지성인 형태로 발현하기 위하여 조작되어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 RpoS+약독화 살모넬라는 면역 반응을 유발하는 데에 있어서 효과적임 입증되었고 따라서, 변형되어진 알러젠을 발현하기 위한 그러한 RpoS+살모넬라의 사용은 흡입이나 섭취에 의한 인간의 알러젠에 대한 노출의 결과를 개선하는 데에 있어서 효과적일 것 같다.
실시예 15
본 실시예는 원하는 외래 항원을 발현하는 재조합 독성약화된 rpoS+ S.typhi 운반(carrier) 균주들을 포함하는 살아있는 경구백신의 안전, 면역성 및 효능의 테스트에 사용될 수 있는 방법을 예시한다.
테스트된 균주들은 ISP1820와 ISP1822의 독성약화된 유도체들이거나 또는 재조합 rpoS 유전자를 포함하는 Ty2 균주 χ8438(표 1)의 독성약화된 유도체들이었다.
연구된 개체들 ; 연구된 개체들은 18∼40세의 남성 또는 여성으로 건강한 성인 지원자들이었다. 대상 지원자들은 연구를 하기전에 선별하였다. 포함기준은 다음 내용을 포함한다:
1. 일반적인 양호한 건강;
2. 의학적 병력의 평가;
3. 정상적이고 규칙적인 배변습관;
4. 일반 물리검사;
5. 다음 내용을 포함하는 일반 실험 조사결과:
정상 뇨분석(urinalysis),
정상적이고 완전한 혈구수와 미분적인, 일반 혈액 화학검사(SGPT, 알카린포스파타제, BUN, 크레아티닌, 단식시 혈당량).
HIⅤ-1에 대한 음성 ELISA
(여성) 임신테스트 음성;
6. 양호한 위생의 실시, 매일의 기록유지와 채변에 대한 의향을 포함한, 필요한 절차들을 이해할 수 있고 따를 수 있을 것.
배제 기준은 다음 내용을 포함한다:
1. 담낭 질병의 병력;
2. 위 무산증(빈번한 제산제, H2블록커 또는 B12사용)
3. 면역결핍증의 병력;
4. (여성) 임신테스트 양성;
5. 프로토콜에의 순응에 방해가 되는 의학적, 심리적 또는 직업적 상태;
6. 설사병;
7. 면역화 전에 7일내 항생물질 치료 병력;
8. 백신에 대한 약물 알레르기 또는 심각한 부작용의 병력.
지원자들을 선별하고 서면동의를 얻었다.
연구 설계; 5명 또는 6명의 지원자들로 된 그룹에 대해 각각의 균주와 사용량에 대한 연구를 하였다. 첫째 그룹에서는, 피실험자는 독성약화된 백신 105CFU 단일용량을 투약받기로 하였다. 이 그룹의 질병의 임상적 증상이 전개되지 않으면, 최대의 안전과 최소의 면역원 용량을 입증하기 위하여 다음 그룹에 사용량의 단계적 확대가 가능하다. 다음 그룹은 106CFU 또는 109CFU에 이르는 최대 용량을 받을 수 있다.
백신 종균의 제조: S. typhi 후보자 백신균주의 저장배지를 -70℃에서 5% 글리세롤을 포함하는 1% 박토펩톤(Difco사)내에 세포의 서스펜젼으로서 저장하였다. 균주들의 종균을 만들기 위하여, 서스펜젼을 녹인후에 특정 사용량을 위해 적절한 CFU/㎖로 희석하였다.
지원자들의 접종: 지원자들의 접종일에, 혈액, 소변 및 대변시료를 채집하고 임상실험 변수에 대한 기준값을 결정하였다. 또한, 혈청과 대변시료에서 면역글로불린을 측정하였다. 피실험자들은 접종전 90분 동안은 아무것도 먹지 못하였다. NaHCO32g을 증류수 5온스에 녹였다. 피실험자들은 상기의 중탄산소다수 4온스를 마실수 있으며, 일분후 피실험자들은 남아있는 중탄산소다수를 1온스에 현탁된 백신을 섭취하였다. 피실험자들은 접종후 90분동안 음식 또는 물을 섭취할 수 없었다.
지원자들의 임상적 모니터링: 지원자들은 최소 이주동안 입원하였고, 그 후 총 4주일에 이르는 동안은 외래환자로서의 지시를 따랐다. 이 기간동안, 제한을 두지는 않지만 열, 두통, 오한, 구토, 설사와 복통을 포함하는 어떠한 역효과들에 대한 관찰을 하였다. 혈액과 대변시료들을 테스트기간 동안 채취하여 배양과 항체결정을 실시하였다. 또한, 백신균주에 대한 PCR을 혈청상에서 행하였다. 연구 동안 어떤 시간대에서 100.8℉ 온도를 나타내는 지원자의 대변시료 및 혈액을 배양을 위해 취하였다; 온도가 12시간 동안 상승된 상태로 남아 있고/또는 혈액배양 결과가 양성이면, 10일간 경구항생물질이 제공될 수 있었다.
시험편 수집방법
대변시료: 백신 접종후 14일동안 지원자들로부터의 모든 대변 횟수, 일관성 및 서술에 관한 기록을 보관해야 한다. 대변의 체적을 측정하고 대변을 5등급 시스템으로 분류한다:
1등급 : 단단한 변(정상)
2등급 : 연한 변(정상)
3등급 : 진한 액체(비정상)
4등급 : 불투명한 물(비정상)
5등급 : 미음과 같은 정도(비정상)
대변배양은 대변시료에 대하여(또는 대변이 통과되지 않았으면 직장 스웝(swab)) 연속일 중 매일 음성으로 될 때까지 살모넬라에 대해 실시했다.
정맥절제: 혈청(20㎖ 혈액)을 사전 스크리닝 평가를 위하여 모았다. 항체(10㎖ 혈액)측정을 위해 혈청을 0, 7, 14 및 28일에 채혈하였다. ELISPOT에 의하여 항체-분비 세포 분석을 위한 림프구 분리를 위해 헤파린 처리된 혈액을(30㎖) 지원자들의 소그룹에서 0, 7, 14 및 28일에 채혈하였다. 소그룹은 그룹 3, 4, 5에서 2명의 지원자로 이루어졌다. 지원자들은 컴퓨터에 의해 무작위로 선택되어질 수 있었다. 혈액(10㎖)은 통상적인 배양 및 PCR 모두에 의하여 생존가능한 백신 유기체를 감지하기 위해 면역화한 후 관찰기간 동안에 음성으로 될 때까지 매일 배양하기 위하여 채혈될 수 있었다. 2달 동안에 지원자에 의해 채혈될 수 있는 혈액은 총 450㎖를 넘을 수 없다. 양성 혈액 배양액 중에서 박테리아는 백신균주의 유전형/표현형에 대한 일치여부를 평가할 수 있다.
세균학: 대변과 직장 스웝은 셀레나이트-시스틴 배양액 내로 접종될 수 있다. 대변은 48시간내에 처리되어야만 한다. 37℃에서 밤새 배양처리후에, 2차배양은 XLT-4 한천상에서 이루어질 수 있다. 살모넬라와 일치성을 나타내는 콜로니들은 S.typhi 0, H와 Vi 항혈청으로의 응집반응에 의해 이룬 동정 및 확인의 API-20 시스템을 통해 처리될 수 있었다. 이 분리균들은 더 한차례의 분석(예, 플라스미드의 존재에 대해, PCR을 사용하여 특별한 DNA 서열의 부재 또는 존재에 대해, 또는 클론된 유전자들에 대한 유전자 프로우브로 서던 블롯팅)을 위해 5%-글리세롤-1% 펩톤내에서 -70℃에서 저장되었다.
혈액 배양액(10㎖)은 50㎖의 Septacheck 병내에 접종될 수 있다. 양성 배양액을 분석하고 상술한 바와 같이 안전하게 보관하였다.
면역학: 혈청 표본은 ELISA에 의해 S. typhi O, H와 Vi 항원 대 IgA, IgM과 IgG에 대해 테스트되었다. H항체는 항원으로서, S. virginia를 사용하는 Widal 튜브 응집반응에 의해서도 측정될 수 있었다(S. manhatten 또한 S. typhy로서 동일한 편모 항원을 공유하지만, 소만틱(somantic)항원을 공유하지는 않음). 말초혈액 단핵 세포들은 항체를 만드는 세포들 대 Salmonella 항원에 대한 ELISPOT를 사용하는 항체 분비세포(ASC)분석을 위하여 수집 및 분리가능하였다. S. typhi O,. H 또는 Vi 항원들에 대하여 IgG, IgA 또는 IgM을 분비하는 림프구를 측정할 수 있었다.
PCR: Salmonella invA 유전자 단편은 혈액 샘플내의 Salmonella typhi의 존재 또는 부재를 확인할 수 있도록 폴리머라제 연쇄반응에 의해 증폭될 수 있다. invA 서열은 Salmonella에 대해 유일하며(Golan과 Cuntiss, 1991), PCR방법에 의하여 침입하는 Salmonella의 존재를 확인하기 위한 진단에 도움이 된다(Rahu 등, 1992).
백신균주의 배출: 백신균주의 배출은 백신 사용후 일주일내에 종식될 것으로 기대된다. 백신균주 배출이 7일 또는 그 이상을 계속하면, 배출을 계속하는 지원자는 매 12시간마다 700mg의 싸이프로플록사신(ciprofloxacin)을 투약받았다. a ≥2 연속일에 대한 음성배양액은 방출할 필요가 있다.
실시예 16
본 실시예에서는 우수한 점액성 및 전신면역 반응을 도출하도록 비강내 투여를 위한 여러가지 혈청형의 독성약화된 RpoS+Salmonella enterica의 사용가능성을 설명하였다. 이러한 후보자 백신 또한 경구, 결막 또는 직장투여될 수 있다.
바람직하게는, Salmonella enterica 혈청형은 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pneB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, frc, poxP, galU 또는 이 유전자들의 조합내에서, 삭제 돌연변이를 일으키는 것과 같은 공지된 독성액화 방법으로 독성약화된다. 더구나, 미생물들은 실시예 4에서 설명된 바 같은 카탈라제 테스트 또는 글리코켄 합성테스트에 의하여 결정된 바의 RpoS+표현형을 가질 수 있다. RpoS+독성약화된 Salmonella enterica 균주들은 Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B, Paratyphi C, Typhimurium, Enteriti-dis, Dublin, 또는 Choleraesuis의 혈청형일 수 있다. 광범위한 숙주 S. enterica 혈청형, Typhimurium과 Enteretidis 및 더많은 숙주가 알맞는 혈청형, Dublin과 Choleraesusis에서는, 이들이 생체내 환경내에서 세포내에서 더욱 신속한 성장 때문에 이들의 면역성을 증진시키는 Salmonella 독성 플라스미드를 소유하는 것이 바람직하다(Gulig in Escherichia coli와 Salmonella, Vol.2 F" Neidhand등, Editor, American Society for Microbiology, Washington DC. pp. 2774-2787, 1996).
인간에서 안전과 효능을 테스트하기 위한 연구디자인은 투여될 살모넬라의 혈청형과 면역화의 비강루우트를 제외하고는 상기의 실시예 15에 설명한 바와 같다. 표 15는 혈청을 달리하는 백신벡터 균주들과 RpoS+표현형을 나타내는 카탈라제와 글리코겐 합성을 위한 이들의 테스트 결과들을 목록하고 있다.
표 15. 박테리아 균주의 RpoS+표현형의 결정
a: n.g. - Q-3 배지에서 성장이 없었음.
S. Choleraesuis χ3246은 글리코겐을 합성할 수 없으나, 이는 카탈라제 테스트에 의하여 RpoS+로서 테스트됨을 주의하라.
S. Paratyphi A, χ8219는 RpoS+표현형을 나타내는 글리코켄을 합성하지만, rpoS 유전자에 의해 조절된 카탈라제를 필요로 한다. 이 균주들 중 어느것도 실시예 2와 3 및 실시예 11에서 설명된 바의 B형 간염 바이러스 코어 Pre-Sl/Pres-2 융합을 특성화하는 pYA3167과 같은 외래항원을 위해 엔코딩하는 Asd+벡터사용을 위하여 asd 돌연변이로 더 변형된 방법들에 의해 독성약화 될 수가 있다. 이 균주들 모두는 RpoS+표현형을 나타낸다.
실시예 15에 설명된 방법들 사이에서의 다른 차이는 면역화의 루우트이다.
비강내 면역화는 적당한 용량의 백신균주를 포함하는 방울을 코로 투여하므로서 이룰수 있는 반면에, 환자는 머리를 뒤로 돌린 채로 수그려 누어 있다. 선택적으로, 비강내 면역화는 분무기로서 콧구멍으로 에어로졸로 만들어 분무하므로써 이룰 수 있다. 투여량은 분우기의 수에 따라 결정된다.
다른 투여방법 또한 테스트될 수 있다. 예로서, 직장면역화는 Nardelli-Haetlige등에 의해 개시된 방법에 의해 이룰 수 있다(Inbect Immun 1996).
결막면역화는 눈물투여로 이룰 수 있다. 모니터링과 면역화된 피실험자들의 안녕과 적절한 면역반응의 도출을 위한 모든 것들은 실시예 15에 설명된 바와 같다.
실시예 17
이 실시예는 인간에게 DNA 백신벡터를 전하는데 사용을 위한 RpoS+살모넬라, 쉬겔라/에스케리키아와 살모넬라/에스케리키아 잡종의 제조방법을 설명한다.
여러 가지의 병원체의 항원들을 엔코딩하는 원형의 플라스미드 DNA는, 병원체로부터 항원유전자가 유도된 병원체에 면역성 유도를 자극하도록 동물숙주내로 도입될 수 있다(UIImer 등, ASM NEWS 62 ; 476-479, 1996 ; UIImer 등, Curr, Opin. Immunol 8 ; 531-536, 1996 ; Whalen, Emerg, Infect, Dis 2 ; 168-175, 1996 ; Robinson, Vaccine 15 ; 785-787, 1997). DNA 백신은 몇가지 병원체의 항원을 특성화하는 유전자 정보가 전사와 번역을 위하여 숙주기구를 사용하는 면역화된 숙주들에 의해 발현되는 그런 발현 시스템을 이용한다. 처음에는 DNA 백신은 근육조직에 주사로 투약되지만, 다른 주입부위들 또한 사용될 수 있다. 최근에, DNA 백신은 피부 또는 점액조직에 DNA-코팅된 금구슬의 주입을 가속화하기 위해 입자층을 사용해 투여되었다.
DNA 백신 벡터들은 발효기내에서 성장된 재조합 E. coli 균주로부터 증식되고 분리된다.
Sizemore 등은(Science, 270:299-302, 1995 ; Vaccine 15 ; 804-807, 1997) E. Coli β-갈락토시다아제를 발현시키기 위해 유전공학처리된 DNAA 백신벡터를 품은(harbored) △ asd 돌연변이와 함께 Shigell flexneri 2a 균주의 사용을 개시했다. Shigella 균주는 진핵세포내로 침입시에 디아미노피멜산의 부재때문에 죽음을 야기하는 △asd 돌연변이에 기인되어 독성약화 되었다. 균주는 배양액내에서 진핵세포의 세포질내로 침입과 그안에서의 용균작용 또는 면역화 마이스(쥐)내로의 용균작용에, 부착후에 세포내로 DNA 백신벡터를 전달할 수 있다. 더욱 최근에, 다른 것들은 DNA 백신 벡터를 소유하는 S. typhimurium 균주들을 사용했으며, 이는 자발적 수단에 의해 세포용해를 야기했다(Powell 등, WO96/34631, 1996 ; Pasenal등, Behring, Inst, Mitt, 98 ; 143-152, 1997 ; Darji 등, Cell 91 ; 765-775, 1997). 용균작용이 자발적인 경우에, 박테리아 균주는 독성약화된 균주를 제공하는 하나 이상의 삭제 돌연변이를 소유할 필요가 있다. Shigella, Salmonella와 침입하는 E. Coli는 장내의 상피세포들(엔테로사이트)에 부착 및 침입하기 보다는 오히려 GALT상에 놓여 있는 M세포들에 부착 및 침입하도록 상당히 향상된 능력을 갖는 것으로 공지되어 있다.
외래 항원들의 전달 또는 모두가 M-세포층을 갖는 NALT, BALT, CALT 및 GALT 내에서 외래항원들의 제조는 전신면역과 마찬가지로 점액성 면역반응의 유도를 초래한다.
점액성 면역반응은 점액 표면상에 콜로니를 만들거나 또는 이 표면을 통해 침입하는 대다수의 전염성 질병에 대하여 보호적이기 때문에, DNA 백신벡터는 어떤 두개의 이들 종들 사이에서 RpoS+Salmonella, Shigella, Escherichia 또는 잡종들에 의해 전달될 수 있다. 이 미생물들은 NALT, CALT, BALT와 GALT의 림프조직 위에 놓인 M세포들에 부착 및 침입하려는 우수한 능력을 갖고 있다. RpoS+미생물로의 구강 및 비강내 면역화 모두는 면역반응을 증가시키기 때문에, RpoS+표현형을 나타내고, 독성약화된 박테리아성 DNA 백신벡터 균주들은 점액성 면역반응을 자극하는 다른 루우트에 의하여 아마도 비강내로 또는 경구로 투여시에 증가된 면역반응을 제공할 수 있음이 기대된다.
외래항원을 발현하기 위해 우리는 DNA 백신벡터 PCMVβ의 유도체를 사용했다. PCMVβ는 암피실린에 대해 내성을 제공할 수 있는 β-락타마제유전자, E. coli내에서 전달을 위하여 복제 PUC 오리진(origin)을 소유하고, 전사된 mRNA의 폴리아데닐화반응을 이루기 위하여 SⅤ40 서열 및 CMⅤ와 SⅤ40 바이러스들로부터의 프로모터와 중진제를 소유한다(MacGregor등, Nucleic Acid Res. 17:1265, 1989).
PCMVβ는 몇 개의 연구에서 테스트용 항원으로 사용되었든 E. coli β-갈락토시다아제를 위한 암호서열을 포함한다. β-갈락토시다아제를 엔코딩하는 lacE유전자는 항원의 전달을 엔코딩하는, 특히 바이러스성, 진균성 및 기생병원체들로부터, DNA의 치환으로 쉽게 제거될 수 있다.
면역화된 동물과 인간숙주에 일부분의 백신으로서 항생물질에 내성이 있는 유전자의 도입은 관심이 계속되기 때문에, PCMVβ-asd를 수득하기 위하여 PCMVβ내에서 앰피실린-내성이 있는 유전자인 S. typhimurium asd 유전자로 치환했다(도 14). 이는 정제된 DNA 백신벡터를 잠재적으로 오염시킬 수도 있는 비용이 첨가된 항생물질의 부재하에서 발효기 내에서 전달될 수 있는 균형이 잡히고 치명적인 숙주-벡터 시스템을 얻기 위해 △asd 돌연변이를 갖는 E. coli 숙주의 사용을 가능케 한다. 더구나, S. typhimuriceni asd 유전자는 두 개의 천연 CpG서열을 소유하므로써(Kreig, J, Lab, Clin, Med, 128:128-133, 1996) DNA 백신벡터의 면역성을 강력히 강화시킨다. 이러한 서열은 DNA-백신에서 앰피실린-내성이 있는 유전자 대신에 현재 자주 사용되고 있는 카나마이신-내성이 있는 유전자에서도 부재이다. 이러한 DNA 백신벡터내에서 S. typhimuricum asd 유전자의 사용은 미국특허 제5,840,483호에 개시되어 있다.
산업적 이용성:
여기에 제공된 세균성 균주들은, 여러 가지의 세균성, 바이러스성, 진균성, 프로타조알 병원체들에 의하여 야기되는 질병을 막기 위하여, 백신을 포함하는 면역원 조성물의 제조에 있어서 직간접적으로 적합하다.
S. typhi 균주들일 수 있는 이들 운반 세균성 균주들은, 모두가 RpoS+표현형을 가지며, 유전자 생성물들의 발현을 위한 타킷조직, 이중성 단백질 또는 핵산분자에 전달을 위한 운반체로서 역할을 할 수 있다. 미생물들은 독성약화 뿐만 아니라, 종전에 사용된 재조합 독성약화 박테리아와 비교시에 림프 조직을 콜로니화하는 개선된 능력 때문에 높은 면역성 또한 보여준다.
본 균주들은 박테랑 세포들에서 재조합 유전자들에 엔코딩된 발현생성물들의 제조를 위한 운반 미생물로서도 또한 유용하다. 더구나, 향상된 안정성과 개선된 면역성을 갖고 사용될 수 있는 균주들은, 독성약화된, 면역원 박테리아내에서 발현될 수 있는 재조환 항원에 대한 항체들의 제조시에 아주 효과적이다.
미생물기탁
다음의 균주들과 플라스미드는 부다페스트조약과 ATCC(Amenican Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, MD)에 따라서 기탁된다.
표시된 취득 번호는 성공적인 생존능력 테스트후에 설정되고, 필요한 사례금이 지불된다. 배양액과 플라스미드에 대한 취득은 37 CFR 1.14와 35USC 122에 따라 자격이 부여된 커미셔너에 의해 결정될 특허출원의 계류기간동안 이용될 수 있다. 공공에 미치는 배양액과 플라스미드의 이용성에 관한 모든 제한은 출원을 바탕으로 한 특허허가시에 제거될 수 있다. 더구나, 지정기탁은 기탁일로부터 30년간 유지될 수 있거나 또는, 기탁을 위한 마지막 요구후 5년간 또는 미국특허의 시행할 수 있는 수명동안 유지될 수 있으며, 어느쪽이던지 더 길어질 수 있다.
배양액 또는 플라스미드가 생존할 수 없거나 또는 소홀히 해서 파괴되거나 또는 플라스미드를 포함하는 균주인 경우에 플라스미드를 손실할 때는, 생명력이 있는 배양액으로 대치될 수 있다.
여기에서 언급된 기탁물들은 편리만을 위한 것이며, 여기에 설명된 단점으로 본 발명을 실시하는데 필요치 않으며, 또한, 이 물질들은 여기에 참고로 구체화하였다.
기탁물 기탁일자 ATCC NO.
균주들:
MGN-1191 1997.11.14일 202054
MGN-1256 1997.11.14일 202053
χS8280 1997.11.14일 202055
χ8281 1997.11.14일 202056
χ8438 1998.11월
플라스미드:
PYA3433 1997.11.14 209462
상술한 내용을 고려했을 때, 본 발명의 몇가지 장점들을 이룰 수 있으며, 다른 유익한 결과들도 얻어졌음을 알 수 있다.
발명의 범위를 벗어나지 않고도 상기 방법과 조성물에 여러 가지의 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 설명에 포함되고, 첨부된 도면에 도시된 모든 내용은 예시적으로서만 설명될 것이며 제한적인 의미는 없을 것이다.

Claims (90)

  1. 하기 (a)와 (b)를 포함하는, 목적 유전자 생성물을 인간에게 운반하는 방법:
    (a) (ⅰ) RpoS+표현형, (ⅱ) 박테리아 균주를 약독화하는 하나 이상의 불활화 돌연변이 및 (ⅲ) 목적 유전자 생성물을 암호화하는 재조합 유전자를 갖는 박테리아 균주를 선별하는 단계;와
    (b) 상기 균주를 인간에게 투여하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 박테리아 균주를 선별하는 단계는 살모넬라 균주의 선별을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 살모넬라 균주의 선별은 S. typhi 균주의 선별을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB. galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합에 있어서의 불활화 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 S. typhi 는 MGN-1191로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 상기 인간에 대한 병원체로부터의 생성물을 암호화하는 재조합 유전자를 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 S. typhi는8281인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 상기 인간에 있어서 면역반응을 억제, 조절, 또는 증대시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 재조합 유전자를 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 자가-항원을 암호화하는 적어도 하나의 재조합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 자가-항원은 배우자-특이적 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 알레르겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. (a) RpoS+ 표현형, (b) 재조합 rpoS+ 유전자, (c) 박테리아 균주를 약독화하는 하나 이상의 불활화 돌연변이 및 (d) 목적 유전자 생성물을 암호화하는 제2의 재조합 유전자를 갖는 약독화된 박테리아 생균주를 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에게 목적 유전자 생성물을 운반하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 박테리아 균주의 투여는 살모넬라 균주의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 살모넬라 균주의 투여는 S. typhi 균주의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는8438로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB. galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합에 있어서의 불활화 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 병원체로부터의 유전자 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 있어서 면역반응을 억제, 조절, 또는 증대시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 자가-항원을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 자가-항원은 배우자-특이적 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 알레르겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 다음의 단계들을 순서에 관계없이 포함하는, 인간에게 목적 유전자 생성물을 운반하기 위한 운반 미생물 균주의 제조방법:
    (a) 박테리아 균주의 RpoS 표현형을 결정하기 위한 시험을 수행하므로써 RpoS+표현형을 갖는 박테리아 균주를 선별하는 단계;
    (b) 상기 균주를 약독화하기 위하여 하나 이상의 불활화 돌연변이를 생성시키는 단계;
    (c) 상기 균주내로 목적 유전자 생성물을 암호화하는 재조합 유전자를 도입시키는 단계.
  25. 제24항에 있어서, 박테리아 균주의 선별은 살모넬라 균주의 선별을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 살모넬라 균주의 선별은 S. typhi 균주의 선별을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB. galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합에 있어서의 불활화 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 MGN-1191로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 상기 인간에 대한 병원체로부터의 유전자 생성물을 암호화하는 재조합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 S. typhi는8281인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 상기 인간에 있어서 면역반응을 억제, 조절, 또는 증대시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 재조합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제27항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 자가-항원을 암호화하는 적어도 하나의 재조합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 자가-항원은 배우자-특이적 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제27항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 알레르겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 해당 미생물을 약독화하는 하나 이상의 불활화 돌연변이, (d) 목적 유전자 생성물을 암호화하는 제2의 재조합 유전자를 갖는 박테리아 균주를 생성시키는 것을 포함하는, 인간에게 목적 유전자 생성물을 운반하기 위한 운반 미생물의 제조방법.
  37. 제36항에 있어서, 박테리아 균주의 생성은 살모넬라 균주의 생성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 살모넬라 균주의 생성은 S. typhi 균주의 생성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는8438로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB. galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합에 있어서의 불활화 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 병원체로부터의 유전자 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제39항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 있어서 면역반응을 억제, 조절, 또는 증대시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제39항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 자가-항원을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제39항에 있어서, 상기 자가-항원은 배우자-특이적 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제39항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 알레르겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 해당 미생물을 약독화하는 하나 이상의 불활화 돌연변이, (d) 목적 유전자 생성물을 암호화하는 제2의 재조합 유전자를 갖는 약독화된 박테리아 생균주를 포함하는, 인간에게 목적 유전자 생성물을 운반하기 위한 운반 미생물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 박테리아는 살모넬라를 포함하는 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 살모넬라는 S. typhi 를 포함하는 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는8438로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 운반 미생물.
  51. 제49항에 있어서, 상기 약독화된 S. typhi 는 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB. galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합에 있어서의 불활화 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 병원체로부터의 유전자 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  54. 제51항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 있어서 면역반응을 억제, 조절, 또는 증대시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  55. 제51항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 자가-항원을 암호화하는 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 자가-항원은 배우자-특이적 항원인 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  57. 제51항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 알레르겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는 운반 미생물.
  58. (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 해당 미생물을 약독화하는 하나 이상의 불활화 돌연변이, (d) 목적 유전자 생성물을 암호화하는 제2의 재조합 유전자를 갖는 약독화된 박테리아 생균주를 포함하는 인간 면역용 백신.
  59. 제58항에 있어서, 상기 박테리아는 살모넬라를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  60. 제59항에 있어서, 상기 살모넬라는 S. typhi 를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  61. 제60항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는8438로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB. galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합에 있어서의 불활화 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  63. 제62항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 병원체로부터의 유전자 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 백신.
  64. 제63항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 백신.
  65. 제62항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 자가-항원을 암호화하는 것을 특징으로 하는 백신.
  66. 제65항에 있어서, 상기 자가-항원은 배우자-특이적 항원인 것을 특징으로 하는 백신.
  67. 제62항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 알레르겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는 백신.
  68. 제58항에 있어서, 상기 약독화된 S. typhi 균주는 약제학적으로 허용가능한 담체내에 존재하는 것을 특징으로 하는 백신.
  69. (a) RpoS+표현형, (b) 재조합 rpoS+유전자, (c) 해당 미생물을 약독화하는 하나 이상의 불활화 돌연변이, (d) 목적 유전자 생성물을 암호화하는 제2의 재조합 유전자를 갖는 약독화된 박테리아 생균주를 포함하는 유전적으로 조작된 세포.
  70. 제69항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 살모넬라 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  71. 제70항에 있어서, 상기 살모넬라 균주는 S. typhi 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  72. 제71항에 있어서, 상기 S. typhi 균주는8438로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 약독화된 S. typhi 균주는 pab 유전자, pur 유전자, aro 유전자, asd, dap 유전자, nadA, pncB. galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU 또는 이들의 조합에 있어서의 불활화 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  74. 제73항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 병원체로부터의 유전자 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  75. 제74항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생동물 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  76. 제73항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 상기 인간에 있어서 면역반응을 억제, 조절, 또는 증대시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  77. 제73항에 있어서, 상기 제2의 재조합 유전자는 자가-항원을 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  78. 제77항에 있어서, 상기 자가-항원은 배우자-특이적 항원인 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  79. 제73항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 상기 인간에 대한 알레르겐을 암호화하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  80. 약제학적으로 허용가능한 담체와 제69항에 따른 유전적으로 조작된 세포를 혼합하는 것을 포함하는 백신 제조방법.
  81. (a) 창자에 연결된 임파조직의 침입 및 정착을 촉진시키는 유전자 생성물을 발현할 수 있는 재조합 독성 유전자, (b) 해당 미생물을 약독화시키는 하나 이상의 불활화 돌연변이 및 (c) 목적 생성물을 암호화하는 제2의 재조합 유전자를 갖는 약독화된 박테리아 생균주를 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에게 목적 유전자 생성물을 운반하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 살모넬라 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 살모넬라 균주는 S. typhi 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  84. (a) 창자에 연결된 임파조직의 침입 및 정착을 촉진시키는 유전자 생성물을 발현할 수 있는 재조합 독성 유전자, (b) 해당 미생물을 약독화시키는 하나 이상의 불활화 돌연변이 및 (c) 목적 생성물을 암호화하는 제2의 재조합 유전자를 갖는 약독화된 박테리아 생균주를 포함하는 유전적으로 조작된 세포.
  85. 제84항에 있어서, 상기 박테리아는 살모넬라를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  86. 제85항에 있어서, 상기 살모넬라는 S. typhi 를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 세포.
  87. 박테리아의 RpoS 표현형을 결정하는 것을 포함하며, RpoS+표현형의 존재는 RpoS- 표현형을 갖는 동종의 박테리아에 비하여 증가된 면역원성을 나타내는 것을 특징으로 하는 박테리아의 면역원성 분석방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 박테리아는 살모넬라를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 살모넬라는 S. typhi 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, RpoS 표현형은 S. typhi의 카탈라제 활성과 글리코겐 생합성 활성의 어느 하나 또는 둘 모두를 분석하므로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
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