JP5504521B2

JP5504521B2 - シュードノカルディア・オートトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）発現ベクター

Info

Publication number: JP5504521B2
Application number: JP2010532898A
Authority: JP
Inventors: 良和藤井; 匡藤井; 章有澤; 具博田村
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Microbiopharm Japan Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Microbiopharm Japan Co Ltd
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2009-10-05
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2029-10-05
Also published as: EP2341137B1; EP2341137A1; US9006412B2; WO2010041619A1; EP2341137A4; JPWO2010041619A1; US20110262978A1

Description

本発明は、シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）中で外来遺伝子を発現し得る発現ベクター、その発現ベクターを用いたシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換体、及びその形質転換体を用いた組換えタンパク質の製造方法に関する。
さらに本発明は、上記発現ベクター及び形質転換体を利用した活性型ビタミンD類及びプラバスタチンの製造方法に関する。

シュードノカルディア・オートトロフィカは放線菌の一種であり、ビタミンD3をはじめとするビタミンD類を不活性型から活性型へ変換する能力を持っていることが知られている（K. Takeda, J. Ferment. Bioeng., 78(5), 380-382(1994)；非特許文献１）。
生体内の合成系で合成されるビタミンD3は、通常不活性型であり、そのままではほとんど生理活性を示さない。不活性型のビタミンD3は、肝臓や腎臓でその25位及び1α位がそれぞれ水酸化され、種々の生理活性を示す活性型ビタミンD3（1α，25-ジヒドロキシビタミンD3）へと変換される。したがって、不活性型から活性型への水酸化反応はビタミンD3の機能発現において特に重要なステップである。
活性型ビタミンD3は体内でのカルシウム吸収や骨組織へのカルシウムの沈着を促進することが知られており、ビタミンD3の欠乏は骨粗しょう症等のカルシウム代謝異常に起因する種々の疾患を引き起こす。さらに近年では、活性型ビタミンD3が細胞分化誘導や免疫調節にも関与することが注目されている。このため、活性型ビタミンD3はカルシウム代謝、細胞分化、免疫調節等の異常に起因する疾患の改善、治療薬として利用することができる。
このように活性型ビタミンD3は、種々の疾患治療薬として利用できるが、工業的に生産する場合、化学合成では製造工程が複雑で収率も低いという問題がある。そのため、より効率的な活性型ビタミンD3の製造方法の確立が望まれている。

近年、高齢化や食事の欧米化に伴い、冠状動脈の硬化により引き起こされる虚血性心疾患が増加している。虚血性心疾患の発症率は、血清コレステロール値が一定水準を越えた場合に増加することが知られている（W. B. Kannel, Ann. Inntern. Med., 74, 1(1971)；非特許文献２）。生体内のコレステロールは、食事から吸収されるものと体内で生合成されるものがあり、ヒトの場合、生合成される量が食事から吸収される量の３〜４倍多いと報告されている（J. M. Dietschy, N. Engl. J. Med., 282, 1179(1970) ；非特許文献３）。従って、コレステロールの生合成を抑制すれば、血清コレステロール値が低下し虚血性心疾患の予防及び治療効果が得られると期待される。

コレステロール生合成の鍵酵素である3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（HMG-CoA）還元酵素の阻害剤としてコンパクチン及びその6β位水酸化体であるプラバスタチンが発見された（特公昭61-13699号公報（US4346227他）（特許文献１）、米国特許第4346227号明細書（特許文献２）、同第4410629号明細書（特許文献３）及び同第4448979号明細書（特許文献４））。プラバスタチンは優れたコレステロールの生合成阻害活性及び臓器選択的阻害活性を示すことから、動脈硬化等の虚血性心疾患を治療または予防する抗高脂血症剤として用いられている。

プラバスタチンを合成する方法としては、コンパクチンを原料として、その6β位を水酸化してプラバスタチンに変換する微生物学的方法が知られている（特公昭62-54476号公報（US4346227他）（特許文献５）、米国特許第4346227号明細書（特許文献２）、同第4410629号明細書（特許文献３）、同第4448979号明細書（特許文献４）及び同第5179013号明細書（特許文献６））。しかし、これらの微生物学的方法では、プラバスタチンの生成能力、生産効率の点で十分と言えるものではなく、より効率的なプラバスタチン製造法の確立が望まれている。

コンパクチンからプラバスタチンへの反応はビタミンD3から活性型ビタミンD3への反応と同様に水酸化であり、活性型ビタミンD3の工業生産に使用されるシュードノカルディア・オートトロフィカ（K.Takeda,J.Ferment.Bioeng.,78(5), 380-382(1994)；非特許文献１）を用いれば効率の良いプラバスタチン生産システムができることが期待されていた。しかし、これまでに、シュードノカルディア・オートトロフィカを宿主とする発現ベクターは報告されていなかった。

特公昭61-13699号公報米国特許第4346227号明細書米国特許第4410629号明細書米国特許第4448979号明細書特公昭62-54476号公報米国特許第5179013号明細書

K. Takeda, J. Ferment. Bioeng., 78(5), 380-382(1994) W. B. Kannel, Ann. Inntern. Med., 74, 1(1971) J. M. Dietschy, N. Engl. J. Med., 282, 1179(1970)

本発明は、シュードノカルディア・オートトロフィカ中で外来遺伝子を発現し得る発現ベクター、その発現ベクターを用いたシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換体、及びその形質転換体を用いたタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
さらに本発明は、上記発現ベクター及び形質転換体を用いて、形質転換体内で活性型ビタミンD3合成に関与する酵素をコードしている遺伝子を高度に発現させ、ビタミンD3から活性型ビタミンD3を製造する方法に関する。また、本変換酵素はビタミンD2の25位水酸化活性も有しているため、本発明はビタミンD2から25-ヒドロキシビタミンD2を製造する方法に関する。
さらに本発明は、上記発現ベクター及び形質転換体を用いて、形質転換体内でコンパクチン水酸化酵素遺伝子を高度に発現させ、コンパクチンからプラバスタチンを製造する方法に関する。

最近、化学合成による活性型ビタミンD3の製造に代わって、微生物を利用した活性型ビタミンD3の製造が注目されている。これは、ビタミンD3を不活性型から活性型へ変換する能力を持っている微生物に不活性型ビタミンD3を与えて、菌体内で活性型ビタミンD3を産生させ、それを取出し精製するものである。利用されている微生物の一種にシュードノカルディア・オートトロフィカがある。
水酸化反応を触媒する酵素としては、シトクロムP450群の酵素が知られており、種々の菌類からもシトクロムP450ファミリーに属する酵素が発見されている。

本発明者らは、シュードノカルディア・オートトロフィカを用いた活性型ビタミンD類の製造を、さらに効率化すべく鋭意検討を重ねた結果、活性化ビタミンD類の合成に関与する酵素遺伝子をシュードノカルディア・オートトロフィカの細胞内に導入、形質転換し、形質転換体内で酵素タンパク質を発現させることで、より効率的に活性型ビタミンD類を製造できることを見出した。

また、シュードノカルディア・オートトロフィカを宿主としたプラバスタチンの製造法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、プラバスタチン合成に関与する酵素遺伝子をシュードノカルディア・オートトロフィカの細胞内に導入し、形質転換体内で酵素タンパク質を発現させることで、高効率なプラバスタチン製造法が確立できた。
これまでシュードノカルディア・オートトロフィカを宿主とする発現ベクターは知られていなかったので本発明者らは、今回新たにシュードノカルディア・オートトロフィカ内に目的の遺伝子を導入、発現させることができる発現ベクターを構築した。さらに目的タンパク質を形質転換体内で効率的に生産するため、簡便な方法で目的遺伝子の発現を誘導できる新規プロモーターを構築し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下の［１］〜［１２］に関する。
［１］シュードノカルディア・オートトロフィカ由来の複製開始領域、外来性遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイト、該マルチクローニングサイトに挿入された外来性遺伝子、プロモーター、ターミネータ、及び欠陥選択マーカーを含有し、シュードノカルディア・オートトロフィカ細胞内で自律複製し、導入された外来性遺伝子の発現を可能とする発現ベクター。
［２］前記複製開始領域が、配列番号４９で表される塩基配列もしくはその相補配列、または当該塩基配列に対して80％以上の相同性を有する塩基配列もしくはその相補配列からなる前記［１］記載の発現ベクター。
［３］前記プロモーターがアセトンによって誘導され、外来性遺伝子を発現する前記［１］または［２］記載の発現ベクター。
［４］前記プロモーター領域が、配列番号２６で表される塩基配列もしくはその相補配列、または当該塩基配列に対して80％以上の相同性を有する塩基配列もしくはその相補配列からなる前記［３］記載の発現ベクター。
［５］大腸菌由来の複製開始領域をさらに含有し、シュードノカルディア・オートトロフィカ及び大腸菌内のいずれにおいても自律複製を可能とし、シャトルベクターとして用いることができる前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の発現ベクター。
［６］ oriT領域を有し、大腸菌S17-1とシュードノカルディア・オートトロフィカの接合により形質転換できる前記［５］記載の発現ベクター。
［７］前記外来性遺伝子がビタミンD水酸化酵素をコードする遺伝子またはコンパクチン水酸化酵素をコードする遺伝子である前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の発現ベクター。
［８］前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の発現ベクターが導入されたシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換体。
［９］前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の発現ベクターをシュードノカルディア・オートトロフィカに導入して形質転換し、得られた形質転換体内で前記外来性遺伝子を発現させ、タンパク質を産生することを特徴とするタンパク質の製造方法。
［１０］外来性遺伝子としてビタミンD水酸化酵素遺伝子が挿入された前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて、該ベクターでシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換し、得られた形質転換体を用いることを特徴とする活性型ビタミンD類の製造方法。
［１１］活性型ビタミンD類が、25-ヒドロキシビタミンD2、25-ヒドロキシビタミンD3、または1α，25-ジヒドロキシビタミンD3である前記［１０］に記載の活性型ビタミンD類の製造方法。
［１２］外来性遺伝子としてコンパクチン水酸化酵素遺伝子が挿入された前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて、該ベクターでシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換し、得られた形質転換体を用いてコンパクチンからプラバスタチンを製造することを特徴とするプラバスタチンの製造方法。

本発明の発現ベクターは、シュードノカルディア・オートトロフィカ内で自律複製を可能とする複製開始領域を有しているため、目的の遺伝子をシュードノカルディア・オートトロフィカに導入し、発現させることができる。
また、本発明の発現ベクターを導入したシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換体を用いれば、形質転換体内で活性型ビタミンD3合成に関与する酵素遺伝子を高度に発現させることが可能となるため、従来のシュードノカルディア・オートトロフィカを利用した活性型ビタミンD3生産系よりも高効率かつ高収率でビタミンD3から活性型ビタミンD3を製造することができる。
また、本発明の発現ベクターを導入したシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換体を用いれば、形質転換体内でプラバスタチン合成に関与する酵素遺伝子を高度に発現させることが可能となるため、シュードノカルディア・オートトロフィカを利用して高効率かつ高収率でコンパクチンからプラバスタチンを製造することができる。

プラスミドpTNR-oriT-rep1とプラスミドpTNR-oriT-rep2のベクターを示す模式図。複製開始領域の同定を示す表。アセトン誘導タンパク質の同定を示す２次元電気泳動像。 aceR遺伝子からaceA遺伝子までの領域の配列（AceR-Pace-AceA; 配列番号２７）を示す遺伝子地図。 VDH発現ベクター構築を示す図。図５Ｂへ続く。図５Ａからの続き。VDH発現ベクター構築を示す図。 BoxAB発現ベクター構築を示す図。還元−酸化炭素結合スペクトル解析によるVDH発現試験結果を示すグラフ。還元−酸化炭素結合スペクトル解析によるBoxA発現試験結果を示すグラフ。コンパクチンからプラバスタチンへの変換を示す図。 BoxAB発現株によるコンパクチン製造試験結果を示すグラフ。プラバスタチン生産を示すグラフ。

以下、本発明の発現ベクター、形質転換体、タンパク質の製造方法についてさらに詳細に説明する。
１．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、シュードノカルディア・オートトロフィカ由来の複製開始領域、外来性遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイト、該マルチクローニングサイトに挿入された外来性遺伝子、プロモーター、ターミネータ、及び欠陥選択マーカーを含有し、シュードノカルディア・オートトロフィカ細胞内で自律複製し、導入された外来性遺伝子の発現を可能とする発現ベクターである。

（１）複製開始領域の同定
はじめに、本発明の発現ベクターが有するシュードノカルディア・オートトロフィカの複製開始領域について説明する。
本発明において「複製開始領域」とは、シュードノカルディア・オートトロフィカ細胞内でプラスミドが複製されるために必須な領域のことをいう（以下、本明細書において「複製必須領域」ともいう。）。つまり、「複製開始領域」を含むプラスミドはシュードノカルディア・オートトロフィカ細胞内で複製され、細胞分裂に際しても娘細胞へ分配され、そこで複製される。

複製開始領域を同定するためには、シュードノカルディア属細菌が保持するプラスミドを単離して、そのプラスミド中の複製開始領域を同定すればよい。これまでに分離、保存されているシュードノカルディア（Pseudonocardia）属細菌をカルチャーコレクション等から集め、培養してプラスミド抽出を行い、プラスミドを保持する菌株を同定する。抽出されたそのプラスミドのDNA配列を決定し、相同性検索により複製開始領域を予測する。その領域を挿入したプラスミドによりシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換して、そのプラスミドが保持されることを確認することにより複製開始領域は同定される。

上記方法により、配列番号４９で表されるシュードノカルディア・オートトロフィカ由来の複製開始領域の塩基配列が得られる。
本発明の発現ベクターが有するシュードノカルディア・オートトロフィカ由来の複製開始領域としては、配列番号４９で表される塩基配列もしくはその相補配列、または当該塩基配列に対して80％以上、より好ましくは90％以上の相同性を有する塩基配列もしくはその相補配列が好ましい。

（２）発現ベクターの構築
本発明の発現ベクターは、前記シュードノカルディア・オートトロフィカ由来の複製開始領域、外来性遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイト、該マルチクローニングサイトに挿入された外来性遺伝子、プロモーター、ターミネータ、及び欠陥選択マーカーを含むよう構築する。
本発明の発現ベクターに用いるマルチクローニングサイト及びターミネータは、特に制限はなく、プロモーターについてはアセトン誘導型プロモーター、チオストレプトン誘導型プロモーター（N. Nakashima, Appl. Environ. Microbiol., 5557-5568(2004)）、ermEプロモーター（T. Schmitt-John, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 493-498(1992)）等が利用可能である。また、欠陥選択性マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アプラマイシン耐性遺伝子等微生物を宿主とした一般的なプラスミドに使用されるものは利用可能である。

本発明の発現ベクターを用いることで、目的の外来性遺伝子をシュードノカルディア・オートトロフィカに導入し、形質転換することができる。また、本発明の発現ベクターを用いることで、外来性遺伝子をシュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換体内で発現させ、目的とするタンパク質等の遺伝子産物を産生させることができる。

２．プロモーター
本発明の発現ベクターが有するプロモーターに特に制限はないが、アセトンによって誘導されるシュードノカルディア・オートトロフィカ由来のプロモーター配列を有することが好ましい。
本発明の発現ベクターが上記アセトン誘導型プロモーターを有することで、アセトンの添加により目的遺伝子の発現を誘導でき、安価で簡便な手法で目的タンパク質を高い収率で得ることができる。

（１）アセトン誘導型プロモーターの同定
まず、シュードノカルディア・オートトロフィカ由来のプロモーターであって、簡便かつ安価に目的遺伝子を誘導可能なプロモーターとして、アセトンにより誘導されるプロモーターの同定を行う。
シュードノカルディア・オートトロフィカの培養液にアセトンを1％（v/v）添加して、さらに培養し、アセトンを添加しない場合と比較して高度に誘導されるタンパク質を二次元電気泳動でバンドとして同定する。そのバンドのアミノ酸配列を解析し、そのタンパク質をコードする遺伝子解析を行うとともに、そのタンパク質をコードする遺伝子の上流に存在するプロモーター配列を同定すればアセトン誘導プロモーターは同定できる。

上述の方法により、配列番号２６で表されるシュードノカルディア・オートトロフィカ由来のアセトン誘導型プロモーター配列が得られた。
本発明の発現ベクターが有するプロモーター配列としては、配列番号２６で表される塩基配列もしくはその相補配列、または当該塩基配列に対して80％以上、より好ましくは90％以上の相同性を有する塩基配列もしくはその相補配列が好ましい。

（２）アセトン誘導型発現ベクターの構築
アセトン誘導型ベクターはプラスミド中のマルチクローニングサイトの上流にアセトン誘導プロモーターを挿入して構築される。構築されたアセトン誘導型ベクターにより形質転換された株は、2日間程度培養し、0.5％もしくは1％のアセトンを培養液に添加するとマルチクローニングサイトに挿入した遺伝子が高発現する。

本発明のアセトン誘導型発現ベクターは、上述のアセトン誘導型プロモーター配列を有しているため、発現系にアセトンを添加することによって、該プロモーター領域の下流に挿入された外来性遺伝子をシュードノカルディア・オートトロフィカ内で誘導的かつ高い効率で発現することができる。

３．シャトルベクターの構築
本発明の発現ベクターは、複数の宿主細胞に適合させるために複合ベクター（シャトルベクター）とすることができる。
本発明においてシャトルベクターとして、例えば、大腸菌及びシュードノカルディア・オートトロフィカのいずれにも導入可能でこれらの宿主細胞中で外来遺伝子を発現し得るベクターが挙げられる。
本発明の発現ベクターをシャトルベクターとして用いる場合、上述のシュードノカルディア・オートトロフィカ由来の複製開始領域に加えて、大腸菌由来の複製開始領域をさらに含有し、シュードノカルディア・オートトロフィカ及び大腸菌内のいずれにおいても自律複製が可能な発現ベクターとすることが好ましい。前記大腸菌由来の複製開始領域として、図６に示すori for E.coli（配列番号４６の2372から3487番目の塩基配列）が好ましい。

シャトルベクターは大腸菌とシュードノカルディア・オートトロフィカにおけるそれぞれの複製開始領域を含むプラスミドを構築すれば作製できる。図６においてori for E.coliとrep5がそれらにあたる。
大腸菌とシュードノカルディア・オートトロフィカの接合には、ベクター中に接合領域を含有することが好ましく、例えば、大腸菌S17-1とシュードノカルディア・オートトロフィカにおいては、oriT領域を有することで接合し形質転換できる。

４．外来性遺伝子
本発明の発現ベクターは外来性遺伝子を含有する。本発明に用いることができる外来性遺伝子として特に制限はなく、例えば、ビタミンD水酸化酵素をコードする遺伝子、コンパクチン水酸化酵素をコードする遺伝子に代表されるシトクロムP450遺伝子やその他化合物の変換に用いられる加水分解酵素、脱水素酵素等が挙げられる。その中でも、ビタミンD水酸化酵素をコードする遺伝子、コンパクチン水酸化酵素をコードする遺伝子等のシトクロムP450遺伝子が好ましい。

５．形質転換体の構築
次に、本発明の発現ベクターを用いたシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換体の構築について説明する。
本発明の形質転換体は、上記本発明の発現ベクターをシュードノカルディア・オートトロフィカに導入することで得られる。
本発明においてベクターの導入方法は、特に制限されないが、公知の遺伝子工学的手法が利用でき、接合、プロトプラスト法、コンピテントセル、エレクトロポレーション法などが好ましく用いられる。中でも、接合、プラトプラスト法がより好ましい。例えば、本発明の発現ベクターが上述のシャトルベクターである場合、最初に発現ベクターを大腸菌S17-1に導入、形質転換し、得られた大腸菌S17-1の形質転換体とシュードノカルディア・オートトロフィカとを用いて接合によりシュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換体を得ることができる。

まず、本発明の発現ベクターにより形質転換された大腸菌S17-1株とシュードノカルディア・オートトロフィカをそれぞれ対数増殖期になるまで培養し、培養液を混合する。低速遠心により菌体を沈殿させ、その菌体を抗生物質の入っていないLB平板培地で1日間培養し接合させる。その菌体をかき取って、抗生物質入りのLB平板培地で培養して形質転換体を選択する。このときに形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカのみが生育するように、大腸菌の生育を阻害するナリジクス酸をＬＢ平板培地へ添加しておく。

６．形質転換体を用いたタンパク質の製造方法
本発明の発現ベクターを用いて、シュードノカルディア・オートトロフィカに外来性遺伝子を導入し、得られたシュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換体内で外来性遺伝子を発現させることで目的のタンパク質を製造することができる。
形質転換体内で、目的遺伝子を発現させタンパク質を得る手法としては、発現ベクターの持つプロモーター等の性質により、適宜公知の手法を選択、使用することができる。

（１）形質転換体を用いた活性型ビタミンD類の製造方法
次に、本発明の発現ベクター及び形質転換体を用いた活性型ビタミンD類の製造方法について説明する。
本発明におけるビタミンD類とは、ビタミンD3、ビタミンD2などを意味する。
本発明の活性型ビタミンD類の製造方法は、上述の発現ベクターにビタミンD水酸化酵素遺伝子を挿入し、該ベクターでシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換し、得られた形質転換体内で該ビタミンD水酸化酵素遺伝子を誘導発現させ、ビタミンD類を活性型ビタミンD類へと変換することによって活性型ビタミンD類を製造するものである。
ビタミンD類に対して活性型ビタミンD類は、その25位及び1α位がそれぞれヒドロキシ化された構造を有し、具体的には活性型ビタミンD3は、25-ヒドロキシビタミンD3、または1α，25-ジヒドロキシビタミンD3であり、活性型ビタミンD2は、25-ヒドロキシビタミンD2である。

その際ビタミンD水酸化酵素としては、これまでにビタミンD3の水酸化を触媒することが報告されてきたシュードノカルディア・オートトロフィカ由来のVDH、ストレプトマイセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）由来のP450SU-1、哺乳類由来のCYP2R1、CYP27A1やCYP27B1が利用可能である（N. Sawada, Biochem. Biophys. Res. Commun., 320, 156-164(2004)、E. Uchida, Biochem. Biophys. Res. Commun., 320, 156-164(2004)、N. Strushkevich, J. Mol. Biol., 380, 95-106(2008)）。その中でも、シュードノカルディア・オートトロフィカを用いた活性型ビタミンD3製造の原因酵素であるVDHを使用するのが好ましい。

シュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換体を用いた活性型ビタミンD類製造法は野生型シュードノカルディア・オートトロフィカによる活性型ビタミンD類製造法にアセトンによる誘導操作を加えて確立した。ビタミンD水酸化酵素をマルチクローニングサイトへ挿入した発現ベクターで形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカを2日間培養し、1％のアセトンを添加してビタミンD水酸化酵素を誘導発現させ、1日間培養する。その培養液にシクロデキストリンと前もって混合しておいたビタミンD類を添加して変換を行い、活性型ビタミンD類を製造する。

本発明の活性型ビタミンD類の製造方法によれば、シュードノカルディア・オートトロフィカに外来性の水酸化酵素遺伝子を導入し、さらに発現誘導によってシュードノカルディア・オートトロフィカ内で該水酸化酵素遺伝子を高発現させることができるため、従来から行われていた微生物を利用した活性型ビタミンD類生産系よりもさらに効率よく、かつ高収率でのビタミンD類生産が可能となる。

（２）形質転換体を用いたプラバスタチンの製造方法
次に、本発明の発現ベクター及び形質転換体を用いたプラバスタチンの製造方法について説明する。
本発明のプラバスタチンの製造方法は、上述の発現ベクターにコンパクチン水酸化酵素遺伝子を挿入し、該ベクターでシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換し、得られた形質転換体内で該コンパクチン水酸化酵素遺伝子を誘導発現させ、コンパクチンをプラバスタチンへと変換することによってプラバスタチンを製造するものである。
コンパクチン及びプラバスタチンは、コレステロール生合成の阻害物質である。図９に示すように、コンパクチンにヒドロキシ基を導入することでプラバスタチンが得られる。

プラバスタチンはコンパクチン水酸化酵素遺伝子をマルチクローニングサイトへ挿入した該発現ベクターにより形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカの培養液にコンパクチンを添加して変換することにより製造するのが好ましい。
コンパクチン水酸化酵素遺伝子としてストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）TM-7由来のboxAやストレプトマイセス・カルボフィラス（Streptomyces carbophilus）SANK 62585株由来のP450sca-2遺伝子（特開平6-70780号公報）等が使用できる。
シュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換体を用いたプラバスタチン製造法は、シュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換株による活性型ビタミンD類製造法に準じて確立した。コンパクチン水酸化酵素とその下流に存在するP450の電子伝達系タンパク質であるフェレドキシンをコードするboxAB遺伝子をマルチクローニングサイトへ挿入した発現ベクターで形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカを2日間培養し、1％のアセトンを添加してコンパクチン水酸化酵素を誘導発現させ、1日間培養する。その培養液にコンパクチンを終濃度が4000mg/Lとなるように添加して変換を行い、プラバスタチンを製造する。変換されてコンパクチン量が減少したら再度添加して変換させると、13g/Lのプラバスタチンが蓄積した。

本発明のプラバスタチンの製造方法によれば、シュードノカルディア・オートトロフィカに外来性の水酸化酵素遺伝子を導入し、さらに発現誘導によってシュードノカルディア・オートトロフィカ内で該水酸化酵素を高発現させることができるため、従来から行われていた微生物を利用したプラバスタチン生産系よりも効率よく、かつ高収率でのプラバスタチン生産が可能となる。

以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント（％）は、培地の説明においては重量パーセント、HPLCの移動相の説明においては、容量パーセントを示す。

製造例：発現ベクター及び形質転換体の構築
（１）シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）DSM 43082株からのプラスミドの抽出
DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）より入手したシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）25株（DSM535, DSM43082, DSM43083, DSM43084, DSM43085, DSM43086, DSM43087, DSM43088, DSM43090, DSM43091, DSM43094, DSM43095, DSM43096, DSM43097, DSM43098, DSM43099, DSM43100, DSM43102, DSM43103, DSM43104, DSM43105, DSM43106, DSM43107, DSM43129, DSM43558の各株）をLB培地（1.0％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1.0％塩化ナトリウム）へ植菌し、ガラスビーズ（直径5mm）2個存在下に30℃で振とう培養した。培養後、回収した菌体に終濃度1mg/mlリゾチームを含むP1 buffer（Plasmid Miniprep kit、キアゲン社）に懸濁し、37℃で30分反応させた後、P2 bufferを加えて菌を可溶化すると共に、引き続きキットの説明書に従ってプラスミド精製を行った。精製されたDNAをアガロース電気泳動で確認すると、11株（DSM535, DSM43082, DSM43085, DSM43085, DSM43087, DSM43095, DSM43102, DSM43104, DSM43105, DSM43107, DSM43129）よりプラスミド様のDNAバンドが確認された。この中から、DSM43082株, DSM43085株, DSM43095株由来精製プラスミドを制限酵素で処理し、そのDNA切断様式を比較した後、DSM43082株由来DNAプラスミドについてさらに解析を進めた。
なお、シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）DSM43082株は、2005年5月9日（契約日）付でDSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；Inhoffenstrasse 7 B，38124 Braunschweig GERMANY）より分譲・入手したが、サンプリング地、サンプリング日、分離源、分離者、分離日については不明である。

DSM43082株由来プラスミドを制限酵素KpnIで消化し、得られたDNA断片の中から約0.9kbと約2.0kbの各断片をアガロースゲルにより分離・精製し、pBluescript SK(+)（ストラタジーン社）にクローニングした。精製したプラスミドに対してT7及びT3プライマー（配列番号８及び９）を用いてシークエンス反応を行い、クローニングしたDNA断片の部分配列を取得した。続いてこの部分情報をもとに、プライマーを新たに設計しDSM43082株より精製したプラスミドを鋳型にシークエンス解析を行った。シークエンスは、プライマーウォーキング法で行い、センス鎖、アンチセンス鎖ともに塩基配列解析開始点が確認されるまで、すなわち環状DNAであることが確認されるまで解析を繰り返した。その結果、得られたプラスミドppa43082は、8047bpからなる環状DNAであることが判明した（配列番号１２）。

（２）pPA43082配列中に含まれるシュードノカルディア・オートトロフィカでの複製必須領域の同定
配列番号１２に示したシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）DSM43082由来のプラスミドpPA43082のDNA配列中で、4kbから6kb付近にSso (single-strand origin)-like配列（配列番号５２）、Dso (double-strand origin)-like配列（配列番号５１）とReplicase遺伝子（配列番号５０）が存在し、複製様式はRolling circle型（S.A. Khan, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 442-455(1997)）と示唆された（図２）。発現ベクターを作成する上で、複製に必須な領域を含む必要があり、最低限複製に必要な領域の同定を行った。すなわち、このpPA43082を鋳型として様々な長さのDNA断片をPCRで増幅し、そのDNA断片を、pTNR-oriT（K. I. Sallam, Gene, 386, 173-182(2007)）のistAB遺伝子とBsrGIとBglII部位を使用して入れ替え、構築されたプラスミドでシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換可能か試験した。

まず、pTNR-oriTをBsrGIとBglIIで消化して、アガロースゲル電気泳動で約4.0kbのDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）で精製してDNA断片-1を得た。
次に、pPA43082の複製必須領域をPCRで増幅するためにプライマーセットrep-1F（BamHI部位を持つ：配列番号１７）とrep-7R（BsrGI部位を持つ：配列番号１８）、rep-1R（BsrGI部位を持つ：配列番号１９）とrep-7F（BamHI部位を持つ：配列番号２０）を作成した。この2組のプライマーを用いてpPA43082を鋳型としてそれぞれPCR反応を行った。PCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、3分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、それぞれ約2.4kbの長さのDNA断片が増幅された。rep-1Fとrep-7Rから増幅した断片をDNA断片-2、rep-1Rとrep-7Fから増幅した断片をDNA断片-3とした。これらPCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約2.4ｋｂのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収した。回収したDNA断片をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）を用いてDNA断片-1と連結し、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換した。その後、カナマイシン（25μg/ml）を含むLB寒天培地（1.5％寒天）を用いて、形質転換された大腸菌を選択した。こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをカナマイシン（25μg/ml）を含むLB液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system（プロメガ社）を用いてプラスミドDNAの精製を行い、DNA断片-2が挿入されたプラスミドpTNR-oriT-rep1とDNA断片-3が挿入されたプラスミドpTNR-oriT-rep2を得た(図１)。これらpTNR-oriT-rep1とpTNR-oriT-rep2により大腸菌S17-1を形質転換し、形質転換株をカナマイシン25μg/mlを含むLB培地にて37℃で10時間培養した。この大腸菌S17-1形質転換株の培養液200μlとLB培地で30℃、80時間培養したシュードノカルディア・オートトロフィカ培養液500μlを混合し、7000rpmで30秒間遠心した。上清500μlを捨て、残った上清で沈殿を懸濁し、全量LB寒天培地へ塗布した。接合によりpTNR-oriT-rep1及びpTNR-oriT-rep2によりシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換するために30℃で24時間培養した後、2mlのLB培地で寒天培地上の菌体を懸濁し、200μlの懸濁液をカナマイシン200μg/mlとナリジクス酸50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布して、シュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換株を選択した。30℃で10日間培養した結果、pTNR-oriT-rep1によるシュードノカルディア・オートトロフィカ形質転換株は得られたが、pTNR-oriT-rep2では形質転換株は得られなかった。本結果より、pTNR-oriT中における複製必須領域の方向が重要であることが示唆され、今後の複製必須領域の同定ではrep1の方向で検討することとした。

複製必須領域を同定するためにプライマーrep-2F（配列番号２１）、rep-3F（配列番号２２）、rep-4R（配列番号２３）、rep-5R（配列番号２４）、rep-6R（配列番号２５）を作成した。これらのプライマーを図２に示すようなセットで用いてpPA43082を鋳型としてPCRを行った。PCR反応はKOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、3分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、それぞれ図２に示す長さのDNA断片が増幅された。上記と同様にして増幅したDNA断片をpTNR-oriTのBsrGI部位とBglII部位に挿入したプラスミドを作成し、接合によりシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換を試みた。検討した範囲ではrep5（pPA48032の4201から6300番目の塩基；2.1kb）を含むDNA配列がシュードノカルディア・オートトロフィカにおける複製に必須と考えられた。
プラスミドpTNR-oriT-rep5で形質転換したシュードノカルディア・オートトロフィカを200μg/mlカナマイシンと50μg/mlナリジクス酸を含む25mlのLB培地で30℃、72時間培養した。その培養液7mlを遠心し、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification system（プロメガ社）を用いプラスミドDNAの精製を行い、プラスミド-1を得た。このプラスミド溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、バンドが見られなかったが、このプラスミド溶液を用いて大腸菌DH5α（タカラバイオ社）を形質転換すると25μg/mlカナマイシンを含むLB寒天培地上でコロニーが得られた。このコロニーを25μg/mlカナマイシンを含むLB培地で培養し、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification system（プロメガ社）を用いプラスミドDNAの精製を行い、プラスミド-2を得た。pTNR-oriT-rep5と抽出したプラスミド-2をそれぞれBsrGIとBglIIで消化すると、両サンプルで5.1kbと1.1kbのDNA断片が得られ、この結果よりpTNR-oriT-rep5はシュードノカルディア・オートトロフィカ中でプラスミドが構造変化を受けず、保持されていたことが示唆された。

（３）アセトン誘導プロモーター配列の同定
シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株を150mlのLB培地に植菌し、220rpmで振とうしながら30℃で102時間培養した。なお、シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株は、1987年以前にIFO（財団法人発酵研究所，現NBRC（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門；〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8））より分譲・入手したが、サンプリング地、サンプリング日、分離源、分離者、分離日については不明である。この培養液10mlを2本用意した200mlのLB培地へそれぞれ植菌し、220rpmで振とうしながら30℃で70時間培養した。2本の培養液の一方へ1mlのアセトンを加え、さらに220rpmで振とうしながら30℃で24時間培養した。これらの培養液を7000rpmで10分間遠心して沈殿として菌体を得た。そこへ20mlのCV緩衝液（50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4、10％ Glycerol）を加え、懸濁して10倍に濃縮された細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液1mlをFastPROTEIN BLUE kit（フナコシ社）を用いて、FastPrep FP120（BIO101, SAVANT社）によりスピード6.0で40秒間激しくサンプルを振る操作を3回繰り返して細胞を破砕した。この細胞破砕液を13000rpmで10分間遠心し、無細胞抽出液を上清として得た。各サンプル25μlをBromophenol Blue（BPB）を含む膨潤液（7M Urea、2M Thiourea、20mM Dithiothreitol（DTT）、2mM Tris-(2-cyanoethyl)phosphine、2% CHAPS、0.2% (v/v) BioLyte 3-10）と混合して２次元電気泳動用のサンプルとした。2次元電気泳動用サンプル125μlにてIPG ReadyStripゲル(7cm、pH3-10NL、BIO-RAD社；以下IPGゲルという)を12時間膨潤した。このゲルを泳動（1次元目、等電点電気泳動）した後、IPGゲルを平衡化緩衝液A（50mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5、6M Urea、30％ Glycerol、2％ SDS、1％ DTT、0.005％ BPB）にて15分間、引き続き平衡化緩衝液B（50mMトリス緩衝液 pH8.5、6M Urea、30% Glycerol、2% SDS、4.5％ Iodoacetamide、0.005％ BPB）にて15分間平衡化を行った。その後、平衡化したIPGゲルを12.5％均一ゲル（7×6.5cm）にセットし、2次元目の泳動を行った（2次元目、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）。泳動後のゲルをSYPRO Ruby（インビトロジェン社）にて染色し、Molecular Imager FX (BIO-RAD社)にて画像の取り込みを行った。その後、目視にて各サンプル間のスポットパターンの比較を行った。その結果、アセトンの添加によって発現が増加しているタンパク質のバンドが３種観察された（図３：スポット1から3）。分子量が約55kDaと推測されるスポット1がアセトン添加により最も発現量が増加していたので、このタンパクバンドの部分のゲルを切り出し、そのゲル片にリジルエンドぺプチダーゼを含むトリス緩衝液pH8.5を加えて35℃、20時間の処理を行った。その後、溶液の全量を逆相HPLCに供して、断片ペプチドを分離した。対照として、スポットの無いゲル部分を切り出して同様に処理した。

［逆相HPLC条件］
カラム：TSKgel ODS-80Ts（2.0×250mm，TOSOH社）、
溶媒Ａ：0.1％トリフルオロ酢酸、2％アセトニトリル、
溶媒Ｂ：0.1％トリフルオロ酢酸、90％アセトニトリル、
流速：200μl/min、
温度：室温、
検出：210nm、280nm、
グラジエント：

分取：200μl/Fraction。

逆相HPLCで得られたスポット1由来と考えられる5つのピークをそれぞれProcise 494 HT Protein Sequence System（アプライドバイオシシテム社）でアミノ酸配列を解析した。その結果、配列番号１から５に示したアミノ酸配列が得られた。これらのアミノ酸配列はBLAST検索によるホモロジーサーチの結果、各種アルデヒドデヒドロゲナーゼの内部配列と高い相同性を示した。
アセトンで誘導されたスポット1のタンパク質をコードする遺伝子の配列を決定するために、分取されたペプチド配列GQYFENPTPITG（配列番号１）を基にDegenerate primerとしてaceA-1F（配列番号６）とペプチド配列MLDHYQQTK（配列番号２）を基にDegenerate primerとしてaceA-1R（配列番号７）を作成した。次に、この2種のプライマーを用いてシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株染色体DNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。PCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、2分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、約1.3kbの大きさのDNA断片-4が増幅された。以下、特に記載しない場合PCRは上記の条件で行った。このPCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約1.3kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収した。このDNA断片-4をBKL kit（タカラバイオ社）でリン酸化し、あらかじめEcoRVで消化してCalf intestine alkalinephosphatase（New England Biolads社）により脱リン酸化しておいたpBluescript II（ストラタジーン社）と連結した。このライゲーション液により大腸菌DH5α株を形質転換した。その後、アンピシリン（50μg/ml）、X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside；40μg/ml））、IPTG（Isopropyl-β-thiogalactopyranoside；0.1mM）を含むLB寒天培地（1.5％寒天）上で、DNA断片-4を組み込んだプラスミドで形質転換された大腸菌株を選択した。この大腸菌のコロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB培地で培養し、増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system（プロメガ社）を用いてプラスミドDNAの精製を行った。得られたプラスミドを鋳型としてDNA塩基配列解析装置（アプライドバイオシシテム社；3130）を用い、2種類のプライマー（配列番号８，９）を使用して付属のプロトコルに従いダイターミネーター・サイクル・シークエンス法でDNA配列解析した。

得られた配列を基にインバースPCR用のプライマーaceA-inv-1F（配列番号１０）とaceA-inv-1R（配列番号１１）を作成した。またシュードノカルディア・オートトロフィカ NBRC12743株染色体DNAをClaI消化し、自己環状化したものを鋳型として調製した。インバースPCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を94℃、1分間、アニーリングを65℃、30秒間、伸長を72℃、3分間行う3段階の反応を30回繰り返した。その結果、約2.0kbの大きさのDNA断片-5が増幅された。このPCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約2.0kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によってDNA断片-5を回収した。このDNA断片-5をBKL kit（タカラバイオ社）でリン酸化し、あらかじめEcoRVで消化してCalf intestine alkalinephosphatase（New England Biolads社）により脱リン酸化しておいたpBluescript II（ストラタジーン社）と連結した。このライゲーション液により大腸菌DH5α株を形質転換した。その後、アンピシリン（50μg/ml）、X-gal（40μg/ml）、IPTG（0.1mM）を含むLB寒天培地（1.5％寒天）上で、DNA断片-5を組み込んだプラスミドで形質転換された大腸菌株を選択した。この大腸菌のコロニーをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB培地で培養し、増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system（プロメガ社）を用いてプラスミドDNAの精製を行った。得られたプラスミドを鋳型としてDNA塩基配列解析装置（アプライドバイオシシテム；3130）を用い、2種類のプライマー（配列番号８，９）を使用して付属のプロトコルに従いダイターミネーター・サイクル・シークエンス法でDNA配列解析した。その結果、アセトン誘導タンパク質（AceA）をコードする遺伝子の上流部分が解析できた。
得られた配列を基にインバースPCR用のプライマーaceA-inv-2F（配列番号１３）とaceA-inv-2R（配列番号１４）を作成した。またシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株の染色体DNAをAatIIで消化し、自己環状化したものを鋳型として調製した。インバースPCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、上記のインバースPCRと同様の条件で反応を行った。その結果、約1.0kbの大きさのDNA断片-6が増幅された。上記と同様の操作でこのDNA断片-6の配列を解析した。その結果、アセトン誘導タンパク質（AceA）をコードする遺伝子の上流部分の配列が得られた。
得られた配列を基にインバースPCR用のプライマーaceA-inv-3F（配列番号１５）とaceA-inv-3R（配列番号１６）を作成した。またシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株染色体DNAをBamHI消化し、自己環状化したものを鋳型として調製した。インバースPCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、上記のインバースPCRと同様の条件で反応を行った。その結果、約3.0kbの大きさのDNA断片-7が増幅された。上記と同様の操作でこのDNA断片-7の配列を解析した。その結果、アセトン誘導タンパク質（AceA）をコードする遺伝子の上流部分が解析できた（配列番号４８）。解析の鋳型としたプラスミドにはaceA遺伝子上流の未解析部分があると考えられたため、プライマーウォーキング法で配列解析を行い、aceA遺伝子の上流に逆向きに存在するタンパク質（AceR）のオープンリーディングフレームとその下流に存在するステムループ構造の配列までDNA配列を決定した（図４，配列番号４７）。本結果よりaceA発現のプロモーター領域はaceA遺伝子とaceR遺伝子の間に存在すると示唆されたため、以後のベクター構築のアセトン誘導プロモーター領域として約0.45kbの配列（Pace；配列番号２６）を使用した。なお、AceRアミノ酸配列を用いてBLAST検索した結果、GAF sensor proteinやtranscriptional regulator（M.Y.Galperin,Environ.Microbiol.,6(6),552-567(2004)）に対して相同性があることが示された。このようにして図４に示したaceR遺伝子からaceA遺伝子までの領域の配列（AceR-Pace-AceA; 配列番号２７）を配列決定した。

（４）シュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換可能なアセトン誘導型発現ベクターの構築（VDH発現ベクターの構築）
oriT遺伝子を増幅するためにプライマーoriT-1F（配列番号２８）とoriT-1R（配列番号２９）を作成した。これらのプライマーを用いてpTNR-oriT（K.I.Sallam,Gene,386,173-182(2007)）を鋳型としてPCR反応を行った。その結果、約1.1kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をBsrGIとBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約1.1kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-8を得た。プラスミドpTNR-AA(田村具博他、環境バイオテクノロジー学会誌、7(1), 3-10, 2007)をBsrGIとBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約6.2kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-9を得た。このDNA断片-9とDNA断片-8をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）で連結してpTNR-AA-oriTを得た（図５）。

続いてpTNR-AA-oriTよりアンピシリン耐性遺伝子を除くために以下の操作を行った。pTNR-AAのアプラマイシン耐性遺伝子と大腸菌での複製必須領域を増幅するためにプライマーpTNR-AA-apr-1F（配列番号３０）とpTNR-AA-ori-1R（配列番号３１）を作成した。これらのプライマーを用いてpTNR-AAを鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、3分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、約2.4kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をBamHIとKpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約2.4kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-10を得た。プラスミドpTNR-AA-oriTをBamHIとKpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約3.7kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-11を得た。このDNA断片-11とDNA断片-10をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）で連結してpTNR-A-oriTを得た（図５）。

次にpTNR-A-oriTのistAB遺伝子を除き、そこへ製造例（２）で同定したシュードノカルディア・オートトロフィカにおける複製必須領域（rep5）を挿入するために以下の操作を行った。pPA43082の複製必須領域（rep5）を増幅するためにプライマーrep-4F（配列番号３２）とrep-6R（配列番号２５）を作成した。これらのプライマーを用いてpPA43082を鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、3分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、約2.1kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をBsrGIとKpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約2.1kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-12を得た。プラスミドpTNR-A-oriTをBsrGIとKpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約3.5kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-13を得た。このDNA断片-13とDNA断片-12をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）で連結してpTAORを得た（図５）。

次にpTAORのマルチクローニングサイトにアセトン誘導プロモーター配列とvdh遺伝子（配列番号４４）を挿入するために以下の操作を行った（国際公開第2008/096695号パンフレット）。まず、アセトン誘導プロモーター配列を増幅するためにプライマーPace-HindIII-1F（配列番号３３）とPace-NdeI-1R（配列番号３４）を作成した。これらのプライマーを用いてシュードノカルディア・オートトロフィカのゲノムDNAを鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、1分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、約0.4kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をHindIIIとNdeIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約0.4kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (プロメガ社)によって回収し、DNA断片-14を得た。続いてvdh遺伝子を増幅させるためにプライマーVDH-1F（配列番号３５）とVDH-1R（配列番号３６）を作成した。これらのプライマーを用いてシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743のゲノムDNAを鋳型としてPCR反応を行った。その結果、約1.2kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をNdeIとNheIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約1.2kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-15を得た。プラスミドpTAORをHindIIIとNheIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約5.7kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-16を得た。このDNA断片-16とDNA断片-14、DNA断片-15をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）で連結してpTAOR2-vdhを得た（図５）。

次にpTAOR2-vdhのマルチクローニングサイトにターミネータ配列を挿入するために以下の操作を行った。pTipQT2（N. Nakashima, Appl. Environ. Microbiol., 5557-5568(2004)）のターミネーター配列を増幅するためにプライマーTerminator-1F（配列番号３７）とTerminator-1R（配列番号３８）を作成した。これらのプライマーを用いてpTipQT2を鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応は、KOD plus（東洋紡社）とPCR増幅装置（Biometra社 T Gradient）を用い、変性を98℃、20秒間、アニーリングを55℃、30秒間、伸長を68℃、1分間行う3段階の反応を25回繰り返した。その結果、約0.2kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をMfeIとAflIIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約0.2kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-17を得た。プラスミドpTAOR2-vdhをMfeIとAflIIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約7.3kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社）によって回収し、DNA断片-18を得た。このDNA断片-18とDNA断片-17をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）で連結してアセトン誘導型VDH発現ベクターpTAOR3-vdh（配列番号４５）を得た（図５）。

（５）BoxAB発現ベクターの構築
ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）TM-7由来のboxA及びboxB遺伝子（以下、boxAB遺伝子ともいう）はコンパクチンからプラバスタチンへの水酸化を触媒する酵素遺伝子として藤井匡らによって取得された（国際公開第2002/099109号パンフレット）。なお、ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）TM-7株は、メルシャン社で分離した株であり、2001年4月25日独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6）に国内寄託（FERM P-18312）し、2002年4月5日国際特許寄託へ移管した（FERM BP-8003）。サンプリング地は日本国神奈川県藤沢市城南メルシャン社藤沢工場内の土壌であり、サンプリング日、分離源、分離者、分離日については不明である。
シュードノカルディア・オートトロフィカのアセトン誘導型BoxAB発現ベクターを構築するために以下の操作を行った。まず、boxAB遺伝子を増幅するためにプライマーBoxAB-1F（配列番号３９）とBoxAB-1R（配列番号４０）を作成した。これらのプライマーを用いてストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）TM-7を鋳型としてPCR反応を行った。その結果、約1.5kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をNdeIとSpeIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約1.5kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-19を得た。プラスミドpTAOR3-vdhをNdeIとSpeIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約6.3kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-20を得た。このDNA断片-20とDNA断片-19をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）で連結してアセトン誘導型BoxAB発現ベクターpTAOR3-boxABを得た（図６）。後述の製造例（６）に示した方法により、pTAOR3-boxABによるシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換を試みたが、形質転換株を得ることができなかったため、以下に示す操作によりBoxAB発現ベクターの構造を変えた。
まず、アセトン誘導プロモーター配列及びboxAB遺伝子及びターミネータ配列を増幅するためにプライマーPBT-1F（配列番号４１）とPBT-1R（配列番号４２）を作成した。これらのプライマーを用いてpTAOR3-boxABを鋳型としてPCR反応を行った。その結果、約2.0kbの長さのDNA断片が増幅された。このDNA断片をKpnIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約2.0kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-21を得た。続いてプラスミドpTAOR3-boxABからプロモーター配列及びboxAB遺伝子及びターミネータ配列を除くためにHindIIIとAflIIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供して約5.6kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-22を得た。このDNA断片-22をBKL kit（タカラバイオ社）により末端の平滑化及び自己閉環化させてpTAOR4を得た。プラスミドpTAOR4をKpnIにより消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約5.6kbのDNA断片を切り出してからWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-23を得た。DNA断片-23をAlkaline Phosphatase（Calf intestine）（タカラバイオ社）により脱リン酸化し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収し、DNA断片-24を得た。DNA断片-21とDNA断片-24をDNA Ligation kit ver 2.1（タカラバイオ社）で連結した反応液で大腸菌DH5αを形質転換して、60μg/mlアプラマイシンを含むLB寒天培地で形質転換株のコロニーを得た。得られたコロニー中で8個任意に選択して、60μg/mlアプラマイシンを含む2mlのLB培地で培養し、増殖した形質転換大腸菌からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification system（プロメガ社）を用いてプラスミドDNAの精製を行った。得られた8サンプルのプラスミドを鋳型としてDNA塩基配列解析装置（アプライドバイオシシテム；3130）を用い、プライマー（配列番号４３）を使用して付属のプロトコルに従いダイターミネーター・サイクル・シークエンス法で解析した。その結果、プラスミドに中にDNA断片-21がそれぞれ逆向きに挿入されたプラスミドpTAOR4-For-boxABとpTAOR4-Rev-boxAB（配列番号４６）が得られたことが示された（図６）。

（６）VDH及びBoxAB発現ベクターによるシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換
接合法を用いて製造例（４）と製造例（５）で作成したpTAOR3-vdh、pTAOR3-boxAB、pTAOR4-For-boxAB及びpTAOR4-Rev-boxABによりシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica） NBRC12743株を形質転換するために以下の操作を行った。まず、それぞれのプラスミドにより大腸菌S17-1株を形質転換した。得られた形質転換株を60μg/mlアプラマイシンを含むLB培地で30℃、15時間培養して培養液を調製した。一方、シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株をLB培地で30℃、72時間培養して培養液を調製した。大腸菌S17-1株の培養液200μlを7000rpmで30秒遠心して菌体を沈殿させ、上澄みを捨て新たに200μl LB培地を加えて菌体を懸濁した。そこに500μlシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株の培養液を加えて、混和した。これを7000rpmで30秒遠心して菌体を沈殿させ、500μlの上澄みを捨て残った200μlで菌体を懸濁した。この細胞懸濁液150μlをLB寒天培地に塗布して、30℃、24時間培養した。寒天培地の表面に菌体が生育しているのを確認し、2mlのLB培地を加え、スプレッターを用いて菌体を懸濁した。この細胞懸濁液200μlを24μg/mlアプラマイシンと50μg/mlナリジクス酸を含むLB寒天培地に塗布し、30℃で7日間培養した結果、プラスミドpTAOR3-vdhとpTAOR4-Rev-boxABによるシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743形質転換株のみ得られた。

（７）シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743形質転換株によるタンパク質発現試験
１）VDH発現試験
VDHはシトクロムP450群に属する酵素タンパク質である。シトクロムP450とは、プロトヘム含有タンパク質で、還元型ヘム鉄に一酸化炭素が結合すると450nm付近に特徴的な吸収ピークを示す一群のタンパク質の総称である。したがって、形質転換株でvdh遺伝子が高発現していれば一酸化炭素結合スペクトル解析によってその発現が検出できる。
以下の操作を行いVDH誘導菌体における発現確認試験を行った。製造例（６）で得たpTAOR3-vdhにより形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743（P. autotrophica NBRC12743/pTAOR3-vdh）のコロニーを24μg/mlアプラマイシンを含む100mlの前培養用培地（1.5％グルコース、0.3％酵母エキス、0.4％塩化ナトリウム、0.2％炭酸カルシウム、1.5％ポリペプトン）に植菌し、30℃、220rpmで72時間培養した。コントロールとしてシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743野生株とpTAOR形質転換株も同時に培養した。この培養液1mlを24μg/mlアプラマイシンを含む100mlの本培養用培地（1％ポリペプトン、2％グルコース、1％ソイプロ、0.5％酵母エキス、0.04％ K2HPO4、0.04％塩化ナトリウム、0.3％炭酸カルシウム）へ植菌した。30℃、220rpmで48時間培養し、1mlアセトン（終濃度：1％）を添加してさらに30℃、220rpmで24時間培養した。pTAOR3-vdhで形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株についてはアセトン添加無しの試験も行った。この培養液を7000rpmで10分間遠心して、沈殿として菌体を得た。上澄みを捨て、培養液に対して5分の1量のCV緩衝液を加え、5倍濃縮細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液1mlをFastPROTEIN BLUE kit（フナコシ社）を用いて、FastPrep FP120（BIO101, SAVANT社）でスピード 6.0で40秒間激しくサンプルを振る操作を各回の間に氷上で冷却しながら3回繰り返して細胞を破砕した。この細胞破砕液を13000rpmで10分間遠心し、無細胞抽出液を上清に得た。この無細胞抽出液をキャップ付き試験管2本に700μlずつ分け、一方の無細胞抽出液に一酸化炭素を通した。次に、両方の無細胞抽出液にハイドロサルファイトナトリウムを少量添加した。一酸化炭素を通していない方のサンプルの400nmから500nmの吸収スペクトルをベースラインとして、スペクトルフォトメーター（U-3310 SpectrophotoMeter、HITACHI社）で一酸化炭素を通したサンプルの400nmから500nmの吸収をスキャンした。その結果、シトクロムP450に特徴的な450nm付近の吸収ピークが観察され、その吸収から一酸化炭素結合型で還元状態P450の分子吸光係数を1mMあたり91として培養液中のVDH発現量を計算した。計算の結果、培養液あたり202nMのVDHが発現していることが示唆された（図７）。

２）BoxAB発現試験
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）TM-7由来のboxAB遺伝子はコンパクチンからプラバスタチンへの水酸化を触媒する酵素遺伝子として藤井匡らによって取得された（国際公開第WO2002/099109号パンフレット）。BoxAはシトクロムP450であり、高発現していれば一酸化炭素結合スペクトル解析によってその発現が検出できる。また、BoxAB誘導菌体によるコンパクチンからプラバスタチンの変換試験によりその発現及び機能しているか確認できる。製造例（６）で得たpTAOR4-Rev-boxABにより形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743（P. autotrophica NBRC12743/pTAOR4-Rev-boxAB）のコロニーを24μg/mlアプラマイシンを含む100mlの前培養用培地（1.5％グルコース、0.3％酵母エキス、0.4％塩化ナトリウム、0.2％炭酸カルシウム、1.5％ポリペプトン）に植菌し、30℃、220rpmで72時間培養した。コントロールとしてシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743の野生株とpTAOR形質転換株も同時に培養した。この培養液1mlを24μg/mlアプラマイシンを含む100mlの本培養用培地（1％ポリペプトン、2％グルコース、1％ソイプロ、0.5％酵母エキス、0.04％ K₂HPO₄、0.04％塩化ナトリウム、0.3％炭酸カルシウム）へ植菌した。30℃、220rpmで48時間培養し、1mlアセトン（終濃度：1％）を添加してさらに30℃、220rpmで24時間培養した。pTAOR4-Rev-boxABで形質転換されたシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）NBRC12743株についてはアセトン添加無しの試験も行った。50mlの培養液をコンパクチン変換に使用し、残りの培養液を7000rpmで10分間遠心して、沈殿として菌体を得た。上澄みを捨て、培養液に対して5分の1量のCV緩衝液を加え、5倍濃縮細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液1mlをFastPROTEIN BLUE kit（フナコシ社）を用いて、FastPrep FP120（BIO101, SAVANT社）でスピード 6.0で40秒間激しくサンプルを振る操作を各回の間に氷上で冷却しながら3回繰り返して細胞を破砕した。この細胞破砕液を13000rpmで10分間遠心し、無細胞抽出液を上清に得た。この無細胞抽出液をキャップ付き試験管2本に700μlずつ分け、一方の無細胞抽出液に一酸化炭素を通した。次に、両方の無細胞抽出液にハイドロサルファイトナトリウムを少量添加した。一酸化炭素を通していない方のサンプルの400nmから500nmの吸収スペクトルをベースラインとして、スペクトルフォトメーター（U-3310 SpectrophotoMeter、HITACHI社）で一酸化炭素を通したサンプルの400nmから500nmの吸収をスキャンした。その結果、pTAOR4-Rev-boxABによる形質転換株で培養液にアセトン添加を行ったサンプルにおいて明瞭な450nm付近の吸収ピークが観察され、培養液あたり396nMが発現していることが示唆された（図８）。

実施例：プラバスタチンの製造
BoxAB発現株によるプラバスタチンの製造試験を行った。コンパクチンはboxAによってプラバスタチンに変換される（図９）。上記の培養法に従って、pTAOR4-Rev-boxAB形質転換株を培養し、アセトンによる誘導を24時間行った。コントロールとしてpTAOR形質転換株を用いた。50mlのアセトンによる誘導を行った培養液を遠心して菌体を沈殿させた。10mlのBuffer A（50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4、2％グリセロール）で懸濁して5倍濃縮の細胞懸濁液を調製し、そこへ終濃度250mg/Lのコンパクチンを添加して4時間変換した。サンプルに対して1：1で溶媒（メタノール：アセトニトリル＝1：1）を加えて反応を止めて、15000rpmで10分間の遠心により得た上清をHPLC分析用サンプルとした。HPLCによるプラバスタチンの分析は以下の条件で行った。分析結果を図１０に示す。

[プラバスタチン分析条件]
カラム：Chromolith Performance RP-18e（100×4.6mm，メルク社）、
溶媒Ａ：水：トリエチルアミン：酢酸＝100：0.1：0.1、
溶媒Ｂ：メタノール：トリエチルアミン：酢酸＝100：0.1：0.1、
流速：2.0ml/min、
温度：40℃、
検出：238nm、
グラジエント：

インジェクション：15μl、
保持時間：コンパクチン 3.1分、
プラバスタチン 1.6分。

図１０から明らかなように、BoxAB発現株では244mg/Lのプラバスタチンの生成が検出された。コントロールではプラバスタチンの生成は確認できず、BoxABの反応によりプラバスタチンが生成されたことが示された。
上記と同様にして培養及びアセトン誘導したシュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica） NBRC12743のBoxAB発現形質転換株（P. autotrophica NBRC12743/pTAOR4-Rev-boxAB）にコンパクチン（開環体）をフィードしてプラバスタチンの蓄積を検討した。25g/Lのコンパクチン（開環体）溶液を25mlのBoxAB誘導培養液に対して反応開始時に4ml、9時間目に1ml、21.5時間目に2ml、33.5時間目に2ml、48時間目に3ml、55時間目に3ml、71時間目に3ml、80時間目に3mlのコンパクチン（開環体）を添加した。培地中のコンパクチンとプラバスタチンの濃度の経時変換を図１１に示した。その結果、100時間で13g/Lのプラバスタチンが変換溶液に蓄積され、高効率なプラバスタチン生産系が構築された。

Claims

シュードノカルディア・オートトロフィカ（Pseudonocardia autotrophica）由来の複製開始領域、外来性遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイト、該マルチクローニングサイトに挿入された外来性遺伝子、プロモーター、ターミネータ、及び選択マーカーを含有し、前記複製開始領域が、配列番号４９で表される塩基配列もしくはその相補配列、または当該塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列もしくはその相補配列からなる、シュードノカルディア・オートトロフィカ細胞内で自律複製し、導入された外来性遺伝子の発現を可能とする発現ベクター。
前記プロモーターがアセトンによって誘導され、外来性遺伝子を発現する請求項１記載の発現ベクター。
前記プロモーター領域が、配列番号２６で表される塩基配列もしくはその相補配列、または当該塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列もしくはその相補配列からなる請求項２記載の発現ベクター。
大腸菌由来の複製開始領域をさらに含有し、シュードノカルディア・オートトロフィカ及び大腸菌内のいずれにおいても自律複製を可能とし、シャトルベクターとして用いることができる請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
oriT領域を有し、大腸菌S17-1とシュードノカルディア・オートトロフィカの接合により形質転換できる請求項４記載の発現ベクター。
前記外来性遺伝子がビタミンD水酸化酵素をコードする遺伝子またはコンパクチン水酸化酵素をコードする遺伝子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現ベクターが導入されたシュードノカルディア・オートトロフィカの形質転換体。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現ベクターをシュードノカルディア・オートトロフィカに導入して形質転換し、得られた形質転換体内で前記外来性遺伝子を発現させ、タンパク質を産生することを特徴とするタンパク質の製造方法。
外来性遺伝子としてビタミンD水酸化酵素遺伝子が挿入された請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて、該ベクターでシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換し、得られた形質転換体を用いることを特徴とする活性型ビタミンD類の製造方法。
活性型ビタミンD類が、25-ヒドロキシビタミンD2、25-ヒドロキシビタミンD3、または1α，25-ジヒドロキシビタミンD3である請求項９に記載の活性型ビタミンD類の製造方法。
外来性遺伝子としてコンパクチン水酸化酵素遺伝子が挿入された請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて、該ベクターでシュードノカルディア・オートトロフィカを形質転換し、得られた形質転換体を用いてコンパクチンからプラバスタチンを製造することを特徴とするプラバスタチンの製造方法。