JPWO2008136451A1 - スフィンゴミエリナーゼ - Google Patents
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Abstract
本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法が提供される。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチドからなる。１つの実施態様では、本発明の酵素は、スフィンゴミエリンを基質としたときのｐＨ１０で３７℃にて１０分間の加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す。
Description
本発明は、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法に関する。
スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンに作用し、セラミドとホスホリルコリンとを生成する酵素であり、酵素番号Ｅ．Ｃ．３．１．４．１２として知られている。近年、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）由来のスフィンゴミエリナーゼの立体構造が解明され、その触媒メカニズムの研究は、動物細胞のスフィンゴミエリナーゼが関与するといわれる細胞の分化、老化、アポトーシスの解明にも重要であると考えられている（ヒデオ アゴウ（Ｈｉｄｅｏ Ａｇｏ）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２００６年，２８１巻（２３号），ｐｐ．１６１５７−１６１６７）。また、スフィンゴミエリンからスフィンゴミエリナーゼによって生成されるセラミドは、皮膚の角質層にある脂質で、肌の保湿に重要な成分であり、化粧品の基材としても知られている。また、セラミドはアトピー性皮膚炎との関連も注目されており、その治療薬としての開発も期待される。
スフィンゴミエリナーゼは、種々の動物組織、脳、肺、肝、腎、副腎、脾、精巣、胎盤などに存在する。
細菌由来では、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ヒロオ イケザワ（ＨＩＲＯＨ ＩＫＥＺＡＷＡ）ら，バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．），１９７８年，５２８巻，ｐｐ．２４７−２５６）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ヘイゼル エム．ドウリー（ＨＡＺＥＬ Ｍ．ＤＯＥＲＹ）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９６５年，４０巻，ｐｐ．２８３−２９６）、リステリア・イワノヴィ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）（ブルーノ ゴンザレス−ゾルン（Ｂｒｕｎｏ Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｏｒｎ）ら，モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９９９年，３３巻，ｐｐ．５１０−５２３）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（ルウド ピー．エイ．エム．セガース（ＲＵＵＤ Ｐ．Ａ．Ｍ．ＳＥＧＥＲＳ）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｅ．），１９９０年，５８巻，ｐｐ．２１７７−２１８５）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（イル−チュン チャン（Ｅｒｒ−Ｃｈｅｎｇ Ｃｈａｎ）ら，バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０００年，３９巻，ｐｐ．４８３８−４８４５）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）（ノリユキ スエヨシ（Ｎｏｒｉｙｕｋｉ Ｓｕｅｙｏｓｈｉ）ら，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），２００２年，１８４巻（２号），ｐｐ．５４０−５４６）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（ケイタロウ スズキ（Ｋｅｉｔａｒｏｕ ＳＵＺＵＫＩ）ら，バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９９５年，５９巻（１１号），ｐｐ．２０８１−２０８６、特開昭５８−４３７８６号公報）などに見出されている。このうち、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（アキヒロ ヤマダ（Ａｋｉｈｉｒｏ ＹＡＭＡＤＡ）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９８８年，１７５巻，ｐｐ．２１３−２２０）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（デイビッド シー．コールマン（Ｄａｖｉｄ Ｃ．Ｃｏｌｅｍａｎ）ら，マイクロバイアル・パソジェネシス（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．），１９８６年，１巻，ｐｐ．５４９−５６４）、リステリア・イワノヴィ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）（ブルーノ ゴンザレス−ゾルン（Ｂｒｕｎｏ Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｏｒｎ）ら，モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９９９年，３３巻，ｐｐ．５１０−５２３）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（ルウド ピー．エイ．エム．セガース（ＲＵＵＤ Ｐ．Ａ．Ｍ．ＳＥＧＥＲＳ）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．），１９９０年，５８巻，ｐｐ．２１７７−２１８５）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）（ノリユキ スエヨシ（Ｎｏｒｉｙｕｋｉ Ｓｕｅｙｏｓｈｉ）ら，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），２００２年，１８４巻（２号），ｐｐ．５４０−５４６）由来のスフィンゴミエリナーゼは、それらの遺伝子がクローニングされており、アミノ酸配列も解明されている。
また、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（ヨシオ ヤマカワ（Ｙｏｓｈｉｏ ＹＡＭＡＫＡＷＡ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７７年，８１巻，ｐｐ．１１５−１２６）、クロストリジウム・ノヴィ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）（リョウ タグチ（ＲＹＯ ＴＡＧＵＣＨＩ）ら，バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．），１９７５年，４０９巻，ｐｐ．７５−８５およびリョウ タグチ（Ｒｙｏ ＴＡＧＵＣＨＩ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７７年，８２巻，ｐｐ．１２１７−１２２３）、ストレプトマイセス・ハチジョウエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｉｓ）（現ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ））（ヨシオ オオカワ（Ｙｏｓｈｉｏ ＯＫＡＷＡ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７５年，７８巻，ｐｐ．５３７−５４５）由来のホスホリパーゼＣが、スフィンゴミエリナーゼ活性を有することが知られている。
さらに、サリニスポラ・トロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）およびサリニスポラ・アレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）のスフィンゴミエリナーゼの遺伝子が報告されているが、その性質は明らかではない。
スフィンゴミエリナーゼを産業上利用するにあたっては、動物組織由来ではスフィンゴミエリナーゼを大量生産することは困難であり、細菌由来が望ましいと考えられる。しかし、スフィンゴミエリナーゼを生成する細菌のなかには、病原性が指摘されているものが多く、その応用範囲が限定されかねない。
スフィンゴミエリナーゼは、種々の動物組織、脳、肺、肝、腎、副腎、脾、精巣、胎盤などに存在する。
細菌由来では、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ヒロオ イケザワ（ＨＩＲＯＨ ＩＫＥＺＡＷＡ）ら，バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．），１９７８年，５２８巻，ｐｐ．２４７−２５６）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ヘイゼル エム．ドウリー（ＨＡＺＥＬ Ｍ．ＤＯＥＲＹ）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９６５年，４０巻，ｐｐ．２８３−２９６）、リステリア・イワノヴィ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）（ブルーノ ゴンザレス−ゾルン（Ｂｒｕｎｏ Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｏｒｎ）ら，モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９９９年，３３巻，ｐｐ．５１０−５２３）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（ルウド ピー．エイ．エム．セガース（ＲＵＵＤ Ｐ．Ａ．Ｍ．ＳＥＧＥＲＳ）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｅ．），１９９０年，５８巻，ｐｐ．２１７７−２１８５）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（イル−チュン チャン（Ｅｒｒ−Ｃｈｅｎｇ Ｃｈａｎ）ら，バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０００年，３９巻，ｐｐ．４８３８−４８４５）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）（ノリユキ スエヨシ（Ｎｏｒｉｙｕｋｉ Ｓｕｅｙｏｓｈｉ）ら，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），２００２年，１８４巻（２号），ｐｐ．５４０−５４６）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（ケイタロウ スズキ（Ｋｅｉｔａｒｏｕ ＳＵＺＵＫＩ）ら，バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９９５年，５９巻（１１号），ｐｐ．２０８１−２０８６、特開昭５８−４３７８６号公報）などに見出されている。このうち、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（アキヒロ ヤマダ（Ａｋｉｈｉｒｏ ＹＡＭＡＤＡ）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９８８年，１７５巻，ｐｐ．２１３−２２０）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（デイビッド シー．コールマン（Ｄａｖｉｄ Ｃ．Ｃｏｌｅｍａｎ）ら，マイクロバイアル・パソジェネシス（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．），１９８６年，１巻，ｐｐ．５４９−５６４）、リステリア・イワノヴィ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）（ブルーノ ゴンザレス−ゾルン（Ｂｒｕｎｏ Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｏｒｎ）ら，モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），１９９９年，３３巻，ｐｐ．５１０−５２３）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（ルウド ピー．エイ．エム．セガース（ＲＵＵＤ Ｐ．Ａ．Ｍ．ＳＥＧＥＲＳ）ら，インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．），１９９０年，５８巻，ｐｐ．２１７７−２１８５）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）（ノリユキ スエヨシ（Ｎｏｒｉｙｕｋｉ Ｓｕｅｙｏｓｈｉ）ら，ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），２００２年，１８４巻（２号），ｐｐ．５４０−５４６）由来のスフィンゴミエリナーゼは、それらの遺伝子がクローニングされており、アミノ酸配列も解明されている。
また、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（ヨシオ ヤマカワ（Ｙｏｓｈｉｏ ＹＡＭＡＫＡＷＡ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７７年，８１巻，ｐｐ．１１５−１２６）、クロストリジウム・ノヴィ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）（リョウ タグチ（ＲＹＯ ＴＡＧＵＣＨＩ）ら，バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．），１９７５年，４０９巻，ｐｐ．７５−８５およびリョウ タグチ（Ｒｙｏ ＴＡＧＵＣＨＩ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７７年，８２巻，ｐｐ．１２１７−１２２３）、ストレプトマイセス・ハチジョウエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｉｓ）（現ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ））（ヨシオ オオカワ（Ｙｏｓｈｉｏ ＯＫＡＷＡ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９７５年，７８巻，ｐｐ．５３７−５４５）由来のホスホリパーゼＣが、スフィンゴミエリナーゼ活性を有することが知られている。
さらに、サリニスポラ・トロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）およびサリニスポラ・アレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）のスフィンゴミエリナーゼの遺伝子が報告されているが、その性質は明らかではない。
スフィンゴミエリナーゼを産業上利用するにあたっては、動物組織由来ではスフィンゴミエリナーゼを大量生産することは困難であり、細菌由来が望ましいと考えられる。しかし、スフィンゴミエリナーゼを生成する細菌のなかには、病原性が指摘されているものが多く、その応用範囲が限定されかねない。
本発明は、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、新規なスフィンゴミエリナーゼを得ることを目的として、該酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から新規な性質を有するスフィンゴミエリナーゼを見出した。
さらに本発明者らは、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにして、この遺伝子が新規な遺伝子であることを確認した。また、この遺伝子を用いて発現プラスミドを構築し、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を形質転換することにより、該酵素を効率よく生産する微生物を得た。
本発明は、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を提供し、この酵素は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドからなる：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解作用を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解作用を示すポリペプチド。
１つの実施態様では、上記酵素は、スフィンゴミエリンを基質としたときのｐＨ１０で３７℃にて１０分間の加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す。
別の実施態様では、上記酵素は、ｐＨ１０で３７℃にて１０分間のスフィンゴミエリンに対する加水分解活性を１００％とした場合にホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する活性が５％未満である基質特異性を有する。
別の実施態様では、上記酵素は、等電点が６．１である。
さらに別の実施態様では、上記酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が３５，０００であり、そしてアミノ酸組成より分析した場合の分子量が３２，０００である。
なお別の実施態様では、上記酵素は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
本発明はまた、上記酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
別の実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターが導入され、スフィンゴミエリンからセラミドとホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を提供する。
１つの実施態様では、上記形質転換体の宿主は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
本発明はさらに、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方法を提供し、この方法は、
上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得る工程；および該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程を含む。
１つの実施態様では、上記宿主は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼが提供される。さらに、該酵素を微生物によって効率よく生産する方法が提供される。
本発明者らは、新規なスフィンゴミエリナーゼを得ることを目的として、該酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から新規な性質を有するスフィンゴミエリナーゼを見出した。
さらに本発明者らは、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにして、この遺伝子が新規な遺伝子であることを確認した。また、この遺伝子を用いて発現プラスミドを構築し、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を形質転換することにより、該酵素を効率よく生産する微生物を得た。
本発明は、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を提供し、この酵素は、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドからなる：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解作用を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解作用を示すポリペプチド。
１つの実施態様では、上記酵素は、スフィンゴミエリンを基質としたときのｐＨ１０で３７℃にて１０分間の加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す。
別の実施態様では、上記酵素は、ｐＨ１０で３７℃にて１０分間のスフィンゴミエリンに対する加水分解活性を１００％とした場合にホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する活性が５％未満である基質特異性を有する。
別の実施態様では、上記酵素は、等電点が６．１である。
さらに別の実施態様では、上記酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が３５，０００であり、そしてアミノ酸組成より分析した場合の分子量が３２，０００である。
なお別の実施態様では、上記酵素は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
本発明はまた、上記酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
別の実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターが導入され、スフィンゴミエリンからセラミドとホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を提供する。
１つの実施態様では、上記形質転換体の宿主は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
本発明はさらに、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方法を提供し、この方法は、
上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得る工程；および該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程を含む。
１つの実施態様では、上記宿主は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。
本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼが提供される。さらに、該酵素を微生物によって効率よく生産する方法が提供される。
図１は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）培養液からの精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す電気泳動写真である。
図２は、ｐＨが１０である場合の酵素活性を基準とした、種々のｐＨでのストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図３は、反応温度が３７℃である場合の酵素活性を基準とした、種々の温度でのストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図４は、種々の温度での処理後のストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素の残存活性を示すグラフである。
図５は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）からクローニングしたスフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域の塩基配列を示す図である。
図６は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列および構造遺伝子についての推定アミノ酸配列を示す図である。
図２は、ｐＨが１０である場合の酵素活性を基準とした、種々のｐＨでのストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図３は、反応温度が３７℃である場合の酵素活性を基準とした、種々の温度でのストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。
図４は、種々の温度での処理後のストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素の残存活性を示すグラフである。
図５は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）からクローニングしたスフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域の塩基配列を示す図である。
図６は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列および構造遺伝子についての推定アミノ酸配列を示す図である。
本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われ、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。
本発明において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導される）、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
（スフィンゴミエリナーゼ）
本発明は、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素（スフィンゴミエリナーゼ）を提供する。
本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性は、例えば、以下のようにして確認され得るが、確認方法はこれに限定されない。
酵素を、まず２ｍｇ／ｍｌの卵黄由来スフィンゴミエリン（Ｓｉｇｍａ製）を含む２０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に添加し、これを３７℃で１０分間インキュベートして、スフィンゴミエリンを加水分解する。次いで、沸騰水中で５分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の１／５０量を分取する。分取した上清に、５０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、および０．１ユニット／ｍｌの子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を４倍量で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させる。さらに、その遊離リン酸を定量するために、９倍量のＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製）を添加し、室温で３０分間放置後、波長６２０ｎｍの吸光度を測定する。この場合、スフィンゴミエリナーゼの酵素量は、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を生成する酵素量を１ユニットとする。
本酵素は、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用いて上記のスフィンゴミエリンと酵素との反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ７〜１３）でスフィンゴミエリナーゼ活性を示し得る。至適ｐＨはｐＨ８〜１２．５の範囲内にあり得る。好ましくは至適ｐＨが９〜１２の範囲内にあり、より好ましくは１０〜１１の範囲内にあり、さらに好ましくは１０付近である。本発明の酵素は、例えば、上記のようにスフィンゴミエリンと酵素とを３７℃にて１０分間反応させた条件下でｐＨ１０における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の活性を示し得る。
本酵素は、例えば、上記のスフィンゴミエリンと酵素との反応条件下では、約２０〜４０℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３０〜４０℃の範囲内にあり、より好ましくは３５〜４０℃の範囲内にあり、さらにより好ましくは約３７℃である。
本酵素は、例えば、５０ｍＭ トリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３０分間処理した場合、４℃から４５℃まででは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり得、そして５０℃でも７０％程度の活性が残存している。
本酵素は、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて上記のスフィンゴミエリンと酵素溶液との反応条件下におくと、１ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋で活性が促進され得るが、１ｍＭのＺｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、およびＥＤＴＡで活性が阻害され得る。
本酵素は、ｐＨ１０の条件下で該酵素と基質とを３７℃にて１０分間反応させた場合、スフィンゴミエリンが基質である場合に対する加水分解活性を１００％とすると、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）を基質とした場合に対する活性が５％未満である基質特異性を有し得る。
本酵素は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約３５，０００ダルトンを示す。このストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、そのアミノ酸組成から計算した分子量は約３２，０００ダルトンである。
本酵素は、泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、Ｐｈａｓｔｇｅｌ ＩＥＦ３−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた等電点電気泳動法により、６．１の等電点を示す。
本発明のスフィンゴミエリナーゼは、好ましくは配列番号２の１位から３３３位までのアミノ酸配列（本明細書では、「配列番号２に記載のアミノ酸配列」ともいう）を有する。本酵素は、スフィンゴミエリナーゼ活性（例えば、スフィンゴミエリンを加水分解する活性；以下も同様である）を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても良い。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本発明において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフィンゴミエリナーゼに含まれる。
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフィンゴミエリナーゼに含まれる。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
本発明のスフィンゴミエリナーゼの供給源は特に限定されないが、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくはストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２が挙げられる。
例えば、上記ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤として製造することができる。
スフィンゴミエリナーゼ酵素製剤の製造に用い得る微生物は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＲＣ１２７８２に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属しかつ本発明のスフィンゴミエリナーゼを生産し得る微生物であればよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、スフィンゴミエリナーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であっても本発明に用いることができる。
ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２を用いたスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。本菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、本菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であり、好ましくは１〜７日間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
本発明のスフィンゴミエリナーゼは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーを繰り返し行うことによりポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。
（スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチド）
上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であり得る。本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の１位から９９９位までの塩基配列（本明細書では、「配列番号１に記載の塩基配列」ともいう）を有する。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明のスフィンゴミエリナーゼの好ましい形態を構成する。
本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸を含み、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしてはまた、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズでき、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記微生物（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、好ましくは、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２）から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。上記塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、または１００個の連続した配列を１つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
さらに、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）検索は、上で説明したとおりである。また、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定および検索についても、上で説明したとおりである。
上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。
（ベクターおよび形質転換体）
本発明によれば、上記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。また、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入することにより、スフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を作製することもできる。
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。微生物中で、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、より好ましくはターミネーターを３’側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されている。
形質転換の対象となる宿主は、上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、スフィンゴミエリナーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したスフィンゴミエリナーゼを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤を製造することができる。宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。
本発明において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導される）、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
（スフィンゴミエリナーゼ）
本発明は、スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素（スフィンゴミエリナーゼ）を提供する。
本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性は、例えば、以下のようにして確認され得るが、確認方法はこれに限定されない。
酵素を、まず２ｍｇ／ｍｌの卵黄由来スフィンゴミエリン（Ｓｉｇｍａ製）を含む２０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に添加し、これを３７℃で１０分間インキュベートして、スフィンゴミエリンを加水分解する。次いで、沸騰水中で５分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の１／５０量を分取する。分取した上清に、５０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、および０．１ユニット／ｍｌの子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を４倍量で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させる。さらに、その遊離リン酸を定量するために、９倍量のＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製）を添加し、室温で３０分間放置後、波長６２０ｎｍの吸光度を測定する。この場合、スフィンゴミエリナーゼの酵素量は、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を生成する酵素量を１ユニットとする。
本酵素は、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用いて上記のスフィンゴミエリンと酵素との反応条件下におくと、そのｐＨ範囲内（ｐＨ７〜１３）でスフィンゴミエリナーゼ活性を示し得る。至適ｐＨはｐＨ８〜１２．５の範囲内にあり得る。好ましくは至適ｐＨが９〜１２の範囲内にあり、より好ましくは１０〜１１の範囲内にあり、さらに好ましくは１０付近である。本発明の酵素は、例えば、上記のようにスフィンゴミエリンと酵素とを３７℃にて１０分間反応させた条件下でｐＨ１０における加水分解活性を１００％とした場合、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の活性を示し得る。
本酵素は、例えば、上記のスフィンゴミエリンと酵素との反応条件下では、約２０〜４０℃で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３０〜４０℃の範囲内にあり、より好ましくは３５〜４０℃の範囲内にあり、さらにより好ましくは約３７℃である。
本酵素は、例えば、５０ｍＭ トリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３０分間処理した場合、４℃から４５℃まででは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり得、そして５０℃でも７０％程度の活性が残存している。
本酵素は、例えば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて上記のスフィンゴミエリンと酵素溶液との反応条件下におくと、１ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋で活性が促進され得るが、１ｍＭのＺｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、およびＥＤＴＡで活性が阻害され得る。
本酵素は、ｐＨ１０の条件下で該酵素と基質とを３７℃にて１０分間反応させた場合、スフィンゴミエリンが基質である場合に対する加水分解活性を１００％とすると、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）を基質とした場合に対する活性が５％未満である基質特異性を有し得る。
本酵素は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約３５，０００ダルトンを示す。このストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、そのアミノ酸組成から計算した分子量は約３２，０００ダルトンである。
本酵素は、泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２由来の天然の酵素は、Ｐｈａｓｔｇｅｌ ＩＥＦ３−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた等電点電気泳動法により、６．１の等電点を示す。
本発明のスフィンゴミエリナーゼは、好ましくは配列番号２の１位から３３３位までのアミノ酸配列（本明細書では、「配列番号２に記載のアミノ酸配列」ともいう）を有する。本酵素は、スフィンゴミエリナーゼ活性（例えば、スフィンゴミエリンを加水分解する活性；以下も同様である）を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても良い。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本発明において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフィンゴミエリナーゼに含まれる。
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフィンゴミエリナーゼに含まれる。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
本発明のスフィンゴミエリナーゼの供給源は特に限定されないが、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくはストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２が挙げられる。
例えば、上記ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤として製造することができる。
スフィンゴミエリナーゼ酵素製剤の製造に用い得る微生物は、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＲＣ１２７８２に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属しかつ本発明のスフィンゴミエリナーゼを生産し得る微生物であればよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、スフィンゴミエリナーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であっても本発明に用いることができる。
ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２を用いたスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。本菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、本菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であり、好ましくは１〜７日間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
本発明のスフィンゴミエリナーゼは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーを繰り返し行うことによりポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。
（スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチド）
上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であり得る。本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の１位から９９９位までの塩基配列（本明細書では、「配列番号１に記載の塩基配列」ともいう）を有する。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明のスフィンゴミエリナーゼの好ましい形態を構成する。
本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸を含み、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしてはまた、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズでき、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記微生物（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、好ましくは、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２）から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。上記塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、または１００個の連続した配列を１つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
さらに、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）検索は、上で説明したとおりである。また、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつスフィンゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定および検索についても、上で説明したとおりである。
上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。
（ベクターおよび形質転換体）
本発明によれば、上記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。また、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入することにより、スフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を作製することもできる。
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。微生物中で、本発明のスフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、より好ましくはターミネーターを３’側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されている。
形質転換の対象となる宿主は、上記スフィンゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、スフィンゴミエリナーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したスフィンゴミエリナーゼを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してスフィンゴミエリナーゼ酵素製剤を製造することができる。宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（スフィンゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法）
本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のように行った：
まず２ｍｇ／ｍｌの卵黄由来スフィンゴミエリン（Ｓｉｇｍａ製）および酵素溶液を含む２０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を、３７℃で１０分間インキュベートして、スフィンゴミエリンを加水分解した。次いで、沸騰水中で５分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の１／５０量を分取した。分取した上清に、５０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、および０．１ユニット／ｍｌの子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を４倍量で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させた。さらに、その遊離リン酸を定量するために、９倍量のＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製）を添加し、室温で３０分間放置後、波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。なお、本実施例のスフィンゴミエリナーゼについては、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を生成する酵素量を１ユニットとした。
（実施例１：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素の精製）
（ａ）培養
ポリペプトン（日本製薬製）１％（ｗ／ｖ）、肉エキス（鰹由来、和光純薬製）１％（ｗ／ｖ）、グルコース１％（ｗ／ｖ）、および塩化ナトリウム０．３％（ｗ／ｖ）からなる培地４Ｌを調製し、３Ｌ容バッフル付き三角フラスコに５００ｍｌずつ分注して、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。予め「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．」ＤＡ Ｈｏｐｗｏｏｄ，ＭＪ Ｂｉｂｂ，ＫＦ Ｃｈａｔｅｒ，Ｔ Ｋｉｅｓｅｒ，ＣＪ Ｂｒｕｔｏｎ，ＨＭ Ｋｉｅｓｅｒ，ＤＪ Ｌｙｄｉａｔｅ，ＣＰ Ｓｍｉｔｈ，ＪＭ ＷａｒｄおよびＨ Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，出版元Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１９８５年の方法で調製しておいたストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）の胞子懸濁液を０．１ｍｌずつ接種し、３０℃で６０時間振とう培養した。この培養液をＡＤＶＡＮＴＥＣ製Ｎｏ２濾紙を用いて濾過することにより、上清を回収した。
（ｂ）硫安分画
（ａ）で回収した培養上清に３０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により除去した。さらに、該溶液に６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により集めた。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６０ｍｌに溶解し、同一緩衝液で透析し、粗酵素液を得た。
（ｃ）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ２００ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．８Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
（ｄ）ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムクロマトグラフィー
（ｃ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し脱塩した。これを、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（６ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．８Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析した。図１は、この溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、溶出画分のバンドを示す。その結果、単一のバンドが観察された（図１）。
このようにして、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２より、電気泳動的に単一に精製された酵素を得た。
（実施例２：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素の性質の測定）
上記の実施例１で得た精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を上記方法で測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を有することを確認した。この精製酵素の酵素学的性質について検討した。
（１）作用ｐＨ：緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用いてｐＨを変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。その結果、この酵素は、反応の至適ｐＨが１０であることが分かった。図２は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが１０である場合の酵素活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図２から分かるように、この酵素は、ｐＨ８からｐＨ１２のアルカリ性の広い範囲で最大活性の５０％以上の活性を示した。
（２）作用温度：酵素とスフィンゴミエリンとの反応温度を変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が３７℃である場合の活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図３に示されるように、この酵素は、２０〜４０℃で活性を発揮し得、そして反応の至適温度は３７℃付近であった。
（３）温度安定性：精製酵素を５０ｍＭ トリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、種々の温度で３０分間処理した後の残存活性を、上記方法に従って測定した。温度処理前の酵素活性を基準として、各温度処理後の酵素活性の残存割合として示した。図４は、種々の温度での処理後の酵素の残存活性を示すグラフである。図４に示されるように、この酵素は、４℃から４５℃までの温度での処理後では、処理前の９０％以上の活性が残存していた。５０℃の処理後では、処理前の７０％程度の活性が残存していた。
（４）各種金属塩およびＥＤＴＡの影響：酵素とスフィンゴミエリンとの反応の際に各種金属イオンまたはＥＤＴＡを添加して、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。この際に、金属塩の沈殿を防ぐために、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に変更した。その結果を、金属塩を添加しない条件を１００とした相対活性で表１に示す。この酵素は、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、およびＥＤＴＡによって阻害を受けた。
（５）基質特異性：スフィンゴミエリンの代わりに各種リン脂質を基質として用いたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。その結果を、スフィンゴミエリンを基質とした場合を１００とした相対活性で表２に示す。この酵素は、表２に示すような基質特異性を示した。
（６）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）に従って、精製酵素の分子量を測定した結果、精製酵素の分子量は約３５，０００であった（図１）。
（７）等電点：Ｐｈａｓｔｇｅｌ ＩＥＦ３−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた等電点電気泳動法により、精製酵素の等電点を測定した結果、精製酵素の等電点は６．１であった。
（実施例３：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素のＮ末端アミノ酸配列の解析）
上記実施例１で得た精製酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列の解析を行った。上記精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は配列番号３に示すとおりであった。
（実施例４：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２の染色体ＤＮＡの分離）
ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２を、トリプチックソイ培地（ベクトン・ディンキンソン社製）５ｍｌを用いて２８℃で４日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および８ｍｇ／ｍｌ リゾチームからなる溶液８００μｌに懸濁し、３７℃で４５分間処理した後、さらに−８０℃で１０分間処理した。次に、これに１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）からなる溶液６ｍｌを添加し、６０℃で２０分間処理した後、氷冷した。この溶液４．５ｍｌにフェノール／クロロホルム混合液４ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離により水相を３ｍｌ分取した。この水相に６ｍｌのエタノールを添加混合してＤＮＡを回収し、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液９００μｌに溶解した。これに、ＲＮａｓｅＡを２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、フェノール／クロロホルム混合液９００μｌを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を６００μｌ分取した。この水相に３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）６０μｌおよびエタノール１．２ｍｌを添加混合し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液６００μｌに溶解した。
（実施例５：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域のクローニング）
スフィンゴミエリナーゼのＮ末端アミノ酸配列およびストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＳ１センスプライマー（配列番号４）を設計した。
また、細菌由来スフィンゴミエリナーゼのアミノ酸配列が、ウシＤＮａｓｅＩのアミノ酸配列と高い相同性を示すことがわかり、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）由来のスフィンゴミエリナーゼおよびウシＤＮａｓｅＩのアミノ酸配列を比較した結果、Ｃ末端に近い領域でＳＤＨＹＰからなるアミノ酸配列を共有していた（ヨウ マツオ（ＹＯ ＭＡＴＳＵＯ）ら，プロテイン・サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９６年，５巻，ｐｐ．２４５９−２４６７）。このアミノ酸配列ＳＤＨＹＰおよびストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＡ１アンチセンスプライマー（配列番号５）を設計した。ここで、配列中のＳはＣまたはＧを表す。
ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。上記実施例４で得た鋳型染色体ＤＮＡ１６８ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー 各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＤＭＳＯ ３％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；５５℃（サイクルごとに１℃ずつ低く設定する）、３０秒；ステップ４；６８℃、１分；ステップ２からステップ４を２０サイクル繰り返す；ステップ５；９４℃、１５秒；ステップ６；４０℃、３０秒；ステップ７；６８℃、１分；ステップ５からステップ７を３０サイクル繰り返す；ステップ８；６８℃、３分。ＰＣＲによって、約８００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。
このＰＣＲ反応液についてアガロース電気泳動を行い、目的の８００ｂｐのバンド部分を切り出し、ＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに結合させ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、ｐＨ７．０）で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに由来するＴ７プライマーおよびＭ１３ ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列を図５および配列番号１２に示す。
（実施例６：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域周辺のクローニング）
上記の実施例５で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、その上流側と下流側とに分けて、それぞれをＰＣＲにより増幅した。
（ａ）上流側のクローニング
上記実施例４で得た染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで完全消化し、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に付属のＳａｕ３ＡＩ Ｃａｓｓｅｔｔｅを連結させてライブラリーを作製した。これを鋳型にして、キットに付属のＣａｓｓｅｔｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１とスフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマーＡＮ１（配列番号６）とを用いて、１回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ ５００ｎｇ、１０×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、プライマー 各２μＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＤＭＳＯ ３％、およびＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ ＨＳ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、３０秒；ステップ３；５５℃、３０秒；ステップ４；７２℃、１分３０秒；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；ステップ５；７２℃、２分。次いで、このＰＣＲ反応液を鋳型として、キットに付属のＣａｓｓｅｔｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃ２とスフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマーＡＮ２（配列番号７）とを用いて、２回目のＰＣＲ増幅を行った。約４００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
（ｂ）下流側のクローニング
上記実施例４で得た染色体ＤＮＡ１００ｎｇをＮａｅＩで完全消化し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてセルフライゲーションさせて、ライブラリーを作製した。これを鋳型にして、スフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したセンスプライマーＳＣ１（配列番号８）およびアンチセンスプライマーＡＣ２（配列番号９）を用いて、いわゆるインバースＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ １００ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー 各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＤＭＳＯ ３％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、３分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；６８℃、１分；ステップ２からステップ３を３５サイクル繰り返す；ステップ４；６８℃、３分。ＰＣＲによって、約４００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
上記実施例５で決定した塩基配列と併せて上記（ａ）および（ｂ）で決定した塩基配列に基づいて、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列を決定し（配列番号１３）、さらに構造遺伝子部分についてその塩基配列からアミノ酸配列を推定した（配列番号１４）。図６は、この決定したスフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列、およびこの塩基配列の下段に、構造遺伝子の推定アミノ酸配列を示す。図６に示す配列解析の結果から、スフィンゴミエリナーゼをコードする構造遺伝子は９９９ｂｐのヌクレオチドからなり、３３３残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。上記実施例３にて決定したストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のＮ末端アミノ酸配列が、上記推定アミノ酸配列中に存在し、完全に一致した（図６中に下線で示す）。
配列類似性検索プログラムＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡを用いることにより、上記推定アミノ酸配列を４種類のタンパク質配列データベース（ＰＴＲ、ＰＲＦ、ＵＮＩ−ＰＲＯＴおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）内の配列と比較した。その結果、上記推定アミノ酸配列は、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ ＣＮＢ−４４０株のスフィンゴミエリン・ホスホジエステラーゼ（スフィンゴミエリナーゼ）と５２％の類似性を示した。
また、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素（すなわちスフィンゴミエリナーゼ）は、この推定アミノ酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、約３２０００ダルトンの分子量を有すると推定された。
（実施例７：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製）
放線菌においてストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼを発現させるために、形質転換に用いる組換えプラスミドを作製した。
まず、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼの構造遺伝子の上流域配列にＢｇｌＩＩ部位を付加したセンスプライマーＳ２（配列番号１０）、および該構造遺伝子の下流域配列にＢｇｌＩＩ部位を付加したアンチセンスプライマーＡ２（配列番号１１）を設計した。次いで、これらのプライマーを用いて、上記実施例４で得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ １６８ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー 各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＤＭＳＯ ５％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；６８℃、１分；ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；ステップ４；６８℃、２分。このＰＣＲにより約１２００ｂｐの特異的な増幅産物が得られた。この増幅された断片をＢｇｌＩＩで消化し、放線菌プラスミドｐＩＪ７０２（ＡＴＣＣ３５２８７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）のＢｇｌＩＩ部位に挿入して、組換えプラスミドｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅを得た。
（実施例８：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の作製）
実施例７で得た組換えプラスミドｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅを用いて、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」に記載の方法に従い、プロトプラスト化された放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６を形質転換し、組換え放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６（ｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅ）を得た。
（実施例９：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の酵素活性測定）
実施例８で得た組換え放線菌を、２０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む１００ｍｌのトリプチックソイ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で培養した。得られた培養液から遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１６時間放置し、遠心分離にて（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）沈殿を回収した。回収した沈殿を５００μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を外液として透析を行い、０．９ｍｌの酵素溶液を得た。この酵素溶液中の酵素活性を、上記スフィンゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法に従って測定した。その結果、酵素溶液の酵素活性は１０．２ユニット／ｍｌであった。なお、ベクターであるプラスミドｐＩＪ７０２を用いて形質転換した放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６（ｐＩＪ７０２）では、スフィンゴミエリナーゼ活性は検出されなかった。
（スフィンゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法）
本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のように行った：
まず２ｍｇ／ｍｌの卵黄由来スフィンゴミエリン（Ｓｉｇｍａ製）および酵素溶液を含む２０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を、３７℃で１０分間インキュベートして、スフィンゴミエリンを加水分解した。次いで、沸騰水中で５分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の１／５０量を分取した。分取した上清に、５０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、および０．１ユニット／ｍｌの子ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を４倍量で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させた。さらに、その遊離リン酸を定量するために、９倍量のＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製）を添加し、室温で３０分間放置後、波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。なお、本実施例のスフィンゴミエリナーゼについては、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において１分間に１μｍｏｌのリン酸を生成する酵素量を１ユニットとした。
（実施例１：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素の精製）
（ａ）培養
ポリペプトン（日本製薬製）１％（ｗ／ｖ）、肉エキス（鰹由来、和光純薬製）１％（ｗ／ｖ）、グルコース１％（ｗ／ｖ）、および塩化ナトリウム０．３％（ｗ／ｖ）からなる培地４Ｌを調製し、３Ｌ容バッフル付き三角フラスコに５００ｍｌずつ分注して、１２１℃で２０分間蒸気殺菌を行った。予め「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．」ＤＡ Ｈｏｐｗｏｏｄ，ＭＪ Ｂｉｂｂ，ＫＦ Ｃｈａｔｅｒ，Ｔ Ｋｉｅｓｅｒ，ＣＪ Ｂｒｕｔｏｎ，ＨＭ Ｋｉｅｓｅｒ，ＤＪ Ｌｙｄｉａｔｅ，ＣＰ Ｓｍｉｔｈ，ＪＭ ＷａｒｄおよびＨ Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，出版元Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１９８５年の方法で調製しておいたストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２（独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）の胞子懸濁液を０．１ｍｌずつ接種し、３０℃で６０時間振とう培養した。この培養液をＡＤＶＡＮＴＥＣ製Ｎｏ２濾紙を用いて濾過することにより、上清を回収した。
（ｂ）硫安分画
（ａ）で回収した培養上清に３０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により除去した。さらに、該溶液に６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（７５００ｒｐｍ、３０分、４℃）により集めた。この沈殿を２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６０ｍｌに溶解し、同一緩衝液で透析し、粗酵素液を得た。
（ｃ）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ２００ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．８Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
（ｄ）ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムクロマトグラフィー
（ｃ）で得られた活性画分を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し脱塩した。これを、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（６ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから０．８Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。溶出した活性画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析した。図１は、この溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、溶出画分のバンドを示す。その結果、単一のバンドが観察された（図１）。
このようにして、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２より、電気泳動的に単一に精製された酵素を得た。
（実施例２：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素の性質の測定）
上記の実施例１で得た精製酵素のスフィンゴミエリナーゼ活性を上記方法で測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を有することを確認した。この精製酵素の酵素学的性質について検討した。
（１）作用ｐＨ：緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用いてｐＨを変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。その結果、この酵素は、反応の至適ｐＨが１０であることが分かった。図２は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが１０である場合の酵素活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図２から分かるように、この酵素は、ｐＨ８からｐＨ１２のアルカリ性の広い範囲で最大活性の５０％以上の活性を示した。
（２）作用温度：酵素とスフィンゴミエリンとの反応温度を変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が３７℃である場合の活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図３に示されるように、この酵素は、２０〜４０℃で活性を発揮し得、そして反応の至適温度は３７℃付近であった。
（３）温度安定性：精製酵素を５０ｍＭ トリス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、種々の温度で３０分間処理した後の残存活性を、上記方法に従って測定した。温度処理前の酵素活性を基準として、各温度処理後の酵素活性の残存割合として示した。図４は、種々の温度での処理後の酵素の残存活性を示すグラフである。図４に示されるように、この酵素は、４℃から４５℃までの温度での処理後では、処理前の９０％以上の活性が残存していた。５０℃の処理後では、処理前の７０％程度の活性が残存していた。
（４）各種金属塩およびＥＤＴＡの影響：酵素とスフィンゴミエリンとの反応の際に各種金属イオンまたはＥＤＴＡを添加して、スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。この際に、金属塩の沈殿を防ぐために、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に変更した。その結果を、金属塩を添加しない条件を１００とした相対活性で表１に示す。この酵素は、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、およびＥＤＴＡによって阻害を受けた。
（７）等電点：Ｐｈａｓｔｇｅｌ ＩＥＦ３−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた等電点電気泳動法により、精製酵素の等電点を測定した結果、精製酵素の等電点は６．１であった。
（実施例３：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素のＮ末端アミノ酸配列の解析）
上記実施例１で得た精製酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列の解析を行った。上記精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は配列番号３に示すとおりであった。
（実施例４：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２の染色体ＤＮＡの分離）
ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）ＮＢＲＣ１２７８２を、トリプチックソイ培地（ベクトン・ディンキンソン社製）５ｍｌを用いて２８℃で４日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および８ｍｇ／ｍｌ リゾチームからなる溶液８００μｌに懸濁し、３７℃で４５分間処理した後、さらに−８０℃で１０分間処理した。次に、これに１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）からなる溶液６ｍｌを添加し、６０℃で２０分間処理した後、氷冷した。この溶液４．５ｍｌにフェノール／クロロホルム混合液４ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離により水相を３ｍｌ分取した。この水相に６ｍｌのエタノールを添加混合してＤＮＡを回収し、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液９００μｌに溶解した。これに、ＲＮａｓｅＡを２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、フェノール／クロロホルム混合液９００μｌを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を６００μｌ分取した。この水相に３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）６０μｌおよびエタノール１．２ｍｌを添加混合し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液６００μｌに溶解した。
（実施例５：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域のクローニング）
スフィンゴミエリナーゼのＮ末端アミノ酸配列およびストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＳ１センスプライマー（配列番号４）を設計した。
また、細菌由来スフィンゴミエリナーゼのアミノ酸配列が、ウシＤＮａｓｅＩのアミノ酸配列と高い相同性を示すことがわかり、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）由来のスフィンゴミエリナーゼおよびウシＤＮａｓｅＩのアミノ酸配列を比較した結果、Ｃ末端に近い領域でＳＤＨＹＰからなるアミノ酸配列を共有していた（ヨウ マツオ（ＹＯ ＭＡＴＳＵＯ）ら，プロテイン・サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９６年，５巻，ｐｐ．２４５９−２４６７）。このアミノ酸配列ＳＤＨＹＰおよびストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＡ１アンチセンスプライマー（配列番号５）を設計した。ここで、配列中のＳはＣまたはＧを表す。
ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。上記実施例４で得た鋳型染色体ＤＮＡ１６８ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー 各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＤＭＳＯ ３％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；５５℃（サイクルごとに１℃ずつ低く設定する）、３０秒；ステップ４；６８℃、１分；ステップ２からステップ４を２０サイクル繰り返す；ステップ５；９４℃、１５秒；ステップ６；４０℃、３０秒；ステップ７；６８℃、１分；ステップ５からステップ７を３０サイクル繰り返す；ステップ８；６８℃、３分。ＰＣＲによって、約８００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。
このＰＣＲ反応液についてアガロース電気泳動を行い、目的の８００ｂｐのバンド部分を切り出し、ＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに結合させ、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、ｐＨ７．０）で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに由来するＴ７プライマーおよびＭ１３ ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列を図５および配列番号１２に示す。
（実施例６：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域周辺のクローニング）
上記の実施例５で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、その上流側と下流側とに分けて、それぞれをＰＣＲにより増幅した。
（ａ）上流側のクローニング
上記実施例４で得た染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで完全消化し、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に付属のＳａｕ３ＡＩ Ｃａｓｓｅｔｔｅを連結させてライブラリーを作製した。これを鋳型にして、キットに付属のＣａｓｓｅｔｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃ１とスフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマーＡＮ１（配列番号６）とを用いて、１回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ ５００ｎｇ、１０×ＥＸ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、プライマー 各２μＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＤＭＳＯ ３％、およびＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ ＨＳ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、３０秒；ステップ３；５５℃、３０秒；ステップ４；７２℃、１分３０秒；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；ステップ５；７２℃、２分。次いで、このＰＣＲ反応液を鋳型として、キットに付属のＣａｓｓｅｔｔｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃ２とスフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマーＡＮ２（配列番号７）とを用いて、２回目のＰＣＲ増幅を行った。約４００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
（ｂ）下流側のクローニング
上記実施例４で得た染色体ＤＮＡ１００ｎｇをＮａｅＩで完全消化し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてセルフライゲーションさせて、ライブラリーを作製した。これを鋳型にして、スフィンゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したセンスプライマーＳＣ１（配列番号８）およびアンチセンスプライマーＡＣ２（配列番号９）を用いて、いわゆるインバースＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ １００ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー 各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＤＭＳＯ ３％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、３分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；６８℃、１分；ステップ２からステップ３を３５サイクル繰り返す；ステップ４；６８℃、３分。ＰＣＲによって、約４００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。
上記実施例５で決定した塩基配列と併せて上記（ａ）および（ｂ）で決定した塩基配列に基づいて、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列を決定し（配列番号１３）、さらに構造遺伝子部分についてその塩基配列からアミノ酸配列を推定した（配列番号１４）。図６は、この決定したスフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列、およびこの塩基配列の下段に、構造遺伝子の推定アミノ酸配列を示す。図６に示す配列解析の結果から、スフィンゴミエリナーゼをコードする構造遺伝子は９９９ｂｐのヌクレオチドからなり、３３３残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。上記実施例３にて決定したストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素のＮ末端アミノ酸配列が、上記推定アミノ酸配列中に存在し、完全に一致した（図６中に下線で示す）。
配列類似性検索プログラムＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡを用いることにより、上記推定アミノ酸配列を４種類のタンパク質配列データベース（ＰＴＲ、ＰＲＦ、ＵＮＩ−ＰＲＯＴおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）内の配列と比較した。その結果、上記推定アミノ酸配列は、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ ＣＮＢ−４４０株のスフィンゴミエリン・ホスホジエステラーゼ（スフィンゴミエリナーゼ）と５２％の類似性を示した。
また、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来精製酵素（すなわちスフィンゴミエリナーゼ）は、この推定アミノ酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、約３２０００ダルトンの分子量を有すると推定された。
（実施例７：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製）
放線菌においてストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼを発現させるために、形質転換に用いる組換えプラスミドを作製した。
まず、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼの構造遺伝子の上流域配列にＢｇｌＩＩ部位を付加したセンスプライマーＳ２（配列番号１０）、および該構造遺伝子の下流域配列にＢｇｌＩＩ部位を付加したアンチセンスプライマーＡ２（配列番号１１）を設計した。次いで、これらのプライマーを用いて、上記実施例４で得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型染色体ＤＮＡ １６８ｎｇ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−５μｌ、プライマー 各３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物 各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＤＭＳＯ ５％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．０ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９４℃、２分；ステップ２；９４℃、１５秒；ステップ３；６８℃、１分；ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；ステップ４；６８℃、２分。このＰＣＲにより約１２００ｂｐの特異的な増幅産物が得られた。この増幅された断片をＢｇｌＩＩで消化し、放線菌プラスミドｐＩＪ７０２（ＡＴＣＣ３５２８７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）のＢｇｌＩＩ部位に挿入して、組換えプラスミドｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅを得た。
（実施例８：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の作製）
実施例７で得た組換えプラスミドｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅを用いて、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」に記載の方法に従い、プロトプラスト化された放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６を形質転換し、組換え放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６（ｐＩＪ７０２−ＳＭａｓｅ）を得た。
（実施例９：ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来スフィンゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の酵素活性測定）
実施例８で得た組換え放線菌を、２０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む１００ｍｌのトリプチックソイ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で培養した。得られた培養液から遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて上清を回収し、６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１６時間放置し、遠心分離にて（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）沈殿を回収した。回収した沈殿を５００μｌの２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を外液として透析を行い、０．９ｍｌの酵素溶液を得た。この酵素溶液中の酵素活性を、上記スフィンゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法に従って測定した。その結果、酵素溶液の酵素活性は１０．２ユニット／ｍｌであった。なお、ベクターであるプラスミドｐＩＪ７０２を用いて形質転換した放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６（ｐＩＪ７０２）では、スフィンゴミエリナーゼ活性は検出されなかった。
本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法が提供される。スフィンゴミエリナーゼをスフィンゴミエリンに作用させて生成されるセラミドは、化粧品の基材などとして有用である。
［配列表］
［配列表］
Claims (14)
- スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドからなる、酵素：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。 - スフィンゴミエリンを基質としたときのｐＨ１０で３７℃にて１０分間の加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ８からｐＨ１２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す、請求項１に記載の酵素。
- ｐＨ１０で３７℃にて１０分間のスフィンゴミエリンに対する加水分解活性を１００％とした場合にホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルセリンに対する活性が５％未満である基質特異性を有する、請求項１または２に記載の酵素。
- 等電点が６．１である、請求項１から３のいずれかに記載の酵素。
- ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が３５，０００であり、そしてアミノ酸組成より分析した場合の分子量が３２，０００である、請求項１から４のいずれかに記載の酵素。
- ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項１から５のいずれかに記載の酵素。
- 請求項１から６のいずれかの項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
- 以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである、請求項７に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。 - ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターが導入され、スフィンゴミエリンからセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体。
- 前記形質転換体の宿主が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である、請求項１１に記載の形質転換体。
- スフィンゴミエリンに作用し、該スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方法であって、
請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得る工程；および
該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程
を含む、方法。 - 前記宿主が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である、請求項１３に記載の製造方法。
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