JPH09206077A - プラスミド及びプラスミドベクター - Google Patents
プラスミド及びプラスミドベクターInfo
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- JPH09206077A JPH09206077A JP8023651A JP2365196A JPH09206077A JP H09206077 A JPH09206077 A JP H09206077A JP 8023651 A JP8023651 A JP 8023651A JP 2365196 A JP2365196 A JP 2365196A JP H09206077 A JPH09206077 A JP H09206077A
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- plasmid
- pcp53
- derived
- vector
- lactobacillus helveticus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
Abstract
(57)【要約】
【課題】ラクトバチルス・ヘルベティカス由来の、高コ
ピー数を有する新規なプラスミド及びその新規なプラス
ミドを改変したシャトルベクターを提供する。 【解決手段】約１１．５ｋｂ長であるプラスミドｐＣＰ
５３、及びこの複製開始領域、細菌由来の複製開始領
域、及びマーカー遺伝子を含む約４．７ｋｂ長であるプ
ラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄを提供する。 【化１】
ピー数を有する新規なプラスミド及びその新規なプラス
ミドを改変したシャトルベクターを提供する。 【解決手段】約１１．５ｋｂ長であるプラスミドｐＣＰ
５３、及びこの複製開始領域、細菌由来の複製開始領
域、及びマーカー遺伝子を含む約４．７ｋｂ長であるプ
ラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄを提供する。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラクトバチルス・
ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）由来に代
表される新規なプラスミド、及びこの新規なプラスミド
を用いて調製されるところの、微生物の形質転換に利用
でき、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスと他の宿
主とのシャトルベクターとして使用することができる新
規なプラスミドベクターに関する。
ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）由来に代
表される新規なプラスミド、及びこの新規なプラスミド
を用いて調製されるところの、微生物の形質転換に利用
でき、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスと他の宿
主とのシャトルベクターとして使用することができる新
規なプラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】ラクトバチルス・ヘルベティカスは、古
くから代表的な酪農用乳酸菌スターターとして発酵乳の
製造に用いられている。ラクトバチルス・ヘルベティカ
スの特徴の１つとして、強い蛋白質分解活性が認められ
ている（Yamamoto, N., et al.,Biosci. Biotech. Bioc
hem., 58, 776-778(1994)）。またラクトバチルス・ヘ
ルベティカスの発酵乳中には、血圧上昇作用に主要な役
割を果たすアンギオテンシン変換酵素に対して、阻害作
用を示す生理活性ペプチドが含まれることが（Nakamur
a, Y. et al., J. Dairy Sci., 78, 777-783(1995)）、
更にはこれらのペプチドに起因する強い血圧降下作用が
認められることが報告されている（Nakamura, Y., et a
l., J. Dairy Sci., 78, 1253-1257(1995)）。このよう
な菌株を有効利用する方法としては、従来から遺伝子組
換え技術を応用して、分子育種する方法等が知られてい
る。既に、乳酸菌について多くのプラスミドが報告され
ているが、乳酸桿菌ラクトバチルス・ヘルベティカスの
プラスミドについての報告例は少ない。従って、ラクト
バチルス・ヘルベティカスの宿主−ベクター系について
の報告例も少ない。
くから代表的な酪農用乳酸菌スターターとして発酵乳の
製造に用いられている。ラクトバチルス・ヘルベティカ
スの特徴の１つとして、強い蛋白質分解活性が認められ
ている（Yamamoto, N., et al.,Biosci. Biotech. Bioc
hem., 58, 776-778(1994)）。またラクトバチルス・ヘ
ルベティカスの発酵乳中には、血圧上昇作用に主要な役
割を果たすアンギオテンシン変換酵素に対して、阻害作
用を示す生理活性ペプチドが含まれることが（Nakamur
a, Y. et al., J. Dairy Sci., 78, 777-783(1995)）、
更にはこれらのペプチドに起因する強い血圧降下作用が
認められることが報告されている（Nakamura, Y., et a
l., J. Dairy Sci., 78, 1253-1257(1995)）。このよう
な菌株を有効利用する方法としては、従来から遺伝子組
換え技術を応用して、分子育種する方法等が知られてい
る。既に、乳酸菌について多くのプラスミドが報告され
ているが、乳酸桿菌ラクトバチルス・ヘルベティカスの
プラスミドについての報告例は少ない。従って、ラクト
バチルス・ヘルベティカスの宿主−ベクター系について
の報告例も少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】分子育種を遺伝子組換
え技術に基づいて行うには、目的の菌株に合ったベクタ
ー、導入効率が高い形質転換法、及び安定にプラスミド
を保持する宿主、即ち宿主−ベクター系の開発が重要課
題である。特に、宿主当たりのコピー数が少ないと有効
物質生産性も低くなり、実用性に問題が生じる。また、
菌体自体を発酵乳として食する場合には、発酵に使用す
る微生物の安全性が問題となる。しかし、既に古くから
発酵乳製造に用いられてきたラクトバチルス・ヘルベテ
ィカスの安全性については、これまで長年の食経験から
実証されている。
え技術に基づいて行うには、目的の菌株に合ったベクタ
ー、導入効率が高い形質転換法、及び安定にプラスミド
を保持する宿主、即ち宿主−ベクター系の開発が重要課
題である。特に、宿主当たりのコピー数が少ないと有効
物質生産性も低くなり、実用性に問題が生じる。また、
菌体自体を発酵乳として食する場合には、発酵に使用す
る微生物の安全性が問題となる。しかし、既に古くから
発酵乳製造に用いられてきたラクトバチルス・ヘルベテ
ィカスの安全性については、これまで長年の食経験から
実証されている。
【０００４】従って、本発明の課題は、ラクトバチルス
属乳酸菌、特にラクトバチルス・ヘルベティカス由来に
代表され、高コピー数を有する新規なプラスミド及びそ
の新規なプラスミドを改変したシャトルベクターとして
使用できる新規なプラスミドベクターを提供することに
ある。
属乳酸菌、特にラクトバチルス・ヘルベティカス由来に
代表され、高コピー数を有する新規なプラスミド及びそ
の新規なプラスミドを改変したシャトルベクターとして
使用できる新規なプラスミドベクターを提供することに
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ラクトバチ
ルス・ヘルベティカス等に属する菌株のプラスミドの有
無及びその分子量を検討した結果、ラクトバチルス・ヘ
ルベティカスＣＰ５３株から、安定に保持され高コピー
数である新規なプラスミドを見い出し、さらにこの新規
なプラスミドを改変することにより、効率的に形質転換
を行うことができる有用なプラスミドベクターを得、本
発明を完成した。
ルス・ヘルベティカス等に属する菌株のプラスミドの有
無及びその分子量を検討した結果、ラクトバチルス・ヘ
ルベティカスＣＰ５３株から、安定に保持され高コピー
数である新規なプラスミドを見い出し、さらにこの新規
なプラスミドを改変することにより、効率的に形質転換
を行うことができる有用なプラスミドベクターを得、本
発明を完成した。
【０００６】即ち、本発明によれば、下記式化３で示さ
れる制限酵素認識部位を有し、約１１．５ｋｂ長である
プラスミドｐＣＰ５３が提供される。
れる制限酵素認識部位を有し、約１１．５ｋｂ長である
プラスミドｐＣＰ５３が提供される。
【０００７】
【化３】
【０００８】また本発明によれば、前記プラスミドｐＣ
Ｐ５３の複製開始領域、細菌由来の複製開始領域、及び
マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターが提供され
る。
Ｐ５３の複製開始領域、細菌由来の複製開始領域、及び
マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターが提供され
る。
【０００９】さらに本発明によれば、前記プラスミドｐ
ＣＰ５３のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む約２ｋｂ長の複製
開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領
域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサ
イクリン耐性遺伝子を含み、下記式化４に示される制限
酵素認識部位を有し、約４．７ｋｂ長であるプラスミド
ベクターｐＣＰ５３Ｄが提供される。
ＣＰ５３のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む約２ｋｂ長の複製
開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領
域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサ
イクリン耐性遺伝子を含み、下記式化４に示される制限
酵素認識部位を有し、約４．７ｋｂ長であるプラスミド
ベクターｐＣＰ５３Ｄが提供される。
【００１０】
【化４】
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のプラスミドｐＣＰ５３
は、前記式化３で表わされる約１１．５ｋｂ長のプラス
ミドであって、例えばラクトバチルス・ヘルベティカス
ＣＰ５３株から分離することができる。このラクトバチ
ルス・ヘルベティカスＣＰ５３株は、ラクトバチルス・
ヘルベティカスに属し、工業技術院生命工学工業技術研
究所に受託番号ＦＥＲＭ−１５３８７として寄託されて
いる。このＣＰ５３株は、本願出願人が保有する菌株コ
レクションの中から得たものであり、下記の菌学的性質
を有する。
は、前記式化３で表わされる約１１．５ｋｂ長のプラス
ミドであって、例えばラクトバチルス・ヘルベティカス
ＣＰ５３株から分離することができる。このラクトバチ
ルス・ヘルベティカスＣＰ５３株は、ラクトバチルス・
ヘルベティカスに属し、工業技術院生命工学工業技術研
究所に受託番号ＦＥＲＭ−１５３８７として寄託されて
いる。このＣＰ５３株は、本願出願人が保有する菌株コ
レクションの中から得たものであり、下記の菌学的性質
を有する。
【００１２】（形態学的性質） １）細胞の形状：桿菌、２）運動性：無、３）胞子の有
無：無、４）グラム染色性：陽性 （生理学的性質） １）カタラーゼ：陰性、２）インドール生成：陰性、
３）硝酸塩の還元：陰性、４）酸素に対する態度：通性
嫌気性、５）グルコースからホモ乳酸発酵によりＤＬ乳
酸を生成、ガス産生無し。
無：無、４）グラム染色性：陽性 （生理学的性質） １）カタラーゼ：陰性、２）インドール生成：陰性、
３）硝酸塩の還元：陰性、４）酸素に対する態度：通性
嫌気性、５）グルコースからホモ乳酸発酵によりＤＬ乳
酸を生成、ガス産生無し。
【００１３】６）各種炭水化物の分解性 グルコース： ＋ マルトース： − ラクトース： ＋ セルビオース： − マンノース： ＋ トレハロース： − フラクトース： ＋ メルビオース： − ガラクトース： ＋ ラフィノース： − シュークロース： − スタキオース： − マルトース： ＋ マンニトール： − アラビノース： − ソルビトール： − キシロース： − ユースクリン： − ラムノース： − サリシン： − 本発明のプラスミドｐＣＰ５３は、ラクトバチルス・ヘ
ルベティカス菌体中で、高コピー数が産生され回収率が
高い。例えば、ｐＣＰ５３を保有するラクトバチルス・
ヘルベティカスＣＰ５３株をＭＲＳ培地にて一晩培養し
た場合、１ｍｌの培養液から約１μｇのプラスミドを精
製することができる。
ルベティカス菌体中で、高コピー数が産生され回収率が
高い。例えば、ｐＣＰ５３を保有するラクトバチルス・
ヘルベティカスＣＰ５３株をＭＲＳ培地にて一晩培養し
た場合、１ｍｌの培養液から約１μｇのプラスミドを精
製することができる。
【００１４】本発明のプラスミドｐＣＰ５３は、例えば
前記ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株を培養
し、培養後菌体を回収し、アガロースゲル電気泳動方法
等の公知な方法で分離することができる。前記培養は、
通常この菌種に用いられる培地や培養条件により行うこ
とができる。菌体の回収も公知の遠心分離法等により行
うことができる。またプラスミドｐＣＰ５３は、制限酵
素による切断、リガーゼによるライゲーションも公知の
プラスミドと同様に行うことができる。
前記ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ５３株を培養
し、培養後菌体を回収し、アガロースゲル電気泳動方法
等の公知な方法で分離することができる。前記培養は、
通常この菌種に用いられる培地や培養条件により行うこ
とができる。菌体の回収も公知の遠心分離法等により行
うことができる。またプラスミドｐＣＰ５３は、制限酵
素による切断、リガーゼによるライゲーションも公知の
プラスミドと同様に行うことができる。
【００１５】本発明のプラスミドベクターは、プラスミ
ドｐＣＰ５３の複製開始領域に、細菌由来の複製開始領
域及びマーカー遺伝子を連結したものであって、前記プ
ラスミドｐＣＰ５３のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む約２ｋ
ｂ長の複製開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の
複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由
来テトラサイクリン耐性遺伝子を含み、前記式化４に示
される制限酵素認識部位を有し、約４．７ｋｂ長である
プラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄ等を挙げることができ
る。
ドｐＣＰ５３の複製開始領域に、細菌由来の複製開始領
域及びマーカー遺伝子を連結したものであって、前記プ
ラスミドｐＣＰ５３のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む約２ｋ
ｂ長の複製開始領域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の
複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由
来テトラサイクリン耐性遺伝子を含み、前記式化４に示
される制限酵素認識部位を有し、約４．７ｋｂ長である
プラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄ等を挙げることができ
る。
【００１６】前記細菌由来のプラスミドとしては、大腸
菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域の他に、公知
のｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９等の複製開始領域を用い
ることが可能である。更に、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ２
４、ｐＶＡ８３８等の、枯草菌や酵母由来ベクターの複
製開始領域等の使用も可能である。
菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域の他に、公知
のｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９等の複製開始領域を用い
ることが可能である。更に、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ２
４、ｐＶＡ８３８等の、枯草菌や酵母由来ベクターの複
製開始領域等の使用も可能である。
【００１７】前記マーカー遺伝子としては、アンピシリ
ン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラム
フェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、あるいは
乳酸菌又は枯草菌由来のβ−ガラクトシダーゼや菌体外
プロテアーゼ等の酵素を産生する遺伝子等を挙げること
ができる。
ン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラム
フェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、あるいは
乳酸菌又は枯草菌由来のβ−ガラクトシダーゼや菌体外
プロテアーゼ等の酵素を産生する遺伝子等を挙げること
ができる。
【００１８】前記プラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄは、
図２に示す手順により、本発明のプラスミドｐＣＰ５３
に、ｐＨＹ３００ＰＬＫプラスミド（宝酒造（株）製
品）を利用し、大腸菌由来プラスミドｐＡＣＹＣ１７７
の複製開始領域及びストレプトコッカス・フェカリス由
来のプラスミドｐＡＭα１のテトラサイクリン耐性遺伝
子を連結することにより得ることができる。図２に示す
本発明以外のプラスミドは、公知であり、市場で購入す
ることができる。このプラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄ
は、大腸菌及びラクトバチルス・ヘルベティカスやラク
トバチルス・パラカゼイ等ラクトバチルス属乳酸菌へ導
入できるシャトルベクターとして使用可能である。
図２に示す手順により、本発明のプラスミドｐＣＰ５３
に、ｐＨＹ３００ＰＬＫプラスミド（宝酒造（株）製
品）を利用し、大腸菌由来プラスミドｐＡＣＹＣ１７７
の複製開始領域及びストレプトコッカス・フェカリス由
来のプラスミドｐＡＭα１のテトラサイクリン耐性遺伝
子を連結することにより得ることができる。図２に示す
本発明以外のプラスミドは、公知であり、市場で購入す
ることができる。このプラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄ
は、大腸菌及びラクトバチルス・ヘルベティカスやラク
トバチルス・パラカゼイ等ラクトバチルス属乳酸菌へ導
入できるシャトルベクターとして使用可能である。
【００１９】
【発明の効果】本発明のプラスミドｐＣＰ５３は、ラク
トバチルス・ヘルベティカス中に安定に保持されかつ高
コピー数を示す。また本発明のプラスミドベクターｐＣ
Ｐ５３Ｄは、ラクトバチルス・ヘルベティカスの形質転
換を効率的に行うことができる有用なシャトルベクター
である。従って、これらは遺伝子組換え技術を用いたラ
クトバチルス・ヘルベティカスの分子育種等に有用であ
る。
トバチルス・ヘルベティカス中に安定に保持されかつ高
コピー数を示す。また本発明のプラスミドベクターｐＣ
Ｐ５３Ｄは、ラクトバチルス・ヘルベティカスの形質転
換を効率的に行うことができる有用なシャトルベクター
である。従って、これらは遺伝子組換え技術を用いたラ
クトバチルス・ヘルベティカスの分子育種等に有用であ
る。
【００２０】
【実施例】以下実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】 （プラスミドの分離）ラクトバチルス・ヘルベティカス
ｐＣＰ５３株を、ＧＡＭ培地（ニッスイ（株）製）に植
菌後、３７℃で一晩培養した。培養終了後、遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ、５分間）により集菌した。菌体
を１０ｍＭリン酸緩衝液−１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ
６．８）で洗浄後、上記遠心分離条件にて菌体を回収し
た。
ｐＣＰ５３株を、ＧＡＭ培地（ニッスイ（株）製）に植
菌後、３７℃で一晩培養した。培養終了後、遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ、５分間）により集菌した。菌体
を１０ｍＭリン酸緩衝液−１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ
６．８）で洗浄後、上記遠心分離条件にて菌体を回収し
た。
【００２２】次に以下の方法でプラスミドの精製を行っ
た。回収した菌体を１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ
社製）、１ｍｇ／ｍｌ Ｎ−アセチルムラミダーゼ（生
化学工業（株）製）を含む２５％シュークロース、１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液０．２ｍｌ（ｐＨ７．０）に懸濁
後、３７℃で３０分間インキュベートした。次に３％Ｓ
ＤＳ−０．２Ｎ ＮａＯＨ溶液０．４ｍｌを添加し室温
にて約５分間放置した。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４．８）溶液を０．３ｍｌ添加し、氷上で５分間放置
後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）により上
清液を回収した。約２倍量のエタノールを上清液に添加
し、−８０℃にて約２０分間放置した。続いて、遠心分
離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）にて沈殿物を回収
し、７０％エタノールにて洗浄後、沈殿物を乾燥した。
沈殿物を０．１ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に溶解し、プラスミドの粗
精製物を得た。この粗精製プラスミドについて、１％ア
ガロースゲル電気泳動によりプラスミドの有無及び分子
サイズの確認を行った。比較のためプラスミドｐＢＲ３
２２保有の大腸菌ＨＢ１０１株をＬＢ培地（バクトトリ
プトン１０ｇ、イ−ストイクストラクト５ｇ、ＮａＣｌ
１０ｇ：ｐＨ７．５）で培養し、同様にプラスミドの
回収量を比較した。その結果、ラクトバチルス・ヘルベ
ティカスＣＰ５３株は、極めて高い回収率でプラスミド
の存在が確認され、これをｐＣＰ５３と命名した。ｐＣ
Ｐ５３の回収量は、大腸菌用プラスミドであるｐＢＲ３
２２の約２０％程度（１μｇ／ｍｌ培養液）であり、ラ
クトバチルス・ヘルベティカスプラスミドとしては、極
めて高い回収率であった。
た。回収した菌体を１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ
社製）、１ｍｇ／ｍｌ Ｎ−アセチルムラミダーゼ（生
化学工業（株）製）を含む２５％シュークロース、１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液０．２ｍｌ（ｐＨ７．０）に懸濁
後、３７℃で３０分間インキュベートした。次に３％Ｓ
ＤＳ−０．２Ｎ ＮａＯＨ溶液０．４ｍｌを添加し室温
にて約５分間放置した。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ４．８）溶液を０．３ｍｌ添加し、氷上で５分間放置
後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）により上
清液を回収した。約２倍量のエタノールを上清液に添加
し、−８０℃にて約２０分間放置した。続いて、遠心分
離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）にて沈殿物を回収
し、７０％エタノールにて洗浄後、沈殿物を乾燥した。
沈殿物を０．１ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に溶解し、プラスミドの粗
精製物を得た。この粗精製プラスミドについて、１％ア
ガロースゲル電気泳動によりプラスミドの有無及び分子
サイズの確認を行った。比較のためプラスミドｐＢＲ３
２２保有の大腸菌ＨＢ１０１株をＬＢ培地（バクトトリ
プトン１０ｇ、イ−ストイクストラクト５ｇ、ＮａＣｌ
１０ｇ：ｐＨ７．５）で培養し、同様にプラスミドの
回収量を比較した。その結果、ラクトバチルス・ヘルベ
ティカスＣＰ５３株は、極めて高い回収率でプラスミド
の存在が確認され、これをｐＣＰ５３と命名した。ｐＣ
Ｐ５３の回収量は、大腸菌用プラスミドであるｐＢＲ３
２２の約２０％程度（１μｇ／ｍｌ培養液）であり、ラ
クトバチルス・ヘルベティカスプラスミドとしては、極
めて高い回収率であった。
【００２３】ｐＣＰ５３の制限酵素認識部位を探る目的
で、６塩基認識の制限酵素９種類について、切断断片を
１％アガロース電気泳動により分析した。その結果、ｐ
ＣＰ５３は分子量約１１．５ｋｂで、図１に示す制限酵
素認識部位を有することが確認された。また、Ｐｓｔ
Ｉ、ＢｇｌＩＩ、あるいはＳａｌＩに対する認識部位は
認められなかった。
で、６塩基認識の制限酵素９種類について、切断断片を
１％アガロース電気泳動により分析した。その結果、ｐ
ＣＰ５３は分子量約１１．５ｋｂで、図１に示す制限酵
素認識部位を有することが確認された。また、Ｐｓｔ
Ｉ、ＢｇｌＩＩ、あるいはＳａｌＩに対する認識部位は
認められなかった。
【００２４】
【実施例２】 （プラスミドベクターｐＣＰ５３Ｄの構築）図２に示す
操作手順に従って、プラスミドｐＣＰ５３の複製開始領
域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域、及
びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを構築した。
操作手順に従って、プラスミドｐＣＰ５３の複製開始領
域、大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域、及
びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを構築した。
【００２５】１）複製開始領域検索用ベクターの構築 図２に示される、大腸菌由来プラスミドｐＡＣＹＣ１７
７の複製開始領域（Ori-177）、ストレプトコッカス・
フェカリス由来のプラスミドｐＡＭα１の複製開始領域
（Ori-pAMα1）、ならびにアンピシリン及びテトラサイ
クリン耐性遺伝子を含んだプラスミドｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ（宝酒造（株）製）１μｇを、ＨａｅＩＩＩで部分分
解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションし
た。このＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１株にマニアチスの方
法(Molecular Cloning)に従って形質転換し、２０μｇ
／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地で生育株
を選択した。図２に示す通りｐＨＹ３００ＰＬＫのグラ
ム陽性菌用複製開始点欠損株はアンピシリン感受性とな
るために、上記選択株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ寒天培地で生育性を調べた。アンピシリン感
受性株数株から前述の方法に従いプラスミドを分離し、
その制限酵素認識部位を調べたところ、図２記載のｐＨ
ＹＤ（２．７ｋｂ）が構築されていることが確認され
た。
７の複製開始領域（Ori-177）、ストレプトコッカス・
フェカリス由来のプラスミドｐＡＭα１の複製開始領域
（Ori-pAMα1）、ならびにアンピシリン及びテトラサイ
クリン耐性遺伝子を含んだプラスミドｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ（宝酒造（株）製）１μｇを、ＨａｅＩＩＩで部分分
解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションし
た。このＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１株にマニアチスの方
法(Molecular Cloning)に従って形質転換し、２０μｇ
／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地で生育株
を選択した。図２に示す通りｐＨＹ３００ＰＬＫのグラ
ム陽性菌用複製開始点欠損株はアンピシリン感受性とな
るために、上記選択株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ寒天培地で生育性を調べた。アンピシリン感
受性株数株から前述の方法に従いプラスミドを分離し、
その制限酵素認識部位を調べたところ、図２記載のｐＨ
ＹＤ（２．７ｋｂ）が構築されていることが確認され
た。
【００２６】２）ｐＣＰ５３プラスミド複製開始領域の
クローニング 前述のグラム陽性菌複製開始点検索用ベクターｐＨＹＤ
１μｇをＨｉｎｄＩＩＩで切断したものと、ｐＣＰ５
３ １μｇをＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡを
大腸菌ＨＢ１０１に形質転換し、２０μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＬＢ寒天培地で生育株を選択した。
得られた形質転換体から得られたＤＮＡを１％アガロー
スゲル電気泳動で分析した結果、ｐＣＰ５３由来と思わ
れる様々の大きさのＨｉｎｄＩＩＩ断片がｐＨＹＤベク
ターに挿入されていることを確認した。
クローニング 前述のグラム陽性菌複製開始点検索用ベクターｐＨＹＤ
１μｇをＨｉｎｄＩＩＩで切断したものと、ｐＣＰ５
３ １μｇをＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。このＤＮＡを
大腸菌ＨＢ１０１に形質転換し、２０μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＬＢ寒天培地で生育株を選択した。
得られた形質転換体から得られたＤＮＡを１％アガロー
スゲル電気泳動で分析した結果、ｐＣＰ５３由来と思わ
れる様々の大きさのＨｉｎｄＩＩＩ断片がｐＨＹＤベク
ターに挿入されていることを確認した。
【００２７】次に、これら各種のプラスミドをラクトバ
チルス・パラカゼイに導入し、４μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンを含むＧＡＭ培地で生育株をスクリーニングし
た。ラクトバチルス・パラカゼイＪＣＭ−８１３０を
１．５ｍＭのグリシンを含むＧＡＭ培地で、３７℃、２
０時間培養後、この培地をさらに新しい１．５ｍＭのグ
リシン含有ＧＡＭ培地で１０倍に希釈し、３７℃で濁度
１．０になるまで培養した。菌体を集菌後、エレクトロ
ポレーション用緩衝液（７ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２７２ｍ
Ｍシュークロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2：ｐＨ７．４）
で洗浄し、１／２０容の同緩衝液に懸濁した。前記各種
プラスミド０．１μｇと前記懸濁菌体０．１ｍｌを混合
後、バイオラッド社製ジーンパルサー用キュベット
（０．１ｃｍキュベット）に入れ氷上で３０分間インキ
ュベートした。その後、ジーンパルサーで４．０ｋＶ／
ｃｍ、２５μＦの条件でエレクトロポレーションした。
菌体を１０倍量のＧＡＭ培地で希釈後、３７℃で１時間
インキュベートし、４μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを
含むＧＡＭ寒天培地で陽性クローンを選択した。得られ
た形質転換体についてプラスミドを１％アガロースゲル
電気泳動により分析したところｐＣＰ５３の約２ｋｂの
断片を含む４．７ｋｂのプラスミドの存在が確認され
た。従って、ｐＣＰ５３の約２．０ｋｂＤＮＡ断片にｐ
ＣＰ５３の複製開始領域（Ori-pCP53）が含まれること
が明らかとなった。このベクターは大腸菌あるいはラク
トバチルス属での複製可能なシャトルベクターとしての
利用が可能であり、ｐＣＰ５３Ｄと命名した。一方、こ
の２．０ｋｂＤＮＡ断片を含まないｐＨＹＤ（２．７ｋ
ｂ）ベクターのみではテトラサイクリン形質転換体は得
られなかった。
チルス・パラカゼイに導入し、４μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリンを含むＧＡＭ培地で生育株をスクリーニングし
た。ラクトバチルス・パラカゼイＪＣＭ−８１３０を
１．５ｍＭのグリシンを含むＧＡＭ培地で、３７℃、２
０時間培養後、この培地をさらに新しい１．５ｍＭのグ
リシン含有ＧＡＭ培地で１０倍に希釈し、３７℃で濁度
１．０になるまで培養した。菌体を集菌後、エレクトロ
ポレーション用緩衝液（７ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２７２ｍ
Ｍシュークロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2：ｐＨ７．４）
で洗浄し、１／２０容の同緩衝液に懸濁した。前記各種
プラスミド０．１μｇと前記懸濁菌体０．１ｍｌを混合
後、バイオラッド社製ジーンパルサー用キュベット
（０．１ｃｍキュベット）に入れ氷上で３０分間インキ
ュベートした。その後、ジーンパルサーで４．０ｋＶ／
ｃｍ、２５μＦの条件でエレクトロポレーションした。
菌体を１０倍量のＧＡＭ培地で希釈後、３７℃で１時間
インキュベートし、４μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを
含むＧＡＭ寒天培地で陽性クローンを選択した。得られ
た形質転換体についてプラスミドを１％アガロースゲル
電気泳動により分析したところｐＣＰ５３の約２ｋｂの
断片を含む４．７ｋｂのプラスミドの存在が確認され
た。従って、ｐＣＰ５３の約２．０ｋｂＤＮＡ断片にｐ
ＣＰ５３の複製開始領域（Ori-pCP53）が含まれること
が明らかとなった。このベクターは大腸菌あるいはラク
トバチルス属での複製可能なシャトルベクターとしての
利用が可能であり、ｐＣＰ５３Ｄと命名した。一方、こ
の２．０ｋｂＤＮＡ断片を含まないｐＨＹＤ（２．７ｋ
ｂ）ベクターのみではテトラサイクリン形質転換体は得
られなかった。
【００２８】
【実施例３】 （ラクトバチルス・ヘルベティカス株のｐＣＰ５３Ｄに
よる形質転換）ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ６
１１株（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号Ｆ
ＥＲＭ−１５４１８）へ前記ｐＣＰ５３Ｄを用いての形
質転換を検討した。ラクトバチルス・ヘルベティカスＣ
Ｐ６１１株を１．５ｍＭのグリシンを含むＧＡＭ培地
で、３７℃、２０時間培養後、この培地をさらに新しい
１．５ｍＭのグリシン含有ＧＡＭ培地で１０倍に希釈
し、３７℃で濁度１．０になるまで培養した。菌体を集
菌後、エレクトロポレーション用緩衝液（７ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、２７２ｍＭシュークロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ
2：ｐＨ７．４）で洗浄し、１／２０容の同緩衝液に懸
濁した。ｐＣＰ５３Ｄ ０．１μｇと前記懸濁菌体０．
１ｍｌとを混合後、前記と同様の条件にてエレクトロポ
レーションした。菌体を１０倍量のＧＡＭ培地で希釈し
て３７℃で１時間インキュベート後、４μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＧＡＭ寒天培地で陽性クローンを
選択した。約６日後、５０００個／μｇＤＮＡの割合で
形質転換体が得られた。この形質転換体は、１０μｇ／
ｍｌのテトラサイクリン濃度において、５０％生残性を
示した。
よる形質転換）ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰ６
１１株（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号Ｆ
ＥＲＭ−１５４１８）へ前記ｐＣＰ５３Ｄを用いての形
質転換を検討した。ラクトバチルス・ヘルベティカスＣ
Ｐ６１１株を１．５ｍＭのグリシンを含むＧＡＭ培地
で、３７℃、２０時間培養後、この培地をさらに新しい
１．５ｍＭのグリシン含有ＧＡＭ培地で１０倍に希釈
し、３７℃で濁度１．０になるまで培養した。菌体を集
菌後、エレクトロポレーション用緩衝液（７ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、２７２ｍＭシュークロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ
2：ｐＨ７．４）で洗浄し、１／２０容の同緩衝液に懸
濁した。ｐＣＰ５３Ｄ ０．１μｇと前記懸濁菌体０．
１ｍｌとを混合後、前記と同様の条件にてエレクトロポ
レーションした。菌体を１０倍量のＧＡＭ培地で希釈し
て３７℃で１時間インキュベート後、４μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含むＧＡＭ寒天培地で陽性クローンを
選択した。約６日後、５０００個／μｇＤＮＡの割合で
形質転換体が得られた。この形質転換体は、１０μｇ／
ｍｌのテトラサイクリン濃度において、５０％生残性を
示した。
【００２９】得られた形質転換体について、プラスミド
を１％アガロースゲル電気泳動により分析したところｐ
ＣＰ５３の約２ｋｂの断片を含む４．７ｋｂのプラスミ
ドの存在が確認された。さらに、ここで得られた形質転
換体を繰り返し継代しても、プラスミドが安定に保持さ
れることが確認された。従って、このベクターはラクト
バチルス・ヘルベティカス種の形質転換において有用な
シャトルベクターであり、ラクトバチルス・ヘルベティ
カスＣＰ６１１株を用いることで効率的形質転換が可能
であった。
を１％アガロースゲル電気泳動により分析したところｐ
ＣＰ５３の約２ｋｂの断片を含む４．７ｋｂのプラスミ
ドの存在が確認された。さらに、ここで得られた形質転
換体を繰り返し継代しても、プラスミドが安定に保持さ
れることが確認された。従って、このベクターはラクト
バチルス・ヘルベティカス種の形質転換において有用な
シャトルベクターであり、ラクトバチルス・ヘルベティ
カスＣＰ６１１株を用いることで効率的形質転換が可能
であった。
【図１】図１は、本発明のプラスミドｐＣＰ５３の制限
酵素地図である。
酵素地図である。
【図２】図２は、本発明のプラスミドｐＣＰ５３Ｄの構
築経路の説明図である。
築経路の説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225）
Claims (3)
- 【請求項１】 下記式化１で示される制限酵素認識部位
を有し、約１１．５ｋｂ長であるプラスミドｐＣＰ５
３。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１記載のプラスミドｐＣＰ５３の
複製開始領域、細菌由来の複製開始領域、及びマーカー
遺伝子を含むプラスミドベクター。 - 【請求項３】 請求項１記載のプラスミドｐＣＰ５３の
ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む約２ｋｂ長の複製開始領域、
大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７の複製開始領域、及びス
トレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐
性遺伝子を含み、下記式化２に示される制限酵素認識部
位を有し、約４．７ｋｂ長であるプラスミドベクターｐ
ＣＰ５３Ｄ。 【化２】
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02365196A JP3746556B2 (ja) | 1996-02-09 | 1996-02-09 | プラスミド及びプラスミドベクター |
| US08/795,345 US5766940A (en) | 1996-02-09 | 1997-02-04 | Plasmid and plasmid vector |
| EP97300783A EP0787800A3 (en) | 1996-02-09 | 1997-02-07 | Plasmid and plasmid vector from Lactobacillus helveticus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02365196A JP3746556B2 (ja) | 1996-02-09 | 1996-02-09 | プラスミド及びプラスミドベクター |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09206077A true JPH09206077A (ja) | 1997-08-12 |
| JP3746556B2 JP3746556B2 (ja) | 2006-02-15 |
Family
ID=12116444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02365196A Expired - Fee Related JP3746556B2 (ja) | 1996-02-09 | 1996-02-09 | プラスミド及びプラスミドベクター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5766940A (ja) |
| EP (1) | EP0787800A3 (ja) |
| JP (1) | JP3746556B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014262A2 (en) * | 1998-09-09 | 2000-03-16 | Genzyme Corporation | Methylation of plasmid vectors |
| JP2002193817A (ja) * | 2000-12-28 | 2002-07-10 | Calpis Co Ltd | 整腸剤 |
| JP5504521B2 (ja) * | 2008-10-06 | 2014-05-28 | 日本マイクロバイオファーマ株式会社 | シュードノカルディア・オートトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）発現ベクター |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1142481B2 (en) * | 1999-01-11 | 2009-09-02 | Calpis Co., Ltd. | Process for producing fermented milk containing angiotensin converting enzyme inhibitory peptide and process for producing milk serum |
| FI113741B (fi) | 1999-11-01 | 2004-06-15 | Valio Oy | Menetelmä verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi |
| WO2003008556A2 (en) * | 2001-07-18 | 2003-01-30 | Expressive Constructs, Inc. | A vector containing an enhanced p15a origin of replication |
| KR101445903B1 (ko) | 2007-05-02 | 2014-09-29 | 메리얼 리미티드 | 향상된 발현 및 안정성을 갖는 ｄｎａ 플라스미드 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0630969A1 (en) * | 1993-06-21 | 1994-12-28 | Communaute Economique Europeenne (Cee) | Vectors containing nucleotide sequences of a plasmid isolated from Lactobacillus curvatus, proteins coded by the genome of these vectors, and the use of such vectors in processes for the production of polypeptides |
-
1996
- 1996-02-09 JP JP02365196A patent/JP3746556B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-02-04 US US08/795,345 patent/US5766940A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-07 EP EP97300783A patent/EP0787800A3/en not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014262A2 (en) * | 1998-09-09 | 2000-03-16 | Genzyme Corporation | Methylation of plasmid vectors |
| WO2000014262A3 (en) * | 1998-09-09 | 2000-06-29 | Genzyme Corp | Methylation of plasmid vectors |
| EP1832657A1 (en) * | 1998-09-09 | 2007-09-12 | Genzyme Corporation | Methylation of plasmid vectors |
| JP2002193817A (ja) * | 2000-12-28 | 2002-07-10 | Calpis Co Ltd | 整腸剤 |
| JP5504521B2 (ja) * | 2008-10-06 | 2014-05-28 | 日本マイクロバイオファーマ株式会社 | シュードノカルディア・オートトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）発現ベクター |
| US9006412B2 (en) | 2008-10-06 | 2015-04-14 | Microbiopharm Japan Co., Ltd. | Expression vector for pseudonocardia autotrophica |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0787800A3 (en) | 1999-09-01 |
| JP3746556B2 (ja) | 2006-02-15 |
| EP0787800A2 (en) | 1997-08-06 |
| US5766940A (en) | 1998-06-16 |
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