WO2008136451A1 - スフィンゴミエリナーゼ - Google Patents

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WO2008136451A1
WO2008136451A1 PCT/JP2008/058159 JP2008058159W WO2008136451A1 WO 2008136451 A1 WO2008136451 A1 WO 2008136451A1 JP 2008058159 W JP2008058159 W JP 2008058159W WO 2008136451 A1 WO2008136451 A1 WO 2008136451A1
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WO
WIPO (PCT)
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enzyme
polynucleotide
amino acid
sphingomyelinase
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/058159
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hitomi Yamaguchi
Akiko Sakoda
Misa Shiihara
Yugo Iwasaki
Original Assignee
Nagase & Co., Ltd.
Nagase Chemtex Corporation
National University Corporation Nagoya University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagase & Co., Ltd., Nagase Chemtex Corporation, National University Corporation Nagoya University filed Critical Nagase & Co., Ltd.
Priority to JP2009513006A priority Critical patent/JP5302189B2/ja
Publication of WO2008136451A1 publication Critical patent/WO2008136451A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04012—Sphingomyelin phosphodiesterase (3.1.4.12)

Definitions

  • This effort relates to a novel sphingomyelinase and a method for producing the same.
  • Sphingomyelinase is an enzyme that acts on sphingomyelin to produce ceramid and phosphorylcholine, and is known as the enzyme number E. C. 3. 1. 4. 12.
  • the three-dimensional structure of sphingomyelinase derived from Bacillus cereus has been elucidated, and its catalytic mechanism has been studied through cell differentiation and aging, which are said to be given by sphingomyelinase of animal cells. It is considered to be important for the elucidation of apoptosis (Hi deo Ago et al., Journal of Biologic Chemistry (J. Biol.
  • Ceramide which is produced from sphingomyelin by sphingomyelinase, is a lipid in the stratum corneum of the skin and is an important component for moisturizing the skin and is also known as a base material for cosmetics. Ceramide is also attracting attention for its relationship with atopic dermatitis, and its development as a therapeutic drug is also expected.
  • Sphingomyelinase is present in various animal tissues, such as brain, lung, liver, kidney, adrenal gland, spleen, testis, and placenta.
  • Clostridium perfringen s (Yoshio YAMAKAWA et al., Journal 'Ob' Biochem., 1977, 81 ⁇ , pp. 115-126), Crostridium ⁇ Clostridium novyi (RY0 TAGUCHI, et al. ⁇ Biochim. Biopys. Acta. 1975, 409 ⁇ , pp. 75-85 and Ryo TAGUCHI J. Biochem., 1977, 82, pp.
  • Streptomyces hach ijoensis currently Streptomyces cinnamoneus
  • Streptomyces cinna moneus Streptomyces cinna moneus
  • An object of the present invention is to provide a novel sphingomyelinase and a method for producing the same.
  • the present inventors cloned the gene encoding the enzyme, revealed its structure, and confirmed that this gene is a novel gene.
  • An expression plasmid was constructed using this gene, and a microorganism belonging to the genus Streptomyces was transformed to obtain a microorganism that efficiently produced the enzyme.
  • the present invention provides an enzyme that acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine, which enzyme is described in any of the following (a) to (c) (A) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • amino acids In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, one or more amino acids have an amino acid sequence substituted, inserted, deleted and Z or added, and exhibiting the hydrolysis action Or
  • the enzyme is 50% or more within the range of pH 8 to pH 12 when the hydrolysis activity for 10 minutes at 37 ° C is 100% at pHIO using sphingomyelin as a substrate.
  • the hydrolytic activity of in another embodiment, the enzyme is 37 at pHIO.
  • PC Phosphatidylcholine
  • PI phosphatidylinositol
  • PA phosphatidic acid
  • PE phosphatidylethanolamine
  • phosphatidylglycease when the hydrolytic activity for sphingomyelin for 10 minutes at C is 100%
  • the enzyme has an isoelectric point of 6.1.
  • the enzyme has a molecular weight of 5,000 as measured by SDS-PAGE and a molecular weight of 32,000 as analyzed from the amino acid composition.
  • the enzyme is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the above enzyme.
  • the polynucleotide is a polynucleotide according to any of the following (a) to (c):
  • the polynucleotide is derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • the present invention further provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention further provides a transformant introduced with the above-mentioned polynucleotide or the above-mentioned vector and having the ability to produce an enzyme that produces ceramid and phosphorylcholine from sphingomyelin.
  • the host of the transformant is a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • the present invention further provides a method for producing an enzyme that acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine.
  • the host is a microorganism belonging to the genus Streptomyces.
  • a novel sphingomyelinase is provided. Furthermore, a method for efficiently producing the enzyme by a microorganism is provided.
  • FIG. 1 is an electrophoresis photograph showing the results of SDS-PAGE analysis of the purified fraction from the culture solution of Streptomyces cinnamone us.
  • FIG. 2 is a graph showing the sphingomyelinase activity of the purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus at various pH values based on the enzyme activity when the pH is 10.
  • Figure 3 is a graph showing the sphingomyelinase activity of the purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus at various temperatures, based on the enzyme activity at a reaction temperature of 37 ° C. is there.
  • FIG. 4 is a graph showing the residual activity of a purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus after treatment at various temperatures.
  • Figure 5 shows the base of the core region of the sphingomyelinase gene cloned from Streptomyces cinnamone us. It is a figure which shows an arrangement
  • FIG. 6 is a diagram showing the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the structural gene of the region containing the sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinnamone us.
  • the enzyme is not limited to a purified enzyme, but includes a crude product, an immobilized product, and the like.
  • Enzyme purification is performed using a well-known method such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, etc., using a culture solution of microorganisms. Containing purified enzyme).
  • the microorganism refers to wild strains, mutant strains (for example, induced by ultraviolet irradiation), or recombinants induced by genetic engineering techniques such as cell fusion or gene recombination. , It may be a strain of deviation. Genetically engineered microorganisms such as recombinants are known to those skilled in the art, for example, as described in Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). It can be easily created using known techniques.
  • the culture solution of microorganisms means both a culture solution containing microbial cells and a culture solution from which microbial cells have been removed by centrifugation or the like.
  • the present invention provides an enzyme (sphingomyelinase) that acts on sphingomyelin and hydrolyzes the sphingomyelin to produce ceramide and phosphorylcholine.
  • enzyme sphingomyelinase
  • the activity of the sphingomyelinase of the present invention can be confirmed, for example, as follows, but the confirmation method is not limited to this.
  • the enzyme is first added to 20 mM sodium glycine monohydroxide buffer ( ⁇ . ⁇ ) containing 2 mg / ml egg yolk-derived sphingomyelin (Sigma), which is incubated at 37 ° C for 10 minutes. Hydrolyzes ingomyelin. Next, the enzyme is inactivated by heating in boiling water for 5 minutes, and 1/50 of the supernatant is collected. The collected supernatant consists of 50 mM sodium glycine monohydroxide buffer (pH 9.
  • the amount of sphingomyelinase enzyme is determined colorimetrically using phosphoric acid as a standard sample, and the amount of enzyme that produces l / mol of phosphoric acid per minute under the above conditions is taken as one unit.
  • this enzyme can be prepared by using Tris-HCl buffer (pH 7-9) and sodium glycine monohydroxide buffer (pH 9: L3) as the buffer under the reaction conditions of the above sphingomyelin and enzyme.
  • the optimum pH can be in the range of pH 8 to: 12.5.
  • the optimum pH is preferably in the range of 9 to 12, more preferably in the range of 10 to 11, and further preferably in the vicinity of 10.
  • the enzyme of the present invention is, for example, in the range of pH 8 to pH 12 when the hydrolysis activity at pH 10 is 100% under the condition where sphingomyelin and the enzyme are reacted at 37 ° C. for 10 minutes as described above. It can show more than 50% activity.
  • the enzyme can act at about 20 to 40 ° C. under the reaction conditions of the above sphingomyelin and the enzyme.
  • the optimum temperature can be within this range. Preferably in the range of about 30-40 ° C, more preferably in the range of 35-40 ° C, and More preferably at about 37 ° C.
  • This enzyme for example, when treated with 50raM tris-maleate buffer (pH 7.0) for 30 minutes can be stable with almost no decrease in activity from 4 ° C to 45 ° C, and Even at 50 ° C, about 70% of activity remains.
  • the enzyme When the enzyme and substrate are reacted at 37 ° C for 10 minutes under the pHIO condition, the enzyme has phosphatidylcholine (PC), assuming that the hydrolysis activity relative to the case where sphingomyelin is the substrate is 100%.
  • PC phosphatidylcholine
  • PI phosphatidylinositol
  • PA phosphatidic acid
  • PE phosphatidinolethanolamine
  • PG phosphatidylglycerol
  • PS phosphatidylserine
  • This enzyme may vary slightly depending on the electrophoresis conditions.
  • a natural enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 has a molecular weight of about 35,000 daltons on SDS-PAGE.
  • This natural enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus NBRC12 782 has a molecular weight calculated from its amino acid composition of about 32,000 daltons.
  • This enzyme may change slightly depending on the electrophoresis conditions.
  • the natural enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus NBRC12782 used Phastgel IEF3-10 (GE Healthcare Biosciences).
  • the isoelectric point of 6.1 is shown by isoelectric focusing.
  • the sphingomyelinase of the present invention is preferably from position 1 of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence up to position 3 (in this specification, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 Column)).
  • this enzyme has sphingomyelinase activity (for example, activity to hydrolyze sphingomyelin; the same applies to the following), one or more amino acids with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 May be an enzyme having a substituted, deleted, inserted, and / or added amino acid sequence.
  • site-directed mutagenesis Nucleic Acid Res., 1982, 10 ⁇ , pp. 6487; Methods in Enzymol., 1983, 100 ⁇ , pp.
  • the structure of the protein can be altered by introducing, insertion, and Z or additional mutations.
  • the number of amino acid residues that can be substituted, deleted, inserted, and z or added is usually 50 or less, such as 30 or less, or 20 or less, preferably 16 or less, more preferably 5 or less, and even more preferably. Is 0-3.
  • amino acid mutations include not only artificially mutated enzymes but also naturally mutated enzymes as long as they have sphingomyelinase activity.
  • a protein having an amino acid sequence having homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is also included in the sphingomyelinase of the present invention as long as it has sphingomyelinase activity.
  • the sphingomyelinase of the present invention is preferably at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90% with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Even more preferably, it may be a protein having an amino acid sequence with at least 95% homology, even more preferably at least 99%.
  • Protein homology for example, databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PR0T, PIR, DAD, or DNA databases such as DDBJ, EMBL, or Gene-Bank, BLAST, FAS
  • homology 1 search for example, databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PR0T, PIR, DAD, or DNA databases such as DDBJ, EMBL, or Gene-Bank, BLAST, FAS
  • it can be done through the Internet using programs such as TA. Confirmation of protein activity can be performed using the procedure described above.
  • the source of the sphingomyelinase of the present invention is not particularly limited, but can be obtained from living cells such as microorganisms.
  • microorganisms include microorganisms belonging to the genus Streptomyces. Preferred is Streptomyces cinnamoneus NBRC12 782.
  • the above Streptomyces cinna moneus NBRC12782 secretes the enzyme out of the cell by liquid culture in an appropriate nutrient medium, so that the culture supernatant can be lyophilized, salted out, by organic solvent, etc.
  • the treated product can be produced as a sphingomyelinase enzyme preparation.
  • Microorganisms that can be used in the production of Sphingomyelinase enzyme preparations are not limited to Streptomyces cinnamoneus NBRC12782, and may be microorganisms belonging to the genus Streptomyces and capable of producing the sphingomyelinase of the present invention. That's fine.
  • natural or artificial mutants of these species or gene fragments necessary for expression of sphingomyelinase activity can be artificially extracted and used in the present invention even for other species that incorporate them. be able to.
  • Sphingomyelinase enzyme preparation using Streptomyces cinnamoneus NBRC 12782 will be described as an example. Since this bacterium is liquid-cultured in a nutrient medium to secrete the enzyme outside the microbial cell, the culture supernatant is treated with freeze-drying, salting out, organic solvent, etc., or the treated product is immobilized. Enzyme preparations can be manufactured. More specifically, this bacterium is treated with an appropriate medium, for example, an appropriate carbon. Culture in a medium containing a source, nitrogen source and inorganic salts to secrete the enzyme.
  • the carbon source starch and starch hydrolysate, moss such as glucose and sucrose, alcohols such as glycerol, and organic acid (for example, acetic acid opiate) or salt thereof (for example, sodium salt) )
  • nitrogen sources include organic nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean flour, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, and urea.
  • inorganic salts include sodium chloride, monopotassium phosphate, magnesium sulfate, manganese chloride, calcium chloride, and ferrous sulfate.
  • the concentration of the carbon source is, for example, 1 to 20% (w / v), preferably 1 to: L0% (w / v).
  • the concentration of the nitrogen source is, for example, in the range of 1 to 20% (w / V), preferably 1 to 10% (w / v).
  • the culture temperature is a temperature at which the above enzyme is stable and the cultured microorganism can sufficiently grow, and is preferably 20 to 37 ° C.
  • the culture time is a time for which the enzyme is sufficiently produced, and is preferably about 1 to 7 days.
  • the culture can be performed preferably under aerobic conditions, for example, with aeration stirring or shaking.
  • the sphingomyelinase of the present invention is fractionated by protein solubility (precipitation with organic solvents, salting out with ammonium sulfate, etc.); cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography; chelate, Purification can be performed by appropriately combining known methods such as affinity chromatography using dyes, antibodies and the like. For example, the culture supernatant of the above microorganism is collected, and then purified by polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) by repeating ammonium sulfate precipitation and further anion exchange chromatography. be able to. (Polynucleotide encoding sphingomyelinase)
  • a polynucleotide encoding the above sphingomyelinase is also disclosed in the present invention. Included in the light.
  • the polynucleotide of the present invention can be an artificial molecule including an artificial nucleotide derivative in addition to a natural polynucleotide such as DNA or RNA.
  • the polynucleotide of the present invention may be a DNA-RNA chimeric molecule.
  • the polynucleotide encoding Sphingomyces " ⁇ " of the present invention is, for example, a nucleotide sequence from position 1 to position 999 of SEQ ID NO: 1 (in this specification, also referred to as "base sequence described in SEQ ID NO: 1") )
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the protein containing this amino acid sequence constitutes a preferred form of the sphingomyelinase of the present invention. To do.
  • the polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention includes one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, and Z in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 as described above.
  • a polynucleotide encoding a protein containing an added amino acid and having sphingomyelinase activity is also included.
  • a person skilled in the art can introduce substitution, deletion, insertion, and Z or addition mutation as appropriate into the polynucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 using a site-directed mutagenesis method (described above). Thus, it is possible to obtain a homologue of a polynucleotide.
  • polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention may also be hybridized under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Also included are polynucleotides that can encode and encode proteins having sphingomyelinase activity.
  • the polynucleotide of the present invention can be used to convert a target gene into the above microorganism (for example, a microorganism belonging to the genus Streptomyces, preferably Streptomyces). Seth Cinna Moneus (NBRC12782) wear. PCR and hybrid screening are used for gene acquisition. It is also possible to chemically synthesize the full length of a gene by DNA synthesis. Based on the base sequence information, a polynucleotide encoding the sphingomyelinase derived from an organism other than the above can also be obtained.
  • a sphingomyelin derived from various organisms " ⁇ "A polynucleotide that encodes a gene can be isolated.
  • PCR data can be used from the region with the highest homology using the sequence information registered in databases such as DNA Databank of Japan (DDB J) and EMBL N Gene-Bank. Primers can also be designed.
  • a polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions is a sequence comprising at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60, or 100 consecutive sequences in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • Select one or more probes to design the probe and use the conditions described in the manual for example, wash conditions: 42 ° C, 0.5 ° C, for example
  • ECL direct nucleic acid labeling and detection system manufactured by GE Healthcare.
  • stringent conditions are, for example, usually 42 ° C, 2 X SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C, 2 X SSC, 0.1 % SDS condition, more preferably 65. C, 0.1 X SSC, and 0.1% SDS Conditions Forces There are no particular restrictions on these conditions. Factors that influence the stringency of a hybridization include multiple factors such as temperature and salt concentration. A person skilled in the art can realize the optimum stringency by appropriately selecting these elements.
  • the polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention includes at least 75%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, and even more than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • it comprises a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence with at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 99% homology, and having a sphingomyelinase activity.
  • Protein homology (homology 1) Search is as described above.
  • the polynucleotide encoding the sphingomyelinase of the present invention is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and still more preferably, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Also included is a polynucleotide that encodes a protein having a base sequence with at least 95%, more preferably at least 99% sequence identity and having strong sphingomyelinase activity. The search for determining the sequence identity of the base sequence is also as described above.
  • the polynucleotide encoding the sphingomyelinase can be expressed in the same or different host using genetic recombination techniques. (Vector and transformants)
  • a vector comprising the above polynucleotide is also provided.
  • a transformant having the ability to produce an enzyme that produces ceramide and phosphorylcholine from sphingomyelin can be produced.
  • Procedures for the production of transformants and the construction of recombinant vectors suitable for the host are techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering. (See, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). For actinomycetes in particular, it can be performed with reference to “PMCTICAL STREPT0 MYCES GENETICS (Kieser et al., John Innes Foundation, 2000)”.
  • this DNA is first introduced into a plasmid vector or a phage vector that is stably present in the microorganism, and its genetic information. Transcription and translation.
  • a promoter corresponding to a unit that controls transcription / translation may be incorporated 5 ′ upstream of the DNA strand of the present invention, more preferably a terminator 3 ′ downstream.
  • a promoter and terminator a promoter and terminator known to function in microorganisms used as hosts are used.
  • vectors, promoters, and terminators that can be used in these various microorganisms refer to “Basic Course of Microbiology 8 Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan”. , 2000) J is described in detail.
  • the host to be transformed is not particularly limited as long as it is an organism that can be transformed with a vector containing a polynucleotide encoding the sphingomyelinase and can express the sphingomyelinase activity.
  • Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus, Streptococcus, Streptococcus Bacteria whose host vector systems such as the genus and Lactobacillus are developed; Host vector systems such as the genus Rhodococcus and Streptomyces are developed Actinomycetes; Saccharomyces Genus, Kleiberomyces (Klu yveromyces) genus, Schizosaccharomyces genus, Chigo Saccharomyces genus (Zygosaccharomyces), Yarrowia genus Yeasts for which host vector systems such
  • insects such as moths (Nature 315, 592 594 (1985)), rapeseed, corn, potatoes and other plants Systems for expressing heterologous proteins in large quantities have been developed and may be used.
  • the obtained transformant can be used for production of an enzyme preparation as described above.
  • the transformant is liquid-cultured in an appropriate nutrient medium, the expressed sphingomyelinase is secreted outside the cell, and the culture supernatant is lyophilized, salted out, treated with an organic solvent, etc.
  • Sphingomyelinase enzyme preparation can be produced.
  • the culture conditions may vary depending on the host cell, the culture can be performed under conditions commonly used by those skilled in the art. For example, when actinomycetes such as the genus Streptomyces are used as a host, tryptic soy medium containing thiostrepton (for example, Becton 'Dickinson') can be used.
  • tryptic soy medium containing thiostrepton for example, Becton 'Dickinson'
  • the enzyme produced by the transformant can be further purified as described above.
  • Example 1 Purification of an enzyme derived from Streptomyces cinna moneus
  • Ammonium sulfate was added to the culture supernatant collected in (a) so as to be 30% (w / v) saturation, and the resulting precipitate was removed by centrifugation (7500 rpm, 30 minutes, 4 ° C). Furthermore, 60% solution (w / v) was added Anmoniumu sulfate so that saturation and the resulting precipitate centrifuged (7500r P m, 30 min, 4 ° C) was collected by. This precipitate was dissolved in 60 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and dialyzed against the same buffer to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution obtained in (b) was applied to a DEAE-Toyopearl 650M column (inner diameter: 26 mm, height: 200 mm, manufactured by Tosoh Corporation) previously equilibrated with 20 ⁇ Tris-HCl buffer ( ⁇ 8.0). After washing the column with the same buffer, the active fraction was eluted with a linear gradient of sodium chloride (from 0M to 0.8M).
  • the active fractions obtained in (c) were collected, desalted by dialyzing against 20 mM Tris-HCl buffer ( PH 8.0). This is pre-washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Apply to an equilibrated RESOURCE Q (6 ml) column (GE Healthcare Biosciences), wash the column with the same buffer, and use a linear gradient of sodium chloride (from 0M to 0.8M) to obtain an active image. Minutes were eluted. The eluted active fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE (12.5% (w / v) polyacrylamide gel). Figure 1 is an electrophoretogram showing the results of SDS-PAGE analysis of this eluted fraction.
  • Lane 1 is a molecular weight marker
  • lane 2 shows the band of the elution fraction. As a result, a single band was observed (Fig. 1). In this way, an electrophoretically purified enzyme was obtained from Streptomyces cinnamoneus NBRC12782.
  • the sphingomyelinase activity of the purified enzyme obtained in Example 1 was measured by the above method, and it was confirmed that it had a sphingomyelinase activity. The enzymatic properties of this purified enzyme were examined.
  • FIG. 2 is a graph showing the enzyme activity at various reaction pHs as relative activity based on the enzyme activity when the reaction pH is 10. As can be seen from FIG. 2, this enzyme exhibited an activity of more than 50% of the maximum activity over a wide range of pH from pH 8 to pH 12.
  • FIG. 3 is a graph showing the enzyme activity at various reaction temperatures as relative activity based on the activity when the reaction temperature is 37 ° C. As shown in Figure 3, the enzyme can be active at 20-40 ° C, and the optimum temperature for the reaction is around 37 ° C.
  • FIG. 4 is a graph showing the residual activity of the enzyme after treatment at various temperatures. As shown in FIG. 4, after the treatment at a temperature from 4 ° C. to 45 ° C., the enzyme remained at 90% or more before the treatment. After treatment at 50 ° C, about 70% of the activity before treatment remained.
  • Substrate specificity Sphingomyelinase activity was measured according to the above method except that various phospholipids were used as substrates instead of sphingomyelin. The results are shown in Table 2 as relative activities with sphingomyelin as the substrate and 100. This enzyme showed substrate specificity as shown in Table 2.
  • Isoelectric point As a result of measuring the isoelectric point of the purified enzyme by isoelectric focusing using Phastgel IEF3-10 (GE Healthcare Bioscience), the isoelectric point of the purified enzyme was 6 It was 1.
  • the amino acid sequence was analyzed by a protein sequencer using the purified enzyme obtained in Example 1 above.
  • the N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme was as shown in SEQ ID NO: 3. (Example 4: Streptomyces cinna moneus NBRC12782 chromosomal DNA isolation)
  • Streptomyces cinnamoneus NBRC 12782 was cultured at 28 ° C for 4 days using 5 ml of tryptic soy medium (Becton Dickinson) and collected. Then, the cells were suspended in 800 ⁇ 1 of a solution consisting of 0.1M NaCl, 0.1 M EDTA (pH 8.0), and 8 mg / ml lysozyme, treated at 37 ° C. for 45 minutes, and further ⁇ Treated at 80 ° C for 10 minutes.
  • Example 5 Cloning of the core region of the sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinna moneus
  • S1 sense primer SEQ ID NO: 4
  • amino acid sequence of bacterial sphingomyelinase is highly homologous to the amino acid sequence of ushi DNasel. llus cereus), Staphylococcus aureu s, and Leptospira interrogans sphingomyelinase and ursi DNasel amino acid sequences were compared. It shared an amino acid sequence consisting of SDHYP (Y0 MATSU0 et al., Protein 'Science (1996),
  • a degenerate oligonucleotide primer A1 antisense primer (SEQ ID NO: 5) for PCR was designed based on the amino acid sequence SDHYP and the codon used in the genus Streptomyces. Here, S in the sequence represents C or G.
  • composition of the PCR reaction solution is as follows. Saddle chromosomal DNA obtained in Example 4 above
  • a specific amplification product of about 800 bp was obtained by PCR.
  • the PCR reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and the desired 800 bp band portion was excised and bound to pCR4-T0P0 vector using T0P0 Blunt Cloning Kit for Sequencing (manufactured by Invitrogen) to transform E. coli J1109.
  • the transformant was cultured in LB medium (keptamine 1%, yeast ex 0.5%, sodium chloride sodium 1%, pH 7.0) containing kanamycin 50 / g / ml, and QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen
  • the plasmid for DNA sequencing was extracted and purified.
  • the T13 primer derived from the pCR4-T0P0 vector The base sequence of the inserted fragment was determined by an automatic sequencer using the imma. This base sequence is shown in FIG. 5 and SEQ ID NO: 12.
  • the chromosomal DNA obtained in Example 4 was completely digested with Sau3AI, and a library was prepared by linking the Sau3AI Cassette attached to TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara Bio). Using this as a saddle, the first PCR amplification was performed using Cassette Primer CI included in the kit and antisense primer AN1 (SEQ ID NO: 6) prepared based on the partial gene sequence of sphingomyelinase. It was.
  • the composition of the PCR reaction solution is as follows.
  • PCR reaction conditions are as follows. Step 1; 94 ° C, 2 minutes; Step 2; 94 ° C, 30 seconds; Step 3; 55 ° C, 30 seconds; Step 4; 72 ° C,
  • the chromosomal DNAlOOng obtained in Example 4 above was completely digested with Nael and self-ligated using DNA Ligation Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to produce a library. Using this as a saddle type, so-called inverse PCR amplification was performed using sense primer SC1 (SEQ ID NO: 8) and antisense primer AC2 (SEQ ID NO: 9) prepared based on the partial gene sequence of sphingomyelinase. It was.
  • the composition of the PCR reaction solution is as follows.
  • PCR reaction conditions are as follows. Step 1; 94 ° C, 3 minutes; Step 2; 94 ° C, 15 seconds; Step 3; 68 ° C, 1 minute; Step 2 to Step 3 are repeated 35 cycles; Step 4; 68 ° C, 3 minutes.
  • the PC R obtained specific amplification product of approximately 400 bp, which sub claw and Jung to P CR4- T0P0 vector of all, to determine the nucleotide sequence. Based on the base sequence determined in the above (a) and (b) together with the base sequence determined in Example 5 above, including the Streptomyces cinnamoneus-derived Sphingomyelinase gene The nucleotide sequence of the region was determined (SEQ ID NO: 13), and the amino acid sequence of the structural gene portion was deduced from the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 14).
  • SEQ ID NO: 13 The nucleotide sequence of the region was determined (SEQ ID NO: 13), and the amino acid sequence of the structural gene portion was deduced from the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 14).
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the region containing the determined sphingomyelinase gene and the predicted amino acid sequence of the structural gene at the bottom of this nucleotide sequence.
  • the results of sequence analysis shown in Fig. 6 revealed that the structural gene coding for sphingomyelinase is a 999 bp nucleotide and encodes a 333 amino acid residue.
  • Streptomyces cinnamoneus determined in Example 3 above Streptom The N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme derived from yces cinnamoneus was present in the deduced amino acid sequence and was completely consistent (indicated by the underline in FIG. 6).
  • the estimated amino acid sequences were compared with the sequences in the four protein sequence databases (PTR, PRF, UNI-PRO T, and SWISS-PR0T).
  • PTR, PRF, UNI-PRO T, and SWISS-PR0T protein sequence databases
  • ] showed 52% similarity to sphingomyelin.phosphogesterase (sphingomyelinase) of Salinispora tropica CNB-440 strain.
  • a purified enzyme derived from Streptomyces cinnamoneus ie, sphingomyelinase was estimated to have a molecular weight of about 32000 daltons when calculated based on the amino acid composition of this putative amino acid sequence. It was done.
  • Example 7 Production of recombinant plasmid containing Sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinna moneus
  • a sense primer S2 (SEQ ID NO: 10) in which a Bglll site was added to the upstream region of the structural gene of Sphingomyelinase derived from Streptomyces cinnamoneus, and An antisense primer A2 (SEQ ID NO: 11) with a Bglll site added to the basin sequence was designed. Subsequently, PCR was performed using these primers with the chromosomal DNA obtained in Example 4 as a saddle.
  • the composition of the PCR reaction solution is as follows. ⁇ ng chromosome DNA 168ng, 10 X PCR Buffer for K0D-plus- 5 ⁇ 1, primers 300 nM each, dNTP mixture 0.2 mM each, MgS0 4 lmM, DMS0 5%, and K0D-plus-DNA Pol Distilled water was added to ymerase 1.0 unit to a total volume of 50 1.
  • PCR reaction conditions are as follows. Step 1; 94 ° C, 2 minutes; Step 2; 94 ° C, 15 seconds; Step 3; 68 ° C, 1 minute; Repeat Step 2 to Step 3 for 30 cycles; Step 4; 68 ° C, 2 Minutes.
  • a specific amplification product of about 1200 bp was obtained.
  • the amplified fragment was digested with BgIII, and ⁇ the BgIII site of mycobacterial plasmid pIJ702 (ATCC35287, obtained from American Type Culture Collection), a recombinant plasmid pIJ70 2 - was obtained SMase.
  • Example 8 Production of recombinant actinomycetes expressing Sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinna moneus
  • Example 9 Measurement of enzyme activity of recombinant actinomycetes expressing Sphingomyelinase gene derived from Streptomyces cinna moneus
  • the recombinant actinomycete obtained in Example 8 was cultured in a 100 ml tryptic soy medium (Betaton 'Dickinson') containing 20 g / ml thiostrepton. The supernatant was recovered from the obtained culture broth by centrifugation (15000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), and ammonium sulfate was added so as to be 60% (w / v) saturated. The mixture was left at 4 ° C for 16 hours, and the precipitate was collected by centrifugation (15000 rpm, 15 minutes, 4 ° C).
  • a novel sphingomyelinase and a method for producing the same are provided. Ceramide produced by causing sphingomyelinase to act on sphingomyelin is useful as a base material for cosmetics.

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Abstract

本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法が提供される。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも75％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチドからなる。１つの実施態様では、本発明の酵素は、スフィンゴミエリンを基質としたときのpH10で37℃にて10分間の加水分解活性を100％とした場合に、pH8からpH12の範囲内で50％以上の加水分解活性を示す。

Description

スフインゴミエリナーゼ
技術分野
本努明は、 新規なスフインゴミエリナーゼおよびその製造方法に関する。
明 背景技術 田
スフインゴミエリナーゼは、 スフインゴミエリンに作用し、 セラミ ドとホ スホリルコリンとを生成する酵素であり、 酵素番号 E. C. 3. 1. 4. 12として知 られている。 近年、 ノ チルス 'セレウス （Bacillus cereus) 由来のスフィ ンゴミエリナーゼの立体構造が解明され、 その触媒メカニズムの研究は、 動 物細胞のスフインゴミエリナ一ゼが闋与するといわれる細胞の分化、 老化、 アポトーシスの解明にも重要であると考えられている （ヒデォ ァゴゥ （Hi deo Ago) ら， ジャーナル.ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー （J. Biol.
Chem. ) , 2006年， 281卷（23号）， pp. 16157-16167) 。 また、 スフインゴミ エリンからスフインゴミエリナーゼによって生成されるセラミドは、 皮膚の 角質層にある脂質で、 肌の保湿に重要な成分であり、 化粧品の基材としても 知られている。 また、 セラミドはアトピー性皮膚炎との関連も注目されてお り、 その治療薬としての開発も期待される。
スフインゴミエリナーゼは、 種々の動物組織、 脳、 肺、 肝、 腎、 副腎、 脾、 精巣、 胎盤などに存在する。
細菌由来では、 バチルス 'セレウス （Bacillus cereus) (ヒロオ ィケ ザヮ (HIROH IKEZAWA) ら， バイオキミ力 ·ェ ·パイオフイジ力 .ァクタ (B iochim. Biophys. Acta. ) ， 1978年， 528卷， pp. 247-256) 、 スタフイロコ ッカス 'ォーレウス (Staphylococcus aureus) (ヘイゼノレ ェム. ドウリ 一 (HAZEL M. DOERY) ら， ジャーナル ·ォブ ·ジェネラル ·マイクロバイオ ロジー （J. Gen. Microbiol. ) ， 1965年， 40卷， pp. 283- 296) 、 リステリ ァ ·イワノヴィ (Listeria ivanovii) (ブルーノ ゴンザレスーゾルン （B runo Gonzalez - Zorn) ら， モレキュラー ·マイクロノ ィォロシー (Mol. Mic robiol. ) , 1999年， 33卷， pp. 510-523) 、 レプトスビラ ·インテロガンス (Leptospira interrogans) (ノレウド ピー. エイ. ェム. セガース (RUUD P. A. M. SEGERS) ら， インフエクシヨン 'アンド 'イミュ-ティー （Infect. Immune. ) ， 1990年， 58卷， pp. 2177— 2185) 、 へリコパクター ' ピロリ （He licobacter pylori; (づ ノレ一チュン チャン (Err— Cheng Chan) ら， ノ づ オケミストリー （Biochemistry) , 2000年， 39卷， pp. 4838-4845) 、 シユー rモナス属 (Pseudomonas sp. ) 、ノリユキ スェヨン (Noriyuki Sueyosh i) ら， ジャーナル ·ォブ ·バクテリォロジ一 (J. Bacteriol. ) ， 2002年， 184卷（2号）， pp. 540-546) 、 ストレプトマイセス属 （Streptomyces sp. ) (ケイタロウ スズキ (Keitarou SUZUKI) ら， バイオサイエンス ·バイオ テクノロジー . アンド 'バイオケミストリー (Biosci. Biotech. Bioche m. ) ， 1995年， 59卷（11号）， pp. 2081- 2086、 特開昭 5 8— 4 3 7 8 6号公 報） などに見出されている。 このうち、 バチルス 'セレウス （Bacillus cer eus) (アキヒロ ヤマダ （Akihiro YAMADA) ら， ョ一口ピアン 'ジャーナ ル ·ォプ ·バイオケミストリー （Eur. J. Biochem. ) ， 1988年， 175卷， p. 213-220) 、 スタフイロコッカス -オーレウス (Staphylococcus aureus)
(デイビッド シー. コーノレマン （David Coleman) ら， マイクロバイァ ル'パソジヱネシス （Microb. Pathog. ) , 1986年， 1卷， pp. 549-564) 、 リ ステリア 'イワノヴィ （Listeria ivanovii) (ブゾレーノ ゴンザレスーゾ ルン (Bruno Gonzalez - Zom) ら， モレキュラー ·マイクロバイォロジー (M ol. Microbiol. ) , 1999年， 33卷， pp. 510- 523) 、 レプトスピラ 'インテロ ガンス (Lentospira interrogans) (ノレウド ピー. エイ. ェム. セガース (RUUD P. A. M. SEGERS) ら， インフエクシヨン 'アンド -イミュニティー (Infect. Immune. ) , 1990年， 58卷， pp. 2177- 2185) 、 およびシユードモ ナス属 (Pseudomonas sp. ) (ノリユキ スェヨシ (Noriyuki Sueyos i) ら ジャーナル ·ォブ 'パクテリォロジ一 （J. Bacterid. ) ， 2002年， 184卷 (2号）， pp. 540-546) 由来のスフインゴミエリナーゼは、 それらの遺伝子が クローニングされており、 アミノ酸配列も解明されている。
また、 クロストリジゥム ·ぺ /レフリンゲンス （Clostridium perfringen s) (ヨシオ ャマカヮ (Yoshio YAMAKAWA) ら， ジャーナル'ォブ 'バイオ ケミストリー （J. Biochem. ) , 1977年， 81卷， pp. 115-126) 、 クロストリ ジゥム ·ノヴィ （Clostridium novyi) (リヨウ タグチ （RY0 TAGUCHI) ら バイォキミカ ·ェ ·バイオフィジカ 'ァクタ （Biochim. Biop ys. Acta. ) 1975年， 409卷， pp. 75- 85およぴリヨウ タグチ （Ryo TAGUCHI) ら， ジャ ーナル ·ォブ ·パイオケミストリー (J. Biochem. ) , 1977年， 82卷， pp. 12 17-1223) 、 ストレプトマイセス ·ノヽチジョゥェンシス (Streptomyces hach ijoensis) (現ストレプトマイセス . シンナモネウス (Streptomyces cinna moneus) ) (ヨシオ ォォカヮ （Yoshio 0KAWA) ら， ジャーナル ·ォブ ·バ ィォケミストリー （J. Biochem. ) ， 1975年， 78卷， pp. 537- 545) 由来のホ スホリパーゼ Cが、 スフインゴミエリナーゼ活性を有することが知られてい る。
さらに、 サリニスポラ ' トロピカ （Salinispora tropica) およぴサリニ スポラ ·ァレニコラ (Salinispora arenicola) のスフインゴミエリナーゼ の遺伝子が報告されているが、 その性質は明らかではない。
スフインゴミエリナーゼを産業上利用するにあたっては、 動物,袓織由来で はスフインゴミエリナーゼを大量生産することは困難であり、 細菌由来が望 ましいと考えられる。 しかし、 スフインゴミエリ^ "一ゼを生成する細菌のな かには、 病原性が指摘されているものが多く、 その応用範囲が限定されかね なレ、。 発明の開示
本発明は、 新規なスフインゴミエリナーゼおよびその製造方法を提供する ことを目的とする。
本発明者らは、 新規なスフインゴミエリナーゼを得ることを目的として、 該酵素を生産する微生物を検索した結果、 ストレプトマイセス （Streptomyc es) 属に属する微生物から新規な性質を有するスフインゴミエリナ一ゼを見 出した。
さらに本発明者らは、 該酵素をコードする遺伝子をクローエングし、 その 構造を明らかにして、 この遺伝子が新規な遺伝子であることを確認した。 ま た、 この遺伝子を用いて発現プラスミ ドを構築し、 ス トレプトマイセス （St reptomyces) 属に属する微生物を形質転換することにより、 該酵素を効率よ く生産する微生物を得た。
本発明は、 スフインゴミエリンに作用し、 該スフインゴミエリンを加水分 解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を提供し、 この酵素 は、 以下の （a ) から （c ) のいずれかに記載のポリペプチドからなる： ( a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有するポリぺプチド；
( ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列において、 1もしくは複数個のァ ミノ酸が置換、 挿入、 欠失および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該加水分解作用を示すポリべプチド；または
( c ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%の相同性を有し、 かつ該加水分解作用を示すポリぺプチド。
1つの実施態様では、 上記酵素は、 スフインゴミエリンを基質としたとき の pHIOで 37°Cにて 10分間の加水分解活性を 100%とした場合に、 pH8から pH12 の範囲内で 50%以上の加水分解活性を示す。 別の実施態様では、 上記酵素は、 pHIOで 37。Cにて 10分間のスフインゴミエ リンに対する加水分解活性を 100%とした場合にホスファチジルコリン （P C) 、 ホスファチジルイノシトール （PI) 、 ホスファチジン酸 （PA) 、 ホス ファチジルェタノールァミン （PE) 、 ホスファチジルグリセ口ール （PG) 、 およぴホスファチジルセリン (PS) に対する活性が 5 %未満である基質特異 性を有する。
別の実施態様では、 上記酵素は、 等電点が 6. 1である。
さらに別の実施態様では、 上記酵素は、 SDS-PAGEで測定した場合の分子量 力 ¾5, 000であり、 そしてァミノ酸組成より分析した場合の分子量が 32, 000で ある。
なお別の実施態様では、 上記酵素は、 ス トレプトマイセス (Streptomyce s) 属に属する微生物に由来する。
本発明はまた、 上記酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
1つの実施態様では、 上記ポリヌクレオチドは、 以下の （a ) から （c ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドである ：
( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
( ) 配列番号 1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジヱン トな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
( c ) 配列番号 1に記載の塩基配列と少なくとも 80%の配列同一性を有す るポリヌクレオチド。
別の実施態様では、 上記ポリヌクレオチドは、 ストレブトマイセス （Stre ptomyces) 属に属する微生物に由来する。
本発明はさらに、 上記ポリヌクレオチドを含むべクタ一を提供する。
本発明はさらに、 上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターが導入され、 スフインゴミエリンからセラミ ドとホスホリルコリンを生成する酵素を産生 する能力を保有する形質転換体を提供する。 1つの実施態様では、 上記形質転換体の宿主は、 ストレプトマイセス （St reptomyces) 属に属する微生物である。
本発明はさらに、 スフインゴミエリンに作用し、 該スフインゴミエリンを 加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方 法を提供し、 この方法は、
上記ポリヌクレオチドまたは上記べクタ一を宿主に導入して、 該酵素を産 生する形質転換体を得る工程；および該形質転換体を培養して該酵素を産生 させる工程を含む。
1つの実施態様では、 上記宿主は、 ストレブトマイセス （Streptomyces) 属に属する微生物である。
本発明によれば、 新規なスフインゴミエリナーゼが提供される。 さらに、 該酵素を微生物によって効率よく生産する方法が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 ス卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamone us) 培養液からの精製画分の SDS- PAGE解析の結果を示す電気泳動写真である。 図 2は、 pHが 10である場合の酵素活性を基準とした、 種々の pHでのストレ プトマイセス ' シンナモネウス （Streptomyces cinnamoneus) 由来精製酵素 のスフインゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図 3は、 反応温度が 37°Cである場合の酵素活性を基準とした、 種々の温度 でのストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) 由 来精製酵素のスフインゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図 4は、 種々の温度での処理後のス トレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) 由来精製酵素の残存活性を示すグラフである。 図 5は、 ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamone us) からクロー-ングしたスフインゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域の塩基 配列を示す図である。
図 6は、 ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinnamone us) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列および構造遺 伝子についての推定アミノ酸配列を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、 酵素とは、 精製酵素に限定されず、 粗精製物、 固定化物 なども含む。 酵素の精製は、 例えば、 微生物の培養液を用いて、 硫安沈澱、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィーなどの、 当業者に 周知の方法を用いて行われ、 種々の精製度の酵素 （ほぼ単一までに精製され た酵素を含む） が得られ得る。
本発明において、 微生物とは、 野性株、 変異株 （例えば、 紫外線照射など により誘導される） 、 あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝 子工学的手法により誘導される組換え体などのレ、ずれの株であってもよい。 組換え体などの遺伝子操作された微生物は、 例えば、 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第 2版 (Sambrook, J.ら編、 Cold Spring Harbor Labo ratory Press, 1989) に記載されるような、 当業者に公知な技術を用いて容 易に作成され得る。 微生物の培養液とは、 微生物菌体を含む培養液、 および 遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
(スフインゴミエリナーゼ）
本発明は、 スフインゴミエリンに作用し、 該スフインゴミエリンを加水分 解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素 （スフインゴミエリ ナーゼ） を提供する。
本発明のスフインゴミエリナーゼの活性は、 例えば、 以下のようにして確 認され得るが、 確認方法はこれに限定されない。 酵素を、 まず 2mg/mlの卵黄由来スフインゴミエリン （Sigma製） を含む 20m M グリシン一水酸化ナトリウム緩衝液 （ρΗΙΟ. Ο) に添加し、 これを 37°Cで 10 分間インキュベートして、 スフインゴミエリンを加水分解する。 次いで、 沸 騰水中で 5分間加熱することにより上記酵素を失活させ、 その上清の 1/50量 を分取する。 分取した上清に、 50mM グリシン一水酸化ナトリウム緩衝液 (p H9. 6) 、 ImM塩化マグネシウム、 および 0. 1ユニット/ mlの子ゥシ腸由来アル カリホスファターゼ （タカラバイオ社製） からなる溶液を 4倍量で加え、 3 7°Cで 30分間ィンキュベートし、 生成したホスホリルコリンからリン酸を遊 離させる。 さらに、 その遊離リン酸を定量するために、 9倍量の BI0MOL GREE N Reagent for Phosphate Detection (BI0M0L Research Laboratories, Inc 製） を添加し、 室温で 30分間放置後、 波長 620nmの吸光度を測定する。 この 場合、 スフインゴミエリナーゼの酵素量は、 リン酸を標準試料として比色定 量し、 上記条件において 1分間に l / molのリン酸を生成する酵素量を 1ュニッ トとする。
本酵素は、 例えば、 緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液 （pH7〜9) およびグ リシン一水酸化ナトリウム緩衝液 （pH9〜： L3) を用いて上記のスフインゴミ エリンと酵素との反応条件下におくと、 その pH範囲内 （pH7〜13) でスフィ ンゴミエリ > ~一ゼ活性を示し得る。 至適 pHは pH8〜： 12. 5の範囲内にあり得る。 好ましくは至適 pHが 9〜12の範囲内にあり、 より好ましくは 10〜11の範囲内 にあり、 さらに好ましくは 10付近である。 本発明の酵素は、 例えば、 上記の ようにスフインゴミエリンと酵素とを 37°Cにて 10分間反応させた条件下で pH 10における加水分解活性を 100%とした場合、 pH8から pH12の範囲内で 50%以 上の活性を示し得る。
本酵素は、 例えば、 上記のスフインゴミエリンと酵素との反応条件下では、 約 20〜40°Cで作用し得る。 至適温度は、 この範囲内にあり得る。 好ましくは 約 30〜40°Cの範囲内にあり、 より好ましくは 35〜40°Cの範囲内にあり、 さら により好ましくは約 37°Cである。
本酵素は、 例えば、 50raM トリスーマレイン酸緩衝液 (pH7. 0) で 30分間処 理した場合、 4°Cから 45°Cまででは、 ほぼ活性の低下が見られず安定であり 得、 そして 50°Cでも 70%程度の活性が残存している。
本酵素は、 例えば、 緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液 （pH8. 0) を用いて 上記のスフインゴミエリンと酵素溶液との反応条件下におくと、 ImMの M g 2 +、 M n 2 +、 および C o 2 +で活性が促進され得るが、 ImMの Z n 2 +、 F e 3 +、 A 1 3 +、 および EDTAで活性が阻害され得る。
本酵素は、 pHIOの条件下で該酵素と基質とを 37°Cにて 10分間反応させた場 合、 スフインゴミエリンが基質である場合に対する加水分解活性を 100%と すると、 ホスファチジルコリン （PC) 、 ホスファチジルイノシトール （PI) 、 ホスファチジン酸 (PA) 、 ホスファチジノレエタノーノレアミン （PE) 、 ホスフ ァチジルグリセロール （PG) 、 またはホスファチジルセリン （PS) を基質と した場合に対する活性が 5 %未満である基質特異性を有し得る。
本酵素は、 電気泳動条件などにより若干変化し得るが、 例えば、 ス トレブ 卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782由来 の天然の酵素は、 SDS - PAGEにおける分子量が約 35, 000ダルトンを示す。 この ス卜レプ卜マイセス - シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12 782由来の天然の酵素は、 そのアミノ酸組成から計算した分子量は約 32, 000 ダルトンである。
本酵素は、 泳動条件などにより若干変化し得るが、 例えば、 ス トレブトマ イセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782由来の天 然の酵素は、 Phastgel IEF3- 10 (GEヘルスケアバイオサイエンス社製) を用 いた等電点電気泳動法により、 6. 1の等電点を示す。
本発明のスフインゴミエリナーゼは、 好ましくは配列番号 2の 1位から 33
3位までのアミノ酸配列 （本明細書では、 「配列番号 2に記載のァミノ酸配 列」 ともいう） を有する。 本酵素は、 スフインゴミエリナーゼ活性 （例えば、 スフインゴミエリンを加水分解する活性；以下も同様である） を有する限り、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列に対して 1または複数のァミノ酸が、 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても 良い。 当業者であれば、 例えば、 部位特異的変異導入法 （Nucleic Acid Re s. , 1982年， 10卷， pp. 6487 ; Methods in Enzymol. , 1983年， 100卷， pp. 44 8 ; Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, 第 2版, Cold Spring Harbo r Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989年； PCR ： A Practical Appr oach, IRL Press, 1991年， pp. 200) などを用いて、 適宜置換、 欠失、 挿入、 および Zまたは付加変異を導入することにより、 タンパク質の構造を改変す ることができる。 本発明において、 置換、 欠失、 挿入、 および zまたは付加 することができるアミノ酸残基数は、 通常 50以下、 例えば 30以下、 あるいは 20以下、 好ましくは 16以下、 より好ましくは 5以下、 さらに好ましくは 0〜3 である。 また、 アミノ酸の変異は、 人工的に変異させた酵素のみならず、 自 然界において変異した酵素も、 スフインゴミエリナーゼ活性を有する限り、 本発明のスフインゴミエリナーゼに含まれる。
配列番号 2に記載のァミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を 有するタンパク質も、 スフインゴミエリナーゼ活性を有する限り、 本発明の スフインゴミエリナーゼに含まれる。 本発明のスフインゴミエリナーゼは、 好ましくは、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%、 好ましく は少なくとも 80%、 より好ましくは少なくとも 85%、 なおより好ましくは少 なくとも 90%、 さらにより好ましくは少なくとも 95%、 さらにより好ましく は少なくとも 99%の相同性を有するァミノ酸配列を有するタンパク質であり 得る。 タンパク質の相同性の （ホモロジ一） 検索は、 例えば SWISS - PR0T、 PI R、 DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、 または DDBJ、 EMBL、 あるいは Gene- Bankなどの DNAデータベースなどを対象に、 BLAST、 FAS TAなどのプログラムを利用して、 例えば、 インターネットを通じて行うこと ができる。 タンパク質の活性の確認は、 上記に記載の手順を利用して行い得 る。
本発明のスフインゴミエリナーゼの供給源は特に限定されないが、 微生物 などの生体細胞から得ることができる。 そのような微生物としては、 ストレ プトマイセス （Streptomyces) 属に属する微生物が挙げられる。 好ましくは ス 卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12 782が挙げられる。
例えば、 上記ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinna moneus) NBRC12782は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌 体外に分泌するので、 その培養上清を凍結乾燥、 塩析、 有機溶媒などにより 処理したものをスフインゴミエリナーゼ酵素製剤として製造することができ る。
スフインゴミエリナーゼ酵素製剤の製造に用い得る微生物は、 ストレプト マイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782に限ら れるものではなく、 ストレプトマイセス属に属しかつ本発明のスフィンゴミ エリナーゼを生産し得る微生物であればよい。 また、 それらの生物種の天然 または人為的変異株や、 スフインゴミエリナーゼ活性の発現に必要な遺伝子 断片を人為的に取り出し、 それを組み入れた他の生物種であっても本発明に 用いることができる。
ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinnamoneus) NBRC 12782を用いたスフインゴミエリナーゼ酵素製剤を例に挙げて、 その製造に ついて説明する。 本菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外 に分泌するので、 その培養上淸を凍結乾燥、 塩析、 有機溶媒などにより処理 する、 あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することが できる。 さらに具体的に説明すると、 本菌を適当な培地、 例えば適当な炭素 源、 窒素源、 無機塩類を含む培地中で培養し、 該酵素を分泌させる。 ここで 炭素源としては、 澱粉および澱粉加水分解物、 グルコース、 シユークロース などの糠類、 グリセロールなどのアルコール類、 および有機酸 （例えば、 酢 酸おょぴクェン酸） またはその塩 （例えば、 ナトリウム塩） などが挙げられ る。 窒素源としては、 酵母エキス、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスチープリ カー、 大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 尿素などの無機窒素化合物挙げられる。 無機塩類としては、 塩化ナトリウム、 リン酸 1カリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化マンガン、 塩化カルシウム、 硫 酸第 1鉄などが挙げられる。 炭素源の濃度は、 例えば 1〜20% (w/v) 、 好ま しくは 1〜： L0% (w/v) の範囲である。 窒素源の濃度は、 例えば 1〜20% (w/ V) 、 好ましくは 1〜10% (w/v) の範囲である。 培養温度は、 上記の酵素が 安定であり、 そして培養される微生物が十分に生育できる温度であり、 好ま しくは 20〜37°Cである。 培養時間は、 上記酵素が十分に生産される時間であ り、 好ましくは 1〜 7日間程度である。 培養は、 好ましくは、 好気的な条件 下で、 例えば、 通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
本発明のスフインゴミエリナーゼは、 タンパク質の溶解度による分画 （有 機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など） ；陽イオン交換、 陰イオン交 換、 ゲルろ過、 疎水性クロマトグラフィー；キレート、 色素、 抗体などを用 いたァフィ二ティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わ せることにより精製することができる。 例えば、 上記微生物の培養上清を回 収した後、 硫安沈殿、 さらに陰イオン交換クロマトグラフィーを繰り返し行 うことによりポリアクリルァミド電気泳動 （SDS - PAGE) において、 ほぼ単一 パンドにまで精製することができる。 (スフインゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチド）
上記スフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドもまた、 本発 明に含まれる。 本発明のポリヌクレオチドは、 DNA、 RNAなどの天然のポリヌ クレオチドに加え、 人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり 得る。 また、 本発明のポリヌクレオチドは、 DNA - RNAのキメラ分子であり得 る。 本発明のスフインゴミエリ"^ "一ゼをコードするポリヌクレオチドは、 例 えば、 配列番号 1の 1位から 999位までの塩基配列 （本明細書では、 「配列 番号 1に記載の塩基配列」 ともいう） を有する。 配列番号 1に記載の塩基配 列は、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、 このアミノ酸配列を含むタンパク質は、 本発明のスフインゴミエリナーゼの 好ましい形態を構成する。
本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 上記のような配列番号 2に記載のァミノ酸配列に 1または複数のァミノ酸が 置換、 欠失、 揷入、 および Zまたは付加したアミノ酸を含み、 かつスフイン ゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもま た挙げられる。 当業者であれば、 配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリ ヌクレオチドに部位特異的変異導入法 （上述） などを用いて、 適宜置換、 欠 失、 挿入、 および Zまたは付加変異を導入することによりポリヌクレオチド のホモログを得ることが可能である。
本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドとしては また、 配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的な塩 基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でハイブリダイ ズでき、 かつスフインゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする ポリヌクレオチドもまた挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、 本明細書中に記載した塩基配列情報に基づ いて、 目的とする遺伝子を、 上記微生物 （例えば、 ストレプトマイセス （St reptomyces) 属に属する微生物、 好ましくは、 ストレプトマイセス · シンナ モネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782) カ ら取得することカ で きる。 遺伝子の取得には、 PCRやハイブリダィズスクリーニングが用いられ る。 また、 DNA合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。 上記塩基配列情報に基づいて、 上記以外の生物に由来する上記スフィンゴミ ェリナーゼをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。 例えば、 上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、 他の 生物から調製した DNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダィゼ ーションを行うことにより、 種々の生物由来のスフインゴミエリ"^ "一ゼをコ ードするポリヌクレオチドを単離することができる。 上記塩基配列情報に基 づいて、 DNA Databank of Japan (DDB J)、 EMBLN Gene - Bankなどの腿に関す るデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジ一の高い領域か ら PCR用のプライマーを設計することもできる。 このようなプライマーを用 レ、、 染色体 DNAもしくは cDNAを铸型として PCRを行うことにより、 上記スフィ ンゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドを種々の生物から単離する こともできる。
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、 配列番号 1に記載の塩基配列中の少なくとも 20個、 好ましくは少なくとも 30 個、 例えば、 40個、 60個、 または 100個の連続した配列を 1つまたは複数選 択してプローブを設計し、 例えば ECL direct nucleic acid labeling and d etection system (GE Healthcare社製） を用いて、 マニュアルに記載の条件 (例えば、 洗浄条件： 42°C、 0. 5 X SSCを含む primary wash buffer) におレヽ て、 ハイプリダイズするポリヌクレオチドを指す。
より具体的には、 「ストリンジェントな条件」 とは、 例えば、 通常、 42°C、 2 X SSC、 0. 1% SDSの条件であり、 好ましくは 50°C、 2 X SSC、 0. 1% SDSの条 件であり、 さらに好ましくは 65。C、 0. 1 X SSCおよび 0. 1% SDSの条件である 力 これらの条件に特に制限されるものではない。 ハイブリダィゼーシヨン のストリンジヱンシ一に影響する要素としては、 温度や塩濃度など複数の要 素があり、 当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリン ジエンシーを実現することが可能である。
さらに、 本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチド としては、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%、 好ましくは 少なくとも 80%、 より好ましくは少なくとも 85%、 なおより好ましくは少な くとも 90%、 さらにより好ましくは少なくとも 95%、 さらにより好ましくは 少なくとも 99%の相同性を有するアミノ酸配列を有し、 かつスフインゴミエ リナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。 タ ンパク質の相同性 （ホモロジ一） 検索は、 上で説明したとおりである。 また、 本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 配列番号 1に記載の塩基配列と少なくとも 80%、 好ましくは少なくとも 85%、 より好ましくは少なくとも 90%、 なおより好ましくは少なくとも 95%、 さら により好ましくは少なくとも 99%の配列同一性を有する塩基配列を有し、 力 つスフインゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、 ポリヌク レオチドもまた挙げられる。 塩基配列の配列同一性の決定おょぴ検索につい ても、 上で説明したとおりである。
上記スフインゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、 遺伝子組 換え技術を用いて、 同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。 (ベクタ一および形質転換体）
本発明によれば、 上記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。 ま た、 上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入することにより、 スフインゴミエリンからセラミ ドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を 産生する能力を保有する形質転換体を作製することもできる。
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構 築は、 分子生物学、 生物工学、 遺伝子工学の分野において慣用されている技 術に準じて行うことができる （例えば、 Sambrookら、 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual第 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989年参照） 。 特に放線菌に関しては、 「PMCTICAL STREPT0 MYCES GENETICS (Kieserら、 John Innes Foundation, 2000年） 」 を参照し て行うことができる。 微生物中で、 本発明のスフインゴミエリ^ ^一ゼをコ一 ドするポリヌクレオチドを発現させるためには、 まず微生物中で安定に存在 するプラスミ ドベクターやファージベクターにこの DNAを導入し、 その遺伝 情報を転写 ·翻訳させる。 そのために、 転写 ·翻訳を制御するュニットにあ たるプロモーターを本発明の DNA鎖の 5'側上流に、 より好ましくはターミネ 一ターを 3'側下流に、 それぞれ組み込めばよい。 このプロモーターおよぴタ 一ミネ一ターとしては、 宿主として利用される微生物中において機能するこ とが知られているプロモーターおよびターミネータ一が用いられる。 これら の各種微生物において利用可能なベクター、 プロモーター、 ターミネータ一 などに関しては、 「微生物学基礎講座 8 遺伝子工学、 共立出版」 、 特に放 線菌に関しては、 「PRACTICAL STREPT0MYCES GENETICS (Kieserら、 John In nes Foundation, 2000年) J などに詳細に記述されている。
形質転換の対象となる宿主は、 上記スフインゴミエリナーゼをコードする ポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、 スフインゴミエリ i "一ゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。 例えば、 ェシエリヒア （Escherichia) 属、 パチノレス （Bacillus) 属、 シユードモナ ス （Pseudomonas) 属、 セラチア （Serratia) 属、 ブレビバタテリゥム （Bre vibacterium) 属、 コリ不ノ クテリゥム (Corynebacterium) 属、 ストレプト コッカス (Streptococcus) 属、 ラク卜バチルス (Lactobacillus) 属など宿 主ベクター系の開発されている細菌； ロドコッカス （Rhodococcus) 属、 ス トレプトマイセス （Streptomyces) 属など宿主ベクター系の開発されている 放線菌；サッカロマイセス （Saccharomyces) 属、 クライべロマイセス （Klu yveromyces) 属、 シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 属、 チゴ サッカロマイセス (Zygosaccharomyces) 、 ャロウィァ (Yarrowia) 属、 卜ジ =tスポ t3ン (Trichosporon) 属、 口ド、スポジジクム (Rhodosporidium; 属、 ピキア（Pichia)属、 キャンディダ（Candida)属などの宿主ベクター系の 開発されている酵母；ノイロスポラ （Neurospora) 属、 ァスペルギルス （As pergillus) 属、 セファロスポリゥム （Cephalosporium) 属、 トリコデノレマ (Trichoderma) 属などの宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げ られる。 遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、 遺伝子の発 現の容易性からは放線菌が好ましい。
また、 微生物以外でも、 植物、 動物において様々な宿主'ベクター系が開 発されており、 例えば、 蚕などの昆虫 （Nature 315, 592 594 (1985) ) や 菜種、 トウモロコシ、 ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現さ せる系が開発されており、 これらを利用してもよい。
得られた形質転換体は、 上記のように酵素製剤の製造に用いることができ る。 具体的には、 形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、 発現したス フインゴミエリナーゼを細胞外に分泌させ、 その培養上清を凍結乾燥、 塩析、 有機溶媒などにより処理してスフインゴミエリナーゼ酵素製剤を製造するこ とができる。 宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、 培養は、 同業者 が通常用いる条件下で行われ得る。 例えば、 ストレプトマイセス （Streptom yces) 属のような放線菌を宿主として用いる場合、 チォストレプトンを含む トリプチックソィ培地 （例えば、 べクトン 'ディッキンソン社製） が用いら れ得る。 形質転換体により産生された酵素は、 上述のようにしてさらに精製 され得る。
実施例
以下の実施例により、 本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら の実施例に限定されるものではない。
(スフインゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法）
本実施例において、 酵素活性の測定は、 基本的には、 以下のように行つ た：
まず 2mg/naの卵黄由来スフインゴミエリン （Sigma製） および酵素溶液を 含む 20mM グリシン〜水酸化ナトリウム緩衝液 (ρΗΙΟ. 0) を、 37°Cで 10分間 インキュベー卜して、 スフインゴミエリンを加水分解した。 次いで、 沸騰水 中で 5分間加熱することにより上記酵素を失活させ、 その上清の 1/50量を分 取した。 分取した上清に、 50mM グリシン一水酸化ナトリウム緩衝液 （pH9.
6) 、 ImM塩化マグネシウム、 および 0. 1ユニット/ mlの子ゥシ腸由来アル力 リホスファターゼ （タカラバイオ社製） からなる溶液を 4倍量で加え、 37°C で 30分間インキュベートし、 生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離さ せた。 さらに、 その遊離リン酸を定量するために、 9倍量の BIOMOL GREEN Re agent for Phosphate Detection (B丄 0M0L Research Laboratories, Inc^) を添加し、 室温で 30分間放置後、 波長 620nmの吸光度を測定した。 なお、 本 実施例のスフインゴミエリナーゼについては、 リン酸を標準試料として比色 定量し、 上記条件において 1分間に l w molのリン酸を生成する酵素量を 1ュ- ットとした。
(実施例 1 ：ス トレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinna moneus) 由来酵素の精製）
( a ) 培養
ポリペプトン （日本製薬製） 1% / 、 肉エキス （鰹由来、 和光純薬製） 1 % (w/v)、 グルコース 1 % (w/v)、 および塩化ナトリウム 0. 3 % (w/v)からなる 培地 4Lを調製し、 3L容バッフル付き三角フラスコに 500mlずつ分注して、 12 1°Cで 20分間蒸気殺菌を行った。 予め 「Genetic Manipulation of Streptomy ces. A Laboratory Manual.」 DA Hop ood, MJ Bibb, KF Chater, T Kieser, CJ Bruton, HM Kieser, DJ Lydiate, CP Smith, JM Wardおよび H Schrempf, 出版元 The John Innes Foundation, 1985年の方法で調製しておいたストレ プ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782
(独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手） の胞子懸濁液を 0. 1mlずつ 接種し、 30°Cで 60時間振とう培養した。 この培養液を ADVANTEC製 No2濾紙を 用いて濾過することにより、 上清を回収した。 ( b ) 硫安分画
( a ) で回収した培養上清に 30% (w/v)飽和となるように硫酸アンモニゥ ムを添加し、 生じた沈殿を遠心分離 （7500rpm、 30分、 4°C) により除去した。 さらに、 該溶液に 60% (w/v)飽和となるように硫酸ァンモニゥムを添加し、 生じた沈殿を遠心分離 （7500rPm、 30分、 4°C) により集めた。 この沈殿を 20 mM トリスー塩酸緩衝液 （pH8. 0) 60mlに溶解し、 同一緩衝液で透析し、 粗酵 素液を得た。
( c ) DEAE- Toyopearl力ラムクロマトグラフィー
( b ) で得られた粗酵素液を、 20πιΜ トリスー塩酸緩衝液 (ρΗ8. 0) で予め 平衡化した DEAE- Toyopearl 650Mカラム （内径 26mm、 高さ 200mm、 東ソ一社 製） にアプライした。 同緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩化ナトリウム （0M から 0. 8Mまで） のリニアグラジヱントにより、 活性画分を溶出させた。
( d ) RESOURCE Qカラムクロマトグラフィー
( c ) で得られた活性画分を集め、 20mMトリスー塩酸緩衝液 (PH8. 0)に対 して透析し脱塩した。 これを、 20mM トリスー塩酸緩衝液 (pH8. 0) で予め平 衡化した RESOURCE Q (6ml) カラム （GEヘルスケアバイオサイエンス社製） にアプライし、 同緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩化ナトリウム （0Mから 0. 8Mまで） のリニアグラジェントにより、 活性画分を溶出させた。 溶出した活 性画分を集めて SDS - PAGE (12. 5% (w/v)ポリアクリルァミドゲル） により解 析した。 図 1は、 この溶出画分の SDS- PAGEによる解析の結果を示す電気泳動 写真である。 レーン 1は、 分子量マーカーであり、 レーン 2は、 溶出画分の バンドを示す。 その結果、 単一のバンドが観察された （図 1 ) 。 このようにして、 ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces c innamoneus) NBRC12782より、 電気泳動的に単一に精製された酵素を得た。
(実施例 2 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinna moneus) 由来酵素の性質の測定）
上記の実施例 1で得た精製酵素のスフインゴミエリナーゼ活性を上記方法 で測定し、 スフインゴミエリ^ "一ゼ活性を有することを確認した。 この精製 酵素の酵素学的性質について検討した。
( 1 ) 作用 pH：緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液 （pH7〜9) およびグリシ ン一水酸化ナトリウム緩衝液 （pH9〜； 13) を用いて pHを変化させたこと以外 は、 上記方法に従って、 スフインゴミエリナーゼ活性を測定した。 その結果、 この酵素は、 反応の至適 pHが 10であることが分かった。 図 2は、 種々の反応 pHでの酵素活性を、 反応 pHが 10である場合の酵素活性を基準とする相対活性 として示したグラフである。 図 2から分かるように、 この酵素は、 pH8から p H12のアル力リ性の広い範囲で最大活性の 50%以上の活性を示した。
( 2 ) 作用温度：酵素とスフインゴミエリンとの反応温度を変化させたこ と以外は、 上記方法に従って、 スフインゴミエリナーゼ活性を測定した。 図 3は、 種々の反応温度での酵素活性を、 反応温度が 37°Cである場合の活性を 基準とする相対活性として示したグラフである。 図 3に示されるように、 こ の酵素は、 20〜40°Cで活性を発揮し得、 そして反応の至適温度は 37°C付近で あつに。
( 3 ) 温度安定性：精製酵素を 50mMトリスーマレイン酸緩衝液 （ρΗ7· 0) 中で、 種々の温度で 30分間処理した後の残存活性を、 上記方法に従って測定 した。 温度処理前の酵素活性を基準として、 各温度処理後の酵素活性の残存 割合として示した。 図 4は、 種々の温度での処理後の酵素の残存活性を示す グラフである。 図 4に示されるように、 この酵素は、 4°Cから 45°Cまでの温 度での処理後では、 処理前の 90%以上の活性が残存していた。 50°Cの処理後 では、 処理前の 70%程度の活性が残存していた。
( 4 ) 各種金属塩およぴ EDTAの影響：酵素とスフインゴミエリンとの反応 の際に各種金属ィオンまたは EDTAを添加して、 スフインゴミエリナーゼ活性 を測定した。 この際に、 金属塩の沈殿を防ぐために、 グリシン一水酸化ナト リウム緩衝液 （ρΗΙΟ. Ο) をトリス一塩酸緩衝液 （pH8. 0) に変更した。 その 結果を、 金属塩を添加しない条件を 100とした相対活性で表 1に示す。 この 酵素は、 Z n 2 +、 F e 3 +、 A l 3 +、 および EDTAによって阻害を受けた。
化合物 （1 mM) 相対活性 （％)
― 100
KCI 116
NaCI 1 10
MgCI2 202
CaCI2 46
BaCI2 103
MnCI2 303
CuCI2 135
CoCI2 260
FeS04 54
ZnS04 1
FeCI3 9
AICI3 3
EDTA 0
( 5 ) 基質特異性：スフインゴミエリンの代わりに各種リン脂質を基質と して用いたこと以外は、 上記方法に従って、 スフインゴミエリナーゼ活性を 測定した。 その結果を、 スフインゴミエリンを基質とした場合を 100とした 相対活性で表 2に示す。 この酵素は、 表 2に示すような基質特異性を示した。 表 2
基質 （2mg/mD 相対活性 （％)
スフインゴミエリン 100 ホスファチジルコリン 2 ホスファチジルイノシ! ル 0 ホスファチジン酸 0 ホスファチジルエタノールァミン 0 ホスファチジルグリセロール 0 ホスファチジルセリン 0
( 6 ) 分子量： SDS- PAGE法 （12. 5% (w/v)ポリアクリルァミドゲル） に従 つて、 精製酵素の分子量を測定した結果、 精製酵素の分子量は約 35, 000であ つた （図 1 ) 。
( 7 ) 等電点： Phastgel IEF3- 10 (GEヘルスケアバイオサイエンス社製） を用いた等電点電気泳動法により、 精製酵素の等電点を測定した結果、 精製 酵素の等電点は 6. 1であった。
(実施例 3 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cmna moneus) 由来酵素の N末端ァミノ酸配列の解析）
上記実施例 1で得た精製酵素を用いて、 プロティンシーケンサーによりァ ミノ酸配列の解析を行った。 上記精製酵素の N末端ァミノ酸配列は配列番号 3に示すとおりであった。 (実施例 4 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinna moneus) NBRC12782の染色体 DNAの分離）
ス卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC 12782を、 トリプチックソィ培地 （べクトン ·ディッキンソン社製） 5mlを用 いて 28°Cで 4日間培養し、 集菌した。 次いで、 この菌体を、 0. 15M NaCl、 0. 1 M EDTA (pH8. 0) 、 および 8mg/ml リゾチームからなる溶液 800 μ 1に懸濁し、 37°Cで 45分間処理した後、 さらに- 80°Cで 10分間処理した。 次に、 これに 1% (w/v) SDS、 0. lM NaCl、 および 0. 1M トリスー塩酸緩衝液 （pH9. 0) からなる 溶液 6mlを添加し、 60°Cで 20分間処理した後、 氷冷した。 この溶液 4. 5mlにフ ェノール Zクロ口ホルム混合液 4mlを加えて攪拌し、 遠心分離により水相を 3 ml分取した。 この水相に 6mlのエタノールを添加混合して DNAを回収し、 10mM トリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) および ImM EDTAからなる溶液 900 μ 1に溶解し た。 これに、 RNaseAを SO g/mlとなるように加え、 37°Cで 1時間処理した後、 フヱノール /ク口口ホルム混合液 900 μ 1を加えて攪拌し、 遠心分離により、 水相を 600 μ ΐ分取した。 この水相に 3Μ 酢酸ナトリウム （ρΗ5. 2) 60 /_ι 1およ びエタノール 1. 2mlを添加混合し、 DNAを回収した。 この DNAを 70% (v/v)エタ ノールに 10分間浸漬した後、 10mMトリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) および ImM E DTAからなる溶液 600 μ 1に溶解した。 (実施例 5 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域のクローニング） スフィンゴミエリナーゼの N末端アミノ酸配列おょぴストレプトマイセス 属の使用コドンに基づいて、 PCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマー S1 センスプライマー （配列番号 4 ) を設計した。
また、 細菌由来スフインゴミエリナーゼのアミノ酸配列が、 ゥシ DNaselの アミノ酸配列と高い相同性を示すことがわかり、 バチルス 'セレウス (Baci llus cereus) 、 スタフイロコッカス ·才一レウス (Staphylococcus aureu s) 、 レプトスピラ 'インテロガンス (Leptospira interrogans) 由来のス フインゴミエリナーゼおよびゥシ DNaselのァミノ酸配列を比較した結果、 C 末端に近い領域で SDHYPからなるアミノ酸配列を共有していた （ヨウ マツ ォ （Y0 MATSU0) ら， プロテイン 'サイエンス （Protein Science) , 1996年，
5巻， pp. 2459- 2467) 。 このアミノ酸配列 SDHYPおよびストレブトマイセス 属の使用コドンに基づいて、 PCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマ一 A1 アンチセンスプライマー （配列番号 5 ) を設計した。 ここで、 配列中の Sは C または Gを表す。
PCRの反応液組成は次のとおりである。 上記実施例 4で得た鎵型染色体 DNA
168ng、 10 X PCR Buffer for KOD-plus- δ μ ΐ, プライマー 各 300nM、 dNTP 混合物 各 0. 2niM、 MgS04 1 、 DMS0 3%、 および K0D- plus- DNA Polymerase 1. 0ユニットに、 蒸留水を全量 50 となるように添加した。 PCR反応条件は次 のとおりである。 ステップ 1 ; 94°C、 2分；ステップ 2； 94°C、 15秒；ステツ プ 3 ； 55°C (サイクルごとに 1°Cずつ低く設定する） 、 30秒；ステップ 4； 6 8°C、 1分；ステップ 2からステップ 4を 20サイクル繰り返す； ステップ 5； 9 4°C、 15秒； ステップ 6； 40°C、 30秒； ステップ 7； 68°C、 1分；ステップ 5か らステップ 7を 30サイクル繰り返す；ステップ 8； 68°C、 3分。 PCRによって、 約 800bpの特異的な増幅産物を得た。
この PCR反応液についてァガロース電気泳動を行い、 目的の 800bpのバンド 部分を切り出し、 T0P0 Blunt Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen 製） を用いて、 pCR4- T0P0ベクターに結合させ、 大腸菌 J1109を形質転換した。 形質転換株をカナマイシン 50 / g/mlを含む LB培地 （ペプトン 1%、 酵母ェキ ス 0. 5%、 塩ィ匕ナトリゥム 1%、 pH7. 0) で培養し、 QIAprep Spin Miniprep K it (Qiagen製） を用いて DNAシーケンス用のプラスミ ドを抽出 '精製した。 続いて、 pCR4 - T0P0ベクターに由来する T7プライマーおょぴ M13 reverseプラ イマ一を用いて自動シークェンサ一によつて、 挿入断片の塩基配列を決定し た。 この塩基配列を図 5およぴ配列番号 1 2に示す。
(実施例 6 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cmna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域周辺のクローニン グ）
上記の実施例 5で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするた めに、 その上流側と下流側とに分けて、 それぞれを PCRにより増幅した。 ( a ) 上流側のクローニング
上記実施例 4で得た染色体 DNAを Sau3AIで完全消化し、 TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ社製） に付属の Sau3AI Cassetteを連結さ せてライブラリーを作製した。 これを铸型にして、 キットに付属の Cassette Primer CIとスフインゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製した アンチセンスプライマー AN1 (配列番号 6 ) とを用いて、 1回目の PCR増幅を 行った。 PCRの反応液組成は次のとおりである。 铸型染色体 DNA 500ng、 10 X EX Taq Buffer 5 μ 1、 プライマー 各 2 μ M、 dNTP混合物 各 0. 2mM、 DMS0 3%、 および TaKaRa EX Taq HS Polymerase 2. 5ュニットに、 蒸留水を全量 50 /z lと なるように添加した。 PCR反応条件は次のとおりである。 ステップ 1； 94°C、 2分；ステップ 2； 94°C、 30秒；ステップ 3； 55°C、 30秒；ステップ 4； 72°C、
1分 30秒；ステップ 2からステップ 4を 30サイクル繰り返す；ステップ 5； 72°C、 2分。 次いで、 この PCR反応液を錶型として、 キットに付属の Cassette Prime r C2とスフインゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチ センスプライマー AN2 (配列番号 7 ) とを用いて、 2回目の PCR增幅を行った。 約 400bPの特異的な増幅産物が得られ、 これを pCR4- T0P0ベクターにサブクロ 一ユングし、 塩基配列を決定した。 ( b ) 下流側のクローニング
上記実施例 4で得た染色体 DNAlOOngを Naelで完全消化し、 DNA Ligation K it (タカラバイオ社製) を用いてセルフライゲーシヨンさせて、 ライブラリ 一を作製した。 これを鎵型にして、 スフインゴミエリナーゼの部分遺伝子配 列に基づいて作製したセンスプライマー SC1 (配列番号 8 ) およびアンチセ ンスプライマー AC2 (配列番号 9 ) を用いて、 いわゆるインバース PCR増幅を 行った。 PCRの反応液組成は次のとおりである。 鎵型染色体 DNA 100ng、 10 X PCR Buffer for KOD- plus - 5 /z l、 プライマー 各 300nM、 dNTP混合物 各 0. 2m M、 MgS04 lmM、 DMSO 3%、 および KOD- plus- DNA Polymerase 1. 0ュニットに、 蒸留水を全量 50 μ 1となるように添カ卩した。 PCR反応条件は次のとおりである。 ステップ 1； 94°C、 3分；ステップ 2； 94°C、 15秒； ステップ 3； 68°C、 1分； ステップ 2からステップ 3を 35サイクル繰り返す；ステップ 4； 68°C、 3分。 PC Rによって、 約 400bpの特異的な増幅産物が得られ、 これを PCR4- T0P0ベクタ 一にサブクローユングし、 塩基配列を決定した。 上記実施例 5で決定した塩基配列と併せて上記 （a ) および （b ) で決定 した塩基配列に基づいて、 ストレプトマイセス .シンナモネウス （Streptom yces cinnamoneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遣伝子を含む領域の塩基配 列を決定し （配列番号 1 3 ) 、 さらに構造遺伝子部分についてその塩基配列 からアミノ酸配列を推定した （配列番号 1 4 ) 。 図 6は、 この決定したスフ ィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列、 およびこの塩基配列の下 段に、 構造遺伝子の推定ァミノ酸配列を示す。 図 6に示す配列解析の結果か ら、 スフインゴミエリナ一ゼをコ一ドする構造遺伝子は 999bpのヌクレオチ ドカ らなり、 333残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。 上記実施例 3にて決定したストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptom yces cinnamoneus) 由来精製酵素の N末端アミノ酸配列が、 上記推定アミノ 酸配列中に存在し、 完全に一致した （図 6中に下線で示す） 。
配列類似性検索プログラム BLASTおよび FASTAを用レ、ることにより、 上記推 定アミノ酸配列を 4種類のタンパク質配列データベース （PTR、 PRF、 UNI - PRO Tおよび SWISS-PR0T) 内の配列と比較した。 その結果、 上記推定アミノ酸配 歹 [|は、 Salinispora tropica CNB— 440株のスフィンゴミエリン .ホスホジェ ステラーゼ （スフインゴミエリナーゼ） と 52%の類似性を示した。
また、 ストレプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneu s) 由来精製酵素 （すなわちスフインゴミエリナーゼ） は、 この推定アミノ 酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、 約 32000ダルトンの分子 量を有すると推定された。
(実施例 7 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミ ドの作 製）
放線菌においてストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cin namoneus) 由来スフインゴミエリナーゼを発現させるために、 形質転換に用 いる組換えプラスミ ドを作製した。
まず、 ス卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneu s) 由来スフインゴミエリナーゼの構造遺伝子の上流域配列に Bglll部位を付 加したセンスプライマー S2 (配列番号 1 0 ) 、 および該構造遺伝子の下流域 配列に Bglll部位を付加したアンチセンスプライマー A2 (配列番号 1 1 ) を 設計した。 次いで、 これらのプライマーを用いて、 上記実施例 4で得た染色 体 DNAを铸型として PCRを行つた。 PCRの反応液組成は次のとおりである。 鎵 型染色体 DNA 168ng、 10 X PCR Buffer for K0D- plus- 5 μ 1、 プライマー 各 3 00nM、 dNTP混合物 各 0. 2mM、 MgS04 lmM、 DMS0 5%、 および K0D- plus- DNA Pol ymerase 1. 0ユニットに、 蒸留水を全量 50 1となるように添加した。 PCR反 応条件は次のとおりである。 ステップ 1 ; 94°C、 2分；ステップ 2； 94°C、 15 秒；ステップ 3； 68°C、 1分；ステップ 2からステップ 3を 30サイクル繰り返 す；ステップ 4； 68°C、 2分。 この PCRにより約 1200bpの特異的な増幅産物が 得られた。 この増幅された断片を Bglllで消化し、 放線菌プラスミ ド pIJ702 (ATCC35287、 American Type Culture Collectionより入手） の Bglll部位に 揷入して、 組換えプラスミド pIJ702- SMaseを得た。
(実施例 8 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス （Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナ一ゼ遣伝子を発現する組換え放線菌の作 製）
実施例 7で得た組換えプラスミド pIJ702 - SMaseを用いて、 「PRACTICAL ST REPT0MYCES GENETICS (Kieserら、 John Innes Foundationヽ 2000年） 」 に記 載の方法に従い、 プロ トプラス ト化された放線菌ストレプトマイセス ' リビ ダンス （Streptomyces lividans) 1326を形質転換し、 組換え放線菌ストレ プトマイセス . リビダンス （Streptomyces lividans) 1326 (pIJ702-SMas e) を得た。
(実施例 9 ： ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の酵素 活性測定）
実施例 8で得た組換え放線菌を、 20 g/mlのチォストレプトンを含む 100m 1のトリプチックソィ培地 （ベタトン 'ディッキンソン社製） で培養した。 得られた培養液から遠心分離 （15000rpm、 5分、 4°C) にて上清を回収し、 6 0% (w/v)飽和となるように硫酸アンモニゥムを加えた。 4°Cで 16時間放置し、 遠心分離にて （15000rpm、 15分、 4°C) 沈殿を回収した。 回収した沈殿を 500 μ ΐの 20mM トリス一塩酸緩衝液 (pH7. 0) に溶解し、 20mM トリスー塩酸緩衝 液 （pH7. 0) を外液として透析を行い、 0. 9mlの酵素溶液を得た。 この酵素溶 液中の酵素活性を、 上記スフインゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法に従 つて測定した。 その結果、 酵素溶液の酵素活性は 10. 2ユニット /mlであった。 なお、 ベクターであるプラスミド pi J702を用いて形質転換した放線菌ストレ プトマイセス . リビダンス （Streptomyces lividans) 1326 (pIJ702) では、 スフインゴミエリナーゼ活性は検出されなかった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 新規なスフインゴミエリナーゼおよぴその製造方法が提 供される。 スフインゴミエリナーゼをスフインゴミエリンに作用させて生成 されるセラミドは、 化粧品の基材などとして有用である。

Claims

請求の範囲
1 . スフインゴミエリンに作用し、 該スフインゴミエリンを加水分解してセ ラミ ドおよびホスホリルコリンを生成する酵素であって、 以下の （a ) から ( c ) のいずれかに記載のポリペプチドからなる、 酵素：
( a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有するポリぺプチド；
( b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数個のァ ミノ酸が置換、 揷入、 欠失および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ該加水分解活性を示すポリぺプチド；または
( c ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%の相同性を有し、 かつ該加水分解活性を示すポリぺプチド。
2 . スフインゴミエリンを基質としたときの pHIOで 37°Cにて 10分間の加水分 解活性を 100%とした場合に、 pH8から PH12の範囲内で 50%以上の加水分解活 性を示す、 請求項 1に記載の酵素。
3 . pHIOで 37°Cにて 10分間のスフインゴミエリンに対する加水分解活性を 10 0%とした場合にホスファチジルコリン、 ホスファチジルイノシトール、 ホ スファチジン酸、 ホスファチジルエタノールァミン、 ホスファチジルグリセ ロール、 およぴホスファチジルセリンに対する活性が 5 %未満である基質特 異性を有する、 請求項 1または 2に記載の酵素。
4 . 等電点が 6. 1である、 請求項 1から 3のいずれかに記載の酵素。
5 . SDS- PAGEで測定した場合の分子量が 35， 000であり、 そしてアミノ酸組成 より分析した場合の分子量が 32， 000である、 請求項 1から 4のいずれかに記 載の酵素。
6 . ストレプトマイセス （Streptomyces) 属に属する微生物に由来する、 請 求項 1から 5のいずれかに記載の酵素。
7 . 請求項 1から 6のいずれかの項に記載の酵素をコードするポリヌクレオ チド。
8 . 以下の （a ) から （c ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドである、 請求項 7に記載のポリヌクレオチド：
( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
( b ) 配列番号 1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とス トリンジェン トな条件でハイプリダイズするポリヌクレオチド；または
( c ) 配列番号 1に記載の塩基配列と少なくとも 80%の配列同一性を有す るポリヌクレオチド。
9 . ストレプトマイセス （Streptomyces) 属に属する微生物に由来する、 請 求項 7または 8に記載のポリヌクレオチド。
1 0 . 請求項 7から 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
1 1 . 請求項 7から 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項 1 0に記載のベクターが導入され、 スフインゴミエリンからセラミ ドおよびホ スホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体。
1 2 . 前記形質転換体の宿主が、 ストレプトマイセス （Streptomyces) 属に 属する微生物である、 請求項 1 1に記載の形質転換体。
1 3 . スフインゴミエリンに作用し、 該スフインゴミエリンを加水分解して セラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方法であって、 請求項 7カゝら 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項 1 0に 記載のベクターを宿主に導入して、 該酵素を産生する形質転換体を得るェ 程；および
該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程
を含む、 方法。
1 4 . 前記宿主が、 ストレプトマイセス （Streptomyces) 属に属する微生物 である、 請求項 1 3に記載の製造方法。
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