CN110157723B - 一步同源重组法在鼠伤寒沙门菌必须基因敲除中的应用 - Google Patents

一步同源重组法在鼠伤寒沙门菌必须基因敲除中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一步同源重组法在鼠伤寒沙门菌必须基因敲除中的应用，具体包括一种含rpsL基因的携带质粒pclone007‑rpsL、rpsL基因染色体线性打靶片段，以及将上述质粒、打靶片段用于鼠伤寒沙门菌必须基因敲除。本发明将鼠伤寒沙门菌必须基因克隆到质粒，并在质粒上对克隆基因进行功能研究较在染色体上进行研究更容易，手段和方法也更多。本发明有利于新型抗生素的研发和新型减毒沙门菌平衡致死宿主载体表达系统的研发。

Description

一步同源重组法在鼠伤寒沙门菌必须基因敲除中的应用
技术领域
本发明属于基因技术领域，涉及一步同源重组法在鼠伤寒沙门菌必须基因敲除中的应用。
背景技术
鼠伤寒沙门菌是一种常见的食源性致病菌，能导致急性胃肠炎及腹泻等症状，严重危害人类健康。服用抗生素是治疗鼠伤寒沙门菌感染的首选方案。研究表明，细菌染色体上的特定必须基因是抗生素的主要作用靶点。因此，对鼠伤寒沙门菌特定必须基因结构和功能进行探究是研发新型抗身素的前提。
目前，对鼠伤寒沙门菌必须基因的研究，主要采用原位突变技术，即：直接对鼠伤寒沙门菌染色体上特定必须基因进行定点突变，并观察不同突变对基因功能的影响。然而，这种基于染色体的原位突变方法效率较低，且操作复杂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供含鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL的携带质粒pclone007-rpsL。
本发明的目的之二在于提供rpsL基因的染色体线性打靶片段。
本发明的目的之三在于提供将上述质粒、打靶片段用于鼠伤寒沙门菌染色体上必须基因rpsL的敲除。
本发明的目的之四在于提供了将上述质粒、打靶片段同时转入(一步法)鼠伤寒沙门菌以敲除其必须基因的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL，是通过以下方法构建得到的：
(A)获得鼠伤寒沙门菌rpsL基因的启动子序列如SEQ ID NO.3所示；
(B)获得含密码子优化的rpsL基因编码序列如SEQ ID NO.7所示；
(C)将SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示序列拼接，获得含鼠伤寒沙门菌rpsL启动子序列和经密码子优化的rpsL编码基因的序列如SEQ ID NO.8所示；
(D)将SEQ ID NO.8所示序列插入到pclone007质粒的T3TE及tonB转录终止子之间，获得含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL，如图1所示。
优选的，步骤(A)的具体方法是：
以鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1基因组(Tang,Tian,et al."Development andevaluation of live attenuated Salmonella vaccines in newly hatched duckings."Vaccine 33.42(2015):5564-5571.)为模板进行PCR扩增，用引物对rpsLPR-For和rpsLPR-Re进行PCR扩增；
rpsLPR-For:5’-tggcgggatcgttgtatatt-3’，如SEQ ID NO.1所示；
rpsLPR-Re:5’-taaatagctcctggttttagct-3’，如SEQ ID NO.2所示；
PCR扩增条件为94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，53℃退火30秒，72℃延伸15秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟；
将PCR产物进行电泳和胶回收，获得rpsL基因启动子序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，步骤(B)的具体方法是：
以鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1基因组为模板进行PCR扩增，用引物对rpsL-For和rpsL-Re进行PCR扩增；
rpsL-For:5’-atggcaacagttaaccagct-3’，如SEQ ID NO.4所示；
rpsL-Re:5’-ttaagccttaggacgcttca-3’，如SEQ ID NO.5所示；
PCR扩增条件为94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。
将PCR产物进行电泳和胶回收，获得rpsL基因编码序列如SEQ ID NO.6所示；
对SEQ ID NO.6所示rpsL编码基因前45bp及后48bp序列进行密码子优化，获得经密码子优化的rpsL基因编码序列如SEQ ID NO.7所示。
rpsL基因染色体线性打靶片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
rpsL基因染色体线性打靶片段的制备方法，具体步骤如下：
以卡那霉素抗性质粒PKD4(Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner."One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts."Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645.)为模板，用引物对rpsL-Kan-For和rpsL-Kan-Re进行PCR扩增；
rpsL-Kan-For:5’-atggcaacagttaaccagctggtacgcaaaccacgtgctgtgtaggctggagctgcttc-3’，如
SEQ ID NO.9所示；
rpsL-Kan-Re:5’-ttaagccttaggacgcttcacgccgtacttagaacgagcatgggaattagccatggtcc-3’，如
SEQ ID NO.10所示；
其中，引物rpsL-Kan-For前39个碱基与鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1rpsL编码基因上游39个碱基一致；引物rpsL-Kan-Re前39个碱基则与鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1rpsL编码基因下游39个碱基一致；
PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟；
将PCR产物进行电泳和胶回收，获得基于鼠伤寒沙门菌染色体rpsL基因的线性打靶片段，如SEQ ID NO.11所示。
含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL、rpsL基因染色体线性打靶片段在鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL敲除中的应用。
利用含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL、rpsL基因染色体线性打靶片段进行鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL敲除的方法，具体步骤如下：
(1)将重组质粒PKD46(Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner."One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts."Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645.)转入鼠伤寒沙门菌野毒株TT-1，通过氨苄抗性筛选，获得一次重组受体菌；
(2)将rpsL基因染色体线性打靶片段和含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL同时转入重组受体菌，通过50μg/mL浓度的卡那霉素抗性筛选获得一次同源重组阳性克隆，然后再转入PCP20质粒(Datsenko,Kirill A.,and Barry L.Wanner."One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts."Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645.)，用以切除卡那霉素抗性基因，获得敲除了染色体rpsL基因同时保留含该基因质粒的目的菌株。
优选的，步骤(1)中，所述氨苄的筛选浓度为：100μg/mL。
本发明的有益效果在于：
1、有益于对鼠伤寒沙门菌必须基因的研究：将鼠伤寒沙门菌必须基因克隆到质粒，并在质粒上对克隆基因进行功能研究较在染色体上进行研究更容易，手段和方法也更多。
2、有益于新型抗生素的研发：抗生素主要作用于细菌的特定必须基因，对特定必须基因的研究将有利于新型抗生素的研发。
3、有益于新型减毒沙门菌平衡致死宿主载体表达系统的研发：将减毒沙门菌染色体上特定必须基因敲除，并将该必须基因克隆到能表达外源基因的质粒上，便构成了平衡致死宿主载体表达系统。该系统能携带和表达外源基因，是构建减毒沙门菌载体疫苗的基石。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL的质粒图谱；
图2为rpsL基因启动子序列PCR扩增结果电泳图谱；
图3为rpsL基因编码序列PCR扩增结果电泳图谱；
图4为rpsL基因线性打靶片段PCR扩增结果电泳图谱；
图5为敲除了染色体上rpsL基因同时保留含rpsL携带质粒的阳性克隆PCR验证图谱；
图6为切除了卡那霉素抗性基因同时保留含rpsL携带质粒的目的菌株PCR验证图谱。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明以敲除鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1染色体必须基因rpsL同时互补含rpsL基因的质粒为例，来说明本发明的具体操作方法。
实施例1：
鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL启动子序列的获取
以鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1基因组为模板进行PCR扩增，用引物对rpsLPR-For和rpsLPR-Re进行PCR扩增。引物序列如下：
rpsLPR-For:5’-tggcgggatcgttgtatatt-3’(SEQ ID NO.1)
rpsLPR-Re:5’-taaatagctcctggttttagct-3’(SEQ ID NO.2)
PCR扩增条件为94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，53℃退火30秒，72℃延伸15秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。
将PCR产物进行电泳(图2)和胶回收，获得rpsL基因启动子序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2：
鼠伤寒沙门菌rpsL编码基因密码子优化
(1)鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL编码序列的获取：
以鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1基因组为模板进行PCR扩增，用引物对rpsL-For和rpsL-Re进行PCR扩增。引物序列如下：
rpsL-For:5’-atggcaacagttaaccagct-3’(SEQ ID NO.4)
rpsL-Re:5’-ttaagccttaggacgcttca-3’(SEQ ID NO.5)
PCR扩增条件为94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。
将PCR产物进行电泳(图3)、胶回收和测序，获得rpsL基因编码序列如SEQ ID NO.6所示。
(2)rpsL编码基因密码子优化
对SEQ ID NO.6所示rpsL编码基因前45bp及后48bp序列进行密码子优化，获得经密码子优化的rpsL基因编码序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例3：
rpsL基因携带质粒pclone007-rpsL的构建
(1)rpsL基因启动子及经密码子优化的rpsL基因全序列获取
将SEQ ID NO.3所示rpsL基因启动子序列和SEQ ID NO.7所示经密码子优化的rpsL基因序列进行拼接，获得SEQ ID NO.8所示含rpsL启动子及经密码子优化的rpsL基因的全序列。
(2)pclone007-rpsL质粒的构建
人工合成SEQ ID NO.8所示序列，并插入到pclone007的T3TE及tonB转录终止子之间，获得含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL如图1所示。
实施例4：
鼠伤寒沙门菌rpsL基因染色体线性打靶片段的获取
以卡那霉素抗性质粒PKD4为模板进行PCR扩增，用引物对rpsL-Kan-For和rpsL-Kan-Re进行PCR扩增。扩增引物序列如下：
rpsL-Kan-For:5’-atggcaacagttaaccagctggtacgcaaaccacgtgctgtgtaggctggagctgcttc-3’
(SEQ ID NO.9)
rpsL-Kan-Re:5’-ttaagccttaggacgcttcacgccgtacttagaacgagcatgggaattagccatggtcc-3’
(SEQ ID NO.10)
其中，引物rpsL-Kan-For前39个碱基与鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1rpsL编码基因前39个碱基一致；引物rpsL-Kan-Re前39个碱基则与鼠伤寒沙门菌野生型菌株TT-1rpsL编码基因后39个碱基一致。
PCR扩增条件为:94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行电泳(图4)和胶回收，获得基于鼠伤寒沙门菌染色体rpsL基因的线性打靶片段，如SEQ ID NO.11所示。
实施例5：
利用一步同源重组法敲除鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL
(1)同源重组受体菌株构建
挑取野生型鼠伤寒沙门菌TT-1单菌落，接种于1ml LB培养液，37℃，170rev/min过夜培养；次日，取100μl菌液接种于10ml新鲜的LB培养液，37℃，170rev/min培养2h；将培养好的菌液置于冰上冷却30min,-4℃离心收获菌体并用等体积预冷的超纯水清洗菌体两次；加入200μl预冷的超纯水重悬洗好的菌体并置于冰上保存；取40μl重悬菌液与10μg重组质粒PKD46混合后进行电转化，电转化参数为：电压1.6KV，电阻200Ω，电容25μF；电转化结束后向每个电击杯中迅速加入600μl新鲜的LB培养液并迅速放37℃孵育1h，随后取50μl菌液涂布含100μg/ml氨苄的LB平板并置于30℃培养；挑取长出的单菌落，在含氨苄的LB平板上纯化两次后提质粒进行电泳鉴定，含有大小约为6400bp质粒的菌株即为同源重组受体菌株。
(2)利用一步法质粒、打靶片段共转导重组技术将鼠伤寒沙门菌染色体上的rpsL基因敲除替换为含卡那霉素抗性基因。
挑取同源重组受体菌株单菌落，接种于1ml含100μg/ml氨苄的LB培养液，30℃，170rev/min过夜培养；次日，取250μl菌液接种于25ml含氨苄和L-阿拉伯糖的新鲜LB培养液，30℃，170rev/min培养至OD600约0.6；将培养好的菌液置于冰上冷却30min,-4℃离心收获菌体并用等体积预冷的超纯水清洗菌体两次；加入200μl预冷的超纯水重悬洗好的菌体并置于冰上保存；取40μl重悬菌液与100ng SEQ ID NO.11所示打靶片段以及50ng图1所示pclone007-rpsL质粒混合并进行电转化，电转化参数为：电压1.6KV，电阻200Ω，电容25μF；电转化结束后向每个电击杯中迅速加入600μl新鲜的LB培养液并放37℃孵育1h，随后取100μl涂布含卡那霉素的LB平板并置于37℃培养；挑取长出的单菌落，在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上纯化两次后，用引物对rpsL-Check-For和rpsL-Check-Re进行PCR鉴定。PCR引物序列如下：
rpsL-Check-For:5’-atggcgttaccgtcgcgat-3’(SEQ ID NO.12)
rpsL-Check-Re:5’-gaacgctgagccagggtct-3’(SEQ ID NO.13)
PCR扩增条件为:94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，55℃退火30秒，72℃延伸120秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行电泳、胶回收和测序，获得图5所示大小约2150bp条带并且测序正确的菌落即为重组成功的菌落。
实施例6：将重组成功菌中的卡那霉素抗性基因切除
挑取重组成功菌单菌落，接种于1ml LB培养液，37℃，170rev/min过夜培养；次日，取10μl菌液接种于10ml新鲜的LB培养液，37℃，170rev/min培养至OD600约0.6；将培养好的菌液置于冰上冷却30min,-4℃离心收获菌体并用等体积预冷的超纯水清洗菌体两次；加入250μl预冷的超纯水重悬洗好的菌体并置于冰上保存；取40μl重悬菌液与10ng PCP20质粒混合后进行电转化，电转化参数为：电压1.6KV，电阻200Ω，电容25μF；电转化结束后向每个电击杯中迅速加入600μl新鲜的LB培养液并放37℃孵育1h，随后取100μl菌液涂布含50μg/ml氯霉素的LB平板并置于30℃培养；挑取长出的单菌落，于42℃，在LB平板上纯化两次后进行氨苄、氯霉素及卡那霉素抗性鉴定，具体方法为：
随机挑取5个纯化后的单菌落，每个单菌落分别划线接种含100μg/ml氨苄、12.5μg/ml氯霉素或50μg/ml卡那霉素的LB平板，并置于37℃培养18h。
挑取仅在含100μg/ml氨苄的LB平板上生长的菌落，提取质粒后用引物对rpsL-Check-For(SEQ ID NO.12)和rpsL-Check-Re-D进行PCR鉴定。引物rpsL-Check-Re-D序列如下:
rpsL-Check-Re-D:5’-accaatgacgcgacgacgt-3’(SEQ ID NO.14)
PCR扩增条件为:94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
将PCR产物进行电泳、胶回收和测序，获得图6所示大小约520bp条带的菌落且测序正确的菌落即为切除了卡那霉素抗性基因同时保留了pclone007-rpsL质粒的重组菌。
上述实验证明了一步法质粒、打靶片段共转导重组方法能够用于敲除鼠伤寒沙门菌染色体必须基因并同时保留含该必须基因的质粒。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一步同源重组法在鼠伤寒沙门菌必须基因敲除中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcgggatc gttgtatatt 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaatagctc ctggttttag ct 22
<210> 3
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcgggatc gttgtatatt tcttgacacc ttttcgacac cgccctaaaa ttcggcgtcc 60
tcatattgtg tgagggcgtt ttattacgtg tttacgaagc aaaagctaaa accaggagct 120
attta 125
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcaacag ttaaccagct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttaagcctta ggacgcttca 20
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcaacag ttaaccagct ggtacgcaaa ccacgtgctc gcaaagttgc gaaaagcaac 60
gtgcctgcgc tggaagcatg cccgcaaaaa cgtggcgtat gtactcgtgt atatactacc 120
actcctaaaa aaccgaactc cgcactgcgt aaagtttgcc gtgttcgtct gactaacggt 180
tttgaagtga cttcctacat cggtggtgaa ggtcacaacc tgcaggagca ctccgtgatc 240
ctgatccgtg gcggtcgtgt taaagacctc ccgggtgttc gttaccacac cgttcgtggc 300
gcgcttgact gctccggcgt taaagaccgt aagcaagctc gttctaagta cggcgtgaag 360
cgtcctaagg cttaa 375
<210> 7
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggcaaccg ttaaccagct ggttcgtaaa ccgcgcgcgc gcaaagttgc gaaaagcaac 60
gtgcctgcgc tggaagcatg cccgcaaaaa cgtggcgtat gtactcgtgt atatactacc 120
actcctaaaa aaccgaactc cgcactgcgt aaagtttgcc gtgttcgtct gactaacggt 180
tttgaagtga cttcctacat cggtggtgaa ggtcacaacc tgcaggagca ctccgtgatc 240
ctgatccgtg gcggtcgtgt taaagacctc ccgggtgttc gttaccacac cgttcgtggc 300
gcgcttgact gctccggcgt taaagaccgt aaacaagcac gtagcaaata tggtgttaaa 360
cgtccgaaag cctaa 375
<210> 8
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggcgggatc gttgtatatt tcttgacacc ttttcgacac cgccctaaaa ttcggcgtcc 60
tcatattgtg tgagggcgtt ttattacgtg tttacgaagc aaaagctaaa accaggagct 120
atttaatggc aaccgttaac cagctggttc gtaaaccgcg cgcgcgcaaa gttgcgaaaa 180
gcaacgtgcc tgcgctggaa gcatgcccgc aaaaacgtgg cgtatgtact cgtgtatata 240
ctaccactcc taaaaaaccg aactccgcac tgcgtaaagt ttgccgtgtt cgtctgacta 300
acggttttga agtgacttcc tacatcggtg gtgaaggtca caacctgcag gagcactccg 360
tgatcctgat ccgtggcggt cgtgttaaag acctcccggg tgttcgttac cacaccgttc 420
gtggcgcgct tgactgctcc ggcgttaaag accgtaaaca agcacgtagc aaatatggtg 480
ttaaacgtcc gaaagcctaa 500
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggcaacag ttaaccagct ggtacgcaaa ccacgtgctg tgtaggctgg agctgcttc 59
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttaagcctta ggacgcttca cgccgtactt agaacgagca tgggaattag ccatggtcc 59
<210> 11
<211> 1574
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggcaacag ttaaccagct ggtacgcaaa ccacgtgctg tgtaggctgg agctgcttcg 60
aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaacttcaag atcccctcac 120
gctgccgcaa gcactcaggg cgcaagggct gctaaaggaa gcggaacacg tagaaagcca 180
gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg 240
aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag 300
actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta 360
aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc 420
gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 480
atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 540
cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 600
cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag 660
cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 720
ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 780
ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 840
cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 900
gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 960
tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg 1020
tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 1080
gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 1140
cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 1200
gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 1260
gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 1320
tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 1380
cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccagctt 1440
caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaactaa 1500
ggaggatatt catatggacc atggctaatt cccatgctcg ttctaagtac ggcgtgaagc 1560
gtcctaaggc ttaa 1574
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcgttac cgtcgcgat 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaacgctgag ccagggtct 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accaatgacg cgacgacgt 19

Claims (5)

1.含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL，其特征在于，是通过以下方法构建得到的：
(A)获得鼠伤寒沙门菌rpsL基因的启动子序列如SEQ ID NO.3所示；
(B)获得含密码子优化的rpsL基因编码序列如SEQ ID NO.7所示；
(C)将SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示序列拼接，获得含鼠伤寒沙门菌rpsL启动子序列和经密码子优化的rpsL编码基因的序列如SEQ ID NO.8所示；
(D)将SEQ ID NO.8所示序列其插入到pclone007质粒的T3TE及tonB转录终止子之间，获得含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL。
2.rpsL基因染色体线性打靶片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.权利要求2所述rpsL基因染色体线性打靶片段的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
以卡那霉素抗性质粒PKD4为模板进行PCR扩增，用引物对rpsL-Kan-For和rpsL-Kan-Re进行PCR扩增；
rpsL-Kan-For:5’-atggcaacagttaaccagctggtacgcaaaccacgtgctgtgtaggctggagctgcttc-3’，如
SEQ ID NO.9所示；
rpsL-Kan-Re:5’-ttaagccttaggacgcttcacgccgtacttagaacgagcatgggaattagccatggtcc-3’，如
SEQ ID NO.10所示；
PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟；
将PCR产物进行电泳、胶回收和测序，获得rpsL基因染色体线性打靶片段，如SEQ IDNO.11所示。
4.权利要求1所述含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL、权利要求2所述rpsL基因染色体线性打靶片段在鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL敲除中的应用。
5.利用权利要求1所述含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL、权利要求2所述rpsL基因染色体线性打靶片段进行鼠伤寒沙门菌必须基因rpsL的敲除，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将重组质粒PKD46转入鼠伤寒沙门菌野毒株TT-1，通过氨苄抗性筛选，获得一次重组受体菌；
(2)将rpsL基因染色体线性打靶片段和含rpsL基因的携带质粒pclone007-rpsL同时转入重组受体菌，通过卡那霉素抗性筛选获得一次同源重组阳性克隆，然后再转入PCP20质粒，用以切除卡那霉素抗性基因，获得敲除了染色体rpsL基因同时保留含该基因质粒的目的菌株。
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