CN108441462B

CN108441462B - 一株枯草芽孢杆菌及其制备方法

Info

Publication number: CN108441462B
Application number: CN201810335577.6A
Authority: CN
Inventors: 赵瑞丽; 王轶; 郑从义
Original assignee: Canvest Wuhan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Canvest Wuhan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN108441462A

Abstract

本发明涉及一株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ΔWB800及其制备方法，属于生物工程技术领域。本发明通过对枯草芽孢杆菌WB800菌株自溶相关基因skfA、sdpC、lytC、xpf的敲除，获得了自溶抑制菌株Δ800，该菌株具有耐热、耐酸、耐胆盐的优良性能，显现出了较好的工业应用前景。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一株经遗传改造后细胞自溶被抑制的枯草芽孢杆菌及其制备方法。

背景技术

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是在自然环境中正常存在的、革兰氏阳性、形成芽胞的非病原微生物菌。作为目前研究得最多的革兰氏阳性土壤细菌和模式微生物之一，枯草芽胞杆菌是公认的GRAS(Generally recognized as safe)菌株，被广泛用于动植物病害的生物防治、植物生长促进剂、益生菌、工业酶类的生产及异源蛋白的表达等诸多领域。

在枯草芽胞杆菌数十年的研究中人们为了提高枯草芽胞杆菌的生物量以及蛋白产量做出了巨大的努力，并取得了不少优良的成果。蛋白酶缺失突变株的构建是其中最广为认知的一个方面。我们知道，枯草芽胞杆菌为分解利用其所处环境中物质，分泌大量的各种酶类，其中很重要的一类就是蛋白酶，而且蛋白酶也在其清除细胞自身错误折叠或未成熟的蛋白质方面起着重要的作用。然而，这些蛋白酶的存在大大的增加了使用枯草芽胞杆菌进行异源表达时目标蛋白被降解的风险。通过生物信息学分析发现，枯草芽胞杆菌的基因组至少编码24个已知蛋白酶以及6个推测的蛋白酶。为了减少重组蛋白被降解的风险以提高蛋白表达产量，人们不断的尝试着对枯草芽胞杆菌的蛋白酶进行缺失。目前构建了一系列蛋白酶缺失菌株WB600、WB700及WB800。尽管WB800有时需要在30℃培养以避免包涵体的形成，但是WB800表达的蛋白质稳定性比WB700有进一步的提高，即使在培养48小时后仍没有蛋白质降解发生。

细胞自溶现象在枯草芽胞杆菌中普遍存在，是制约其产量提高的一个重要因素。值得注意的是研究发现，当蛋白酶缺失时会导致细胞在从对数生长期向稳定期过渡时细胞自溶的增加。这可能是由于蛋白酶与细胞内自溶酶的降解有关，而自溶酶的累积会导致细胞发生裂解自溶。细胞自溶酶是细胞中普遍存在的一类水解酶，它们在细胞的正常生命中扮演者重要角色。然而既然它们的累积会导致枯草芽胞杆菌生物量的降低。那么我们是否可以通过基因敲除技术来抑制细胞自溶进而达到提高枯草芽胞杆菌生物量的目的呢？

微生态制剂也叫活菌制剂、益生素，它是可以直接饲喂的有益活体微生物制剂。通过维持肠道内微生态平衡而发挥作用，具有防治疾病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染、无残留、不产生抗药性，可作为抗生素的替代品应用于饲料添加剂中。其中，枯草芽孢杆菌是我国农业部公布的可直接饲喂动物且允许使用的饲料级益生菌菌种之一。已有枯草芽孢杆菌被制成无毒副作用、无残留的绿色饲料添加剂。该类产品要求能耐高温、耐酸、耐盐，在配合饲料制粒过程中以及通过酸性胃环境保持稳定。这样到达动物肠道内后才能在动物体内发挥诸多有益作用，提高动物的健康水平和生产性能。因此开发一种能够耐热且耐受酸和胆盐的枯草芽孢杆菌菌株对于降低微生态制剂生产成本，强化微生态制剂功效具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于从枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB800出发，经过一系列自溶相关基因敲除，得到一株自溶现象明显被抑制，且更加耐热、耐酸和耐胆盐处理的枯草芽胞杆菌菌株。本发明中使用大肠杆菌与芽胞杆菌的穿梭载体pGK12构建目的基因的敲除载体，其具有氯霉素抗性基因；pGK12在芽胞杆菌中为温敏型复制，其温度敏感型的复制区在相对较低的37℃下可以正常复制，而温度高于50℃无法正常复制。因而可以利用高温来筛选质粒是否与基因组发生了整合。

为了达成上述的目的，本发明提供了一株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)△WB800，于2018年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072)，其保藏编号为M2018055，分类命名为枯草芽胞杆菌△WB800(Bacillussubtilis △WB800)。

进一步地，其中所述枯草芽胞杆菌具有四个缺失的基因，依次为skfA、sdpC、lytC、xpf。

为了达成上述的目的，本发明还提供上述枯草芽胞杆菌ΔWB800的制备方法，包括以下步骤：

1)以枯草芽胞杆菌WB800的基因组为模板，分别扩增得到要敲除的目的基因上、下游同源臂的序列；

2)通过酶切位点将上、下同源臂与温敏型载体pGK12进行连接并转化到大肠杆菌中进行扩增，获得大量敲除载体；

3)利用二步化学转化法将步骤2)构建好的敲除载体转化到待敲除基因的枯草芽胞杆菌WB800菌株中，使用低于37℃的温度在含有氯霉素抗性的LB培养基培养，以维持该敲除载体的正常复制；

4)步骤3)中得到的含敲除载体的WB800，在37℃的LB液体培养基中生长12-16h后，取500μL，转接到5mL含氯霉素抗性的LB培养基中，并置于45℃培养6-12h；

5)取步骤4)得到的菌液500μL转入新的5mL含氯霉素抗性的LB液体培养基，置于50℃条件下培养6-12h；

6)此时，将上述步骤5)得到的含有质粒整合到基因组上的菌株接种到液体无抗LB培养基中，于37℃培养，连续无抗传代8-12次；

7)取步骤6)的菌液在不含抗生素的LB平板上划线分单菌落，检测不含抗性的菌落，PCR验证其基因敲除情况，如果验证片段大小正确，此时将成功获得单一目的基因敲除菌株；

8)上述1)-7)的方法成功敲除第一个基因后，在此基础上同样沿用步骤1)-7)的方法，依次敲除另外三个与细胞自溶相关的基因，最终获得枯草芽胞杆菌四重细胞自溶相关基因缺失菌株ΔWB800。

进一步地，其中步骤2)中，所述酶切位点包括HindIII、PstI和EcoRI。

进一步地，其中步骤2)中，所述上、下同源臂与温敏型载体pGK12是通过T4连接酶进行连接的。

进一步地，其中所述LB培养基的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氯霉素7.5μg/mL。

进一步地，其中所述LB平板的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。

进一步地，其中步骤5)中，在50℃的高温培养条件下质粒无法复制，质粒只有通过同源臂与基因组上相应同源区段发生交换，整合到基因组上才能使其氯霉素抗性基因表达，进而在抗性培养基中生长。

利用上述方法依次敲除自溶相关基因skfA、sdpC、lytC、xpf，获得四重缺失菌株△WB800。

pGK12是穿梭载体，既可以在大肠杆菌中复制，也可以在枯草芽孢杆菌中进行复制。本发明选择用它来做敲除载体，是因为它在大肠杆菌中转化效率比较高，方便操作，可以先进行上、下游同源臂及载体连接，等敲除载体构建成功，并在大肠杆菌中大量复制后，提取出来，然后转入枯草芽孢杆菌WB800中进行后续敲除过程。

本发明具有如下有益效果：

相较于出发菌株WB800，本发明所获得的突变菌株ΔWB800，其细胞自溶基本完全被抑制；敲除株抗自溶能力得到了增强，推测其抵抗不良生长条件的能力也会有相应的提高。

相较于出发菌株，本发明所获得的突变菌株ΔWB800，其抗逆性有较为明显的提高；具体表现为经热处理后剩余活菌比例由出发菌株的0.5％提高到了7.1％；经酸性处理0.5h，活菌比例由0.09％提高到2.95％；对于胆盐的耐受的活菌率从0.22％大幅度提升到6.53％。

本发明弥补了目前广泛研究的WB800菌株自溶率高、抗逆性差的不足，为其进一步应用到工业生产提供了有利条件。

附图说明

图1为突变株细胞自溶活性检测图；

图2为突变菌株对高温的耐受性图；

图3为突变菌株对强酸的耐受性图；

图4为突变菌株对高盐的耐受性图。

具体实施方式

下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

以下所涉及的材料或试剂除非特别说明，均为市售。

实施例1：枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)△WB800的获得

首先是构建敲除载体。用PCR的方法从WB800基因组上分别扩增出敲除基因的上、下游同源臂，之后Q ID NO.1所示的skfA上游正向引物和如SEQ ID NO.2所示的skfA上游反向引物扩增得到skfA基因的上游同源臂，使用如SEQ ID NO.3所示的skfA下游正向引物和如SEQ ID NO.4所示的skfA下游反向引物扩增得到skfA基因的下游同源臂，将上游同源臂用限制性内切酶HindIII和PstI进行切割，下游同源臂用限制性内切酶PstI和EcoRI进行切割，再以两端限制性内切酶HindIII和EcoRI进行切割载体pGK12，然后将上、下游同源臂和载体片段用T4连接酶进行连接。将得到的连接产物转化大肠杆菌感受态，挑取转化子，液体摇菌，提取质粒进行测序，以检测连接是否正确，最终获得构建成功的敲除载体。用此方法分别成功构建了skfA、sdpC、lytC、xpf四个基因的敲除载体(如SEQ ID NO.5所示的sdpC上游正向引物和如SEQ ID NO.6所示的sdpC上游反向引物用于扩增sdpC基因的上游同源臂，如SEQ ID NO.7所示的sdpC下游正向引物和如SEQ ID NO.8所示的sdpC下游反向引物用于扩增sdpC基因的下游同源臂；如SEQ ID NO.9所示的lytC上游正向引物和如SEQ ID NO.10所示的lytC上游反向引物用于扩增lytC基因的上游同源臂，如SEQ ID NO.11所示的lytC下游正向引物和如SEQ ID NO.12所示的lytC下游反向引物用于扩增lytC基因的下游同源臂；如SEQ ID NO.13所示的xpf上游正向引物和如SEQ ID NO.14所示的xpf上游反向引物用于扩增xpf基因的上游同源臂，如SEQ ID NO.15所示的xpf下游正向引物和如SEQ ID NO.16所示的xpf下游反向引物用于扩增xpf基因的下游同源臂)。

接着进行枯草芽孢杆菌基因的敲除。将构建成功的敲除载体从大肠杆菌中提取出来，采用二步化学转化法将其转入枯草芽孢杆菌WB800中，转化产物用无菌玻璃棒全部涂布到含有氯霉素抗性的LB固体平板(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氯霉素7.5μg/mL，琼脂粉15g/L)，37℃进行孵育生长。挑取转化子，用pGK12质粒特异性鉴定引物进行菌落PCR，即使用如SEQ ID NO.17所示的pGK12通用正向引物和如SEQ ID NO.18所示的pGK12通用反向引物扩增质粒pGK12上的特异性片段，如果可以扩增到该片段，表明质粒pGK12正常转入目的宿主，即获得成功转入敲除载体的菌株。将正确的转化子接入5mL含有氯霉素抗性的液体LB(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氯霉素7.5μg/mL)，200rpm在37℃培养12-16h；然后取500μL上述菌液转接到5mL含有氯霉素抗性的液体LB，并置于200rpm，45℃培养6-12h；取培养后的菌液500μL转接到5mL含有氯霉素抗性的液体LB中，50℃培养6-12h。在高温培养条件下质粒无法复制，质粒只有通过同源臂与基因组上相应同源区段发生交换，整合到基因组上才能使其氯霉素抗性基因表达，进而在抗性培养基中生长。接着将含有质粒(其为上述含有敲除基因上、下游同源和氯霉素的的敲除质粒)整合到基因组上的菌株接种到5mL液体无抗LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/)中，于37℃培养，12h记为一次，连续无抗传代8-12次。取连续传代8-12次后的菌液在不含抗生素的LB平板上划线分单菌落。挑取单一菌落分别点种无抗LB平板和氯霉素抗性LB平板，通过负筛选，得到不含抗性的菌株。对不含抗性的菌落，用目的敲除基因外围的引物进行PCR，即，例如使用如SEQID NO.19所示的skfA外围正向引物和如SEQ ID NO.20所示的skfA外围反向引物扩增skfA基因及其前后各约300bp的片段，PCR产物送测序，根据其大小和序列情况判断其基因敲除情况，进而获得成功敲除基因的菌株(另外还分别三对引物，分别为：如SEQ ID NO.21所示的sdpC外围正向引物和如SEQ ID NO.22所示的sdpC外围反向引物、或如SEQ ID NO.23所示的lytC外围正向引物和如SEQ ID NO.24所示的lytC外围反向引物、或如SEQ ID NO.25所示的xpf外围正向引物和如SEQ ID NO.25所示的xpf外围反向引物)。

在敲除一个基因的菌株的基础上，继续用相同的方法，敲除第二个基因，依次再敲除第三个和第四个基因，最终获得四重自溶相关基因(skfA、sdpC、lytC、xpf)缺失的菌株ΔWB800。

实施例2：菌株的自溶活性检测

挑取待测枯草芽胞杆菌单菌落，接种于液体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)中，于37℃，200rpm过夜培养活化菌体，以1％(v/v)的接种量将上述菌液转接至装有50mL液体LB培养基的250mL三角烧瓶，于37℃、200rpm培养至对数中期(约3h，OD₆₀₀值达到1.0左右)，取样测量记录下OD₆₀₀值后，加入终浓度为0.05M的NaN3溶液。37℃，200rpm继续培养，每隔0.5h测OD₆₀₀值。以加入NaN3后每个时间点的OD₆₀₀与起始的OD₆₀₀比值作为纵坐标绘制自溶曲线。

在加入NaN₃后4h时，出发菌株WB800有80％的细胞裂解，而四重缺失突变株ΔWB800细胞自溶活性几乎完全被抑制，仅有2％的细胞裂解(见图1)。

实施例3：菌株的耐热、耐酸、耐高盐性能检测

挑取待测枯草芽胞杆菌单菌落，接种于液体LB培养基中，于37℃，200rpm过夜培养活化菌体，以1％(v/v)的接种量将上述菌液转接至装有50mL液体LB培养基的250mL三角烧瓶，于37℃，200rpm培养至稳定期(约12h)，取样测量记录下OD₆₀₀值。取0.5mL菌液，室温，8000g离心5min，10mM PBS(pH 7.4)洗两次。

耐热性：0.5mLPBS重悬，55℃水浴处理30min，不同时间间隔取样，梯度稀释后涂布LB固体平板(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L)，生长12h后记录活菌数。未经热敷处理的菌液计数结果定义为100％。

耐酸性：用pH 2.0的生理盐水重悬，37℃孵育0.5h。不同时间间隔取样，梯度稀释后涂布LB固体平板，生长12h后记录活菌数。未经孵育的菌液计数结果定义为100％。

耐盐性：用0.5mL0.3wt％(pH 8.0)胆盐重悬，37℃孵育0.5h。不同时间间隔取样，梯度稀释后涂布LB固体平板(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L)，生长12h后记录活菌数。未经孵育的菌液计数结果定义为100％。

结果表明，改造后的菌株ΔWB800经55℃处理30min，剩余活菌数目由出发菌株WB800的0.5％提高到了7.1％；在酸性耐受方面，由原来的0.09％提高到2.95％；对于胆盐的耐受也有较大幅度的提升，从0.22％到6.53％(结果见图2、图3、图4)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉珈创生物技术股份有限公司

<120> 一株枯草芽孢杆菌及其制备方法

<130> WH1801025-1

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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Claims

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）△WB800，于2018年 1 月 24 日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2018055，分类命名为枯草芽孢杆菌△WB800，其特征在于：以枯草芽孢杆菌WB800的基因组为模板，敲除与细胞自溶相关的skfA、sdpC、lytC、xpf基因，最终获得的枯草芽孢杆菌多重细胞自溶相关基因缺失菌株△WB800。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以枯草芽孢杆菌WB800的基因组为模板，分别扩增得到要敲除的目的基因上、下游同源臂的序列；

2）通过酶切位点将上、下同源臂与温敏型载体pGK12进行连接并转化到大肠杆菌中进行扩增，获得大量敲除载体；

3）利用二步化学转化法将步骤2）构建好的敲除载体转化到待敲除基因的枯草芽孢杆菌WB800菌株中，使用低于37 ℃的温度在含有氯霉素抗性的LB培养基培养，以维持该敲除载体的正常复制；

4）步骤3）中得到的含敲除载体的WB800，在37 ℃的LB液体培养基中生长12-16 h后，取500μL，转接到5mL含氯霉素抗性的LB培养基中，并置于45 ℃培养6-12 h；

5）取步骤4）得到的菌液500μL转入新的5mL含氯霉素抗性的LB液体培养基，置于50 ℃条件下培养6-12 h；

6）此时，将上述步骤5）得到的含有质粒整合到基因组上的菌株接种到液体无抗LB培养基中，于37 ℃培养，连续无抗传代8-12次；

7）取步骤6）的菌液在不含抗生素的LB平板上划线分单菌落，检测不含抗性的菌落，PCR验证其基因敲除情况，如果验证片段大小正确，此时将成功获得单一目的基因敲除菌株；

8）上述1)-7)的方法成功敲除第一个基因后，在此基础上同样沿用步骤1)-7)的方法，依次敲除另外三个与细胞自溶相关的基因，最终获得枯草芽孢杆菌四重细胞自溶相关基因缺失菌株△WB800。

3.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述酶切位点包括HindIII、PstI和EcoRI。

4.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述上、下同源臂与温敏型载体pGK12是通过T4连接酶进行连接的。

5.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氯霉素7.5μg/mL。

6.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，所述LB平板的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。