JP4318473B2 - グルコース脱水素酵素の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）のグルコース脱水素酵素複合体を大量発現するエシェリヒア属細菌、及び酵素複合体の製造方法に関する。グルコース脱水素酵素は、酵素電極を用いたグルコースセンサ等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース脱水素酵素として、ブルクホルデリア属の微生物（ブルクホルデリア・セパシア（Burkhorderia cepacia）ＫＳ１株）が産生する酵素が知られている。同酵素は、触媒サブユニットであるαサブユニット、チトクロームＣであるβサブユニット、及びγサブユニットからなる複合体であり、熱安定性が高く、反応に溶存酸素の影響を受けにくい等の優れた性質を有している。同酵素のαサブユニット及びγサブユニットをコードするＤＮＡが単離され、βサブユニットをコードするＤＮＡの一部も単離された。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）での発現に成功している（以上、特許文献１参照）。しかしながら、発現されたGDHはβサブユニットを持たないものと考えられる。
【０００３】
ところで、エシェリヒア・コリのチトクローム成熟系として、ｃｃｍ系（cytochrome C maturation system）が知られている。ｃｃｍ系は、エシェリヒア・コリにおいて、嫌気下、かつ、特殊な条件下で発現することが知られている（非特許文献１）。ｃｃｍ系をコードするオペロン（ｃｃｍＡＢＣＤＥＦＧＨ）のＤＮＡ配列は既に明らかになっている（非特許文献２、３）。さらに、ｃｃｍ系を発現するプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリにおいて、異種生物由来の共有結合型マルチヘムチトクロームを好気下で発現、生産させたことが報告されている（非特許文献４〜７）。
【０００４】
また、ｃｃｍオペロンを含むプラスミドとして、同オペロンをｐＡＣＹＣ１８４に挿入して得られたプラスミドｐＥＣ８６（非特許文献８）が知られている。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第０２／３６７７９号パンフレット
【非特許文献１】
J. Bacteriol. 177, 4321-4326 (1995)
【非特許文献２】
Nature 409 (6819), 529-533 (2001)
【非特許文献３】
GeneBank database accession U0008 (1993)
【非特許文献４】
Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 744-7 (1998)
【非特許文献５】
Biochim. Biophys. Acta, 1411, 114-20 (1999)
【非特許文献６】
Biochim. Biophys. Acta, 1481, 18-24 (2000)
【非特許文献７】
Protein Sci 9, 2074-84 (2000)
【非特許文献８】
Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 744-7 (1998)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、エシェリヒア・コリにおいて、前記グルコース脱水素酵素のαサブユニットのみを発現させた場合に比べて、αサブユニットとβサブユニットを同時に発現させた場合はその効率が低いことを見出している。本発明は、αサブユニットとβサブユニットを含む酵素複合体を、エシェリヒア属細菌で大量発現させる手段を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア属細菌において、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素複合体をコードするＤＮＡの発現が、同細菌のｃｃｍ系の発現を増強することによって高めることができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌。
（２）αサブユニットをコードするＤＮＡがβサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御される（１）に記載のエシェリヒア属細菌。
（３）さらに、前記グルコース脱水素酵素のγサブユニットをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入された（１）に記載のエシェリヒア属細菌。
（４）γサブユニットをコードするＤＮＡがαサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置する（３）に記載のエシェリヒア属細菌。
（５）前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである（１）〜（４）のいずれかに記載のエシェリヒア属細菌。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを発現させ、グルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素複合体の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエシェリヒア属細菌は、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素（以下、単に「GDH」ともいう）のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡ（以下、各々「αサブユニット遺伝子」及び「βサブユニット遺伝子」ということがある）が発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である。
【００１０】
前記エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。
また、前記ブルクホルデリア・セパシアとしては、ＫＳ１株、ＪＣＭ２８００株、ＪＣＭ２８０１株、又はＪ２３１５株等が挙げられる。ＫＳ１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。ＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株は、理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM）から入手することができる。また、Ｊ２３１５株は、American Type Culture Collection（ATCC）にATCC番号BAA-245として、The Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCMTM)に菌株番号LNG 16656として寄託されており、これらから入手することができる。
【００１１】
ＫＳ１株のGDH αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す（ＷＯ ０２／３６７７９号パンフレット参照）。この塩基配列には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、５’末端側から２番目及び３番目のＯＲＦは、それぞれαサブユニット（配列番号２）、及びβサブユニット（配列番号３）をコードしている。また、１番目のＯＲＦはγサブユニット（配列番号２）をコードしていると推定される。また、配列番号９に、βサブユニット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。配列番号１０において、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号９及び１０において、第１番目のアミノ酸残基はValと記載されているが、Metである可能性が高く、また、翻訳後に脱落している可能性がある。
【００１２】
本発明に用いるαサブユニット遺伝子は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子に限られず、コードされるポリペプチドがＧＤＨ活性を有する限り、配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。尚、配列番号３には、配列番号１の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、Ｎ末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。
【００１３】
また、βサブユニット遺伝子は、GDHのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号１０のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。尚、GDHのβサブユニットとして機能するとは、ＧＤＨの酵素活性を損なわずにチトクロームＣとして機能することをいう。
【００１４】
αサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号１の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基配列の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１５】
また、βサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号９の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またβサブユニット遺伝子は、配列番号９の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１６】
前記ストリンジェントな条件としては、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
【００１７】
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって、取得することができる。PCR用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、ブルクホルデリア・セパシアの他の菌株からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
【００１８】
本発明においては、αサブユニット遺伝子はβサブユニット遺伝子の上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御されることが好ましい。
また、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子とともに、γサブユニットをコードするＤＮＡ（γサブユニット遺伝子）が発現可能な形態でエシェリヒア属細菌に導入されることが好ましい。その際、γサブユニット遺伝子は、αサブユニット遺伝子の上流に位置し、単一のプロモーターによって各サブユニット遺伝子の発現が制御されることが好ましい。
【００１９】
γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２、１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによって取得することができる（後記実施例参照）。
【００２０】
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子（必要に応じてγサブユニット遺伝子）を含むＤＮＡ（以下、「GDHαβ遺伝子」という）を発現可能な形態でエシェリヒア属細菌に導入するには、GDHαβ遺伝子をエシェリヒア属細菌で機能するベクターに挿入し、得られた組換えベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換すればよい。その際、GDHαβ遺伝子の上流にエシェリヒア属細菌で機能するプロモーターを配置することによって、同プロモーターの制御下でGDHαβ遺伝子を発現させることができる。
【００２１】
前記エシェリヒア属細菌で機能するベクターとしては、例えば、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等が挙げられる。また、前記プロモーターとしては、例えばlac、trp、tac、trc、PL、tet、PhoA等が挙げられる。また、プロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、GDHαβ遺伝子を挿入することによって、同遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、pTrc99A、 pBluescript、pKK223-3等が挙げられる。
【００２２】
また、GDHαβ遺伝子は、発現可能な形態でエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ中に組み込まれてもよい。
組換えベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２３】
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記のようにしてGDHαβ遺伝子が導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である。
ｃｃｍ系は、ｃｃｍオペロン（ｃｃｍＡＢＣＤＥＦＧＨ）によってコードされている。ｃｃｍオペロンは、例えば、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって、取得することができる。PCR用プライマーは、報告されている塩基配列（DDBJ/EMBL/GenBank ACCESSION AE005452）に基づいて合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、他のエシェリヒア属細菌からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
【００２４】
ｃｃｍオペロンとしては、前記の報告されている塩基配列を有するＤＮＡの他、同塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃｃｍ系をとして機能する酵素群をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２５】
ｃｃｍ系は、嫌気下、かつ、特殊な条件下で発現することが知られている（非特許文献１）。本発明において、「ｃｃｍ系の発現が増強された」とは、エシェリヒア属細菌の野生株又は非改変株よりも発現量が高められたか、又は、嫌気下、かつ、特殊な条件下でなくても発現するように改変されたことをいう。嫌気下、かつ、特殊な条件下ではない条件としては、好気性条件下が挙げられる。
【００２６】
ｃｃｍ系の発現を増強するには、ｃｃｍオペロンの各遺伝子を、構成的に発現するプロモーター、又は発現制御が可能なプロモーターに連結し、得られた組換え遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入すればよい。好適なプロモーター及びベクター、並びにエシェリヒア属細菌へのｃｃｍオペロンの導入は、前記GDHαβ遺伝子について記載したのと同様である。
【００２７】
ｃｃｍオペロンを含むプラスミドとして、同オペロンがｐＡＣＹＣ１８４に挿入して得られたｐＥＣ８６が挙げられる。同オペロンは、ｔｅｔプロモーターの制御下で構成的に発現する。また、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上のｃｃｍオペロンをＰＣＲ等によりクローニングし、適当なプロモーターの支配下に挿入したプラスミドを作製することもできる。
【００２８】
また、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上のｃｃｍオペロンのプロモーターを、適当なプロモーターに置換することによっても、同オペロンの発現を増強することができる。
【００２９】
本発明のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子を発現させ、これらの発現産物としてGDH酵素複合体を産生させ、これを採取することにより、GDH複合体を効率よく製造することができる。ここで、「GDH複合体」とは、好ましくは各サブユニットが会合して多量体タンパク質を形成しているものをいうが、遊離した各サブユニットの混合物も含まれる。
【００３０】
エシェリヒア属細菌の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３１】
培地の栄養源としては、エシェリヒア属細菌の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３２】
培養温度は、エシェリヒア属細菌が生育し、GDH複合体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、GDH複合体が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は12〜72時間程度である。培地のpHは菌が発育し、GDH複合体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはpH6.0〜9.0程度の範囲である。
【００３３】
GDH複合体は、培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、GDH複合体が培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、GDH複合体を含有する溶液とエシェリヒア属細菌菌体と分離した後に利用される。GDH複合体が菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加して各サブユニットを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３４】
上記のようにして得られたGDH複合体含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製を行うことにより、精製されたGDH複合体を得ることができる。カラムクロマイトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。
【００３５】
尚、GDHはαサブユニット単独でも酵素活性を示す。したがって、本発明のエシェリヒア属細菌又はGDH複合体から、αサブユニットのみを単離、精製して使用することもできる。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ブルクホルデリア・セパシア KS1株GDH βサブユニットをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブルクホルデリア・セパシア KS1株GDHβサブユニットの検索
Sanger Centre のブルクホルデリア・セパシアJ2315株ゲノムデータベース(http://www.sanger.ac.uk/)を用いて、KS1株由来GDHのβサブユニット遺伝子を検索した。すでに明らかにされているKS1株GDHβサブユニットのN末端配列（配列番号５）を参考に、アセトバクターＳｐ．、グルコノバクターＳｐ．由来のアルコール脱水素酵素（Tamaki T. et al., Biochim Biophys Acta 1088(2):292-300 (1991)、Matsushita K., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 304-310 (1992)、Takemura H., et al., J Bacteriol,175,6857-66 (1993)、Kondo K. et al., Appl Environ Microbiol, 63,1131-8 (1997)）、エルビニアｓｐ．、シュードモナスｓｐ．由来のグルコン酸脱水素酵素（Yum DY, et al., J Bacteriol ,179,6566-72,(1997)、Matsushita K. et al., J Biochem,85,1173-81 (1979)）、グルコノバイターｓｐ．由来のソルビトール脱水素酵素（Choi, E.S., et al., FEMS Microbiol. Lett., 125, 45-50 (1995)）、エルビニアｓｐ．、パントエアｓｐ．由来の２−ケトグルコン酸脱水素酵素（Pujol CJ et al., J Bacteriol ,182,2230-7,(2000)）のチトクロムｃサブユニットとホモロジーの高いアミノ酸配列（配列番号６）をデザインした。
【００３７】
上記アミノ酸配列を指標として、前記ブルクホルデリア・セパシアJ2315株のデーターベースからBLASTを用いてホモロジーの高いアミノ酸配列をコードしている遺伝子配列を検索した。つぎに、得られた５つの配列に対して、KS1株GDHαサブユニットのＣ末端配列とのホモロジーを検索した結果、２つの遺伝子断片から翻訳されるアミノ酸配列が高いホモロジー（＞90%）を示した。各遺伝子断片は200〜500bpと短かったので、これらの配列に対して相同性の高い配列を、Blastを用いてブルクホルデリア・セパシアJ2315株のゲノムデーターベースから検索し、各断片をつなぎ合わせた。その結果、3110bpの断片を得た。得られた塩基配列にはGDHのＣ末端と思われるORFと1275bpからなるチトクロームｃ構造遺伝子と思われるORFが存在した。得られたJ2315株の塩基配列と既にクローニングされているKS1株αサブユニット塩基配列を比較した結果、αサブユニット下流にはJ2315株チトクロームｃのシグナルペプチドをコードする塩基配列に相同性の高い塩基配列が含まれていた。
以上のことから、すでにクローニングされているブルクホルデリア・セパシアKS1株のGDH遺伝子（配列番号１、ＷＯ ０２／３６７７９号パンフレット参照）の三番目のORF（配列番号１の塩基番号２３８６以降）は、β−サブユニットをコードしていると推定された。また、精製されたβ−サブユニットのＮ末端におけるアミノ酸配列と、配列番号１中の塩基番号２４５２〜２４６６の塩基配列によって翻訳される５アミノ酸残基が一致したことからも、前記ORFはβサブユニットをコードしていると考えられた。
【００３８】
＜２＞インバースPCR法を用いたβサブユニット構造遺伝子の増幅
（１）菌体の培養及びゲノムの抽出
KS1株を5mlの完全培地（0.5% polypepton 、0.3% yeast extract 、0.5% NaCl）を用いて37℃で一晩振とう培養した。得られた菌体からGennomicPrepTM Cells and Tissue DNA Isolation Kit（Amersham Pharmacia Biotech社）を用いてゲノムを抽出した。方法は付属のマニュアルに従った。得られたゲノムに対してフェノール/クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿させた後、精製水に溶解した。
【００３９】
（２）ゲノム断片の環状化
KS1株より抽出したゲノムを、BamHI、EcoRI、HindIII、SmaI、SacIおよびXhoIで消化し、エタノール沈殿によってゲノム断片を回収した。制限酵素消化したゲノム1μgをDNAライゲーションキット（宝酒造(株)）を用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行った。
【００４０】
（３）ＰＣＲ
KS1株GDHβサブユニットのＮ末端シグナル配列領域の塩基配列からデザインしたフォワードプライマー（EF1配列番号７）50pmol, リバースプライマー（ER1配列番号８）50pmol（プライマーはいずれもInvitrogen社に依託合成）、LATaq（宝バイオ（株）） 0.5ml、dNTP溶液 8μl, 10×PCR buffer 5μlに精製水を全量50μlとなるように加え、プログラムテンプコントロールシステム PC-801（ASTEC）を用いてPCRを行った。PCRの反応は、以下の条件で行った。94℃ 5分、98℃ 20秒、62℃ 30秒を30サイクルの後、72℃ 6分、72℃ 10分。
【００４１】
SmaIで制限酵素消化したゲノムをテンプレートとした場合において、約2.1kbpの大きさの断片がアガロース電気泳動で確認された。
【００４２】
＜３＞PCR増幅断片のシークエンシング
（１）ＴＡクローニング
前記のインバースＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、バンドを切り出し、Gene clean II KIT（Bio101 inc.）を用いて精製した。この断片を、pGEMR-T and pGEMR-T EASY Vector Systems（Promega）を用いて、pGEM-T Vectorにライゲーションした。ライゲーションを行ったベクターでエシェリヒア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリン 50μg/ml、X-Gal 40μg/ml、IPTG 0.1μMを含むＬ寒天培地を用いて一晩培養した。出現したコロニーから白色のコロニーを選択し、アンピシリン50μg/mlを含むＬ培地で一晩培養して、菌体からプラスドをアルカリ法により抽出した。
【００４３】
（２）シークエンスサンプルの調製
得られたプラスミドをRNase処理し、これに0.6倍量の20% PEG6000/2.5M NaClを加え、氷上に1時間放置した。その後15000r.p.m、4℃で15分間遠心分離し、ペレットを得た。これを70％エタノールで洗浄し、ペレットを真空乾燥させた。これを精製水に溶解した。
【００４４】
（３）ＤＮＡ塩基配列の解析
（２）で得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を、ABI PRISMTM310 Genetic Analzer ( PERKIN-ELMER Applised Biosystems)を用いて解析した。ベクターのマルチクローニングサイトからM13プライマーを用いて挿入断片の一部の配列を決定した結果、これまでに解析されているβサブユニットＮ末端を含む塩基配列が確認された。この配列を手がかりにプライマーを順次作製して用い、挿入断片の塩基配列を決定した。結果を配列番号９に示す。また、この塩基配列に含まれるORFがコードするアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００４５】
βサブユニットは、全部で425個のアミノ酸残基から構成されており、すでに得られているＮ末端アミノ酸配列と比較して、そのうち22残基はシグナルペプチドであると考えらる。アミノ酸配列から計算される分子量は45,276Daであり、シグナルペプチドを除いた分子量42,731Daは、SDS-PAGEから求められたKS1株GDHβサブユニットの分子量43kDaとほぼ同等の値であった。βサブユニットのアミノ酸配列中には、チトクロームｃにおいてヘムとの結合モチーフ（配列番号１１）が３ヶ所に確認された。このORFはαサブユニット構造遺伝子のORFのすぐ下流に位置し、開始コドンの上流にSD配列と思われる配列が存在した。
【００４６】
得られたアミノ酸配列についてBLASTによるホモロジー検索を行ったところ、ラルストニア・ソアナセアルム（Ralstonia solanacearum）由来のオキシドレダクターゼ脱水素酵素のチトクロムｃサブユニットと65%、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）由来のソルビトール脱水素酵素のチトクロムｃサブユニットと48%、エルビニア・シプリペディイ（Eriwinia cypripedii）由来のグルコン酸脱水素酵素のチトクロームｃサブユニットと44%、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）由来２−ケト−グルコン酸脱水素酵素のチトクロームｃサブユニットとアミノ酸レベルて４６．４％と、全体にわたって高い相同性を示していた。またこれらのチトクロームｃのアミノ酸配列中には、ヘム結合モチーフ（配列番号１１）配列が保存されていた。
尚、KS1株のGDHβサブユニット構造遺伝子は、J2315株のGDHβサブユニット構造遺伝子と、塩基配列レベルで９２．０％、アミノ酸レベルで９２．２％の相同性を有している。
【００４７】
【実施例２】
エシェリヒア・コリへのGDHαβ遺伝子の導入及びｃｃｍ系の増強
＜１＞ブルクホルデリア・セパシア KS1株からの染色体DNAの調製
ブルクホルデリア・セパシア KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をTL液体倍地(ポリペプトン １０g、酵母抽出液 １g、NaCl ５g、KH2PO4 ２g、グルコース ５g；１L、pH 7.2)を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
【００４８】
＜２＞GDHαβ遺伝子の調製
前記染色体DNAを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００４９】
＜フォワードプライマー：cF1＞
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3'（配列番号１２）
＜リバースプライマー：GDHbU1＞
5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'（配列番号１３）
【００５０】
増幅した断片のC末端側を平滑末端化した後、N末端側をNcoIで消化し、同様に処理したpTrc99A（Pharmacia社）にライゲーションした。得られた組換えベクターでE. coli DH5αを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のLB培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入DNA断片を解析したところ、約3.8kbの挿入断片が確認された。本プラスミドをpTrc99Aγαβと命名した。本プラスミド中のGDHαβ遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99Aγαβは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
【００５１】
＜３＞ｃｃｍ系プラスミドの調製
pTrc99AγαβをEcoT221で消化した後に末端を平滑化した。次にNotIで消化して、アガロースゲル電気泳動により短いDNA断片を分離、回収した。このDNA断片をScaIとNotIで消化したpBBR122（MoBiTec社）に挿入して、pBBGDHγαβを作製した。
【００５２】
E. coli JM109より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をLB培地（ポリペプトン 10g、酵母エキス 5g、NaCl 10g；1L、pH7.0）を用いて３７℃で一夜振盪培養した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくい取り、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、JM109染色体DNA溶液とした。
【００５３】
JM109染色体DNAを鋳型として、以下に配列を示すオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによりｃｃｍ系遺伝子をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００５４】
＜フォワードプライマー：ECccmD1＞
5'- TGGCCATGGTTGAAGCCAGAGAGTTACTTT -3'（配列番号１４）
＜リバースプライマー：ECccmU1＞
5'- TTATTTACTCTCCTGCGGCGACAAATGTTG -3'（配列番号１５）
【００５５】
増幅した末端を平滑化した後、Ｎ末端側をNcoIで消化した。この断片をACCIで消化、平滑末端化した後、NcoIで消化したpBBGDHγαβとライゲーションしてpBBJMccmを作製した。尚、pBBGDHγαβをNcoIで消化することにより、GDHαβ遺伝子は削除されている。
【００５６】
＜４＞GDHαβ遺伝子及びｃｃｍ系のエシェリヒア・コリへの導入
E. coli JM109をpTrc99Aγαβ及びpBBJMccmで形質転換し、JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccmを得た。また、コントロールとしてpTrc99AγαβでE. coli JM109を形質転換したJM109/pTrc99Aγαβを得た。
これらの形質転換体を50μg/mlアンピシリンと50μg/mlカナマイシン（JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm）、または50μg/mlアンピシリン（JM109/pTrc99Aγαβ）を含む10mLの2×YT培地で34℃、１夜振盪培養した。また、ブルクホルデリア・セパシアKS1株を10mLの完全培地で１夜振盪培養した。培養液の一部から遠心分離により各菌体を回収し、遠心分離前の液量になるように1%コール酸ナトリウムを含む10mM リン酸カリウム緩衝液（ｐH7.0）を加えた後に超音波により細胞を破砕した。次に、破砕液を遠心分離した上清中のGDH活性を測定した。
【００５７】
GDH活性は次の操作にて測定した。47mM リン酸緩衝液pH6.0、20mM グルコース、2mMフェナジンメトサルフェート、0.1mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノールを、37℃で予め加温した後にサンプルを加えて反応を開始し、37℃に保ち、600nmの吸光度変化を測定して求めた。GDH活性は、2,6-ジクロロフェノールインドフェノールの分子吸光係数4.76mM/cmを用いて、酵素1単位（U）は1分毎に１μモルの2,6-ジクロロフェノールインドフェノールが酸化される量と定義して求めた。
結果は、JM109/pTrc99Aγαβ、ブルクホルデリア・セパシアKS1、JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccmのGDH活性は、それぞれ、0.3U/mL、1.4U/mL、32U/mLであった。すなわち、 JM109/pTrc99AγαβにはGDH活性がほとんど認められず、野生株であるブルクホルデリア・セパシアKS1にはGDH活性がわずかであったが、JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccmでは非常に高いGDH活性が認められた。尚、JM109/pTrc99Aγαβ, pBBJMccmからGDH複合体を精製し、SDS-PAGEを行ったところ、KS1株から精製したGDH複合体と同様の泳動パターンを示すことが確認できた（図１）。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニットとβサブユニットを含む酵素複合体を、エシェリヒア属細菌で大量発現させることができる。
【００５９】
【課題を解決するための手段】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ブルクホルデリア・セパシアKS1株及びエシェリヒア・コリJM109/pTrc99Aγαβ,pBBJMccmから精製されたGDH複合体のSDS-PAGEの結果を示す図（写真）。
レーン１：マーカー
レーン２：KS1株から精製したGDH
レーン３：JM109/pTrc99Aγαβ、pBBJMccmから精製したGDH
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）のグルコース脱水素酵素複合体を大量発現するエシェリヒア属細菌、及び酵素複合体の製造方法に関する。グルコース脱水素酵素は、酵素電極を用いたグルコースセンサ等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース脱水素酵素として、ブルクホルデリア属の微生物（ブルクホルデリア・セパシア（Burkhorderia cepacia）ＫＳ１株）が産生する酵素が知られている。同酵素は、触媒サブユニットであるαサブユニット、チトクロームＣであるβサブユニット、及びγサブユニットからなる複合体であり、熱安定性が高く、反応に溶存酸素の影響を受けにくい等の優れた性質を有している。同酵素のαサブユニット及びγサブユニットをコードするＤＮＡが単離され、βサブユニットをコードするＤＮＡの一部も単離された。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）での発現に成功している（以上、特許文献１参照）。しかしながら、発現されたGDHはβサブユニットを持たないものと考えられる。
【０００３】
ところで、エシェリヒア・コリのチトクローム成熟系として、ｃｃｍ系（cytochrome C maturation system）が知られている。ｃｃｍ系は、エシェリヒア・コリにおいて、嫌気下、かつ、特殊な条件下で発現することが知られている（非特許文献１）。ｃｃｍ系をコードするオペロン（ｃｃｍＡＢＣＤＥＦＧＨ）のＤＮＡ配列は既に明らかになっている（非特許文献２、３）。さらに、ｃｃｍ系を発現するプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリにおいて、異種生物由来の共有結合型マルチヘムチトクロームを好気下で発現、生産させたことが報告されている（非特許文献４〜７）。
【０００４】
また、ｃｃｍオペロンを含むプラスミドとして、同オペロンをｐＡＣＹＣ１８４に挿入して得られたプラスミドｐＥＣ８６（非特許文献８）が知られている。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第０２／３６７７９号パンフレット
【非特許文献１】
J. Bacteriol. 177, 4321-4326 (1995)
【非特許文献２】
Nature 409 (6819), 529-533 (2001)
【非特許文献３】
GeneBank database accession U0008 (1993)
【非特許文献４】
Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 744-7 (1998)
【非特許文献５】
Biochim. Biophys. Acta, 1411, 114-20 (1999)
【非特許文献６】
Biochim. Biophys. Acta, 1481, 18-24 (2000)
【非特許文献７】
Protein Sci 9, 2074-84 (2000)
【非特許文献８】
Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 744-7 (1998)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、エシェリヒア・コリにおいて、前記グルコース脱水素酵素のαサブユニットのみを発現させた場合に比べて、αサブユニットとβサブユニットを同時に発現させた場合はその効率が低いことを見出している。本発明は、αサブユニットとβサブユニットを含む酵素複合体を、エシェリヒア属細菌で大量発現させる手段を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア属細菌において、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素複合体をコードするＤＮＡの発現が、同細菌のｃｃｍ系の発現を増強することによって高めることができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌。
（２）αサブユニットをコードするＤＮＡがβサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御される（１）に記載のエシェリヒア属細菌。
（３）さらに、前記グルコース脱水素酵素のγサブユニットをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入された（１）に記載のエシェリヒア属細菌。
（４）γサブユニットをコードするＤＮＡがαサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置する（３）に記載のエシェリヒア属細菌。
（５）前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである（１）〜（４）のいずれかに記載のエシェリヒア属細菌。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを発現させ、グルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素複合体の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエシェリヒア属細菌は、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素（以下、単に「GDH」ともいう）のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡ（以下、各々「αサブユニット遺伝子」及び「βサブユニット遺伝子」ということがある）が発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である。
【００１０】
前記エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。
また、前記ブルクホルデリア・セパシアとしては、ＫＳ１株、ＪＣＭ２８００株、ＪＣＭ２８０１株、又はＪ２３１５株等が挙げられる。ＫＳ１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。ＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株は、理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM）から入手することができる。また、Ｊ２３１５株は、American Type Culture Collection（ATCC）にATCC番号BAA-245として、The Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCMTM)に菌株番号LNG 16656として寄託されており、これらから入手することができる。
【００１１】
ＫＳ１株のGDH αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す（ＷＯ ０２／３６７７９号パンフレット参照）。この塩基配列には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、５’末端側から２番目及び３番目のＯＲＦは、それぞれαサブユニット（配列番号２）、及びβサブユニット（配列番号３）をコードしている。また、１番目のＯＲＦはγサブユニット（配列番号２）をコードしていると推定される。また、配列番号９に、βサブユニット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。配列番号１０において、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号９及び１０において、第１番目のアミノ酸残基はValと記載されているが、Metである可能性が高く、また、翻訳後に脱落している可能性がある。
【００１２】
本発明に用いるαサブユニット遺伝子は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子に限られず、コードされるポリペプチドがＧＤＨ活性を有する限り、配列番号３のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。尚、配列番号３には、配列番号１の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、Ｎ末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。
【００１３】
また、βサブユニット遺伝子は、GDHのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号１０のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。尚、GDHのβサブユニットとして機能するとは、ＧＤＨの酵素活性を損なわずにチトクロームＣとして機能することをいう。
【００１４】
αサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号１の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基配列の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１５】
また、βサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号９の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またβサブユニット遺伝子は、配列番号９の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１６】
前記ストリンジェントな条件としては、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
【００１７】
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって、取得することができる。PCR用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、ブルクホルデリア・セパシアの他の菌株からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
【００１８】
本発明においては、αサブユニット遺伝子はβサブユニット遺伝子の上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御されることが好ましい。
また、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子とともに、γサブユニットをコードするＤＮＡ（γサブユニット遺伝子）が発現可能な形態でエシェリヒア属細菌に導入されることが好ましい。その際、γサブユニット遺伝子は、αサブユニット遺伝子の上流に位置し、単一のプロモーターによって各サブユニット遺伝子の発現が制御されることが好ましい。
【００１９】
γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２、１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによって取得することができる（後記実施例参照）。
【００２０】
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子（必要に応じてγサブユニット遺伝子）を含むＤＮＡ（以下、「GDHαβ遺伝子」という）を発現可能な形態でエシェリヒア属細菌に導入するには、GDHαβ遺伝子をエシェリヒア属細菌で機能するベクターに挿入し、得られた組換えベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換すればよい。その際、GDHαβ遺伝子の上流にエシェリヒア属細菌で機能するプロモーターを配置することによって、同プロモーターの制御下でGDHαβ遺伝子を発現させることができる。
【００２１】
前記エシェリヒア属細菌で機能するベクターとしては、例えば、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等が挙げられる。また、前記プロモーターとしては、例えばlac、trp、tac、trc、PL、tet、PhoA等が挙げられる。また、プロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、GDHαβ遺伝子を挿入することによって、同遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、pTrc99A、 pBluescript、pKK223-3等が挙げられる。
【００２２】
また、GDHαβ遺伝子は、発現可能な形態でエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ中に組み込まれてもよい。
組換えベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２３】
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記のようにしてGDHαβ遺伝子が導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である。
ｃｃｍ系は、ｃｃｍオペロン（ｃｃｍＡＢＣＤＥＦＧＨ）によってコードされている。ｃｃｍオペロンは、例えば、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって、取得することができる。PCR用プライマーは、報告されている塩基配列（DDBJ/EMBL/GenBank ACCESSION AE005452）に基づいて合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、他のエシェリヒア属細菌からも、同様にしてバリアントを取得することができる。
【００２４】
ｃｃｍオペロンとしては、前記の報告されている塩基配列を有するＤＮＡの他、同塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃｃｍ系をとして機能する酵素群をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２５】
ｃｃｍ系は、嫌気下、かつ、特殊な条件下で発現することが知られている（非特許文献１）。本発明において、「ｃｃｍ系の発現が増強された」とは、エシェリヒア属細菌の野生株又は非改変株よりも発現量が高められたか、又は、嫌気下、かつ、特殊な条件下でなくても発現するように改変されたことをいう。嫌気下、かつ、特殊な条件下ではない条件としては、好気性条件下が挙げられる。
【００２６】
ｃｃｍ系の発現を増強するには、ｃｃｍオペロンの各遺伝子を、構成的に発現するプロモーター、又は発現制御が可能なプロモーターに連結し、得られた組換え遺伝子をエシェリヒア属細菌に導入すればよい。好適なプロモーター及びベクター、並びにエシェリヒア属細菌へのｃｃｍオペロンの導入は、前記GDHαβ遺伝子について記載したのと同様である。
【００２７】
ｃｃｍオペロンを含むプラスミドとして、同オペロンがｐＡＣＹＣ１８４に挿入して得られたｐＥＣ８６が挙げられる。同オペロンは、ｔｅｔプロモーターの制御下で構成的に発現する。また、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上のｃｃｍオペロンをＰＣＲ等によりクローニングし、適当なプロモーターの支配下に挿入したプラスミドを作製することもできる。
【００２８】
また、エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上のｃｃｍオペロンのプロモーターを、適当なプロモーターに置換することによっても、同オペロンの発現を増強することができる。
【００２９】
本発明のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子を発現させ、これらの発現産物としてGDH酵素複合体を産生させ、これを採取することにより、GDH複合体を効率よく製造することができる。ここで、「GDH複合体」とは、好ましくは各サブユニットが会合して多量体タンパク質を形成しているものをいうが、遊離した各サブユニットの混合物も含まれる。
【００３０】
エシェリヒア属細菌の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３１】
培地の栄養源としては、エシェリヒア属細菌の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３２】
培養温度は、エシェリヒア属細菌が生育し、GDH複合体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、GDH複合体が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は12〜72時間程度である。培地のpHは菌が発育し、GDH複合体を生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはpH6.0〜9.0程度の範囲である。
【００３３】
GDH複合体は、培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、GDH複合体が培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、GDH複合体を含有する溶液とエシェリヒア属細菌菌体と分離した後に利用される。GDH複合体が菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加して各サブユニットを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３４】
上記のようにして得られたGDH複合体含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって精製を行うことにより、精製されたGDH複合体を得ることができる。カラムクロマイトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。
【００３５】
尚、GDHはαサブユニット単独でも酵素活性を示す。したがって、本発明のエシェリヒア属細菌又はGDH複合体から、αサブユニットのみを単離、精製して使用することもできる。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ブルクホルデリア・セパシア KS1株GDH βサブユニットをコードする遺伝子の単離
＜１＞ブルクホルデリア・セパシア KS1株GDHβサブユニットの検索
Sanger Centre のブルクホルデリア・セパシアJ2315株ゲノムデータベース(http://www.sanger.ac.uk/)を用いて、KS1株由来GDHのβサブユニット遺伝子を検索した。すでに明らかにされているKS1株GDHβサブユニットのN末端配列（配列番号５）を参考に、アセトバクターＳｐ．、グルコノバクターＳｐ．由来のアルコール脱水素酵素（Tamaki T. et al., Biochim Biophys Acta 1088(2):292-300 (1991)、Matsushita K., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 304-310 (1992)、Takemura H., et al., J Bacteriol,175,6857-66 (1993)、Kondo K. et al., Appl Environ Microbiol, 63,1131-8 (1997)）、エルビニアｓｐ．、シュードモナスｓｐ．由来のグルコン酸脱水素酵素（Yum DY, et al., J Bacteriol ,179,6566-72,(1997)、Matsushita K. et al., J Biochem,85,1173-81 (1979)）、グルコノバイターｓｐ．由来のソルビトール脱水素酵素（Choi, E.S., et al., FEMS Microbiol. Lett., 125, 45-50 (1995)）、エルビニアｓｐ．、パントエアｓｐ．由来の２−ケトグルコン酸脱水素酵素（Pujol CJ et al., J Bacteriol ,182,2230-7,(2000)）のチトクロムｃサブユニットとホモロジーの高いアミノ酸配列（配列番号６）をデザインした。
【００３７】
上記アミノ酸配列を指標として、前記ブルクホルデリア・セパシアJ2315株のデーターベースからBLASTを用いてホモロジーの高いアミノ酸配列をコードしている遺伝子配列を検索した。つぎに、得られた５つの配列に対して、KS1株GDHαサブユニットのＣ末端配列とのホモロジーを検索した結果、２つの遺伝子断片から翻訳されるアミノ酸配列が高いホモロジー（＞90%）を示した。各遺伝子断片は200〜500bpと短かったので、これらの配列に対して相同性の高い配列を、Blastを用いてブルクホルデリア・セパシアJ2315株のゲノムデーターベースから検索し、各断片をつなぎ合わせた。その結果、3110bpの断片を得た。得られた塩基配列にはGDHのＣ末端と思われるORFと1275bpからなるチトクロームｃ構造遺伝子と思われるORFが存在した。得られたJ2315株の塩基配列と既にクローニングされているKS1株αサブユニット塩基配列を比較した結果、αサブユニット下流にはJ2315株チトクロームｃのシグナルペプチドをコードする塩基配列に相同性の高い塩基配列が含まれていた。
以上のことから、すでにクローニングされているブルクホルデリア・セパシアKS1株のGDH遺伝子（配列番号１、ＷＯ ０２／３６７７９号パンフレット参照）の三番目のORF（配列番号１の塩基番号２３８６以降）は、β−サブユニットをコードしていると推定された。また、精製されたβ−サブユニットのＮ末端におけるアミノ酸配列と、配列番号１中の塩基番号２４５２〜２４６６の塩基配列によって翻訳される５アミノ酸残基が一致したことからも、前記ORFはβサブユニットをコードしていると考えられた。
【００３８】
＜２＞インバースPCR法を用いたβサブユニット構造遺伝子の増幅
（１）菌体の培養及びゲノムの抽出
KS1株を5mlの完全培地（0.5% polypepton 、0.3% yeast extract 、0.5% NaCl）を用いて37℃で一晩振とう培養した。得られた菌体からGennomicPrepTM Cells and Tissue DNA Isolation Kit（Amersham Pharmacia Biotech社）を用いてゲノムを抽出した。方法は付属のマニュアルに従った。得られたゲノムに対してフェノール/クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿させた後、精製水に溶解した。
【００３９】
（２）ゲノム断片の環状化
KS1株より抽出したゲノムを、BamHI、EcoRI、HindIII、SmaI、SacIおよびXhoIで消化し、エタノール沈殿によってゲノム断片を回収した。制限酵素消化したゲノム1μgをDNAライゲーションキット（宝酒造(株)）を用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行った。
【００４０】
（３）ＰＣＲ
KS1株GDHβサブユニットのＮ末端シグナル配列領域の塩基配列からデザインしたフォワードプライマー（EF1配列番号７）50pmol, リバースプライマー（ER1配列番号８）50pmol（プライマーはいずれもInvitrogen社に依託合成）、LATaq（宝バイオ（株）） 0.5ml、dNTP溶液 8μl, 10×PCR buffer 5μlに精製水を全量50μlとなるように加え、プログラムテンプコントロールシステム PC-801（ASTEC）を用いてPCRを行った。PCRの反応は、以下の条件で行った。94℃ 5分、98℃ 20秒、62℃ 30秒を30サイクルの後、72℃ 6分、72℃ 10分。
【００４１】
SmaIで制限酵素消化したゲノムをテンプレートとした場合において、約2.1kbpの大きさの断片がアガロース電気泳動で確認された。
【００４２】
＜３＞PCR増幅断片のシークエンシング
（１）ＴＡクローニング
前記のインバースＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、バンドを切り出し、Gene clean II KIT（Bio101 inc.）を用いて精製した。この断片を、pGEMR-T and pGEMR-T EASY Vector Systems（Promega）を用いて、pGEM-T Vectorにライゲーションした。ライゲーションを行ったベクターでエシェリヒア・コリDH5αを形質転換し、アンピシリン 50μg/ml、X-Gal 40μg/ml、IPTG 0.1μMを含むＬ寒天培地を用いて一晩培養した。出現したコロニーから白色のコロニーを選択し、アンピシリン50μg/mlを含むＬ培地で一晩培養して、菌体からプラスドをアルカリ法により抽出した。
【００４３】
（２）シークエンスサンプルの調製
得られたプラスミドをRNase処理し、これに0.6倍量の20% PEG6000/2.5M NaClを加え、氷上に1時間放置した。その後15000r.p.m、4℃で15分間遠心分離し、ペレットを得た。これを70％エタノールで洗浄し、ペレットを真空乾燥させた。これを精製水に溶解した。
【００４４】
（３）ＤＮＡ塩基配列の解析
（２）で得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を、ABI PRISMTM310 Genetic Analzer ( PERKIN-ELMER Applised Biosystems)を用いて解析した。ベクターのマルチクローニングサイトからM13プライマーを用いて挿入断片の一部の配列を決定した結果、これまでに解析されているβサブユニットＮ末端を含む塩基配列が確認された。この配列を手がかりにプライマーを順次作製して用い、挿入断片の塩基配列を決定した。結果を配列番号９に示す。また、この塩基配列に含まれるORFがコードするアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００４５】
βサブユニットは、全部で425個のアミノ酸残基から構成されており、すでに得られているＮ末端アミノ酸配列と比較して、そのうち22残基はシグナルペプチドであると考えらる。アミノ酸配列から計算される分子量は45,276Daであり、シグナルペプチドを除いた分子量42,731Daは、SDS-PAGEから求められたKS1株GDHβサブユニットの分子量43kDaとほぼ同等の値であった。βサブユニットのアミノ酸配列中には、チトクロームｃにおいてヘムとの結合モチーフ（配列番号１１）が３ヶ所に確認された。このORFはαサブユニット構造遺伝子のORFのすぐ下流に位置し、開始コドンの上流にSD配列と思われる配列が存在した。
【００４６】
得られたアミノ酸配列についてBLASTによるホモロジー検索を行ったところ、ラルストニア・ソアナセアルム（Ralstonia solanacearum）由来のオキシドレダクターゼ脱水素酵素のチトクロムｃサブユニットと65%、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）由来のソルビトール脱水素酵素のチトクロムｃサブユニットと48%、エルビニア・シプリペディイ（Eriwinia cypripedii）由来のグルコン酸脱水素酵素のチトクロームｃサブユニットと44%、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）由来２−ケト−グルコン酸脱水素酵素のチトクロームｃサブユニットとアミノ酸レベルて４６．４％と、全体にわたって高い相同性を示していた。またこれらのチトクロームｃのアミノ酸配列中には、ヘム結合モチーフ（配列番号１１）配列が保存されていた。
尚、KS1株のGDHβサブユニット構造遺伝子は、J2315株のGDHβサブユニット構造遺伝子と、塩基配列レベルで９２．０％、アミノ酸レベルで９２．２％の相同性を有している。
【００４７】
【実施例２】
エシェリヒア・コリへのGDHαβ遺伝子の導入及びｃｃｍ系の増強
＜１＞ブルクホルデリア・セパシア KS1株からの染色体DNAの調製
ブルクホルデリア・セパシア KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をTL液体倍地(ポリペプトン １０g、酵母抽出液 １g、NaCl ５g、KH2PO4 ２g、グルコース ５g；１L、pH 7.2)を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離機により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離機により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
【００４８】
＜２＞GDHαβ遺伝子の調製
前記染色体DNAを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００４９】
＜フォワードプライマー：cF1＞
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3'（配列番号１２）
＜リバースプライマー：GDHbU1＞
5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'（配列番号１３）
【００５０】
増幅した断片のC末端側を平滑末端化した後、N末端側をNcoIで消化し、同様に処理したpTrc99A（Pharmacia社）にライゲーションした。得られた組換えベクターでE. coli DH5αを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天培地で生じるコロニーを採取した。得られた形質転換体を液体のLB培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入DNA断片を解析したところ、約3.8kbの挿入断片が確認された。本プラスミドをpTrc99Aγαβと命名した。本プラスミド中のGDHαβ遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99Aγαβは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
【００５１】
＜３＞ｃｃｍ系プラスミドの調製
pTrc99AγαβをEcoT221で消化した後に末端を平滑化した。次にNotIで消化して、アガロースゲル電気泳動により短いDNA断片を分離、回収した。このDNA断片をScaIとNotIで消化したpBBR122（MoBiTec社）に挿入して、pBBGDHγαβを作製した。
【００５２】
E. coli JM109より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をLB培地（ポリペプトン 10g、酵母エキス 5g、NaCl 10g；1L、pH7.0）を用いて３７℃で一夜振盪培養した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくい取り、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、JM109染色体DNA溶液とした。
【００５３】
JM109染色体DNAを鋳型として、以下に配列を示すオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによりｃｃｍ系遺伝子をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００５４】
＜フォワードプライマー：ECccmD1＞
5'- TGGCCATGGTTGAAGCCAGAGAGTTACTTT -3'（配列番号１４）
＜リバースプライマー：ECccmU1＞
5'- TTATTTACTCTCCTGCGGCGACAAATGTTG -3'（配列番号１５）
【００５５】
増幅した末端を平滑化した後、Ｎ末端側をNcoIで消化した。この断片をACCIで消化、平滑末端化した後、NcoIで消化したpBBGDHγαβとライゲーションしてpBBJMccmを作製した。尚、pBBGDHγαβをNcoIで消化することにより、GDHαβ遺伝子は削除されている。
【００５６】
＜４＞GDHαβ遺伝子及びｃｃｍ系のエシェリヒア・コリへの導入
E. coli JM109をpTrc99Aγαβ及びpBBJMccmで形質転換し、JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccmを得た。また、コントロールとしてpTrc99AγαβでE. coli JM109を形質転換したJM109/pTrc99Aγαβを得た。
これらの形質転換体を50μg/mlアンピシリンと50μg/mlカナマイシン（JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccm）、または50μg/mlアンピシリン（JM109/pTrc99Aγαβ）を含む10mLの2×YT培地で34℃、１夜振盪培養した。また、ブルクホルデリア・セパシアKS1株を10mLの完全培地で１夜振盪培養した。培養液の一部から遠心分離により各菌体を回収し、遠心分離前の液量になるように1%コール酸ナトリウムを含む10mM リン酸カリウム緩衝液（ｐH7.0）を加えた後に超音波により細胞を破砕した。次に、破砕液を遠心分離した上清中のGDH活性を測定した。
【００５７】
GDH活性は次の操作にて測定した。47mM リン酸緩衝液pH6.0、20mM グルコース、2mMフェナジンメトサルフェート、0.1mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノールを、37℃で予め加温した後にサンプルを加えて反応を開始し、37℃に保ち、600nmの吸光度変化を測定して求めた。GDH活性は、2,6-ジクロロフェノールインドフェノールの分子吸光係数4.76mM/cmを用いて、酵素1単位（U）は1分毎に１μモルの2,6-ジクロロフェノールインドフェノールが酸化される量と定義して求めた。
結果は、JM109/pTrc99Aγαβ、ブルクホルデリア・セパシアKS1、JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccmのGDH活性は、それぞれ、0.3U/mL、1.4U/mL、32U/mLであった。すなわち、 JM109/pTrc99AγαβにはGDH活性がほとんど認められず、野生株であるブルクホルデリア・セパシアKS1にはGDH活性がわずかであったが、JM109/pTrc99Aγαβ，pBBJMccmでは非常に高いGDH活性が認められた。尚、JM109/pTrc99Aγαβ, pBBJMccmからGDH複合体を精製し、SDS-PAGEを行ったところ、KS1株から精製したGDH複合体と同様の泳動パターンを示すことが確認できた（図１）。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニットとβサブユニットを含む酵素複合体を、エシェリヒア属細菌で大量発現させることができる。
【００５９】
【課題を解決するための手段】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ブルクホルデリア・セパシアKS1株及びエシェリヒア・コリJM109/pTrc99Aγαβ,pBBJMccmから精製されたGDH複合体のSDS-PAGEの結果を示す図（写真）。
レーン１：マーカー
レーン２：KS1株から精製したGDH
レーン３：JM109/pTrc99Aγαβ、pBBJMccmから精製したGDH
Claims (6)
- ブルクホルデリア・セパシアのグルコース脱水素酵素のαサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、ｃｃｍ系の発現が増強されたエシェリヒア属細菌。
- αサブユニットをコードするＤＮＡがβサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置し、単一のプロモーターによってそれぞれの発現が制御される請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
- さらに、前記グルコース脱水素酵素のγサブユニットをコードするＤＮＡが発現可能な形態で導入された請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
- γサブユニットをコードするＤＮＡがαサブユニットをコードするＤＮＡの上流に位置する請求項３に記載のエシェリヒア属細菌。
- 前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである請求項１〜４のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培養して、αサブユニット及びβサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを発現させ、グルコース脱水素酵素複合体を産生させ、これを採取するグルコース脱水素酵素複合体の製造方法。
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