CN114934005A - 解淀粉芽胞杆菌表达宿主 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽胞杆菌表达宿主，以解淀粉芽胞杆菌HZ‑12为出发菌，敲除基因epr、nprE、aprE、aprX、mpr、pbpF、vpr、ykct1、htrB、hag，获得突变株BAX‑10，在野生菌HZ‑12和突变株BAX‑10异源表达碱性蛋白酶基因aprE，BAX‑10分泌表达的碱性蛋白酶AprE的酶活力相对于野生菌HZ‑12提高了57%，BAX‑10具有更高效地表达异源蛋白酶的能力。

Description

解淀粉芽胞杆菌表达宿主

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及重组的解淀粉芽胞杆菌表达宿主及其构建方法和应用。

背景技术

解淀粉芽胞杆菌可以产生芽胞，从而能够适应高温等多种环境压力，且解淀粉芽胞杆菌具有多种优良特性，目前在食品、农业、医药等不同领域被广泛研究和应用(Ngalimat et al 2021)。如在农业生产方面，解淀粉芽胞杆菌可产生多种抑制病原真菌、细菌的抑菌物质，可用于植物疾病的生物防治。在医药领域中，解淀粉芽胞杆菌可产生多种生物活性成分，包括降血糖、抗病毒、抗炎等功能活性成分，具有巨大的开发价值。在食品领域，解淀粉芽胞杆菌因不含外毒素和内毒素，具有良好的食品安全性，已经被GB 2760—2014许可作为多种食品用酶的生产宿主菌和供体菌株，主要包括蛋白酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶和谷氨酰胺酶。因此，利用解淀粉芽胞杆菌生产食品酶制剂具有巨大的市场前景。

尽管如此，解淀粉芽胞杆菌作为宿主菌仍存在较大的改善空间，如其自身蛋白酶和冗余蛋白对分泌表达目标蛋白的影响尚未阐明，高效的宿主菌相对比较缺乏，这些问题都制约着解淀粉芽胞杆菌作为宿主菌在酶制剂领域的广泛应用。因此，本发明为了获取具有蛋白高效表达的解淀粉芽胞杆菌宿主，在解淀粉芽胞杆菌中叠加敲除了10个基因，构建了能够高效表达外源蛋白酶的宿主菌株。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一株解淀粉芽胞杆菌表达宿主，以解淀粉芽胞杆菌HZ-12为出发菌，敲除基因epr、nprE、aprE、aprX、mpr、pbpF、vpr、ykct1、htrB、hag，获得的突变株BAX-10具有更高效地表达异源蛋白酶的能力。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

解淀粉芽胞杆菌表达宿主，该菌株是以解淀粉芽胞杆菌HZ-12为出发菌，敲除基因epr、nprE、aprE、aprX、mpr、pbpF、vpr、ykct1、htrB、hag(核苷酸序列如SEQ ID NO.1-10所示)，构建方法如下：

(1)构建敲除载体：以epr基因为例，根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的epr基因上下游序列约500bp，设计上下游同源臂引物epr-AF/R和epr-BF/R，以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因作为模板，分别扩增出aprE上下同源臂序列A和B，PCR产物纯化后回收，通过SOE-PCR将同源臂序列A和B相连接在一起，产物回收纯化后与温敏型敲除质粒T2(2)-ori分别用限制性内切酶BamHI和XbaI进行双酶切，产物回收后，用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因epr的敲出载体(T2Δepr)。用同样的方法还构建了T2ΔnprE、T2ΔaprE、T2ΔaprX、T2Δmpr、T2ΔpbpF、T2Δvpr、T2Δykct1、T2ΔhtrB、T2Δhag。

(2)构建缺失突变株：将构建的敲除质粒T₂ΔaprE电转化到解淀粉芽胞杆菌感受态细胞中，涂布于Kan抗性平板上，37℃培养16-20小时，转化子用引物T2-F/R验证，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测。对正确的转化子进行单交换和双交换，从而得到HZ-12Δepr。用同样的方法在HZ-12Δepr的基础上，依次叠加敲除nprE、aprE、aprX、mpr、pbpF、vpr、ykct1、htrB、hag，最终获得缺失突变菌株解淀粉芽胞杆菌BAX-10。

上述解淀粉芽胞杆菌BAX-10在表达异源蛋白酶中的应用：BAX-10敲除了中性蛋白酶基因nprE和碱性蛋白酶基因aprE，菌株中几乎无胞外残余蛋白酶活性。在本发明的具体实施例中，在解淀粉芽胞杆菌BAX-10和野生菌HZ-12中表达碱性蛋白酶基因aprE，结果表明，BAX-10具有更高效地表达碱性蛋白酶AprE的能力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

首次在解淀粉芽胞杆菌HZ-12中叠加敲除10个基因，得到系列突变株BAX-1-BAX-10，在野生菌HZ-12和突变株BAX-3至BAX-10系列宿主菌进行异源表达碱性蛋白酶基因aprE，宿主菌BAX-4、BAX-6、BAX-7、BAX-8、BAX-9和BAX-10相对于野生菌HZ-12都有显著的提高，在BAX-10中分泌表达的AprE的酶活力最高，相比于野生菌HZ-12提高了57％；利用地衣芽胞杆菌BL9进行宿主菌对比分析，相比之下BAX-10具有更高效地表达胞外蛋白酶的能力。

附图说明

图1：敲除载体T2Δepr的构建过程。

图2：单交换和双交换流程图。

图3：BAX-10菌落PCR验证图。从BAX-10中用引物扩增出的DNA条带：泳道1为eprA-F/eprB-R，泳道3为nprEA-F/nprEB-R，泳道5为aprEA-F/aprEB-R，泳道7为aprXA-F/aprXB-R，泳道9为mprA-F/mprB-R，泳道11为pbpFA-F/pbpFB-R，泳道13为vprA-F/vprB-R，泳道15为ykct1A-F/ykct1B-R，泳道17为htrBA-F/htrBB-R，泳道19为hagA-F/hagB-R；从HZ-12中用引物扩增出来的DNA条带：泳道2为eprA-F/eprB-R，泳道4为nprEA-F/nprEB-R，泳道6为aprEA-F/aprEB-R，泳道8为aprXA-F/aprXB-R，泳道10为mprA-F/mprB-R，泳道12为pbpFA-F/pbpFB-R，泳道14为vprA-F/vprB-R，泳道16为ykct1A-F/ykct1B-R，泳道18为htrBA-F/htrBB-R，泳道20为hagA-F/hagB-R。

图4：蛋白酶缺陷系列菌株的胞外蛋白酶活性检测。

图5：游离载体pHY/aprE构建过程图。

图6：表达碱性蛋白酶基因aprE的不同宿主菌株发酵产碱性蛋白酶的酶活。

图7：BL9/aprE和BAX-10/aprE发酵产碱性蛋白酶的酶活曲线。

图8：BL9和BAX-10表达胞外碱性丝氨酸蛋白酶工程菌的SDS-PAGE结果。

具体实施方式

实施例1蛋白酶缺失菌株BAX-10的构建

1、解淀粉芽胞杆菌HZ-12蛋白酶(或肽酶)的信息

解淀粉芽胞杆菌HZ-12属于已公开的生物材料，已在文章(Ruan Liying,Li Lu,Zou Dian,Jiang Cong,Wen Zhiyou,Chen Shouwen,Deng Yu,Wei Xuetuan,(2019)Metabolic engineering of Bacillus amyloliquefaciens for enhanced productionof S-adenosylmethionine by coupling of an engineered S-adenosylmethioninepathway and the tricarboxylic acid cycle.Biotechnol.Biofuels 12,211)中报道过，现保存于华中农业大学微生物工程实验室。

利用MEROPS数据库中列出的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的所有已知和假定的蛋白酶或肽酶，Blast找出B.amyloliquefaciens HZ-12基因序列中相应的蛋白酶或肽酶基因，再结合文献报道的B.amyloliquefaciens蛋白酶或肽酶基因，并利用EditSeq计算出其蛋白分子量，本发明选择敲除了10个基因，表1列出相关信息。

表1 B.amyloliquefaciens HZ-12的部分蛋白酶(肽酶)

2、敲除载体的构建

(1)T2Δepr载体的构建

构建过程如图1所示，根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的epr基因上下游序列，设计了epr基因的两个同源臂的引物：epr-AF/AR和epr-BF/BR(见表2)。以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段epr(A+B)，序列如SEQ IDNO.11所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切epr(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因epr的敲除载体(T2Δepr)。

(2)T2ΔnprE载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的nprE基因上下游序列，设计了nprE基因的两个同源臂的引物：nprE-AF/AR和nprE-BF/BR(见表2)。以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段nprE(A+B)，序列如SEQ IDNO.12所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切nprE(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因nprE的敲除载体(T2ΔnprE)。

(3)T2ΔaprE载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的aprE基因上下游序列，设计了aprE基因的两个同源臂的引物(见表2)：aprE-AF/AR和aprE-BF/BR。以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段aprE(A+B)，序列如SEQ IDNO.13所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切aprE(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因aprE的敲除载体(T2ΔaprE)。

(4)T2ΔaprX载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的aprX基因上下游序列，设计了aprX基因的两个同源臂的引物(见表2)：aprX-AF/AR和aprX-BF/BR。以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段aprX(A+B)，序列如SEQ IDNO.14所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切aprX(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因aprX的敲除载体(T2ΔaprX)。

(5)T2Δmpr载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的mpr基因上下游序列，设计了mpr基因的两个同源臂的引物(见表2)：mpr-AF/AR和mpr-BF/BR。以B.amyloliquefaciensHZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段mpr(A+B)，序列如SEQ ID NO.15所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切mpr(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因mpr的敲除载体(T2Δmpr)。

(6)T2ΔpbpF载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的pbpF基因上下游序列，设计了pbpF基因的两个同源臂的引物(见表2)：pbpF-AF/AR和pbpF-BF/BR。以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段pbpF(A+B)，序列如SEQ IDNO.16所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切pbpF(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因pbpF的敲除载体(T2ΔpbpF)。

(7)T2Δvpr载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的vpr基因上下游序列，设计了vpr基因的两个同源臂的引物(见表2)：vpr-AF/AR和vpr-BF/BR。以B.amyloliquefaciensHZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段vpr(A+B)，序列如SEQ ID NO.17所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切vpr(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因vpr的敲除载体(T2Δvpr)。

(8)T2Δykct1载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的ykct1基因上下游序列，设计了ykct1基因的两个同源臂的引物(见表2)：ykct1-AF/AR和ykct1-BF/BR。以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段ykct1(A+B)，序列如SEQ IDNO.18所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切ykct1(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因ykct1的敲除载体(T2Δykct1)。

(9)T2ΔhtrB载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的htrB基因上下游序列，设计了htrB基因的两个同源臂的引物(见表2)：htrB-AF/AR和htrB-BF/BR。以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段htrB(A+B)，序列如SEQ IDNO.19所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切htrB(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因htrB的敲除载体(T2ΔhtrB)。

(10)T2Δhag载体的构建

根据B.amyloliquefaciens HZ-12全基因组序列中的hag基因上下游序列，设计了hag基因的两个同源臂的引物(见表2)：hag-AF/AR和hag-BF/BR。以B.amyloliquefaciensHZ-12的基因组DNA作为模板，分别扩增得到上下游同源臂(A，B)。PCR产物纯化回收后，通过SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段hag(A+B)，序列如SEQ ID NO.20所示。产物回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切hag(A+B)。产物回收后，与同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(2)-ori用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化子采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因hag的敲除载体(T2Δhag)。

表2敲除载体构建PCR引物

3、缺失突变株B.amyloliquefaciens BAX-1的构建

将T₂Δepr质粒电转入野生型B.amyloliquefaciens HZ-12菌株感受态中，涂布于Kan抗性平板上，37℃培养16-20小时，转化子用引物T2-F/eprB-R和T2-R/eprA-F做菌落PCR验证，产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测。将阳性克隆在含0.1％Kan的LB培养基中45℃进行单交换过程，培养10小时。进一步，挑取完成单交换菌株于5mL LB的PA瓶中(无Kan)，在37℃摇床中进行同源重组双交换(培养时间和转接次数根据实际交换情况进行微调)，对双交换后的培养物稀释(稀释倍数10^-3-10^-6)，稀释了10^-3的培养物继续在37℃中摇瓶培养，将稀释了10^-6的培养物涂布于不含Kan的LB平板上，并对其长出的单菌落分别对应点种于含0.1％Kan和不含Kan的平板上；对在不含Kan的平板上生长而在含0.1％Kan的平板上不长的单菌落用引物eprA-F/eprB-R进行PCR验证，筛选双交换菌株，操作流程如图2。最后得到双交换成功菌株HZ-12Δepr，并命名为B.amyloliquefaciens BAX-1。

4、缺失突变株B.amyloliquefaciens BAX-2-BAX-9的构建

构建方法如3，在B.amyloliquefaciens BAX-1的基础上分别依次叠加敲除nprE(敲除菌株命名为BAX-2)、aprE(敲除菌株命名为BAX-3)、aprX(敲除菌株命名为BAX-4)、mpr(敲除菌株命名为BAX-5)、pbpF(敲除菌株命名为BAX-6)、vpr(敲除菌株命名为BAX-7)、ykct1(敲除菌株命名为BAX-8)、htrB后得到菌株HZ-12ΔeprΔnprEΔaprEΔaprXΔmprΔpbpFΔvprΔykct1ΔhtrB，命名为B.amyloliquefaciens BAX-9。

5、缺失突变株B.amyloliquefaciens BAX-10的构建

将成功构建的敲除载体T2Δhag，在BAX-9的基础上敲除hag基因，将得到的缺失突变菌株HZ-12ΔeprΔnprEΔaprEΔaprXΔmprΔpbpFΔvprΔyktc1ΔhtrBΔhag命名为BAX-10，缺失基因包括epr、nprE、aprE、aprX、mpr、pbpF、vpr、ykct1、htrB和hag。最终，采用10对验证引物，对出发菌株B.amyloliquefaciens HZ-12和B.amyloliquefaciens BAX-10的10个基因进行PCR综合验证，对于BAX-10而言，所扩增片段长度与同源臂片段相同，对于出发菌株HZ-12而言，所扩增得片段长度等于同源臂和目的基因的总长度，结果如图3所示，进一步证明从HZ-12的基因组中成功叠加敲除了10个基因。

6、解淀粉芽胞杆菌BAX-1-BAX-10的发酵液特征

分别挑取菌落HZ-12、BAX-1、BAX-2、BAX-3、BAX-4、BAX-5、BAX-6、BAX-7、BAX-8、BAX-9和BAX-10接种于50mL的液体LB培养基(氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH7.2-7.4)中，37℃培养8-12小时；当OD₆₀₀达到3.5-4.0时，以3％接种量接入到发酵培养基(蛋白胨80g/L，酵母粉25g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化铵6g/L，pH 7)中，在37℃，180r/min培养48小时(稳定后期)。野生型HZ-12为对照菌株，每个设置3个摇瓶重复。取样，检测蛋白酶缺失系列菌株BAX-1-BAX-10的胞外蛋白酶活性，通过脱脂牛奶平板法指示胞外蛋白酶活性(Yang et al 2020)。

在含有0.5％脱脂奶粉的LB平板上打孔，并将菌株发酵上清液加入到孔内，37℃培养12h，形成透明圈，结果如图4所示。突变体BAX-1在0.5％脱脂奶粉平板形成的透明圈与野生菌株HZ-12没有显著性差别，突变体BAX-2形成的透明圈相比于BAX-1明显变小，BAX-3、BAX-4、BAX-5、BAX-6、BAX-7、BAX-8、BAX-9以及BAX-10都未显示透明圈。以上结果表明，在HZ-12中敲除了中性蛋白酶基因nprE和碱性蛋白酶基因aprE后的蛋白缺陷型菌株中几乎无胞外残余蛋白酶活性，说明在解淀粉芽胞杆菌HZ-12中分泌的胞外蛋白酶主要是中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

实施例2外源碱性蛋白酶AprE的高效分泌表达

碱性蛋白酶AprE表达质粒pHY/aprE构建过程如图5所示。根据NCBI上公布的B.subtillis 168基因组上P43启动子的序列设计引物P43-F(SEQ ID NO.21)和P43-R(SEQID NO.22)，以B.subtillis 168全基因为模板，PCR扩增片段得到启动子P43片段，大小为305bp。

根据B.licheniformis WX-02全基因组序列中amyL基因的终止子序列设计引物TamyL-F(SEQ ID NO.23)和TamyL-R(SEQ ID NO.24)，以B.licheniformis WX-02全基因组为模板，PCR扩增片段得到终止子片段，大小为501bp。

根据NCBI上公布的B.subtillis 168的碱性蛋白酶基因aprE的序列设计一对引物aprE-F(SEQ ID NO.25)和aprE-R(SEQ ID NO.26)，以菌株B.subtillis D7全基因组DNA为模板，PCR扩增aprE基因片段，大小为1146bp(序列如SEQ ID NO.27所示)。

PCR产物纯化回收，以P43-F和TamyL-R为引物通过SOE-PCR将aprE基因、终止子TamyL和P43启动子连接起来，纯化后回收，与pHY300PLK质粒分别用SmaI和XbaI进行双酶切，产物回收后，用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，采用pHY300-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因aprE的强化表达载体(pHY/aprE)，构建过程图如5。

同时，为排除宿主菌自身胞外蛋白酶活性的影响，选取BAX-3至BAX-10系列宿主菌进行异源表达。将构建成功的表达质粒pHYaprE电转化到缺失菌株HZ-12、BAX-3、BAX-4、BAX-5、BAX-6、BAX-7、BAX-8、BAX-9和BAX-10中。以设计的pHY300PLK载体上的引物pHY300-F/pHY300-R作为引物，经过菌落PCR验证，最终得到工程菌株HZ/aprE、BAX-3/aprE、BAX-4/aprE、BAX-5/aprE、BAX-6/aprE、BAX-7/aprE、BAX-8/aprE、BAX-9/aprE和BAX-10/aprE。

为了进一步研究缺失菌株对于碱性蛋白酶基因aprE的影响，分别从HZ/aprE、BAX-3/aprE、BAX-4/aprE、BAX-5/aprE、BAX-6/aprE、BAX-7/aprE、BAX-8/aprE、BAX-9/aprE和BAX-10/aprE的甘油管中划线于带有0.1％Tet抗性平板上，再挑取菌落接种于含有20μL的Tet(20μg/mL)50mL液体LB培养基里，37℃，180r/min振荡培养9-11h，直到OD₆₀₀为3.5-4时，以3％的接种量接种到50mL的发酵培养基中(g/L：蛋白胨80，酵母粉25，磷酸氢二钾5，氯化铵6，pH＝7)，37℃，180r/min振荡培养60h，用福林法检测碱性蛋白酶酶活力，参考国标GB1886.174-2016。结果如图6所示，与对照工程菌株HZ/aprE相比，BAX-3/aprE和BAX-5/aprE的酶活未显示显著性差别，工程菌BAX-4/aprE、BAX-6/aprE、BAX-7/aprE、BAX-8/aprE、BAX-9/aprE和BAX-10/aprE相对于对照菌株HZ/aprE都有显著的提高。其中工程菌株BAX-10/aprE的胞外碱性蛋白酶的活性最高，达到了666.83U/mL，相比于对照菌株HZ/aprE(424.51U/mL)提高了57％。上述结果表明，在B.amyloliquefaciens HZ-12的部分基因缺失型菌株中异源表达aprE，可显著提高碱性蛋白酶发酵活性。

同时，利用具有高效分泌胞外蛋白酶能力的地衣芽孢杆菌BL9(Wei et al 2015)进一步评估BAX-10表达胞外蛋白酶的应用潜力。将构建的强化表达载体pHY/aprE电转化到B.licheniformis BL9感受态细胞中，涂布于含0.1％Tet抗性平板上，37℃培养16-20小时，转化子用引物pHY300-F/R验证，产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，琼脂糖凝胶电泳验证，最终得到工程菌BL9/aprE。

利用BAX-10/aprE和BL9/aprE进行摇瓶发酵，方法与上文相同，一共发酵60小时，探究不同时间段菌体发酵过程的碱性蛋白酶酶活力。结果如图7所示，在不同发酵时期，BAX-10/aprE的碱性蛋白酶活性均高于BL9/aprE，其中，在发酵36h时，BL9/aprE的碱性蛋白酶活性达到最高(372.36U/mL)，而BAX-10/aprE的碱性蛋白酶酶活力(556.61U/mL)提高了49％。在发酵时间为60h时，与BL9/aprE的碱性蛋白酶(317.81U/mL)相比，BAX-10/aprE的碱性蛋白酶酶活力(593.00U/mL)提高了85％。取BAX-10/aprE和BL9/aprE在该时段的发酵上清液，通过SDS-PAGE跑胶验证，AprE蛋白酶大小为28.4KDa，结果如图8所示，进一步证明外源碱性蛋白酶分别在BAX-10/aprE和BL9/aprE中获得了表达，且从条带粗细也能看出BAX-10/aprE中的碱性蛋白酶表达量高于BL9/aprE。

参考文献

1.Ngalimat MS,Yahaya RSR,Baharudin MMA,Yaminudin SM,Karim M,Ahmad SA,Sabri S.A Review on the Biotechnological Applications of the OperationalGroup Bacillus amyloliquefaciens.Microorganisms,2021,9.

2.Yang S,Zhai L,Huang L,Meng D,Li J,Hao Z,Guan Z,Cai Y,Liao X.Miningof alkaline proteases from Bacillus altitudinis W3 for desensitization ofmilk proteins:Their heterologous expression,purification,andcharacterization.Int J Biol Macromol.2020,153:1220-1230.

3.Wei X,Zhou Y,Chen J,Cai D,Wang D,Qi G,Chen S.Efficient expressionof nattokinase in Bacillus licheniformis:host strain construction and signalpeptide optimization.J Ind Microbiol Biotechnol.2015,42(2):287-95.

4.国家食品药品监督管理总局，GB1886.174-2016，食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂.北京：中国标准出版社，2016。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 解淀粉芽孢杆菌表达宿主

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1743

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtatcaca ccctgaaacc gataatggcc gcggccttgt gcatcagcct gttctccgcc 60

gcggcgcccg cgcacgccga gacgcatgac cgggacgtta tcgtggtgta caaaaatcaa 120

aacggcaagg aatccgccat agacagcgga gcggatgtgg aacagaccta tcagcatctt 180

ccggcagtcg ccgtgtcagc cgattcgcaa acggtgaaag acctgaaaca ggaccctgac 240

atcttatatg tagaagagaa tgtatccttt caggcagcag gcggttctga tatccgcccg 300

ttatcagcgg cccaaagcag cagttacgtg ctgccgcaat gggatatcga accgactcag 360

gttaagcagg cgtggaaaga aggcttgacg ggaaaaaagg tgaaagtggc tgtcattgac 420

agcggcattt accctcatga tgatctctcc attgccggag gctattccgc agtcagctat 480

actccctcat acaaagatga caacggacac gggacgcatg tcgccggaat cattgcggcc 540

aaacatgacg gatacggcat cgacggcatc gcgccggatg tccggttata tgcggttaaa 600

gcattagaca gaaaaggagc gggagatctc aaaagccttc ttaaagcgat cgactggtcg 660

atcgccaata aaatggacat catcaatatg agcctcggga caaacgcaga cagcaaaagt 720

cttcacgacg ccgttgacaa agcttacaaa aaaggaatcg tgatcgttgc tgccgcagga 780

aacgacggca ataaaaaacc cgtcaattat ccgggcgcct acagcagcgt aacggcagtc 840

tcagcgtcaa ctgaaaaaaa cgggctcgcg gctttttcca cgaccggaaa acaaattgag 900

tttgccgcac ccggcactaa tattacgagc acgtatctga atcaaatgta cgccacagct 960

gacggcacat ctcaagccgc gccgcacgtc accggcatgt tcgcgctgct caggcagaaa 1020

tatccggagg aagcaaatac acagctccgg cagcagatgc agcagaacgt caaagatctg 1080

ggcgctcccg gacgtgacag ccgattcggc tacggactgg cgcaatatca cacaaaacaa 1140

aagggctttg ccgaacgggc cgtaataaaa gcggaaaaga cgaaaaagca ggcagatatc 1200

aatgaagcaa aaacggcagt cagcaaactg tccaagttaa agggaaaaac cgctctcgag 1260

gcgcggatca ataaagttca gacggcaaga aatgtgacgg acgcaagaga caaagtccgg 1320

actgccgaaa aacaaaagaa aaaaaccgcc gtcaatgccg cacaaagcgc cattcgcaaa 1380

ttaccggccg gttcagagaa aaaagggctg caaaagcggc tgaacgctgt caactcaagc 1440

cttttgagaa ctgctgaggc cagcgtcaag caggcggaaa aaaagacttc tgaggccaac 1500

accgcaaaag cccaaaaagc agtcagcgaa atccagccgg gaaaagaaaa aaccgctctg 1560

gaaaaacggc ttggctggat aaaagataaa ctcaaccggc agcaggcaag ggacaaagta 1620

aaaacggcgg aaaaaaccaa gacgaaaaaa gcaaaatcag cggcgcaaac ggcagtcagc 1680

cgattgaagc cgtctgccga aaagaccagc ctgcaaaaac gcgtgcgtgc gattcgggtg 1740

aaa 1743

<210> 2

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgcagaatg agagaatgct ggtttattat aacaatataa gttttcatta ttttcaaaaa 60

gggggattta ttgtgggttt aggtaagaaa ttgtctgttg ctgtcgccgc ttcctttatg 120

agtttaacca tcagtcttcc gggtgttcag gcagctgaga atcctcagct taaagaaaac 180

ctgacgaact ttgtgccgaa gcattctttg gtgcaatctg aattgccttc agtcagtgac 240

aaagcaatca agcaatactt gaaacaaaac ggcaaagtct tcaaaggcaa cccttctgag 300

agactgaagc tgattgacca cacgaccgat gatctcggct acaagcactt ccgttatgtg 360

cctgtcgtta acggtgtgcc tgtgaaagac tcgcaagtca ttattcacgt cgataaatcc 420

aacaatgtct atgcgattaa cggtgaatta aacaacgatg cttctgccaa aacggcaaac 480

agcaaaaaat tatctgcaaa tcaggcgctg gatcatgctt ttaaagcaat cggcaaatca 540

cctgaagccg tctctaacgg caacgttgca aacaaaaaca aagccgagct gaaagcagcg 600

gccacaaaag acggtaaata ccgactcgcc tatgatgtaa ccatccgcta catcgaaccg 660

gaaccagcta actgggaagt aaccgttgat gcggaaacag ggaaagtcct gaaaaagcaa 720

aacaaagtgg agcatgccgc tgcaaccgga acaggtacga ctcttaaagg aaaaacggtc 780

tcattaaata tttcttctga aaacggcaaa tatgtaatgc gtgatctttc gaagcctacc 840

ggaacacaaa ttattacgta cgatctgcaa aaccgacaat ataacctgcc gggcacgctc 900

gtatcaagca ctacaaacca gttcacaact tcttctcagc gcgctgcggt tgatgcgcat 960

tacaatctcg gcaaagtgta tgattatttc tatcagacgt ttaaacgcaa cagctacgac 1020

aatagaggcg gcaaaatcgt atcttccgtt cattacggca gcagatacaa taacgcggcc 1080

tggatcggcg accaaatgat ttacggtgac ggtgatggct cattcttctc gcctctttcc 1140

ggttcaatgg acgtaacggc ccatgaaatg acacacggcg ttacacagga aacagccaac 1200

ctgaactatg aaaatcagcc gggcgcttta aacgaatcct tctccgatgt attcgggtac 1260

ttcaccgata ctgaggactg ggatatcggt gaggatatta cggtcagcca gccggctctc 1320

cgcagcttat ccaatccgac aaaatacgga cagcccgacc attacaaaaa ttatcaaaac 1380

cttccgaaca ctgatgccgg cgactacggc ggcgtgcata caaacagcgg aattccgaac 1440

aaagccgctt acaacacgat tacaaaaatc ggagtgaaaa aagcggagca gatttactat 1500

cgcgcactga cggtatatct cactccgtca tcaagcttta aagatgcaaa agcagctttg 1560

attcaatcag cgcgggacct ttacggctct caagacgctg caagcgtaga agcggcctgg 1620

aatgcggtcg gcttgtaa 1638

<210> 3

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttactgagct gccgcctgta cgttgatcag cccttttcca tagtagaaag catcaccaag 60

ttttgtagtg gtgttttcta aactgctgcg gacttgagtg tttgtccagt tcgggtgctt 120

agaaagaatc aaagcagccg ctccggcaac gtgcggagat gccattgacg taccattgta 180

cgcgccgtat ttgtttccag gaagcgtgct ttggatagag acgcctggtg ccatgacatc 240

aagctcagaa cctacgcttg agaaagatgc tctttggttg ctgctgttaa cagcgcctac 300

cgcaatgaca gaagggtatt taccagggta gcccactgtg cttgagccgc cggaagtgcc 360

ttcgttaccg gctgccgcaa ccactacgac gccggaagca acggctttgt caactgccgc 420

ttttaacgct gcagaaccag aaggtccgcc gaggctcatg ttaataacgt ccatattgtt 480

tgcgatcgcc cactcaattc cgttaatgat ccagctgtac tggccggaac cgtcagcgcc 540

gagaactttt acagcgtaaa gagatgcgct tggcgcaacg cctaatacac cgactgagtt 600

attaagagcc gcaactgtac cggcaacgtg agttccgtga gagttgttat cttggaaagg 660

atttgtttca gaaggaacca tgctggctcc gcctgctacc tttaaatcag gatgagaaga 720

atcgataccg ctgtcgataa ccgctacttt aacatttgat ccggtgaagc cttgagagtg 780

cagagcaggg gctttaatct gtgatacgcc gtaaggcacg gactgcgcgt acgcctgtgc 840

aatgtgatct tcttcaacgt aagcgacgct agggtctttt ttcagctctt ttacagcttt 900

ttcatttaat gtagctgaag ctgcgtctac atatttgaat tgcttttcca ctttcccgcc 960

tttttcagaa atgacatctt ttttcttggc ggcgctcatc gtgctcattg tctgcttaaa 1020

tccgacaata tatttctttt ccccgtttga tttccctgca gcctgggcag aagtcgtgct 1080

gccgaacgcc atcgtaaaga ttaacgctaa agcaaacagc aaactgatcc ataccttttt 1140

gcctctcac 1149

<210> 4

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtttggtt actcaatggt acaaatggtg cggtcaaatg ctcataagct ggactggccg 60

ctcagagaaa acgtattaca gttatataaa cctttcaaat ggacaccttg ctttttacac 120

aattttttcg aaaaaaaggt gaaaaacaga aagaaaatgt cagtcatcat tgaatttgaa 180

gagggctgcc atgaatccgg ttttcacagc acaggacagg tcttatcaaa agaaaaacgc 240

tgcaccataa aaaagcagtt tcaaacaatc aattgctgca gcgccgaagt cacgccgtcc 300

gcccttcaca tgcttctttc gcaatgccgg gatatccgta aaatctattt aaaccgtgaa 360

gtaaaagctc tccttgatac agcagctgaa tcgtctcatg caaaagaagt gacccgtaac 420

ggcaccgtat taacaggaaa aggcgtaacc gtcgccgtta ttgataccgg aatctatcag 480

catcccgatt tagaaggcag gattatcgga tttgcggact ttgtcaacca aaagacagaa 540

ccgtatgatg acaacggaca cggcacccat tgcgccggtg atatcgcaag cagcggcgct 600

tcatcttcgg gtaaatatca ggggccggcg ccggaagccg atctgatcgg agtcaaggtt 660

ttaaacaaat caggatcagg aaccttggct gatatcattg aaggtgtgga atggtgcata 720

caatataata aagaacacac aaagaatccg atcagaatca tcagcatgtc gctgggcgga 780

gatgcgctca aatatgataa agaaacggac gacccgctcg tcaaggccgt tgaagaggca 840

tggaatgaag gaatcgtcgt ctgcgtcgcc gcgggcaact ccggtccgga agctcaaacg 900

atttcaagcc ccggtgtcag cgagaaagtc atcacggtag gcgcctatga tgacaatgat 960

acggccagca atgaggacga tacggtcgct tctttctcaa gccgcggccc gacggtgtac 1020

ggaaaagaga agcctgacat tcttgcgccc ggggtcgata tcgtatctct acgttctccg 1080

cgttcatatc ttgacaaatt acagaaatca aaccgagtag gctccttgta tttcagtctg 1140

tcgggcacgt ccatggccac tccgatctgt gcgggcatcg ctgccttaat ccttcagcaa 1200

aacccgcagc tttcgcctga cgaagtgaaa acattgatca gacaaagtcc ggatcaatgg 1260

acaaatgaag atccgaacat ttacggagcg ggcgcagtga acgctgaaaa cgctgtgccg 1320

aaagagtaa 1329

<210> 5

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttattgattt gaccaatatt gaatgttgtc gaatacactg tttgtcaccc ttgttcccag 60

attgtaagac gacccgccgt ttgtatgaat ggcaatggcg gtctggccgg tgtcgctgta 120

attgcggtaa acgggcgatc cgctctggca gccgaacgta tctgtcgtgt aagtgagttt 180

atatgtctcg gcagaacgta tcggcttgct gtccgaccac atggaaccgg acactttgtc 240

gcacggatac cctgtcacgg ttgaggaaag cccggccgga ctggaactgt tggtcgtccg 300

atagccgtac cagccgacag tattcccggg cgacccgttt actttgattg cgccgtagtc 360

atagtttgtg tcaccgtttt ctgtccaccc tttgacactg tagaaggtct tgcctgaata 420

agagtcgtac gggtacgatg acccgttgcg gccgggagct gccgtaattt tcgatgccca 480

gccgtttttc tgatcataca cgcaatgtcc cgccgtaacg atcgtgtcag cattgacaaa 540

aaaaccggtg catccgtagg tgcttgtgct gccgctgtat gtaacggtca gctgtgctgt 600

cgcgcgatat ggaaatgatg ttgtgggaga aattctgatt cgttcgtctg tcccaataat 660

actggaaggc tttaatgact tgatgtcagc tttgctgttt tgtgcaagct gtcttttggt 720

gaggcccgtt ccttcataag cgggggatgt ctgtgttgtt tgtacaggct gattctgatt 780

tgcgtcaaac tcctcaccgc tgtttgatac agatgtctgc gggctgcccg ctgcttctgc 840

tgaaacagca aataatgaaa ctgacagtaa gaatgcggta aggctcagca atcgttttga 900

aactgtcttc at 912

<210> 6

<211> 2142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgctgaaaa agaaaaaaag attctttatt ccggctgtaa ttgcggcggc aaccgctttt 60

ctcgcgttaa tcggatacat tatcattata tttctcggcc attatgtcat cgatgaaaag 120

aaattaatac tgcacgcatc ttcaaaaatc gtcgatcaag acggtgatga aatcgcgagc 180

ctctatacgg aaaatcgtga gccggtatcc attcagcagg ttccggaaga tgtgagagat 240

gcctttatcg ccgttgaaga taaacggttt tacgaacatc acggcattga tgtgaagtct 300

gtcggccggg cggtgttccg ggatgtttta gcaggcggca aggtggaggg cggaagcacg 360

atcacccagc agctggcgaa aaacattttt ctgactcatg ataaaacatt tttgcgcaag 420

acgaaggaag tcattatcgc catcaatctt gagcgtgatt acagcaagga caagctgctt 480

gaaatgtacc tgaaccagct ttatttcggc catggcgttt acggcattca agccgcgtcc 540

cactactact ttaataaaga agtaaaagat ttaaccgttg cagaaggagc cgttctggca 600

gcgattccga aggcgccatc tctttattcg ccgattcagc atccggataa aaataaagaa 660

cggcgcgata cgattcttgc aatgatgaac gatcaaggct atatcagcgc caaggaagcc 720

gtcagagccc agggccggac attggggctt aatgtcaaga aaacatcaga aacgccttgg 780

tttgacagtt atatcgatct tgtcatcaag gaggcggaag accgttattc gatgtcagga 840

gaacagctgc ttcaaggcgg ctatacgatc cggacgtcac ttgattccaa gctgcagaaa 900

acggcatata ccctcatgaa ggaaagcggc tattttccgg ggacggatca ggcggcagag 960

ggaagcgccg tctttattga taataaaacc ggaggcgtgc gcgcggcggt cggcgggcgc 1020

gactacgtga caaaaggata caacagggtt acggcgaagc ggcagccggg ctcaacgttt 1080

aagccgattg ccgtatacgg gcccgccatg caggaagaca agttcaaacc gtattcgctt 1140

ctccaagaca aactgacgtc ctacgacggg tatgaaccga aaaattatga cggacagtac 1200

aagggggaag tgacgatgca ggatgcgatc acttacagca taaatgcgcc cgctgtctgg 1260

acattgaagc agatcggcgt ggatacggga aaatcgtatc ttgagaaaaa cggcatgaac 1320

atttctgaca acggactcgc gattgcgctg ggcggtctgt ctgaaggcgt cactccgctt 1380

cagcttgccg gagcttatca tacctttgcg gcaaacggaa tgtatacgaa gccatttttt 1440

atagagaaca tcacggacga agacggagaa acgctatccg ggcctaaaaa cggcaaaacg 1500

cgcgtcttca gcggacagac ggcatggaat atgacgagaa tgcttcagca ggtcgtaaaa 1560

gaaggaaccg cttcacaagg cagctatcga ggtgacctgg cggggaaaac cggcacgacc 1620

acatttaccg gcatccccgg cgcgacaaag gacgcctggt ttgcgggata cactcccgga 1680

ctgacgggag ccgtctggat gggctatgac aaaacggata aaacccatta cctgaaaggc 1740

ggaagccagt acccggtcag actctttaaa gatatcgtca caaaagcggg tgaaaacggc 1800

cggacattca aaaagcctga aaatgtgaag gaactgggca gcccgattga gctggaggcg 1860

gtaaaatccc tgtcggcccg ttatacattt aaggcgatgg gactgattac ggttcaatta 1920

aaatgggata ttcaaaagga tgatcgggtt gtttaccgaa tatatgagaa gaaagacgga 1980

aaagacaagc ttctggattc ggtgaaagga aaaggcagct ttgacatacc gtacgccaat 2040

ctgttttcag gggcctcata caaagtcgtt ccatttaatt cgcagacgaa tcaagaagga 2100

gagggaacgg aatacgttca gccgaagctt ttttcttctt aa 2142

<210> 7

<211> 2412

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgaaaaaag gaatcatccg ttatctgctt ccggcttttg tcttatcctt taccttatcc 60

acaagttcac aggctgcgcc ggcaacaaaa ccgcaaactc ctgatcttga gaaggctgag 120

gtatttggtg acattgatat gaccaccggc aaacaaacga cagtcatcgt cgagctgaag 180

gaaaagtcac tggcggaagc aaaggaactc ggcaaagcac agacaaaaag caagctgaaa 240

agcgaacgct caaaagtaaa aaagaaagcg ctcaaaacca ttaaacacgg aaaaatcaac 300

agggaatatg agcaagtgtt ttccggcttc tccatgaaac tcccggcaaa tgaaattccg 360

aaactgttga gtgatcagga tgtcaaagcg gtttatccga acgtcaccta tcataccgat 420

cagctgaaag ataaagacat caccctatct aaggatgccg tgtctccgca gatggatgac 480

agcgcgcctt atataggggc aaatgacgcg tggaagctcg gctatacggg gaaaggcgtc 540

aaggtggcca ttattgacac cggtgtcgaa tataaacacc ctgacttaaa gaaaaatttc 600

ggacaatata aaggatacga ttttgtggat aacgattacg atcctgaaga aacgccgtcc 660

ggtgatccga gaggcgcgtc gactgaccac ggaacccatg tcgcgggcac ggtagcggca 720

aacggaacga ttaaaggcgt agcgccggat gctacactcc ttgcctaccg tgtgctcggt 780

ccgggcggaa gcggaacaac ggagaacgtc atcgccggta ttgaacgcgc cgtacaggac 840

ggagcggatg tcatgaacct ttctctcggc aattctgtga ataacccaga ctgggcgaca 900

agcacggcgc ttgactgggc gatgtcagaa ggcgtcacgg ccgttacatc aaacggaaac 960

agcgggccga acaattggac cgtcggctct ccgggaacgt ccagagaagc tatctccgtc 1020

ggagcgacac agctgccgct gaacgagtac gccgtctcct tcggttccta ttcctcagcg 1080

aaagtaatgg ggtacaacaa agaagatgac ataaaagcac tgaataaaaa agaaacagag 1140

ctcatagagg cgggtatcgg cgagcaaaag gattttgaag gcaaagatct gaaaggaaaa 1200

gtcgcggtcg tcaaacgggg cagcatcgcc tttgtggata aagcagacaa cgccaaaaaa 1260

gcgggcgcga tcggtatggt tgtgtataac aatgccccgg gagaaattga agccaacgta 1320

ccgggcatgt ccgtgccgac ggttaagctt tcatcagaag acggcgaaaa actcgtcagc 1380

caattaaaag cgggcggcac aaaagcgaca ttccatttat ccgtggctaa atcgctcact 1440

gaacaaatgg cagacttttc gtcacgcggt ccggttatgg acacgtggat gattaaacct 1500

gacgtctccg ctcccggcgt aaacatcgtc agcaccattc cgacccatga tccggccgac 1560

ccgtacggct acggatcgaa gcagggaacg agcatggctt ccccgcatgt agccggcgca 1620

gctgccgtca tcaagcaggc caaaccgaaa tggagcccgg aacaaataaa agccgctctt 1680

atgaacacgg cggaaacctt aacggacgcg gacggtgacg tatacccgca taatgcgcaa 1740

ggcgccggaa gcatcagaat catgaaggcg atcaaagcag actcccttgt cgccccggga 1800

agttattctt acggaacgtt tatgaaagac aaaggcaatg aaacgaaaaa agaaaccttt 1860

acgattgaaa accaatcgtc catcagaaaa tcatatcagc tcgagtactc tttcaacggc 1920

acgggcatta ccgtttcggg cacagaccgg gtcgtgatcc ccgctcatca aaccggaaag 1980

gtcaatgcga aagtaaaggt caatgccaaa aaagtaaagg caggcaccta tgagggaacc 2040

gtcacagtgc gtgaaggcgg aaaaacagtc gcaaaagtgc cgacgctgct gattgtaaaa 2100

gagccggact atccgcgcgt aacgtcaatc gacgtacagg acggcacaac gcagggaacc 2160

taccaaattg aaacctatct tccggctgga gccgaagagc ttgccttcct tgtatatgac 2220

agtaatcttg actttgtcgg ccaagccggc atctacaaaa agcaggataa aggctatcaa 2280

tatttcgact ggaacggcaa agtcaatggt gacaccgcac tgccggcagg agaatattat 2340

atgctggcct atgccgcgaa caaagggaaa tcaagccagg tgctgactga aaaacctttt 2400

atcattgaat aa 2412

<210> 8

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttaggagtcc agaccaacgc cttcatattt ctcttccttt ctgccccagc ggatttggtc 60

taacaatgtt tgatgaagct ccttcgttga tgccgcaata catgattgct ggttctgata 120

acttaaatct gtcagaagcg tttcgtccaa agaccggccg tatgcatccg taatgaccac 180

tcccgctttc ttcgccaaaa agacgcttgc ggcaatatca taaggaaaca aatgcagcac 240

ctctccgttt ccgacctgct gaaaatctga aagcagcttc ggatcatctt tcagcagacg 300

attgccgata tccacataag catccatctg ccccgtgata attcgtgaaa tcgaataaga 360

agcgctgttg aaaacaaaaa ccccgccatt attggctgac cggtcaatca gatgaccgta 420

tgcatccgtc atcagctgtg ccggatgccc gttaaattca aggctccaaa acatattttt 480

aatatcccgc actccgctca aattcggtaa ttctccctga tacccctcaa actgaatggc 540

atcgctgtaa atatcaccgt acatgtaagc gcccgatttc aattcaagca aaaaagcaaa 600

ttcgatatcc ttaatctttg cgtttggctt atatgaagca agcgcaatcg aaatacacga 660

catttcaagc cccgcggcgg ccggacgcgt tccgtctatc ggatctacaa ttaaaatata 720

ttgcggatct tctccaatca gcttcaggcc gccatcctcc gtgtaaaaag caaccggatg 780

gcccttatct tgaatataat ccagcaccgc ctcctcagca gcggcgtcta tgttaaattg 840

ggcgtcgcct cccggagaat agccgtttac gagccggttt ttcagcgtgc ctttttgact 900

tttcacctta tgataaacaa attgtccaag cccgatgata tagtctctca c 951

<210> 9

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcagcttgcg ctttcagttt gtttcgttaa tgtgacgttc agcgtctttt tgcttccgct 60

tctgagcact tgaacagtcg ttttatcgcc gattttcagc tggttatata agatctgtct 120

gatatcggcg ctgctgtcga catctttgcc gttcagttgt acaatgacgt catttgattt 180

gatgcccgct ttcgcagccg gtgagccgga ttgcacttct tttacgtaaa cacccttaga 240

cagctggtcg ccgaacagtc cgagcgtgtt ttcctgatag gtttccggca cttgcgccat 300

gtcaatcatc tgcacaccta aaaacgggcg cttgactttt ccttttgcaa gcagctggtc 360

gactatcggt tctacatcat tgctcggaat ggcaaagccg agtgactcca cgccgttttc 420

actgactttc atgctgttga tcccgatgac ctggccgctt gagttgatta acgggccgcc 480

gctgtttccg gggttaatcg ccgcatccgt ctgaatcacg ttcatttcca ccgtgccttg 540

ggatgtatcg gcgtccaccg ttctgttcag cccgctgatg acaccttgtg tgacggtgcc 600

ggaaaactgc tggccgagcg ggttgccgat ggcaatcact ttatcggcaa tgcggagctt 660

ggaggaatcc ccgaagctgg ccgctttttt gacattggac gagctgattt ccaatacagc 720

caagtcactg atggcatcct ttccgacaag ctttgccgtt tcggttttcc cattgtaaag 780

agtgaccgac agtttgttcg ccccttctac gacatgattg tttgtaatga tgtacgcttt 840

ttcgccgtct tttttgaaga tgacgcctga ccccgtgccg ctttccgttt cagagcttga 900

accgccgtca agtccgaact ggctgctttg cgaagcttgg tagttggaca ctccgacaat 960

cgcgggctcc aattcttcca ccatatccgc tacgcttgag gtatttttca aaggcgttga 1020

cgtaaaattc gaagactgaa cttgtttcgt atcagaaacg gcttctgtct tatgctgctc 1080

acccggcagg ttcggcacaa tgccaagcac aaggcctccg ccgataatgc cgcctaaaat 1140

cgggctcagc caagcggctc tccgtttttt ttcttttttc acggcagccg tttttgcaaa 1200

ttccgtaccg gcagccgtct cgttttccgg ttctttcgag acgggccctt caagcagctc 1260

gggctcctga tggctgatct gctgctgttc atttctgttt tgttccgtat gtgaaagatc 1320

tgactgatcg cggcttctgc cgtcatctcg atgatcgttc at 1362

<210> 10

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaaccttta agcaattgaa gaacttgctg aggctgttgg ttagcttgcg caagcatagc 60

ttgagaagcc tgagtaagga tgttgttttt cgtgtactcc atcatctcag aagccatgtc 120

tacgtcacgg atacgtgatt cagcagaagt caggttctca gaagaagtac caaggttgtt 180

gattgtgtgc tctaaacggt tttgaaccgc accaagttta gcgcgctcgc tagatactgt 240

gtcgatagct gttttgattg ttgtaagagc tgaagacgca gctttagctg aagaagagat 300

gtcgatacct tttgttactt tagaatctgc agctaatttt tcagatgcaa cgactttacc 360

gtcagtatca taatagccgg ctgcttttgt aaccttacca tctggatctg ttacttcatc 420

cgcccaagta gcagtgcttt ttccgtcagt tgatgtcaat gtattttgat cattggatac 480

tgtataagtc gtaccaactt tcaggctttc agagtccatt ttattgatag acaggctcat 540

tgtttggcct tcgttagctc cgatttggaa cgtcaggttt tgcgcagttc cgtcaagaag 600

tttcttcgtg ttgaactcag tgtcagtaga gattcttgtt acttcagacg ctaattggtc 660

catctctttt tgaagctcag aacggtcaga atctgtgttt gtatcgttag ctgcttgtgt 720

agcaagctcg ctcatacgct gaagaatgct gtgagtttcg ttcaatgcac cctcagatgt 780

ttggataaga gagattccgt cttgagcgtt tttagacgcc atgtctaaac cgcggatttg 840

agaacgcatt ttttcagaga tcgcaagacc cgcagcgtca tcaccagcgc ggttgatgcg 900

aagacctgaa gataattttt ccatgttttt tgcagcagag tttgaacctg cattcagctg 960

acggctagtg ttaagagccg cgatattgtg gttgattctc at 1002

<210> 11

<211> 1139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctcccacca taatctctgt tgacgagccg tcagggataa acggaatctg atacggcgtc 60

gccaataaaa aggcggcaag ggcaatggct cccgacgaca gggcatccac ctcatagctt 120

tccgcaagcc ggtaagcaat cccaaaggcg gcgacaagcg ccataatgtc aaaggacgca 180

ttcacgggat acccgagttt ttcaacccaa ttttcaccga aaagaccagc cataaaatcg 240

gcataaccgg gaatcggaag actcgtcaga atcagaaaaa ccgatccgat gatgataagc 300

ggcatagtca aaataatgcc gtcccgcaaa gctcttaagt gcctttggcc ggcgactttt 360

ccggcgacag gcatgatttt ttcttccatg acccgattga acgtactcat ttatcaaaaa 420

cccccttttt gagttcattg cgcagatgtc ttaaagcatt ttctccatca tattttggaa 480

acgcttacat ttgcatacag aaattttcct tatccctcag gaaaaaaaga attccgcact 540

gccgatatat aaagaaaaag ggggaattgc ataataaaaa aaacgcttgt gagccgatca 600

acggcttcac aagcgttttc atcacacctg cctattggtt catggccggg cggtcaatcg 660

tgttccattt cgtaaaggac atatatcgga aataatgatc acgatacggg tgcgaggtgc 720

ctgtattcca aggcttgtcc ccgccgcaga aatggacgat ggccggttcg gcacgtgttt 780

ctctgtaacg tatacggtcg atcagttcag gaggcgtttt ctcattcatg ataatatgcg 840

tctgcgcgtt ccagcgcgga tgcagttcat gccattgatc atataagatc gcgttaagcg 900

cgtcctgatc atgaaacacg agaaaatcct ccgagctgtt atcattgata aaatcaatca 960

cttttttaga aatattctgt tttctccaag gttcgaaatc tataatcata ataccggaat 1020

taaaatactt ggcagtgtcg ctgatattca tttttttcag tctttcatgc tgtccggcat 1080

cttctaccgc cgcaactatt gccggggaaa tatccaagtc ccataaaacc gaaatatct 1139

<210> 12

<211> 1070

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attaagagat gaacgatcgg aagaagctct ctttcttccg atatcaaata gtgcgcgcta 60

aagcgagtac tctgcacctg atgaaccaat tcaactgtta tgcccgccaa taatacggcc 120

ctgagcagaa ttcctgaata aaaccaaact ctctcacgac tgattttcga atgaaaagtc 180

agcgcgtata aaacagcaag gcagacggct gaccactgaa tgatcaacac gctctgtctg 240

cttaaaatga aatatctgtc gaaatgctga ataaaatgac tgaaaatctc tgacatctga 300

aacaatcctt ttcgtttatt aaggcctcac ctgtttagac aaacggctat aaaaaaagtt 360

ttacagatcg gaacattttt cctctatcat ttctcccgac ttcatttgtc atttttttca 420

gaataaatcg catcattcga ctcatgtttg attcaacacg tgcctctcgg cttatcccct 480

gacgctgccc gcctgaagcc tttacgggac gattctatca attcatcagc gaagtctagt 540

tttataacaa gaaaagagac cggagaaatc cggtctcttt tttatatctg aacatttcac 600

aatggcttca ccatgatcat atatgtcttt tcccgatcgt ctttttcaag cttaagctgt 660

tcaaagccgc attggcttaa aaacaaaacc cattcctgcc tgtccagggg aacggctgaa 720

aacatcgctt tatgctctcc tctcagccgg cccgcaatct cttcaatgac cgcgcgaccg 780

attcctttct cttttgcctc cggagcgacg gccacggttc cgagccacgg ttttccgttt 840

gaaggcgccc attccaaatg aaaactgacg gcggcaggag cgccgtcaat ctcccatacg 900

agccacgttc cattgtacat ggagtatgca agcataaact ccgccgcatt ttttgttccg 960

aactcttcgt ttttccacac cgggtgtgat gccgccagct gctccagaaa cccgagatct 1020

tcttcttcaa aatctctacc tgtcagcatg taaatagtcg tcaaagataa 1070

<210> 13

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggttcgaat aagcggatcg ttttgtggga tacgacgctt aacaaactga aggatcggga 60

aattttgttc attatggggc atgagatggg gcactatgtg atgaagcacg tgtacatcgg 120

actggccggg tatctgctgc tgtcattagc cgggttttat atcattgaca agctttataa 180

gcggctgtcc aaattcttcg gccgaatgct tcatataaag gggcctgaag atctggccgc 240

cctcccgctg ttattgctgc tcatatccgt tctcagtttt gcttctgatc cgattacgaa 300

cgccgtctcc cggtatcagg aaaacgccgc cgaccgttac ggcatcgagc tgaccggaaa 360

ccgggaagcg gcgattgaga cgtttcagga cttggccgat acgggactga gccgggtcaa 420

cccgccgttt ctcgtcaaaa ttttcagagg gagccacccg tcgatcatgg agcggattga 480

acatgcggag gaagaaaaat aataaaaaaa ccggcggggc catggccgac gccggttttt 540

tatgtttctt tatccactcc ttttttcatt tgcagaataa ccaatagaca gattattctg 600

tggattaatt gtatagtatg gaataatatt ttagtagacc caattttttt cagtttgttt 660

tatttctatt taggtatatc atctctcttt cgtttaatag gaacccgaaa tatttaaatt 720

ttaatggaaa aaaccgatgg aaggacatga gtatttgtac acagccgcaa tcgctctctt 780

gtttactggg tcgaacggtt tgattccatt tttggaagct gaggcaaaaa caggataaat 840

gtcacctttt gttgaatgca gaagtctgat ggaaacgaaa gcggaatgaa ataaagcggc 900

cggcatgaat cagtctttgg ctttcttgag ggagaaaagc tgtgaaacca ttttataaaa 960

ataatgataa tgaatatcat tgatactcat attgtcaatg atataattgc ggaaaaacga 1020

aagaggggga acagatgaaa ccaattttca gtatgctgat gatcttatcc gttc 1074

<210> 14

<211> 1127

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcagtgaaaa acttcccggt ttcgaaaaat caatggattg tcacggttca agcgctcaaa 60

tgccgggcat cagtgaaaaa aggttgagag agggcaaaaa aaaagggagg aacgcccgaa 120

ttttcagggg cgggagattc acggccggaa acggacggca tcaagaatac gcttttagaa 180

atgaatatcc gcctcccgaa gcaaatgcgc aggacagaat ggagcccgtc aaaaaagttc 240

tcatctgcct ttttgtacag caaaatgcca ttacagcccg ctcatcccct ttttttatca 300

taatggtccg ttttgaaacg gagccgtctt ttttcatata tataatatca atcggaagct 360

gtttttccaa ggaatgtctc aatatgatgt tcatgtatat actaccttcc gccggcttca 420

ttacaaaacg aacaaacgtt ccgtttcaac tcgatttctt ctcctgaaaa agccgcaagt 480

aaccagcgct cctgaaggac aaacaaactg accgaactta cggcctgttc atatggtata 540

gagagaatcg ccagaatggg aggaaaagta tatccttttt atcatgagaa cggggtcgtc 600

tgcaccggca gatgactccg tttttcaggt gaatagatga aacatttata atgaaggaac 660

tcggaacagt tcagaaccgg ctgtcagaaa aaaagatcaa tgcaaggcag tgtatttcta 720

aaaaaatagg gaataagtat ggtgtagata aaaggaggaa tcacaatggc acttacaaac 780

accgaattgt ctgaatggct gcaaaaacag atcggacaaa cgcttgatat cagaaaagga 840

gagctgacag acagccgaaa cgagatttct gatatggatc agatcatgct tcaccttgat 900

gacgttctcg tccgccggac aaaccatccc gatgactatg tagcggatga agaactcgtt 960

ttaaaagggc acggcacaac ctatacggag gaaggaaatg tcccgcttcc ccaagatgcg 1020

tatgaaatcc ctctgctcgg cgccattacc atccaacagg agcaagacgg attaaaggta 1080

catacagatc gggccgtgta tacaatcggg acccggaaag agcaata 1127

<210> 15

<211> 1186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcctctgaaa acggcacgac aatagccgct gcggtgagcg tttccgcctt taacctggca 60

aacgcgctcg gcgcctggat cggcggtttg attctcgggg gaacgggatc ttactcatgg 120

ctgtttgccg gcggtgcgct gatgacggct ctcggccttg tgctttccac gttcgctcat 180

ctgtctgaga agaaagatgt ttatgaatac caagtgcata aaggataaca aaaagcttgc 240

aggggatatt ccgcctgcaa gcttttttca atgtttcaac gtaatgctga tcaccgtatg 300

tttatcgctc tcagctaagg aaatattccg ggtttccggt accccgtctt tttcaaaaac 360

aacggcatag gttcctttcg cgccgctttt ccatgtcatc tcgccgtggt gatcagtctt 420

gcctattatc tctccgcggt ctatattcgg ctgatgatct gactccgccg ctttcatcac 480

ggtaaccgtc acaccggccg ccggtgaacc gtctgcattc tcaacatgga gcgtaacggg 540

cagtgctttt ttggcggcgg aatcatccgc tttgccgcat ccgcataaaa cggctgccgc 600

gagaaagaag acaaaagctt ttataaaacc cctccttttt tgtctaccgg cttgcggttt 660

aacatttaac atattatgga attaatttag cgttatgacc gcaagaggat gtttttttcc 720

gcaaaaaaaa gaccgggtca ttcccggtct cttacggtgt gtgttatcgt ctgcctgaag 780

ctctcatgcg ctcttgcggg tgcgaattaa ttgaaccgtc cgctcgttta gaagcgtagt 840

catcctttgc ccgcggttcg ccttcaaact tattattgtt ctgattagga aatccttttg 900

ctttgttccg gaccatttgt tttccccctc ggccaatatc aaaaggttgc gccttctgga 960

ctgaagacgt aaagttagta tatgcctgtg acaagctgcg taaaagcagc aggttttccc 1020

aaggaaagga gacagagaca tgaatacata tatcgacaaa ctgacgaatt tgctgcttga 1080

gaaaaatgac atgctcagct atttgcaagc gcggacttgg gttgagcttt tatggggaga 1140

tttcgaagcg acttacgcaa aagccggccg cccgtatcaa ggagag 1186

<210> 16

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgggaaaaaa tagacgtcgt gtcgataccg gcagatgttc cgcgtttttt atgagcttcc 60

tgataagagt ttgactgctg ccaatcctga aaggcttttt cctcttccca cagggtcaaa 120

atgacatacg tatcgccttc gagcggtctt aatacgcgga tggctttaaa accgggttca 180

ttttccactt tgccggcgcg gtttttaaac cggttttcaa acagcggacg gccttcctgg 240

gtaacggcga tgttgttgag gacggcgtag cccggatttt tgatttcccc gacgctgtcg 300

atgctttcat aggaatgggg cgcctgaaaa acggtttctc catttgtttc atgaattaaa 360

accgcattat cctccccttg catcagcacc atattctcac tcgggtgttt cttggcaatc 420

gtctttaaaa aatcggctgt cccgtatgta atataaacct tcatatcagc cacctcctgc 480

ttgctagtat atcaaaagag tggtataagt ttctattggc gactcattct gacataattc 540

gaaacaatat ttcccatact acaagttaag aaaggcgagg tgactttcat gaattcggcg 600

attttttgaa cattaagcct caattctata ccattcagaa aaaacaaggt atagtgtaat 660

gggcgaagaa cacgaacgta tggttgcagg aggaaaggtg gaaattcaga tgagtaaacg 720

agaagcgttt aatgatacgt ttttaaaagc ggcacgggga gaaaaaacaa atcacgtccc 780

tgtctggtac atgaggcagg cggggaggtc tcagccggaa taccgcaagc tgaaagaaaa 840

gtacggctta gtcgaaatta cgcatcagcc cgagctgtgc gcgtatgtga cgaggctccc 900

ggtcgagcag tacggagtgg acgctgccat tttatataaa gatattatga cgcctcttcc 960

ttatatcgga gtggatgttg aaataaaaaa cggaatcggc ccggtgatcg atcagccggt 1020

gcgctctgct gcggatattg aaaagctcgg cgaactgaat cccgaacagg atgttcctta 1080

cgtgctgga 1089

<210> 17

<211> 1146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaagaccatc cacacccgta aagatactag caaacgtttc attgcaaatc atccctccgc 60

ttctttttga cagacagctt gttcgcaggc ctgtttttct ctccgcttta acggaaaagg 120

cggccgatcc ttctccgcta aaaactagcg ggtctagcaa ccctatgact ctatgataga 180

cgcggcaggg cgaattgttt gtcacaatat gagtgaaaaa acaaactagt tttcagaagt 240

tttgttgaaa gctgatggaa atgacctgaa aaatggaaaa gccgataaaa aaagttatac 300

acaccttatc ccttggttaa gcacagctta aacacagggt atatccacat atccacaaac 360

tcgatctata ttttgtatag gaacactcgt tcccaacaat atatatacac aattttattc 420

agttatgcac aggattttgt gtataactcc ctccttattc acagaccaat ttccataaat 480

gagtcatatg tcacaaggat tattttgaat tttcaagaaa tatatactag atttctaatt 540

tagataaaga aaaaggggga aacacgaccg aacaaccctg ctggagcatc agcagggttt 600

ctttctgatt aatcggcaaa agcttctcga agcaggcgat atgactgaag tttatcttca 660

aaatgatgag taatggtcac agccattact tcttctgttg cgtatgcttt actgagagcc 720

agaatctgtt ccttcacttg ctgcttcgtt ccgatgatca tccgattccg attatcggca 780

attcgtcttt gttcatacgg tgtatacgta ttgccgcgga cggtttcgta agacggtacg 840

ccgtgaagcg gaatcccctg ttcacccgca agcagcgtat aatccatgac ggccgcgagt 900

tcctccgctt tctcttccgt gtccgcgcac agcacaaaca ccgccacggc tgtttttggt 960

tcttttccta atagagaagg tttaaatctg cgcttatatt gtgctgtcgt gctttctccg 1020

ccttctccat taataaaatg ggcaaacata tagcctgctc ccatttctgc gctcagaagc 1080

gcgctttccc ccgaagaacc gagaagccag acttccggcg ccgtcttaat aaggggtgat 1140

gcggtc 1146

<210> 18

<211> 1295

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cacggttaat gcttcagggt ggtagacata atccgatatc cggctcgccg cctcgcttcg 60

gaaactgcct atttcagtcg caaccgtcaa ccgcgccagt tttttcacca tcatttgcac 120

aagcagtccg attggccccg accccaaaac caagaccgag tcctccggct gaatcgaagc 180

tttgtccaca acattcagca cacaggagag aggctcaacc aatgtggccc gctcccattc 240

cattgaatcc ggaattctgt acatgaacct gtcttctccg acgtaatatt ccgcaaacgt 300

tccgtgcgcc ccgattccga gctgccaatc ctcgaaggtt tcgcaataac acgtcagccc 360

tctccggcaa taatgacatt tcccgcaaaa ctgcgtagga tcaatcacga cgcggtctcc 420

gacttttaca tttgtcacgt ccggtccgat ttccacgacc gctcccaccg attcatgccc 480

cataatcata tgatgggttg cattcatttt tcctttcaac acatttaaat ccgttccgca 540

gataccggtg ccgaaaattt tcactttcac atcattggat ttccgaattt gaggctcgtc 600

cacctcttga tattcaagct tatcattgat ttcctccaat agcttgcgaa gtctgtagca 660

gagcacttcg gcttcactaa gtgtaatggt taaaggcgga cggattttaa atacatttcc 720

gaacccgtaa cgggatgtcc ggagaatcag cccgtaatcc attgcccgtt ttgcaatata 780

attggtcagc tccacatccg gttcattgtt ctcttttaca atctccacac cgatcataag 840

accgacgcct cttacctcag aaataaaagc gaaatcctct ttcatcgttt ctaagcgatc 900

cataatataa tgaccgaccg tcgttacatt ttccaaaaat cccggacgct gcatgatatc 960

tatggtttta cacgcggcag cggcggccat cacatttgag ccgtacgtga aggagtgcgt 1020

ataccccgga agcccggtat acttgtcctc cgtcagagtg gcggcgactt ggaagcctgt 1080

gcccccgagc ccttttgcta ccgtcatcat attaggtttc acatcgaagt ggtccgcggc 1140

aaacattttg cccgtccgtc cgaacccggt ctgaatttca tcaaaaatca gggcgatatc 1200

gtgttcatca caaagctgtc tcagctgttt aaaatactct ttaggcggaa cgacgtttcc 1260

accgtttccg gatatcggtt caataatcat ggcgg 1295

<210> 19

<211> 1093

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acagatcaca gggaggacga tgaatatgaa tacacaaaac gcgaaaaaaa ctgaaactct 60

tgttgagaaa tcaatgaaca cacaattatc aaactggttt atcctttact ctaaactgca 120

ccgcttccat tggtatgtaa aagggcctca cttctttacg cttcatgaaa aatttgaaga 180

actgtataac gaagcggcgg aaacggcgga cgccatcgca gagcgtcttc tggccatcgg 240

cggacagcct gcggcgactt tgcacactta ccttgaacaa gcttccatta cggatgaagg 300

tcaggaaaaa acggcttctg aaatggtgaa atcactgatt caagactata aacaaatcag 360

ccgcgaatca aaatttgtca tcggcatcgc agaggaacaa aatgacccgt caactgccga 420

cctgtttgtc ggattagttg aagaagcgga caagcatgtg tggatgctgt cagcctactt 480

aggagaatga cgaaaaaagc tgaacctcag ttgaaggttc agcttttttt tttgcgtatt 540

cacgcacact ccttcagcat gttttcattc tatcgattac atattcatcg catgtacaag 600

ttctattgtc ccaataataa ggagaaaagc aaagctccaa aacaaaatgt gtttgaacat 660

gttatcttcc ccgctttttt tcttcctttc ttcccttata cacatcataa acaaacattg 720

tgggataaaa atgaaaagaa tatgtgaaat tatgaaaatg cggcttgagt atgttaaaac 780

tagtataatg acgttgaaag gatgtgaaat gccttgtcat acaccattta tctagttgaa 840

gatgaggata acctgaatga actgctcaca aaatatttag agaatgaagg ctggaacatt 900

acatctttca caaaaggcga agatgccaga aagcagatgc agccgtctcc ccacttgtgg 960

attcttgaca tcatgcttcc ggatacggac ggctatacat tgataaaaga aataaaagaa 1020

aaagatcccg atgtgccggt cattttcatt tccgcgcggg atgccgatat tgacagagtc 1080

ctcgggttag agc 1093

<210> 20

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tattctgttc ggcactgacg gccaccgcgc tgacactgga atccgaactt gttactgttt 60

ttttattcca gtttgtggac atcagcatat tattaaatgt agtagaatac atgtcggcaa 120

tctgggtatt catttcccga taagcatcgc gcttccattc aagcgtctgc ttttgctggt 180

ttaatttatt aagcggctgc ttttcggcat ccatcatttt tttcaccaga gaatctacat 240

caagaccgga attaaggcct gtgattcttg tgaccatatg taccctctcc ttttcggcgt 300

ttagtcgtag acggctctat gacaacagtg agtttccgac tgtttatcat atcacagctc 360

cataaatgta tgatcttatt cttatatcgg tcatattaaa aggttttcaa taatttaact 420

gcaaaatata atgtttcatt ttgtcaatag ggttctttgg cttgctgaag gaggagttag 480

ctgaagaaat aaaaaaaaga tcctggagaa ccaggatctt tccgtcattt gtatttcctc 540

cctgaattgt ttttcgcacg tccttgtgca tttgcgcagc gtcatttctg aagaaaattt 600

ttcctctcat tggctacaat atatatatcg gacggccgct tccattgttt atattgaaaa 660

taaaaaaatc ctcacttttt ttgtgaggat aagttaagta ataaatcagt attaaaagat 720

acggctctgt tgttctcttc caggatcgac aagtagattt ctttccggtg aatatctacg 780

tgctgaggcg cttcaattcc cagcttcact tgttctcctt cgatagcgat cacctttatt 840

tcaatatccg gcccgatctg aatggactca ttcacttttc ttgagagaac tagcatgatc 900

ctcctcctat cagatgtttt gtttcatagg aagcatcatg taaaatgatt tgtttcgcct 960

tcatttcctt tttattgacg ataatcggcg cttttaaatt ggcggtcgtg ttttcaaaag 1020

gctcttccag cgttaaaatc gccatcactt cgacgtcctc tatatcttca atatgcaaaa 1080

gct 1083

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcccccgggt gataggtggt atgttttcg 29

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tccacaattt tttgcttctc atttcatgtg tacattcctc tc 42

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgtacaagca gctgcacaat aaaagagcag agaggacgga ttt 43

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgtacaagca gctgcacaat aaaagagcag agaggacgga ttt 43

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gagaggaatg tacacatgaa atgagaagca aaaaattgtg ga 42

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaatccgtcc tctctgctct tttattgtgc agctgcttgt acg 43

<210> 27

<211> 1146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120

gtcggattta agcagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180

gaaaaaggcg gaaaggttca aaagcaattt aagtatgtta acgcggccgc agcaacattg 240

gatgaaaaag ctgtaaaaga attgaaaaaa gatccgagcg ttgcatatgt ggaagaagat 300

catattgcac atgaatatgc gcaatctgtt ccttatggca tttctcaaat taaagcgccg 360

gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420

attgactctt ctcatcctga cttaaacgtc agaggcggag caagcttcgt tccttctgaa 480

acaaacccat accaggacgg cagttctcac ggtacgcatg tcgccggtac gattgccgct 540

cttaataact caatcggtgt tctgggcgta gcgccaagcg catcattata tgcagtaaaa 600

gtgcttgatt caacaggaag cggccaatat agctggatta ttaacggcat tgagtgggcc 660

atttccaaca atatggatgt tatcaacatg agccttggcg gacctactgg ttctacagcg 720

ctgaaaacag tagttgataa agcggtttcc agcggtatcg tcgttgctgc cgcagccgga 780

aacgaaggtt catccggaag cacaagcaca gtcggctacc ctgcaaaata tccttctact 840

attgcagtag gtgcggtaaa cagcagcaac caaagagctt cattctccag cgcaggttct 900

gagcttgatg taatggctcc tggcgtgtcc atccaaagca cacttcctgg aggcacttac 960

ggcgcttata acggaacgtc catggcgact cctcacgttg ccggagcagc agcgctaatt 1020

ctttctaagc acccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca 1080

acataccttg gaagctcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140

caataa 1146

Claims (4)

1.解淀粉芽胞杆菌表达宿主，其特征在于，以解淀粉芽胞杆菌HZ-12为出发菌，敲除基因epr、nprE、aprE、aprX、mpr、pbpF、vpr、ykct1、htrB、hag。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌表达宿主，其特征在于，敲除基因epr、nprE、aprE、aprX、mpr、pbpF、vpr、ykct1、htrB、hag的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-10所示。

3.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌表达宿主在表达异源蛋白酶中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的异源蛋白酶为中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

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